Biodistribuição de células mononucleares de medula óssea ...

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

FACULDADE DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE RADIOLOGIA

Biodistribuição de células mononucleares de medula óssea marcadas com tecnécio-99m após terapia celular

para o acidente vascular cerebral

Paulo Henrique Rosado de Castro

Tese submetida ao Corpo Docente da Faculdade de

Medicina da Universidade Federal do Rio de Janeiro,

como parte dos requisitos necessários à obtenção do

Grau de Doutor em Medicina (Radiologia). Área de

Concentração: Medicina Nuclear.

Orientadores: Profa Dra Lea Mirian Barbosa da Fonseca

Profa Dra Rosalia Mendez Otero

Rio de Janeiro

2013

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FICHA CATALOGRÁFICA

Rosado de Castro, Paulo Henrique Biodistribuição de células mononucleares de medula óssea marcadas com tecnécio-99m após terapia celular para o acidente vascular cerebral / Paulo Henrique Rosado de Castro. -- Rio de Janeiro: UFRJ / Faculdade de Medicina, 2013. xi, 95 f. : il. ; 31 cm. Orientadores: Lea Mirian Barbosa da Fonseca e Rosalia Mendez Otero Tese (doutorado) – UFRJ / Faculdade de Medicina / Radiologia, 2013. Referências bibliográficas: f. 54-71 1. Biodistribuição. 2. Células-tronco. 3. Tecnécio-99m. 4. Terapias celulares. 5. Acidente vascular cerebral. 6. Radiologia - Tese. I. Barbosa da Fonseca, Lea Mirian. II. Mendez Otero, Rosalia. III.Universidade Federal do Rio de Janeiro, Faculdade de Medicina, Radiologia. IV. Título.

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

FACULDADE DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE RADIOLOGIA

Biodistribuição de células mononucleares de medula óssea marcadas com tecnécio-99m após terapia celular

para o acidente vascular cerebral

Paulo Henrique Rosado de Castro

Orientadores: Profa Dra Lea Mirian Barbosa da Fonseca

Profa Dra Rosalia Mendez Otero

Banca Examinadora: Profa Dra Bianca Gutfilen

Profa Dra Maria Célia Resende Djahjah

Prof. Dr. Sergio Augusto Lopes de Souza

Prof. Dr. Gabriel Rodriguez de Freitas

Profa Dra Maria Carolina Pinheiro Pessoa Landesmann

Professores Suplentes: Prof. Dr. Antonio Carlos Pires Carvalho

Prof. Dr. Alysson Roncally Silva Carvalho

Rio de Janeiro

2013

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DEDICATÓRIA

À minha mãe, Marilda, pelo amor infinito, incentivo e

exemplo de fé, honestidade, alegria e dedicação à vida

profissional e à família.

À minha noiva, Evelyn, melhor companheira de estudos,

com quem tenho a felicidade de compartilhar a vida, pelo

amor, incentivo e compreensão.

Ao meu pai, José, pelo amor, apoio e exemplo de fé,

honestidade e bom humor.

Ao meu segundo pai, Raul, pelo carinho, compreensão e

exemplo de tranquilidade e resiliência.

Ao meu irmão, Pedro, meu melhor amigo e companheiro

nos momentos mais difíceis.

À minha madrinha, Patrícia, pelo carinho e exemplo de

dedicação aos pacientes e à Medicina.

Aos meus avós, em especial meu avô José (in

memoriam), pelo exemplo de esforço e integridade.

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AGRADECIMENTOS

Às minhas orientadoras e mentoras, Professoras Lea Mirian Barbosa da Fonseca

e Rosalia Mendez Otero, exemplos de profissionais íntegras e dedicadas pelas quais

tenho a mais profunda admiração e que despertaram o interesse que possuo hoje pela

Medicina Nuclear e Terapia Celular. Será eterna minha gratidão por todas as

oportunidades e ensinamentos não apenas técnicos, mas de vida, ao longo desses

anos.

Aos Professores Bianca Gutfilen, Sergio Augusto Lopes de Souza e Gabriel

Rodriguez de Freitas, cujo empenho e dedicação foram absolutamente essenciais desde

o planejamento inicial até o desenvolvimento e conclusão desta pesquisa. Agradeço

imensamente por todo o apoio, ensinamentos e estímulo.

Aos Professores Antonio Carlos Pires Carvalho, Maria Célia Resende Djahjah e

Maria Carolina Landesmann, pelos conselhos e incentivo desde a graduação a

pesquisar nos campos da Radiologia e Medicina Nuclear e pelas correções para a

qualificação desta Tese.

Ao Professor Alysson Roncally Carvalho, pela pronta aceitação em participar

desta banca e pelas correções para a qualificação desta Tese.

Aos Professores e Pesquisadores com os quais tive o privilégio de trabalhar e

cujo empenho foi fundamental para o desenvolvimento dos diferentes projetos ao longo

do Doutorado: Alane Ramos, Andreia de Vasconcelos dos Santos, Angelo Maiolino,

Charles Andre, Eduardo Wajnberg, Emerson Gasparetto, Felipe Schmidt, Leandro Vairo,

Louise Moraes, Maurício Friedrich, Pedro Brasil, Pedro Pimentel Coelho, Rafaella

Monteiro Silva, Regina Goldenberg, Roberto Coury Pedrosa, Ronaldo de Souza Leão

Lima, Sergio Salles Xavier, Soniza Leon, Taís Kasai-Brunswick e Valeria Battistella.

Às equipes do Laboratório de Marcação de Células e Moléculas e do Laboratório

de Neurobiologia Celular e Molecular, pelo auxílio na execução dos trabalhos e

colaborações.

Aos Professores Mario Fiorani, Juliana Soares e Ricardo Gattass e à equipe do

Laboratório de Fisiologia da Cognição, pelo primeiro estímulo à pesquisa na iniciação

científica.

À minha família e amigos, pelo apoio em todas as etapas da minha formação.

A Douglas, Aquemi, Lillian e Sue e às famílias Simabuguro e Chinem, pelo

carinho com que me acolheram.

À Coordenação do Curso de Pós Graduação em Radiologia, pela oportunidade e

suporte oferecidos desde o início do projeto.

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À equipe do Departamento de Radiologia da UFRJ, em especial Dalila e Lucia,

sempre dispostas a ajudar em todos os momentos.

Às equipes dos Serviços de Medicina Nuclear e Radiologia do HUCFF, que

possibilitaram a realização dos exames necessários para este trabalho.

Aos pacientes incluídos neste estudo e seus familiares, que nos motivam a

continuar pesquisando para melhorar o tratamento do AVC.

Às agências de fomento CAPES, CNPq e FAPERJ (Proc E-26/110.776/2010),

pelo financiamento a esta pesquisa.

