Biofísica · O que podemos tirar qualitativamente desse experimento? O desvio da trajetória pode...

Biofísica

Métodos Experimentais em Biofísica- Espectrometria de Massas

- Cristalografia de Proteínas

Prof. Dr. Walter F. de Azevedo Jr.

©2

01

5D

r.W

alter

F.

de

Aze

ve

do

Jr.

1

Espectrometria de Massas (Fundamentos)

2

v

Se um objeto está movimentando-se numa

dada trajetória, e submetemos esse objeto

a uma força lateral (F), teremos uma

mudança na sua trajetória. Consideremos

o lançamento de uma bola de basquete,

imagine que estamos com uma mangueira

d’água, e direcionamos um jato d’água

para a bola. Sua trajetória será alterada,

devido à força transversal F exercida sobre

a bola. Consideremos uma outra situação,

uma bola de tênis, com a mesma

velocidade (v) da bola de basquete. Se

dirigirmos o mesmo jato d’água para a bola

de tênis, teremos um desvio da trajetória

maior ainda. Estamos considerando que

ambas as bolas estão com a mesma

velocidade (v) e o jato d’água exerce a

mesma força F.

F

R

O que podemos tirar qualitativamente

desse experimento? O desvio da

trajetória pode ser expresso pelo raio da

curva (R) que a bola descreve ao ser

submetida a uma força transversal (F).

Assim, um desvio grande equivale a

dizer que a bola descreve uma curva

com raio menor.

Olhando-se a física do sistema, temos

uma bola submetida a uma aceleração

centrípeta, que a coloca em uma

trajetória circular, pelo menos enquanto

submetida à força exercida pela água da

mangueira.

4

v

F

v

F

Rbola de tênis

Rbola de basquete


A força é que leva à aceleração

centrípeta, causando a trajetória circular

de raio (R). A força centrípeta (F) é dada

pela equação abaixo:

onde R é o raio da circunferência, m a

massa da bola e v a velocidade da bola.

Isolando-se o raio da circunferência (R)

da equação acima temos:

A partir da equação do raio, vemos que

para uma força e velocidade constantes,

temos que o raio da circunferência (R) é

proporcional à massa da bola (m).

R

mvF

2

F

mvR

2

5

v

F

v

F

Rbola de tênis

Rbola de basquete


5

Olhando a equação do raio da trajetória,

vemos que o termo entre parênteses é

constante, o que varia é a massa da bola

e, consequentemente, o raio da

circunferência.

A equação acima é uma forma de

determinarmos a massa (m) de uma

partícula a partir do raio (R) da

circunferência descrita pela partícula

quando submetida a uma força

conhecida, como a exercida por um jato

d’água.

v

F

F

vmR

2

v

F

Rbola de tênis

Rbola de basquete


6

Isolando-se a massa (m) da equação

anterior temos:

Resumindo, num experimento onde

lançamos um partícula com velocidade

(v) constante, sabemos a velocidade (V)

e a força (F), podemos determinar a

massa (m).

Este é o princípio para entendermos o

funcionamento de espectrômetro de

massas.v

F

2v

RFm

v

F

Rbola de tênis

Rbola de basquete


7

v

F

R

Bx

qvBEqF

Quando temos uma partícula com carga

q, se deslocando com velocidade v em

uma região, onde temos um campo

elétrico E e um campo magnético B, essa

partícula fica sujeita a uma força devido

aos campos elétrico e magnético, essa

força (F) é chamada força de Lorentz e

tem a seguinte expressão:

Estamos considerando que o campo

magnético (B) é perpendicular à

velocidade da partícula, como no

desenho ao lado.

Campo magnético perpendicular

ao plano do slide, x indica essa situação


Considerando-se somente o campo magnético B, a partícula será sujeita a uma força

(F), dada pela seguinte equação:

Essa força de aceleração centrípeta submete a partícula a uma aceleração radial (a),

fazendo com que uma partícula de massa m e velocidade v descreva uma trajetória

circular com raio R, essa força centrípeta tem a seguinte expressão:

Igualando-se as duas equações acima, chegamos a seguinte expressão para a massa

(m) de uma partícula, com raio da trajetória (R) num campo magnético constante (B):

8

qvBF

R

mvF

2

v

qBRmqvB

R

mvF

2


9

Partícula com carga positiva deslocando-se num campo magnético constante gerado por um ímã.

Figura disponível em: <http://www.school-for-champions.com/science/magnetism_lorentz.htm#.VFzoQpV0zIU

>

Acesso em: 19 de outubro de 2015.

B

F

v

Considerando que temos um campo magnético (B) constante entre os polos norte e

sul de um ímã, temos uma força (F) atuando sobre uma partícula com carga positiva e

velocidade v, como indicada na figura abaixo.


Muito bem, as observações

anteriores servem de base para

o entendimento de umas das

técnicas mais usadas na análise

de moléculas biológicas no

século XXI, a espectrometria de

massas. Esta técnica permite

que as massas moleculares de

amostras de proteínas,

peptídeos e outras moléculas

biológicas sejam determinadas

com precisão, a partir do desvio

que apresentam ao deslocarem-

se num campo magnético

gerado por um eletromagneto.

Ao lado temos o diagrama

esquemático de um

espectrômetro de massas típico.

Descreveremos cada

componente do equipamento

nos próximos slides.10

IonizaçãoAceleração

eletromagneto

Para

bomba de

vácuo

Deflexão

Detecção

amostra

vaporizada

amplificador

gravador de

dados

Diagrama esquemático de um espectrômetro de massas.

