Biorremediacao

36 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.34 - janeiro/junho 2005

Meio ambiente

Christine Claire GaylardeMicrobiologista, M.Sc., Ph.D., Profa. do Depto. deBiofísica, [email protected]

BIORREMEDIAÇÃO

Biorremediação é um processono qual organismos vivos, normal-mente plantas ou microrganismos,são utilizados tecnologicamente pararemover ou reduzir (remediar)poluentes no ambiente. Este proces-so biotecnológico de remediação temsido intensamente pesquisado e re-comendado pela comunidade cientí-fica atual como uma alternativa viá-vel para o tratamento de ambientescontaminados, tais como águas su-perficiais, subterrâneas e solos, alémde resíduos e efluentes industriaisem aterro ou áreas de contenção.Embora outras tecnologias que usamprocessos físicos e/ou químicos se-jam também indicadas paradescontaminar ambientes poluídos,o processo biológico debiorremediação é uma alternativaecologicamente mais adequada eeficaz para o tratamento de ambien-tes contaminados com moléculas or-gânicas de difícil degradação e me-tais tóxicos.

As moléculas orgânicas de difícildegradação, denominadas “recalci-trantes”, podem ser de origem natu-

ral, sintetizadas pelo metabolismobiológico, ou sintéticas, produzidaspor tecnologias industriais modernase estranhas ao ambiente natural,por esta razão denominadas“xenobióticas” (xenos, do grego =estrangeiro). Estas moléculasxenobióticas, introduzidas no ambi-ente desde o início do século XX,compreendem vários tipos de com-postos, aplicados na industria quími-ca e de materiais, tal comoagrotóxicos, corantes, fármacos,polímeros e plásticos, podendo sertóxicas a sistemas biológicos e/ourecalcitrantes, uma vez que não fa-zem parte do conjunto de moléculasproduzidas pelo metabolismoevolutivo que propicia a vida naTerra. Muitos dos xenobióticos e/ouseus produtos de degradação resul-tam em efeitos nocivos e/oumutagênicos aos organismos vivos,podendo levar à eliminação seletivade indivíduos e acarretar modifica-ções na estrutura ecológica e funcio-nal da comunidade biológica.

Por estas razões há, atualmente,uma grande preocupação em sedesenvolverem biotecnologias paradescontaminar ambientes poluídospor xenobióticos. Os processos bio-lógicos de descontaminação, enqua-drados na categoria de biorreme-diação, utilizam, geralmente, micror-ganismos autóctones (do próprioambiente) ou introduzidos (em esta-do nativo ou geneticamente modifi-cados) com capacidade de bio-degradar xenobióticos, resultando emprodutos de degradação com estru-tura menos recalcitrante em relação

Maria De Lourdes BellinasoBioquímica, M.Sc., Ph.D., Profa. do Depto. de Biologiae Química, UNIJUÍ[email protected]

Gilson Paulo ManfioBiólogo, M.Sc., Ph.D., Pesquisador da NaturaInovação e Tecnologia em Produtos [email protected]

à molécula or ig inal , ou namineralização do xenobiótico, pro-duzindo compostos químicos sim-ples, como: CO

2, H

2O, NH

3, SO

4

-2,PO

4

-2.

Biodegradação dos

xenobióticos

O sistema metabólico que setem mostrado mais apto parabiodegradar moléculas xenobióticasrecalcitrantes, nos processos debiorremediação, é o microbiano, umavez que os microrganismos desem-penham a tarefa de reciclar a maiorparte das moléculas da biosfera, par-ticipando ativamente dos principaisciclos biogeoquímicos e, represen-tando, portanto, o suporte de manu-tenção da vida na Terra. Esta extraor-dinária diversidade metabólica sedeve à combinação do potencialgenético individual das diferentesespécies microbianas em um siste-ma natural, com enzimas e vias me-tabólicas que evoluíram ao longo debilhões de anos, e a capacidade demetabolismo integrado apresentadapela comunidade microbiana emconjunto: produtos do metabolismode um microrganismo pode sersubstrato para outros. Este intensosinergismo metabólico entre micror-ganismos, praticamente ausente nosorganismos mais complexos, é defundamental importância nabiodegradação de xenobióticos. Mui-tos fatores ambientais de naturezafísica, química e biológica influenci-am na capacidade de um sistemamicrobiano de biodegradar uma

Aspéctos biológicos e técnicos da biorremediação de xenobióticos

Imagens cedidas pelos autores

Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento n.34 - janeiro/junho 2005 37

molécula.