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LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

ACA - artéria cerebral anterior

ACM - artéria cerebral média

AVC - acidente vascular cerebral

BHE - barreira hemato-encefálica

CMN - células mononucleares

CTM - células tronco mesenquimais

CTH - células tronco/progenitoras hematopoiéticas

CTN - células tronco/progenitoras neurais

ECD – etilenocisteína dietil éster

FDA - Food and Drug Administration (Agência de Administração de Alimentos e

Medicamentos dos Estados Unidos)

18F-FDG - fluordesoxiglicose marcada com flúor-18

G-CSF - granulocyte colony-stimulating factor (fator estimulador de colônias de

granulócitos)

111In - índio-111

iPS - induced pluripotent stem cells (células-tronco pluripotentes induzidas)

NIHSS - National Institutes of Health Stroke Scale (escala de AVC dos Institutos

Nacionais de Saúde dos Estados Unidos)

NT2N - neurônios derivados de uma linhagem celular de teratocarcinoma

humano

PET - positron emission tomography (tomografia por emissão de pósitrons)

RM - ressonância magnética

SDF-1 - stromal derived factor-1 (fator derivado do estroma-1)

SPECT - single photon emission computed tomography (tomografia por emissão

de fóton único)

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99mTc - tecnécio-99m

TC - tomografia computadorizada

tPA - tissue plasminogen activator (ativador do plasminogênio tecidual)

VEGF - vascular endothelial growth factor (fator de crescimento de endotélio

vascular)

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RESUMO

As terapias celulares, que foram desenvolvidas há mais de 40 anos para

aplicação em doenças malignas, vem sendo estudadas com resultados

promissores em diferentes enfermidades, incluindo o acidente vascular cerebral

(AVC). Os objetivos deste estudo foram avaliar a exequibilidade do

acompanhamento de células mononucleares (CMN) de medula óssea marcadas

com tecnécio-99m (99mTc) após injeção intra-arterial ou intravenosa em pacientes

com AVC isquêmico e analisar as diferenças na biodistribuição das células nos

dois grupos. Foram incluídos 12 pacientes neste estudo aberto, não-

randomizado, sendo 7 no grupo intra-arterial e 5 no grupo intravenoso. A terapia

celular foi realizada 19 a 89 dias após o AVC, e a dose de células injetadas

variou de 1 x 108 a 5 x 108. Foram realizadas cintilografias de corpo inteiro 2 e 24

horas e Tomografias por Emissão de Fóton Único (SPECT, do inglês Single

Photon Emission Computed Tomography) 2,5 horas após a terapia celular.

Foram aperfeiçoados métodos de quantificação para avaliação da captação nos

diferentes órgãos de interesse e realizadas fusões de imagens SPECT com as

de Tomografia Computadorizada (TC) ou Ressonância Magnética (RM). A

quantificação das imagens de corpo inteiro indicou que a via intra-arterial

resultou em maior captação no fígado e baço e menor captação nos pulmões em

comparação com a via intravenosa após 2 e 24 horas. Além disso, o grupo

intravenoso teve um aumento na porcentagem de captação no fígado e baço e

uma redução nos pulmões nas imagens de 24 horas em comparação com as

imagens de 2 horas. A quantificação das imagens SPECT 2,5 horas após a

terapia celular indicou que a injeção intra-arterial resultou em maior captação no

hemisfério ipsilateral do que a injeção intravenosa, com grande variação entre os

pacientes. Apesar das imagens SPECT com 2,5 horas demonstrarem maior

captação no hemisfério ipsilateral, a captação no cérebro em relação ao corpo

inteiro foi baixa e não apresentou diferença estatística entre os grupos. Em

conclusão, foi possível realizar o acompanhamento de CMN de medula óssea

marcadas com 99mTc até 24 horas após injeção intra-arterial ou intravenosa em

pacientes com AVC isquêmico.

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ABSTRACT

Cell therapies, developed more than 40 years ago for malignant diseases,

have been studied with promising results for different ailments, including stroke.

The objectives of this study were to evaluate the feasibility of tracking bone

marrow mononuclear cells labeled with Technetium-99m (99mTc) after intra-

arterial or intravenous injection in patients with ischemic stroke and analyze the

differences in the biodistribution of cells between both groups. Twelve patients

were included in this open, non-randomized study, 7 in the intra-arterial and 5 in

the intravenous group. Cell therapy was performed 19 to 89 days after the stroke

and the amount of cells varied from 1 x 108 to 5 x 108. Whole body scintigraphies

were performed at 2 and 24 hours and Single Photon Emission Computed

Tomographies (SPECT) were performed at 2,5 hours. The quantification methods

for evaluation of uptake in the different organs were improved and fusions of

images with Computed Tomography or Magnetic Resonance images. The

quantifications of whole body images indicated that the intra-arterial route

resulted in higher uptake in the liver and spleen and lower uptake in the lungs in

comparison with the intravenous injection after 2 and 24 hours. Furthermore, the

intravenous group had an increase in the percentage of uptake in the liver and

spleen and reduction in the lungs at 24 hours in comparison with 2-hour images.

The quantification of SPECT images 2,5 hours after cell therapy indicated that the

intra-arterial infusion resulted in higher uptake in the ipsilateral hemisphere in

comparison with the intravenous route, with great variation between patients.

Although SPECT images at 2,5 hours demonstrated higher uptake in the

ipsilateral hemisphere, the total uptake in the brain in comparison with the whole

body was low and didn`t have statistical difference between groups. In

conclusion, it was possible to track bone marrow mononuclear cells labeled with 99mTc up to 24 hours after intra-arterial or intravenous injections in patients with

ischemic stroke.

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SUMÁRIO

DEDICATÓRIA ................................................................................................................................. 4!AGRADECIMENTOS ........................................................................................................................ 5!LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS ..................................................................... 7!ABSTRACT ..................................................................................................................................... 10!SUMÁRIO ....................................................................................................................................... 11!1. INTRODUÇÃO E OBJETIVOS ..................................................................................................... 1!

1.1. Introdução .............................................................................................................................. 1!1.2. Objetivos ................................................................................................................................ 3!

2. REVISÃO DA LITERATURA ........................................................................................................ 4!2.1. O acidente vascular cerebral .................................................................................................. 4!

2.1.1. Penumbra isquêmica ............................................................................................................................................. 5!2.1.2. Abertura da barreira hemato-encefálica após o AVC ............................................................................................ 5!2.1.3. Avaliação neurológica do AVC .............................................................................................................................. 6!2.1.4. Tratamento do AVC ............................................................................................................................................... 6!2.1.5. Potencial regenerativo do cérebro ........................................................................................................................ 7!

2.2. As células-tronco .................................................................................................................... 8!2.2.1. Terapias celulares ................................................................................................................................................. 8!2.2.2. Marcação de células-tronco para imagem in vivo ................................................................................................. 9!

2.3. Terapias celulares para o AVC em modelos animais .......................................................... 11!2.3.1. Tipos celulares utilizados .................................................................................................................................... 11!

2.3.1.1. Células-tronco/progenitoras neurais ............................................................................................................ 11!2.3.1.2. Células-tronco/progenitoras não-neurais .................................................................................................... 13!

2.3.2. Mecanismos potenciais das terapias celulares para o AVC ............................................................................... 13!2.3.2.1. Células-tronco/progenitoras neurais ............................................................................................................ 13!2.3.2.2. Células-tronco/progenitoras não-neurais .................................................................................................... 15!

2.4. Estudos clínicos publicados em terapia celular para o AVC ................................................ 16!2.4.1. Ensaios com administração intracerebral ........................................................................................................... 19!

2.4.1.1. Neurônios derivados de teratocarcinoma humano ...................................................................................... 19!2.4.1.2. Células fetais porcinas ................................................................................................................................ 20!2.4.1.3. Células mononucleares de medula óssea autóloga .................................................................................... 20!

2.4.2. Ensaios com administração intratecal ................................................................................................................. 21!2.4.2.1. Células fetais humanas ............................................................................................................................... 21!2.4.2.2. Células mononucleares de medula óssea autóloga .................................................................................... 22!2.4.2.3. Células-tronco mesenquimais derivadas de cordão umbilical alogênico .................................................... 22!