Imagem disponível em:

< http://www.chemguide.co.uk/analysis/masspec/howitworks.html >.



http://www.chemguide.co.uk/analysis/masspec/howitworks.html

A amostra (átomos ou moléculas) é vaporizada. Essa amostra vaporizada é injetada e

submetida ao processo de ionização, que ocorre na câmara de ionização, mostrada

abaixo. Nessa câmara temos um feixe de elétrons gerados a partir de um filamento

de metal aquecido. Os elétrons são atraídos para uma placa metálica positiva,

chamada armadilha de elétrons (electron trap). A amostra vaporizada, ao passar pelo

feixe de elétrons, é ionizada, gerando íons positivos, ou seja, temos agora uma

amostra formada em parte por partículas com carga +1. A grande maioria dos íons

gerados tem carga +1, mas podemos ter íons com carga maior. Esses íons são

forçados para direita pelo repelente de íons (ion repeller). A câmara de ionização é

mantida num potencial elétrico de +10.000 Volts, que promove a ejeção de cargas

positivas.

11

Espectrometria de Massas (Ionização)

Diagrama esquemático da câmara de ionização de um espectrômetro de massas.

Imagem disponível em: < http://www.chemguide.co.uk/analysis/masspec/howitworks.html >.


Repelente de

íons

Amostra vaporizada

Armadilha de elétrons

Elétrons

Íons positivos

Filamento de metal aquecido


O feixe com as partículas da amostra sai da câmara de ionização e atravessa três

fendas, como indicado na figura abaixo. As fendas aceleradoras de feixes são

chamadas de lentes eletrostáticas, pois realizam o “foco” do feixe de íon. Essas

fendas têm como função gerar um feixe de partículas estreito e permitir a aceleração

das partículas carregadas da amostra vaporizada. As fendas apresentam potencial

elétrico decrescente, da esquerda para direita, sendo que a fenda final apresenta um

potencial elétrico de 0 volts. Tal arranjo de fendas possibilita a aceleração do feixe de

partículas carregadas.

12

Espectrometria de Massas (Aceleração)

Diagrama esquemático das fendas aceleradoras de feixe de um espectrômetro de massas.



Placa intermediária Placa final a 0 Volts

Feixe de íons

Câmara de ionização a

+ 10.000 Volts


Ao chegar ao eletromagneto, o feixe é submetido a uma deflexão que é inversamente

proporcional à massa da partícula, ou seja, partículas mais leves sofrem maiores

desvios. Outra parâmetro que afeta o desvio é a carga, íons mais positivos são mais

defletidos, assim se tivermos, para uma mesma massa, um íon com carga +2, esse

sofrerá um desvio maior que uma partícula com mesma massa mas carga +1. Como o

desvio do feixe de partículas depende da massa e da carga, é padrão combinarmos

essas informações na razão m/z (massa/carga). Por exemplo, se um íon tem uma

massa atômica de 12 e uma carga de +1, sua razão m/z é 12. Veja que o “z” é

minúsculo, não confundir com “Z” maiúsculo, usado para representar o número

atômico.

13

Espectrometria de Massas (Deflexão)

Diagrama esquemático do eletromagneto de um espectrômetro de massas.



Eletromagneto

Feixe de íons

misturadosFeixe de íons C

Feixe de íons BFeixe de íons A


No diagrama esquemático abaixo temos a indicação de três feixes de íons. Se

considerarmos que todos os feixes são de partículas com carga +1, temos que o feixe

A tem as partículas mais leves, seguido do feixe B, sendo o mais massivo o feixe C.

14Diagrama esquemático do eletromagneto de um espectrômetro de massas.



Eletromagneto

Feixe de íons

misturadosFeixe de íons C

Feixe de íons BFeixe de íons A

Espectrometria de Massas (Deflexão)


No diagrama visto no slide anterior, temos que só o feixe B chega ao detector de

íons, os outros feixes colidem com as paredes do espectrômetro de massas e são

removidos pela bomba de vácuo. Um íon do feixe B, ao chegar no detector de íons,

colide com a placa metálica do detector, essa placa está ligada a um fio. O íon, que

colidiu com a placa, captura um elétron da placa, tornando-se neutro (carga elétrica

zero). A captura do elétron do metal, deixa uma lacuna de elétron na placa metálica,

que é preenchida por um elétron do fio ligado à placa metálica. Essa corrente é

detectada e amplificada. Quanto mais íons colidirem com a placa metálica do detector

de íons, mais elétrons serão capturados e maior será a corrente gerada. Assim, a

corrente gerada é proporcional ao número de íons que atinge o detector.

15

Espectrometria de Massas (Detecção)

Diagrama esquemático do detector de íons de um espectrômetro de massas.



Feixe de íons B

Caixa de metal

Para o amplificador

Íon positivo

elétrons


Os íons do feixe A podem ser detectados diminuindo-se a intensidade do campo

magnético. Já os íons do feixe C, necessitam um aumento na intensidade do campo

magnético, para que possam atingir o detector de íons.

16Diagrama esquemático do detector de íons de um espectrômetro de massas.



Feixe de íons B

Caixa de metal

Para o amplificador

Íon positivo

elétrons



A análise realizada pelo espectrômetro de massas gera um espectro de massas, que é

mostrado num gráfico onde temos no eixo vertical a abundância relativa do íon e no

eixo x a razão m/z. A abundância relativa é diretamente proporcional à intensidade

corrente medida, assim o que temos também é uma representação da intensidade

relativa das correntes medidas. Esse gráfico é chamado de espectro de massas da

amostra. No caso abaixo temos uma amostra do elemento químico molibdênio. Pelo

espectro vemos que o isótopo mais abundante do molibdênio é o de razão m/z igual a

98.

