Universidade de Brasília

Instituto de Ciências Biológicas Departamento de Biologia Celular

Pós-Graduação em Biologia Molecular

Biofortificação de Plantas de Alface

(Lactuca sativa L.) Geneticamente Modificadas

para Aumento do Teor de Folato

Aline Costa Santos Nunes

Orientador: Prof. Dr. Francisco José Lima Aragão

Brasília

Abril de 2009

ii

Universidade de Brasília

Instituto de Ciências Biológicas Departamento de Biologia Celular

Pós-Graduação em Biologia Molecular

Biofortificação de Plantas de Alface

(Lactuca sativa L.) Geneticamente Modificadas

para Aumento do Teor de Folato

Aline Costa Santos Nunes

Tese apresentada ao Departamento de

Biologia Celular, curso da Pós-Graduação

em Biologia Molecular como parte do

requisito à obtenção do título de Doutora em

Biologia Molecular.

Orientador: Prof. Dr. Francisco José Lima Aragão

Brasília

Abril de 2009

iii

Universidade de Brasília

Instituto de Ciências Biológicas Departamento de Biologia Celular

Pós-Graduação em Biologia Molecular

Biofortificação de Plantas de Alface

(Lactuca sativa L.) Geneticamente Modificadas

para Aumento do Teor de Folato

Aline Costa Santos Nunes

Tese apresentada ao Departamento de Biologia Celular, curso da Pós-Graduação em Biologia Molecular como parte do requisito à obtenção do

título de Doutora em Biologia Molecular.

Aprovada por

________________________________________ Dr. Francisco José Lima Aragão

________________________________________

Dra. Lidia Maria Pepe de Moraes

_________________________________________ Dra. Vera Tavares de Campos Carneiro

_________________________________________

Dr. Cristiano Lacorte

_________________________________________ Dr. Thales Lima Rocha

iv

Dedicatória

Dedico à minha filha Letícia, que nasceu durante a realização desta Tese, por

iluminar meus dias e noites com lindos sorrisos,

à meu marido Antônio Carlos, por acreditar em mim e

estar sempre ao meu lado,

à minha mãe e nonna Nara, por minha educação e por

nos dar amor e carinho incondicionais,

à meu pai e nonno Alfranci, por minha educação e por ser um exemplo de

dedicação e perseverança.

v

Agradecimentos

Letícia, te agradeço por ter aberto mão do tempo comigo para que eu pudesse concluir este trabalho

e sempre me esperar, quando acordada, com um sorriso meigo e alegre, sem cobranças nem culpas

apenas carinho e amor.

Antônio Carlos, meu gi, por estar sempre ao meu lado, me apoiando, incentivando e ser parte da

minha vida há mais de 17 anos.

Nara, minha mãe e nonna da Letícia, por dar a base da educação que tenho hoje, me aconselhar, me

dar força, pelo amor e carinho incondicionais durante toda a minha vida.

Alfranci, meu pai e nonno da Letícia, por me apoiar, me incentivar, me educar e ser um exemplo de

perseverança e dedicação.

Rafael e Alexandre, meus irmãos, por torcerem por mim sempre, e por compreenderem minhas

ausências.

Ao Dr. Prof. Francisco José Lima Aragão, que acreditou em mim e neste projeto, por me orientar e

ser um amigo.

Ao Dr. Elíbio, Dr. Giovanni e Dr. Cristiano Lacorte pelo apoio, orientações e conselhos durante a

realização deste trabalho.

Aos amigos do Laboratório de Transferência de Genes da Embrapa Recursos Genéticos e

Biotecnologia pelas conversas, ajudas e incentivos. Agradeço especialmente à Danielle C.

Kalkmann, amiga e excelente estagiária, Andréa, André, Aisy, Bárbara Dias, Elsa, Emanuel,

Fernanda, Helena, Luís, Maria Laine, Nicolau Brito, Paula, Sharon, Taina, Thaís, Warley e

Welcimar.

Ao pessoal do laboratório de integração praga-planta, em especial ao Dr. Thales Rocha, Ariane F.

Lacerda, Caroline de A. Bezerra e Raquel S. de Oliveira pela ajuda com a análise de Western blot.

À Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia pela disponibilidade das instalações físicas,

equipamentos e pela capacitação de recursos humanos.

Ao Programa de Pós-Graduação da Biologia Celular e Molecular da Universidade de Brasília pela

oportunidade de desenvolver este trabalho.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nivel Superior (CAPES) pelo suporte

financeiro.

Ao Instituto Sabin pelas análises de quantificação de folato por quimioluminescência.

Enfim, a todos aqueles que de uma maneira direta ou indireta, estiveram presentes e participaram

desta grande conquista, o meu muito obrigado.

vi

Índice Dedicatória_________________________________________________________ iv

Agradecimentos ______________________________________________________ v

Índice _____________________________________________________________ vi

Abreviaturas & Símbolos _____________________________________________ ix

Índice de figuras e tabelas ____________________________________________ xii

Resumo __________________________________________________________ xiiii

Abstract _________________________________________________________ xiiiii

Capítulo 1 ___________________________________________________________ 1

Introdução __________________________________________________________ 1

1.1. O Folato ___________________________________________________________________ 1

1.1.1. Breve histórico, composição e funções _______________________________________ 1 1.1.2. Biossíntese de folato em planta _____________________________________________ 5 1.1.3. Quantificação de folato em plantas ________________________________________ 11 1.1.4. Doenças associadas à deficiência de folato ___________________________________ 13

1.2. A Alface __________________________________________________________________ 18

1.2.1. Doenças e pragas que atacam a cultura de alface _______________________________ 21

1.3. Método de transformação genética mediado por Agrobacterim tumefaciens __________ 24

1.3.1. O gênero Agrobacterium ___________________________________________________ 25

1.3.2. Ocorrência da doença _____________________________________________________ 26

1.3.3. Biologia do processo infeccioso ______________________________________________ 27

1.3.4. Agrobacterium como vetor de transformação de plantas _________________________ 35

1.3.5. Sistema de transformação __________________________________________________ 36

1.4. Método de transformação genética mediado pelo processo biobalístico ______________ 37

1.4.1. Os sistemas ______________________________________________________________ 38

1.4.2. As micropartículas ________________________________________________________ 40

1.4.3. Parâmetros físicos importantes _____________________________________________ 41

1.4.4. Os vetores _______________________________________________________________ 43

1.4.5. Transformação de meristemas apicais ________________________________________ 44

1.4.6. Transformação cloroplasmática _____________________________________________ 45

1.4.7. Inoculação de vírus e viróides _______________________________________________ 46

1.4.8. Diolística ________________________________________________________________ 46

1.5. Método de transformação genética por eletroporação de protoplasto _______________ 47

1.6. Engenharia genética de alface ________________________________________________ 49

1.7. Engenharia genética para biofortificação de plantas _____________________________ 51

vii

1.8. Objetivo geral _____________________________________________________________ 56

1.8.1. Objetivos específicos ______________________________________________________ 56

Capítulo 2 __________________________________________________________ 57

Aumento da expressão de GTP ciclohidrolase I em plantas de alface _________ 57

2.1. Introdução ________________________________________________________________ 57

2.2. Materiais & Métodos _______________________________________________________ 58

2.2.1. Construção do vetor para transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens __ 58

2.2.2. Transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens ________________________ 59

2.2.2.1. Preparo de Agrobacterium tumefaciens sepa EHA105 _________________________ 59

2.2.2.2. Transformação da Agrobacterium EHA105 com o gene de interesse (pCGCHI) ___ 59

2.2.2.3. Desinfestação e germinação de sementes ____________________________________ 60

2.2.2.4. Co-cultura alface-Agrobacterium ___________________________________________ 60

2.2.2.5. Seleção e crescimento das plantas __________________________________________ 61

2.2.3. Análise das plantas por reações em cadeia da polimerase (PCR) __________________ 61

2.2.3.1. Extração de DNA genômico das plantas para análise por PCR __________________ 61

2.2.3.2. A PCR ________________________________________________________________ 62

2.2.4. Análise de western blot ____________________________________________________ 62

2.2.4.1. Expressão de gchI em E. coli ______________________________________________ 62

2.2.4.2. Extração protéica de folhas de alface para western blot ________________________ 62

2.2.4.3. SDS-PAGE e western blot ________________________________________________ 63

2.2.5. Análise de folato em plantas pelo método microbiológico ________________________ 63

2.2.5.1. Crioproteção da cultura de Lactobacillus rhamnosus _________________________ 63

2.2.5.2. Extração de folato de folhas de alface _______________________________________ 64

2.2.5.3. Tratamento bi-enzimático dos extratos de folato ______________________________ 64

2.2.5.4. Quantificação de folato em folha de alface ___________________________________ 65

2.3. Resultados & Discussão _____________________________________________________ 66

Anexo _____________________________________________________________ 71

Nunes, A.C.S.; Kalkmann, D.C.; Aragão, F.J.L. (2009) Folate Biofortification of Lettuce by expression of a codon optimized chicken GTP cyclohydrolase I gene. Transgenic Research

(in press) ___________________________________________________________________ 71

Capítulo 3 __________________________________________________________ 79

Aumento da expressão de corismato sintase em plantas de alface ____________ 79

3.1. Introdução ________________________________________________________________ 79

3.2. Materiais & Métodos _______________________________________________________ 80

3.2.1. Construção do vetor para transformação plastidial por bombardeamento__________ 80

viii

3.2.2. Otimização dos parâmetros de transformação cloroplasmática por biobalística _____ 82

3.2.3. Transformação cloroplasmática por bombardeamento e regeneração das plantas ___ 83

3.2.4. Confirmação da inserção do transgene _______________________________________ 85

3.2.4.1. Extração de DNA genômico das plantas para análise por PCR __________________ 85

3.2.4.2. A PCR ________________________________________________________________ 85

3.2.5. Análise de folato em plantas pelo método microbiológico ________________________ 85

3.3. Resultados & Discussão _____________________________________________________ 86

Capítulo 4 __________________________________________________________ 92

Conclusões & Perspectivas ____________________________________________ 92

Referências Bibliográficas ____________________________________________ 94

ix

Abreviaturas & Símbolos

ACA anticardiolipina ACA-IgM anticorpo anticardiolipina ADC aminodeoxicorismato ADCS aminodeoxicorismato sintase ATP adenosina trifosfato BAP 6-benzilaminopurina CaMV vírus do mosaico da couve-flor cs corismato sintase CTB subunidade B da toxina do cólera CTB-GFP subunidade B da toxina do cólera com a proteína verde fluorescente CTB-Pins subunidade B da toxina do cólera com a proinsulina humana Cu cobre CSPD substrato quimiluminescente de marca registrada CTAB brometo de cetiltrimetilamônio DAMP 3-deoxi-D-arabino-heptulosonato-7-fosfato DHFS dihidrofolato sintase DHM dihidromonapterina DHN dihidroneopterina DMSO dimetilsulfóxido DNA ácido desoxirribonucléico FAAM folic acid assay medium (sigma) Fe ferro FIGLU ácido formiminoglutâmico FPGS folilpoliglutamato sintase g grama gchI GTP ciclohidrolase I Glu glutamato GTP guanosina trifosfato H4PteGlun 5,6,7,8-tetrahidropteroilpoliglutamatos HbsAg proteína de superfície do antígeno da hepatite B HPLC cromatografia líquida de alta performance (em inglês) IDR ingestão diária recomendada IFN-GFP interferon com proteína verde fluorescente IgG imunoglobulina IPTG Isopropil β-D-1-tiogalactopiranosida LeCS Lycopercicon esculentum corismato sintase M molar mA miliamperes Mg magnésio Mn manganês MTHFR 5,10-metilenotetrahidrofolato redutase NAA ácido naftaleno acético NaCl cloreto de sódio

x

NAD nicotinamida adenina dinucleotídeo nm nanometros oxdc oxalato decarboxilase PCR reações em cadeia da polimerase Pi fósforo inorgânico -P monofosfato -PP pirofosfato -PPP trifosfato pABA ácido para-aminobenzóico pb pares de base psi libra-força por polegada quadrada PteGlun pteroilpoliglutamato PTS proteína total solúvel PVDF difluorido polivinilideno PVP polivinilpirrolidona RNA ácido ribonucléico rpm rotações por minuto sCTN gene fusionado da subunidade B da toxina do cólera com um peptídio sinal

de retenção no retículo endoplasmático SDS-PAGE eletroforese em gel de poliacrilamida SERK Somatic Embryogenesis Receptor-like Kinase THF tetrahidrofolato tRNA RNA transportador UI unidades internacionais UV ultravioleta X-gluc 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-glucurônico Zn zinco

xi

Índice de figuras e tabelas Fig. 11- Estrutura química da forma monoglutamilada do folato (THF) ............................................................ 2 Fig. 21- Reações dependentes de folato e o fluxo de carbono na fotorespiração em plantas ........................... 3 Fig. 31- A via metabólica de biossíntese do folato em plantas ........................................................................... 6 Fig. 41- Via metabólica da fenilalanina, tirosina e triptofano, em destaque o ramo metabólico do chiquimato ao corismato ........................................................................................................................................................ 9 Tabela 1. Composição nutricional da alface (por 100 gramas de produto) ..................................................... 21 Fig. 51– Esquema biológico do processo infeccioso, mostrando todos os passos da transferência do DNA da bactéria para a planta hospedeira . .................................................................................................................. 28 Fig. 62– Esquema básico dos principais sistemas biobalísticos para transformação genética de plantas ...... 39 Fig. 71- Representação esquemática do T-DNA presente no vetor pCGCHI utilizado para transformar folhas de alface mediado por Agrobacterium tumefaciens ......................................................................................... 58 Fig. 81- Eletroforese em gel de agarose 12% mostrando os fragmentos de 461 pb amplificados por PCR do gene gchI de algumas plantas T0 ....................................................................................................................... 66 Fig. 91- Expresssão de GgGCHI em folhas de alface transgênicas. Western blot da expressão de GgGCHI em folhas de plantas transgênicas, fígado de galinha e E. coli detectados pelo uso de anticorpo anti-hGCHI ..... 67 Fig. 101- Quantificação de folato total em linhagens de alface transgênicas T3 e não transgênicas .............. 69 Fig. 112- Cassete de expressão do vetor pRL1000 usado na construção do vetor de transformação plastidial de alface ............................................................................................................................................................ 80 Fig. 121- Vetor de transformação plastidial pLeCS para bombardeamento de folhas de alface ................... 822 Tabela 2. Números de pontos azuis obtidos na expressão transiente do gene gus em folhas de alface. ...... 866 Fig. 131- Folhas de alface após o experimento com gene gus ........................................................................ 877 Fig. 141- Broto da planta ABD8, 5 semanas após o bombardeamento, saindo de uma intensa massa branca de células. ........................................................................................................................................................ 888 Fig. 152- Eletroforese em gel de agarose 12% mostrando os fragmentos de 1.100 pb amplificados por PCR do gene lecs de algumas plantas T3 ..................................................................................................................... 889 Fig. 161- Quantificação de folato de três linhagens transgênicas, de planta de alface não transformada e de planta de espinafre. ........................................................................................................................................... 90

xii

Resumo

O folato é uma vitamina do complexo B, solúvel em água, formada por

pterina, ácido para-aminobenzóico (pABA) e uma a oito partes de glutamato. Estudos

sugerem que sua deficiência em gestantes está relacionada ao aborto espontâneo, e no

feto a defeitos do tubo neural, anencefalia, anacefalia, coluna bífida, lábio leporino e

síndrome de Down, e estabelece uma relação entre dietas com níveis inadequados de

folato e o surgimento de defeitos congênitos, problemas para o desenvolvimento

cognitivo, aumento do risco de doenças cardiovascures, esquizofrenia, mal de

Alzheimer, anemia megaloblástica e depressão. A alface foi escolhida para ter o seu

teor de folato aumentado por ser uma hortaliça cultivada e consumida em todo o

mundo, in natura, e ter seu protocolo de transformação estabelecido. Foram

modificadas duas vias metabólicas do folato: a via das pterinas e a via do pABA. Para

isso dois sistemas em paralelo foram usados: um sistema mediado por Agrobacterium

tumefaciens em que foi transferida a região codificante do gene GTP ciclohidrolase I

(gchI), que catalisa o primeiro passo na via metabólica das pterinas. O gene do gchI

foi sintetizado baseado em uma seqüência de Gallus gallus com a otimização de

códons para expressão em alface, sob o controle do promotor 35S de CaMV

duplicado. Na via de síntese do pABA foi usado o sistema de bombardeamento, para

inserir a região codificante do gene Corismato Sintase (lecs) de tomate (Solanum

lycopersicum =Lycopercicon esculentum) no genoma cloroplasmático de alface. A

LeCS catalisa o primeiro passo desta via. 29 linhagens de alface contendo o transgene

gchI e 4 linhagens contendo o transgene lecs foram obtidas. Plantas da geração T1

foram analisadas para quantificação de folatos totais pelo método microbiológico com

Lactobacillus rhamnosus (ATCC7469). Os resultados mostram que houve um

aumento de até 8,5 vezes no teor de folato em linhagens transgênicas expressando

gchI e de 1,8 vezes nas linhagens transgênicas transformadas com lecs, quando

comparadas com plantas não transformadas. Essas linhagens serão utilizadas em

experimentos para a determinação da biodisponibilidade de folato em animais.

xiii

Abstract

Folate is a complex B vitamin, water-soluble, formed by pterine, para-aminonzoic

acid (pABA) and one to eight parts of glutamate. Some studies suggest that its

deficiency in pregnant women is related to miscarriage, and that in the foetus it is

related to defects of the neural tube, anencephalia, anacephalia, spine bifide, leporine

lip and Down syndrome, and establish a relation between diets with inadequate folate

levels and the appearance of congenital defects, problems in the cognitive

development, increase in the risk of cardiovascular diseases, schizophrenia,

Alzheimer´s disease, megaloblastic anemia and depression. The lettuce plant was

chosen to have its folate level increased because it is a vegetable cultivated and

consumed throughout the world, in natura, and because it has its transformation

protocol established. We have transformed two metabolic ways of folate: the way of

pterines and the way of pABA. For such purpose two systems have been used in

parallel: a system mediated by Agrobacterium tumefaciens in which we have

transfered the codifying region of the gene GTP ciclohidrolase I (gchI), which

catalizes the first step in the metabolic way of the pterines. The gene of the gchI was

synthetized based on a sequence of Gallus gallus with the optimization of codons for

the expression in lettuce, under control of the promoter 35S dCaMV. In the way of

pABA we used the bombardment system, in which we inserted the codifying region

of the gene corismato sintase (lecs) of tomato (Solanum lycopersicum =Lycopercicon

esculentum) in the lettuce chloroplastic genome, which catalyses the first step of this

pathway. We obtained 29 lineages of lettuce containing the transgene gchI and 4

lineages containing the transgene lecs. Plants of the generation T1 were analysed for

the quantification of total folates by means of the microbiological method with

Lactobacillus rhamnosus (ATCC7469). The results show there has been a increase in

up to 8.5 times in the folate level in transgenic lineages expressing gchI and 1.8 times

in transgenic lineages transformed with lecs, when compared to non transformed

plants. These lineages will be used in experiments for the determination of the

bioavailability of folate in animals.

1

Capítulo 1

Introdução

1.1. O Folato

1.1.1. Breve histórico, composição e funções

O folato é uma vitamina do complexo B solúvel em água, também conhecido

como ácido fólico, ácido pteroilmonoglutâmico, folacina ou vitamina B9. Descoberto

em 1931 por Lucy Wills, foi isolado pela primeira vez de folhas de espinafre em 1941

por Herschel K. Mitchell, Esmond E. Snell e R. J. Williams, e por isso foi chamado

inicialmente de folium (folha em latim) e posteriormente de ácido fólico (derivado de

folium). Em 1946 foi sintetizado pela primeira vez por Robert B. Angier, James H.

Boothe, Brian L. Hutchings na forma de pteroilmonoglutamato (Eskes, 2000).

O termo folato é usado para se referir aos folatos naturais das plantas ou

fortificados; e ácido fólico à todas as formas sintéticas ou suplementadas. Segundo a

Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), em sua Portaria n°32, de 13 de

janeiro de 1998, suplementos ou suplementos vitamínicos e ou de minerais, são

alimentos que servem para complementar com estes nutrientes a dieta diária de uma

pessoa saudável, em casos onde sua ingestão, a partir da alimentação, seja insuficiente

ou quando a dieta requerer suplementação. Devem conter de 25% a 100% da ingestão

diária recomendada (IDR) de vitaminas e ou minerais, na porção diária indicada pelo

fabricante, não podendo substituir os alimentos, nem serem considerados como dieta

exclusiva. Conforme Portaria n°31, de 13 de janeiro de 1998, alimento

fortificado/enriquecido ou simplesmente adicionado de nutrientes é todo alimento ao

qual for adicionado um ou mais nutrientes essenciais contidos naturalmente ou não no

alimento, com o objetivo de reforçar o seu valor nutritivo, prevenir ou corrigir

deficiências demonstradas em um ou mais nutrientes, na alimentação da população ou

em grupos específicos da mesma. De forma semelhante alimento restaurado ou com

reposição de nutrientes essenciais é todo alimento ao qual for adicionado nutriente

2

com a finalidade de repor, quantitativamente, aquele reduzido durante o

processamento e armazenamento do alimento.

Os folatos e seus derivados, conhecidos genericamente como folato, são

moléculas formadas por três partes, que consistem em pterina, pABA e uma a oito

partes de glutamato. O THF, monoglutamilado, possui apenas um resíduo de

glutamato e fórmula molecular C19H19N7O6 (fig. 1) (Eskes, 2000).

Fig. 11- Estrutura química da forma monoglutamilada do folato (THF). A maioria dos folatos em plantas tem uma cauda γ-poliglutamilada e até sete resíduos ligados ao primeiro glutamato. O anel pterínico pode existir em tetra- e di-hidro e nas formas totalmente oxidadas (De La Garza et al., 2004).

Bactérias, fungos e plantas sintetizam folato de novo por uma complexa via

metabólica que termina com a adição de resíduos de glutamato ATP-dependente

(adenosina trifosfato dependente). As células dos mamíferos não possuem a

habilidade de gerar folatos, portanto é fundamental que estes estejam presentes em

sua dieta (Konings et al., 2001; Scott et al., 2000). As principais fontes de folato são:

cereais, frutas (abacates, bananas, maçãs, tomates), frutas cítricas (laranjas e

grapefruit), folhas verdes (espinafres, brócolis, couve), sementes, frango, carne e

fígado crus. No entanto, os folatos estão presentes em pequenas concentrações em

plantas (tipicamente ≤ 5 nmoles por peso fresco). Segundo Johansson et al. (2007) a

quantidade de folato total presente em folhas de alface variam entre 30 e 198 μg por

100 g de peso fresco. Holasová et al. (2008) encontraram valores acima de 50 μg de

folato por 100 g de peso fresco de espinafre, repolho, alface, couve-flor e brócolis; e

menos de 25 μg/100 g em batatas, cenoura e pimenta. Konings et al. (2001)

quantificaram folato em vários alimentos utilizando HPLC (sigla em inglês para

cromatografia líquida de alta performance), encontrando valores de 65 μg de folato

por 100 g de brócolis, 100 μg de folato por 100 g de espinafre cru e 83 μg de folato

por 100 g de produto cozido, 8 μg de folato por 100 g de tomate fresco e 43 μg de

folato por 100 g de alface fresco. Os resultados de Konings et al. (2001) também

3

apontaram que não há diferença nos níveis de folato dos vegetais analisados com

relação à estação do ano, ou seja, não houve variação estatisticamente significante nos

níveis de folato relacionados à estação de crescimento da planta.

A absorção do folato ingerido compreende a conversão de poliglutamatos a

monoglutamatos por uma conjugase do jejuno. O folato na forma monoglutamilada

entra nas células do intestino e é completamente reduzido à THF por uma enzima

tetrahidrofolato redutase. O THF, folato derivado de pteroilpoliglutamato (PteGlun), é

a forma ativa do folato e pode ser transportado diretamente para a circulação ou ser

convertido a THF-poliglutamato que é estocado, ou a 5-metil THF monoglutamato, a

forma predominante do folato no soro e tecidos. Os locais de estocagem no corpo são

fígado, pâncreas, rins, cérebro e hemácias (Eskes, 2000).

O THF pode aceitar uma unidade de carbono da serina ou glicina para formar

5,10-metileno-tetrahidrofolato. Isto também ocorre para a síntese de timidilato que é

incorporado ao DNA, oxidado a formil-THF, usado para a síntese de purinas para

incorporação no RNA e DNA, ou reduzido a 5-metil-THF, usado na metilação da

homocisteína (Eskes, 2000) (fig. 2).

Fig. 21- Reações dependentes de folato e o fluxo de carbono na fotorespiração em plantas (Cossins, 2000; Sahr et al., 2005).

A homocisteína é um intermediário formado quando da metabolização do

aminoácido essencial metionina. O processo começa com a desmetilação de um

intermediário secundário sulfurado da metionina, a S-adenosilmetionina, dando

origem à homocisteína. A seguir, duas rotas são seguidas: a primeira regulada pela

concentração da vitamina B6, que visa à excreção da homocisteína pelos rins,

diminuindo sua concentração sérica e a segunda, responsável pelo retorno da

4

homocisteína à metionina, dependente da concentração de vitamina B12 e de folato.

Dessa forma, as vitaminas do complexo B são cofatores essenciais no metabolismo da

homocisteína, pois ambas as rotas são dependentes desses substratos. A ingestão

média diária de homocisteína deve ser responsável por manter a concentração sérica

na ordem de 10 mmol/L em homens adultos, mas dietas ricas em metionina e pobres

em vitamina B produzem a elevação dos níveis séricos desse aminoácido, chamada

hiperomocisteinemia, o que pode levar a algumas doenças (Eskes, 2000) (ver item

1.3.4. Doenças associadas à deficiência de folato).

Folatos metabolicamente ativos também contêm um número de resíduos γ-

glutamil e são chamados folilpoliglutamatos. O pool celular do 5,6,7,8-

tetrahidropteroilpoliglutamato (H4PteGlun) participa no metabolismo de um carbono

pela doação ou recepção de grupos carbono simples, com ordem de oxidação de

formil a metenil (fig. 2).

