bioquímica-relatório antigo

I – INTRODUÇÃO:

Enzimas

Para que a vida seja possível, é necessário que as reações químicas que acontecem, aconteçam a uma certa velocidade. Muitas das reações bioquímicas não aconteceriam na velocidade que acontecem nos seres vivos, que são elevadas, se não fossem catalisadas. Nos seres vivos, a catálise de reações químicas é feita por enzimas. As enzimas são proteínas que, atuam como catalisadores na maioria das reações bioquímicas, elas baixam a energia de ativação necessária para que ocorra uma reação química. As enzimas aceleram as reações na ordem de 106 a 1012! Por exemplo, uma enzima que acelerou a reação na ordem de 1012 e concluiu a reação em 1 segundo, se esta reação acontece sem a enzima levaria aproximadamente 317,1 centenas de anos!

Estrutura

Estruturalmente, as enzimas possuem todas as características das proteínas, tendo zonas da sua estrutura responsáveis pela catálise. A zona reativa da enzima é denominada sítio ativo e é onde se liga o substrato que vai ser transformado no produto. Existem também outras zonas da cadeia polipeptídica que são sensíveis à presença de algumas espécies químicas, regulando a atividade da enzima. Essas zonas são denominadas centros alostéricos. A enzima deve manter sua estrutura e isso é importante para sua atividade. Essa estrutura pode ser perdida se a enzima é colocada num meio com um pH, temperatura ou concentração salina que favoreça sua desnaturação.

Algumas enzimas não reagem apenas se chocando com o substrato, elas necessitam da presença de outras espécies químicas, cofatores e/ou coenzimas. Os co-fatores e as co-enzimas são fundamentais na catálise porque se associam na estrutura da enzima, no sítio ativo ou próximo dele permitindo que o substrato seja ligado e catalisado ao produto. Os cofatores podem ser: podem ser íons metálicos, como o Mg2+, o Zn+ ou o Fe2+, etc. As coenzimas são moléculas orgânicas derivadas de lipídios, vitaminas ou outras moléculas orgânicas e quando estão em solução, eles se associam às enzimas para realizar a catálise, no final da catálise eles são liberados também, sem nenhuma modificação, por isso é chamado de co-fator ou co-enzima. Durante a reação, a enzima pode mudar sua estrutura, mas sempre voltará a sua estrutura inicial depois da reação.Pra que ocorra a uma reação, eu tenho que ter a enzima e o substrato num meio com temperatura, pH e concentração salina regulados, se a minha enzima usar um co-fator e co-enzima, eu tenho que ter os 2, se ela usar 1, eu preciso de 1, se não usar ninguém, não preciso de ninguém.

Mecanismo

As enzimas atuam diminuindo a energia de ativação da reação que ela catalisa, elas fazem isso se estabilizando com uma ligação como ponte de sulfeto. Essa energia que estava sendo usada quando a enzima não estava ligada, depois da ligação está disponível para o sistema, essa energia é chamada de energia de energia livre de Gibbs (G), essa energia diminui a energia que é usada para a ativação da reação e torna a reação viável. Essa Em geral, uma enzima catalisa apenas um substrato na pela estrutura do seu sítio ativo. Quando um substrato se liga ao sítio ativo, forma-se o chamado complexo enzima-substrato (ES). O substrato se altera enquanto se encontra ligado à enzima, transformando-se num produto, e forma o complexo enzima-produto. O produto desliga-se da enzima e ela está preparada para novo ciclo catalítico.

http://pt.wikibooks.org/wiki/Bioqu%C3%ADmica/Constituintes_estruturais_dos_sistemas_vivos/Amino%C3%A1cidos_e_Prote%C3%ADnas/Prote%C3%ADnas

http://pt.wikibooks.org/wiki/Imagem:DNA_polymerase.png

http://pt.wikibooks.org/wiki/Imagem:Carbonic_anhydrase_1CA2_active_site.png

Explicando melhor:

E+S = o sítio ativo possui cargas, então ele atrai o substrato (que é o bastão no desenho) que também tem cargas, só que opostas as da enzima.

ES = As duas cargas são estabilizadas, a energia que foi disponibilizada para o sistema, a energia livre de Gibbs (G), foi usada para vencer a primeira barreira de ativação.

Estado de transição - ele tencionado ao máximo!

EP = Catalise. Transformação do substrato em produto, passando pelo estado de transição. Para a enzima quebrar o bastão ela precisa “forçar”, as cargas que irão tencionar o bastão até quebrar.

E + P = Depois do bastão (substrato) quebrado, a enzima está ligada a algo que não é o substrato, então a enzima libera o produto e é formada Enzima + Produto (estado mais estável).

Propriedades

Como são proteínas, e estão sujeitas a se desnaturar, cada enzima possui um pH ótimo e uma temperatura ótima de funcionamento. Fora dessa temperatura a enzima começa a sofrer desnaturação, perdendo a sua estrutura tridimensional e a sua função, que é a capacidade catalítica. As enzimas também sofrem desnaturação a temperaturas baixas.

