Biomateriais – Propriedades e AvaliaçãoPROGRAMAÇÃO CURSO TNM-5783-2017

Viabilidade Celular | Patricia Santos Lopes | UNIFESP

O que são biomateriais?

https://www.researchgate.net/figure/Translational-quest-for-next-generation-biomaterials_fig1_307940875

Biomaterial

• O termo biomaterial engloba todos os

materiais usados para aplicações

médicas que estejam em interfaces

com sistemas vivos ou outros

sistemas desenvolvidos para uso

extra corpóreos

• Os biomateriais incluem metais,

cerâmicas, polímeros naturais

(biopolímeros), polímeros sintéticos

de estrutura simples ou complexas, e

compósitos

Avaliação da segurança desses biomateriais

ou biocompatibilidade

MÉTODOS PARA A AVALIAÇÃO DA BIOCOMPATIBILIDADE

• A avaliação da biocompatibilidade de

materiais e dispositivos consiste

numa sequência de testes que

incluem testes in vitro, testes ex-

vivo, in silico, in vivo (modelos

animais) e ensaios clínicos

• Os procedimentos e metodologias

detalhadas para estes testes, estão

disponíveis em publicações da ISO,

ASTM, NIH, FDA, ANVISA, OECD e

várias outras sociedades profissionais

https://en.uit.no/forskning/forskningsgrupper/gruppe?p_document_id=520078

BIOCOMPATIBILIDADE DO DISPOSITIVO

• A caracterização in vitro = é um pré-

requisito que deve ser avaliado antes

da avaliação de sua biocompatibilidade

final

• Materiais e dispositivos que não

passarem por estes pré-requisitos

não deveriam ser avaliados em sua

biocompatibilidade final.

ISO 10993 - Biological evaluation of medical devices

• ISO 10993-1:2009 Part 1: Evaluation and testing in

the risk management process

• ISO 10993-2:2006 Part 2: Animal welfare requirements

• ISO 10993-3:2003 Part 3: Tests for genotoxicity,

carcinogenicity and reproductive toxicity

• ISO 10993-4:2002/Amd 1:2006 Part 4: Selection of

tests for interactions with blood

• ISO 10993-5:2009 Part 5: Tests for in vitro

cytotoxicity

• ISO 10993-6:2007 Part 6: Tests for local effects after

implantation

• ISO 10993-7:2008 Part 7: Ethylene oxide sterilization

residuals

• ISO 10993-8:2001 Part 8: Selection of reference

materials (withdrawn)

• ISO 10993-9:1999 Part 9: Framework for identification

and quantification of potential degradation products

• ISO 10993-10:2010 Part 10: Tests for irritation and

delayed-type hypersensitivity

• ISO 10993-11:2006 Part 11: Tests for systemic toxicity

• ISO 10993-12:2012 Part 12: Sample preparation and

reference materials (available in English only)

• ISO 10993-13:1998 Part 13: Identification and

quantification of degradation products from

polymeric medical devices

ISO 10993 - Biological evaluation of medical devices

• ISO 10993-14:2001 Part 14: Identification

and quantification of degradation products

from ceramics

• ISO 10993-15:2000 Part 15: Identification

and quantification of degradation products

from metals and alloys

• ISO 10993-16:1997 Part 16: Toxicokinetic

study design for degradation products and

leachables

• ISO 10993-17:2002 Part 17:

Establishment of allowable limits for

leachable substances

• ISO 10993-18:2005 Part 18: Chemical characterization of materials

• ISO/TS 10993-19:2006 Part 19: Physico-chemical, morphological and topographical characterization of materials

• ISO/TS 10993-20:2006 Part 20: Principles and methods for immunotoxicology testing of medical devices

• ISO/TR 15499:2012 Guidance on the conduct of biological evaluation within a risk management process

• Citotoxicidade do extrato, direta ou indireta

• Sensibilização dérmica ou de mucosa

• Irritação cutânea primária, irritação cutânea

cumulativa ou irritação intradérmica

Preparação de amostras

ISO 10993-12

Preparação da amostra de acordo com a ISO 10993

Example of planning a film extraction for use in biological safety trials regarding the indirect cytotoxicity.