Fatores físicos e químicos

Os principais parâmetros físicosque influenciam na degradabilidadesão: natureza física da matriz onde ocomposto é encontrado (solo, água,sedimento), temperatura e luz. Porexemplo, ambientes complexos, taiscomo solos e sedimentos, têm apropriedade de, através da atraçãode cargas opostas, adsorver molécu-las, diminuindo, desta maneira, abiodisponibilidade do poluente. Nasregiões temperadas do globo, a ati-vidade metabólica de microrganis-mos pode ser reduzida em funçãodas baixas temperaturas médias anu-ais, reduzindo, conseqüentemente,a taxa de degradação de poluentesnestas áreas.

Diversos fatores químicos po-dem influenciar, acelerando ou redu-zindo, a taxa de degradação de umpoluente. Entre estes fatores inclu-em-se a composição química damatriz ambiental, que define a capa-cidade nutritiva, o pH, umidade, teorde oxigênio dissolvido, o potencialredox do meio e a composição eestrutura química do poluente. Me-tais pesados, quando presentes, po-dem interagir com enzimas produzi-das pelos microrganismos, inibindo asua atividade e, por conseguinte, acapacidade degradativa destes. Poroutro lado, concentrações adequa-das de metais que têm ação decofatores enzimáticos podem me-lhorar a capacidade degradativa domeio. A presença de outros compos-tos xenobióticos de estrutura sim-ples pode também dificultar o meta-bolismo de moléculas mais comple-xas, pois a comunidade microbianase direcionaria seu metabolismo paradegradar, preferencialmente, osmenos complexos.

Como exemplo da influência daestrutura química na degradação deum poluente, pode-se citar a altapers is tência de compostosnitroaromáticos no ambiente. Ape-sar de intensos esforços, ainda nãoforam isoladas bactérias capazes demineralizar muitos dos nitroaro-máticos produzidos pelo homem,como, por exemplo, o TNT (utiliza-do em explosivos) e os herbicidas

orizalin e trifluralina. Os três com-postos apresentam, em comum, trêsgrupos nitro no anel aromático quedificultam sua mineralização.

Fatores biológicos

A biodegradação de um com-posto químico no meio ambientedepende, sobretudo, da presença deuma população de microrganismoscapaz de metabolizar a moléculaoriginal e seus produtos de degrada-ção. Não existem, na biosfera atual,rotas enzimáticas catabólicas capa-zes de degradar todos os compostosnovos que a cultura humana sinteti-zou durante os últimos 100 anos.Sabe-se, entretanto, que algunsxenobiót icos podem serbiodegradados por microrganismosque possuam enzimas capazes decatabolizar moléculas específicas, oumesmo pela ação conjunta de con-sórcios microbianos, em que cadamicrorganismo atua individualmen-te sobre diferentes etapas do pro-cesso de biodegradação.

A biodegradação é mais prová-vel quando a estrutura química doxenobiótico é semelhante à estrutu-ra de moléculas naturais. Por exem-plo, existe uma grande diversidadede moléculas naturais com estruturascomplexas, tais como a lignina, ricaem anéis benzênicos - estruturamolecular natural mais abundante nabiosfera depois da glicose -, osesteróides, os terpenos e compostoshalogenados naturais, que ocorremem grande abundância e são normal-mente metabolizados por microrga-nismos no ambiente.

As enzimas que catabolizam adegradação de compostos naturaispodem apresentar baixaespecificidade pelo seu substrato e,desta maneira, os xenobióticos comestrutura química semelhante a com-postos naturais podem ser reconhe-cidos pelo sítio ativo da enzima,possibilitando, assim, que sejam qui-micamente transformados. Quandoo xenobiótico tem a possibilidade depercorrer todos os passos catalíticosde uma determinada rota catabólicaenzimática, provavelmente ele setorna uma possibilidade nutritiva parao microrganismo, sendo os produtosde sua degradação aproveitados pelo

seu metabolismo construtivo eenergético. Porém, quando o com-posto é apenas parcialmente degra-dado, por ação de uma ou maisenzimas de uma rota catabólica semque o produto resultante contribuapara a sobrevivência do microrganis-mo, esta transformação metabólica édenominada de “co-metabolismo”.