Uma mesma enzima pode catalisar muito rapidamente várias vezes a mesma reação, no entanto, pela mesma razão, as enzimas não alteram o equilíbrio químico da reação que catalisam. As enzimas são específicas para o seu substrato, catalisando uma só reação. Existem algumas enzimas que catalisam substratos similares, mas normalmente são mais específicas para um deles.

Velocidade inicial (Vo)

A maioria dos estudos da enzima é feio in vitro ("em vidro"), isso quer dizer que esse estudo é feito em um lugar fora dos sistemas vivos, em um ambiente controlado e fechado de um laboratório e que são feitos normalmente em recipientes de vidro.

Normalmente, os estudos in vitro usam uma concentração de substrato muito superior à concentração de enzima, para que a probabilidade de uma enzima encontrar uma molécula de substrato seja o mais elevada possível.

Outra vantagem do uso de uma concentração de substrato ([S]) maior que a concentração de enzima ([E]) é a possibilidade de calcular a variação da velocidade de reação com [E] sem que a [S] varie muito. Como S está a ser convertido em P, a [S] diminui com o tempo, e a [P] aumenta na solução. Como a [S] influência a formação do complexo ES e na formação de produto, ela vai influenciar também a velocidade da reação (V0). Mas se fizermos apenas o cálculo da velocidade inicial da reação, a variação de [S] não é grande e por isso ela pode considerada constante.

http://pt.wikipedia.org/wiki/Vidro

A velocidade medida (velocidade inicial, V0) depende apenas de [E]. Um gráfico de V0 x [S] apresenta uma forma característica de semi-hipérbole: a baixas concentrações de substrato, a variação de V0 x [S] é linear; à medida que se usam [S] mais elevadas a V0 varia cada vez menos, tendendo para um valor limite, denominado: velocidade máxima, Vmax.

A baixas concentrações de substrato, a maior parte da enzima em solução está forma livre, quando a [S] está elevada, todas as enzimas se encontraram, por um instante, na forma ES, mas mesmo que a [S] seja alta, as moléculas de enzima não têm capacidade de catalisar todo o substrato.

Equação de Michaelis-Menten

A semi-hipérbole da velocidade de uma enzima pela concentração do substrato (V0 x [S]) esta na forma da seguinte equação de Michaelis-Menten:

KM é a constante de Michaelis.

Convertendo a equação de Michaelis-Menten para gerar o gráfico do DUPLO RECÍPROCO

A equação de Michaelis-Menten pode ser transformada numa equação da reta, do tipo y=ax+b:

GRAFICO DO DUPLO RECÍPROCO:

V0

Vmax

Vmax/2

[S]Km

A última forma da equação de Michaelis-Menten é conhecida como equação de Lineweaver-Burk. Um gráfico de Vo-1 (y) por [S]-1 (x) é uma reta igual a Km/Vmax (a), que intercepta o eixo das coordenadas (Y) no ponto Vmax

-1 (b), interceptando também o eixo das abcissas (x) no ponto Km-1. Este gráfico é chamado de duplo recíproco pois é uma representação gráfica do recíproco de ambos os parâmetros Vo e [S]. Esta fórmula que gera um reta determina mais precisamente o Vmax, um parâmetro que só se obtém por aproximação num gráfico de Michaelis-Menten. Outra vantagem na utilização da equação de Lineweaver-Burk é visível em inibição enzimática, sendo mais fácil de detectar e distinguir entre diferentes tipos de inibição: ao usar diferentes concentrações de inibidores ou tipos de inibição diferentes, o gráfico do duplo recíproco muda.

Inibidores

Os inibidores enzimáticos são compostos que podem diminuir a atividade de uma enzima, todos eles vão se ligar a enzima, a inibição enzimática pode ser reversível ou irreversível; Existem 2 tipos de inibição enzimática

Irreversível:

O inibidor irreversível se liga ao sítio ativo onde o substrato se ligaria e não desligam, a enzima não funciona mais.Neste caso a Vmax diminui e o Km também diminui.

Abaixo um exemplo: 10E 5E + 10S 5ES 5EP 5E + 5P + 5I

5EI

Reversíveis:

Km-1

1/V

Vmax-1

[S]-1

Km/Vmax

Vmax

Vmax/2

Km

Inibidor Irreversível

Vmax/2diminui

Km diminui

Vmax INC

- Inibição Enzimática Reversível Competitiva:

Quando o inibidor se liga reversivelmente ao mesmo sítio de ligação do substrato; O efeito é revertido aumentando-se a concentração de substrato; Este tipo de inibição depende das concentrações de substrato e de inibidor;Vmax não muda e Km aumenta.