2.4.3. Ensaios com administração intra-arterial ............................................................................................................ 22!2.4.3.1. Células mononucleares de medula óssea autóloga .................................................................................... 22!2.4.3.2. Células-tronco mesenquimais derivadas de cordão umbilical alogênico .................................................... 24!

2.4.4. Ensaios com administração intravenosa ............................................................................................................. 24!2.4.4.1. Células monunucleares de sangue de cordão umbilical alogênico ............................................................. 24!2.4.4.2. Células-tronco mesenquimais derivadas de medula óssea autóloga ......................................................... 25!2.4.4.3. Células mononucleares de medula óssea autóloga .................................................................................... 26!2.4.4.5. Células-tronco progenitoras hematopoiéticas CD34+ autólogas ................................................................ 27!

2.5. Estudos clínicos registrados em terapia celular para o AVC ............................................... 28!3. PACIENTES, MATERIAL E MÉTODO ....................................................................................... 31!

3.1. Pacientes .............................................................................................................................. 31!3.2. Aspirado da medula óssea e marcação com Tecnécio-99m ............................................... 32!3.3. Citometria de fluxo ............................................................................................................... 33!3.4. Terapia celular ...................................................................................................................... 33!3.5. Exames de imagem .............................................................................................................. 34!3.6. Avaliação neurológica .......................................................................................................... 35!3.7. Análise estatística ................................................................................................................ 35!

4. RESULTADOS ............................................................................................................................ 36!4.1. Características dos pacientes .............................................................................................. 36!4.2. Exames de imagem .............................................................................................................. 37!4.3. Avaliação neurológica .......................................................................................................... 43!

5. DISCUSSÃO ............................................................................................................................... 46!6. CONCLUSÕES ........................................................................................................................... 53!7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................................... 54!ANEXO 1 ......................................................................................................................................... 72!ANEXO 2 ......................................................................................................................................... 75!ANEXO 3 ......................................................................................................................................... 79!ANEXO 4 ......................................................................................................................................... 80!ANEXO 5 ......................................................................................................................................... 81!ANEXO 6 ......................................................................................................................................... 83

1

1. INTRODUÇÃO E OBJETIVOS

1.1. Introdução

O acidente vascular cerebral (AVC) é a segunda maior causa de

mortalidade no mundo depois das doenças isquêmicas do coração, sendo

responsável por aproximadamente 11,1% das mortes, segundo as últimas

estatísticas do Estudo sobre a Carga Global de Doenças de 2010 (do inglês

Global Burden of Disease Study 2010)113. Após um AVC, cerca de um quarto dos

pacientes vai a óbito dentro de um mês, e metade dentro de um ano49. Estima-se

que em 2005 ocorreram 16 milhões de novos AVCs e 5.7 milhões de mortes no

mundo168. Estes números devem aumentar para 23 milhões de novos AVCs e 7.8

milhões de mortes em 2030168. No Brasil, as doenças cerebrovasculares são a

maior causa de morte, a frente das doenças isquêmicas do coração, tendo o

número de mortes aumentado de 84.713, em 2000, para 99.732, em 2010124.

Atualmente, o ativador do plasminogênio tecidual (tPA, do inglês tissue

plasminogen activator) é o único agente farmacológico aprovado para o

tratamento do AVC agudo. Outras estratégias que podem ser utilizadas incluem a

administração de aspirina dentro de 48 horas do início do quadro, a

implementação de unidades especializadas para o tratamento de AVC e o uso da

descompressão hemisférica em pacientes jovens com AVC maligno no território

da artéria cerebral média (ACM) e edema cerebral. No entanto, diante das

limitações dos tratamentos atuais na redução da mortalidade e incapacidade

causados pelo AVC, há uma constante busca por novas terapias. A lesão

causada pelo AVC está praticamente completa depois de 24 a 48 horas, e

terapias neuroprotetoras que precisam ser administradas em janelas terapêuticas

de poucas horas são difíceis de aplicar na prática clínica78.

As terapias celulares, que foram desenvolvidas há mais de 40 anos para

aplicação em doenças malignas, vem sendo estudadas com resultados

promissores em diferentes enfermidades27, 96. Para o AVC, as terapias celulares

buscam aumentar mecanismos regenerativos como angiogênese, neurogênese e

sinaptogênese78, 120. As terapias celulares endógenas são aquelas que visam

estimular, por exemplo, a migração de células da medula óssea para a corrente

sanguínea, com agentes farmacológicos como o fator estimulador de colônias de

2

granulócitos (G-CSF, do inglês granulocyte colony-stimulating factor). As terapias

celulares exógenas envolvem a injeção de uma variedade de células para

produzir benefícios estruturais ou funcionais. Nesse sentido, tem sido

demonstrado que células de diferentes origens podem apresentar efeitos positivos

em modelos pré-clínicos de AVC agudo e crônico19, 120. Além disso, pequenos

ensaios clínicos foram realizados para estudar a segurança e possível eficácia da

terapia celular em pacientes com AVC, mas pouco se sabe sobre a migração e

biodistribuição destas células nos pacientes

Nesse cenário, as técnicas não-invasivas de imagem in vivo podem ser

utilizadas para aumentar o entendimento das diferentes vias de injeção existentes

e sua correlação com a avaliação funcional dos pacientes. A marcação com

radioisótopos é um método já estabelecido na prática clínica que permite o

monitoramento sistêmico de células no corpo. Uma de suas aplicações, a

cintilografia com leucócitos marcados, vem sendo utilizada há mais de 30 anos

para detecção de diferentes infecções, como por exemplo as pulmonares,

cardiovasculares e musculoesqueléticas139. A técnica desenvolvida por Gutfilen e

cols. para marcação de leucócitos mononucleares com tecnécio-99m (99mTc) e

cloreto estanoso permitiu também o estudo da migração destas células em

doenças inflamatórias como a Doença de Crohn e a Retocolite Ulcerativa, além

de processos infecciosos, com baixo custo e de forma reprodutível68, 69, 70, 164.

Posteriormente, esta técnica foi aplicada com sucesso na marcação de células de

medula óssea em terapias celulares para modelos experimentais de cirrose

hepática30, 144, silicose98, colite31 e AVC isquêmico173 e para pacientes com cirrose

hepática40 e miocardiopatia chagásica crônica10. O conhecimento acumulado

nestes trabalhos permitiu a aplicação desta técnica no presente estudo clínico de

terapia celular para pacientes com AVC isquêmico.

3

1.2. Objetivos

Objetivo principal

Avaliar a exequibilidade do acompanhamento da migração de células

mononucleares (CMN) de medula óssea marcadas com 99mTc após injeção intra-

arterial ou intravenosa em pacientes com AVC isquêmico.

Objetivos secundários

Desenvolver ou aperfeiçoar os métodos de quantificação e avaliar as

diferenças na biodistribuição das CMN nos grupos intra-arterial e intravenoso 2 e

24 horas após a injeção das células.

Analisar a viabilidade de protocolos de fusão das imagens SPECT com as

de tomografia computadorizada (TC) ou ressonância magnética (RM).