17

abundância

relativa

Espectro de massas do molibdênio.





Há diversos refinamentos da técnica de espectrometria de massas, especificamente

com foco em cada uma das etapas do processo. Por exemplo, no método MALDI

(matrix-assisted laser desorption ionization), temos uma mistura da amostra a ser

analisada com uma substância de baixa massa molecular, se comparada com uma

proteína. Essa substância absorbe radiação ultravioleta, pois a maioria do

espectrômetros de massa, que usam o método MALDI, apresentam um laser na faixa

UV. A mistura amostra+substância é dissolvida em solvente orgânico e levada a uma

câmara de vácuo, que leva à solidificação da mistura amostra+substância.

18

Espectrometria de Massas (MALDI)

Raio

laser

Íon da

amostra

Para o analisador

de massa

Mistura amostra/matriz

Matriz

ionizada

Método de ionização da amostra MALDI. A amostra a ser

analisada é misturada a uma substância que absorve radiação

ultravioleta, por exemplo a substância 2,5-dihidroxi ácido

benzoico. Essa mistura é dissolvida em solvente orgânico, por

exemplo acetonitrilia, e injetado numa câmara de vácuo para

cristalizar, o que forma a matriz. Imagem disponível em: <

http://www.magnet.fsu.edu/education/tutorials/tools/ionization_

maldi.html >.


http://www.magnet.fsu.edu/education/tutorials/tools/ionization_maldi.html

A remoção do ar na câmara de vácuo leva à evaporação do solvente orgânico e à

cristalização da mistura amostra + substância, formando o que chamamos de matriz.

Essa matriz é pulverizada a partir de um feixe de laser de alta intensidade, como

ilustrado abaixo. A substância absorve UV ionizando-se e transferindo parte da energia

absorvida para a proteína (amostra). A amostra é levada à ionização no processo.

Todos os detalhes do processo de ionização da amostra não são totalmente

entendidos, mas o resultado líquido é que a amostra é levada à ionização.

19

Raio

laser

Íon da

amostra

Para o analisador

de massa

Matriz

ionizada

Mistura amostra/matriz

Método de ionização da amostra MALDI. A amostra a ser

analisada é misturada a uma substância que absorve radiação

ultravioleta, por exemplo a substância 2,5-dihidroxi ácido

benzoico. Essa mistura é dissolvida em solvente orgânico, por

exemplo acetonitrilia, e injetado numa câmara de vácuo para

cristalizar, o que forma a matriz. Imagem disponível em: <

http://www.magnet.fsu.edu/education/tutorials/tools/ionization_

maldi.html >.



http://www.magnet.fsu.edu/education/tutorials/tools/ionization_maldi.html

20Diagrama da técnica MALDI. Figura modificada da original disponível em:

http://mutage.oxfordjournals.org/content/15/5/415.full.pdf+html .

Acesso em: 19 de outubro de 2015. Bakhtiar R., Tse FLS. Mutagenesis (2000) 15 (5): 415-430.

O diagrama abaixo ilustra os principais passos do método

de MALDI aplicado na análise de um peptídeo (amostra).

O peptídeo ionizado permite a análise da massa dos seus

fragmentos.

Espectro de massas do peptídeo


http://mutage.oxfordjournals.org/content/15/5/415.full.pdf+html

21

Espectrometria de Massas (TOF)

A sigla TOF representa em inglês time of flight, ou seja, tempo de voo. É um método

de espectrometria de massas que não usa o desvio num campo magnético (B) para

determina a razão m/z de uma amostra, e sim seu tempo de voo (time of flight). O

diagrama abaixo ilustra o princípio. A amostra ionizada é submetida a uma diferença

de potencial (V0) que acelera as partículas de massa m, essas partículas entram numa

região sem campo elétrico e magnético, chamada de espaço de deriva (drift space). A

diferença de potencial (V0) faz com que as partículas com carga q tenham energia

potencial U = qV0, que é convertida em energia cinética (K), como indicado abaixo.

0

2

2

1

qVU

mvK

2

00

2 2

2

1

v

V

q

mqVmv

Considerando-se que toda energia

potencial U é convertida em energia

cinética K, temos:

22

Pela equação abaixo vemos que a razão m/z, onde z é a carga q, depende somente

da velocidade da partícula (v) na região de dereviva (drift space) e do potencial (V0).

Considerando-se que a espaço percorrido no voo tem um comprimento x, o tempo de

voo (t) da partícula será dado por:

onde

Assim, quanto maior a razão m/q da

partícula, maior o tempo de voo (t).

O uso concomitante dos métodos MALDI

e TOF leva a um espectrômetro de

massas MALDI-TOF, muito usado para o

estudo de amostras biológicas como

proteínas, peptídeos e ácido nucleicos.

v

xt

2/1

0

2/1

0

2

2

qV

mxt

m

qVv

Espectrometria de Massas (TOF)

Na análise dos espectros de

massas de peptídeos,

terminamos com os valores

das massas dos resíduos de

aminoácidos, assim, para

identificar sobre qual

aminoácido o pico no espectro

de massa se refere, temos

que fazer uso de uma tabela

de massas moleculares dos

resíduos de aminoácidos,

como a indicada ao lado.

Lembrem-se que para o C-

terminal, temos que somar o

peso atômico do oxigênio e do

hidrogênio.