- Inibição Enzimática Reversível Não-Competitiva:

Quando o inibidor liga-se reversivelmente à enzima em um sítio próprio de ligação, podendo estar ligado à mesma ao mesmo tempo que o substrato; Este tipo de inibição depende apenas da concentração do inibidor;Vmax diminui, pois a disponibilidade de ES é menor;A ligação do Substrato independe da presença de I, eles não competem e Km é constante.

E + S ES EP E + P + + I I

IE + S IES

- Inibição Enzimática Reversível Acompetitiva:

O inibidor só é capaz de se ligar a enzima depois do substrato;Vmax diminui poque [ES] diminui;Km diminui;

Vmax

Vmax/2Não muda

Kmaumenta

Inibidor Reversível competivo

Km

Vmax

Vmax/2

Km = Km INC

Inibidor Reversível não-competitivo

Vmax/2diminui

Vmax INC

E + S ES EP E + P + I

IES

- Inibição Enzimática Reversível Mista:Vmax diminui e Km diminui, mas não é proporcional e se comporta de várias formas.

- Gráfico do duplo recíproco das diferentes formas de inibidores:

II – MATERIAL:

SOLUÇÃO PADRÃO DE P-NITROFENOL (PNP) 0,1 mM EM TAMPÃO TRIS-HCl pH 9,5SOLUÇÃO PADRÃO DE P-NITRO-FENIL-FOSFATO (PNPP) 1 mM EM TAMPÃO TRIS-HCl pH 9,5SOLUÇÃO PADRÃO DE P-NITRO-FENIL-FOSFATO (PNPP) 10 mM EM TAMPÃO TRIS-HCl pH 9,5SOLUÇÃO TAMPÃO BORATO-NaOH 0,3 M, pH 9,5, 10,5 e 11,5SOLUÇÃO TAMPÃO CITRATO HCl 0,2 M, pH 5,5, 6,5 e 7,5

Vmax

Vmax/2

Km

Inibidor Reversível AcompetitivoVmax/2

diminui

Km diminui

Vmax IAC

[S]-1

Vo-1

Km-1

INCIC

Sem inibidor

IAC

IAC – inibidor Acompetitivo(é paralelo à reta sem inibidor)IC – inibidor CompetitivoINC – inibidor não-competitivo

SOLUÇÃO DE NaOH 2 MSOLUÇÃO DE ENZIMA: FOSFATASE ALCALINA (EC 3.1.3.1) 0,022 mg/mL (Sigma Fine Chemicals)PIPETADOR AUTOMÁTICO 20-100 UlPIPETAS DE 1, 2 e 5 mLPRÓPIPETESTUBOS DE ENSAIOVORTEXBANHO DE GELO (0ºC)BANHO-MARIA (37ºC) – marca: FISATOMBANHO-MARIA (68ºC) – marca: BIOMATICCUBETASESPECTROFOTÔMETRO – marca: 22 RS SPECTROObs.: Tris = [tris(hidroximetril)aminometano] ou 2-amino-2(hidroximetil)- 1,3 propanodiol

III - OBJETIVO:

Verificar a influência de diferentes fatores físico-químicos sobre a atividade da enzima como:

A partir dos valores obtidos na execução das práticas e suas respectivas representações gráficas, comprovar a influência desses diferentes fatores na atividade e velocidade das reações enzimáticas.

Conhecer as condições ótimas de catálise. Determinar o tipo de inibidor utilizado e a sua influência na cinética enzimática.

IV – PROCEDIMENTO:

A) Construção de uma curva padrão de PNP:

1. Transferiu-se, com auxilio de pipeta e pró-pipete, alíquotas das soluções indicadas para tubos de ensaio devidamente rotulados segundo a tabela abaixo:

Tubo nº Solução padrão de PNP (mL)

Tampão Tris-HCl, pH 9,5 (mL)

Solução NaOH 2M (mL)

Branco - 3,0 1,01 0,2 2,8 1,0

2 0,4 2,6 1,03 0,8 2,2 1,04 1,2 1,8 1,05 1,4 1,6 1,06 1,8 1,2 1,0

Obs: O volume final em todos os tubos foi rigorosamente o mesmo, ou seja, 4,0 mL (com NaOH).

2. Homogeneizaram-se os tubos manualmente.3. Procedeu-se à leitura espectrofotométrica da absorbância, a 405 nm (filtro azul), de cada um dos tubos. Utilizou-se o tubo branco como referência de calibração para o aparelho.

B) Influência do pH

4. Transferiu-se, com auxílio de pipeta e pró-pipete, alíquotas das soluções indicadas para tubos de ensaio devidamente rotulados segundo a tabela abaixo, exceto a solução de enzima:

Tubo nº

Solução tampãocitrato-HCl (mL)

Solução tampãoTris-HCl (mL)

Solução tampãoBorato-NaOH (mL)

PNPP 1mM (mL)

Enzima

(mL)pH 5,5

pH 6,5

pH 7,5

pH 7,5

pH 8,5 pH 9,5

pH 9,5

pH 10,5

pH 11,5

B1 1,1 1,0B2 1,1 1,0B3 1,1 1,01 1,0 1,0 0,12 1,0 1,0 0,13 1,0 1,0 0,14 1,0 1,0 0,15 1,0 1,0 0,16 1,0 1,0 0,17 1,0 1,0 0,18 1,0 1,0 0,19 1,0 1,0 0,1

Obs: O volume final em todos os tubos foi rigorosamente o mesmo, ou seja, 2,1 mL.