4

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1. O acidente vascular cerebral

Embora exista a previsão de leve queda nas taxas de mortalidade

específicas por idade entre 2005 e 2030, o envelhecimento da população mundial

irá resultar em um aumento no número de mortes para todas as idades de 89 por

100.000 em 2005 para 98 por 100.000 em 2030. Em 2005 estimou-se que 87%

das mortes por AVC ocorreram em países de média e baixa renda, e este número

aumenta para 94% se consideradas as mortes em pessoas abaixo de 70 anos. A

mortalidade deve aumentar mais rápido em países de baixa e média renda em

comparação com os de alta renda168. O AVC foi responsável por 102 milhões de

anos de vida perdidos por incapacidade em 2010, um aumento da quinta para a

terceira maior causa em 20 anos130. No mundo, os AVCs são responsáveis por 2

a 4% dos custos totais de saúde, enquanto nos países industrializados este valor

supera os 4%. Nos Estados Unidos, os custos para a sociedade em 2009 foram

estimados em 38.6 bilhões de dólares63. No entanto, a proporção de fundos de

pesquisa direcionados para AVC permanece muito pequena150.

Os AVCs hemorrágicos respondem por aproximadamente 20% dos casos

e seu mecanismo mais comum é a doença hipertensiva em pequenos vasos, que

causa pequenos aneurismas que se rompem subseqüentemente.

Aproximadamente 2/3 dos pacientes com hemorragia intracerebral primária são

hipertensos. Os outros pacientes podem apresentar malformações vasculares

intracranianas (angiomas cavernosos ou malformações arteriovenosas),

angiopatia amilóide cerebral ou infartos prévios com consequente hemorragia

secundária.

Os AVCs isquêmicos respondem por cerca de 80% dos casos. A

classificação TOAST (Trial of Org 10172 in Acute Stroke Treatment) divide os

mecanismos responsáveis pela oclusão vascular em: 1) aterosclerose de grandes

artérias; 2) cardioembolismo; 3) oclusão de pequenas artérias (lacunas); 4) AVC

de outras etiologias determinadas; 5) AVC de causa indeterminada49.

As fases do AVC podem ser divididas em aguda (dias), subaguda

(semanas) ou crônica (meses). Os eventos isquêmicos que duram menos de 24

5

horas são definidos como Ataque Isquêmico Transitório, porém esta distinção é

arbitrária e dano cerebral pode ser visto em RM em pelo menos 25% destes

pacientes90.

2.1.1. Penumbra isquêmica

Quando a oclusão de um vaso ocorre, um determinado volume de tecido

ao redor do centro isquêmico é afetado funcionalmente, porém não

estruturalmente57. Este tecido é conhecido como penumbra isquêmica e é alvo de

intervenções terapêuticas uma vez que sua recuperação está associada com

melhora neurológica49. O dano funcional com integridade estrutural pode ser

avaliado através de RM até 24 horas e através da Tomografia por Emissão de

Pósitron (PET, do inglês Positron Emission Tomography) até 48 horas após o

AVC118.

Na área de penumbra isquêmica, uma cascata de eventos neuroquímicos

começa com a depleção de energia, seguida pela perda da homeostase de íons,

liberação de glutamato, disfunção dos canais de cálcio, liberação de radicais

livres, rompimento da membrana, alterações inflamatórias e ativação de morte

celular por necrose e apoptose47.

2.1.2. Abertura da barreira hemato-encefálica após o AVC

A barreira hemato-encefálica (BHE) é uma barreira de permeabilidade

entre o sangue e o cérebro, onde as células endoteliais dos capilares cerebrais

formam junções de oclusão67. A isquemia cerebral leva à disfunção da BHE14, 46.

Em pacientes com AVC agudo, o aumento na permeabilidade da BHE

determinado por TC foi notado 12 horas após o início dos sintomas44. Foi

demonstrado que após uma oclusão da ACM em ratos ocorre aumento na

permeabilidade da BHE a partir de 3 horas este fenômeno pode persistir até 5

semanas14, 167. Em um estudo com RM, a disfunção na BHE foi evidenciada em

47 (33%) de 144 pacientes com AVC isquêmico179. A disfunção da BHE

apresentou associação com a transformação hemorrágica e pior desfecho

6

clínico179. Além disso, tanto a transformação hemorrágica quando a disfunção

precoce da BHE foram mais comuns em pacientes tratados com tPA179.

2.1.3. Avaliação neurológica do AVC

A aplicação de resultados de ensaios clínicos na prática médica requer a

interpretação e integração de medidas de desfecho. A escala dos Institutos

Nacionais de Saúde dos Estados Unidos (NIHSS, do inglês National Institutes of

Health Stroke Scale) consiste na avaliação de 15 itens e permite uma avaliação

quantitativa de componentes fundamentais do exame neurológico (anexo 2). A

escala NIHSS avalia o nível de consciência, os movimentos extraoculares, o

campo visual, o funcionamento da musculatura facial, a força nas extremidades,

sensibilidade, coordenação (ataxia), linguagem (afasia), discurso (disartria) e

negligência89. O Índice Barthel mede 10 aspectos básicos da atividade

relacionada ao auto-cuidado e mobilidade (anexo 3). A pontuação normal é de

100, e pontuações menores indicam maior grau de dependência89. A escala

modificada de Rankin é utilizada para avaliar o grau de incapacidade após o AVC

(anexo 4). Ela é dividida em 7 pontuações, sendo que 0 indica a ausência de

sintomas, 5 indica incapacidade grave e 6 indica morte89.

2.1.4. Tratamento do AVC

A trombólise com tPA tem importantes limitações, principalmente a curta

janela terapêutica de até 4,5h, o que limita seu uso a uma minoria (2 a 4%) dos

pacientes126. Além disso, o tPA previne a incapacidade em apenas 6 pacientes

para 1000 AVCs isquêmicos, e não reduz a mortalidade73. O pior efeito colateral

da trombólise é a possibilidade de hemorragia intracerebral sintomática, que

ocorre em 6 a 7% dos pacientes.

A administração de aspirina dentro de 48h do AVC reduz a mortalidade e

incapacidade em 9 pacientes por 1000 tratados, provavelmente por prevenção

secundária49.

7

O maior avanço no tratamento do AVC foi o tratamento dos pacientes em

unidades especializadas, que é efetiva e apropriada para todos os tipos de AVC.

O manejo dos pacientes nestas unidades reduz a mortalidade em 20% e melhora

o estado funcional em outros 20%. Ainda que os componentes precisos das

unidades ainda não estejam claros, a melhora do controle da pressão arterial, a

mobilização precoce e a aderência às melhores práticas clínicas foram

identificados como alguns dos componentes necessários. Foi demonstrado que

uma unidade de AVC pode prevenir morte ou incapacidade em 50 para 1000

AVCs49.

Além destas medidas, em pacientes jovens com AVC maligno no território

da ACM e edema cerebral, a descompressão hemisférica deve ser realizada. Isso

pode ocorrer 2 a 5 dias após o AVC em 1-10% dos pacientes com AVC

supratentorial49.

2.1.5. Potencial regenerativo do cérebro

Até recentemente, acreditava-se que as células do sistema nervoso central

eram incapazes de se regenerar. No entanto, durante a última década, evidências

da neurogênese no cérebro humano adulto foram demonstradas no giro dentado

do hipocampo e na zona subventricular em torno dos ventrículos laterais41, 52, 165.

Isto constituiu a base para que trabalhos experimentais investigassem a terapia

celular como potencial tratamento de doenças neurológicas, em particular o AVC.

Estudos recentes com pacientes que sofreram AVC isquêmico foram

capazes de demonstrar evidência de neurogênese na penumbra isquêmica, onde

as células se localizaram preferencialmente na proximidade dos vasos

sanguíneos86, 116, 123, 191. Estes resultados sugerem a ocorrência de neurogênese

compensatória induzida pelo AVC, que pode contribuir para a recuperação pós-

isquêmica, e representam, portanto, um alvo potencial para a terapia do AVC.