23

Espectrometria de Massas (Espectro de Massas)

Amino Acid Short Abbrev. FormulaMon. Mass§(Da)

Avg. Mass (Da)

Alanine A Ala C3H5NO 71.03711 71.0788

Cysteine C Cys C3H5NOS 103.00919 103.1388

Aspartic acid D Asp C4H5NO3 115.02694 115.0886

Glutamic acid E Glu C5H7NO3 129.04259 129.1155

Phenylalanine F Phe C9H9NO 147.06841 147.1766

Glycine G Gly C2H3NO 57.02146 57.0519

Histidine H His C6H7N3O 137.05891 137.1411

Isoleucine I Ile C6H11NO 113.08406 113.1594

Lysine K Lys C6H12N2O 128.09496 128.1741

Leucine L Leu C6H11NO 113.08406 113.1594

Methionine M Met C5H9NOS 131.04049 131.1986

Asparagine N Asn C4H6N2O2 114.04293 114.1039

Pyrrolysine O Pyl C12H21N3O3 255.15829 255.3172

Proline P Pro C5H7NO 97.05276 97.1167

Glutamine Q Gln C5H8N2O2 128.05858 128.1307

Arginine R Arg C6H12N4O 156.10111 156.1875

Serine S Ser C3H5NO2 87.03203 87.0782

Threonine T Thr C4H7NO2 101.04768 101.1051

Selenocysteine U Sec C3H5NOSe 150.95364 150.0388

Valine V Val C5H9NO 99.06841 99.1326

Tryptophan W Trp C11H10N2O 186.07931 186.2132

Tyrosine Y Tyr C9H9NO2 163.06333 163.1760

Fonte da tabela em: <

http://en.wikipedia.org/wiki/Proteinogenic_amino_acid >.


http://en.wikipedia.org/wiki/Proteinogenic_amino_acid#monmassnote

http://en.wikipedia.org/wiki/Atomic_mass_unit

http://en.wikipedia.org/wiki/Atomic_mass_unit

http://en.wikipedia.org/wiki/Alanine

http://en.wikipedia.org/wiki/Cysteine

http://en.wikipedia.org/wiki/Aspartic_acid

http://en.wikipedia.org/wiki/Glutamic_acid

http://en.wikipedia.org/wiki/Phenylalanine

http://en.wikipedia.org/wiki/Glycine

http://en.wikipedia.org/wiki/Histidine

http://en.wikipedia.org/wiki/Isoleucine

http://en.wikipedia.org/wiki/Lysine

http://en.wikipedia.org/wiki/Leucine

http://en.wikipedia.org/wiki/Methionine

http://en.wikipedia.org/wiki/Asparagine

http://en.wikipedia.org/wiki/Pyrrolysine

http://en.wikipedia.org/wiki/Proline

http://en.wikipedia.org/wiki/Glutamine

http://en.wikipedia.org/wiki/Arginine

http://en.wikipedia.org/wiki/Serine

http://en.wikipedia.org/wiki/Threonine

http://en.wikipedia.org/wiki/Selenocysteine

http://en.wikipedia.org/wiki/Valine

http://en.wikipedia.org/wiki/Tryptophan

http://en.wikipedia.org/wiki/Tyrosine

http://en.wikipedia.org/wiki/Proteinogenic_amino_acid

Na biologia, o espectrômetro de massas MALDI-TOF pode ser usado para o

sequenciamento de peptídeos, ou seja, para a determinação da sua sequência de

resíduos de aminoácidos, baseado na massa precisa de cada fragmento identificado

no espectro de massas, como indicado na figura abaixo. Na figura abaixo, cada pico

representa a massa molecular precisa de um fragmento do peptídeo analisado.

Vejamos o processo de determinação da sequência em detalhes.

24Espectro de massas de um peptídeo com 21 resíduos de aminoácidos. Imagem disponível em: <

http://www.pnas.org/content/96/13/7131/F3.large.jpg>.Acesso em: 19 de outubro de 2015. Keough T et al. PNAS 1999;96:7131-7136

GVLVVAASGNSGASSISYPAR


A análise do espectro de massas visa determinar a estrutura primária do peptídeo

analisado. O primeiro pico da esquerda para direita representa o C-terminal do

peptídeo. O eixo x indica a razão m/z, como estamos considerando que todos os íons

têm carga +1, a massa do primeiro pico equivale a uma massa de 175 Da, próxima à

massa da arginina presente num C-terminal. Assim, o C-terminal (final do peptídeo) é

uma arginina. Para identificar os próximos aminoácidos, seguimos com os picos. No

espectro a diferença entre cada pico consecutivo indica a massa do aminoácido.

Abaixo, a seta vermelha indica que para o próximo pico temos uma diferença de 71,2

Da, ou seja, uma alanina.





O segundo pico indica uma diferença de massas de 97,0 Da, uma prolina. Seguindo-

se o processo identificamos todos os picos e temos a sequência de aminoácidos do

peptídeo. Na aplicação do espectrômetro de massas para o sequenciamento de

proteínas, temos que a amostra da proteína é submetida à clivagem a partir da ação

de proteases, como tripsina. Os fragmentos da proteólise são purificados a partir da

técnica de cromatografia líquida e injetados no espectrômetro de massas para

sequenciamento. Os trechos dos peptídeos sequenciados são sobrepostos e a

sequência completa da proteína é determinada.





1. Cristalização. Nesta

etapa a macromolécula é

trazida a um estado de

supersaturação que

favorece a formação de

cristais, como os

mostrados acima. Os

cristais de moléculas

biológicas normalmente

apresentam dimensões

inferiores a 1 mm de

comprimento em cada

aresta.