Os processos celulares das plantas e de outros organismos dependem muito do

metabolismo de um carbono mediado por THF poliglutamilados, que significa a

transferência de um carbono para diversos processos metabólicos. O folato é um co-

fator que age como um doador, bem como receptor destes grupos (Cossins, 2000). Os

processos celulares que requerem unidades de um carbono são: biossíntese de ácidos

nucléicos, biossíntese de aminoácidos e biogênese de grupo metil, essencial para a

divisão celular (Sousa et al., 2007). O que reforça a importância desta vitamina, vital

para o desenvolvimento e funcionamento normal do corpo (Eskes, 2000) (fig. 2).

A função primária do folato é prover unidades de carbono para a síntese de

três das quatro bases do DNA, guanina, adenina e timina. Os folatos normalmente

adquirem seus grupos C1 da serina ou do formato, e as enzimas da via de síntese de

purinas necessitam desse C1, que fica ligado ao tetrahidrofolato, para o inserirem

como C-2 ou C-8 do anel da purina. Igualmente, a conversão da uracila (RNA) em

timina (DNA), é realizada pela enzima timidilato sintase, que usa o cofator como seu

doador de C1 (Scott, 1999).

Alternativamente, o 5,10-metilenotetrahidrofolato usado pela timidilato sintase

pode ser direcionado para o ciclo de metilação. Esse ciclo assegura à célula um

suprimento adequado de S-adenosilmetionina, que age como um doador de grupos

metil para uma série de metiltransferases. Estas enzimas metilam uma série de

substratos de lipídeos, hormônios, DNA e proteínas (Scott, 1999)(fig. 2).

5

Humanos e outros mamíferos não podem produzir essa molécula, devendo

inseri-lo em sua dieta. Pelo fato de as plantas serem a maior fonte de folato e a

deficiência do mesmo ser um problema global, o aumento dos níveis de folato em

plantas é um alvo da engenharia metabólica (Basset et al., 2002).

1.1.2. Biossíntese de folato em planta

O fracionamento celular e estudos imunohistoquímicos nos últimos 40 anos

têm revelado a extensa compartimentalização do metabolismo das plantas. Em anos

mais recentes, novas tecnologias como espectrometria de massa e programas que

predizem seqüências de proteínas a partir de dados encontrados em bancos de dados

aceleraram o fluxo de informação (Lunn, 2007). De uma maneira geral, as proteínas

desempenham nas plantas função estrutural, enzimática, reguladora, de nutrição, de

defesa e de transporte, porém a localização intracelular da maioria das proteínas no

proteoma de plantas ainda é desconhecida ou incompleta (Lunn, 2007). Atualmente

sabe-se que todas as vias metabólicas das plantas estão interconectadas, e o maior

desafio dos bioquímicos é entender a regulação e o controle das redes metabólicas.

Para entender como funcionam as células dos eucariotos, é necessário entender não

apenas como o metabolismo e outros processos são compartimentalizados na célula,

mas também como eles são interligados e controlados. Entender este processo em

plantas é particularmente difícil pela presença de estruturas e compartimentos

adicionais, como plastídios, parede celular, plasmodesmata, apoplasto e vacúolos

(Lunn, 2007).

Como já mencionado, o folato é uma molécula formada por três grupos

funcionais: pterina, pABA e de um a oito resíduos de glutamato. Em plantas, o

resíduo de pterina, hidroximetildihidropteroato, é formado a partir de GTP no citosol,

enquanto o precursor pABA é sintetizado nos plastídios, ambos se unem na

mitocôndria ocorrendo subseqüentes condensação, glutamilação e redução, para a

síntese de THF (Basset et al., 2004; Hanson & Gregory III, 2002; Lunn, 2007) (fig.

3).

6

Fig. 31- A via metabólica de biossíntese do folato em plantas. Aminodeoxicorismato (ADC), ácido para-aminobenzóico (pABA), guanosina trifosfato (GTP), dihidropterina (H2Pterina), dihidropteroato (H2Pteroato), dihidrofolato (H2Folato), tetrahidrofolato (H4F-Glu1) formamidepirimidina nucleosídio trifosfato (FPNT), GTP ciclohidrolase I (GCHI), corismato sintase (cs), dihidroneopterina aldolase (DHNA), hidroximetildihidropterina pirofosfokinase (HPPK), dihidropteroato sintase (DHPS) dihidrofolato sintase (DHFS), dihidrofolato redutase (DHFR), folilpoliglutamato sintase (FPGS), resíduo de glutamato (Glu) (Cossins, 2000; Hanson & Gregory III, 2002; Sahr et al., 2005).

O folato é relativamente estável tanto na sua forma sintética quanto nas formas

existentes in vivo, quando está associado a proteínas e o anel pteridímico não é

reduzido (Scott, 1999). No entanto, os folatos são instáveis se expostos à luz (Hanson

& Gregory III, 2002), e até 50% de sua quantidade natural é destruída no cozimento,

processamento e estocagem dos alimentos. Essa degradação ocorre por oxidação, com

quebras que ocorrem entre o C-9 e o N-10, gerando resíduos de pterinas ou pABA-

glutamil (Scott, 1999). O tempo, a temperatura e o pH da água de cozimento são

alguns fatores responsáveis pelas perdas de folato dos alimentos (Dang et al., 2000).

As plantas compõem a principal fonte de folato em dietas humanas, mas muitas

frutas, tubérculos e grãos são pobres nesta vitamina, sendo sua deficiência um

problema mundial (De La Garza et al., 2004).

Apesar de sua baixa quantidade e suscetibilidade a alterações, o status de

folato em plantas mantem-se para grandes fluxos metabólicos. Por exemplo, na

fotorrespiração normal de uma folha C3, se 30% do folato total da folha participasse

7

na reação mitocondrial de conversão de glicina para serina, mediada por THF, um

pool de 1 nmol/g de folato deveria levar a um fluxo de carbono de 1-2 µmol/g/min,

isto é, a unidade C1 precisa retornar 20 a 30 vezes por segundo para ser reutilizada, o

que é diversas vezes mais rápido que o turnover de ATP nas folhas, que já é bastante

rápido (Hanson & Gregory III, 2002).

Os passos da via metabólica da síntese de folato em plantas não são totalmente

conhecidos, mas provavelmente são os mesmos encontrados em bactéria (Hanson &

Gregory III, 2002). Os poliglutamatos são as coenzimas preferidas no metabolismo de

um carbono, porque a afinidade das enzimas dependentes de folato aumenta

proporcionalmente ao número de resíduos de glutamato (Ravanel et al., 2001).

A ligação de glutamatos para a formação do folato envolve duas reações. A

primeira é catalisada pela dihidrofolato sintase (DHPS), que adiciona o primeiro

resíduo de glutamato ao grupo carboxil do dihidropteroato (DHP) para formar

dihidrofolato (DHF). Presente apenas em organismos que possuem a habilidade para

produzir THF de novo de 6-hidroximetildihidropterina, pABA e precursores de

glutamato (plantas, algumas bactérias, fungos e protozoários). A segunda é formada

por uma seqüência de ligações γ entre os resíduos de glutamato, uma reação catalisada

pela enzima folipoliglutamato sintase (FPGS) (Ravanel et al., 2001).

Dos quatorze passos para esta síntese, nove são mediados por enzimas

específicas. Os genes e enzimas de plantas para os cinco passos finais foram

caracterizados e as enzimas se mostraram mitocondriais, o que contraria sua primeira

localização citosólica em outros eucariotos (Hanson & Gregory III, 2002). Os

primeiros passos que produzem pterina e pABA são menos conhecidos em plantas, no

entanto, dados genômicos mostram que plantas têm uma enzima homóloga a de

bactérias na síntese de pterina, a GTP ciclohidrolase I (GCHI) e dihidroneopterina

aldolase (DHNA). As seqüências de resíduos de aminoácidos destas proteínas

parecem não possuir sinais de endereçamento para organelas específicas, e por isso

são presumivelmente citosólicas (Hanson & Gregory III, 2002) (fig. 3).

Dados genômicos também mostram que plantas têm homólogos da primeira

enzima da síntese de pABA, aminodeoxicorismato sintase (ADCS) e as proteínas

destas plantas têm domínios que correspondem a ambas as subunidades da enzima

bacteriana. A ADCS de planta tem peptídeos sinais de endereçamento para os

plastídios, o que é consistente com a síntese de corismato, o substrato da ADCS,

também ocorrer no cloroplasto (Hanson & Gregory III, 2002) (fig. 3). Por isso, são

8

necessárias reações coordenadas para a produção de folato nas plantas, ocorrendo três

passos de transporte de membrana que envolve três compartimentos celulares

distintos, o que é diferente em procariotos, onde as enzimas são predominantemente

citosólicas (Basset et al., 2002).

A via do chiquimato é responsável pela biossíntese de componentes

aromáticos em bactérias, leveduras, fungos e plantas (Herrmann & Weaver, 1999;

Roberts et al., 1998). A via do chiquimato é o precursor para a via de síntese de

corismato e envolve sete reações (fig. 4). A primeira envolve a condensação de dois

intermediários do metabolismo de carboidratos: fosfoenolpiruvato da glicólise e D-

eritrose-4-fosfato da via das pentose-fosfato, que é eventualmente convertido a

corismato, o último intermediário comum na síntese de três aminoácidos aromáticos

(fenilalanina, tirosina e triptofano). Esta reação é catalisada por 3-deoxi-D-arabino-

heptulosonato-7-fosfato (DAMP) sintase (fig. 4), que não é inibida pelo feedback de

qualquer dos resíduos de aminoácidos aromáticos formados, e é ativada por triptofano

e Mg+2. A segunda enzima, 3-dehidroquinato sintase (fig. 4), catalisa o primeiro passo

de ciclização, formando 3-dehidroquinato. Por meio da liberação de uma molécula de

água, a 3-dehidroquinato dehidratase catalisa a síntese de 3-dehidrochiquimato, que é

o substrato da enzima chiquimato desidrogenase para síntese de chiquimato (fig. 4). O

quinto passo é catalisado pela chiquimato quinase (fig. 4), que fosforila chiquimato a

chiquimato 3-fosfato. A penúltima enzima envolvida, a 3-fosfochiquimato-1-

carboxiviniltransferase (fig. 4) catalisa fosfoenolpiruvato a 5-O-(1-carboxivinil)-3-

fosfochiquimato e fosfato. E o último passo da via é a enzima corismato sintase (fig.

4) que catalisa 5-O-(1-carboxivinil)-3-fosfochiquimato para sintetizar o corismato e

fosfato, requerendo a redução do cofator nucleotídico flavina (Buchanan et al., 2002).

O corismato sintetizado pode ser direcionado à síntese de pABA, quinonas,

flavonóides e alcalóides, ou pode ser direcionado para as mitocôndrias para a síntese

de folato. Em todos os genes que codificam as enzimas da via do chiquimato se

encontrou peptídeos sinais de direcionamento para os cloroplastos (cTP) nos N-

terminais das regiões codificantes, corroborando que a via da chiquimato é realmente

localizada nos plastídios (Weaver & Herrmann, 1997).

9

Fig. 41- Via metabólica da fenilalanina, tirosina e triptofano, em destaque o ramo metabólico do chiquimato ao corismato (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) http://www.genome.ad.jp/kegg/pathway/map/map00400.html).

As plantas possuem também homólogos de enzimas que participam da síntese

de pterinas (que também formam folato), como a GTP cyclohydrolase I (GCHI) e a

dihidroneopterina aldolase (DHNA) (fig. 3). As seqüências de resíduos de

aminoácidos destas proteínas parecem não possuir sinais de endereçamento para

organelas específicas, e por isso são presumivelmente citosólicas (Hanson & Gregory

III, 2002), o que implica que a mitocôndria deve importar a pterina para produzir

folato do citosol da célula (Basset et al., 2002). O primeiro passo da síntese de pterina

é de interesse especial, pois envolve guanosina trifosfato (GTP), controlando o fluxo

da via de síntese de folato. Este passo, mediado por GCHI, é uma expansão complexa

do anel, que converte GTP a dihidroneopterina (DHN) trifosfato e formato (fig. 3)

(Basset et al., 2002). No segundo passo um pirofosfato é quebrado por

dihidroneopterina trifosfato sintase (DHPS), formando dihidroneopterina monofosfato

(Klaus et al., 2005). A seguir a dihidrofolato sintase (DHFS), presente exclusivamente

na mitocôndria, catalisa a síntese de dihidropteroato a 7,8 dihidrofolato. Este é

convertido a THF-monoglutamilado pela catalização da enzima dihidrofolato redutase

(DHFR) (fig. 3). Como último passo para a síntese das diferentes formas de folatos, a

folilpoliglutamato sintase (FPGS) catalisa as ligações entre a molécula de folato e os

10

resíduos de glutamato (Ravanel et al., 2001). FPGS está presente em diferentes

isoformas na mitocôndria, no citosol e no cloroplasto, com cada isoforma codificada

por um gene (fig. 3).

As enzimas da síntese de folato em Arabidopsis são codificadas por um a três

genes. Dados de EST (Expressed Sequence Tag) indicam uma situação similar em

outras plantas, porém, a abundância de ESTs para genes das enzimas de síntese de

folato é muito superior se comparado com o status do folato. Os ESTs de síntese de

NAD(-P), purinas e pirimidinas são similares, mesmo o status de folato sendo dez

vezes menor que de NAD(-P) e 100 a 200 vezes menor que de purinas e pirimidinas,

que implica em uma altíssima capacidade de síntese de folato. Esta capacidade talvez

ocorra devido: (1) ao retorno do pool de folato mitocondrial na fotorrespiração de

folhas ter que ser extremamente rápido, por não se encontrar complexado entre a

glicina decarboxilase e a serina hidroximetiltransferase, por isso pode ficar exposto à

matriz mitocondrial e a uma degradação química e (2) a constatação de que a luz

degrada o folato, por isso as folhas expostas à luz solar têm o seu folato rapidamente

degradado, o que implica em uma igualmente rápida síntese de folato (Hanson &

Gregory III, 2002). Por isso, a atividade das enzimas de síntese de folato da

mitocôndria são mais que suficientes para repor o pool mitocondrial de folato a cada

meia hora (Neuburger et al., 1996).

Em um estudo com A. thaliana, Ravanel et al. (2001) isolaram cDNAs que

codificam DHFS e três formas de FPGS, usaram mutantes deficientes na atividade

destas enzimas, mediram in vitro a incorporação de glutamato no dihidrofolato e

tetrahidrofolato e analisaram a função de cada uma destas enzimas. A conclusão que

chegaram é que DHFS está presente exclusivamente na mitocôndria, fazendo deste

compartimento o único local de síntese de dihidrofolato nas células das plantas. Já

FPGS está presente em diferentes isoformas na mitocôndria, no citosol e no

cloroplasto, sendo cada isoforma codificada por um gene separado, situação única

entre os eucariotos. Esta compartimentalização das isoformas está em acordo com a

predominância de derivados de tetrahidrofolato conjugados a γ-glutamil e a presença

de serina hidroximetiltransferases e C1-tetrahidrofolato interconvertendo enzimas no

citosol, mitocôndria e plastídios. A combinação do FPGS e estas reações mediadas

por folato pode suprir cada compartimento com coenzimas folato poliglutamilados,

necessárias nas reações de metabolismo de um carbono, além de sugerir que o

transporte das formas de folato não são conjugadas (Ravanel et al., 2001).

11

Ao que tudo indica o controle substancial da via metabólica do folato reside no

conhecimento e controle das enzimas das vias metabólicas de pterina e pABA

(principalmente, gchI e adcs) (Hanson & Gregory III, 2002).

1.1.3. Quantificação de folato em plantas

A determinação dos níveis de folato em plantas é complicada, devido ao

comprimento da cauda de poliglutamil, dos estados de oxidação do anel de pterina e

dos C substituintes. Além disso, as moléculas são suscetíveis a interconversão e

degradação oxidativa durante a extração das folhas e análise quantitativa. Assim, a

validade dos resultados analíticos depende muito do uso de um método apropriado de

extração, processamento do extrato e da quantificação (Hanson & Gregory III, 2002).

O folato total de alimentos é determinado após a extração, deconjugação de

poliglutamatos a monoglutamatos com o uso de uma conjugase (γ-glutamil hidrolase),

e de um método de quantificação (Pandrangi & LaBorde, 2004). Folatos podem ser

medidos por métodos de quimioluminescência, HPLC e ensaios microbiológicos. Os

métodos de quimioluminescência são comumente usados para determinação de folato

em sangue, e têm-se mostrado inadequados para determinação de folato total em

plantas, devido às diferenças entre as várias formas de folato e de afinidades entre a

molécula de folato e a proteína ligante usada no ensaio. O método HPLC proporciona

informação qualitativa e quantitativa, mas o preparo de padrões confiáveis é difícil

para medir folatos instáveis.

O método microbiológico utiliza Lactobacillus rhamnosus (ATCC 7469, = L.

casei) é o mais usado para quantificação de folato total (Hanson & Gregory III, 2002)

e possui alta sensibilidade (Gregory III et al., 1984). Entretanto, esse método possui

pouca precisão, porque o microrganismo não responde aos folatos poliglutâmicos,

respondendo apenas aos di e monoglutamilfolatos, é moroso e não diferencia entre as

principais formas de folato (Gregory III et al., 1984). Além disso, certos componentes

da planta em análise podem estimular ou inibir o crescimento da bactéria, resultando

em dados não confiáveis (Konings et al., 2001).

Os Lactobacillus são bactérias Gram positivas, anaeróbicas facultativas, que

preferencialmente crescem em meio microaerofílico. Elas são organismos fastidiosos,

que apenas crescem em meio contendo carboidrato como fonte de energia, além de

12

fontes de carbono, nucleotídeos essenciais, aminoácidos e vitaminas (Pandrangi &

LaBorde, 2004).

O método utiliza placas de Elisa para medição do crescimento da bactéria em

extratos de alimentos. O crescimento da bactéria é medido pela turbidez das amostras

após certo período de incubação. Um importante aperfeiçoamento na técnica é o uso

de culturas crioprotegidas em glicerol, pois se pode produzir a bactéria em larga

escala e congelá-las para posterior uso, o que gera economia de tempo e uniformidade

das alíquotas da cultura no uso (Tamura, 1990; Wilson & Horne, 1982). Mas, mesmo

com os avanços nesta análise, muitas vezes o organismo encontra dificuldades para

crescer. Além disso, as culturas crioprotegidas perdem a viabilidade após 2-3 meses,

tornando difícil a manutenção adequada das culturas.

A efetiva extração de folato é essencial para sua quantificação, e essa fase

pode ser dificultada nas plantas porque o folato pode estar em paredes celulares ou

ligadas a proteínas e resíduos de amido (Hanson & Gregory III, 2002). Outro passo

enzimático importante é a deglutamilação de folatos poliglutâmicos, uma vez que L.

rhamnosis responde mais a folatos com apenas três ou menos resíduos de glutamato

(Gregory et al., 1990). Similarmente, muitos métodos de HPLC requerem a completa

conversão do folato à forma monoglutâmica (Pfeiffer et al., 1997).

Alguns trabalhos demonstram um significante aumento nas medidas de folato

após um tratamento com algumas enzimas deglutamilantes: protease, α-amilase e

conjugase. Konings et al. (2001), em ensaio para quantificar folato de uma série de

alimentos, encontraram que extratos de fruta tratados bi-enzimaticamente com

protease e α-amilase, apresentaram concentrações 16% maiores de folato que os

exemplos não tratados. Da mesma forma, extratos tratados de produtos derivados de

leite apresentaram 21% a mais de folato na quantificação que os mesmos não tratados

com as enzimas. Examinando 12 diferentes tipos de cereais, Pfeiffer et al. (1997)

encontraram que no tratamento trienzimático a quantidade de folato foi em média

19% maior que nos extratos tratados apenas com a conjugase. Holasová et al. (2008),

encontraram maior eficiência na determinação de folato em espinafre, repolho e

brócolis após o tratamento com α-amylase e conjugase, do que com o tratamento

trienzimático ou apenas com conjugase. Já Pandrangi e LaBorde (2004) concluíram

que a extração ótima de folato de folhas de espinafre envolve um tratamento bi-

enzimático, consistindo em incubação a 37°C com protease por 8 horas a pH 4,0,

seguido de tratamento com conjugase a 37°C por 3 horas a pH 7,0. Porém, os

13

resultados variados dos estudos já feitos demonstram que as condições ótimas para a

análise de folato precisam ser determinadas para cada alimento, e que as condições

sub-ótimas podem resultar em subestimação da quantidade de vitamina.

1.1.4. Doenças associadas à deficiência de folato

Em 1960, M. M. Nelson reportou os efeitos da deficiência de folato no

desenvolvimento de embriões de ratos (Persad et al., 2002). Em humanos o estudo

desta vitamina começou antes de 1965, com o pediatra Richard Worthington

Smithells, um dos primeiros a reconhecer o possível papel da nutrição,

particularmente o metabolismo do folato, para a embriologia humana (Eskes, 2000).

Os primeiros estudos de associação de doenças envolvendo deficiência de

folato foram realizados em Liverpool, em colaboração com a obstetra Elizabeth D.

Hibbard, usando o teste do ácido formiminoglutâmico (FIGLU), produto

intermediário excretado pela urina quando o folato encontra-se em falta no organismo.

Mulheres que deram a luz a recém-nascidos com má formação mostraram uma

incidência cinco vezes maior de FIGLU do que as mães de recém-nascidos normais.

Os autores concluíram que “a ocorrência familiar de malformação do sistema nervoso

sérico pode ser mediado, em certos casos, por um defeito genético determinado do

metabolismo do folato” (Eskes, 2000). Foi reconhecida então que a má nutrição era

um dos fatores responsáveis por más formações congênitas. Em pesquisas posteriores,

os níveis de vitaminas em um grupo de 900 mulheres durante o primeiro trimestre de

gestação foram investigados e seis destas tiveram bebês com defeitos do tubo neural

(DTN). Nestas mães, baixos níveis de folato sérico foram observados, com valores

significativamente menores que aqueles encontrados nas outras mães. A seqüência

lógica seria o estudo de uma possível prevenção destes defeitos por meio de uma

intervenção com o uso de multivitaminas no período pré-concepção, este período foi

escolhido por saber-se que o tubo neural se fecha na terceira semana pós-concepção, e

o uso de multivitaminas devido à deficiência de mais de uma vitamina por estas

mulheres. Para este estudo mães que já tinham filhos com estes defeitos foram

selecionadas. Os estudos finais confirmaram o efeito protetor de um preparo

multivitamínico contendo 360 µg diários de ácido fólico (Eskes, 2000).

Após Nicholas Wald e Paul Polani (1984) expressarem consideráveis dúvidas

da eficácia da suplementação com vitamina pré-concepção, os autores anunciaram um

14

grande estudo clínico randomizado duplo-cego na tentativa de validar os resultados

precedentes. Após quase 10 anos, tal estudo demonstrou uma redução de 72% da re-

ocorrência de DTN quando 400 µg de ácido fólico era administrado no período

próximo à concepção (MRC, 1991).

Outros estudos mostram também que a ingestão de suplementos vitamínicos

contendo ácido fólico no período pré-concepção reduz o risco de DTN em recém-

nascidos (Abramsky et al., 1999; Liu et al., 2004; Persad et al., 2002).

Recomendações do Departamento de Saúde do Reino Unido (UK Department of

Health) sugerem que a proteção contra DTN pode ser obtida pela ingestão de doses

diárias de 400 µg de ácido fólico usando suplementação, alimentos fortificados com

ácido fólico e dietas com alimentos ricos em folato. No entanto, não houve aumento

significativo do status de folato quando as mulheres estudadas apenas comiam

alimentos ricos nesta vitamina (Cuskelly et al., 1999).

Outro estudo parece demonstrar a diminuição do risco de nascimentos de

crianças com lábio leporino em mulheres que haviam ingerido complexos

multivitamínicos contendo ácido fólico, de um mês antes até dois meses depois da

concepção. Porém esta associação pode não ser atribuída especificamente ao ácido

fólico, podendo ser uma conseqüência de outros componentes do suplemento

vitamínico, mas parece estar altamente relacionado ao uso de multivitamínicos

contendo ácido fólico (Shaw et al., 1995).

A gravidez está associada com um aumento acelerado nas reações de

transferência de um carbono, incluindo as necessárias à síntese de nucleotídeos e à

divisão celular, o que é a base para o substancial aumento no requerimento de folato

durante a gravidez. Um estudo com dieta controlada, conduzido com grávidas,

confirmou as descobertas de estudos populacionais que a combinação de 300µg de

ácido fólico sintético por dia de suplementos, alimentos fortificados ou ambos, mais

100 µg de folato de alimentos ricos nesta vitamina por dia, são suficientes para manter

o status normal durante a gravidez (Fitzpatrick, 2003).

Dados recentes também indicam que ácido fólico pode reduzir o risco de

aborto espontâneo. Pesquisas na Suécia e Suíça, onde os grãos consumidos não foram

fortificados com ácido fólico, encontraram que a deficiência desta vitamina está

associada com o aumento do risco de aborto espontâneo (George et al., 2002; Hess et

al., 2001). Outros dados sugerem que suplementação com ácido fólico antes da

concepção pode ser um potencial redutor na freqüência de síndrome de Down.

15

Algumas mães de crianças com síndrome de Down tinham valores alterados de folato,

bem como, mutação no gene da metilenotetrahidrofolato redutase, estas alterações

também foram observadas em bebês com DTN (Barkai et al., 2003; James et al.,

1999).

O valor da Ingestão Diária Recomendada (IDR) para lactantes é de 500µg de

Folato Dietético Equivalente (FDE) por ser importante durante a amamentação, já que

todo o folato fornecido para a formação do bebê é dado pela mãe (FDE é 1µg de

folato dos alimentos ou 0,6µg de ácido fólico de suplementos ou alimentos

fortificados. Esta equivalência se dá pela diferença entre a biodisponibilidade destes

tipos de folato) (Fitzpatrick, 2003).

O folato é necessário para a formação e crescimento das células vermelhas do

sangue. Na anemia por deficiência de folato, as células vermelhas são anormalmente

grandes, chamadas de megalócitos e, quando na medula óssea, são chamados de

megaloblastos. Conseqüentemente, esta anemia é chamada de anemia megaloblástica.

Dietas pobres, alimentos muito cozidos, alcoolismo, doenças de má absorção e

gravidez são fatores de risco. Nestes casos, suplementos de ácido fólico oral ou

intravenoso podem ser dados em curto espaço de tempo até a anemia ser corrigida, ou

pelo resto da vida no caso de má absorção pelo intestino (Fitzpatrick, 2003).