8

2.2. As células-tronco

As células-tronco podem ser definidas como células clonogênicas que têm

a capacidade de auto-renovação e diferenciação em múltiplas linhagens de

células180. As células-tronco estão presentes ao longo da vida, embora as

diferenças de potencial de diferenciação permitam sub-classificações.

As células-tronco totipotentes são capazes de dar origem a um organismo

inteiro e podem ser derivadas a partir de oócitos fertilizados e do zigoto até a fase

de oito células. As célula-tronco pluripotentes podem dar origem a todos os tipos

de tecidos, de qualquer uma das três camadas germinativas, mas ao contrário

das células totipotentes não podem dar origem a um organismo inteiro. As

células-tronco multipotentes são mais diferenciadas. Elas são capazes de se

diferenciar em vários tipos de células dentro de um sistema (por exemplo, do

sangue). Células-tronco oligopotentes e unipotentes tem diferenciação de

potencial mais restrito, sendo a primeira capaz de produzir mais do que um tipo

de célula (por exemplo, de células progenitoras mielóides), e a segunda capaz de

produzir apenas um tipo de célula madura180.

As células progenitoras são células geradas por células-tronco, que

passam a se diferenciar em células maduras (por exemplo, as células

progenitoras endoteliais). Ao contrário das células-tronco, que podem replicar por

tempo indeterminado, as células progenitoras só podem se dividir um número

limitado de vezes e, portanto, se encontram em uma posição intermediária entre

as células-tronco e células maduras totalmente diferenciadas180.

2.2.1. Terapias celulares

Embora as pesquisas com células-tronco tenham recebido muita atenção

recentemente, o primeiro transplante bem sucedido de células-tronco

hematopoéticas derivadas da medula óssea ocorreu no final dos anos 1960 e deu

ao seu autor, Donnall Thomas, o Prêmio Nobel de Medicina em 1990. O

transplante de células-tronco hematopoiéticas autólogas ou alogênicas é agora

um procedimento de rotina e é utilizado com sucesso clinicamente para o

tratamento de doenças tais como linfoma, mieloma múltiplo, leucemia,

9

neuroblastoma, tumores de células germinativas, certos tipos de anemias tais

como anemia falciforme ou anemia aplástica, transtornos auto-imunes como lúpus

eritematoso sistêmico, amiloidose e outras discrasias sanguíneas135. Em 2006,

foram realizados cerca de 50.000 transplantes de células-tronco hematopoiéticas

no mundo66.

Além de doenças malignas e auto-imunes, estudos experimentais e

ensaios clínicos com terapias celulares tem sido realizados em outras

enfermidades como as doenças cardíacas isquêmicas e doença arterial periférica.

Uma meta-análise de 50 estudos clínicos com terapias celulares para doenças

cardíacas isquêmicas agudas e crônicas, com um total de 2.625 pacientes

concluiu que o tratamento de células de medula óssea melhora a fração de

ejeção, volume diastólico final e volume sistólico final do ventrículo esquerdo e

reduz o tamanho do infarto84. Um estudo recente que investigou a injeção

transendocárdica de células de medula óssea autóloga ou alogênicas em 30

pacientes com cardiomiopatia isquêmica indicou melhora no remodelamento

ventricular, capacidade funcional e qualidade de vida, com 13 meses de

acompanhamento76. Já em relação à doença arterial periférica, uma meta-análise

de 37 estudos envolvendo injeção de células da medula óssea, sangue periférico

ou G-CSF indicou que as terapias celulares melhoraram significativamente os

índices de isquemia, como o índice tornozelo-braquial, tensão transcutânea de

oxigênio e ausência de dor a curta distância. Também houve melhora da

cicatrização da úlcera e redução do número de amputações53. Nenhum desses

benefícios ocorreu com o G-CSF.

2.2.2. Marcação de células-tronco para imagem in vivo

A marcação de células pode ser realizada através de radiofármacos para

detecção em Medicina Nuclear ou um contraste exógeno para ser detectado por

RM. A marcação celular com radioisótopos tem sido usada por décadas para

monitorar células sistemicamente em estudos de Medicina Nuclear como na

cintilografia com leucócitos marcados139, 149. A meia-vida de 6 horas do 99mTc é

uma importante vantagem sobre a fluordesoxiglicose marcada com flúor-18 (18F-

FDG), que possui meia-vida de 110 minutos. O índio-111 (111In), outro

10

radiofármaco que pode ser usado para marcação de células, permite estudos por

até 96 horas, porém resulta em imagens de pior resolução e acarreta alta dose

de radiação para o paciente e para as células transplantadas139. Vários relatórios

têm indicado danos celulares pela marcação com 111In24, 35, 61, 136. O 99mTc, por sua

vez, permite imagens por 24 horas e resulta em menor radiação para o paciente e

maior resolução espacial139.

Uma outra possibilidade de marcação de células é com nanopartículas de

ferro. As nanopartículas de óxido de ferro foram desenvolvidas inicialmente para

detecção de lesões hepáticas após injeção intravenosa e foram posteriormente

utilizadas para marcação de células. Em modelos pré-clínicos, a marcação de

células com nanopartículas permite o rastreamento por dias ou mesmo semanas

após terapias celulares, melhor resolução espacial e correlação anatômica26, 101.

Alguns ensaios clínicos com um pequeno número de pacientes realizaram a

marcação de diferentes tipos de células-tronco ou progenitoras28, 88, 190. No

entanto, a marcação de células com nanopartículas sofre de limitações comuns a

outros métodos de marcação exógena, como a diluição do meio de contraste com

a divisão celular e a possibilidade da transferência das nanopartículas para

macrófagos. Além disso, estudos recentes indicaram que nanopartículas podem

alterar eventos celulares56, 91, e estas técnicas de marcação não foram aprovadas

pela Agência de Administração de Alimentos e Medicamentos dos Estados

Unidos (FDA, do inglês Food and Drug Administration) ou pela Anvisa.

Outra abordagem para marcação de células in vivo é a transfecção de

genes repórteres para estudos de imagem por bioluminescência, medicina

nuclear ou RM. Esta abordagem é extremamente valiosa, uma vez que só revela

a atividade de células marcadas que sejam viáveis e metabolicamente ativas.

Além disso, a transfecção de células permite a expressão a longo prazo do gene

repórter, evitando o problema visto com contrastes exógenos que são diluídos

com a proliferação celular. A imagem por bioluminescência tem sido utilizada com

sucesso para investigar a distribuição de células marcadas até 30 dias após

terapias celulares em modelos animais de isquemia cerebral42, 141 . No entanto,

apesar da bioluminescência permanecer uma técnica extremamente importante

em estudos experimentais de terapias celulares, tem resolução espacial (2-3mm)

11

e profundidade de penetração limitadas (1 cm) e não pode ser utilizada na prática

clínica.

Do mesmo modo, em Medicina Nuclear, uma interação específica entre o

produto do gene repórter e uma sonda administrada pode ser usado para gerar

um sinal que pode ser detectado por Tomografias por Emissão de Fóton Único

(SPECT, do inglês Single Photon Emission Computed Tomography) e PET4 . Num

exemplo, um ensaio humano recente descreveu que células T transduzidas com

um vírus herpes simplex tipo 1 puderam ser detectadas no cérebro e em outras

partes do corpo, após infusão intracraniana em pacientes com glioma através de

PET182. A transfecção de genes também pode ser utilizada para facilitar a

absorção de ferro pelas células injetadas e, portanto, gerar um sinal que pode ser

distinguido em RM, dispensando a necessidade de agentes de contraste

exógenos60. Entretanto, mesmo sendo técnicas promissoras, novos estudos são

necessários para determinar a segurança do uso de vírus para transfecção e a

modificação do metabolismo do ferro intracelular.