Positive controls: Films containing zinc diethyldithiocarbamate (SPU-ZDEC), dibutyldithiocarbamate (SPU-

ZDBC) and/or natural rubber latex. Negative control: gauze.

Biomaterais

Preparação dos extratos líquidos

Meios de extração:

a) Meio polar: Água, Solução salina fisiológica, Meio de cultura sem soro;

b) Meio não polar: óleo recém refinado com grau farmacopeico.

c) Meio adicional: Etanol/água; etanol/solução salina; PEG 400 diluído, DMSO (0,5%), Meio de cultura com soro (preferencial – não polar)

USAR O EXTRATO IMEDIATAMENTE SEM TRATAMENTO

Testes In vitroCitotoxicidadeToxicidade – nível celularISO 10993-5

Citotoxicidade

• Extrato – preferencialmente em meio de cultura com soro ou solução

fisiológica. Tempo de extração 37º C por 24h (impede a degradação do meio

de cultura e do soro). Pode ser feita apenas do extrato (100%) ou uma curva

de diluição.

• Direta – colocação da amostra sobre a monocamada de células ou células

em suspensão, ou colocação da células sobre o biomaterial.

• Indireta – utilização de ágar contendo as células e colocação das amostras

sobre o ágar.

Métodos de determinação da citotoxicidade

• 1. Exclusão do corante (Dye exclusion):

Trypan blue, eosina, Congo red,

erythrosine B;

• 2. Métodos colorimétricos (Colorimetric

assays): MTT, MTS, XTT, WST-1, WST-8,

LDH, SRB, NRU e Cristal violeta;

• 3. Métodos fluorimétricos (Fluorometric

assays): alamar Blue e CFDA-AM;

• 4. Método de luminescência

(Luminometric assays): ATP e real-time

viabilidade.

http://dx.doi.org/10.5772/intechopen.71923

Quais as vantagens e

desvantagens de cada método?

A partir das amostras preparadas - plaqueamento

Ensaios Biológicos: citotoxicidade

Citoxicidade

CULTURA CELULAR

FIBROBLASTO DE

CAMUNDONGO BALB 3T3, L929,

CHO, QUERATINÓCITOS

HUMANOS ou outras células,

SUBCONFLUÊNCIA DE 80%

20000

CÉLULAS

/POÇO DA

PLACA DE

96 POÇOS.

Exemplo da disposição das concentrações

na placa e coloração após o uso do

Neutral Red (corante vital).

OECD 129 (2010)

Citotoxicidade

• Leitura em Microplate reader (Multiskan EX 355, Thermo Electron Corporation)

em 540nm (NR)

RESULTADOS

1E-3 0,01 0,1 1 10

-60

-40

-20

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

Via

bilid

ade

celu

lar (

%)

Concentração Dypterix alata (mg/mL)

solv

curvaA

curvaB

DOI: 10.1002/app.48763

ATLA 39, 189–196, 2011

Enquanto para substâncias químicas em geral o ideal é 90 % de viabilidade celular (IC10),

para os biomateriais , de acordo com a ISO 10993-5, o ideal é que o extrato (método

indireto), ou o material (método direto), apresentem no mínimo, 70% de viabilidade celular

(IC 30). Avaliação qualitativa é feita no método direto ou no indireto = morfologia das células

Resultados

DOI:

10.1557/jmr.2018.463

International Journal of Biological Macromolecules 152

(2020) 803–811

Avaliação Biológica : método direto e Adesão Celular

Amostras e

Lamínulas foram

encaixadas nos

poços da placa de

24 poços

Cultivo celular

2,5x104 céls/poço

Balb/c 3T3

24hFixação

DAPI

Amostras

transferidas para

uma nova placa

Avaliação Biológica : Adesão Celular

EP

ICLO

RID

RI

NA

CO

NT

RO

LE

Controle Epicloridrina

Scaffolds

C EA

B

Controles de

Células

D F

Amostras coradas com DAPI aumento de 100x. A: Controle de células, lamínula com células Balb/c 3T3 antes da ativação do fluoróforo.B: Controle de

células (mesmo campo de A) após ativação do fluoróforo. C: Scaffold Controle (quitosana) sem aplicação de células. D: Scaffold Controle (quitosana)

com aplicação de células. E: Scaffold Reticulado com Epicloridrina sem aplicação de células. F: Scaffold Reticulado com Epicloridrina com aplicação de

células.