O uso crônico de álcool pode levar à deficiência secundária de folato. Isto se

dá devido a uma redução na absorção de folato pela competição com o etanol,

alteração no metabolismo hepatobiliar e aumento da excreção biliar de folato causado

pelo etanol. Estudos com animais sugerem que a deficiência de folato acelera o

desenvolvimento precoce de doenças do fígado ligado ao alcoolismo. Humanos que

consomem álcool regularmente devem consumir diversos alimentos ricos em folato e

consumir um suplemento alimentar contendo ácido fólico (Fitzpatrick, 2003).

O metabolismo do folato também tem um papel importante na função do

sistema nervoso. Estudos de deficiência de folato e hiperomocisteinemia são

reportados para doenças cardiovasculares, derrames (Boushey et al., 1995; Selhub et

al., 1995) esquizofrenia (Regland et al., 1995) e os níveis de folato tendem a ser

baixos em pessoas com mal de Alzheimer (Clarke et al., 1998), demência vascular

(Faβbender et al., 1999; Gallucci et al., 2004) e depressão (Fava et al., 1997).

O estudo Framingham Heart (Fitzpatrick, 2003) mostrou que quanto maior o

nível sangüíneo de homocisteína maior o estreitamento das artérias carótidas ao

cérebro, o que aumenta a probabilidade de derrames. A homocisteína do soro pode ser

16

reduzida com suplementação de ácido fólico conforme Brouwer et al. (1999) e Wald

et al. (2001). Baseados nas descobertas de Wald et al. (2001), uma redução na

homocisteína do soro para 3 µmol/L, pode ser conseguida com a ingestão diária de

0,8 mg de ácido fólico. Isso pode reduzir os riscos de isquemia no coração em 16 %,

trombose em 25 % e derrame em 24 %. O mecanismo pelo qual a

hiperomocisteinemia pode aumentar o risco de doença vascular está incerto. Embora

diversas hipóteses tenham sido propostas, ainda são necessários mais estudos bem

controlados para se provar a eficiência do ácido fólico na prevenção e tratamento de

doenças cardiovasculares (Fitzpatrick, 2003).

Estudos em várias partes do mundo, inclusive Bélgica, México e Brasil, têm

mostrado que mutações no gene 5,10-metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR)

podem reduzir a atividade desta enzima e levar à hiperomocisteinemia, uma

deficiência que tem sido associado a várias doenças vasculares, em particular, doença

arterial coronária e trombose venosa profunda. Em um estudo no México com 45

pacientes com altas concentrações de homocisteína e baixos níveis de folato no

sangue foram associados ao aumento no risco de trombose venosa cerebral.

Populações com baixo poder socio-econômico e deficiência nutricional podem

contribuir para a alta incidência desta doença (Cantu et al., 2004). Em outro estudo

realizado na Bélgica com diabéticos tipo 2, com e sem hiperomocisteinemia, mostrou

uma maior incidência de mutação na metilenotetrahidrofolato redutase (C677T) em

diabéticos com hiperomocisteinemia do que nos pacientes com homocisteina normal e

pode contribuir juntamente com fatores não genéticos na prevalência de

hiperomocisteinemia (Buysschaerta et al., 2004). Um estudo de caso foi relatado no

Brasil, de uma jovem de 19 anos na segunda gestação e com um filho que apresentou

trombose venosa profunda em seu pós-parto anterior. Sendo uma das possíveis causas

de trombose a presença de um anticorpo anticardiolipina (ACA). Uma investigação

das causas de trombose revelou anticorpo anticardiolipina (ACA-IgM) e heterozigose

para a mutação C677T no gene MTHFR. A paciente recebeu 55.000 UI de heparina

subcutânea diariamente da 15ª a 36ª semana de gestação, quando ela deu a luz. Não

houve complicações clinicas durante o período pós-parto e ela foi liberada 3 dias após

o parto (Couto et al., 2002).

Estudo realizado no Kaiser Permanente´s Southern California Endocrinology

Laboratory dos E.U.A. analisou amostras de sangue humano no período de 1994 a

1998 a fim de avaliar se houve mudança nas concentrações de folato sérico desde que

17

a fortificação de alimentos começou em 1° de janeiro de 1998. O valor médio de

folato destas amostras aumentou de 12,6 para 18,7 μg por litro. Além disso, a

porcentagem de indivíduos com valores baixos foi reduzida. A explicação provável é

a fortificação de alimentos com ácido fólico desde 1996 nos E.U.A. ano em que a

Food and Drug Administration (FDA), agência americana responsável pela regulação

e controle de alimentos e remédios, obrigou a fortificação com 140 μg para cada 100g

de cereais (Lawrence et al., 1999).

No Canadá, de 1995 a 1998 houve uma recomendação na suplementação de

ácido fólico para mulheres antes da concepção e, a partir de novembro de 1998 houve

a implementação da fortificação de produtos graneleiros, isto é, produtos a base de

arroz, milho, batata, cereais e produtos panificados são fortificados com ácido fólico.

Um estudo na Nova Escócia avaliou a incidência de DTN antes (1991-1994) e após a

suplementação (1995-1998) e comparativamente não foi observado mudança

significativa na incidência de DTN, no entanto, quando foram comparados os dados

antes (1991-1997) e após a fortificação (1998-2000) foi mostrada uma queda de mais

de 50% na incidência de DTN, dando destaque ao que tange anencefalia e coluna

bífida (Hossain et al., 2004; Persad et al., 2002).

No Brasil, os altos índices de anemia e de doenças causadas pela deficiência

de ácido fólico na população brasileira, levaram o Ministério da Saúde e a ANVISA a

tornar obrigatória a fortificação das farinhas de trigo e milho. Com a publicação da

Resolução RDC n° 344, de 13 de dezembro de 2002, desde junho de 2004 as farinhas

de trigo e de milho vendidas diretamente ao consumidor, e aquelas utilizadas como

matéria-prima pelas indústrias na fabricação de outros produtos, passaram a ser

enriquecidas com Fe e ácido fólico. Cada 100 g das farinhas de trigo e milho deverão

conter 4,2 mg de Fe e 0,15mg de ácido fólico. Com isso, as farinhas e produtos

industrializados, como pães, macarrão, biscoitos, misturas para bolos e salgadinhos

deverão apresentar maior quantidade de Fe e ácido fólico em sua formulação final

(ANVISA, acessado em 01/04/2009). Espera-se assim, reduzir a incidência destas

doenças relacionadas com dietas de níveis inadequados de folato.

18

1.2. A Alface

A alface (Lactuca sativa) é uma hortaliça da Divisão Magnoliophyta, classe

Magnoliopsida, Ordem Asterales, Família Asteraceae, Genero Lactuca, Espécie

Lactuca sativa (Mabberley, 1997). Considerada a hortaliça folhosa mais importante

na alimentação do brasileiro, sendo seu consumo médio anual em torno de 41 kg per

capita (Nadal et al., 1986), o que assegura à cultura expressiva importância

econômica (Grangeiro et al., 2006).

Quanto à sua estrutura, a alface é uma planta herbácea delicada, com caule

diminuto, ao qual se prendem folhas amplas que crescem em volta do caule em roseta,

podendo ser lisas ou crespas, formando ou não uma cabeça. Conforme a cultivar, a

coloração pode ocorrer em vários tons de verde e roxo (Filgueira, 2000). Originária da

região do Mediterrâneo, de clima temperado, esta espécie vegetal já era utilizada

como planta medicinal desde 4.500 a.C., como tranquilizante, digestivo, emoliente e

fornecedor de vitaminas e como hortaliça, sua utilização é registrada desde 2.500 a.C.

Acredita-se que tenha sido trazida para o Brasil pelos portugueses e as espécies

silvestres trazidas na época ainda podem ser encontradas no sul da Europa e na Ásia

Ocidental, regiões de clima temperado (Goto & Tivelli, 1998).

A sua adaptação a regiões de temperatura mais elevada, como o Brasil, tem

gerado obstáculos ao seu crescimento e desenvolvimento, impossibilitando que a

cultura expresse todo o seu potencial produtivo. Nestas condições, ocorre redução do

ciclo da cultura, comprometendo sua produção, devido à aceleração do metabolismo

da planta e, conseqüentemente, a antecipação da fase reprodutiva. Mesmo assim, são

cultivados no Brasil, aproximadamente 30 mil hectares sendo responsável pela

geração de aproximadamente 60 mil empregos diretos (Grangeiro et al., 2006;

Makishima, 1993; Setúbal & Silva, 1992).

No Brasil existem informações de pesquisas a respeito do crescimento e

acúmulo de nutrientes em diferentes cultivares. Entretanto, as mesmas foram

realizadas em regiões de clima mais ameno (Radin et al., 2004), ou em condições de

cultivo protegido (Lopes et al., 2003; Menezes Júnior et al., 2004) sem aplicação

prática naquelas regiões que cultivam alface, em condições de altas temperatura e

luminosidade (Grangeiro et al., 2006). O seu cultivo em estufas agrícolas permite a

utilização intensiva da terra e do capital, e sua produção de maneira controlada,

dependendo menos das condições climáticas e com melhor aproveitamento dos

19

insumos, possibilitando a distribuição da produção ao longo do ano, o que regulariza a

oferta e possibilita ao produtor evitar épocas de menor preço (Rodrigues et al., 1997;

Trani et al., 2006). Outra técnica que tem se mostrado muito promissora no cultivo de

alface é a hidroponia, que trouxe vantagens como a antecipação da colheita, a

homogeneidade de oferta e qualidade dos produtos durante todo o ano, a ausência de

necessidades de rotação de culturas e a redução no uso de agrotóxicos, quando

comparado com o cultivo tradicional (Luz et al., 2006).

Até 1993, segundo Nagai (1993), a preferência predominante no Brasil era

para a alface de folhas lisas do tipo manteiga, entretanto, foi observado, atualmente,

grande demanda para o tipo crespa (Oliveira et al., 2004), sendo que a participação de

folhas crespas atende a 70% do mercado consumidor dessa folhosa. Nos últimos anos,

tem sido observado no mercado de sementes de alface um número crescente de

cultivares, sendo algumas delas adaptadas ao cultivo protegido. Para outras, há

ausência de informações (Trani et al., 2006).

No Brasil atualmente são plantados seis grupos de cultivares de alface, sendo:

grupo Americana, com folhas que formam uma cabeça, semelhante ao repolho, com

os bordos das folhas crespas (ex.: cultivares Tainá e Lucy Brown); Repolhuda-

Manteiga, semelhante ao anterior, mas com os bordos das folhas lisas (ex.: cultivares

Elisa e Aurélia); grupo Solta-Lisa que são alfaces que não formam uma cabeça e

possuem os bordos das folhas lisos (ex.: cultivares Regina e Uberlândia-10000);

Solta-Crespa que são alfaces semelhantes ao grupo anterior, mas possuem os bordos

das folhas crespos (ex.: cultivares Vera e Verônica), é o que mais cresceu em área

plantada no Brasil, correspondendo hoje a 70% do mercado. Existe ainda o grupo

Mimosa, que são alfaces com folhas bem recortadas (como a cultivar Salas Bowl) e o

grupo Romana, sendo estes dois últimos com menor importância econômica

(Filgueira, 2000).

A alface é uma hortaliça mundialmente conhecida e consumida crua como

salada, no entanto, em alguns lugares as folhas são secas, curadas e fumadas como

tabaco (USDA, 2008), em outros, como na China, é consumida quente em sopas

(Simoon, 1991). Para os Yazidi, comunidade fechada do nordeste do Iraque com

estimativa de, no máximo, 700.000 pessoas, comer alface é um tabu, uma das mais

antigas tradições desta religião “kurdish”, envolta em mistérios e segredos que nem

eles explicam (MacFarquhar, 2003).

20

Variedades de alface de todos os tipos, lisas e crespas, são cultivadas ao redor

do mundo em regiões de clima moderado e necessitam de muita água e luz para seu

crescimento. Os principais produtores da União Européia são: Espanha, Itália e

França. No mundo os principais produtores são China e EUA. Segundo dados da FAO

(Food and Agriculture Organization of the United Nations) a produção mundial de

alface combinada com a de chicória foi de 23,55 milhões de toneladas em 2007, e de

22,77 milhões de toneladas em 2006, com um aumento de 3,4% em um ano, e sendo

sempre observado algum crescimento ao longo dos últimos anos (FAOSTAT,

acessado em 15/02/2009).

Segundo dados do Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA)

100 g das folhas verdes da alface possuem em sua composição nutricional mais de

95% de água, baixo valor calórico (15 kcal), baixo teor de gorduras totais (0,15g) e

quantidade razoável de proteínas totais (1,36 g), vitaminas e minerais. Entre estes

destaca-se a vitamina A, vitamina C, niacina, cálcio, fósforo e ferro (tabela 1). Cada

100g de folhas de alface crua possui 38 µg de folato, enquanto outros produtos são

considerados ricos em folato como o espinafre (Spinacia oleracea) que possui 194 µg

de folato em 100 g de produto crú, brócolis têm 71 µg de folato em 100 g de produto

crú, couve (Brassica oleracea var. viridis) com 166 µg de folato em 100 g de produto

crú, que se reduz para 93 µg de folato quando cozida e fervida e o feijão preto

(Phaseolus vulgaris) que contem 444 µg de folato quando crú e diminui para 149 µg

de folato após cozido. Outros são considerados pobres em folato como o espinafre

(Tetragonia tetragonoides) que possui 15 µg de folato por 100 g de produto crú, o

tomate possui 29 µg de folato em 100 g de produto e quando verde tem 9 µg por 100

g de produto e batata tanto crua quanto cozida sem casca possuem 9 µg de folato por

100 g de produto o que sobe para 22 µg de folato por 100 g de produto com casca.

21

Tabela 1. Composição nutricional da alface (por 100 gramas de produto)

Nutrientes Valores Vitaminas Valores Água 95,07 g Vitamina C 18,0 mg Energia 15 kcal Tiamina 0,070 mg Proteína 1,36 g Riboflavina 0,080 mg Gordura Total 0,15 g Niacina 0,375 mg Carboidratos 2,79 g Ácido pantotênico 0,134 mg Fibra total 1,3 g Vitamina B-6 0,090 mg Açúcares totais 0,78 g Folato total 38 µg Glicose (dextrose) 0,36 g Colina total 13,4 mg Frutose 0,43 g Betaina 0,2 mg Minerais Valores Vitamina A, RAE 370 µg Cálcio 36 mg β-Caroteno 4443 µg Ferro 0,86 mg Vitamina A 7405 UI Magnésio 13 mg Vitamina E 0,29 mg Fósforo 29 mg Vitamina K 173,6 µg Potássio 194 mg Sódio 28 mg Zinco 0,18 mg Cobre 0,029 mg mg – miligramas Manganês 0,250 mg µg – microgramas Selênio 0,6 µg UI – Unidades internacionais

(USDA, 2008)

1.2.1. Doenças e pragas que atacam a cultura de alface

Todas as doenças causadas por fungo têm condições favoráveis de

desenvolvimento em alta umidade e clima ameno com temperaturas entre 10 e 28°C,

condições estas que são ideais também para o desenvolvimento da cultura de alface.

A septoriose causada pelo fungo Septoria lactucae Passerini é uma das

doenças mais disseminadas que afetam a cultura da alface. Sua importância deve-se às

lesões necróticas no limbo foliar que prejudicam o valor comercial do produto. Nos

campos, a doença causa nas folhas manchas com contornos irregulares e seca das

folhas devido a coalescência de muitas manchas, resultando em danos na formação

das sementes. O fungo ataca principalmente as folhas, mas pode afetar também a

haste e os órgãos florais. O tecido afetado, inicialmente com aspecto desidratado,

torna-se pardacento, com numerosos pontos de cor escura visíveis a olho nú. Não há

cultivares consideradas imunes a esta doença, mas em observações de campo pode-se

verificar diferenças nos níveis de resistência horizontal (Sousa et al., 2003).

22

A cercosporiose ou mancha de cercospora é causada pelo fungo Cercospora

longissima, e atinjem inicialmente as folhas mais baixas. As lesões têm tamanhos

variados, tornando-se irregulares ou angulares, com coloração marrom clara a escura,

circundadas por tecido clorótico com ponto central de coloração acinzentada. Quando

a doença apresenta alta severidade, as lesões coalescem e extensas áreas do tecido

foliar morrem (Gomes et al., 2006).

O míldio é uma das principais doenças da alface, com ocorrência em qualquer

fase do ciclo da cultura. O fungo oomiceto Bremia lactucae ataca as folhas através de

manchas amareladas de tamanho variável, afetando a produção, a qualidade e o valor

do produto colhido. É responsável por perdas superiores a 80% na produtividade. Para

minimizar os danos, além do emprego de cultivares resistentes e do controle da água

de irrigação, é de fundamental importância o diagnóstico correto no início do

desenvolvimento dos primeiros sintomas, bem como a adoção de fungicidas

adequados às exigências do patógeno.

A doença do tombamento das mudas é um problema que afeta principalmente

solos frios com pouca drenagem e com excesso de irrigação. É causado por fungos

que permanecem no solo por longos períodos de tempo. As sementes morrem sem

germinar. As plantas germinadas também são atacadas murchando e tombando.

Lessões escuras e encharcamento são normalmente visíveis no caule da planta na

linha do chão.

O mofo-branco ou podridão do caule é causado pelo fungo Sclerotinia

sclerotiorum (Lib.) De Bary, que sobrevive no solo e que infecta mais de 360 espécies

de plantas (Amorin, 1995). Este patógeno pode atacar a planta em qualquer estágio de

desenvolvimento, principalmente próximo à colheita e produz estruturas de resistência

denominadas escleródios, que tornam a doença de difícil controle em função do longo

período de permanência destas no solo (Rodrigues et al., 2007).

A doença queima da saia, embora surja com certa frequência, não causa

grandes prejuízos a não ser quando existe atraso na germinação da planta. É causada

pelo fungo Rhizoctonia solani e os sintomas mais graves causado pelo

estrangulamento parcial dos caules são: atraso no desenvolvimento da planta,

deformação e descoloração dos caules, necrose do tecido vascular, pigmentações

púrpuras nas folhas. Em período úmido, o fungo pode manifestar-se na base dos

caules necrosados e formar uma baínha esbranquiçada. A rizoctónia produz uma

toxina que tem efeito inibidor do crescimento. As raízes são igualmente infectadas e

23

algumas delas destruídas, razão pela qual as plantas dispõem de um sistema radicular

fraco. O fungo mantem-se de um ano para o outro, sob a forma de esclerotos no solo,

ou como micélio em resíduos vegetais existentes no solo. Na primavera, quando as

condições são mais favoráveis, os esclerotos germinam e invadem os caules da planta,

especialmente através de feridas. O desenvolvimento da doença é estimulado por

umidade elevada e temperaturas baixas do solo.

O mofo cinzento causado pelo fungo Botrytis cinerea ocasiona um

acinzentamento das folhas, gerando perdas de produtividade.

A podridão-mole ou podridão-da-base-das-folhas-externas, causada pela

bactéria Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, é uma das doenças mais

destrutivas nas culturas da alface. Aparece inicialmente como uma murcha nas folhas

externas, sendo que plantas próximas à colheita são mais suscetíveis. A murcha é

causada pelo colapso dos tecidos vasculares, com o desenvolvimento de descoloração

rosa a marrom. Com o progresso da doença, a medula do caule torna-se encharcada,

macerada e esverdeada. Em estágios avançados, toda a planta pode tornar-se

apodrecida. Durante a pós-colheita as folhas externas tornam-se murchas,

descoloridas e toda a planta pode apodrecer.

A podridão negra das raízes ou murchadeira é uma doença relativamente

recente, que foi constatada em 1999 e que se encontra em expansão no estado de São

Paulo. É causado pelo fungo Thielaviopsis basicola e seus sintomas são manchas

escuras nas raízes que, com o avanço da doença vão se tornando totalmente

apodrecidas. A planta pode emitir novas raízes e há a redução do crescimento da

planta e murcha nas horas mais quentes do dia.

A doença da mancha de alternaria, causada pelo fungo Alternaria alternata

que afetam as folhas até estas amadurecerem. Os sintomas são observados 48 horas

após a infecção, formando pequenas manchas escuras, rodeadas por um halo

amarelado. Podem se expandir, ocupando grandes áreas da superfície foliar e atingir

as nervuras. Nos ramos, os sintomas são semelhantes aos observados em folhas, com

lesões de 1 a 10 mm de diâmetro.

A mancha bacteriana é causada pela bactéria Xanthomonas campestris pv.

vesicatoria e ocasiona prejuízos na produção de alface. Os sintomas iniciais são

observados nas bordas das folhas mais velhas como manchas irregulares de coloração

marron. O aumento da severidade provoca necrose total das folhas, que por sua vez

secam, afetando a produtividade e aceitabilidade pelo consumidor.

24

O vírus do mosaico da alface ou ferrugem é causado por um potyvirus, que é

totalmente inofensivo para o consumidor, mas torna a planta não comercializável por

causar defeitos e alterações na cor das folhas, tornando-as marrons nas suas partes

inferiores. O que pode causar uma perda de 100% da produção devido aos sintomas

serem observados apenas na colheita.

Há ainda a doença chamada nematóide-das-galhas, causada pelo nematóide

Meloidogyne sp., que tem se tornado um dos principais problemas enfrentados no cultivo

da alface, sendo responsáveis por importantes perdas, uma vez que reduzem a

quantidade e a qualidade do produto colhido. Cultivares de alface quando atacadas

pelos nematóides apresentam debilidade intensa da planta, ocasionando uma densa

formação de galhas no sistema radicular. As galhas obstruem a absorção de água e

nutrientes do solo, resultando em plantas amareladas, com cabeça de tamanho

reduzido, pequeno volume foliar e sem valor para o consumo in natura.

As principais pragas que atacam a plantação de alface são: pulgões ou afídios que

tem dupla importância na cultura: que se alimentam das folhas e das raízes e causam

danos diretos sugando a seiva, injetando toxinas, e até provocando o desenvolvimento

da fumagina, causando perdas, tanto quantitativas, como qualitativas; ou como

vetores de vírus, especialmente o vírus do mosaico da alface, lagarta minadora e

lagarta tesourinha, mosca-branca, cochonilha, paquinhas, grilo, lesmas, caracóis,

tatuzinhos, tripes do fumo e besouro preto e tanto podem se alimentar da planta como

serem transmissoras de doenças ao se alimentarem de uma planta doente e após de uma

saudável.

1.3. Método de transformação genética mediado por Agrobacterim tumefaciens

A galha-da-coroa (do inglês crown-gall) é uma doença de plantas conhecida

na Europa desde a Antigüidade, manifestando principalmente em plantas de

propagação vegetativa. Essa doença traduz-se pela formação de uma galha na coroa

(junção entre o tronco e a raiz) ou diretamente nas raízes da planta infectada. Sabe-se,

há mais de um século, que o agente etiológico causador da galha-da-coroa é uma

bactéria tipicamente do solo, a Agrobacterium tumefaciens (Cavara, 1897; Smith &

Townsend, 1907).

Ao contrário das células sadias, os tecidos da galha-da-coroa, quando isolados

da planta e cultivados in vitro, são capazes de crescer indefinidamente em meio de

25

cultura, sem o acréscimo de reguladores de crescimento (Braun, 1958; White &

Braun, 1941). Essa particularidade despertou o interesse de cientistas que trabalham

nos mais diferentes campos da pesquisa, pois, até então, pensava-se que a proliferação

do tecido das galhas vegetais seria induzida somente por um estímulo externo, de

natureza química ou mecânica. Os pesquisadores inicialmente associaram o

desenvolvimento dessas galhas ao câncer animal, o que estimulou numerosas

pesquisas para o entendimento das causas dessa doença (Fernandes & Martins, 1985;

Hooykaas & Schilperoort, 1992). Esses estudos concluíram que o surgimento da galha

é, na realidade, o resultado de um processo natural de transferência de genes da

bactéria para a célula vegetal, que passam a sintetizar substâncias que estimulam a

divisão celular no sítio de infecção.

Os conhecimentos gerados desde então levaram a um entendimento

aprofundado do parasitismo Agrobacterium-planta, sendo considerado atualmente um

sistema modelo para estudos das interações patógeno-hospedeiro, do transporte

intercelular de macromoléculas e do direcionamento de proteínas para o núcleo. Nos

últimos anos, o mecanismo de transferência de informação genética destas bactérias

para as plantas tem propiciado o uso de Agrobacterium como vetor natural de

transferência de genes e permitido a obtenção de um grande número de plantas

geneticamente modificadas.

1.3.1. O gênero Agrobacterium

As agrobactérias (Agrobacterium spp.) são bactérias tipicamente do solo, do

tipo bacilo Gram negativo e aeróbico, porém, alguns isolados conseguem sobreviver

sob condições reduzidas de oxigênio quando se encontram nos tecidos vegetais. Suas

células apresentam um tamanho de 0,6 a 1,0 x 1,5 a 30 µm, ocorrem isoladas ou aos

pares e não formam esporos. As agrobactérias são móveis na rizosfera graças a dois

flagelos polares e de dois a quatro filamentos laterais que permitem sua

movimentação a 60 μm/segundo, aproximadamente. A temperatura de crescimento

destas bactérias está na faixa de 25 a 28°C, com colônias geralmente convexas,

circulares, lisas, apigmentadas ou de cor creme (Holt et al., 1994).

Agrobacterium tumefaciens é considerada a espécie-tipo do gênero

Agrobacterium e foi descrita pela primeira vez por Smith e Townsend (1907), como

26

Bacillus tumefaciens. Posteriormente, o gênero Agrobacterium foi proposto por Conn

e enquadrado na família Rhizobiaceae que agrupa, entre outros, os gêneros

Rhizobium, Bradyrhizobium, Phyllobacterium e Azorhizobium que são bactérias

fixadoras de nitrogênio (Holt et al., 1994; Kersters & De Ley, 1984). No gênero

Agrobacterium (do grego agros = campo e bakterion = bastonete) estão descritas,

além de Agrobacterium tumefaciens, que causa a doença conhecida como galha-da-

coroa (crown-gall), outras quatro espécies, que diferem entre si pela sintomatologia e

especificidade de hospedeiro: (1) A. rhizogenes (Riker) Conn. que provoca a síndrome

da raiz em cabeleira (do inglês hairy root); (2) A. rubi (Hildebrand) Starr e Weiss que

induz tumores em Rubus spp.; (3) A. vitis Ophel e Kerr que induz tumores em Vitis

spp. e (4) A. radiobacter (Beijejerinck e van Delden) Conn., que são bactérias

saprófitas, não-patogênicas.