5. Utilizando um pipetador automático, adicionou-se 0,1 mL (100 μL) da solução de enzima aos tubos 1 a 9 em intervalos de 30 segundos, determinando o horário exato de início do ensaio.6. Homogeneizaram-se os tubos com vigor7. Incubaram-se os tubos em banho-maria a 37°C por 10 minutos.8. Paralisou-se a reação adicionando 1,0 mL de NaOH 2M aos tubos de 1 a 9 em intervalos de 30 segundos, e posteriormente aos tubos restantes.9. Homogeneizaram-se os tubos com vigor.10. Procedeu-se a leitura espectrofotométrica da absorbância, a 405 nm (filtro azul), de cada um dos tubos. Utilizaram-se os tubos brancos (B1, B2 e B3) de cada um dos tampões como referência de calibração para o aparelho.

C) Influência da temperatura11. Transferiu-se, com auxilio de pipeta e pró-pipete, alíquotas das soluções indicadas para tubos de ensaio devidamente rotulados segundo a tabela abaixo, exceto a solução de enzima e de NaOH:

Tubo nºTampão Tris-HCl pH 9,5

H2O (mL)

PNPP 1mM (mL)

Temperatura (°C)

Enzima (mL)

Solução de NaOH

(mL)1B 0,5 2,0 1,0 0 - 1,01 0,5 1,9 1,0 0 0,1 1,0

2B 0,5 2,0 1,0 25 - 1,02 0,5 1,9 1,0 25 0,1 1,0

3B 0,5 2,0 1,0 37 - 1,03 0,5 1,9 1,0 37 0,1 1,0

4B 0,5 2,0 1,0 68 - 1,04 0,5 1,9 1,0 68 0,1 1,0

Obs: O volume final de todos os tubos foi rigorosamente o mesmo, ou seja, 3,5 mL (sem NaOH).

12. Utilizando o pipetador automático, adicionou-se 0,1 mL (100 μm) da solução de enzima aos tubos 1 a 4 em intervalos de 30 segundos, determinando o horário exato de início do ensaio.13. Homogeneizaram-se os tubos com vigor.14. Incubou-se cada um dos tubos por 10 minutos cada um na temperatura indicada.15. Paralisou-se a reação adicionando 1,0 mL de NaOH 2M aos tubos de 1 a 4 em intervalos de 30 segundos.16. Homogeneizaram-se os tubos com vigor.17. Procedeu-se a leitura espectrofotométrica da absorbância, a 405 nm (filtro azul), de cada um dos tubos. Utilizaram-se os tubos brancos como referência de calibração para cada um dos tubos no aparelho.

D) Curso Temporal18. Foi transferido com auxílio de pipeta e pró-pipete, alíquotas das soluções indicadas para tubos de ensaio devidamente rotulados segundo a tabela abaixo, exceto a solução de enzima e de NaOH:

Tubo nº

TampãoTris-HCl pH

9,5

H2O (ml)

PNPP 1 mM (ml)

Enzima (ml)

Tempo (min)

Solução de NaOH (ml)

B 0,5 1,0 1,0 0,1 0 1,01 0,5 1,0 1,0 0,1 3 1,02 0,5 1,0 1,0 0,1 6 1,03 0,5 1,0 1,0 0,1 9 1,04 0,5 1,0 1,0 0,1 12 1,05 0,5 1,0 1,0 0,1 15 1,06 0,5 1,0 1,0 0,1 30 1,07 0,5 1,0 1,0 0,1 45 1,0

Obs.: O volume final de todos os tubos é o mesmo, ou seja, 2,6 mL (sem NaOH).

19. Utilizando um pipetador automático, foi adicionado 1,0 mL da solução de NaOH ao tubo B, e em seguida foi adicionado 0,1 mL (100 uL) da solução de enzima.

20. Foi utilizado um pipetador automático para adicionar 0,1 mL (100 uL) da solução de enzima aos tubos 1 à 7 em intervalos de 30 segundos determinando o intervalo exato de início do ensaio.21. Foram homogeneizados os tubos com vigor.22. Todos os tubos foram encubados em banho-maria à 37ºC.23. A reação foi paralisada adicionando 1,0 da solução de NaOH, Respeitando o tempo de encubação de cada amostra.24. Os tubos foram homogeneizados com vigor.25. Foi efetuada a leitura espectrofotométrica da absorbância a 405 nM (filtro azul), de cada um dos tubos, utilizando o “tubo branco” como referência de calibração para o aparelho.