2.3. Terapias celulares para o AVC em modelos animais

2.3.1. Tipos celulares utilizados

2.3.1.1. Células-tronco/progenitoras neurais

As células-tronco/progenitoras neurais (CTN) são células com capacidade

de auto-renovação e potencial de gerar neurônios e células da glia. As CTN

podem ser isoladas do cérebro fetal ou de um dos dois nichos neurogênicos que

persistem no cérebro adulto: a zona subventricular dos ventrículos laterais e a

zona subgranular giro dentado do hipocampo5, 95, 153. Apesar da evidência que as

CTN fetais transplantadas podem se integrar funcionalmente no cérebro de

pacientes com doença de Parkinson108, ainda há muitos obstáculos para o uso de

células destas duas fontes em ensaios clínicos para o AVC. Por exemplo, a

necessidade de múltiplos fetos para tratar um único paciente é de difícil

implementação em grandes ensaios clínicos, além de ser complexa do ponto de

vista ético. Além disso, o isolamento de CTN adultas para transplante autólogo

12

necessitaria de biópsias cerebrais e muitos dias em cultura para expansão e teria

outras limitações, porque são especializadas em gerar um número limitado de

subtipos neuronais, mesmo depois de uma isquemia cerebral110.

CTN também podem ser geradas de células pluripotentes, incluindo

células-tronco embrionárias (derivadas de blastocistos) e células-tronco

pluripotentes induzidas (iPS, do inglês induced pluripotent stem cells, obtidas por

reprogramação epigenética de células adultas através de uma combinação de

fatores de transcrição). Em todos esses casos, as CTN podem ser expandidas in

vitro, formando aglomerados de células chamados neuroesferas, compostas por

uma população heterogênea de células em proliferação, que podem ser induzidas

à diferenciação em diversos fenótipos de linhagens neuronais ou gliais. No

entanto, o uso clínico de CTN derivadas de embriões ainda está associado com o

risco de formação de teratomas, se células indiferenciadas persistirem em meio

às células transplantadas159. O transplante de CTN alogênicas também requer

imunossupressão, o que está associado com diversos efeitos colaterais.

CTN podem ser obtidas após reprogramação de células somáticas do

próprio paciente, permitindo um transplante autólogo. Ainda que um estudo

recente tenha alertado para a possibilidade de teratomas derivados de células iPS

desencadearem imunogenicidade em camundongos189, a resposta imune pode

não ocorrer quando células totalmente diferenciadas derivadas de células

embrionárias ou iPS são transplantadas3. A criação de bancos públicos de

linhagens celulares derivadas de células embrionárias ou iPS pode ser uma forma

mais prática de gerar estas células utilizando boas práticas de fabricação, no

tempo adequado para o transplante e, ao mesmo tempo, reduzir a

imunogenicidade das CTN54.

Outras potenciais fontes de células neurais para transplante são neurônios

e CTN induzidas gerados diretamente de fibroblastos ou outras células por uma

combinação de fatores de transcrição, sem ter que passar pelo estágio de iPS74,

115, 176. Neurônios derivados de teratocarcinomas humanos também já foram

usados em ensaios clínicos para AVC como será discutido posteriormente93, 94, 119,

131, 132.

13

2.3.1.2. Células-tronco/progenitoras não-neurais

Células-tronco mesenquimais (CTM) e células-tronco/progenitoras

hematopoiéticas (CTH) são os dois tipos não-neurais mais utilizados em estudos

pré-clínicos e clínicos para o AVC.

CTH podem ser isoladas da medula óssea ou do cordão umbilical, ou

podem ser mobilizadas para a corrente sanguínea através da administração de

agentes farmacológicos como o G-CSF. A maioria dos estudos em modelos

animais realizou o transplante da fração mononuclear de uma destas fontes, que

também contém outros tipos celulares incluindo monócitos e linfócitos, além de

CTM, CTH e progenitoras endoteliais142. Alternativamente, um grupo menor de

estudos transplantou CMN humanas CD34+, uma subpopulação enriquecida com

CTH e progenitoras endoteliais.

As CTM são multipotentes com a capacidade de gerar linhagens

osteogênicas, condrogênicas e adipogênicas. As CTM também podem ser

isoladas e expandidas em cultura a partir de diversos tecidos, incluindo a medula

óssea, tecido adiposo e cordão umbilical.

Apesar de um grupo de critérios mínimos definidos pela Sociedade

Internacional para Terapia Celular (International Society for Cellular Therapy) ser

usado para identificar as CTM, existem diferenças funcionais e fenotípicas entre

as CTM de diferentes fontes48, 188.

2.3.2. Mecanismos potenciais das terapias celulares para o AVC

2.3.2.1. Células-tronco/progenitoras neurais

CTN administradas por via intracerebral migram para o sítio de isquemia

cerebral72, onde elas sobrevivem por até dois meses e se diferenciam em

neurônios, astrócitos e oligodendrócitos funcionais43. Porém, a necessidade de

gerar diferentes subtipos de neurônios que devem emitir longos axônios e formar

as sinapses apropriadas ainda é um dos maiores desafios da medicina

regenerativa109, 112.

14

Além do potencial das CTN de substituir neurônios perdidos, estudos pré-

clínicos recentes observaram que parte dos efeitos terapêuticos das CTN no

cérebro isquêmico pode ser atribuída a mecanismos parácrinos, uma vez que

CTN secretam fatores neurotróficos e de crescimento in vitro2, 77, 114. Por exemplo,

foi demonstrado que o transplante de CTN aumenta a neovascularização e

melhora a integridade da BHE após o AVC através de um mecanismo dependente

de fator de crescimento de endotélio vascular (VEGF, do inglês vascular

endothelial growth factor)80. VEGF é também um dos principais fatores envolvidos

no papel modulatório do meio condicionado derivado de CTN na função da

microglia129. Da mesma forma, CTN permanecem em contato próximo com

células da microglia, mesmo quando injetadas no cérebro de animais controle72,

sugerindo que um mecanismo parecido pode ocorrer in vivo129.

De maneira interessante, o transplante de CTN contribui para a

recuperação funcional de animais com isquemia cerebral, independente da via de

injeção6, 71, 163. As CTN migram para o sítio de lesão, mesmo quando injetadas por

via intra-arterial, e este recrutamento é dependente de receptores de citocinas1, 71.

Por outro lado, o transplante intravenoso de CTN resulta apenas na migração

marginal das células para o cérebro lesionado e em um modelo de hemorragia

intracerebral, as CTN migram principalmente para o baço. Entretanto, o

tratamento resultou em redução da inflamação, formação de edema e apoptose

no cérebro. Como estes efeitos não foram observados em animais

esplenectomizados, os autores sugeriram que as CTN podem promover

neuroproteção pela modulação da resposta inflamatória do baço100.

Similarmente, apesar dos baixos níveis de migração e diferenciação

neuronal no cérebro isquêmico, as CTN adultas transplantadas demonstraram

efeitos neuroprotetores e anti-inflamatórios em um modelo animal de AVC6.