1.3.2. Ocorrência da doença

As agrobactérias encontram-se distribuídas em todo mundo, em solos

cultivados ou não e na rizosfera das plantas contaminadas onde são encontradas nas

galhas, raízes ou no solo adjacente. As agrobactérias patogênicas ocorrem com maior

freqüência em regiões de clima frio. Esta preferência deve estar ligada à sensibilidade

das mesmas a altas temperaturas e a sensibilidade térmica do processo de infecção

(Lippincott et al., 1981).

Mais de 600 espécies vegetais são susceptíveis à infecção por A. tumefaciens e

A. rhizogenes, pertencendo, a maioria delas, à classe das Angiospermas dicotiledôneas

(>60%) e Gymnospermas e, mais raramente, às Angiospermas monocotiledôneas (De

Cleene & De Ley, 1976; Escobar & Dandekar, 2003). Na Europa, a doença é

conhecida desde a antigüidade, quando foi primeiramente observada por Aristóteles e

por seu estudante Teofrasto em videiras. Embora sua incidência seja baixa, a galha-

da-coroa pode tomar proporções devastadoras em certas culturas, principalmente em

países temperados, conduzindo à altas perdas da produção, em particular para

algumas espécies ornamentais, frutíferas e florestais, que são propagadas

vegetativamente.

No Brasil, os primeiros relatos sobre doenças causadas por espécies de

Agrobacterium surgiram na década de 30 em pessegueiro e, posteriormente a galha-

da-coroa foi relatada em várias outras espécies como castanheira, videira, ameixeira,

27

alface, chuchu, mandioca, entre outras (Barros et al., 2004; Beriam et al., 1996;

Gomes et al., 1998). Em Minas Gerais, a galha da roseira surgiu primeiramente em

algumas propriedades e, posteriormente, as práticas agronômicas adotadas para esta

cultura, como a propagação vegetativa e enxertia, contribuíram para uma rápida

disseminação do patógeno (Romeiro, 1995).

Além de plantas, Agrobacterium pode transformar, em condições de

laboratório, uma vasta gama de organismos eucarióticos, incluindo fungos

filamentosos, levedura, cogumelos cultivados, ouriço-do-mar e células humanas

(Bulgakov et al., 2006; Lacroix et al., 2006b). Essas descobertas abriram a

possibilidade de utilização de Agrobacterium como um vetor universal de

transformação genética e pode ser explorado como uma nova ferramenta

biotecnológica para a engenharia genética de todos os organismos eucarióticos.

1.3.3. Biologia do processo infeccioso

No início do processo de infecção de uma planta por Agrobacterium, ocorre o

reconhecimento e a penetração da bactéria no tecido vegetal lesado em decorrência de

ferimentos superficiais causados por insetos, geadas ou tratos culturais. As bactérias

são atraídas em direção ao tecido vegetal por quimiotactismo positivo em relação às

moléculas-sinal (compostos fenólicos, monossacarídeos, aminoácidos e prótons), que

são exsudadas pelas células presentes no local da lesão, como uma resposta

inespecífica de defesa (Tzfira & Citovsky, 2000). A liberação de íons H+ (prótons)

nos espaços intercelulares culmina com o abaixamento do pH no local do ferimento,

condição que favorece o processo infeccioso (fig. 5).

28

Fig. 51– Esquema do processo infeccioso, mostrando todos os passos da transferência do DNA da bactéria para a planta hospedeira (Brasileiro & Aragão, 2009).

Uma vez em contato com as células vegetais, as bactérias sintetizam

microfilamentos de celulose que estabilizam a ligação inicial, propiciando uma

melhor fixação entre a bactéria e a célula hospedeira (Matthysse et al., 2000).

Os filamentos de celulose formados permitem a formação de agregados de

células bacterianas em volta das células vegetais próximas ao tecido ferido. Acredita-

se que existam receptores específicos para Agrobacterium na superfície da célula da

planta, pois um número finito de agrobactérias é capaz de se ligar a estas células

(Gelvin, 2000; Matthysse & McMahan, 1998). Recentemente, foi demonstrado que a

infecção por Agrobacterium ativa a expressão de vários genes de defesa da planta

durante os estágios iniciais do processo infeccioso (Dafny-Yelin et al., 2008). Essas

proteínas de defesa são utilizadas pela bactéria para auxiliar no seu processo de

29

transformação genética, um exemplo de desvio do sistema biológico de defesa vegetal

a seu favor. Quando não mais necessários, nos estágios mais avançados da infecção

(formação do tumor), esses genes de defesa terão sua expressão reprimida pela

bactéria.

Com a ligação bactéria-planta estabilizada, as moléculas-sinal sintetizadas

pela planta ativam a expressão de genes de virulência que estão localizados em um

plasmídio de alto peso molecular (200 a 800 kb), conhecido como plasmídio Ti (do

inglês tumor-inducing). Em determinadas linhagens, o plasmídio Ti pode representar

50% do genoma (Allardet-Servent et al., 1993). Este plasmídio está presente somente

em linhagens patogênicas de Agrobacterium, em um baixo número de cópias, e pode

ser transferido via conjugação, para outras bactérias (van Larebeke et al., 1974;

Watson et al., 1975).

Duas importantes regiões funcionais no plasmídio Ti envolvidas diretamente

no processo de indução tumoral foram identificadas: a região-T, que corresponde ao

segmento de DNA transferido para a célula vegetal e a região de virulência ou região

vir, que contem genes que codificam enzimas responsáveis pela excisão e

transferência da região-T (Stachel & Nester, 1986; van Larebeke et al., 1974).

O plasmídio Ti possui também outras três regiões funcionais que não estão

diretamente envolvidas com o processo de indução tumoral. Estas regiões são

conhecidas como: (1) região de transferência conjugativa (loci tra e trb), responsável

pela transferência conjugativa do plasmídio Ti entre linhagens de Agrobacterium spp.

ou para outras bactérias Gram-negativas; (2) região de absorção e catabolismo de

opinas (região opc), envolvida na síntese de mais de 40 enzimas específicas

responsáveis pela absorção das opinas para dentro da célula e posterior catabolismo

das mesmas pela bactéria, e (3) região de replicação (região rep), que é necessária

para a replicação e funções ligadas à manutenção e estabilidade do plasmídio Ti

dentro da bactéria, controle do número de cópias durante a divisão celular e

incompatibilidade entre bactérias. A maioria dessas regiões é conservada entre os

diferentes tipos de plasmídio Ti, principalmente àquelas pertencentes à mesma classe

de opina.

A região vir, que é ativada pelas moléculas-sinal durante a ligação

Agrobacterium-hospedeiro, é formada por um conjunto de seis ou mais operons

(conhecido como regulon vir), contendo 34 genes conhecidos. Os operons da região

vir são co-regulados por duas proteínas da própria região vir, VirA e VirG, que são

30

induzidas, de maneira coordenada, em resposta às moléculas-sinal (estímulos

químicos), isto é, após o reconhecimento extracelular, o sinal químico é convertido

em uma reposta intracelular (McCullen & Binns, 2006).

No sistema conhecido como two-component regulatory system ao qual

pertencem as duas proteínas, a proteína VirA funciona como uma proteína sensora,

enquanto a proteína VirG age como um ativador transcricional. Liga-se a regiões

promotoras dos operons vir, iniciando assim o processo de transferência da região-T

(Hooykaas & Beijersbergen, 1994; Winans et al., 1994). Na presença das moléculas-

sinal, a proteína VirA, uma histidina quinase presente na membrana da bactéria, vai se

autofosforilar e, subseqüentemente transfosforilar a proteína VirG, localizada no

citoplasma bacteriano. Uma vez fosforilada, a proteína VirG passa de sua forma

inativa para uma forma ativa, ativando a sua própria transcrição e a dos demais

operons vir (Hooykaas & Beijersbergen, 1994; Winans et al., 1994). Esta proteína

interage com a região vir box, uma seqüência específica e altamente conservada de 12

pb, presente na região promotora de cada operon vir, permitindo uma regulação e uma

expressão coordenada desses genes (Jin et al., 1990). Uma vez que todos os genes da

região vir forem ativados, inicia-se o processo de transferência da região-T para a

célula vegetal.

A região-T é definida e delimitada por duas seqüências repetidas de 23 pb,

conhecidas como extremidades direita e esquerda. O processo de reconhecimento,

clivagem e transferência da região-T inicia-se graças à atividade do operon virD e

virC que reconhecem e clivam dentro desses 23 pb que delimitam a região-T.

Ao que tudo indica, VirD1 reconhece as extremidades da região-T e converte o

DNA para a forma relaxada, através de sua atividade topoisomerase, expondo as

sequências específicas de clivagem para a proteína VirD2, uma proteína com

atividade endonucleásica, que tembém reconhece de forma especifica os 23 pb de

cada extremidade da região-T (Yanofsky et al., 1986).

Após a clivagem, a proteína VirD2 mantem-se covalentemente ligada à

extremidade 5’ da região-T (Herrera-Estrella et al., 1988; Pansegrau et al., 1993),

enquanto uma segunda clivagem ocorre na extremidade 3’ esquerda, levando a

liberação da fita inferior da região-T. Enquanto isso, uma cópia da mesma é

sintetizada a partir da extremidade direita na direção 5’→ 3’, utilizando a fita de DNA

superior da região-T como molde, mantendo assim a fita superior em forma duplex. A

31

síntese da fita inferior continua até atingir o sítio de clivagem da extremidade 3’

esquerda. A molécula de DNA linear, fita simples, gerada a partir do deslocamento da

fita inferior da região-T foi denominada de fita-T. Desta forma, o deslocamento da

fita-T ocorre na direção 5’→ 3’ da inferior da região-T, iniciando na extremidade

direita e terminando na extremidade esquerda, indicando a existência de polaridade no

processamento da fita-T (Zambryski et al., 1989).

As proteínas VirC1 e VirC2, codificadas pelo operon VirC, ligam-se a uma

seqüência conservada localizada próxima à extremidade direita, denominada

overdrive (ou região ode). Acredita-se que esta ligação favoreça a correta orientação

do complexo protéico VirD1/VirD2 para o reconhecimento dos sítios de clivagem,

aumentando desta forma a eficiência no processo de clivagem e transferência da fita-T

(Toro et al., 1989).

Após sua formação, a fita-T deixa a célula bacteriana, penetra na célula

vegetal, atravessa a membrana interna bacteriana, seu periplasma e a membrana

externa bacteriana e se integra ao DNA nuclear da planta. Supõe-se que a fita-T é

transportada da bactéria para a célula vegetal, como um complexo nucleoprotéico,

conhecido como complexo-T imaturo e formado pela fita-T protegida na extremidade

5’ pela VirD2 (Citovsky et al., 1989).

O transporte do complexo-T da agrobactéria para o citoplasma da célula

vegetal indica a necessidade de se formar uma estrutura funcionalmente similar a um

pilus, ou poro celular, e ocorreria através da interação das proteínas do operon virB

com o complexo-T (Ward et al., 1988; Zupan et al., 1998). O operon virB contém 11

genes, sendo que a maioria das proteínas VirB está localizada nas membranas interna

e externa da bactéria e está diretamente ligada à formação do canal VirB ou ao

fornecimento de energia (atividade ATPase) necessária para a formação do canal

VirB e para o processo de exportação das moléculas (Cascales & Christie, 2004;

McCullen & Binns, 2006).

A proteína VirD4, uma proteína ancorada na membrana interna da bactéria,

seria o produto que intermediaria a ligação do complexo-T ao canal VirB, auxiliando

na translocação entre a bactéria e a célula hospedeira. O complexo protéico formado

por VirB e VirD4, associado às membranas da bactéria, vai permitir a translocação do

complexo-T imaturo para o citoplasma da célula vegetal através de um sistema

secretório do tipo IV (T4SS) (Christie, 2004). As proteínas VirB2, VirB5 e,

32

provavelmente, VirB7 formam o pilus-T, que é um filamento extracelular que

intermedeia a ligação do canal VirB/VirD4 à parede (ou membrana) da célula vegetal

(McCullen & Binns, 2006).

Sabe-se que, uma vez no citoplasma, a maturação do complexo-T é finalizada

por sua associação com proteínas efetoras exportadas pela bactéria, em particular com

VirE2 (Gelvin, 2003). A proteína VirE2 é uma Single Strand Binding Protein e liga-

se covalentemente e de maneira não-específica à fita-T (Christie et al., 1988; Gietl et

al., 1987). Por ocorrer com certa abundância e apresentar alta afinidade por DNA fita

simples é sugerido que a ligação da proteína VirE2 à fita inferior do T-DNA, além de

evitar o dobramento da mesma, poderia protegê-la da degradação de nucleases

durante seu transporte através dos poros nucleares (Citovsky et al., 1989).

Uma vez superada a membrana da agrobactéria, a segunda etapa da

transferência do complexo-T é atravessar os espaços intercelulares, parede celular e a

membrana plasmática vegetal até o nucleoplasma. Provavelmente existam receptores

na membrana celular vegetal que possam auxiliar na entrada do complexo-T no

citoplasma da célula vegetal, que é feito de forma ativa (Citovsky & Zambryski,

1993; Howard et al., 1992). Esta ativação é mediada por uma seqüência-sinal de

localização nuclear, presente na própria molécula a ser transportada ou em moléculas

associadas a ela. Como a fita-T não possui sinais de direcionamento, sua importação

para o núcleo da célula vegetal é provavelmente mediada pelas proteínas da

agrobactéria que a acompanham, as proteínas VirD2 e VirE2 (Ziemienowicz et al.,

2001).

Dentro do citoplasma, o complexo-T percorre um caminho para atingir o núcleo

da célula hospedeira. A densa estrutura do citoplasma, composta por microtúbulos

encruzilhados, actina e rede de filamentos intermediários, impede a difusão Brownian

de macromoléculas, indicando um mecanismo ativo de transporte intracelular do

complexo-T (Tzfira, 2006). O grande tamanho do complexo-T (estimado em 50 kD) e

sua estrutura solenoidal reforçam a hipótese do envolvimento de proteínas motoras

associadas aos microtúbulos durante seu transporte intra-citoplasmático (Abu-Arish et

al., 2004; Suh et al., 2003).

A última etapa no processo de importação e transferência da fita-T culmina

com sua integração no genoma nuclear da célula hospedeira. Entretanto, os

mecanismos moleculares envolvidos nas etapas de passagem pela membrana nuclear,

transporte intranuclear e de direcionamento para a cromatina ainda são poucos

33

conhecidos. O diâmetro do complexo-T (15 nm) excede o tamanho limite do

complexo do poro nuclear (Nuclear Pore Complex – NPC) de 9 nm, indicando que o

complexo-T entra no núcleo por um mecanismo ativo, mediado pela maquinaria de

importação nuclear da célula hospedeira envolvendo também as proteínas VirD2,

VirE2 e VirE3 (Citovsky et al., 2006).

Enquanto muitas proteínas de Agrobacterium envolvidas no processo de

transferência do complexo-T já foram caracterizadas, pouco é conhecido sobre os

fatores celulares vegetais que participam deste processo. Proteínas vegetais

pertencentes às famílias das carioferinas, das cicloferinas, as importinas e as proteínas

VIP (VirE-interacting protein) podem atuar como mediadoras do transporte e

protetoras do transporte do complexo-T (Gelvin, 2003).

A fita-T não codifica nenhuma proteína requerida para sua integração,

diferentemente de outros elementos móveis como transposons e retrovírus. Assim, a

integração da fita-T no genoma da planta pode ser mediada pelas proteínas VirD2 e

VirE2, em combinação com vários fatores e mecanismos moleculares da própria

célula hospedeira (Tzfira & Citovsky, 2000; Tzfira et al., 2004). Os fatores da planta

são necessários para a complementação da molécula de fita-T para DNA dupla fita

(dsDNA), para a produção de quebras no genoma do hospedeiro e para a ligação da

molécula do T-DNA nessas quebras.

Estudos realizados em plantas transgênicas de Arabidopsis indicam que os

sítios de integração da fita-T ocorrem geralmente dentro das regiões

transcricionalmente ativas do genoma e de descondensação da cromatina, não

havendo, entretanto, nessas regiões, uma preferência por cromossomo ou seqüência

(Lacroix et al., 2006a). A integração da fita-T geralmente ocorre em quebras da fita

dupla (double strand breaks – DSBs) no DNA do genoma eucariota por dois

caminhos: via recombinação ilegítima ou não-homóloga (NHR) ou via recombinação

homóloga (HR) que necessita homologia entre o DNA integrante e o DNA-alvo. No

sistema NHR, o DNA integrante está geralmente em forma de fita dupla e sua

integração envolve enzimas de junção de pontas não-homólogas (nonhomologous

end-joining – NHEJ), enquanto que o sistema HR necessita de uma DNA integrante

que esteja, pelo menos parcialmente, em forma de fita simples e, geralmente, envolve

um mecanismo de reparo de lacuna de fita simples (single-strand gap repair – SSGR)

(Lacroix et al., 2006a).

34

Uma vez transferida e integrada no genoma da célula vegetal, a fita-T passa a

ser denominada T-DNA ou DNA transferido. Essa integração é estável e o T-DNA é

transmitido para as células-filha após a divisão mitótica e durante a meiose e a

singamia. Os genes presentes no T-DNA, embora apresentem origem procariota,

possuem seqüências regulatórias que são reconhecidas pelo sistema eucarioto vegetal

e que permite sua expressão após a integração. Um grupo destes genes, também

conhecidos como oncogenes, codifica para a síntese de enzimas envolvidas na via de

biosíntese de hormônios vegetais (auxinas e citocininas), e também na regulação do

balanço auxina/citocinina. A expressão destes genes causa um desequilíbrio hormonal

nas células transformadas resultando na proliferação desordenada das mesmas,

levando assim, à formação de tumores nos sítios infectados da planta (Andrade et al.,

2003; Zupan et al., 2000). Desta forma, a produção endógena de hormônios pelas

células transformadas explica porque esses tumores, uma vez isolados da planta, são

capazes de crescer indefinidamente em meio de cultura, mesmo na ausência de

reguladores de crescimento (Hooykaas & Schilperoort, 1992).

Outros genes presentes na região-T codificam enzimas envolvidas na via da

biosíntese de opinas. As opinas produzidas nas células transformadas (tumor) são

secretadas nas regiões intercelulares do tumor e metabolizadas especificamente pela

linhagem de Agrobacterium indutora do tumor (Petit et al., 1983). Porém, como

somente a linhagem indutora é capaz de catabolizar essa opina como fonte de energia,

carbono e nitrogênio, as células transformadas pelo T-DNA continuam dividindo-se

incontroladamente devido à produção de citocininas e auxinas e quanto mais elas se

dividem, mais elas produzem opinas que vão sendo utilizadas pela bactéria. Criando

desta forma um nicho favorável para o seu desenvolvimento (Dessaux et al., 1993).

O sistema de infecção de plantas pelas agrobactérias representa, assim, uma

situação única na natureza: a transferência de um elemento genético, o T-DNA, de

um organismo procariota para um organismo eucariota superior, com sua subseqüente

integração e expressão no genoma hospedeiro. A demonstração de que a causa da

proliferação celular da galha é a transferência de informação genética da bactéria para

a célula vegetal (Chilton et al., 1977) foi o ponto de partida para pesquisas intensivas

visando a utilização desse sistema natural de transferência de genes para a obtenção

de plantas transgênicas (Zambryski, 1992).

35

1.3.4. Agrobacterium como vetor de transformação de plantas

O conhecimento dos mecanismos moleculares e celulares envolvidos no

processo de infecção de uma planta hospedeira por Agrobacterium permitiu a

utilização desta bactéria como vetor natural de transformação genética de plantas. O

ponto de partida para pesquisas intensivas nesta área foi a demonstração de que

nenhum gene presente na região-T, exceto os 23 pb de suas extremidades, é

necessário ao processo de transferência e integração da fita-T no genoma da planta

infectada (Hoekema et al., 1983; Zambryski et al., 1983). Assim, os genes presentes

na região-T podem ser eliminados e substituídos por genes de interesse, com sinais

para expressão e regulação em plantas, sem que isto afete o processo de transferência.

Além das extremidades da região-T, a região vir do plasmídio Ti é

fundamental para o processo de transferência. Entretanto, a remoção dos oncogenes

do T-DNA se faz necessária, pois a expressão destes genes interfere no balanço

hormonal de auxinas e citocininas nas células transformadas induzindo sua

multiplicação descontrolada. Por este motivo, as células transformadas pelo T-DNA

selvagem não são capazes de regenerar plantas normais. Uma linhagem de

Agrobacterium, cujo oncogenes foram removidos do seu plasmídio Ti, é denominada

“linhagem desarmada”, pois não é mais capaz de induzir a formação de galhas em

plantas.

Conclui-se então, que o desenvolvimento de vetores baseados no sistema

Agrobacterium requer que as extremidades, direita e esquerda, da região-T sejam

conservadas, mantendo também intacta a região vir, e que os oncogenes sejam

removidos. Desta maneira, qualquer outra nova seqüência de DNA, inserida entre as

extremidades da região-T, pode ser transferida e integrada no genoma vegetal, sem

afetar a regeneração da célula transformada em uma planta.

Após a obtenção de uma linhagem desarmada de Agrobacterium, a próxima

etapa é a clonagem na região-T do gene a ser transferido para a planta. Entretanto, o

grande tamanho do plasmídio Ti (aproximadamente 200 kb) dificulta sua

manipulação. Assim, o sistema binário foi desenvolvido, onde os genes presentes na

região vir do plasmídio Ti funcionam in trans para processar e transferir a região-T

(Hoekema et al., 1983). A região-T, contendo os genes de interesse entre suas

extremidades, deverá estar clonada em pequenos plasmídios (de 10 a 30 kb),

denominados vetores binários. Estes vetores são capazes de se replicar

36

autonomamente tanto em Escherichia coli como em Agrobacterium (Brasileiro &

Carneiro, 1998).

1.3.5. Sistema de transformação

A partir do desenvolvimento de vetores binários e sua introdução em

linhagens desarmadas de Agrobacterium, foi possível a transferência de genes

exógenos para plantas, utilizando esta bactéria como vetor natural de transformação.

Os primeiros estudos de transformação genética de plantas envolveram a inoculação

de tecidos de fumo (Nicotiana tabacum) com linhagens engenheiradas de

Agrobacterium (Herrera-Estrella et al., 1983; Zambryski et al., 1983). A partir de

então, o sistema de transformação via Agrobacterium vem sendo utilizado para

transformar um grande número de plantas. A alta eficiência de transformação, o baixo

custo operacional, assim como a simplicidade dos protocolos de transformação e de

seleção são as principais razões para a universalidade do uso do sistema

Agrobacterium (Brasileiro & Lacorte, 2000; Tzfira & Citovsky, 2006).

Atualmente diferentes características de interesse sócio-econômico já foram

introduzidas em diferentes espécies vegetais por transformação genética,

principalmente através do sistema Agrobacterium e do método biobalístico

(Brasileiro, 2001; Brasileiro & Cançado, 2000; Guimarães et al., 2003). Essas

características visam principalmente o melhoramento do desempenho em campo das

plantas cultivadas, através da resistência a estresses bióticos e abióticos.

Características relacionadas ao desenvolvimento da planta e à qualidade do produto

também podem ser modificadas em plantas transgênicas. A tendência é que cada vez

um maior número de características possa ser manipulado via engenharia genética,

aumentando a gama de produtos a serem disponibilizados para o agricultor e o

consumidor. Em um futuro breve, as plantas transgênicas desempenharão também o

papel de biofábricas, desenvolvidas para a produção de produtos de interesse para as

indústrias de medicamentos, de alimentos e de rações.

Além de todas as implicações para a agricultura e outros setores da economia,

as plantas transgênicas constituem também um excelente sistema para estudos básicos

em diferentes campos da biologia, como fisiologia, genética, botânica, biologia

molecular e celular.

37

1.4. Método de transformação genética mediado pelo processo biobalístico

O processo biobalístico (do inglês biolistic), foi desenvolvido inicialmente por

J. Sanford, N. Allen, T. Klein e E. Wolf da Cornell University (USA) (Sanford, 2000;

Sanford et al., 1987; Sanford et al., 1993) e é também conhecido por aceleração ou

bombardeamento de partículas. Foi desenvolvido como uma alternativa para a

introdução direta de material genético no genoma nuclear de plantas superiores.

Desde então, sua universalidade de aplicações tem sido avaliada, demonstrando ser

um processo efetivo e simples para a introdução e expressão de genes em bactérias,

protozoários, fungos, algas, insetos, tecidos vegetais e animais e organelas isoladas,

como cloroplastos e mitocôndria (Aragão et al., 1992; Aragão et al., 1993; Bailey et

al., 1993; Barreto et al., 1997; Bogo et al., 1996; Boynton et al., 1988; Daniell et al.,

1991; Harrier & Millam, 2001; Johnston et al., 1988; Klein & Fitzpatrick-Mcelligott,

1993; Rech et al., 1996; Sanford, 2000; Sanford et al., 1993; Vainstein et al., 1994).

O método consiste na aceleração de partículas com 0,2 a 3 µm de diâmetro,

que atravessam de forma não letal a parede celular e a membrana plasmática

carreando substâncias adsorvidas para o interior da célula (Klein et al., 1987; Sanford,

1988). O processo biobalístico tem sido mais empregado para introduzir moléculas de

DNA, no citoplasma, núcleo e cloroplasto, embora moléculas de RNA e proteínas

possam ser carreadas. Várias modificações têm sido realizadas, aumentando a

eficiência e possibilitando a obtenção de plantas transgênicas de diversas espécies,

que até então não haviam sido transformadas com o uso de outras metodologias

(Aragão et al., 1996; Aragão et al., 2000; Birch & Franks, 1991; Christou, 1995;

Luthra et al., 1997; Rech et al., 2008).

Nos casos em que os sistemas de transformação mediados por Agrobacterium

não podem ser utilizados, devido aos sistemas de cultura de tecidos existentes, a

técnica de biobalística deve ser empregada, uma vez que pode transformar diferentes

tipos de tecidos e células. Além disso, é uma técnica rápida, que envolve menos

manipulação das células em cultura, quando comparados com outros métodos. Vários

tipos de explantes e células podem ser utilizados para a transformação por

biobalística, tais como folhas, calos e caule.

A biobalística pode também ser utilizada juntamente com a inoculação com

Agrobacterium, em tecidos bombardeados cujos microferimentos ampliam a área de

38

infecção, aumentando a eficiência de transformação (Bidney et al., 1992; Brasileiro et

al., 1996). Neste caso, o tecido pode ser bombardeado com partículas nuas e depois

submetido a uma co-cultura com Agrobacterium, ou as bactérias podem ser

previamente misturadas às partículas que são então bombardeadas.