2. Coleta de dados de difração de raios X no LNLS.

Os cristais apresentam um arranjo ordenado de

moléculas, como uma pilha de tijolos ordenados. Na

analogia, cada tijolo representa uma molécula. As

distâncias entre os átomos são da ordem de 1 Å (0,1 nm

ou 10-10 m), usando-se raios X (com comprimento de

onda da ordem de Å ) teremos difração.

3. Interpretação do padrão de

difração de raios X. A figura

abaixo é o registro da difração de

raios X de um cristal. Os raios X

interagem com o cristal, o que

produz um padrão de difração. A

análise desta informação

possibilita a resolução de estrutura

3D.

4. Resolução da estrutura.

A partir da análise do

padrão de difração é

possível gerar mapas de

densidade eletrônica (à

direita). A interpretação de

tais mapas gera a estrutura

3D de molécula.

5. Análise. A partir da estrutura

resolvida procedemos à análise,

onde relaciona-se a estrutura 3D à

sua função biológica.

Etapas para resolução da

estrutura 3D de

macromoléculas biológicas

por cristalografia

27

Cristalografia de Proteínas

Geodo de ametistas (MCT-PUCRS) Cristal de Quartzo (MCT-PUCRS)

Normalmente os cristais inorgânicos e de pequenas moléculas de uma forma geral

são rígidos, transparentes e com arestas bem definidas, como os cristais de ametista

e quartzo mostrados abaixo. A rigidez estrutural é reflexo das fortes interações que

estabilizam o arranjo cristalino, tais como interações iônicas e ligações covalentes.

©2

00

9D

r.W

alter

F.

de

Aze

ve

do

Jr.

© 2

00

9 D

r. W

alter

F.

de

Aze

ve

do

Jr.

Cristais de Pequenas Moléculas

28

Abaixo temos exemplos de cristais inorgânicos, como os cristais de rubi, não

lapidados e lapidados (foto da esquerda) e os cristais de quartzo (foto da direita). Os

cristais são da coleção do Natural History Museum, London-UK (2011, 2013).

© 2

011 D

r. W

alter

F.

de

Aze

ve

do

Jr.

© 2

01

3 D

r. W

alter

F.

de

Aze

ve

do

Jr.

29

Cristais de Pequenas Moléculas

As cristalizarmos proteínas, peptídeos e ácidos nucleicos esses apresentam-se como

cristais relativamente frágeis, transparentes (na maioria) e com arestas bem definidas.

Abaixo temos 3 cristais proteínas e peptídeos: enoil-redutase de Mycobacterium

tuberculosis (Oliveira et al. 2006), mastoparano isolado de vespa Anterhynchium

flavomarginatum micado (Delatorre et al., 2001) e uropesina (Canduri et al., 2001).

Oliveira JS, Pereira JH, Canduri F, Rodrigues NC, de Souza ON, de Azevedo Jr. WF, Basso LA, Santos DS. J. Mol. Biol.

359(3):646-666, 2006.

Delatorre, P, Olivieri, JR, Ruggiero Neto, J, Lorenzi, CC, Canduri, F, Fadel, V, Konno, K, Palma, MS, Yamane, T, De Azevedo Jr.,

W F. Biochim. Biophys. Acta. 1545(1-2):372-376, 2001.

Canduri, F, Teodoro, LG, Fadel, V, Lorenzi, CC, Hial, V, Gomes, RA, Neto, JR, De Azevedo Jr., WF. Acta Crystallogr. Sect. D-

Biol. Crystallogr. 57(11):1560-70, 2001.

Cristais de Macromoléculas Biológicas

30

http://www.biocristalografia.df.ibilce.unesp.br/crystals/empaf2.html

http://www.biocristalografia.df.ibilce.unesp.br/crystals/empaf2.html

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16647717?ordinalpos=27&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVDocSum



Cristais de proteína apresentam:

1) Fragilidade mecânica, devido às

ligações que estabilizam o cristal. Nos

cristais de pequenas moléculas as

ligações que estabilizam o

empacotamento cristalino normalmente

são iônicas e covalentes, nos cristais de

macromoléculas biológicas as ligações

são normalmente ligações de hidrogênio.

2) Alto conteúdo de solvente. Os

cristais de macromoléculas biológicas

apresentam alto conteúdo de solvente, se

comparados com cristais de pequenas

moléculas, tal conteúdo de solvente

permite que ligantes possam difundir-se

pelo retículo cristalino, permitindo o

estudo de complexos entre proteínas e

ligantes.

Cristal da proteína lisozima, com dimensões aproximadas de

1 mm x 1mm x 1mm. A proteína cristalizada apresenta-se

como tijolos empilhados de forma ordenada. Podemos

pensar que cada molécula de proteína é um tijolo. A

fragilidade mecânica do arranjo deve-se às fracas interações

intermoleculares, que estabilizam o cristal de proteína. Tais

interações são normalmente ligações de hidrogênio.

31


3) Fragilidade a danos causados por

radiação. A exposição de cristais de

proteínas às radiações ionizantes, como

raios X, leva à quebra de ligações e a

geração de radicais livres no retículo

cristalino, que podem quebrar as frágeis

ligações de hidrogênio que estabilizam o

cristal. No empacotamento das moléculas

cristalizadas temos grandes canais de

solventes, como mostrado ao lado. As

moléculas de água, quando expostas à

radiação ionizante, podem formar radicais

livres, que quebram as ligações de

hidrogênio envolvidas na manutenção do

arranjo cristalino.