Em conjunto, estes estudos fornecem evidências que, além de substituição

neuronal, as CTN podem contribuir para a recuperação funcional após o AVC por

uma combinação de mecanismos, incluindo neuroproteção e imunomodulação. As

CTN podem também estimular mecanismos endógenos de plasticidade e

regeneração cerebral, aumentando a neurogênese no hipocampo140, estimulando

o reparo neurovascular80, resgatando o transporte axonal e induzindo a

plasticidade dendrítica e axonal2.

15

2.3.2.2. Células-tronco/progenitoras não-neurais

Embora tenha sido proposto que as CTH e CTM podem diferenciar-se em

células neuronais in vitro, os neurônios derivados de CTH ou CTM não disparam

potenciais de ação11, 151 e este fenômeno não foi reproduzido in vivo158, 171. Um

estudo estimou que apenas uma pequena fração (cerca de 0,02%) de CTH

derivadas de medula óssea injetadas por via intravenosa migraram para o cérebro

isquêmico, onde a maioria das células transplantadas adotou um fenótipo de

macrófago / microglia. Apesar disto, o transplante de CTH diminuiu a dimensão do

AVC e reduziu a inflamação no cérebro e baço dos animais tratados158. Além

disso, tem sido observado que as CTM se localizam apenas transitoriamente no

cérebro isquêmico após uma infusão intra-arterial125 e que as CMN de sangue de

cordão umbilical promovem recuperação funcional no modelo animal de AVC,

apesar da baixa migração celular21. Em resumo, as CTM e as CMN de medula

óssea ou cordão umbilical podem melhorar a função neurológica em vários

modelos de isquemia cerebral, através de uma combinação de efeitos, tais como

a neuroproteção, imunomodulação e estímulo da plasticidade neural7, 23, 37, 45, 62,

133, 137, 174, 175, 181, 185, e estes efeitos não são necessariamente devido à presença

das células no local da lesão. Além disso, o transplante de CTM e CTH pode

também induzir angiogênese e neurogênese no cérebro isquêmico9, 170, dois

processos que estão intimamente ligados por vários mecanismos de regulação64.

Estes mecanismos de ação parecem basear-se na secreção de fatores

neurotróficos e moléculas imunomoduladoras pelas células transplantadas107, 147,

um efeito que pode ainda ser modulado pelo microambiente hospedeiro. Deste

modo, a migração transitória das células transplantadas e as mudanças

dinâmicas que ocorrem no cérebro isquêmico durante o processo de reparação

sugerem que múltiplas injeções podem ser necessárias para otimizar a liberação

dos fatores apropriados pelas células injetadas 172. Além disso, a inflamação

sistêmica induzida pelo AVC também pode modular o fenótipo das populações de

CMN de medula óssea, melhorando a sua capacidade de induzir a recuperação

após a isquemia cerebral, quando as células são coletadas e transplantadas no

16

primeiro dia após o insulto184. Por isso, é necessário avaliar o melhor momento

para a coleta de células da medula óssea, no caso de transplante autólogo.

Por último, as células progenitoras endoteliais podem ser isoladas a partir

do sangue periférico ou do sangue do cordão umbilical e expandidas em cultura.

Estas células migram para o cérebro isquêmico através de um mecanismo

dependente de fator derivado do estroma-1 (SDF-1, do inglês stromal derived

factor-1), reduzindo o tamanho da lesão e melhorando o resultado neurológico em

camundongos55. A co-administração de células progenitoras derivadas do

endotélio e do músculo liso de células de sangue de cordão umbilical também

aumentam angiogênese e neurogênese em um modelo animal de AVC134. Assim,

estudos pré-clínicos que comparem a eficácia de células progenitoras endoteliais,

CTM, e CTH de diferentes fontes são necessários. Nesse sentido, tem sido

demonstrado que a administração intravenosa de CTM derivadas de medula

óssea promove um grau semelhante de recuperação funcional ao que é

observado após o transplante de CMN derivadas de medula óssea em um modelo

animal de AVC, quando a dose é ajustada para cada tipo celular45. Outro estudo

mostrou que não havia nenhuma diferença nos efeitos terapêuticos das CTM

derivadas de medula óssea ou de cordão umbilical em um modelo de isquemia

focal187.

2.4. Estudos clínicos publicados em terapia celular para o AVC

Encontramos 27 artigos no idioma inglês envolvendo 19 ensaios diferentes

de terapias celulares, com um total de 231 doentes tratados. Doze ensaios foram

para AVC isquêmico, 2 para hemorrágico e 5 para isquêmico ou hemorrágico

(Tabela 1). Seis ensaios realizaram transplantes intravenosos, 5 injetaram células

no parênquima, 5 utilizaram a via intra-arterial e 3 efetuaram administrações

intratecais (Tabela 1).

17

Tabela 1. Ensaios clínicos com resultados publicados

Referência do estudo/ País

Desenho do estudo

Via de injeção

Tipo celular Subtipo de AVC Variação de idade (média)

Tempo entre o AVC e terapia celular

No. de paciente tratados (no. de controles)

No. de células injetadas

Volume, taxa e velocidade de infusão

Seguimento

Kondziolka e cols., 200094 / Estados Unidos

Fase I, não randomizado, simples cego

IC Células NT2N

Isquêmico nos gânglios da base (8 casos) ou córtex e gânglios da base (4 cases)

44-75 7 a 55 meses (média 27 meses)

12 (sem controles)

2!106 (8 pacientes); 6!106 (4 pacientes)

Não especificado

52-60 meses

Rabinovich e cols., 2005146 / Rússia

Case series, não randomizado, aberto

IT Células fetais humanas

Hemorrágico (3 casos) na ACM e isquêmico (7 casos) na ACM ou ACM+ACA

35-56 4 a 24 meses (média 12,1 meses)

10 (10 controles históricos)

1 (5 pacientes) ou 2 (5 pacientes) injeções de 2!108

Não especificado

6 meses

Kondziolka e cols., 200593 / Estados Unidos

Fase II, randomizado, simples cego

IC Células NT2N

Isquêmico (9 casos) ou hemorrágico (9 casos) em gânglios da base

40-70 1 a 5 anos (média 3,5 anos)

14 (4 controles sem injeção)

5!106 (7 pacientes); 1!107 (7 pacientes)

Não especificado

18 a 29 meses

Savitz e cols., 2005155 / Estados Unidos

Fase I, não randomizado, aberto

IC Células fetais porcinas

Isquêmico em estriado 25-52 (média 39,8)

4 a 10 anos (média 4,9 anos)

5 (sem controles)

Até 5 injeções de 107

10 µL/min, 106 células/ µL

4 anos

Man e cols., 2006117 / China

Série de casos, não randomizado, aberto

IV CMN de sangue de cordão alogênico

Isquêmico (6 casos) ou hemorrágico (4 casos)

35- 75 (média 56)

3 meses a 7 anos (média 23.5 meses)

10 (sem controles)

6 infusões de " 1!108, 1 a 7 dias de intervalo

Não especificado

3 meses

Mendonça e cols., 2006121; Correa e cols., 200739 / Brasil

Relato de caso, fase I, não randomizado, aberto

IA CMN de medula óssea autóloga

Isquêmico de ACM 54 e 37 5 (1 paciente) and 9 dias (1 paciente)

2 (sem controles)

1!108 (1 paciente) e 3!107 (1 paciente)

3 mL in 10 min (primeiro paciente)

2-4 meses

Suárez-Monteagudo e cols., 2009169 / Cuba

Série de casos, não randomizado, aberto

IC CMN de medula óssea autóloga

Isquêmico ou hemorrágico no tálamo, gânglios da base ou córtex

41- 64 (média 51,4)

3 a 8 anos (média 5 anos)