Adesão e Proliferação Celular - Resultados

Testes in vitrotestes de sensibilização e irritação dérmica

ISO 10993-10

Irritação X sensibilização

• Irritação: Processo inflamatório que ocorre na área de contato com o produto, podendo ocorrer após a

primeira aplicação (irritação primária) ou com a continuidade do uso (irritação acumulada). É determinada

por um dano tecidual agudo ou crônico de intensidade variada. É dependente da concentração dos

ingredientes no produto final, da formulação como um todo, quantidade aplicada, frequência e modo de

aplicação (SAM-PAIO & RIVITTI, 2007).

• Sensibilização: Processo inflamatório que envolve mecanismo imunológico, do tipo celular, com tempo de

contato variável, de alguns dias ou mesmo alguns anos, até que o organismo reconheça um ou mais

ingredientes como alergênico. Em geral, é uma resposta que não ocorre nas primeiras aplicações, a não

ser que o indivíduo já se encontre sensibilizado a um dos ingredientes do produto, podendo aparecer em

outra área, diferente da área de aplicação. O processo alérgico pode decorrer tanto em função dos

ingredientes isolados, quanto da interação entre eles no produto, formando novo componente (SAMPAIO;

RIVITTI, 2007).

• As respostas de irritação e sensibilização do ponto de vista clínico são semelhantes, caracterizadas pela

ocorrência de um ou mais dos seguintes sinais clínicos: eritema, edema, pápula e pústula. Diferenciam-se

pelo fato da irritação ser dose dependente, enquanto que a sensibilização não: o indivíduo uma vez

sensibilizado desenvolverá a reação a toda exposição ao(s) ingrediente(s) (SAMPAIO; RIVITTI, 2007).

Modelos de Pele equivalentes

• Epiderme humana reconstruída – RHE (reconstructed human epidermis

• Queratinócitos humanos estratificados

• Episkin (L’óreal); Epiderm (Mattek )

• Modelo de pele completa – LSEs – living skin equivalentes

• Epiderme

• Derme

• Strata test (Stratatech – USA); Graftskin (Organogenesis); mattekepiderm ft (Mattek)

Conceitos Importantes

https://www.biocompare.com/3464-Tech-Insights/563796-More-Like-Life-Microporous-Membrane-Based-Culture-Systems/?arev=true

Transwell

https://www.biocompare.com/3464-Tech-Insights/563796-More-Like-Life-Microporous-

Membrane-Based-Culture-Systems/?arev=true

Episkin (L`Oreal) EpiDerm™ Skin Model

• suporte de colágenos

• queratinócitos de cultura

de 3 dias

• diferenciação em meio

ar/líquido

Modelo in house de Equivalente Dermo-epidérmico

Preparo da Derme

MOSCA, RC ; ISAAC, C. ; MATHOR, MB . The Mesenchymal Stem Cells Bioengineered Tissue Using Cobalt-60 Radiation. The Online Journal of Scientific Posters, v. 11, p. EP11682, 2012.

Preparo do Substituto

Colágeno Humano

Hidrogel

Gel de fibrina

Biomaterais para substituição da derme de cadáver

Testes de sensibilização

OECD 442C, D, E, A

Adverse outcome pathway” (AOP)

• Efeitos adversos – gerando os testes de segurança

• Uma AOP é um modelo que liga a exposição de uma

substancia aos efeitos tóxicos, por meio da

identificação da sequencia bioquímica de eventos

necessários para produzir o efeito tóxico

Diagrama de fluxo das vias associadas com a sensibilização cutânea

Fonte: adaptado de OECD, 2014.