Cristais de proteína normalmente apresentam:

Canais de solvente

Canais de solvente

32


Rede= construção matemática

Base de átomos= entidade física

Para estudos de cristalografia, faz-se necessário uma definição de cristal. Para facilitar

a visualização, consideremos um cristal bidimensional. Num plano temos um conjunto

de pontos (construção matemática), igualmente espaçados, cada ponto apresenta

igual vizinhança, de forma que, um observador sobre um ponto qualquer olhando para

uma dada direção, não conseguirá diferir ao deslocar-se para outro ponto da rede.

Resumindo, os pontos são indistinguíveis, quando consideramos sua vizinhança.

Esses pontos formam uma rede. Acoplando-se a cada ponto da rede, uma base de

átomos (entidade física), sendo a mesma base de átomos para todos os pontos da

rede, teremos uma rede cristalina, ou cristal bidimensional.

+ =

Rede + base de átomos = cristal bidimensional

33

Rede Cristalina

Retículo= construção matemática

Base de átomos= entidade física

Retículo + base de átomos = Retículo cristalino

No caso tridimensional, temos que cada ponto do espaço tem que satisfazer a

condição de igual vizinhança em três dimensões. Os pontos têm que apresentar igual

espaçamento, formando assim um retículo (construção matemática). Acoplando-se a

cada ponto do retículo uma base de átomos (entidade física), temos um retículo

cristalino, o cristal tridimensional. A base de átomos pode ser tão simples como

átomos isolados ou tão complexas como um capsídeo de um vírus.

34

Retículo Cristalino

Na figura ao lado, cada molécula está

representada só com os carbonos alfa,

com uma linha ligando os átomos. Tal

representação simplifica a figura e dá

idéia dos elementos de estrutura

secundária presentes na proteína. A visão

estereográfica permite ver a profundidade

de figura. A figura da direita é a visão do

olho direito e a da esquerda do olho

esquerdo. Olhando para ambas figuras,

de forma relaxada, é possível ter noção

de tridimensionalidade da figura. Deixe

seu nariz no centro da figura e relaxe os

olhos, para visualizar em 3D. A caixa que

envolve as 4 moléculas é a cela unitária.

Canduri, F, Teodoro, LG, Fadel, V, Lorenzi, CC, Hial, V, Gomes, RA, Neto, JR, De Azevedo Jr., WF. Acta Crystallogr. Sect. D-

Biol. Crystallogr. 57(11):1560-70, 2001.35

Retículo Cristalino

α ângulo entre b e c

β ângulo entre a e c

γ ângulo entre a e b

a

b

c

Podemos pensar o cristal como uma pilha de tijolos ordenados. Cada tijolo encaixado

noutro. Desta forma temos uma pilha bem formada e com extremidades retas. O tijolo

básico que forma esta pilha é a cela unitária. Num cristal ela contém uma ou mais

moléculas. A cela unitária é a menor unidade que apresenta a simetria do cristal. A

partir da translação ao longo dos eixos do retículo teremos o cristal. Os eixos da cela

unitária recebem o nome de a, b e c, o ângulo entre os eixos a e b é chamado , entre

os eixos b e c é e por último entre a e c o ângulo .

36

Cela Unitária

Para cristalizarmos uma macromolécula

biológica é necessário trazê-la a um

estado de supersaturação. Consideremos

uma proteína dissolvida em um tampão.

Para que a proteína seja levada a formar

cristais, é necessário que as moléculas da

proteína dissolvidas na solução, sejam

trazidas a uma situação onde as

moléculas estejam próximas umas das

outras. Para levar a proteína a tal

situação, podemos aumentar sua

concentração (eixo vertical), ou aumentar

a concentração do sal presente na

solução da proteína. O diagrama ao lado

ilustra as diferentes regiões de

solubilidade da proteína.

37

Cristalização de Macromoléculas Biológicas

O processo de cristalização da proteína

normalmente deve ser lento (muitas horas

ou dias), ou seja, considerando-se a

proteína inicialmente numa região abaixo

da curva de solubilidade, devemos

aumentar a concentração salina, ou da

proteína, de modo a trazê-la na região de

supersaturação, de forma lenta. Na região

de supersaturação teremos as moléculas

da proteína próximas umas das outras, o

que, em casos favoráveis, promoverá o

aparecimento dos primeiros núcleos

cristalinos. Esses microcristais servirão de

base para o crescimento de cristais

maiores, adequados para experimentos

de difração de raios X.

38


Para cristalizarmos proteínas,

normalmente usamos o método de

difusão de vapor. Uma gota de proteína é

colocada sobre uma lamínula. Na gota

adicionamos uma solução contendo sal,

ou outro agente precipitante, como

polietileno glicol (PEG). Colocamos essa

lamínula sobre um poço, onde temos a

solução do precipitante. Ao fecharmos

esse sistema ocorrerá difusão de

moléculas de água da gota para o poço,

levando a proteína, em casos favoráveis,

a um estado de supersaturação, que pode

levar à formação dos primeiros núcleos

cristalinos.

39


Fenômeno de salting-in. a) Macromolécula biológica sem a presença de íons dissolvidos na solução. A atração eletrostática entre

os grupos carregados em duas os mais macromoléculas causa a aglomeração e precipitação. b) Íons blindam a interação

eletrostática entre as macromoléculas, aumentando a solubilidade.