E) Curva do substrato

26. Foi transferido com auxílio de pipeta e pró-pipete, alíquotas das soluções indicadas para tubos de ensaio devidamente rotulados segundo a tabela abaixo, exceto a solução de enzima e de NaOH:

TUBO Nº TAMPÃOTris-HCl pH

9,5

H2O (mL)

PNPP 10 mM (mL)

ENZIMA (mL)

Solução de NaOH

(mL)B 0,5 2,5 - 0,1 1,01 0,5 2,4 0,1 0,1 1,02 0,5 2,3 0,2 0,1 1,03 0,5 2,2 0,3 0,1 1,04 0,5 2,1 0,4 0,1 1,05 0,5 1,9 0,6 0,1 1,06 0,5 1,7 0,8 0,1 1,07 0,5 1,5 1,0 0,1 1,08 0,5 1,3 1,2 0,1 1,09 0,5 0,7 1,8 0,1 1,0

10 0,5 0,5 2,0 0,1 1,011 0,5 0,3 2,2 0,1 1,012 0,5 0,1 2,4 0,1 1,013 0,5 - 2,5 0,1 1,0

Obs.: O volume final de todos os tubos é o mesmo, ou seja, 3,1 mL (sem NaOH).

27. Foi utilizado um pipetador automático para adicionar 0,1 mL (100 µM) da solução de enzima aos tubos em intervalos de 30 segundos, determinando o horário exato de início do ensaio.28. Foram homogeneizados os tubos com vigor.29. Os cubos foram incubados em banho-maria a 37ºC a 15 minutos.30. A reação foi paralisada adicionando 1,0 mL de NaOH 2M aos tubos em intervalos de 30 segundos, e depois aos tubos restantes.28. Foram homogeneizados os tubos com vigor.32. A leitura espectrofotométrica da absorbância foi feita a 405 nM (filtro azul), em cada um dos tubos, foi utilizado o tubo “branco” como referência de calibração para o aparelho.

F) Influência do inibidor

33. Foi transferido alíquotas das soluções indicadas para tubos de ensaio devidamente rotulados segundo a tabela abaixo, exceto a solução de enzima e de NaOH:

TUBO Nº TAMPÃOTris-Pi-HCl pH 9,5

H2O (mL)

PNPP 1 mM (mL)substrato

ENZIMA (mL)

Solução de NaOH (mL)

Leitura da Abs (405 nM)

B 0,5 2,5 - 0,1 1,0 0,0001 0,5 2,4 0,1 0,1 1,0 0,0042 0,5 2,3 0,2 0,1 1,0 0,0053 0,5 2,2 0,3 0,1 1,0 0,0064 0,5 2,1 0,4 0,1 1,0 0,0075 0,5 1,9 0,6 0,1 1,0 0,0096 0,5 1,7 0,8 0,1 1,0 0,0217 0,5 1,5 1,0 0,1 1,0 0,0138 0,5 1,3 1,2 0,1 1,0 0,0059 0,5 0,7 1,8 0,1 1,0 0,031

10 0,5 0,5 2,0 0,1 1,0 0,04111 0,5 0,3 2,2 0,1 1,0 0,04212 0,5 0,1 2,4 0,1 1,0 0,03513 0,5 - 2,5 0,1 1,0 0,045Obs.: O volume final de todos os tubos é o mesmo, ou seja, 3,1 mL (sem NaOH).

34. Foi utilizado um pipetador automático para adicionar 0,1 mL (100 ul) da solução de enzima aos tubos em intervalos de 30 segundos.35. Foram homogeneizados os tubos com vigor.36. Todos os tubos foram encubados em banho-maria a 37ºC por 15 minutos.37. A reação foi paralisada adicionando 1,0 mL de NaOH 2M aos tubos em intervalos de 30 segundos.

36. Foram homogeneizados os tubos com vigor e procedida a leitura espectrofotométrica da absorbância, a 405 nM (filtro azul), de cada um dos tubos, utilizando o tubo “branco” como referência de calibração para o aparelho.

V – RESULTADOS:

a) Avaliação cinética da reação:

1. Leitura da absorbância

Tubo Abs (405 nm)B 0,0001 0,0682 0,1753 0,3174 0,4455 0,5026 0,592

2. Cálculo das concentrações de PNP para a construção da curva padrão:

Tubo 10,1 mM PNP ------ 1000 mL 0,1 mM xNP ------ 0,2 mL x = 0,00002 mmols

0,00002 mmols ----- 4,0 mL0,000x2 mmols ----- 1000 mL x = 0,005 mM











3. Concentração nos tubos:

Tubo nº [PNP] em mM1 0,0052 0,0103 0,0204 0,0305 0,0356 0,045

4. Cálculo da equação da reta:

y = ax

Escolhidos dois pontos na reta: A (0,030;0,45) e B (0,020;0,32)

= 13FCM=

0,07

692 =

b) Influência do pH

1. Leitura da absorbância:

Tubo Abs (405 nm) Tubo Abs (405 nm) Tubo Abs (405 nm)B1 0,000 B2 0,000 B3 0,0001 0,100 4 0,149 7 0,1492 0,219 5 0,139 8 0,0403 0,214 6 0,367 9 0,010