Outra aplicação da técnica de biobalística é no estudo da expressão gênica

transiente. Uma seqüência de DNA introduzida em uma célula pode vir a ser

transcrita, mesmo sem ser integrada ao genoma. A maior expressão gênica transiente

é observada de 24 a 72 horas após a transferência, não sendo praticamente detectada

após uma semana. A análise da expressão transiente foi e ainda é bastante utilizada

para otimização dos parâmetros envolvidos no processo de bombardeamento. No

entanto, tem sido mais utilizada em estudos de regulação gênica e para a avaliação de

promotores (seqüências regulatórias). Nestes casos, genes quiméricos são construídos,

como as seqüências regulatórias ligadas a genes marcadores (principalmente gus e

gfp), e as construções são utilizadas para o bombardeamento de tipos celulares

específicos. Para esse tipo de estudo a biobalística apresenta vantagens sobre as

técnicas que utilizam protoplastos (eletroporação ou transformação mediada por

PEG), uma vez que os tipos celulares são transformados sem necessidade de

manipulações mais sofisticadas in vitro. A expressão gênica pode ser analisada em

células intactas e tecidos organizados, o que é essencial para o estudo de promotores

tecido-específicos e a técnica é simples e mais rápida.

1.4.1. Os sistemas

Foram desenvolvidos e construídos diferentes sistemas capazes de acelerar

micropartículas cobertas com ácidos nucléicos, a velocidades superiores a 1.500

km/h. Todos estes sistemas baseiam-se na geração de uma onda de choque com

energia suficiente para deslocar uma membrana carreadora contendo as

micropartículas cobertas com DNA (Rech et al., 1996; Rech et al., 2008) (fig. 6 - A e

B), outros sistemas não exigem a utilização de uma menbrana carreadora (Aragão et

al., 1995; Finer et al., 1992; Sautter et al., 1991; Takeuchi et al., 1992; Vain et al.,

1993) (fig. 6 - C e D).

A onda de choque pode ser gerada através de uma explosão química de

pólvora seca (Sanford et al., 1987), por uma descarga de hélio a alta pressão (Aragão

et al., 1996; Aragão et al., 2000; Sanford et al., 1991), por uma descarga de ar

39

comprimido (Morikawa et al., 1989), pela vaporização de uma gota de água através

da descarga elétrica com alta voltagem e baixa capacitância (Christou, 1993; McCabe

& Christou, 1993; McCabe et al., 1988) ou baixa voltagem a alta capacitância

(Aragão et al., 1992; Aragão et al., 1993; Rech et al., 1991). Os sistemas que utilizam

alta pressão de gás hélio e descarga elétrica têm demonstrado possuírem um amplo

espectro de utilização e serem mais eficientes para a obtenção de altas freqüências de

transformação.

Fig. 62– Esquema básico dos principais sistemas biobalísticos para transformação genética de plantas. Nestes sistemas temos em comum que (1) as micropartículas (em geral de ouro ou tungstênio) são recobertas com o DNA contendo os genes a serem inseridos. As partículas são aceleradas a altas velocidades (2) e penetram nas células vegetais de forma não destrutiva (3). Os sistemas diferem basicamente na geração de energia para movimentar as partículas e no suporte em que elas são depositadas que pode ser (A) gás hélio com alta pressão com as partículas depositadas sobre um suporte plástico (membrana carreadora de kapton ou mylar), (B) descarga elétrica para vaporização de uma gota de água com as partículas depositadas sobre um suporte plástico, (C) gás hélio com baixa pressão e as partículas presas por capilaridade (em suspensão em um meio líquido) sobre uma tela de metal (PIG), (D) gás hélio com baixa pressão e as partículas secas depositadas no interior de um tubo fino de plástico. Nos sistemas A e B a membrana carreadora fica retida em uma tela, pela qual as partículas atravessam em direção às células-alvo (Aragão & Brasileiro, 2009).

Os equipamentos desenvolvidos originalmente possuem uma câmara selada

com vácuo parcial, o que limita muito sua utilização em amostras grandes ou pouco

resistentes a danos provocados pela exposição ao vácuo. Assim, foram desenvolvidos

equipamentos mais sofisticados que não requerem câmaras de vácuo e podem ser

utilizados in vivo, em amostras grandes e em condições de campo (Rech et al., 1996;

Rinberg et al., 2005; Roizenblatt et al., 2006; Shefi et al., 2006). Equipamentos

manuais (hand-held gene guns) têm sido utilizados com sucesso para transfectar

diversos tipos celulares e organismos, como bactérias e levedura, e especialmente

40

para introduzir genes em plantas e animais no campo ou casa de vegetação, e para

inoculação de vírus em plantas (Burkhalter & Bernardo, 1989; Grutzendler et al.,

2003; O’Brien & Lummis, 2004; Rech et al., 1996; Sambrook & Russell, 2006).

1.4.2. As micropartículas

Micropartículas de distintas naturezas podem ser empregadas como

carreadoras de DNA, desde que não degradem ou causem quebras em ácidos

nucléicos, tenham alta densidade, tamanho e formato adequados. No início do

desenvolvimento da tecnologia biobalística foram testadas micropartículas de vários

materiais, tais como metais com alta densidade como platina e irídio, além de vidro,

sílica e outras, resultando em baixa freqüência de transformação genética (Sanford et

al., 1993). Recentemente a prata tem sido utilizada em uma técnica chamada de

diolística (Roizenblatt et al., 2006). Atualmente, os microprojéteis mais empregados

como microcarreadores têm sido partículas de tungstênio ou ouro. As de tungstênio

têm formato irregular e tamanho entre 0,2 e 3,0 µm, são potencialmente tóxicas para

alguns tipos de células (Armaleo et al., 1990; Russell et al., 1992) e sujeitas à

oxidação rápida com conseqüente efeito negativo sobre o DNA, seu custo é bastante

reduzido. As de ouro são biologicamente inertes, de formato esférico e diâmetro de

1,0 a 7,5 µm, mais uniforme que as de tungstênio, têm um custo mais elevado.

Experimentos com células animais têm demonstrado que partículas de ouro maiores

são mais adequadas (Cheng & Joho, 1994; Rech et al., 1996). Células desidratadas de

Escherichia coli e Agrobacterium tumefaciens, funcionando como uma forma natural

de encapsulação de DNA, foram utilizadas com sucesso no lugar das micropartículas

cobertas de DNA, para a transferência de genes em suspensão celular de fumo e milho

(Rasmussen et al., 1994).

O tipo apropriado de micropartículas varia em função do tamanho das células

a serem transformadas. Como uma regra geral, as micropartículas devem possuir um

tamanho aproximado de 1/10 do tamanho da célula-alvo. Portanto, para células de

microrganismos (células bacterianas e esporos fúngicos), micropartículas com

diâmetro em torno de 0,2 µm (M5, Sylvania) são mais apropriadas. Para células de

plantas, partículas com diâmetro em torno de 0,2 a 1,5 µm (M10, Sylvania) são as

mais indicadas. Mazus et al. (2000) mostraram evidências de que partículas de

tungstênio podem interagir com plasmídios e gerar quebras na molécula de dsDNA

41

gerando moléculas lineares. Partículas de ouro de 1 a 3 µm, que não apresentam

toxidez são recomendadas para células animais, que apresentam maior tamanho e

também podem ser utilizadas para determinados tipos de células vegetais (Aragão et

al., 1993).

Diversas características relativas às micropartículas influem na eficiência de

transformação, pela interação com o DNA ou com a célula. Dessa forma, estudos

visando avaliar o efeito de diferentes tamanhos, formatos, homogeneidade e tipo de

material das partículas podem contribuir para a otimização do processo de

biobalística. Recentemente micropartículas com formatos de rosca, em forma de tubos

e com cavidades têm sido desenvolvidas e podem ser bastante úteis.

Diversos protocolos de precipitação de DNA sobre as partículas têm sido

descritos (Sanford et al., 1993). O método mais utilizado, desenvolvido inicialmente

por Klein et al. (1987), emprega cloreto de cálcio e espermidina. As partículas com o

DNA adsorvido são lavadas e ressuspendidas em etanol absoluto, e distribuídas sobre

a membrana carreadora. O etanol evapora rapidamente e as partículas com o DNA

permanecem secas sobre o macrocarreador. Como o etanol absoluto e a espermidina

são muito higroscópicos, as partículas com o DNA tendem a absorver umidade,

formando agregados. Estes agregados de micropartículas danificam as células quando

as atingem, resultando em baixa freqüência de transformação. O experimento de

Smith et al. (1992) mostrou claramente que a umidade relativa do ar no momento da

deposição das micropartículas na membrana é um fator muito importante. Esse fator e

tanto mais importante quanto menor for o diâmetro das partículas utilizadas e menor

for a célula-alvo. DNA em excesso ou preparações impuras também causam a

aglomeração das partículas (Aragão et al., 1993; Klein et al., 1988). Variações nas

metodologias de precipitação de DNA sobre as micropartículas, bem como protocolos

alternativos, podem diminuir os problemas associados aos métodos disponíveis,

principalmente pela redução da formação de agregados, e na reprodutibilidade dos

experimentos.

1.4.3. Parâmetros físicos importantes

As micropartículas são rapidamente desaceleradas em conseqüência do atrito

com o ar, devido a sua massa reduzida. Para que haja uma minimização desse efeito

nos principais sistemas de biobalística descritos (com exceção dos sistemas hand-

42

held), a quantidade de ar na câmara deve ser reduzida com auxílio de uma bomba de

vácuo. O vácuo deve ser mantido a uma pressão em torno de 710 mm de Hg. Vácuo

acima desse nível não conduz a uma melhor freqüência de expressão do gene

introduzido, provavelmente por causa da redução do vapor residual de água da própria

amostra biológica. Para certas aplicações o vácuo deve ser reduzido, como no caso do

bombardeamento de células animais em cultura e animais in vivo (Johnston et al.,

1991). Em alguns casos, gás hélio é injetado na câmara de vácuo, de forma que

substitua o ar residual. A adição do gás hélio, de baixo peso molecular e baixa

densidade, aumenta a eficiência de transformação, provavelmente pela redução do

atrito e conseqüente diminuição da desaceleração. Esse fato tem sido observado

principalmente em microrganismos, onde se utilizam micropartículas menores (0,2

µm). Em bactérias, o aumento da eficiência pode chegar a 6 vezes e, em leveduras, a

até 4 vezes (Sanford et al., 1993; Smith et al., 1992). No caso de plantas, onde se

empregam partículas até cinco vezes maiores (1,0 µm), a injeção de hélio na câmara

de bombardeamento não apresenta efeito significativo na eficiência de transformação

(Sanford et al., 1993).

Outro parâmetro muito importante que deve ser otimizado para cada tipo

celular são as distâncias entre as células-alvo e o ponto de origem das partículas ou da

fonte geradora de energia para movê-las. No caso dos equipamentos de gás hélio a

alta pressão, deve-se otimizar a distância entre a membrana de ruptura e a membrana

carreadora de partículas (macrocarreador), a distância entre a membrana carreadora

até a tela de retenção e desta até o tecido-alvo. Isto é importante devido ao fato de

ondas de choque e acústica se propagarem pelo interior do equipamento no momento

do disparo. Estas, necessárias para a aceleração do macrocarreador, podem causar

danos às células-alvo (Russell et al., 1992). A intensidade e forma dessas ondas

variam conforme as distâncias entre a fonte geradora da onda de choque (membrana

de ruptura) e o macrocarreador, entre o macrocarreador e a tela de retenção, e desta

até as células-alvo. Esses parâmetros também influem na velocidade final das

micropartículas, sua capacidade de penetração e, conseqüentemente, na eficiência da

transferência e expressão gênica (Kemper et al., 1995; Kikkert, 1993; Sanford et al.,

1993).

Outro parâmetro importante é a pressão do gás hélio. Na maioria dos casos

essa pressão é de 1.200 psi, entretanto, deve ser ajustada para cada tecido a ser

bombardeado. Uma pressão muito alta pode acarretar dano aos tecidos enquanto

43

pressões mais baixas podem levar a uma baixa penetração das partículas, que podem

não atingir os tipos celulares desejados em cada tecido-alvo.

1.4.4. Os vetores

O processo biobalístico é bastante influenciado por algumas das características

dos vetores empregados, com efeitos marcantes sobre a introdução e integração dos

genes exógenos nas células. O DNA plamidial pode ser precipitado sobre

micropartículas, acelerado e introduzido, tanto na forma circular quanto linear. O

tamanho do vetor aparentemente não é um fator limitante (Lacorte et al., 1997;

Sanford et al., 1993). Entretanto, há uma limitação da massa de DNA que poderá ser

adsorvida às micropartículas. Grandes quantidades de DNA tendem a gerar

aglomerados de micropartículas (Aragão et al., 1993; Lacorte et al., 1997).

Teoricamente, 400 a 800 cópias de um plasmídio de 10 kb são adsorvidas em uma

micropartículas com 1,2 µm de diâmetro médio. Estes aglomerados causam danos às

células devido às suas dimensões e massa. O número de cópias dos genes introduzidos

é um fator importante para sua expressão transiente (Lacorte et al., 1997), no entanto,

a influência sobre a integração ainda necessita ser investigada. Finalmente, como o

tamanho do vetor (DNA plasmidial) é diretamente proporcional à sua massa e

inversamente proporcional ao número de cópias possível de ser precipitado sobre as

micropartículas, deve-se então dar preferência a vetores pequenos, entre 2-15 kb. A

freqüência de transformação estável, isto é, a obtenção de plantas transformadas,

parece ser um pouco reduzida quando da utilização de vetores lineares (Bonfim et al.,

2007; Vianna et al., 2004). Entretanto, devido a questões de biossegurança pode-se

optar pela utilização de vetores lineares. Esses vetores são produzidos após a remoção

(pela digestão com enzimas apropriadas) de seqüências gênicas que conferem

resistência a antibióticos, presentes nos vetores circulares. É recomendável que o

vetor circular possua um sítio para uma enzima que permita a digestão e eliminação

de genes desnecessários para o processo de transformação genética. É possível a co-

transformação, com a utilização de dois ou três vetores simultaneamente. Isto

permitirá a segregação dos transgenes nas gerações seguintes. As freqüências de co-

transformação para genes presentes em um único vetor são de cerca de 100%

44

enquanto que para genes presentes em vetores distintos é de cerca de 50% (Aragão et

al., 1996).

Os plasmídios utilizados no processo biobalístico não necessitam de nenhuma

seqüência moduladora da sua integração no genoma vegetal, ao contrário dos vetores

de Agrobacterium. Em levedura (Orr-Weaver et al., 1981) e algumas espécies de

Synechococcus (Williams & Szalay, 1983), a integração do DNA exógeno ocorre

devido a seqüências homólogas ao DNA cromossomal (recombinação homóloga). A

integração do DNA exógeno, introduzido por métodos diretos no genoma de células

vegetais parece ser diferente. Aparentemente sua integração independe de presença de

seqüências homólogas no genoma vegetal (Ilda et al., 1990; Morikawa et al., 1994).

Entretanto, o mecanismo de integração ainda necessita ser mais bem compreendido.

1.4.5. Transformação de meristemas apicais

Com o surgimento dos processos biobalísticos abriu-se a possibilidade de

transformação direta in situ das células do meristema apical. Desta forma vislumbrou-

se a possibilidade de obtenção de plantas transgênicas através da transformação de

celulas-mãe do meristema apical. No final dos anos 80, a soja, a primeira planta

transgênica pelo processo biobalístico foi obtida a partir de células transformadas do

meristema apical (McCabe et al., 1988).

O meristema apical vem sendo alvo de um grande número de estudos. A

maioria destes tem investigado a função das diferentes células que o compõem. A

região apical é constituída do meristema apical propriamente dito, dos primórdios dos

órgãos laterais e da região de maturação, onde a diferenciação se torna aparente

(Cutter, 1965). A região apical de meristemas apicais de feijão é composta

basicamente pelo meristema apical, primórdios foliares e folhas primárias.

A transformação destas células meristemáticas através do processo biobalístico

tem-se mostrado bastante eficiente. Em cultivares de algodão, a eficiência de

transformação ficou entre 0,027 e 0,71%, com relação ao número de plantas

transgênicas obtidas e o número de embriões bombardeados (Aragão et al., 2005;

McCabe & Martinell, 1993). A freqüência de transformação, no entanto, pode ser

significativamente aumentada através da indução de organogênese na região do

meristema apical. Em feijoeiro, a freqüência de transformação foi de 0,9% com a

45

utilização de vetores circulares (Aragão et al., 1996) e entre 0,2 e 0,8 com o uso de

vetores lineares (Bonfim et al., 2007; Vianna et al., 2004).

Com relação aos fatores biológicos que influenciam o processo, vão desde

aqueles relacionados à integração do DNA exógeno no genoma vegetal até a

neoformação de brotos a partir das células meristemáticas apicais. Além da fisiologia

das células, a morfologia da região apical e sua resposta a citocininas são fatores

muito importantes. Algumas variedades de feijão apresentam os meristemas apicais

encobertos total ou parcialmente pelos primórdios foliares, o que dificulta sua

transformação, sendo necessário encontrar variedades cujo domo apical seja

completamente exposto ao bombardeamento (Aragão & Rech, 1997; Bonfim et al.,

2007). Em caupi, não foi possível encontrar variedades com o domo apical exposto.

No entanto foi possível realizar a transformação pelo bombardeamento de células

meristemáticas apicais após a remoção das folhas primárias e primórdios foliares (Ivo

et al., 2008). Estes pontos são extremamente importantes para o desenvolvimento de

uma metodologia de transformação que seja independente da cultivar.

1.4.6. Transformação cloroplasmática

A transformação cloroplasmática, inserção do transgene no genoma do

cloroplasto, em alguns casos tem algumas vantagens em relação à transformação do

genoma nuclear. As principais vantagens apontadas são: altos níveis de expressão

heteróloga (De Cosa et al., 2001; Tregoning et al., 2003), contenção do transgene

devido ao fato de que para a maioria das plantas superiores o genoma cloroplasmático

tem herança materna (Birky, 2001; De Cosa et al., 2001; Ruf et al., 2001; Svab &

Maliga, 1993), ausência do efeito de posição devido ao fato de que é possível

direcionar a integração para uma região específica (Staub & Maliga, 1992), e

diminuição dos problemas de silenciamento gênico quando múltiplos genes devem ser

inseridos, devido ao fato de que a maquinaria traducional dos cloroplastos tem a

capacidade de traduzir transcritos policistrônicos, onde há um promotor para um ou

mais genes (De Cosa et al., 2001; Kanamoto et al., 2006; Staub & Maliga, 1995).

Com o advento da biobalística foi possível inicialmente transformar uma alga verde

(Chlamydomonas) (Boynton et al., 1988). Entretanto, apesar de todas estas vantagens,

quase uma década foi necessária até que essa tecnologia tenha sido desenvolvida para

plantas superiores (Svab et al., 1990; Ye et al., 1990). Apesar de ser possível

46

transformar cloroplastos com outras metodologias (eletroporação e mediada por

PEG), o processo de biobalística tem sido mais presente na literatura.

1.4.7. Inoculação de vírus e viróides

A biobalística também tem sido utilizada para a inoculação de vírus e viróides

em plantas. O genoma viral clonado, ou mesmo DNA ou RNA de uma planta

infectada, é transferido para a célula, possibilitando a infecção. Este método tem sido

empregado, principalmente em vírus, nos casos em que os métodos para inoculação

mecânica não são eficientes, como os geminivírus (Aragão et al., 1995; Gal-On et al.,

1997; Garzón-Tiznado et al., 1993; Gilbertson et al., 1991). Também tem sido usado

para inoculação com viróides (Matoušek et al., 2004). Ultimamente, tem sido

utilizado por vários grupos como o método preferido para inoculação em estudos

básicos de fitopatologia e teste de plantas transgênicas resistentes (Calegario et al.,

2007; Helloco-Kervarrec et al., 2002; Makwarela et al., 2006).

1.4.8. Diolística

O processo de biobalística tem também sido utilizado para introduzir

substâncias fluorescentes ou coloridas (corantes) em células. Essa técnica é chamada

de diolística (O’Brien & Lummis, 2004; 2007). Os corantes são aderidos às

micropartículas ou filtros e então são bombardeados para penetrarem nas células. A

utilização destes corantes não tóxicos, como a carbocianina, que podem ser

transportados pela célula, tem permitido a marcação de muitos tipos celulares e

permanecem funcionais por um longo período (O’Brien & Lummis, 2007). A

diolística tem vantagens sobre outras técnicas, como a microinjeção e eletroporação,

por ser mais simples, rápida, e poder marcar um maior número de células ao mesmo

tempo. Além disso, a técnica de microinjeção pode dialisar o conteúdo celular, causar

ruptura em componentes celulares vitais, afetando o funcionamento da célula. A

técnica de diolística tem sido muito útil para estudos da arquitetura e morfologia em

células animais (O’Brien & Lummis, 2007) porém ainda é pouco utilizada para o

estudo de células vegetais.

47

1.5. Método de transformação genética por eletroporação de protoplasto

A eletroporação de protoplastos é um método utilizado para introduzir

macromoléculas (RNA, proteínas, corantes e drogas) em células vegetais.

Protoplastos são células vegetais desprovidas de parede celular e,

teoricamente, podem ser isolados de qualquer tecido vegetal. Em cultura de tecidos

com condições bem-estabelecidas, os protoplastos reconstituem suas paredes,

dividem-se, formam colônias, calos e regeneram plantas, por embriogênese ou

organogênese (Abdullah et al., 1985; Panis et al., 1993).

Para se obter os protoplastos é necessário a incubação do tecido vegetal em

meio de digestão composto de enzimas pectocelulolíticas, e enzimas que digerem os

principais componentes da parede celular: celulose, lignina e pectina. Outros

parâmetros importantes, que devem ser determinados para cada tecido e genótipo

diferente, são (1) o pH, que deve favorecer a atividade enzimática e não comprometer

a viabilidade das células, (2) a pressão osmótica, que deve favorecer a estabilidade

dos protoplastos recém formados, (3) a composição do meio de digestão, (4) o tempo

de permanência do tecido nesse meio e (5) o estado fisiológico da planta doadora.

Após a digestão da parede celular, os protoplastos devem ser purificados, e o

número de protoplastos intactos determinado, utilizando-se um hemacitômetro. Após

esta purificação e quantificação, realiza-se imediatamente a eletroporação que

consiste na indução de poros reversíveis nas membranas celulares, resultando em

fluxo de íons e moléculas através da membrana deformada (Chang, 1989).

Adiciona-se à suspensão de protoplastos, o plasmídeo no qual estão clonados

os genes de interesse e os genes marcadores, que facilitam a recuperação das células

transformadas. Pode-se também adicionar DNA carreador (DNA de timo de boi ou

DNA de esperma de salmão fragmentado), com a finalidade de aumentar a eficiência

de transformação. No momento da eletroporação o grande número de células

encontra-se individualizado e homogêneo, o que favorece a obtenção de

transformantes independentes e facilita a seleção. A seleção é feita no início da

cultura, quando a maioria das células derivadas dos protoplastos está na segunda

divisão. Esta seleção precoce é bastante eficiente, evita o aparecimento de falsos

transformantes ou quimeras, o que é um problema em outras técnicas de

transformação, nas quais a seleção é realizada em tecidos ou órgãos intactos.

48

Introduziram pela primeira vez DNA exógeno em células de camundongo,

desta maneira. Adaptaram a técnica de eletroporação a protoplastos de milho e fumo,

oferecendo, assim, uma alternativa de transformação de cereais, pois o sistema de

transformação via Agrobacterium era considerado ineficiente em monocotiledôneas

Fromm et al. (1985).

Assim, por meio da eletroporação de protoplastos diferentes genes foram

incorporados ao genoma de diversas plantas, de forma estável, conferindo-lhes novas

características. Os genes exógenos geralmente se mantêm de forma estável

segregando na progênie, de acordo com as leis de Mendel. Nos últimos anos, a

eletroporação tem sido particularmente útil em estudos de expressão transiente, que é

a expressão do gene exógeno sem necessária integração ao genoma da planta

hospedeira. Esse tipo de experimento possibilita a análise rápida da funcionalidade de

construções e permite o estudo de promotores e de outros fatores envolvidos no

controle da expressão gênica, livres do efeito de posição observadas na transformação

estável.

A maioria dos aparelhos de eletroporação, os eletroporadores, utiliza descarga

de capacitores para produzir pulsos de alta voltagem. A intensidade do pulso é

determinada pela voltagem aplicada e condutividade do meio. Quando não se

conhecem os parâmetros para a eletroporação de uma espécie ou tecido vegetal, é

sempre necessário otimizar: a intensidade da voltagem e a capacitância, a duração do

pulso, a condutividade do meio, a concentração dos protoplastos e a quantidade de

DNA (plasmídeo e carreador), entre outros. O grau de permeabilidade da membrana

dependerá do campo elétrico aplicado e do tipo celular. Altos níveis de

permeabilização facilitam a entrada de DNA, entretanto, diminuem a viabilidade da

célula. Portanto, é necessário estabelecer uma curva de viabilidade da célula em

relação aos parâmetros aplicados. O campo elétrico ótimo para uma expressão

transiente máxima varia com a espécie e, geralmente, corresponde a uma viabilidade

dos protoplastos inferior a 50%.

A eficiência de transformação mediado pela eletroporação é dada de duas

maneiras: (1) frequência absoluta de transformação (FAT), que representa o número

de colônias transformadas dividido pelo número inicial de protoplastos, e (2)

freqüência relativa de transformação (FRT), dada em porcentagem, que representa o

número de colônias transformadas dividido pelo número total de colônias obtidas sem

seleção, multiplicado por 100. A eficiência de transformação varia significativamente

49

entre diferentes espécies e mesmo entre cultivares da mesma espécie. Quanto ao tipo

de plasmídio utilizado, alguns trabalhos demonstram que o plasmídeo linearizado

favorece a transformação, entretanto, altas freqüências de transformação têm sido

obtidas utilizando-se plasmídeos circulares. A transformação com dois plasmídeos

(co-transformação ) também é viável.