O produto do co-metabolismo,muitas vezes, pode servir de substratopara transformações enzimáticas deoutras espécies microbianas, possi-bilitando a degradação completa doxenobiótico (mineralização). O co-metabolismo, aparentemente umatransformação fútil quando analisadasob a ótica de um microrganismoisolado, tem um papel importantenas biotecnologias de remediaçãode sítios contaminados, pois, geral-mente, nenhum microrganismo pos-sui todas as enzimas necessárias paraa metabolização completa de umxenobiótico.

Trocas de material genéticopodem ocorrer entre microrganis-mos na natureza e constituem umoutro fator que contribui para o po-tencial biodegradador de uma comu-nidade. Muitas rotas catabólicas decompostos complexos estão locali-zadas no genoma plasmidial.Plasmídeos podem ser trocados en-tre bactérias de uma mesma espé-cie, ou mesmo entre microrganis-mos de espécies diferentes, atravésde mecanismos de conjugação outransformação de células naturalmen-te competentes (células com capa-cidade de assimilar DNA exógeno nanatureza). Estes processos de inter-câmbio de material genético favore-cem a disseminação de genes, e,conseqüentemente, a disseminaçãopotencial de enzimas relacionadasao metabolismo catabólico de umamolécula recalcitrante.

Obviamente, as característicasfísico-químicas e nutricionais do meioexterno e o compart imentointracelular microbiano estão estrita-mente relacionados. Mesmo que umsistema microbiano porte todos osrequisitos bioquímicos e genéticosnecessários para a degradação deum xenobiótico, se as característicasfísico-químicas e componentesnutricionais do meio não condizem


com as necessidades metabólicas domicrorganismo, a biodegradação nãoocorrerá.

Visão interdisciplinar

A pesquisa técnico-científica,com o objetivo de tornar os fenôme-nos naturais mais facilmente com-preensíveis, geralmente enfoca oestudo de parâmetros físicos, quími-cos e biológicos relacionados à de-gradação de maneira separada. Comoabordado anteriormente, estesparâmetros são estritamente relacio-

nados em um processo debiorremediação. Por esta razão, aimplementação de processos deremediação em um ambiente conta-minado requer a condução de umestudo detalhado, com uma visãointerdisciplinar, envolvendo profis-sionais de diferentes áreas de conhe-cimento, como microbiologia, bio-química, biologia molecular, químicaorgânica e analítica e engenharia.

Por exemplo, é necessário umconhecimento aprofundado das ca-racterísticas químicas da molécula

xenobiótica que se pretende elimi-nar em um processo debiorremediação, uma vez que a es-trutura química influencia vários as-pectos do metabolismo biológico. Apresença de grupos químicos na es-trutura molecular, como halogênios,-NO

2, -SO

3H, CN, -CH

3, -CF

3, -NH

2, -

OCH3, bem como arranjos específi-

cos destes radicais na cadeia de car-bono, que interferem na distribuiçãoeletrônica da molécula (proprieda-des enantioméricas ou quirais), podedificultar a catálise enzimática, con-

Avaliação da naturezado ambiente contaminado

(p.ex., solo, sedimento, aqüífero)�

Caracterização da contaminação(natureza do composto,quantidade, distribuição)

�

Planejamento dotipo de biorremediação

(análises biológicas, geológicas,geofísicas, hidrológicas)

�

Decisão por biorremediaçãoin-situ ou ex-situ

Utilização de plantas(fitorremediação)

Utilização demicrorganismos

Seleção eintrodução de

plantasGEPs

(geralmentealóctones com aspropriedades de

interesse)

(introduçãode plantas

geneticamentemodificadas)

Bioestimulação

(favorecimento depopulações demicrorganismos

autóctonesdegradadores)

Bioaumentação(introdução de microrganismos degradadores)

OGMs (introduçãode microrganismos

geneticamentemodificados)

Autóctones(isolamento e

seleção demicrorganismos

com aspropriedades deinteresse a partirde amostras doambiente a ser

tratado)

Alóctones(seleção de

microrganismoscom as

propriedades deinteresse a partirde material ex

situ disponívelem coleções de

culturas ou outrasfontes)

Propagação e introduçãono ambiente

�Monitoramento do processoe intervenções para ajuste

Figura 1. Esquema geral dasetapas para definição eimplementação de um processode biorremediação


fer indo à molécula maiorrecalcitrância. Por exemplo, os de-tergentes sintéticos alquilbenzenosulfonados, comercializado nos anos60-70, provocaram sérios impactosambientais decorrentes de elevadograu de persistência no ambiente.Espessas camadas de espumas seacumulavam nos rios, acarretandogrande mortandade de peixes. Pes-quisas biológicas mostraram que asua alta persistência no ambienteestava relacionada à presença detrês grupos metilas na molécula. Umnovo desenho químico da molécula,em que foram retirados os gruposmetilas, permitiu o aumento dabiodegradabilidade destes detergen-tes sintéticos, diminuindo, destamaneira, o impacto ambiental.