O aumento da solubilidade de uma macromolécula a baixa concentração salina

(<0,5M) é chamada salting-in. Segundo a teoria de Debye-Hückel para soluções

iônicas, um aumento na força iônica reduz a atividade dos íons em solução e aumenta

a solubilidade do composto iônico. Uma forma alternativa de se tratar o fenômeno é

considerar o salting-in como o resultado da competição entre grupos carregados na

superfície da macromolécula e os íons em solução. Na ausência de íons no solvente,

a macromolécula precipita devido à atração de eletrostática entre cargas opostas em

diferentes partes da macromolécula. Se os íons são adicionados à solução, esses

blindam os grupos carregados na macromolécula e aumentam a sua solubilidade.

+

- +

-+

- +

-

+

+

-

-

a) b)

40


Sequência de eventos para a montagem de uma gota de cristalização: a) Coloca-

se 1-2L da solução da macromolécula biológica sobre a lamínula de vidro. b)

Adiciona-se 1-2L da solução do reservatório à gota com a solução da macromolécula

biológica. c) Ao final temos uma gota (2+2) com a solução de macromolécula biológica

mais a solução do reservatório.

Solução do poço

41


Com o aumento do número de

macromoléculas cristalizadas, tornou-se

óbvio que muitas das condições de

cristalização se assemelhavam, ou seja,

havia uma concentração de resultados

positivos de cristalização de

macromoléculas, usando-se número

limitado de precipitantes, tampões e

aditivos. Isto levou à proposição de

diversos métodos de cristalização (Carter

& Carter, 1979), onde um número limitado

de condições de cristalização eram

tentados, usando-se pequenas

quantidades da macromolécula

(miligramas). A partir da observação dos

resultados preliminares desses

experimentos era possível determinar que

tampão, aditivo e agente precipitante

seriam os mais favoráveis e a partir daí

proceder-se a sucessivos melhoramentos

até se conseguir cristais adequados.

Jancarik, J, & Kim, S. -H. (1991) J. Appl. Crystallogr. 24, 409-411.42


Por tentativa e erro a matriz

multimensional foi simplificada

eliminando-se as condições que podem

ser parcialmente representadas por

resultados de outras condições, a

proposta original apresenta 58 condições.

Comercialmente a empresa Hampton

Research, (USA) simplificou o método

original, e disponibiliza um kit com 50

condições de cristalização.

Comercialmente há outros kits usando-se

como princípio a variação de pH, força

iônica e agentes precipitantes.

Fonte: http://www.hamptonresearch.com/products/ProductDetails.aspx?cid=1&sid=17&pid=1

43


Um dos sistemas usados para cristalização de proteínas é a placa linbro, mostrada

acima. Essa placa apresenta 24 poços, que permite testarmos diversas condições de

cristalização. As lamínulas são colocadas sobre cada um dos poços, e vedadas com

graxa de vácuo.

Fonte: http://www.hamptonresearch.com

44


Cristais de proteínas são frágeis, assim diversos cuidados são tomados na

manipulação desses. Na coleta de dados de difração de raios X, uma forma possível

de manipularmos os cristais e deixando-os saturados de solvente e inseri-los num

capilar, como mostrado na figura acima. Os cristais nessa situação podem ser levados

para coleta de dados de difração de raios X.45

Coleta de Dados de Difração de Raios X

Uma forma alternativa de coletarmos dados, é transferir o cristal para uma solução

com protetor criogênico (polietileno glicol, glicerol entre outros). Usando-se esse

método, o cristal pode ser exposto a um fluxo de nitrogênio líquido e transferido para

uma base metálica (cabeça goniométrica). O cristal fica pronto para a coleta de dados.

As temperaturas criogênicas minimizam os dados causados pela radiação. 46


Foto disponível em: < http://www.hamptonresearch.com >.


Na figura da esquerda vemos uma base de cobre usada como suporte para cristais. À

direita temos um cristal inserido num laço. A exposição ao nitrogênio líquido leva à

formação de um filme rígido e transparente que mantém o cristal no laço.47


http://www.hamptonresearch.com/

A cristalografia por difração de raios X,

usada para resolução de estruturas de

proteínas, baseia-se na interferência de

ondas eletromagnéticas. As figuras ao

lado mostram interferência entre ondas,

temos duas ondas em fase, ondas 1 e 2,

onde seus máximos e mínimos coincidem

e a onda apresenta o mesmo

comprimento de onda, o resultado da

soma das duas é uma onda com a

amplitude resultante igual à soma das

amplitudes das ondas 1 e 2. No caso de

interferência destrutiva, temos as ondas

fora de fase, exatamente meio

comprimento de onda, onde o máximo da

onda 1 coincide com o mínimo da onda 2,

o resultado da soma é uma onda de

amplitude zero.

Interferência

construtiva Interferência

destrutiva

1 2 3 4 5 6

-4

-3

-2

-1

1

2

3

4

1 2 3 4 5 6

-4

-3

-2

-1

1

2

3

4

1 2 3 4 5 6

-4

-3

-2

-1

1

2

3

4

1 2 3 4 5 6

-4

-3

-2

-1

1

2

3

4

1 2 3 4 5 6

-4

-3

-2

-1

1

2

3

4

1 2 3 4 5 6

-4

-3

-2

-1

1

2

3

4

1 1

2 2

48

Difração de Raios X

Abaixo temos uma animação que vemos interferência construtiva e destrutiva para de

duas ondas. As ondas 1 e 2 são representadas acima, o resultado das duas ondas está

representada na onda debaixo. Vemos quando os pico coincidem temos uma

interferência construtiva, e a onda desenhada com a linha grossa, atinge o máximo.