AOP – Skin Sensitization

Skin Sensitization

• OECD TG 442C (2015) - Direct Peptide Reactivity Assay addressing the first

key event of the skin sensitization;

• OECD TG 442D (2018) – ARE - Nrf2 Luciferase Test Method addressing the

second key event of the skin sensitization.

• OECD TG 442E (2018) - In Vitro Skin Sensitisation - The third key event is

the activation of dendritic cells (DC) typically assessed by expression of

specific cell surface markers, chemokines and cytokines.

• The fourth key event is T- cell proliferation, which is indirectly evaluated in the

murine Local Lymph Node Assay (LLNA) (OECD 442 A, 2010).

In silico

• A metodologia in silico pode ser associada aos outros métodos in vitro de forma a produzir uma abordagem

ainda mais exata e precisa.

• Conhecimento acerca da estrutura de substâncias químicas e suas respectivas atividades e a semelhança

entre substâncias, é possível desenvolver relações de estrutura-atividade (quantitativas) [(Q)SARs],

capturá-las em ferramentas computacionais e predizer a atividade de um composto sobre o qual ainda não

se tem dados ou cujos dados são escassos a partir de outro composto parecido, porém sobre o qual já se

possui muitos dados (CRONIN et al., 2009; GRINDON et al., 2008).

• OECD vem trabalhando em conjunto com a European Chemicals Agency (ECHA), desde 2005, numa

ferramenta computacional, a OECD QSAR Toolbox.

• Predição do potencial de sensibilização cutânea = softwares já amplamente aceitos, como o DEREK

(Deductive Estimate of Risk from Existing Knowledge), TOPKAT (Toxicity Prediction by Komputer Assisted

Technology) e OASIS/TIMES (Tissue Metabolism Simulator) (GRINDON et al., 2008). Existem, ainda,

programas de computador capazes de estimar características físico-químicas, biofarmacêuticas, de

metabolismo e toxicidade de substâncias químicas como o ADMET Predictor™, da empresa americana

Simulations Plus (SIMULATIONS PLUS, 2020).

IRRITAÇÃO/CORROSÃO DÉRMICAIn Vitro Skin Corrosion: Human Skin Model Test

(OECD -431, 2004)

• Sistema teste: modelo in vitro de pele humana

• Princípio: substâncias corrosivas têm a capacidade de reduzir a viabilidade celular. Avaliar a capacidade da substância teste em penetrar no estrato córneo do modelo de pele humana*, por difusão ou erosão, e causar citotoxicidade nas camadas celulares inferiores.

• Corrosivo

• - viabilidade W 50%, após 3 min

• - viabilidade Y 50%, após 3 min e W

15%, após 1 hora

• Não-corrosivo:

• - viabilidade Y 50%, após 3 min

• - viabilidade Y 15%, após 1 hora

Corrosão/irritação dérmica

CORROSÃO/IRRITAÇÃODÉRMICA

• Definições:

• Corrosão dérmica: produção de danos irreversíveis a pele, como necrose visível

na epiderme e derme após aplicação da substância teste

• Irritação dérmica: produção de danos reversíveis na pele após aplicação da

substância teste

• Substâncias corrosivas são aquelas capazes de causar destruição visível ou

alterações irreversíveis em tecidos vivos no sítio de contato.

• Teste in vivo utiliza coelhos. Exposição de 3 minutos, 1 e 4 horas.

CORROSÃO/IRRITAÇÃODÉRMICA

• In Vitro Skin Corrosion: Transcutaneous Electrical Resistance Test (TER): em

pele de rato

• In Vitro Skin Corrosion: Human Skin Model Test

• EPISKIN

• EpiDerm

IRRITAÇÃO/CORROSÃO DÉRMICAIn Vitro Skin Corrosion: Human Skin Model Test

• Sistema teste: modelo in vitro de pele humana

• Princípio: substâncias corrosivas têm a capacidade de reduzir a viabilidade celular.

Avaliar a capacidade da substância teste em penetrar no estrato córneo do modelo

de pele humana*, por difusão ou erosão, e causar citotoxicidade nas camadas

celulares inferiores.