O grau de toxicidade de umamolécula também é relacionado comsua estrutura molecular. A estruturamolecular define o tipo e a intensi-dade de interação com diferentescomponentes e metaból i tosintracelulares (estruturas da paredee membrana celular, organelas, eestrutura terciária de proteínas e áci-dos nucléicos), que podem ocasio-nar efei tos c i totóxicos e/oumutagênicos.

Um outro efeito importante as-sociado à estrutura molecular quetambém deve ser considerado é abiodisponibilidade da molécula.Muitos xenobióticos têm caráterapolar, o que muitas vezes não écompatível com sítios de entrada etransportadores da membrana celu-lar, indisponibilizando-o, desta ma-neira, para o metabolismo intracelular.Alguns microrganismos contornameste obstáculo produzindosurfactantes e possibilitando, assim,a entrada de moléculas apolares parao interior da célula. A busca debiossurfactantes que possam ser uti-lizados como aditivos em solos con-taminados com compostos poucosolúveis é hoje uma das linhas comgrande desenvolvimento em pes-quisas de biorremediação.

Outro aspecto a ser analisado éa composição química do ambiente,a qual contribui para definição dovalor nutritivo do meio. Quando omeio não fornece macro emicronutrientes necessários para o

metabolismo celular dos microrga-nismos degradadores, é necessária aadição controlada destes ao sistema,por meio do emprego de técnicas deengenharia, como, por exemplo, ainjeção de nutrientes via galerias e/ou buracos no solo e uso de formu-lações de liberação lenta nos ambi-entes aquáticos. Como conseqüên-cia destas adições, a taxa de degra-dação pode ser aumentada.

Técnicas de aplicação de nutri-entes têm se mostrado eficientespara a despoluição de ambientesaquáticos contaminados com petró-leo. Experimentos de campo de-monstraram um aumento de 5 a 10vezes nas taxas de degradação. Noentanto, existem dúvidas sobre osefeitos a longo prazo, uma vez queas taxas de degradação em áreastratadas e não-tratadas tendem a seequalizar com o tempo. A introduçãode nutrientes e/ou surfactantes como objetivo de aumentar a atividademicrobiana ou a biodisponibilidadedo poluente é um t ipo debiorremediação conhecido comobioestimulação.

Outra opção que pode ser ado-tada para se melhorar o potencialbiodegradador de um ambiente con-taminado é a adição de populaçõesde microrganismos degradadoresautóctones (que já presentes naque-le ambiente), ou de organismosdegradadores ou mediadores debiodegradação (e.g, produtores debiossurfactantes) estranhos ao siste-ma (alóctones), repicados em labo-ratório. A utilização de técnicas parase aumentar populações microbianasdegradadoras é denominada debioaugmentação.

Portanto, cada processo debiorremediação é particular e quasesempre necessita de uma adequaçãoe de uma otimização específica paraaplicação em diferentes sítios afeta-dos, requerendo sempre uma análi-se integrada de parâmetros físicos,químicos e biológicos.

Etapas de implementação

de um processo de

Biorremediação

A biorremediação é umatecnologia complexa e sua

implementação ocorre em etapasque compreendem um estudo doambiente, do tipo de contaminante,dos riscos e da legislação pertinente(Figura 1). Em primeiro lugar, é ne-cessário uma caracterização do tipoe da quantidade do poluente, bemcomo avaliações de natureza bioló-gica, geológica, geof ís ica ehidrológica do sítio contaminado.

As avaliações biológicas ocor-rem, em primeira estância, em labo-ratório, e têm como objetivo aotimização da biodegradação do com-posto. Elas compreendem os testesde bioestimulação, pela adição denutrientes e/ou surfactantes, e ostestes de bioaugmentação, pelaadição de culturas de microrganis-mos biodegradadores ou mediado-res. Com base nos dados obtidos é,então, escolhida a técnica debiorremediação mais adequada paraa situação e testes de campo sãorealizados, para verificar a eficiênciado processo in situ.