2. Cálculo da velocidade da reação:

Abs (405 nm) y ÷ a = [PNP] (mM) V = [PNP]/tAbs1 0,100 13 0,00769 7,69 x 10-4

Abs2 0,219 13 0,0168 1,68 x 10-3

Abs3 0,214 13 0,0165 1,65 x 10-3

Abs4 0,149 13 0,0115 1,15 x 10-3

Abs5 0,139 13 0,0107 1,07 x 10-3

Abs6 0,367 13 0,0282 2,82 x 10-3

Abs7 0,149 13 0,0115 1,15 x 10-3

Abs8 0,046 13 0,00354 3,54 x 10-4

Abs9 0,002 13 0,000154 1,54 x 10-5

pH V = [PNP]/minSolução tampão Citratato-HCl (mL)pH 5,5 0,000769pH 6,5 0,00168pH 7,5 0,00165Solução tampão Tris-HCl (mL)pH 7,5 0,00115pH 8,5 0,00107pH 9,5 0,00282Solução tampão Borato-NaOH (mL)pH 9,5 0,00115

pH 10,5 0,000354pH 11,5 0,0000154

c) Influência da Temperatura:

1. Leitura da Absorbância

Tubo Abs (405 nm)B1 0,0001 0,073B2 0,0002 0,165B3 0,0003 0,219B4 0,0004 0,060

2. Cálculo da velocidade da reação

Tubo nº Temperatura em ºC [PNP] / min1 0 5,61 . 10-4

2 25 1,27 . 10-3

3 37 1,68 . 10-3

4 68 4,61 . 10-4

d) Curso temporal:

Abs (405 nm) y ÷ a = [PNP] (mM) V = [PNP]/tAbs1 0,073 13 0,00561 5,61 . 10-4

Abs2 0,165 13 0,0127 1,27 . 10-3

Abs3 0,219 13 0,0168 1,68 . 10-3

Abs4 0,060 13 0,00461 4,61 . 10-4

Como esta parte da prática não foi realizado pelo grupo, por falta de tempo, o valor das absorbâncias foram obtidos com o Grupo 1.

1. Leitura da absorbância

Tubo Abs (405 nm)B 0,0001 0,1052 0,1833 0,2844 0,3345 0,3956 0,6207 0,700

2. Cálculo da concentração de produto

Abs (405 nm) y ÷ a = [PNP]Abs1 0,105 13 8,08 . 10-3

Abs2 0,183 13 1,4 . 10-2

Abs3 0,284 13 2,2 . 10-2

Abs4 0,334 13 2,57 . 10-2

Abs5 0,395 13 3,03 . 10-2

Abs6 0,620 13 4,77 . 10-2

Abs7 0,700 13 5,38 . 10-2

Tempo de incubação e [PNP]:Tubo nº Tempo (min) [PNP]1 3:00 8,08 . 10-3

2 6:00 0,014 . 10-2

3 9:00 0,022 . 10-2

4 12:00 2,57 . 10-2

5 15:00 3,03 . 10-2

6 30:00 4,77 . 10-2

7 45:00 5,38 . 10-2

e) Curva de Substrato


Como esta parte da prática não foi realizado pelo nosso grupo, por falta de tempo, o valor das absorbâncias foram obtidos fazendo uma média dos resultados dos outros grupos.

LEITURA DA ABSORBÂNCIA (405 nm)Tubo nº Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Professor

1 0,057 0,146 0,141 0,2142 0,080 0,147 0,197 0,3073 0,086 0,197 0,203 0,3394 0,084 0,221 0,235 0,3775 0,108 0,252 0,272 0,4166 0,123 0,256 0,302 0,4337 0,118 0,307 0,312 0,4628 0,135 0,317 0,340 0,4919 0,150 0,367 0,375 0,539

10 0,160 0,367 0,386 0,55511 0,239 0,370 0,407 0,49112 0,177 0,384 0,419 0,51913 0,166 0,382 0,418 0,517

Como são 4, os grupos que obtiveram os valores da Abs, a média foi feita da seguinte forma: foram pegos 4 valores por ponto e descartados o mais alta e o mais baixo e foi feita a média com os valores que sobraram.