Em um estudo inicial com alface (Lactuca sativa L.), protoplastos de folhas

adultas de alface foram eletroporadas em soluções tampão ajustadas osmoticamente

contendo o DNA plasmidial com pCAMV CAT ou pABD1. Os protoplastos de

alface se mostraram possíveis de sofrer transformação direta sob as condições gerais

empregadas nos protoplastos de tabaco. A integração do DNA exógeno ao DNA

genômico da alface de plantas resistentes foi demonstrado por análise de Southern

blot. A transformação direta permite novas oportunidades em estratégias específicas

para o desenvolvimento de novas cultivares de alface (Michelmore et al., 1987a) e de

outras plantas superiores.

1.6. Engenharia genética de alface

A engenharia genética é uma importante ferramenta no auxílio ao

melhoramento de plantas. Dessa forma, diversas pesquisas e estudos utilizando a

engenharia genética, têm sido realizados em plantas de alface com o objetivo de

melhorar sua tolerância a herbicidas, aumentar sua resistência a patógenos, para

supressão da formação de certas substâncias que iniciam o processo de escurecimento

de suas folhas, para modificação da forma das folhas, dentre outros.

Como exemplo, Dias et al. (2006) expressaram o gene da oxalato

decarboxilase (oxdc) de Flammulina sp. em plantas de alface transgênicas para

conferir resistência ao fungo Sclerotinia sclerotiorum, que produz ácido oxálico,

degrada as paredes celulares das células da folha e causa o apodrecimento de plantas

como alface, soja, feijão e tomate. Com o uso da transformação mediada por

Agrobacterium tumefaciens foram produzidas plantas contendo o gene oxdc que ao

clivarem o ácido oxálico não apresentaram sintomas quando folhas isoladas foram

inoculadas com uma cultura de S. Sclerotiorum.

Santos et al. (2008) produziram linhagens transgênicas de alface objetivando

silenciar o gene serk (somatic embryogenesis receptor-like kinase) endógeno usando

RNA antisense. O gene serk tem um papel importante na indução de embriogêneses

50

somáticas e zigóticas em plantas. As plantas transgênicas obtidas apresentaram uma

redução no número de sementes viáveis e redução em sua habilidade de formar

estruturas embriogênicas somáticas in vitro. Além disso, as linhagens transgênicas

apresentaram uma maior sucetibilidade ao fungo S. sclerotiorum (estes resultados

corroboram a idéia de que o gene serk pode estar envolvido não apenas no

crescimento e desenvolvimento das plantas, como provavelmente no mecanismo geral

da percepção de estresse biótico e abiótico).

Nagata et al. (2000) obtiveram plantas transgênicas de alface resistentes ao

herbicida glifosato (N-(fosfonometil) glicina), pela superexpressão da enzima 5-

enolpiruvil chiquimato-3-fosfato sintase (epsps).

Plantas de alface também têm sido utilizadas para expressão de biofármacos.

Usando o sistema Agrobacterium, Young-Sook et al. (2006) expressaram um gene

para produção da subunidade β da toxina do cólera (CTB), uma toxina usada como

vacina contra o cólera, infecção intestinal aguda causada pela bactéria Vibrio cholerae

que é capaz de produzir uma enterotoxina que causa diarréia. O gene CTB sintético,

com otimização de códons comuns nas plantas de alface foi fusionado com um

peptídeo sinal de retenção no retículo endoplasmático. A expressão nas plantas

transgênicas alcançou o nivel de 0,24% de CTB em relação à proteína total solúvel.

Em outro trabalho recente, houve transformação de cloroplastos de folhas e

tabaco e obtiveram linhagens destas plantas transgênicas com a expressão das

proteínas fusionadas da subunidade β da toxina do cólera e da proinsulina humana

(CTB-Pins, em inglês cholera toxin B subunit–human proinsulin). CTB-Pins

acumulou mais de 16% da proteína total solúvel (PTS) em tabaco e mais de 2,5% de

PTS em alface. Oito miligramas de folhas de tabaco em pó expressando CTB-Pins ou,

como controle negativo, CTB-proteína verde fluorescente (CTB-GFP) ou interferon-

GFP (IFN-GFP), ou folhas não transformadas foram administradas oralmente,

semanalmente por um período de 7 semanas, para fêmeas diabéticas de camundongos

não obesas de 5 semanas de idade. O pâncreas de camundongos tratados com CTB-

Pins mostrou uma diminuição na infiltração das células características de linfócitos

(insulitis), produção de insulina nas células β das ilhas pancreáticas dos camundongos

tratados com CTB-Pins foram significantemente preservadas, com baixos níveis de

glicose sanguíneo ou na urina, em contraste com as poucas células β restantes nas

ilhotas pancreáticas dos controles negativos (Ruhlman et al., 2007). Segundo os

autores, este é o primeiro anúncio de expressão de proteína terapêutica em

51

cloroplastos transgênicos de uma cultivar comestível. Plantas de alface

transplastônicas, isto é, com todos os cloroplastos da planta transformados com o gene

de interesse, no caso CTB-Pins, cresceram normalmente e, como esperado, os

transgenes foram maternalmente herdados na progênie T1. Estes resultados abrem a

possibilidade de produção de baixo custo de proteínas terapêuticas para humanos, e de

desenvolvimento de uma estratégia para o tratamento de várias outras doenças auto-

imunes (Ruhlman et al., 2007).

Vários trabalhos têm sido realizados para se produzir em alface subunidades

de vacinas recombinantes o que se refere ao uso de proteína derivada de patógeno, ou

apenas o domínio imunogênico da proteína, chamado epitopo, ou o próprio patógeno

morto ou atenuado para estimular a proteção imunológica. O conceito original do uso

de plantas para a produção de vacinas foi baseado na idéia que o tecido vegetal pode

servir de alimento aos humanos e animais comercialmente importantes. Este método

de vacinação dispararia uma resposta imune na mucosa, o que representa o primeiro

passo de defesa contra a maioria dos patógenos. A expressão de proteínas de uma

variedade de patógenos microbiano e viral possibilitou a expressão de sistemas de

produção de subunidades de vacinas em plantas transgênicas, incluindo a expressão

da proteína de superfície do antígeno da hepatite B (HbsAg) em alface (Kapusta et al.,

2001). Outra proteína expressa em alface é a glicoproteina viral E2 recombinante de

cólera dos porcos ou peste suína clássica, uma doença altamente contagiosa e

frequentemente fatal nos suínos, bastante importante para a economia da suinocultura,

já que a doença permanece endêmica ou recorrente em outras áreas (Legocki et al.,

2005).

1.7. Engenharia genética para biofortificação de plantas

Humanos necessitam de mais de 22 elementos minerais, os quais podem ser

conseguidos com uma dieta apropriada, no entanto, populações que subsistem de

dietas a base de cereais, ou que subsistem do plantio em regiões com desbalanço de

minerais no solo, principalmente ferro (Fe), zinco (Zn), cálcio (Ca), magnésio (Mn),

cobre (Cu), iodo (I) e selênio (Se) sofrem de carência de um ou mais destes minerais

essenciais (White & Broadley, 2005). Estratégias tradicionais para aumentar estes

minerais nas dietas das populações carentes levaram a programas de suplementação

ou fortificação de alimentos. Infelizmente, estas intervenções nem sempre foram bem

52

sucedidas. Uma solução alternativa é aumentar a concentração de minerais ou

vitaminas em plantas comestíveis, isto é chamado “biofortificação”. Este processo

pode ser conseguido pela fertilização mineral ou melhoramento gênico de plantas.

Existe considerável variação genética em espécies cultivadas que podem ser

manipuladas para estratégias de biofortificação sustentável. Variedades com aumento

na concentração de minerais em suas porções comestíveis já estão disponíveis e novos

genotipos com maiores densidades de minerais estão sendo desenvolvidos (White &

Broadley, 2005).

Durante a última década, têm havido consideráveis progressos na elucidação

das vias biossintéticas de plantas importantes para a saúde do ser humano. Esse

avanço possibilitou o uso de técnicas de modificações gênicas para desenvolver

variedades cultiváveis com aumento nas quantidades de minerais e vitaminas

essenciais, e melhorou as características dos componentes nutracêuticos. Muitas

pesquisas com vitaminas e minerais têm focado em gerar novas variedades de plantas

cultivadas para melhorar a dieta da população dos países em desenvolvimento.

A biotecnologia de plantas pode contribuir muito para a segurança alimentar e

nutricional. Por exemplo, o desenvolvimento do “Golden Rice” ou arroz dourado

(rico em provitamina A) gerado pelo grupo do prof. Ingo Potrykus. Esse trabalho deu

início à aplicação de tecnologia genética para se obter tanto melhoria na qualidade

nutricional quanto na saúde da população humana (Potrykus, 2001). Deficiências de

minerais e proteínas, bem como segurança alimentar continuam sendo os maiores

desafios para países em desenvolvimento.

Atualmente projetos de pesquisa estão direcionando seus esforços sobre dois

produtos: mandioca (Manihot esculenta Crantz) e arroz (Oryza sativa L.). A raiz

tropical mandioca é a maior fonte de alimento para aproximadamente 600 milhões de

pessoas no mundo (Sautter et al., 2006). Na África sub-Sahariana mais de 200

milhões de pessoas utilizam a mandioca como sua maior fonte de energia alimentar. A

qualidade nutricional da raiz da mandioca não é suficiente para suprir todas as

necessidades dietéticas diárias (Sautter et al., 2006). Ainda neste contexto, o arroz

constitui-se no principal alimento de metade da população do mundo, fornecendo

aproximadamente 20% da energia per capita e 13% da proteína para consumo humano

do mundo (Sautter et al., 2006). Por isso, o desenvolvimento de novas linhagens de

arroz com aumento na quantidade de provitamina A e Fe é importante, pois

representam deficiências mundiais.

53

A pesquisa na produção de nutracêuticos tem geralmente sido induzida a gerar

novas cultivares para mercados nas nações desenvolvidas, com o objetivo de fornecer

cultivares elite exibindo grande apelo de consumo. Os grandes progressos com

nutracêuticos têm sido feitos com apenas alguns tipos de metabólitos até o momento,

em particular na produção de novos ácidos graxos polinsaturados de cadeia longa em

sementes oleaginosas e para aumentar as quantidades de flavonóides e carotenóides

em tomate e batata (Davies, 2007). No entanto, devido ao rápido progresso na

elucidação de vias de biossíntese de metabólitos vegetais, espera-se em um futuro

próximo grande sucesso com o aumento dos níveis de componentes das plantas para a

saúde dos seres humanos, por meio da biotecnologia (Davies, 2007).

Arroz, o principal produto agrícola do mundo, é uma fonte pobre em

micronutrientes essenciais, incluindo folato. A fortificação de sementes dessa cultura

foi alcançada por intermédio da superexpressão de um locus simples contendo dois

genes de Arabidopsis thaliana dos ramos da pterina e pABA na via de biossíntese de

folato. Esse trabalho propiciou um aumento de 100 vezes na quantidade de folato

quando comparado com linhagens selvagens. A partir de 100g de grãos crus polidos

foram obtidos quatro vezes o requerimento diário para um adulto, que é de 200µg de

folato por dia (Storozhenko et al., 2007).

Outros grupos trabalharam na via metabólica de produção de folato

envolvendo a superexpressão do GTP ciclohidrolase I (gchI), que catalisa o primeiro

passo da síntese de pterinas, em A. thaliana e tomate (Solanum lycopersicum) (De La

Garza et al., 2004; Hossain et al., 2004). Apesar de terem conseguido um aumento de

2 a 4 vezes no fluxo de pterinas, os pesquisadores notaram um severo decréscimo nos

níveis de ácido para-aminobenzóico (pABA) nas plantas transformadas, sugerindo

que o suprimento de pABA tinha se tornado limitante para a síntese de folato. Para

solucionar este problema, De La Garza et al. (2007) combinaram as duas vias

metabólicas no tomate, a de síntese de pABA e a de síntese de pterinas, conseguindo

ainda uma produção de folato pelo fruto suficiente para suprir as recomendações

diárias de folato para um adulto com apenas 100g de tomate. Os tomates acumularam

sete vezes mais folato do que qualquer outro vegetal verde considerado rico em folato.

Diversos trabalhos têm sido realizados em arroz com o objetivo de aumentar

os teores de Fe, normalmente baixos neste produto. Nandi et al. (2002) e Suzuki et al.

(2003) expressaram lactoferrina humana, a maior proteína ligada a Fe do leite humano

em arroz. Usando a tecnologia da biobalística com um promotor específico do

54

endosperma de arroz (glutelina), foram obtidas altas concentrações de lactoferrina, 5g

a cada kg de grãos, 6% das proteínas totais. Vale ressaltar que a expressão

permaneceu estável por mais de cinco gerações. Contudo, apesar de ter havido um

aumento de 120% no conteúdo de Fe, este incremento foi modesto, e não proveria um

aumento substancial na quantidade de Fe diário de um adulto (Nandi et al., 2002;

Suzuki et al., 2003). Com o objetivo de se conseguir um maior aumento da expressão

de ferritina, Goto et al. (1999) e Murray-Kolb et al. (2002) introduziram o gene da

ferritina de soja em arroz, uma vez que cada molécula de ferritina pode estar ligada a

4.500 átomos de Fe. Os resultados demonstraram um aumento de 2 a 3 vezes na

quantidade de Fe quando compararam linhagens transformadas com linhagens não

transformadas.

Outro grupo de pesquisa inseriu o gene da ferritina de feijão (Phaseolus

vulgaris L.) em arroz, usando a transformação mediada por Agrobacterium e o

promotor de arroz da glutelina. Os resultados exibiram um aumento de duas vezes na

quantidade de Fe (Lucca et al., 2001a). Uma preocupação neste tipo de experimento é

a mudança de cor do arroz conforme o aumento na quantidade de Fe. A alteração na

cor pode ocorrer mesmo com uma pequena variação na concentraçaõ de Fe. Além

disso, outros aspectos precisam ser avaliados, tais como a possibilidade de

alergenicidade e a receptividade do consumidor (Lönnerdal, 2003).

O aumento de Fe em solos deficientes neste mineral podem ser contornados

aumentando em plantas não gramíneas a expressão de genes codificando Fe(III)

redutases (Connolly et al., 2003; Samuelsen et al., 1998), ou ainda pelo incremento a

partir de gramíneas da síntese e exudação de substâncias quelantes (Takahashi et al.,

2001).

Mutantes de pêssego (brz e dgl) e Arabidopsis (frd3, também conhecido como

man1), com atividade constitutiva de Fe(III) redutase, acumulam não somente Fe mas

também Zn, Ca, Mn, Cu e Mg em brotações jovens, no entanto, quelantes de Fe são

necessários para o transporte do floema para as sementes (Grusak, 2000; Rogers &

Guerinot, 2002; Wang et al., 2003). Todos estes mutantes expressam

constitutivamente a Fe(III) redutase, transportadores de Fe2C e atividade HC-ATPase

em células de raíz e contém altas concentrações de nicotianamina (Grusak, 2000;

Rogers & Guerinot, 2002; Wang et al., 2003). Interessante, a superexpressão de

nicotianamina sintase também resultou em um aumento nas concentrações de Fe, Zn e

Mn em brotações de tabaco transgênico (Douchkov et al., 2005). A superexpressão do

55

transportador Zn2C de Arabidopsis em raiz de cevada (Hordeum vulgare) aumentou a

concentração de Fe e Zn na semente (Ramesh et al., 2004).

Outras estratégias transgênicas para aumentar a biodisponibilidade de Fe e Zn

em porções comestíveis têm focado no aumento das concentrações de proteínas

ligadas a metais, como ferritina e lactoferritina, aumentando componentes

promotores, como ácido ascórbico, β-caroteno e peptídios contendo cisteína, e

reduzindo componentes antinutricionais, como fitato e taninos (Holm et al., 2002;

Lönnerdal, 2003). Estas estratégias têm obtido certo sucesso.

A expressão de ferritina de planta ou lactoferritina humana no endosperma de

arroz aumentou a concentração de Fe, Zn e Cu nas sementes (Lucca et al., 2001b;

Nandi et al., 2002; Vasconcelos et al., 2003), e a superexpressão de ferritina de planta

aumentou a concentração de Fe em folhas de alface (Goto & Yashihara, 2001).

Concentrações de ácido ascórbico foram aumentadas em alface (Jain &

Nessler, 2000), altas concentrações de β-caroteno e α-tocoferol foram conseguidas em

arroz e outras plantas (Beyer et al., 2002; Paine et al., 2005; Shintani & DellaPenna,

1998) e tanto concentrações de lisina quanto de cisteína têm sido aumentadas em

sementes e grãos de várias espécies vegetais (Bouis et al., 2003; Lucca et al., 2001a;

Welch & Graham, 2004).

Ácido fítico é um inibidor da absorção de Fe e Zn em humanos e animais e

acredita-se ser o maior fator contribuinte para o problema mundial de deficiência

destes minerais. A redução do conteúdo de fitato na dieta mostrou ser fortemente

correlacionado ao aumento da absorção de Fe e Zn, portanto, qualquer redução no

conteúdo de fitato nos alimentos deve resultar em um aumento no status destes

minerais. Mutantes espontâneos com baixos níveis de ácido fítico foram encontrados

em milho, cevada e arroz e resultaram em sementes com redução de 50 a 90% deste

ácido quando comparado aos controles (Raboy, 2002; Raboy et al., 2001).

Nunes et al. (2006) usando a técnica de RNA interferente, construíram um

vetor de silenciamento do gene mio-inositol-1-fosfato sintase (GmMIPS1) que foi

utilizado para transformação de plantas de soja (Glycine max (L.) Merrill) por

biobalística e obtiveram linhagens transgênicas apresentando redução de mais de 94%

no teor de fitato em soja, quando comparadas às plantas não transformadas (controle).

Para reduzir a concentração de fitato em alimentos humanos e de animais,

duas estratégias transgênicas têm sido adotadas. A primeira bloqueia enzimas na via

de biossíntese de inositol hexafosfato (Hitz et al., 2002; Pilu et al., 2003; Shi et al.,

56

2005; Shi et al., 2003; Shukla et al., 2004) e produz pouco fitato e alta quantidade de

fósforo inorgânico (Pi). A segunda estratégia se baseia na superexpressão de fitases,

enzimas que degradam o fitato, em porções comestíveis em várias cultivares,

incluindo alfafa, soja, canola, arroz e trigo (Brinch-Pedersen et al., 2003; Chiera et al.,

2004; Goto & Yashihara, 2001; Holm et al., 2002) porém igualmente reduz a

concentração de fitato e aumenta a de Pi nas sementes (White & Broadley, 2005).

1.8. Objetivo geral

Aumentar a concentração de folato em plantas geneticamente modificadas de

alface pela superexpressão dos genes de duas enzimas da via metabólica do folato,

GTP ciclohidrolase I (gchI) e Lycopercicon esculentum corismato sintase (lecs).

1.8.1. Objetivos específicos

1) Construção de um vetor para transformação de alface mediada por A.

tumefaciens com a finalidade de expressar o gene da GTP ciclohidrolase I

(gchI) de galinha (Gallus gallus) (com os códons otimizados) em plantas

de alface geneticamente modificadas.

2) Clonagem do gene da corismato sintase (CS) de tomate e construção de

um vetor para transformação cloroplasmática de alface.

3) Otimização de parâmetros para transformação genética do genoma

cloroplasmático de alface por biobalística.

4) Adaptação para a alface de um sistema microbiológico para quantificação

de folatos totais nesta hortaliça.

57

Capítulo 2

Aumento da expressão de GTP ciclohidrolase I em plantas de alface

2.1. Introdução

A alface foi escolhida para ter seu nível de folato aumentado, por ser uma

hortaliça consumida em todo o mundo, ser a mais plantada e consumida no Brasil, na

forma de saladas, logo, sem tratamento, crua, o que reduz as perdas por manipulação e

processamento e ter baixo teor de folato. Por ser um produto perecível, os centros de

plantio devem ser próximos aos centros consumidores, o que também reduz o tempo

de armazenamento e conseqüentemente as perdas de folatos.

Os folatos são parte de uma grande família de poliglutamatos (com até 8

resíduos de glutamil) de ácido pteróico e análogos, e são cofatores essenciais para as

reações de transferência de um carbono necessários para a biosíntese de purinas,

pirimidinas, formilmetionil-tRNA e timidilato e no metabolismo de vários

aminoácidos, incluindo metionina, serina e glicina (Cossins & Chen, 1997;

Storozhenko et al., 2005). Em plantas, os precursores das pterinas são sintetizados de

GTP no citosol (ramo da pterina), enquanto ácido para-aminobenzóico (pABA) é

sintetizado de corismato nos plastídios (ramo do pABA). A biosíntese de pterinas é

regulado pela GTP ciclohidrolase I (gchI), a primeira enzima desta via metabólica.

Ambos os precursores das pterinas e de pABA são importados para dentro da

mitocondria para participar na condensação de folatos pela adição de glutamatos

(Cossins, 2000).

O gene sintético baseado no gene de galinha (Gallus gallus) foi escolhido por

seu produto não apresentar feedback negativo, quando produzido em plantas, evitando

assim que seu produto iniba a formação de mais substrato e assim não atinja todo o

potencial de expressão desejado (De La Garza et al., 2004). A técnica de

transformação mediada por A. tumefaciens foi escolhida por ser um protocolo

estabelecido e conhecido e por ser direcionado para a transformação nuclear, como é

o caso do gene gchI. Esta técnica foi primeiramente utilizada em alface em 1987

58

(Michelmore et al.) e na cultivar Verônica pela primeira vez no Brasil em 1998

(Lovato et al.).

2.2. Materiais & Métodos

2.2.1. Construção do vetor para transformação mediada por

Agrobacterium tumefaciens

O gene GTP ciclohidrolase I (gchI) foi sintetizado pela empresa Epoch

Biolabs Inc (Sugar Land, TX, USA) de acordo com a seqüência de Gallus gallus

(Genebank acesso n.° Z49267), substituindo 10 códons raros em alface do gene de

galinha (Gallus gallus): TGT para TGG, CCA para CCG, GGT para GGC, AGA para

CGT, GCA para GCG, AGA para AGG, ACA para ACG, CCT para CCC, GGT para

GGC e CAT para CAC. O DNA sintético foi inserido entre os sítios de NcoI e SacI do

vetor pBI426 (Datla et al., 1991), substituindo o gene fusionado gus:nptII.

O cassete de expressão foi então transferido para o vetor pCAMBIA1300

usando EcoRI e HindIII para gerar o vetor pCGCHI que foi transferido para A.

tumefaciens estirpe EHA105 (Hood et al., 1993) por eletroporação, que consiste no

uso de um pulso elétrico de alta voltagem para criar poros na membrana celular e

permitir a entrada do DNA exógeno nas células alvo. Foi usado como agente seletivo

das plantas a higromicina. O vetor pCGCHI (fig. 7) foi utilizado na transformação de

alface (cv. Verônica) mediado por A. tumefaciens de acordo com Dias et al. (2006).

Fig. 71- Representação esquemática do T-DNA presente no vetor pCGCHI utilizado para transformar folhas de alface mediado por Agrobacterium tumefaciens. Borda esquerda (BE), terminador 35S do vírus do mosaico dourado da couve-flor (35Ster), gene marcador da higromicina fosfotransferase (hpt) que confere resistência à higromicina, promotor 35S do vírus do mosaico dourado da couve-flor (35Spro), terminador do gene de síntese da nopalina (nost), cassete de expressão do gene gchI (gchI), vírus do mosaico da alfafa (AMV), promotor 35S duplicado do vírus do mosaico dourado da couve-flor (d35Spro), borda direita (BD).

59

2.2.2. Transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens

2.2.2.1. Preparo de Agrobacterium tumefaciens sepa EHA105

uma colônia de agrobactéria sepa EHA105 foi retirada com o auxílio de uma

alça e colocada em tubo falcon de 50 mL contendo 5 mL de meio Luria-Bertani (ou

meio LB) (1% triptona, 0,5% extrato de levedura e 1% de cloreto de sódio, ajustar o

pH para 7,0 com NaOH 5N e autoclavar à 121°C por 20 min.) e 50 mg/L de

rifampicina. A cultura foi incubada durante 12 h a 28°C com agitação. No dia

seguinte, o inóculo foi transferido para um Erlenmeyer de 250 mL contendo 50 mL de

novo meio LB com 50 mg/L de rifampicina e 100 µL do pré-inóculo. A cultura foi

incubada novamente novamente com agitação e temperatura de 28°C até uma OD600nm

de 0,6 (aproximadamente 14 h) e deixada no gelo por 15 minutos. A cultura foi então

centrífuda (Centrifuga refrigerada 5810R da Eppendorf) por 5 min. a 5000g (ou 8000

rpm no rotor SS35). O sobrenadante foi descartado e secado em papel-filtro

autoclavado. Em seguida foi ressuspendido em 300 µL de água milli-Q com 20 mM

de cloreto de cálcio (CaCl2), misturado no gelo e distribuído em alíquotas de 100 µL

de bactéria por tubo de microcentrifuga e após congelá-las no nitrogênio líquido

foram guardados no freezer -80°C até o uso.

2.2.2.2. Transformação da Agrobacterium EHA105 com o gene de

interesse (pCGCHI)

5 µL de DNA (pCGCHI) foram pipetados, colocados no tubo da bactéria

EHA105 e deixados no gelo por 30 minutos. Foi colocado no nitrogênio líquido até

solidificar (aproximadamente 2 min.) e transferidos para banho-maria à 37°C por 5

min., após o choque térmico, foi adicionado 1 mL de meio LB, homogeneizado com

pipeta e incubado em estufa à 28 °C por 2 h. Após este tempo, 100 µL de EHA105

transformada foi plaqueada em meio LB sólido (1% triptona, 0,5% extrato de

levedura e 1% de cloreto de sódio, ajustar o pH para 7,0 com NaOH 5N, 1,6% de ágar

e autoclavado à 121°C por 20 min.) com os antibióticos (50 mg/L de rifampicina e 50

mg/L de canamicina). A placa foi então incubada em estufa à 28°C até crescerem as

colônias (2 a 3 dias). As colônias que crescerem foram testadas por reações em cadeia

da polimerase (PCR), com primers específicos (sequencias de DNA presente do gene

60

introduzido) e programa AHAS no termociclador. O programa AHAS consiste em

ciclos de: 95°C por 5 min., 35 ciclos de (95°C por 1 min., 55°C por 1 min., 72°C por

1 min.), 72°C por 7 min. e 4°C.