Porém, devido à complexidadedesta biotecnologia, cuja eficiênciaenvolve vários fatores, muitos pro-blemas de difícil equacionamentopodem surgir no decorrer do proces-so. Entre os principais problemasencontrados na aplicação de proces-sos de biorremediação estão:

• a poluição geralmente envol-ve vários compostos, de diferentesclasses químicas, requerendo a sele-ção e utilização de diferentes micror-ganismos com metabolismo especí-fico para os diferentes poluentes;

• quando as concentrações dospoluentes são baixas, os microrga-nismos podem não produzir asenzimas necessárias; quando sãomuito altas, os microrganismos po-dem ser inibidos;

• alguns dos poluentes presen-tes podem ser incompatíveis com oprocesso de biodegradaçãoimplementado;

• alguns compostos são rapida-mente adsorvidos pelo solo, sedi-mento e/ou água, diluindo-se abaixodo nível exigido para a ativação dabiodegradação, contudo permane-cendo ainda em concentrações aci-ma da desejável;

• a taxa da biorremediação podeser muito baixa, resultando em um


processo de longa duração.Alguns dos problemas acima re-

latados podem ser superados atravésdo uso de microrganismos genetica-mente modificados, os OGMs (Gene-

tically Engineered Microorganisms,ou GEMs, em inglês).

OGMs na despoluição ambiental

O uso de organismos-genetica-mente-modificados (OGMs) oferecea possibilidade de se contornar algu-mas das limitações dos processos debiorremediação, principalmente asrelacionadas à taxa da degradação dopoluente. A manipulação genética deum microrganismo pode permitir oaumento da taxa de degradação atra-vés de diferentes estratégias:

· inserção de genes que codifi-cam enzimas catabólicas específicaspara a molécula-alvo;

· inserção de genes que confe-rem resistência a compostos inibitóri-os no ambiente ou aos produtos dedegradação da molécula-alvo;

· inserção de genes ou altera-ções genéticas que auxiliam na solu-ção de problemas ligados à baixaconcentração do poluente, como, porexemplo, aumento da captação/ab-sorção do composto pela célula ou daexpressão da enzima.

A incorporação destes genes emuma bactéria geralmente é feita viaplasmídios ou transposons, e poderesultar na manutenção do DNAexógeno na forma de plasmídio ou nainserção dos genes no cromossomobacteriano.

Os primeiros OGMs a serem apli-cados na despoluição do ambienteforam as bactérias recombinantesdesenvolvidas por Chakrabarty, nosanos 70. Através de sucessivas

recombinações entre cepas com di-versos plasmídeos, foram obtidas vá-rias linhagens de bactérias capazes dedegradar mais de um tipo dehidrocarboneto. A mais conhecida foia capaz de degradar cânfora, naftalina,octano e xileno.

Obviamente, a produção de umabactéria capaz de degradar múltiplospoluentes em laboratório não signifi-ca a resolução completa dos proble-mas da biorremediação. Muitosquestionamentos de ordem técnica eética necessitam ser respondidos:

• os organismos sobreviverão noambiente?

• eles se reproduzirão?• eles se espalharão para outros

locais?• causarão danos ao ambiente?• transferirão os genes para ou-

tros organismos no ambiente?

A seguir serão examinadas essasquestões.

Sobrevivência

Microrganismos modificados emlaboratório podem ser selecionadospara apresentarem baixacompetitividade com o objetivo deserem eliminados ou, ainda, para per-derem as características especiais derecombinação após um certo tempode vida, sendo, assim, pouco compe-tentes para sobrevivência no ambien-te natural.

No entanto, um dos problemasprincipais dos OGMs é a instabilidadede seus genes exógenos, principal-mente quando inseridos em forma deplasmídios. Quando esta instabilida-de é devido à segregação deficiente,ou seja, parte da população geradaapós um ciclo de divisão celular podenão ter o plasmídio, o problema podeser superado com a inserção dos genesde interesse no cromossomobacteriano, mediante o uso detransposons. Entretanto a inserção denovos genes no cromossomo de ummicrorganismo pode ter efeitos ines-perados, como interferência naregulação de outras vias metabólicas,acarretando, por exemplo, o aumen-to da produção de toxinas ouinativação da expressão de outraspropriedades de interesse.Multiplicação no local

Figura 2. Possíveis estratégias de trabalho para detecção, monitoramento ecaracterização da diversidade em amostras ambientais utilizando abordagenstradicionais e independentes-de-cultivo (adaptado de diferentes fontes).