LEITURA DA ABSORBÂNCIA (405 nm)Tubo nº Grupo 2 Grupo 3 Média Aritmética

1 0,146 0,141 0,14352 0,147 0,197 0,1723 0,197 0,203 0,24 0,221 0,235 0,2285 0,252 0,272 0,2626 0,256 0,302 0,2797 0,307 0,312 0,30958 0,317 0,340 0,32859 0,367 0,375 0,371

10 0,367 0,386 0,376511 0,370 0,407 0,388512 0,384 0,419 0,401513 0,382 0,418 0,4


Abs (405 nm) y ÷ a = [PNP] V=[PNP]/t1 0,1435 13 0,011 7,36 x 10-42 0,172 13 0,013 8,82 x10-43 0,2 13 0,015 1,02 x 10-34 0,228 13 0,017 1,17 x 10-35 0,262 13 0,020 1,34 x 10-36 0,279 13 0,021 1,43 x 10-37 0,3095 13 0,024 1,59 x 10-38 0,3285 13 0,025 1,68 x 10-39 0,371 13 0,028 1,9 x 10-3

10 0,3765 13 0,029 1,93 x 10-311 0,3885 13 0,030 1,99 x 10-312 0,4015 13 0,031 2,06 x 10-313 0,4 13 0,031 2,05 x 10-3

3. Cálculos da concentração de substrato nos tubos:

Tubo 110 mM PNPP ------ 1000 mL 0,1 mM xNP ------ 0,1 mL x = 0,001 mmol

0,001 mmol ----- 3,1 mL0,000x2 ols ----- 1000 mL x = 0,323 mM












0,010 mmol ----- 3,1 mL0,0 0x ols ----- 1000 mL x = 3,23 mM













Tubo nº [PNPP] (mM) V = [PNP] / min1 0,323 7,36 x 10-42 0,645 8,82 x 10-43 0,968 1,02 x 10-34 1,29 1,17 x 10-35 1,94 1,34 x 10-36 2,58 1,43 x 10-37 3,23 1,59 x 10-38 3,87 1,68 x 10-39 5,81 1,9 x 10-310 6,45 1,93 x 10-311 7,10 1,99 x 10-312 7,74 2,06 x 10-313 8,07 2,05 x 10-3

f) Influência do inibidor


TUBO Nº PNPP 1 mM (mL)substrato

Leitura da Abs (405 nM)

B - 0,0001 0,1 0,0042 0,2 0,0053 0,3 0,0064 0,4 0,0075 0,6 0,0096 0,8 0,0217 1,0 0,0138 1,2 0,0059 1,8 0,03110 2,0 0,04111 2,2 0,042

12 2,4 0,03513 2,5 0,045


Abs (405 nm) y ÷ a = [PNP] V=[PNP]/t1 0,004 13 3,077 x 10-4 2,05 . 10-52 0,005 13 3,846 x 10-4 2,564 x 10-5

3 0,006 13 4,61 x 10-4 3,08 x 10-5

4 0,007 13 5,38 x 10-4 3,59 x 10-5

5 0,009 13 6,92 x 10-4 4,61 x 10-5

6 0,021 13 1,61 x 10-3 1,07 x 10-4

7 0,013 13 1,00 x 10-3 6,67 x 10-5

8 0,005 13 3,846 x 10-4 2,564 x 10-5

9 0,031 13 2,38 x 10-3 1,59 x 10-4

10 0,041 13 3,15 x 10-3 2,1 x 10-4

11 0,042 13 3,23 x 10-3 2,15 x 10-4

12 0,035 13 2,69 x 10-3 1,79 x 10-4

13 0,045 13 3,46 x 10-3 2,31 x 10-4

Como concentração do substrato já foi calcula anteriormente e o volume da solução é o mesmo, a [PNPP] foi usada novamente.

Tubo nº [PNPP] (mM) V=[PNP]/t1 0,323 2,05 . 10-52 0,645 2,564 x 10-5

3 0,968 3,08 x 10-5

4 1,29 3,59 x 10-5

5 1,94 4,61 x 10-5

6 2,58 1,07 x 10-4

7 3,23 6,67 x 10-5

8 3,87 2,564 x 10-5

9 5,81 1,59 x 10-4

10 6,45 2,1 x 10-4

11 7,10 2,15 x 10-4

12 7,74 1,79 x 10-4

13 8,07 2,31 x 10-4

3. Agora, sobrepondo os dois, com e sem inibidor.

4. Duplo recíproco SEM INIBIDOR: Inverso da velocidade x Inverso da concentração de substrato

Tubox = y =

1 3,09 1,36 . 103

2 1,55 1,13 . 103

3 1,03 9,8 . 102

4 0,775 8,55 . 102

5 0,515 7,46 . 102

6 0,388 6,99 . 102

7 0,310 6,29 . 102

8 0,258 5,95 . 102

9 0,172 5,26 . 102

10 0,155 5,18 . 102

11 0,141 5,02 . 102

12 0,129 4,85 . 102

13 0,124 4,88 . 102

5. Cálculo de Vmáx e Km a partir da construção do duplo-recíproco

Os dois últimos valores foram descartados por estarem muito distantes da reta Y.

A reta corta o eixo do x em -0,803.

Quando na equação da reta, y=0 , a reta corda o eixo da abscissa.

6. Duplo recíproco SEM INIBIDOR: Inverso da velocidade x Inverso da concentração de substrato

Tubo nºx = y =

1 3,09 487802 1,55 390013 1,03 324674 0,775 278555 0,515 216926 0,388 93467 0,310 149928 0,258 390019 0,172 628910 0,155 476211 0,141 465112 0,129 558613 0,124 4329

Novamente os dois últimos valores foram descartados por estarem muito distantes da reta Y.