2.2.2.3. Desinfestação e germinação de sementes

0,1 g de sementes (aproximadamente 100 sementes) foram desinfestadas. A

tensão superficial das sementes foi reduzida colocando-as em uma seringa e

adicionando aos poucos 20 mL de água destilada autoclavada com 2 gotas de tween

20 e descartando a água a cada lavagem. Para a desinfestação 1% de hipoclorito de

sódio foi colocado na seringa e deixado por 15 min. mexendo a seringa de vez em

quando. Novamente as sementes foram lavadas com água destilada autoclavada pura

por 4 a 5 vezes. Após as lavagens, ágar 0,2% autoclavado foi colocado na seringa e

bem misturado para as sementes se expalharem. Três magentas foram preparadas e

autoclavadas com papel-toalha em forma de “U” invertido e água da torneira até a

metade da altura do papel-toalha. As sementes foram distribuídas sobre o papel-toalha

e colocadas para germinar em sala de crescimento por 2 dias.

2.2.2.4. Co-cultura alface-Agrobacterium

Em fluxo laminar, as sementes germinadas (aproximadamente 100 sementes)

de alface foram organizadas em placa de Petri autoclavada, as cascas marrons foram

removidas, e as raízes cortadas para separar os 2 cotilédones (aproximadamente 200

cotilédones) e ferir a planta para a penetração das Agrobácterias.

Em outra placa de Petri autoclavada, foi colocado o inóculo de Agrobacterium

EHA105 transformado com o vetor pCGCHI e 2/3 dos cotilédones (aproximadamente

130 cotilédones). Esta mistura ficou em contato por 15 minutos, mexendo a placa de

vez em quando. Após este tempo, os cotilédones foram retirados da placa e colocados

em placa contendo meio MS (0,44 g de meio MS com vitaminas, 3 g de sacarose)

com 0,1 mg/L de 6-benzilaminopurina (BAP), 0,1 mg/L de ácido indol-3-butírico

(AIB), 0,1 mg/L de canamicina e 0,1 mg/L de rifampicina). Os cotilédones foram

arrumados de forma circular na placa. Em outra placa de Petri, o restante dos

cotilédones (1/3 ou 70 cotilédones) foram da mesma forma arrumados porém estes

61

sem haver contato com a Agrobacterium (controle). As placas foram deixadas na sala

de crescimento por 48h.

2.2.2.5. Seleção e crescimento das plantas

Após 2 dias na sala de crescimento, metade dos cotilédones controle (não

transformados) foram transferidos para novo meio MS com 50 mg/L de claforan e a

outra metade para meio MS com 50 mg/L de claforan e 50 mg/L de higromicina. Os

cotilédones tranformados foram igualmente transferidos para novo meio MS com 50

mg/L de claforan e 50 mg/L de higromicina. O crescimento de plântulas foi então

observado a partir das células transformadas e resistentes aos antibióticos.

2.2.3. Análise das plantas por reações em cadeia da polimerase (PCR)

2.2.3.1. Extração de DNA genômico das plantas para análise por PCR

O DNA foi isolado de discos foliares de acordo com Doyle & Doyle (1987).

Um disco foliar das plantas a serem testadas foi retirado e macerado com bastões

autoclavados, foi acrescentado a cada amostra 0,4 mL de tampão CTAB 2X [1,4 M de

cloreto de sódio, 100 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 20 mM de ácido etilenodiamino

tetra-acético (EDTA), 2% de brometo de cetil-trimetilamônio (CTAB), 2% de

polivinilpirrolidona (PVP)]. As amostras foram agitadas por 20 min. à 60°C e em

seguida foram adicionados 0,4 mL de clorofórmio. As suspensões foram

homogeneizadas em agitador do tipo vórtex por 6 seg. e centrifugadas a 14.000 rpm

por 5 min. Foram retirados 0,2 mL do sobrenadante e transferidos para novo tubo de

microcentrífuga. Foram adicionados 0,2 mL de isopropanol e os tubos foram

invertidos 8 vezes. As amostras foram centrifugadas a 14.000 rpm por 5 min. O

sobrenadante foi excluído por sucção com a pipeta e as amostras foram deixadas secar

por aproximadamente 30 min. com o tubo invertido sobre papel-filtro. O DNA foi

ressuspendido em 20 µL de água mili-Q e guardados a -20°C até posterior uso.

62

2.2.3.2. A PCR

As PCR foram realizadas de acordo com Bonfim et al. (2007). Os primers

CHMUT591C (5´ ATGTGTAGCTTCGATCACCACTCC-3´) e CHMUT130 (5´-

AGACCAAGA AGCGAGGAGGACAAC-3´) foram utilizados para amplificar uma

seqüência de 461 pb correspondente ao gene gchI. A mistura foi colocada no

termociclador onde foi tratada a 95°C por 5 minutos e 35 ciclos de amplificação

(95°C por 1 min, 55°C por 1 min., 72°C por 1 min.) com um ciclo elongador final de

7 min. a 72°C, terminando a 4°C. A mistura foi então aplicada em gel de agarose 1%

e visualizada sob luz UV com blue green dye (LGC Biotecnologia, Brazil)

2.2.4. Análise de western blot

2.2.4.1. Expressão de gchI em E. coli

O gene gchI foi expresso em Escherichia coli para ser usado como controle

positivo. A seqüência codante do gchI foi inserida no vetor de expressão de E. coli

pDEST17 (Invitrogen) gerando o vetor pDESTGCHI. Meio LB (0,5 L) com adição de

50 mg de ampicilina (antibiótico de seleção) foi inoculado com uma cultura celular

crescida durante 12 horas de células BL21-Lys transformadas contendo o plasmídio

pDESTGCHI. As células cresceram com agitação a 37°C até uma OD600nm entre 0,7 e

0,9, com a expressão do gene gchI induzido por IPTG 1mM (Isopropil β-D-1-

tiogalactopiranosida). A cultura cresceu por mais 5 horas a 37°C. As células foram

aliquotadas e armazenadas a -80°C. A proteína GCHI foi purificada em coluna de

níquel e foi analisada por SDS-PAGE. O His6-tag gchI foi usado como um controle

positivo.

2.2.4.2. Extração protéica de folhas de alface para western blot

A extração protéica foi realizada pela mistura de 0,1 g de folha de alface

macerada no nitrogênio líquido e 30 µL de tampão de amostra (125 mM Tris pH 6,8,

4% SDS, 10% β-mercaptoetanol, 20% glicerol, 0,04% azul de bromofenol). A mistura

foi fervida por 5 min. e aplicada no gel de poliacrilamida 12%. Uma nova extração foi

realizada pela mistura de 0,1g de folha de alface macerada no nitrogênio líquido e 30

63

µL de tampão de extração (50mM Tris-HCl pH 6,8, 1% β-mercaptoetanol, 0,2%

PVP). A proteína total foi quantificada usando o Quick StartTM Bradford Protein

Assay (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA).

2.2.4.3. SDS-PAGE e western blot

As proteínas foram aplicadas em um mini gel SDS-PAGE 12%,

eletrotransferido para a membrana Immobilon-P PVDF (Millipore) sob 100 mA por

70 min., ficando 12h a 4°C bloqueando em solução salina de tampão Tris (20 mM

Tris base, 137 mM NaCl, pH 7,6), contendo 5% (p/v) de leite desnatado e 0,1% (v/v)

de tween 20. A membrana foi incubada com anticorpo primário policlonal IgG de

camundongo anti-GCHI (NP000152, Human GCHI epitopo a.a. 84–173, Novus

Biologicals Inc, Littleton, CO, USA) diluído 1:4.000 em tampão de bloqueio por 4h a

25°C. O anticorpo secundário foi incubado por 4h a 25°C com antimouse IgG de

cabra conjugado com fosfatase alcalina (Bio-Rad) em uma diluição de 1:7.000 em

solução de bloqueio. Blots foram revelados com o substrato CSPD quimiluminescente

(Applied Biosystems) de acordo com instruções do fabricante e expostos ao filme

Kodak Standard.

2.2.5. Análise de folato em plantas pelo método microbiológico

As plantas positivas para o transgene gchI tiveram o seu teor de folato

quantificado pelo método microbiológico, mediado por Lactobacillus rhamnosus

(ATCC 7469).

2.2.5.1. Crioproteção da cultura de Lactobacillus rhamnosus

Para ser utilizada na quantificação de folato em extratos de folha de alface, a

cultura de L. rhamnosus, a partir de uma cultura liofilizada, foi crioprotegida para

maior durabilidade e estabilidade, de acordo com Wilson e Horne (1982) da seguinte

forma: 1 mL de meio FAAM (Folic Acid Assay Médium, Sigma) foi adicionada à

cultura liofilizada e foi hidratada por 10 minutos. O meio continha 47 mg do meio

FAAM por litro de meio final, contendo 0,3 μg/L de ácido fólico e 250 mg/L de ácido

ascórbico, autoclavado a 121°C por 10 minutos e após frio foi utilizado.

64

Um volume de 0,5 mL desta suspensão bacteriana foi inoculado em 10 mL de

meio FAAM e incubou-se a 37°C por 7 horas. Depois, 0,5 mL da cultura bacteriana

foi retirada e juntada a 189 mL de meio FAAM, incubando o inóculo a 37°C por 18

horas. O recipiente contendo a cultura bacteriana foi retirado da estufa e resfriado

imediatamente em gelo. O mesmo volume de glicerol 80% gelado e estéril foi

adicionado à cultura. Toda a solução foi aliquotada em tubos de 2 mL, que foram

guardados a –80°C até o uso.

2.2.5.2. Extração de folato de folhas de alface

O método microbiológico foi usado para a determinação de folato em folhas

de alface seguindo o protocolo AACC Method 86-47 (DeVries et al., 2001; Hyun &

Tamura, 2005) com modificações. Para a extração de folato, cinco gramas de folha de

alface foram macerados com nitrogênio líquido em um cadinho de porcelana com a

ajuda de um pistilo. O pó resultante foi ressuspenso em 25 mL de tampão fosfato 0,1

M (pH 4,1) com 114 mM de ácido ascórbico, em um tubo falcon. A mistura foi

aquecida em banho-maria por 10 minutos a 100°C, resfriada rapidamente em gelo e

armazenada até o uso no freezer –80°C (Tamura, 1990).

2.2.5.3. Tratamento bi-enzimático dos extratos de folato

O tratamento bi-enzimático foi seguido conforme proposto por Pandrangi e

LaBorde (2004). Foi misturado 250 μL do extrato vegetal contendo folato a 250 μL de

tampão citrato 0,3 M (pH 4,0) e 500 μL de protease (Protease, Tipo XIV: bacteriana,

de Streptomyces griseus; Sigma) e incubado a 37°C por 8 horas. Após este tempo a

amostra foi fervida por 5 minutos para inativar a enzima. 200 μL deste extrato

resfriado foi adicionado a 950 μL de tampão fosfato 0,3 M (pH 7,0) e 50 μL de

conjugase, que foi novamente incubada a 37°C, desta vez por 3 horas.

A conjugase foi preparada de acordo com Wilson e Horne (1982). Sangue de

bovino foi coletado e deixado coagular. Em seguida foi centrifugado a 5.000 g por 10

min. O soro (16 mL) foi dializado a 4ºC por 18 h em um litro de tampão fosfato de

potássio 0,1 M (pH 7,0) contendo 2 g de carvão ativado para remoção de folatos

endógenos. O dializado foi então estocado a –20ºC em alíquotas de 0,5 mL até o uso.

65

2.2.5.4. Quantificação de folato em folhas de alface

Para a quantificação de folato placas de ELISA de 96 poços foram utilizadas

para o acondicionamento do meio de crescimento da bactéria. O meio FAAM sem

adição de ácido fólico foi utilizado, sendo este último adicionado nos pontos da curva,

e presente naturalmente no extrato da planta que se deseja quantificar. No ensaio foi

utilizado o tampão fosfato 50 mM (pH 6,1). Fez-se uma curva, adicionada de ácido

fólico sintético, ácido pteroil-L-glutâmico (Sigma), para servir de referência na

quantificação, e as amostras de plantas, que serviriam como fonte de folato para o

crescimento da bactéria também foram preparadas. Todos os pontos da curva e todos

os extratos de plantas a serem quantificados foram preparados em triplicata.

No preparo das amostras de planta, foi preparada uma mistura (mistura A),

contendo 100 μL de FAAM, 25 μL de tampão fosfato 50 mM (pH 6,1) e 5 μL da

bactéria crioprotegida. Foi distribuída então 130 μL da mistura A em cada poço da

placa de ELISA. Em seguida, foi adicionado a cada poço 2,5 μL do extrato tratado bi-

enzimaticamente de cada planta a ser analisada, mais 167,5 μL do meio FAAM

(autoclavado por 10 minutos a 121°C e adicionado de ácido ascórbico, sem ácido

fólico).

No preparo da curva, foi feita uma diluição seriada: primeiramente foi

adicionado 170 μL de meio FAAM a cada poço da placa; acrescentado ao primeiro

poço 60 μL de solução de ácido fólico na concentração de 100 ng/mL, e mais 170 μL

de meio FAAM. Após misturar com o auxílio da pipeta, foram retirados 170 μL da

solução e colocados no poço seguinte, que já continha 170 μL de meio FAAM, e

assim foi repetido por 7 vezes, o ácido fólico também foi diluído por 7 vezes, gerando

as seguintes concentrações: 0,2 ng, 0,1 ng, 0,05 ng, 0,025 ng, 0,0125 ng, 0,00625 ng e

0,003125 ng de ácido fólico. Após a diluição seriada feita para todos os sete pontos da

curva, cada ponto foi repetido mais duas vezes e foi adicionado também a cada poço

130 μL da mistura A. Ao final de cada diluição seriada, foi feito um branco: um poço

contendo apenas 130 μL da mistura A e mais 170 μL de meio FAAM, ou seja, um

ponto da curva foi feito sem adição de ácido fólico.

Após o preparo de toda a placa, esta foi lacrada com filme adesivo plástico

estéril para microplacas de ELISA (Axygen Scientific Inc.) e incubada a 37°C, sem

agitação, por 48 horas. Transcorrido esse tempo, a placa foi levada a um

66

espectofotômetro de densidade ótica, onde a turbidez (o crescimento bacteriano) do

meio foi medida a 595 nm.

Uma regressão polinomial, com auxílio do programa Excel, permitiu cruzar os

dados obtidos na curva com os dados das plantas, para obter a quantidade de folato

equivalente nas plantas de acordo com o crescimento da bactéria observado. Os dados

da concentração de folato foram normalizados usando o valor de proteína total e os

resultados foram expressos em ng de folato por mg de proteína total.

As análises de variância foram realizadas com o SAS System for Windows

(versão 8.02, SAS Institute, Cary, NC).

2.3. Resultados & Discussão

Em 45 experimentos de transformação por A. tumefaciens, com 130 explantes

cada experimento, 57 plantas regeneradas foram obtidas a partir de calos individuais,

e destas, 29 plantas positivas para o transgene gchI quando testadas por PCR com

primers específicos.

As plântulas positivas foram aclimatadas e cada linhagem avançada até a

terceira geração (T3). Não foi observada qualquer diferença fenotípica entre as plantas

geneticamente modificadas e os controles (plantas não transgênicas). As folhas das

plantas foram analisadas por PCR em cada geração para avaliar a presença do

transgene gchI (fig. 8).

Fig. 81- Eletroforese em gel de agarose 12% mostrando os fragmentos de 461 pb amplificados por PCR do gene gchI de algumas plantas T0. Linha 1: branco, linha 2 a 6: linhagens de plantas de alface transgênicas, linha 7: controle negativo (planta não transgênica) e linha 8: controle positivo, vetor utilizado na transformação diluído 1.000 vezes.

67

Para confirmar a expressão do gene gchI, a proteína de folhas das plantas T3

foram extraídas e analisadas por SDS-PAGE e Western blot. O produto do transgene

gchI foi detectado nas linhagens transgênicas (fig. 9).

Fig. 91- Expresssão de GgGCHI em folhas de alface transgênicas. Western blot da expressão de GgGCHI em folhas de plantas transgênicas, fígado de galinha e E. coli detectados pelo uso de anticorpo anti-hGCHI. Linha1-2: folhas de alface não transgênicas; linhas 3-5: linhagens transgênicas de alface; linha 6: 30µg de proteína total isolada de fígado de galinha; linha 7: GCHI-6His de células de E.coli transformadas com o plasmídio pDEST-GCHI. Marcadores de massa molecular indicados à esquerda (em kDa).

Nenhuma reação cruzada com a proteína GCHI endógena foi detectada e

nenhuma banda foi observada nas plantas não transgênicas (fig. 9). Como esperado,

uma banda imunoreativa foi observada, correspondendo em tamanho à massa

molecular predeterminada de 30kDa (incluindo as extensões N- e C-terminais) do

produto do gene gchI expresso em E. coli (fig. 9). O uso de anticorpo anti-GCHI

contra o epitopo de GCHI humano correspondente aos aminoácidos de posição 84 a

173 mostraram que o gene de G. gallus com os códons otimizados foram expressos

em folhas de alface. Nenhum sinal foi observado nas linhagens não transgênicas. Na

verdade, a GCHI de G. gallus é muito divergente da GCHI de plantas, apresentando

uma identidade de apenas 39% com GCHI de S. lycopersicum (E=1e-26) e Arabidopsis

thaliana (E=3e-26). Além disso, o epitopo humano GCHI tem alta identidade com o

GCHI de galinha (94%) e baixa identidade com o epitopo de plantas (<41%).

Uma banda GCHI imunoreativa maior e outra menor foram observadas nas

linhagens transgênicas. A proteína GCHI de galinha detectadas em ambas folhas de

alface transgênicas e fígado de galinha mostraram uma massa molecular maior

quando comparadas com a GCHI de galinha expressado em E. coli. Esta enzima é um

multímero composto de subunidades idênticas, mas seu número exato de subunidades

ainda não foi determinado para a maioria das espécies. Diferenças nos padrões de

1 2 3 4 5 6 7

50-

37-

25-

68

eletroforese, relativas à massa molecular esperada in silico, tem sido observada em

GCHI de plantas e animais (Cha et al., 1991; Yoneyama & Hatakeyama, 1998). Esta

diferença no tamanho da proteína pode também ser atribuída às modificações pós-

traducionais, como a glicosilação e fosforilação. Hesslinger et al. (1998) mostraram

que GCHI está sujeita a modificações pós-traducionais. Adicionalmente, uma análise

in silico usando o algoritmo YinOYang 1.2 (Gupta & Brunak, 2002) previu 5 resíduos

de Ser/Thr na GCHI de galinha com alto potencial (0,77 a 0,99; limiar = 0,5) para

glicosilação N-acetilglucosamina bem como fosforilação.

Em folhas de alface transgênicas, GCHI de galinha parece ser

eletroforeticamente superior que a proteína encontrada no fígado de galinha. Apesar

de as plantas possuírem um sistema endomembrana e uma via secretora similar aos

das células de animais, diferenças nos padrões de glicosilação entre plantas e animais

têm sido observadas (Balen & Krsnik-Rasol, 2007; Ma et al., 2003; Streatfield, 2007).

Porém, outros experimentos são necessários para confirmar se estas diferenças podem

influenciar na atividade enzimática.

A fim de determinar se a expressão do gchI exógeno aumentou a quantidade

de folato, foi quantificado pelo método microbiológico mediado por L. rhamnosus o

folato total das linhagens transgênicas e não transgênicas (controle) (fig. 10).

Por meio da equação gerada (y = -3,6139x3 + 4,4752X2 – 1,1239x + 0,0815;

R2= 0,9999), foram calculados os valores equivalentes de cada medida observada nas

plantas, para se obter os valores correspondentes em ng/μg de tecido fresco. Em

seguida, o valor foi dividido pela quantidade de proteína existente em cada poço da

placa de ELISA (quantificado por Bradford). A partir destas quantificações foram

verificadas que a linhagens transgênicas mostraram um aumento no teor de folato de

até 8,5 vezes quando comparadas com plantas não transformadas (controle) (fig. 10).

69

Fig. 101- Quantificação de folato total em linhagens de alface transgênicas T3 e não transgênicas (controle). Valores de folato de 19 linhagens transgênicas foram significativamente diferentes (barras cinzas) das plantas não transformadas (controle). Valores de folato de 10 linhagens transgênicas não foram significativamente diferentes (barras brancas) das plantas não transformadas (controle). O controle e o espinafre estão representados por barras pretas. As barras representam as médias +/- SD (Student´s t-test; P>0,05 versus controle). Espinafre também foi analisado por ser considerado rico em folato.

Os resultados revelaram que 19 linhagens apresentaram aumento significativo

na quantidade de folato (P=0,05), apresentando um aumento de 2,1 a 8,5 vezes

quando comparado às linhagens não transgênicas (fig. 10). Além disso, o espinafre

(Spinacea oleracea), uma planta rica em folatos, foi analisado. Os resultados

revelaram que algumas linhagens transgênicas, como a AA16-C3-3, 47B5, 47B2

tiveram 72,6; 67,4 e 51,5%, respectivamente do total de folato encontrado no

espinafre.

As plantas expressando o gene gchI de galinha apresentaram uma aumento de

até 8,5 vezes mais folatos que os controles. Uma estratégia similar, porém usando

gchI de bactéria, foi similarmente bem sucedida no aumento de síntese de pterinas e

folato em folhas de A. thaliana (Hossain et al., 2004) e tomate (De La Garza et al.,

2004). Apesar do aumento no teor de folato em tomate em duas e até três vezes, as

frutas amadurecidas após colheita das plantas continham níveis de folato similares às

frutas controle que amadureceram nas plantas (De La Garza et al., 2004). Em

Arabidopsis, a expressão do gene gchI de E. coli resultou em um aumento de duas a

quatro vezes no teor de folatos. Em todos os casos, a expressão do gene gchI gerou

altos níveis de pterina quando comparados com o aumento de folato total (De La

Garza et al., 2004; Hossain et al., 2004). Estes resultados sugerem a existência de um

gargalo no fluxo da via de síntese de folato, provavelmente no suprimento de pABA.

Recentemente, De La Garza et al. (2007) cruzou linhagens de tomate

a to

tal

Con

trole

Espi

nafre

70

superexpressando tanto pABA quanto pterina e produziu plantas com acúmulo de 25

vezes mais folato nas frutas.

A quantidade de folato obtida nas folhas de alface foi de 188,5 µg/100 g de

peso fresco (346,5ng de folato/mg de proteína total), o que representa 5,4 vezes mais

folato do que o observado em folhas verdes de alface cruas var. crispa (USDA

National Nutrient Database for Standard Reference, http://www.nal.usda.gov/fnic/

foodcomp/search/). Com estes resultados plantas de alface fortificadas obtidas neste

trabalho fornecerão 26% da IDR de folato para adultos (400 µg/dia para um adulto)

pela ingestão diária de uma porção regular (56g ou uma xícara de chá, de acordo com

USDA National Nutrient) de folhas destas alfaces.

71

Anexo

Nunes, A.C.S.; Kalkmann, D.C.; Aragão, F.J.L. (2009) Folate Biofortification

of Lettuce by expression of a codon optimized chicken GTP cyclohydrolase I

gene. Transgenic Research (in press)

72

73

74

75

76

77

78

79

Capítulo 3

Aumento da expressão de corismato sintase em plantas de alface

3.1. Introdução

O aumento da expressão do gene da corismato sintase (cs) foi escolhido por

ser o primeiro passo da via metabólica do pABA, um precursor para a formação de

folatos. Como já mencionado anteriormente no capítulo 2, estudos mostram que

mesmo havendo um aumento no teor de folato pela superexpressão do gene gchI, esta

superexpressão gera altos níveis de pterina quando comparados com o aumento de

folato total (De La Garza et al., 2004; Hossain et al., 2004). Estes resultados sugerem

a existência de um gargalo no fluxo da via de síntese de folato, possivelmente no

suprimento de pABA. No entanto, isso não foi observado quando De La Garza et al.

(2007) cruzaram linhagens de tomate tanto com aumento da expressão de pABA

quanto de pterinas e produziram plantas com acúmulo de 25 vezes mais folato nestas

frutas quando comparadas com as frutas não transformadas. A técnica de

transformação por biobalística foi escolhida por ser um protocolo estabelecido,

conhecido e por poder ser direcionado para a transformação plastidial, como é o caso

do gene da cs.

A transformação cloroplasmática é mediada por biobalística e tem algumas

vantagens em relação à transformação do genoma nuclear. As principais vantagens

apontadas são: altos níveis de expressão heteróloga (De Cosa et al., 2001; Tregoning

et al., 2003), contenção do transgene devido ao fato de que para a maioria das plantas

superiores o genoma cloroplasmático tem herança materna (Birky, 2001; Ruf et al.,

2001; Svab & Maliga, 1993), ausência do efeito de posição devido ao fato de que é

possível direcionar a integração para uma região específica (Staub & Maliga 1992), e

diminuição dos problemas de silenciamento gênico quando múltiplos genes devem ser

inseridos, devido ao fato de que a maquinaria traducional dos cloroplastos tem a

capacidade de traduzir transcritos policistrônicos, onde há um promotor para um ou

mais genes (De Cosa et al., 2001; Kanamoto et al., 2006; Staub & Maliga, 1995).

80

Desde 1990 é possível transformar plantas superiores com o processo de

transformação de cloroplastos por biobalística (Svab et al., 1990; Ye et al., 1990).

3.2. Materiais & Métodos

3.2.1. Construção do vetor para transformação plastidial por

bombardeamento

O vetor pRL1000 utilizado na construção do vetor final para transformação de

plastídio de alface por bombardeamento foi gentilmente cedido pelo Dr. Hirosuke

Kanamoto (Research Institute of Innovative Technology for the Earth, Kyoto, Japan).

O pRL1000 (Kanamoto et al., 2006) consiste de um sítio de integração plastidial por

recombinação e um cassete de seleção que confere resistência a espectinomicina

(aadA) (fig. 11).

Fig. 112- Cassete de expressão do vetor pRL1000 usado na construção do vetor de transformação plastidial de alface (Kanamoto et al., 2006).

O gene da corismato sintase de tomate (lecs) foi clonado de Solanum

lycopersicum L. (=Lycopersicon esculentum Mill.). Para isso inicialmente flores de

tomate foram retiradas da planta e imediatamente o RNA total foi extraído em

nitrogênio líquido seguindo-se o protocolo do kit micro-to-midi total RNA purification

system da Invitrogen (Carlsbad, California, USA), conforme indicação do fabricante.

81

A partir do RNA total obtido, cDNA foi sintetizado com o uso do kit

Superscript II RNAse H- Reverse Transcriptase da Invitrogen (Carlsbad, California,

USA), conforme indicação do fabricante.