Quando o poluente é o únicosubstra to para cresc imentomicrobiano, a multiplicação das cé-lulas terminará na presença de bai-xos níveis do mesmo. Esta é uma boamaneira de controlar a população deOGMs no ambiente. Contudo os mi-crorganismos podem perder a ativi-dade antes que a concentração dopoluente atinja o nível desejado. Esteproblema pode ser superado comengenharia genética, utilizando pro-motores induzidos pela deprivaçãode nutrientes. Como exemplo, po-demos citar os genes T4MO (tolueno4-monoxigenase) de Pseudomonas

mendocina KR1, que foram clonadossob o controle do gene groEL. Abactéria geneticamente modificadapromoveu, nas mesmas taxas, a de-gradação de tolueno, fenol etricloretileno sob condições adequa-das e sub-óptimas de glicose, nitro-gênio e fósforo.

Riscos e dispersão dos OGMs

no ambiente

Quais são os efeitos indesejá-veis da liberação de OGMs no meioambiente? Sem dúvida, conhecer osefeitos indesejáveis da inserção deorganismos vivos geneticamente mo-dificados na natureza é uma dasmetas mais importantes da comuni-dade científica atual. Entre os efeitosmais questionados estão:

• competição do OGM com amicrobiota, flora e fauna local, po-dendo levar à extinção destas espé-cies nativas;

• a troca de genes entre micror-ganismos geneticamente modifica-dos e populações microbianas au-tóctones, já cientificamente compro-vada, pode levar à degradação gené-tica das espécies autóctones;

• a possibilidade de introduçãoao ambiente de espécies que apre-sentem fatores de patogenicidadepara a população autóctone, espéci-es que produzem endo-e/ouexotoxinas ou que contenham genesde resistência a antibiótico; esta éuma situação que deve de ser avali-ada em laboratório antes da libera-ção dos microrganismos no ambien-te;

• o desequilíbrio da estrutura dacomunidade, podendo levar à de-

gradação ambiental;• a impossibilidade da elimina-

ção dos microrganismos introduzi-dos depois que eles terminam o seutrabalho.

Grande parte destes efeitos po-deriam ser contornados através doisolamento físico dos OGMs, ou seja,pelo confinamento do sítio contami-nado durante o tratamento comOGMs. Porém surge uma nova ques-tão: É possível o isolamento físicodos OGMs?

Microrganismos têm uma gran-de capacidade de disseminação, sen-do capazes de se espalhar através dosolo, na água, no vento, por coloni-zação ou adsorção a outros seresvivos, incluindo microrganismos(protozoários, algas), pequenos ani-mais, raízes e sementes de plantas.Por estas razões, é razoável que aresposta desta pergunta seja: “Pro-vavelmente, na maioria dos casos, éimpossível o isolamento de OGMs”.Em vista disso, é necessário que omicrorganismo seja construído demaneira que seus efeitos no meioambiente sejam mínimos e/ou seutempo de sobrevivência seja limita-do.

Avanços científicos, contudo, su-gerem que OGMs no ambiente nãotrazem necessariamente efeitos in-superáveis. No ano 1993, noHorticultural Research Internationalde Littlehampton, e no Institute ofVirology and EnvironmentalMicrobiology de Oxford, no ReinoUnido, uma l inhagem dePseudomonas f luorescens

cromossomalmente modificada foiaplicada em sementes do trigo evaporizada nas folhas emergentes.As conclusões das investigações fo-ram as seguintes:

• a vaporização não causou gran-de espalhamento do OGM nas áreaslocais adjacentes aos locais de apli-cação;

• P. f luorescens normal erecombinante causaram mudançastemporárias (de até 69 dias) namicrobiota do filoplano e na rizosferadas plantas inoculadas, mas não norestante do solo, e os microrganis-mos mais sensíveis foram os não-formadores de esporos de cresci-

mento rápido;• as mudanças produzidas pela

introdução da linhagem recombinan-te não foram diferentes daquelascausadas pela não-recombinante;

• as perturbações foram peque-nas, sem efeitos para o crescimentoe/ou saúde das plantas.