5. Cálculo de Vmáx e Km a partir da construção do duplo-recíproco

Quando na equação da reta, y=0 , a reta corda o eixo da abscissa.Y=31019x+5247,40=31019x+5247,4-5247,4=31019xx=-0,169

A reta corta o eixo do x em -0,1692.

VI – DISCUSSÃO:

a. Construção da curva padrão de PNP

• O aumento da concentração de PNP progressiva em cada um dos tubos induz a um aumento proporcional das absorbâncias observadas no espectrofotômetro, esse aumento de absorbância e produto é representado por um gráfico linear e sua equação é determinada com os cálculos a partir dos pontos A e B da curva padrão.

• Na reação de formação de produto a enzima catalisa o PNPP formando o produto PNP que é um fosfato alcalino.

b. Influência do pH

• A enzima teve atividade em todas as faixas de pH, ou seja, não houve desnaturação.

• O tampão Tris-HCl, de pH 9,5, teve a maior velocidade, ou seja, a maior eficácia. A menor velocidade foi com o pH 11,5, Comprovada pelo do gráfico.

• A faixa de pH 7,5 – 9,5 do tampão Tris-HCl apresentou as maiores velocidades e o tampão borato-NaOH, na faixa de pH 9,5 à 11,5, apresentou as menores velocidades, portanto ele possuía a menor eficiência para a enzima.

c. Influência da Temperatura

• A enzima apresentou maior atividade (velocidade) na temperatura de 37°C, indicando assim uma temperatura ótima.

• Como era de se esperar, a temperaturas muito altas ou muito baixas, a atividade enzimática é reduzida.

• A temperatura de 68°C ocasionou em uma desnaturação da enzima, resultando na redução da velocidade, no entanto, ela ainda apresentou uma pequena atividade, observada no gráfico e na prática (tubo estava um pouco amarelo, indicando presença de produto).

d. Curso Temporal

• O aumento do tempo de incubação ou reação faz com que aumente a concentração do produto formado é representado pela faixa linear progressiva do gráfico.

• À medida que a reação prossegue, a velocidade de formação de produto vai diminuindo, porque o substrato vai acabando, pois foi consumido pela enzima. O gráfico, portanto é modificado, já que a formação de produto perde velocidade.

e. Curva de Substrato:

• Quando a concentração de substrato é pequena, a velocidade inicial é diretamente proporcional à concentração do substrato [PNPP], visto pela faixa linear do gráfico da curva de substrato obtido. Quando a concentração de substrato aumenta a enzima se encontra saturada por ele, e a velocidade não depende mais da concentração (nesse ponto a velocidade tende à máxima, ou seja, Vmax).

• A curva que representa a presença do inibidor demonstrou valores de velocidades muito inferiores às velocidades da curva sem inibidor, indicando a eficiência inibitória.

f. Importância dos tubos brancos nos experimentos

• No tubo branco, a concentração de PNP (produto) é nula, então calibrando o espectrofotômetro em absorbância “0”, ou seja, transmitância “100”, então ele pode afirmar que nesse tubo a absorbância é 0 (zero) e a partir daí atribuir valores de absorbância ou transmitância ao tubos com produto formado. Somente com o uso desse tubo, os valores de absorbância dos tubos seguintes puderam ser coerentes com as suas concentrações.

g. Duplo-Recíproco:

• A partir da construção do gráfico duplo-recíproco não foi possível identificar o inibidor correto.

• revelou-se um inibidor misto, afetando tanto o KM quanto a velocidade máxima da reação.

• De acordo com o observado no gráfico o inibidor revelou-se um inibidor misto, afetando tanto o KM quanto a velocidade máxima da reação, pois o Km aumentou e Vmáx diminuiu.

VII – CONCLUSÃO FINAL:

• Atingimos o objetivo, comprovamos que alterações do meio em que está a enzima e o substrato interferem na cinética enzimática.

• As teorias, dadas em sala de aula, foram compreendidas e provadas através da prática de enzimas.

VIII – BIBLIOGRAFIA:

• BERG, Jeremy M., TYMOCZKO, John L., STRYER, Lubert. Bioquímica. 5ª edição. Editora Guanabara-Koogan. Rio de Janeiro, 2004.

• STRYER, Lubert. Bioquímica. 4ª edição. Editora Guanabara-Koogan. Rio de Janeiro, 1996.

• LEHNINGER, Albert L. Bioquímica – Compontentes moleculares da célula. 2ª edição. 6ª reimpressão Ed Edgard Blücher ltda. São Paulo, 1967.

• CHAMPE, Pámela C. & HARVEY, Richard A. Bioquímica Ilustrada. 2ª edição. 7ª reimpressão. Editora Artmed. Porto Alegre, 1996.

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