Com o cDNA, foram feitas então reações em cadeia da polimerase com

transcrição reversa (RT-PCR) usando-se Platinum Taq DNA Polymerase High

Fidelity da Invitrogen (Carlsbad, California, USA). A fim de se obter o gene lecs1-2

de aproximadamente 1.100 pb, e também substituir um sítio da enzima de restrição

SacI por um sítio de KpnI na mesma posição. Estas reações foram realizadas em duas

partes lecs1 e lecs2. Para isso 2 pares de primers: LeCSPSTF

(GCTGCAGTTGTAGGGAGGGATTTATGGCTGGTAGTACATTTGG) e

LeCSKPNR (GCGGTACCTGATGAAATTTTGCAAG) foram usados visando a

amplificação do gene lecs1 (de aproximadamente 200 pb) e, LeCSKPNF

(CAGGTACCGCAGATGGGC TGACTAC) e LeCSPSTSACR (CGAGCTCTGCAG

TCAGAGGGTAACCTC) para amplificar o gene lecs2 (de aproximadamente 900

pb). Todas as reações foram colocadas em um termociclador PTC-100 (MJ

Researcher) em 50 μL de solução contendo 40 ng de cDNA, 60 mM Tris–SO4 (pH

8,9), 18 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 250 nM de cada dNTP, 200 nM de cada

primer e 5 U de Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity (Invitrogen). A reação

ocorreu nas seguintes condições: 1 ciclo de 95ºC por 5 min., 35 ciclos (95ºC por 1

min., 55ºC por 1 min, 68ºC por 1 min.) e um ciclo de elongação final (68ºC por 5

min.). Os fragmentos foram clonados separadamente no vetor pGEM-T-Easy

(Promega) e seqüenciados com os primers universais M13 e T7 em um seqüenciador

automático (ABI Prism 3700).

Após verificados no seqüenciamento, cada fragmento foi então digerido com

enzimas de restrição específicas: LeCS1 com as enzimas KpnI e NcoI e LeCS2 com

KpnI e SacI. Ambos os fragmentos foram ligados com T4 DNA ligase para se obter o

inserto LeCS1-2.

O vetor pRL1000 e o inserto LeCS1-2 foram então digeridos com a enzima de

restrição PstI e ambos foram ligados, sendo obtido assim o vetor policistrônico de

transformação por bombardeamento pLeCS (fig. 12). No vetor policistrônico um

promotor (LsPrrn) é capaz de codificar a síntese de uma molécula de RNAm, que

possui a informação para a produção de duas ou mais proteínas (AadA e LeCS), que

poderão ser geradas ao mesmo tempo.

82

Fig. 121- Vetor de transformação plastidial pLeCS para bombardeamento de folhas de alface. Contém cassete de expressão do gene aadA que confere resistência ao antibiótico espectinomicina, sob o controle de elementos regulatórios de plastídio de alface, especialmente o promotor do operon RNA ribossomal 16S (LsPrrn) fusionado e o terminador do gene psbA de alface (LsTpsbA).

3.2.2. Otimização dos parâmetros de transformação cloroplasmática por

biobalística

Folhas jovens de alface (3 a 4 semanas de idade) crescidas em meio estéril,

foram organizadas, de 6 em 6, em placa de Petri de bombardeamento (pequenas), com

o lado adaxial para cima, contendo meio de regeneração (meio MS 3% de sacarose

suplementado com 0,1 mg/L de ácido naftaleno acético (NAA), 0,1 mg/L de BAP e

0,6% de ágar, pH 5,8 e autoclavado a 121°C por 20 minutos). Após um dia de

incubação no meio de regeneração, as folhas foram bombardeadas usando

micropartículas cobertas com DNA do vetor pBI 426 com o uso de um acelerador de

micropartículas que utiliza alta pressão de gás hélio.

Foram realizados 4 experimentos diferentes, sendo 3 bombardeamentos em

cada, com 6 explantes por bombardeamento, conduzidos em condições controladas:

umidade relativa do laboratório em 40%, distância de 8 milimetros (mm) entre a

pLeCS7826 bp

rbcL

LsPrrn

aadA

lecs

LsTpsbA

accD

Nco I (2194)

Sph I (1324)

Xba I (1698)

Sal I (4522)

Bam

Bam HI (3576) Hin dIII (3728)

Hin

Kpn I (1418)

Kpn I (3224)

Pst I (2995)

Pst I (4181)

Bgl I (253)

Bgl I (2829)

Bgl I (6960)

HI (2190)

dIII (5588)

83

câmara de gás a alta pressão (gerador de onda de choque) e a membrana carreadora

contendo as micropartículas cobertas de DNA, distância de 13 mm entre a membrana

carreadora e a tela de retenção, distância de 80 mm entre a tela de retenção e o

material a ser bombardeado, pressão de vácuo de 27 polegadas de mercúrio.

No primeiro experimento utilizou-se uma pressão de gás hélio de 800 psi, com

partículas de tungstênio de 0,2 μm de diâmetro (M5). No segundo, utilizou-se uma

pressão de 800 psi e partículas de tungstênio de 1 μm de diâmetro (M10). No terceiro

experimento, utilizou-se pressão de 1200 psi, com partículas M5, e no quarto, pressão

de 1200 psi com partículas M10 de tungstênio.

Após o bombardeamento, os explantes foram levados à sala de cultivo, onde

ficaram por 24 horas. Transcorrido este tempo, foram transferidos para placa de

ELISA com 2 mL de tampão de ácido 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-glucurônico (X-

gluc) [100 mM NaH2PO4.H2O, 0,5 mM K4Fe(CN)6.3H2O, 10 mM Na2EDTA.2H2O,

0,1% Triton X-100, 0,1% de X-gluc a 50 mg/mL diluído em dimetilsulfóxido

(DMSO)] para cada grupo de folhas bombardeadas (6 folhas bombardeadas por tiro).

Os explantes foram colocados no escuro a 37°C por 16 horas. O tampão de reação foi

retirado e 3 mL de etanol 70% foi adicionado em cada grupo de folhas, para

interromper a reação, retirar a clorofila e permitir melhor visualização da cor azul,

colocados por 16 horas à temperatura ambiente. Após este tempo o etanol foi retirado

e água foi adicionada. Os explantes foram analisados em uma lupa marca Zeiss

modelo Stemi SV11 (Alemanha) com um aumento de 40 vezes e a quantidade de

pontos azuis gerados em cada tiro foram contados.

3.2.3. Transformação cloroplasmática por bombardeamento e

regeneração das plantas

As sementes de alface da cv. Verônica tiveram sua tensão superficial reduzida

pela lavagem em solução de tween 20 em água destilada autoclavada. Em seguida as

sementes foram desinfestadas por 15 minutos em solução de 1% de hipoclorito de

sódio. Foram realizadas ainda três lavagens sucessivas com água autoclavada, e a

semeadura foi feita em placa de Petri contendo 25 mL do meio de cultura MS

(Murashige & Skoog, 1962) com 3% de sacarose e 0,6% de ágar (pH 5,8). O meio foi

então esterilizado em autoclave a 1 atmosfera de pressão e 121°C por 20 minutos. A

84

germinação se deu em sala de crescimento com lâmpadas fluorescentes, com

fotoperíodo de 16 horas e temperatura de 25°C.

Com os parâmetros estabelecidos, folhas jovens (3 a 4 semanas de idade)

foram organizadas em novas placas de Petri de bombardeamento, com o lado adaxial

para cima, contendo meio de regeneração (meio MS com 3% de sacarose

suplementado com 0,1 mg/L de NAA, 0,1 mg/L de BAP e 0,6% de ágar, pH 5,8 e

autoclavado). Após um dia de incubação no meio de regeneração, grupos de 6 folhas

foram bombardeadas usando micropartículas de tungstênio WP-100 (Atlantic

Equipment Enginners, Bergenfield, NJ, USA) de 1 μm de diâmetro cobertas com o

vetor pLeCS com o uso de um acelerador de micropartículas que utiliza alta pressão

de gás hélio.

Foram feitos 18 experimentos, de 12 bombardeamentos cada, com 6 explantes

em cada bombardeamento, sendo que os bombardeamentos foram conduzidos em

condições controladas de umidade relativa do laboratório inferior a 40%, distância de

8 mm entre a câmara de gás a alta pressão (gerador de onda de choque) e a membrana

carreadora contendo as micropartículas com DNA, distância de 13 mm entre a

membrana carreadora e a tela de retenção, distância de 80 mm entre a tela de retenção

e o material a ser bombardeado, pressão de vácuo de 27 polegadas de Hg e pressão do

gás hélio de 1200 psi.

Dois dias após o bombardeamento, as folhas foram cortadas em pequenos

pedaços (4 x 4 mm) e colocadas com o lado adaxial para baixo, em contato com novo

meio de regeneração, contendo desta vez 50 mg/L de espectinomicina (antibiótico

seletivo), 500 mg/L de PVP para evitar o escurecimento do meio pela oxidação de

compostos fenólicos, 3% de sacarose, 0,6% de agar, 0,1 mg/L de NAA, 0,1 mg/L de

BAP e pH 5,8.

Após o início do aparecimento das radículas, cerca de dois meses após a

transformação, as plantas regeneradas foram transferidas para o meio com a metade

de sais do meio MS e metade da concentração de sacarose, contendo ainda 0,6% de

agar, 0,1 mg/L de NAA e 50 mg/L de espectinomicina, para induzir o enraizamento.

Depois de devidamente enraizadas, as plantas foram transplantadas para

vermiculita e foram levadas à casa de vegetação por 7 dias. Após esse período as

mudas foram transferidas para vaso com terra, mantidas na casa de vegetação, onde

permaneceram com irrigações diárias até o florescimento e produção das sementes.

85

3.2.4. Confirmação da inserção do transgene

Durante o período de aclimatação das plantas, análises para confirmação da

integração do transgene no cloroplasto da planta e para quantificação de folato no

tecido vegetal foram realizados.

3.2.4.1. Extração de DNA genômico das plantas para análise por PCR

O DNA foi isolado de discos foliares de acordo com Doyle e Doyle (1987).

Descrito no Capítulo 2, ítem 2.2.2.1. Extração de DNA genômico das plantas para

análise por PCR.

3.2.4.2. A PCR

A PCR foi realizada de acordo com Bonfim et al. (2007), para a confirmação

da inserção dos transgenes. Os primers específicos LeCSPSTF

(5´GCTGCAGTTGTAGGGAGGGATTTATGGCTGGTAGTACATTTGG-3´) e

LeCSPSTSACR (5´-CGAGCTCTGCAG TCAGAGGGTAACCTC-3´) foram

utilizados para amplificar uma seqüência de aproximadamente 1.100 pb

correspondente ao gene LeCS. As amostras foram colocadas no termociclador onde

foram tratadas a 95°C por 5 minutos, 35 ciclos de amplificação (95°C por 1 min.,

55°C por 1 min., 72°C por 1 min.) com um ciclo final de 72°C por 7 min., terminando

a 4°C.

Os produtos do PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1%

(p/v) preparado com tampão TBE 1X (10,8 g de Tris base, 5,5 g de ácido bórico e 4

mL de EDTA 500 mM, pH 8,0, em q.s.p. 1 L de água destilada) e corado com 1

mg/100 mL de brometo de etídeo. As bandas foram visualizadas e fotografadas com o

auxílio do Gel Doc 2000TM (Biorad).

3.2.5. Análise de folato em plantas pelo método microbiológico

A quantificação de folato foi realizada nas linhagens ABD12-1, ABD12-2 e

ABD18, plantas positivas para o transgene LeCS que tiveram o seu teor de folato

quantificado pelo método microbiológico, mediado por L. rhamnosus (ATCC 7469),

86

conforme descrito no Capítulo 2 (ítem 2.2.4 Análise de folato em plantas pelo método

microbiológico).

Os dados foram comparados sempre aos dos controles (plantas não

transformadas) e espinafre, por conter altas concentrações da vitamina. Os dados

foram então cruzados com os dados da curva de crescimento do microorganismo,

obtida por diluição seriada de ácido fólico como descrito no Capítulo 2 (ítem 2.2.4.4.

Quantificação de folato em folhas de alface).

Uma regressão polinomial, com auxílio do programa Excel, permitiu cruzar os

dados obtidos na curva com os dados das plantas, para obter a quantidade de folato

equivalente nestas plantas de acordo com o crescimento da bactéria observado.

3.3. Resultados & Discussão

No experimento para otimização dos parâmetros de bombardeamento das

folhas de alface, os dados gerados podem ser visualizados na tabela 2, onde estão

representados os ensaios usando pressões de 800 ou de 1.200 psi, com micropartículas

de tungstênio de 0,2 μm de diâmetro (M5) ou de 1 μm de diâmetro (M10). Os dados

foram conseguidos por meio da contagem dos pontos azuis existentes nas folhas de

alface após o bombardeamento com o vetor pBI 426. Em cada experimento, realizado

em triplicata, 6 explantes foram bombardeados, dando um total de 18 explantes por

experimento. Entre 9 e 105 pontos de expressão do gene gus puderam ser visualizados

por experimento nas folhas de alface (fig. 13).

Tabela 2. Números de pontos azuis obtidos na expressão transiente do gene gus em folhas de alface, foram usadas pressões de 800 e 1200 psi e partículas M5 e M10. Número de pontos azuis Experimento 1 Experimento 2 Experimento 3 Experimento 4

Triplicata 800 psi / M5 800 psi / M10 1200 psi / M5 1200 psi / M10 1 4 7 1 64 2 8 28 2 41 3 5 66 6 0

87

Fig. 131- Folhas de alface após o experimento com gene gus. (A) não há expressão do gene gus (B) há uma grande concentração de pontos azuis, onde ocorreu a reação histoquímica.

Conforme descrito na tabela 2, os experimentos utilizando partículas de

tungstênio de 1 μm (M10) e pressões de gás hélio de 800 e 1200 psi apresentaram os

valores mais elevados de número de pontos azuis. Kanamoto et al. (2006) usaram para

a cultivar de alface var. Cisco uma pressão de 900 psi, com partículas de ouro de 0,6

μm de diâmetro, indicando que maiores diâmetros de partículas têm tido melhores

resultados para folhas de alface, não se podendo afirmar o mesmo quanto à pressão

usada, que parece não surtir diferenças significativas na eficiência do sistema. É

importante notar também uma relação entre a espécie da planta e o tamanho de

partícula a ser utilizada, uma vez que Svab e Maliga (1993) obtiveram alta freqüência

de transformação de tabaco (Nicotiana tabacum) utilizando partículas de tunsgtênio

de apenas 0,1 μm de diâmetro. Por isso, foram escolhidas as condições de

bombardeamento de 1200 psi e partículas M10 para a transformação de folhas de

alface. Portanto, os demais experimentos visando inserir o gene de interesse foram

conduzidos nessas condições (tabela 2).

Uma semana após a transferência dos explantes para meio seletivo, estes

formaram um calo esbranquiçado. De 4 a 6 semanas após a passagem para o meio de

seleção, começaram a surgir pequenos brotos verdes (fig. 14), que foram então

transferidos para meio de enraizamento. Depois da planta formada, esta foi transferida

para vermiculita e finalmente para o solo.

A B

88

Fig. 141- Broto da planta ABD8, 5 semanas após o bombardeamento, saindo de uma intensa massa branca de células.

Nos 18 experimentos realizados, com 12 bombardeamentos cada, foram dados

216 tiros, e bombardeados 1.296 explantes, sendo obtidas 4 linhagens de plantas (uma

linhagem transgênica em 54 tiros). A primeira foi regenerada do oitavo experimento

(ABD8). Depois, mais duas plantas do experimento 12 foram obtidas (ABD12-1 e

ABD12-2). No último experimento, mais uma planta foi gerada (ABD18). Apesar da

baixa freqüência de produção em alface, o baixo número de transformantes por

experimento não é incomum. Na transformação de plastídeos de tabaco (Nicotiana

tabacum), Svab & Maliga (1993) obtiveram 1-15 linhagens transgênicas por

bombardeamento. Porém, na transformação de folhas de Arabidopsis uma linhagem

transgênica foi obtida em 100 tiros (Sikdar et al., 1998), uma linhagem foi obtida em

35 tiros de batata (Solanum tuberosum) (Sidorov et al., 1999) e uma planta

transgênica a cada 20 tiros de tomate (Lycopersicon esculentum) (Ruf et al., 2001).

Logo, entre as plantas superiores a transformação de plastídeos seria viável

habitualmente apenas para o tabaco, que é a planta que apresenta maior eficiência na

transformação, por isso, há ainda a necessidade de se desenvolver métodos mais

eficientes de transformação de cloroplastos de alface.

Durante a regeneração das plantas não se notou o escurecimento do meio de

cultura, como relatado por Kanamoto et al. (2006), porque foram adicionados ao meio

500 mg/L de PVP. Já foi notório o escurecimento dos calos não transformados após 2

meses no meio de cultura; primeiramente todos se tornavam brancos, e aqueles que

não se desenvolveram tornaram-se marrons, momento em que foram eliminados.

89

As plantas ABD positivas para o transgene lecs apresentaram um

desenvolvimento normal na casa de vegetação, sementes foram geradas, e as

progênies avaliadas se mostraram também positivas quanto à integração do gene

exógeno. Testes quanto à segregação do gene continuam sendo efetuados no

laboratório; toda a progênie tem sido avaliada por PCR (fig. 15).

Fig. 152- Eletroforese em gel de agarose 12% mostrando os fragmentos de 1.100 pb amplificados por PCR do gene lecs de algumas plantas T3. Linha 1 a 10: fragmento do DNA amplificado por PCR das plantas filhas da ABD12-1; linha 11 a 17: fragmento das plantas filhas da ABD12-2, linha 18: branco, linha 19: controle negativo (planta não transgênica) e linha 20: controle positivo, vetor utilizado na transformação diluído 1.000 vezes.

Algumas plantas filhas, porém, demonstraram quantidade anormal de flores e

sementes, além de um crescimento pronunciado. Três linhagens apresentaram um

número muito superior de flores por planta (cerca de 3 a 5 vezes). Quanto a essas

anomalias têm-se realizado outras análises, como a quantificação de AIA (ácido indol

acético), pois possivelmente esteja ocorrendo um desvio do corismato para a via

metabólica do triptofano, que é um precursor do hormônio AIA, uma auxina

envolvida com a regulação do crescimento da planta, dominância apical, formação de

raízes adventícias e florescimento (Altamura & Tomassi, 1998; Salisbury, 1955).

Para a quantificação de folato, calcularam-se os valores equivalentes de cada

medida observada nas plantas usando a equação gerada no programa Excel (y = -

3,6139x3 + 4,4752X2 – 1,1239x + 0,0815; R2= 0,9999). Estes valores foram então

transformados para ng/μg de tecido fresco. Em seguida, dividiu-se pela quantidade de

proteína existente em cada poço da placa de ELISA (quantificado por Bradford). Por

intermédio destas quantificações, as linhagens transgênicas mostraram um aumento

no teor de folato de até 77,8% (fig. 16). Entretanto, esses aumentos não são

estatisticamente significativos quando os dados são analisados com um teste t de

Student (P>0,05 versus controle).

90

Quantificação de Folato de 3 linhagens transgênicas

-5000

0

5000

10000

15000

20000

C- espinafre ABD18 ABD12-1 ABD12-2

Plantas

ng d

e fo

lato

/ ug

de

prot

eína

Fig. 161- Quantificação de folato de três linhagens transgênicas (ABD18, ABD12-1 e ABD12-2), de planta de alface não transformada (controle negativo) e de planta de espinafre, por conter alto teor de folato, os valores são fornecidos em ng de folato/µg de proteína total. As respectivas barras de erro estão representadas.

De La Garza et al. (2004), ao transformarem tomate, conseguiram um aumento

de duas a três vezes nas concentrações de folato em relação ao controle, após a

alteração da via das pterinas. Os autores sugeriram que o baixo aumento deveu-se

principalmente à diminuição nos níveis de pABA verificado nas plantas

transformadas, sendo este um fator limitante à expressão eficaz do gchI (GTP

ciclohidrolase I).

De la Garza et al. (2004) reportaram um aumento de até 20 vezes em relação

ao controle nos níveis de pABA em tomate, ao superexpressarem adcs. Porém, este

aumento de pABA não repercutiu em aumento significativo nos níveis de folato dos

frutos. Quando duas linhagens modificadas foram cruzadas (as que expressaram adcs

e as que expressaram gchI), o nível de folato nos frutos aumentou em cerca de 25

vezes em relação ao controle (De La Garza et al., 2007).

Os níveis de folato quantificados para as plantas transformadas com o vetor

lecs foram inferiores ao esperado, mas não se pode compará-los a outros estudos, pois

estes foram conduzidos com outras vias metabólicas e visando um aumento nos níveis

de folato em frutos e não em folhas. A hipótese de que parte do aumento ocasionado

pela transformação nos níveis de corismato esteja sendo usado para a formação de

alcalóides e outros compostos aromáticos ainda deverá ser avaliada. Como comentado

anteriormente, em plantas, resíduos de aminoácidos aromáticos produzidos pela via

metabólica do lecs servem como precursores para vários metabólitos secundários,

como AIA, indol alcalóides, fenilpropanóides e flavonóides (Herrmann, 1995). Mais

91

de 90% destes resíduos de aminoácidos são usados pelas bactérias para síntese de

proteínas (Dixon & Paiva, 1995). A caracterização da via metabólica do chiquimato

(via do pré-corismato) e do corismato é, portanto importante na elucidação e

engenharia genética de metabolismos secundários em plantas (Pascal et al., 2004).

Certos metabólitos secundários, incluindo fenilpropanóides e flavonóides, têm

importante papel no sistema de defesa das plantas (Dixon & Paiva, 1995; Dixon &

Steele, 1999) e o AIA é importante na produção de flores e conseqüentemente,

sementes. Por isso, há a possibilidade da via do lecs para a síntese de folato estar

sendo desviada para a síntese de auxina, com efeito no desenvolvimento de

meristemas florais, o que explicaria em parte a baixa quantificação de folato nas

plantas ABD e o alto número de flores. Caso este dado venha a ser confirmado nos

ensaios que estão em andamento, há um grande interesse na inserção deste vetor em

plantas produtoras de flores ornamentais e plantas produtoras de sementes importantes

para a alimentação humana e animal, ou com interesse agronômico.

92

Capítulo 4

Conclusões & Perspectivas

Como esperado um aumento no teor de folato foi obtido nas plantas

geneticamente modificadas expressando o gene gchI. Com este resultado plantas de

alface fortificadas obtidas neste trabalho fornecerão 26% da IDR de folato para

adultos (400 µg/dia para um adulto) pela ingestão diária de uma porção regular (56 g

ou uma xícara de chá, de acordo com USDA National Nutrient) de folhas destas

alfaces.

As linhagens geradas poderão ser iseridas em um programa de melhoramento

genético para que essa característica seja transferida para outras variedades. Além

disso, linhagens com alto teor de folato devem ser submetidas as análises de

biossegurança para que, no futuro, seja possível a avaliação de liberação de um

produto comercial que certamente teria um impacto positivo na saúde humana.

Ainda, o aumento de folato obtido poderá ser maior com a manipulação da via

de síntese de pABA. Nesse trabalho, essa via foi manipulada pela expressão do gene

de uma corismato sintase nos cloroplastos. Entretanto, não se obteve o aumento

esperado nas linhagens obtidas. Isto pode ocorrer devido ao desvio da via metabólica

de síntese de corismato para síntese de auxinas (por exemplo, AIA) e não para a

síntese de folato, como se esperava. Novos estudos deverão ser realizados para que se

possa compreender o que foi observado nesse trabalho. Essa compreensão ainda

depende de um maior conhecimento do controle das rotas metabólicas do chiquimato

e pABA em cloroplastos. Se for comprovado o desvio da via metabólica do corismato

para AIA haverá o interesse na inserção deste vetor, com as modificações necessárias,

para o aumento da produção de flores, no caso de plantas ornamentais ou na produção

de sementes e grãos em cultivares de interesse agronômico ou consumidos por

humanos e animais.

Provalmente um maior teor de folato poderá ser obtido com a expressão de um

gene de uma aminodeoxicorismato sintase (adcs). Essa deverá ser a etapa seguinte

nesse trabalho. Os resultados obtidos neste trabalho corroboram com aqueles

93

observados na literatura, os quais estabelecem uma necessidade de síntese tanto da via

do pABA quanto da via das pterinas, simultaneamente, para se ter plantas com maior

quantificação de folatos se comparado ao aumento obtido com a superexpressão de

cada substrato da via metabólica isoladamente. Em tomates houve um aumento de

apenas duas vezes quando superexpressou-se apenas um gene da via metabólica das

pterinas, e pABA mostrou-se um fator limitante para uma maior quantificação nos

níveis de folato (De La Garza et al., 2004). No entanto, um aumento de 25 vezes mais

folato foi observado em plantas expressando os genes gchI e AtADCS quando

comparado com plantas não transformadas, o que proveria a IDR total em menos de

uma porção padrão de tomate para mulheres grávidas. Nestas frutas uma quantidade

sete vezes superior de folato foi obtida em relação à plantas consideradas com alto

teor de folato (De La Garza et al., 2007).

Com estes resultados será possível produzir plantas convencionalmente,

cruzando as plantas que mais produzirem pABA (lecs ou adcs) com as que mais

produzirem pterinas (gchI) para se obter uma planta elite, com maior quantidade de

folato e então realizar um teste nutricional comparativo com a planta de alface elite e

uma planta de alface não transformada para avaliação da biodisponibilidade de folato

em animais (camundongos e/ou coelhos). Além disso, haverá a necessidade de

quantificar os vários metabólitos da via de síntese de pterinas e pABA. Isso poderia

lançar luz sobre como essas rotas são processadas em plantas, tanto no citoplasma

quanto nas mitocôndrias e cloroplastos, além de possivelmente terem alguma

relevância do ponto de vista de biossegurança. Já que níveis elevados de pterinas

foram observados em plantas transformadas como tomate (aumento de 10 vezes no

teor de pterinas) (De La Garza et al., 2004), arroz (25 vezes) (Storozhenko et al.,

2007) e Arabidopsis (1.000 vezes) (Hossain et al., 2004) quando se objetivou

aumentar o teor de folato. Este acúmulo não é interessante já que os efeitos do

acúmulo de pterinas no organismo humano não são conhecidos e podem ter

consequências para a saúde humana, devido ao importante papel das pterinas na

fisiologia humana (De La Garza et al., 2004; Storozhenko et al., 2007).

94

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