Mesmo que estes resultados su-giram que o ambiente não tenha sidosignificativamente alterado, é sem-pre recomendado, diante das pou-cas evidências experimentais e práti-cas existentes, limitar o espaço e otempo de vida dos OGMs. Devido àquase imposs ibi l idade doconfinamento físico dos OGMs, pes-quisas, hoje, sugerem que o próprioDNA do microrganismo porte emseu código o limite de espaço físicoe de tempo de vida. Por exemplo,estes atributos são contempladosquando os OGMs são construídospara sobreviverem somente em con-dições de poluição ou, ainda, até queum evento específico, geneticamen-te projetado, ocorra na fisiologia domicrorganismo ou no ambiente. Umexemplo de evento geneticamenteprojetado é o uso dos elementos

suicidas, tais como o gene hok, quecontrola a produção de uma proteína“killer” (assassina) nas células, ativa-da pela ausência de poluente. Oproblema do uso deste gene suicidaé que pode sobreviver até 1 em 104

células por geração, devido às taxasde mutações normais em estirpessuicidas negativas. Utilizando-se umsistema suicida de 2 componentes(cada um dos quais codifica um me-canismo suicida diferente), a taxa desobrevivência cai para 10-7 a 10-8

células/geração. Entretanto, esta taxade sobrevivência ainda pode serconsiderada elevada, em função dasdensidades que as populaçõesintroduzidas no ambiente podematingir. Cálculos mostram que umnível de confinamento satisfatório éatingido somente quando os organis-mos modificados carregam 8 meca-nismos suicidas separados, cada qualcom um tipo de controle diferente.

Contudo, um outro problemasurge. Pesquisas mostram que o DNA,de OGMs ou, mesmo, o liberadoapós a morte das células podem ser


transferidos para outras células

Transferência de genes e seu

controle

Os microrganismos podemtransferir DNA através dos processosde conjugação (transferência deplasmídios entre células), transdução(transferência mediada por vírus) etransformação (entrada de DNA domeio em células competentes). Sãoprocessos naturais, cujos mecanis-mos não cabem nos objetivos destecapítulo. Entretanto, cabe ressaltarque existe a possibilidade desta trans-ferência de DNA e, conseqüente-mente, dos genes de degradação oucontrole, entre os OGMs e os micror-ganismos naturalmente presentes noambiente.

Para evitar transferências degenes dos OGMs para populaçõesautóctones, cientistas têm desenvol-vido estratégias moleculares, como,por exemplo, vetores suicidas deconfinamento que não permitem areplicação ou causam a destruiçãodo DNA após serem transferidos paraoutros microrganismos.

Uma outra possibilidade paraevitar a transferência de genesindesejados é optar pela utilizaçãode genes marcadores ou reguladoresque não representem riscos de da-nos ao ambiente. Por exemplo, genesde resistência a antibióticos,comumente ut i l izados comomarcadores de OGMs, podem sersubstituídos por genes marcadoresde resistência a sais de Hg, arsenito,telurito, herbicidas, ou outrosmarcadores que não apresentem ris-co ambiental.

Detecção de microrganismos e

genes de degradação no

ambiente

A introdução de microrganismos,sejam eles OGMs ou não, e/ou autilização de estratégias que favore-çam o aumento de populaçõesmicrobianas específicas em um dadoambiente para fins de biorremediaçãorequer, necessariamente, a adoçãode práticas de monitoramentomicrobiológico voltadas para adetecção e/ou quantificação de mi-crorganismos e/ou dos genes intro-

duzidos no ambiente. Este tipo deprática pode visar diferentes objeti-vos, ligados direta ou indiretamenteà atividade de degradação desejada:

• quantificar a população dosmicrorganismos de interesse, ligadosao processo de degradação dopoluente ou xenobiótico;

• avaliar a disseminação deOGMs e não-OGMs introduzidos noambiente;

• avaliar a possibilidade de trans-ferência dos genes para comunida-des microbianas locais, e, ainda;

• fornecer informações valiosaspara avaliação de possíveis impactosambientais da introdução ou dofavorecimento de populações espe-cíficas, refletido em alterações nacomposição e estrutura de comuni-dades microbianas naturais do sítio.

Diferentes estratégias podemser adotadas para a realização destesmonitoramentos. Os métodos expe-rimentais utilizados podem ser divi-didos, basicamente, em dois grandesgrupos, de acordo com a abordagemque é empregada:

• métodos baseados em iso-

lamento e cultivo: o monitoramen-to é realizado utilizando-se protoco-los convencionais de microbiologia,baseados no isolamento dos micror-ganismos da amostra ambiental einoculação em meios de cultivo sele-tivos e/ou não-seletivos, avaliandoos resultados através do crescimentode colônias em placas de Petri ou emensaios de diluição utilizando tubosmúltiplos, e;

• métodos independentes-

de-cultivo: o monitoramento de li-nhagens microbianas e/ou de gru-pos microbianos específicos na amos-tra é realizado através da análise decélulas e/ou ácidos nucléicos extraí-dos da amostra, utilizando-se sondasmoleculares para genes determina-dos ou a amplificação destes pormetodologias de PCR.