EPISKIN™

• Modelo tridimensional da pele humana –

L`Oreal

• Substância aplicada sobre o material

• Líquidos – 50 L, sólidos – 20 mg

• 3, 60 e 240 minuto

• Viabilidade celular = MTT

• 35% de decréscimo na viabilidade celular

indica corrosividade na pele humana.

EpiDerm™

• MatTek Corporation

• Mecanicamente e funcionalmente parecida com o EPISKIN™.

• Líquidos e semi-sólidos = 50 L

• Sólidos = 25 mg + 25 L de água

• 3 e 60 minutos

• MTT

• Corrosivo se induzir 50% decréscimo de viabilidade celular em 3 minutos ou 85% a 60 minutos

TER em fragmentos de pele de rato

• Mede-se a resistência elétrica transcutânea após a aplicação da substância teste

• Materiais corrosivos provocam perda da integridade da função barreira do estrato córneo

• Pele de Ratos

• Líquido = 150 L; sólidos = 100 mg + 150 L de água

• 2 e 24 horas

ISO/TS 10993-20:2006 Part 20: Principles and methods for immunotoxicology testing of medical devices

É possível montar um sistema

in vitro para avaliar a

imunotoxicologia dos

biomateriais ?

Skin Tissue Models. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-810545-0.00015-2

Novas abordagens

Hipóteses

Clinical Pharmacology: Advances and Applications 2016:8

163–176

Cultural evolution: Towards more predictive

in vitro models of biological systems

Making in vitro models more biologically relevant— and therefore

more predictive—requires continuous evaluation and redesign of

our ‘gold standard’ environments for cell and tissue culture

Ross Booth, Ph.D., Jun Park, Ph.D., Cindy Chen, Ph.D., Robin Clark, Ph.D., MilliporeSigma

Bioimpressoras

https://3dprintingindustry.com/news/biogelx-commences-

international-strategy-launching-3d-bioprinting-material-in-

brazil-163028/

Bioprinting – contrução de tecidos com

precisão de posicionamento das células

Electrospinning – tecidos funcionais

com materiais biocompatíveis

Conclusão

• Citotoxicidade primeiro teste biológico a ser realizado nos novos

biomateriais;

• Utilização de testes in vitro prioritariamente;

• Publicação com os testes in vitro = validação de métodos in vitro;

• Busca por novos testes alternativos ao uso de animais;

• In silico?

• Modelos imunotoxicológicos ?

• Bioimpressora?

Referências

• 3D bioprinting of skin tissue: From pre-processing to final product evaluation. 10.1016/j.addr.2018.07.016

• Construction of three-dimensional dermo-epidermal skin equivalents using cell coating technology and their utilization asalternative skin for permeation studies and skin irritation tests. DOI: 10.1089/ten.TEA.2016.0529

• Skin models for the testing of transdermal drugs. https://doi.org/10.2147/CPAA.S64788

• Advances in the Biofabrication of 3D Skin in vitro: Healthy and

• Pathological Models. doi: 10.3389/fbioe.2018.00154

• Alternatives to Biological Skin in Permeation Studies: Current Trends and Possibilities. doi:10.3390/pharmaceutics12020152

• Design and Fabrication of Human Skin by Three-Dimensional Bioprinting. DOI: 10.1089/ten.tec.2013.0335

• Fully Three-Dimensional Bioprinted Skin Equivalent Constructs with Validated Morphology and Barrier Function. DOI:10.1089/ten.tec.2018.0318

• A Method for Determination and Simulation of Permeability and Diffusion in a 3D Tissue Model in a Membrane InsertSystem for Multi-well Plates. URL: https://www.jove.com/video/56412. DOI: doi:10.3791/56412

• Immunocompetent human in vitro skin models. doi.org/10.1016/B978-0-12-810545-0.00015-2

Agradecimentos

Obrigada !!!!

patricia.lopes@unifesp.br

https://twitter.com/runawaylabbook/status/781509546728628224

https://www.glasbergen.com/ngg_tag/skin-cells/

https://br.pinterest.com/pin/137289488750243536/

https://www.pinterest.dk/pin/34269647137431107/