49


Onda 1

Onda 2

Ondas 1 + 2

Imagem disponível em: < http://www.xtal.iqfr.csic.es/Cristalografia/parte_05-en.html> .


http://www.xtal.iqfr.csic.es/Cristalografia/parte_05-en.html

Para resolver uma estrutura de

macromoléculas biológicas (proteína ou

ácido nucleico), a partir da difração de

raios X, precisamos cristalizá-las. O cristal

é um arranjo ordenado das moléculas, no

caso proteínas ou ácido nucleicos. Uma

forma de imaginarmos um cristal é por

meio da analogia com uma pilha de

tijolos, onde cada tijolo é uma molécula e

a pilha ordenada de tijolos o nosso cristal.

A incidência de raios X sobre um cristal

gera um padrão de difração, a partir do

qual podemos elucidar a estrutura

tridimensional da macromolécula.Pilha ordenada de tijolos. Na nossa analogia, cada tijolo

representa uma molécula. A pilha de tijolos é o cristal.

Foto disponível em:

<http://www.sciencephoto.com/media/358564/enlarge >


50


http://www.sciencephoto.com/media/358564/enlarge

Considere um conjunto de planos paralelos de um cristal, como mostrado na figura

abaixo, com distância interplanar (d). Incidindo sobre este conjunto de planos

paralelos temos raios X de comprimento de onda . Podemos analisar a difração de

raios X como se fosse resultado da reflexão dos raios X pelos planos. Para que ocorra

difração, num dado ângulo , é necessário que as ondas difratadas sofram

interferência construtiva. Usando-se a analogia com uma pilha de tijolos, onde cada

tijolo é uma molécula cristalizada, podemos pensar que os planos paralelos são as

superfícies dos tijolos, que como estão empilhados, formam planos paralelos.

d

Raios X

d

51


Analisemos a diferença de caminho

ótico dos feixes 1 e 2, indicados na

figura. O feixe 2 percorre a distância

A + B a mais que o feixe 1. Assim,

para que as ondas dos feixes 1 e 2

sofram interferência construtiva, a

diferença de caminho ótico entre elas

deve ser um número inteiro de

comprimentos de onda.

A B

A + B = 2.A = 2 d.sen

dd

d

d.sen

1

2

1

2

52


A diferença de caminho ótico (2 d.sen

) tem que ser um número inteiro de

comprimento de ondas (n.), onde n

é inteiro, assim temos:

2 d.sen = n. (Lei de Bragg)

A B

dd

d

d.sen

1

2

1

2

2.senθ

n.λd =1,54.10-10m

53


Num experimento típico de difração de raios X, temos a fonte de radiação, o cristal e o

detector, como mostrado no diagrama esquemático abaixo. Normalmente os ângulos

de difração são expressos em relação ao feixe incidente, ou seja, 2 .

2

Fonte de raios X

Cristal

54


No caso de colocarmos um filme fotográfico para registrar a imagem de difração de

raios X, como mostrado no diagrama abaixo, teremos um padrão de difração de raios

X bidimensional, quanto mais distante o ponto de difração de raios X do ponto central

da figura (feixe direto) maior o ângulo de espalhamento (2). A foto da direita foi girada

90º com relação ao diagrama de esquerda. No aparato experimental o filme ou placa

de imagem está perpendicular ao plano.

2

Cristal

Filme fotográfico ou placa de imagem

Feixe de raios X

Feixe direto

Film

e f

oto

grá

fico o

u p

laca

de

im

age

m

55


Experimentos de cristalização no

espaço normalmente geram cristais

de melhor qualidade para estudos

de difração de raios X. As

condições de microgravidade do

espaço, propiciam um

empacotamento cristalino mais

ordenado, gerando cristais que

difratam à mais alta resolução. A

proteína uropesina (Canduri et al.,

2001) foi cristalizada em condições

de microgravidade na missão STS-

95 do ônibus espacial Discovery (

Disponível em: <

http://www.youtube.com/watch?v=N

9IFiQNY8mE >).

Fonte: http://www.aviationspectator.com/more-aviation-photos?page=405. Crédito: NASA

Cristal de uropepsina .56

Cristalização de Proteínas no Espaço


http://www.youtube.com/watch?v=N9IFiQNY8mE

http://www.aviationspectator.com/more-aviation-photos?page=405

Diversas técnicas físicas são de

fundamental importância para o estudo de

sistemas biológicos, entre elas a

cristalografia por difração de raios X e a

espectrometria de massas. Tais técnicas

tem fundamentos na Física e na

Química. As principais aplicações da

cristalografia e da espectrometria estão

relacionadas com as disciplinas de

Bioquímica Estrutural e Biologia

Molecular.

Aula de

hoje

QuímicaBiologia

Molecular

Bioquímica

Estrutural Física

57

Relação com Outras Disciplinas

Artigo indicado

Segue um artigo de revisão sobre cristalografia de proteínas:

Protein crystallography in drug discovery.

Canduri F, de Azevedo WF.

Curr Drug Targets. 2008 Dec;9(12):1048-53.

58

Material Adicional (Artigo Indicado)

Drenth, J. (1994). Principles of Protein X-ray Crystallography. New York: Springer-

Verlag.

Rhodes, G. (2000). Crystallography Made Crystal Clear. 2nd ed.San Diego: Academic

Press.

Stout, G. H. & Jensen, L. H. (1989). X-Ray Structure Determination. A Practical Guide.

2nd ed. New York: John Wiley & Sons.

59

Referências

Biofísica · O que podemos tirar qualitativamente desse experimento? O desvio da trajetória pode...

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