Dependendo da estratégia debiorremediação utilizada, do tipo deamostra e ambiente alvo, os méto-dos de cultivo podem ser facilmenteempregados e fornecer parâmetrosadequados para avaliação das popu-lações de microrganismosbiodegradadores e aspectos geraisdas populações microbianas na amos-

tra. No caso de sítios e estratégias debiorremediação onde populaçõesmicrobianas altamente diversificadassão favorecidas (alta diversidade deespécies envolvidas no processo),onde existam fatores limitantes aocultivo, como presença de compos-tos recalcitrantes altamente tóxicosou amostras de difícil coleta e mani-pulação (subsolo, aqüíferos profun-dos, resíduos industriais tóxicos), emcasos onde os OGMs introduzidosnão são diferenciáveis de popula-ções naturais por cultivo, os méto-dos baseados em isolamento e culti-vo não são adequados para omonitoramento. Nestes casos, o usode métodos independentes-de-cul-tivo podem representar uma alter-nativa mais eficaz e eficiente para omonitoramento.

Os métodos independentes-de-cultivo, por sua vez, permitem adetecção e monitoramento tanto dosmicrorganismos específicos como dosgenes de degradação relacionadosao processo de biorremediação. Den-tre os métodos mais utilizados paradetecção específica de microrganis-mos e genes podemos citar ahibridização com sondas molecularesem ensaios de FISH (fluorescent in

situ hybridization) ou em membra-na de nylon (dot blot), e a amplifica-ção dos genes-alvo em reações dePCR.

Uma representação de diferen-tes possíveis estratégias emetodologias que podem ser em-pregadas em um estudo de popula-ções microbianas em amostrasambientais é apresentada na Figura2. O detalhamento destes métodos eapresentação de protocolos não sãoobjetos deste capítulo. Porém, comoestes são amplamente difundidos, éfácil a localização de trabalhos naliteratura que relatam a aplicação dediferentes estratégias moleculares aoestudo de processos debiorremediação.

Algumas estratégias emetodologias independentes-de-cul-tivo podem ser utilizadas para umacaracterização fina das comunidadesmicrobianas presentes na amostra epopulações específicas. A amplifica-ção de genes ribossomais utilizandoiniciadores (primers) grupo- ou es-


pécie-especí f icos permite avisualização de padrões de bandasrepresentativos da comunidade es-tudada em análises eletroforéticas,como no caso do DGGE/TGGE(denaturing gradient gel

electrophoresis e thermal gradient

gel electrophoresis), métodos quepermitem a separação de fragmen-tos de mesmo tamanho, porém comseqüências gênicas diferentes, e doARDRA (amplified ribosomal DNA

restriction analysis) ou t-RFLP (ter-

minal fragment length

polymorphism), métodos que per-mitem a diferenciação de microrga-nismos nas amostras pela análise dopadrão de bandas gerados por restri-ção enzimática do DNA amplificado.

Por outro lado, a construção debancos genômicos, produzidos apartir da clonagem dos fragmentosde genes ribossomais (ou de outrosgenes de interesse, incluindo genescodificadores de enzimas de viascatabólicas), amplificados por PCR,permite a geração de material paraseqüenciamento de DNA e análiseposterior filogenética de seqüênciasde DNA ribossomal e proteínas.

A apl icação de métodosmoleculares geralmente implica emcustos mais elevados, comparadocom a utilização de protocolos tradi-cionais baseados em isolamento emcultivo. Contudo, métodos indepen-dentes-de-cultivo permitem a gera-ção de dados com elevado conteúdode informação e de natureza com-plementar aos métodosmicrobiológicos tradicionais, possi-bilitando a detecção e quantificaçãode OGMs e microrganismos não-modificados também pela presençados genes de degradação no DNA epelo nível de atividade metabólica(quantidade de RNA intracelular)presente na célula. Na Figura 2 ob-serva-se relacionamento entre astécnicas que podem ser utilizadasnos estudos tradicionais e molecularesde amostras ambientais.

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