5 (sem controles)

1,4!107 a 5,5!107 (média 3.4 !107)

8 injeções de 2,5 #L

1 (4 casos) e 5 anos (1 caso)

Lee e cols., 201099 (cont. de Bang e cols., 20058) / Coréia do Sul

Fase I/ II, randomizado, simples cego

IV CTM de medula óssea autóloga

Isquêmico de ACM Média 64 Injeções 19 a 37 dias (mediana 32,5 dias) e 2 semanas depois

16 (36 controles sem injeção)

5!107 (2 doses com 2 semanas de intervalo)

Não especificado

5 anos

Honmou e cols., 201179 / Japão


IV CTM de medula óssea autóloga

Isquêmico em substância cinzenta, branca ou lesões mistas

41- 73 (média 59,2)

36 a 133 dias (média 68 dias)

12 (sem controles)

0,6!108 a 1,6!108 (média 1,1!108)

Em 30 min; volume não especificado

12 meses

ACM, artéria cerebral média; ACA, artéria cerebral anterior; CMN, células mononucleares; CTM, células tronco mesenquimais; CTH, células tronco/progenitoras hematopoiéticas; IA, intra-arterial; IC, intracerebral; IT, intratecal; IV, intravenosa; NT2N, neurônios derivados de teratocarcinoma humano.

18

Tabela 1. Ensaios clínicos com resultados publicados (continuação)

Referência do estudo/ País

Desenho do estudo

Via de injeção

Tipo celular Subtipo de AVC Variação de idade (média)

Tempo entre o AVC e terapia celular

No. de paciente tratados (No. de controles)

No. de células injetadas

Volume, taxa e velocidade de infusão

Seguimento

Savitz e cols., 2011156 / Estados Unidos


IV CMN de medula óssea autóloga

Isquêmico de ACM Média 55 24 a 72 h 10 (79 controles históricos)

7!108/kg a 1!109/kg (média 9,6!108/kg)


6 meses

Han e cols., 201175 / Coréia do Sul

Não especificado IT CTM de cordão umbilical alogênico

Isquêmico na ponte, mesencéfalo e cerebelo

17 35 dias 1 (sem controles)

3,6!107 Não especificado

2 meses

Bhasin e cols., 201117, 201216, 201315 / India

Fase I, não randomizado, simples cego (RM)

IV CTM ou CMN de medula óssea autóloga

Isquêmico ou hemorrágico em ACM

Média 45 média 9,6 meses

20 (14 CMN de medula óssea; 6 CTM de medula óssea; 20 controles sem injeção)

5!107 a 6!107 250 mL em 3 h (1.4 mL/min)

6 meses

Friedrich e cols., 201259 / Brasil

Fase I/II, não randomizado, simples cego (TC)

IA CMN de medula óssea autólogas

Isquêmico de ACM 30-78 (média 63)


20 (sem controles)

5 ,1!107 a 6!108 (média 2,2!108)

15 mL em 30 min (0,5 mL/min)

6 meses

England e cols., 201251 / Reino Unido

Sub-grupo de Fase IIb, randomizado

IV CTH CD34+ autólogas

Isquêmico Não especificado for sub-grupo

3 a 30 dias 8 (6 G-CSF; 2 placebo;sem controles)

2!107 a 4,3!108

Não especificado

3 meses

Sharma e cols., 2012160 / Índia

Não especificado IT CMN de medula óssea autóloga

Hemorrágico em tálamo

69 1 ano 1 (sem controles)

5!107 Não especificado

Não especificado

Moniche e cols., 2012127 / Espanha

Fase I/II, não randomizado, simples cego

IA CMN de medula óssea autóloga

Isquêmico de ACM Média 66,9 5 a 9 dias (média 6,4 dias)

10 (10 controles )

média 1,6!108 0,5 a 1 mL/min; duração não especificada

6 meses

Prasad e cols., 2012143 / Índia


IV CMN de medula óssea autóloga

Isquêmico de ACM ou ACM+ACA

30-70 (média 51,5)


11 (sem controles)

1,9!108 a 1,9!109 (média 8!107)


12 meses

Li e cols., 2012106 / China

Fase I, não randomizado, simples cego

IC CMN de medula óssea autóloga

Hemorrágico em Gânglios da base

39-74 (média 56,3)

5 a 7 dias (média 5,9 dias)

60 (40 controles com salina)

2,5!108 a 2,3!109 (mediana 1,3!109)

3,5 mL; duração não especificada

6 meses

Jiang e cols., 201285 / China


IA CTM de cordão umbilical alogênico

Isquêmico (3 cases) ou hemorrágico (1 case) em ACM

40-59 (média 49)

11 a 50 dias (média 25,5)

4 (sem controles)

2!107 20 mL em 20 min (1 mL/min)

6 meses

ACM, artéria cerebral média; ACA, artéria cerebral anterior; CMN, células mononucleares; CTM, células tronco mesenquimais; CTH, células tronco/progenitoras hematopoiéticas; IA, intra-arterial; IC, intracerebral; IT, intratecal; IV, intravenosa; NT2N, neurônios derivados de teratocarcinoma humano.

19

2.4.1. Ensaios com administração intracerebral

2.4.1.1. Neurônios derivados de teratocarcinoma humano

Kondziolka e cols.94 realizaram o primeiro ensaio clínico de terapia celular

para AVC. O estudo envolveu o transplante de neurônios derivados de uma

linhagem celular de teratocarcinoma humano (NT2N). Este estudo de fase I, não-

randomizado, observador-cego incluiu 12 pacientes com AVC dos gânglios da

base e déficits motores fixos que ocorreram 6 meses a 6 anos antes do

transplante. Oito pacientes receberam um total de 2 milhões de células na área da

lesão, e os outros 4 pacientes receberam 6 milhões de células. Imunossupressão

com ciclosporina A foi iniciada uma semana antes da cirurgia e continuou durante

8 semanas. Um paciente teve uma única crise convulsiva generalizada 6 meses

após a cirurgia, e outro paciente teve um novo AVC distante da área do

transplante de células neuronais. No entanto, estas complicações não foram

avaliadas pelos autores como tendo relação com o transplante, e não foram

observados efeitos adversos nos 5 anos de seguimento. Sete de 11 exames PET

realizados 6 meses após a injeção das células mostraram um aumento na

absorção de 18F-FDG no local do implante, ao passo que com 12 meses este

número diminuiu para 3119. Os autores sugeriram que este achado poderia estar

relacionado com a viabilidade das células na área do AVC, ou, alternativamente, a

uma maior atividade metabólica devido a um processo inflamatório, embora

nenhuma modificação indicativa de inflamação tenha sido observada na RM. O

procedimento foi avaliado como seguro e viável, e a autópsia de um doente que

morreu de enfarte do miocárdio 27 meses após o transplante de células mostrou

que as células NT2N teriam sobrevivido no cérebro131.

Este estudo foi seguido por um estudo de fase II, randomizado, duplo-cego,

que incluiu 9 pacientes com AVC isquêmico e 9 com AVC hemorrágico 1-6 anos

antes, e com um déficit motor fixo que fosse estável durante pelo menos 2

meses93. Sete pacientes receberam 5 milhões de células e outros 7 pacientes 10

milhões de células, enquanto 4 pacientes serviram como grupo de controle não

cirúrgico. Todos os sujeitos participaram de um programa de reabilitação para

20

AVC. Um paciente sofreu uma crise convulsiva no dia após a cirurgia, e outro

apresentou drenagem de um hematoma subdural crônico assintomático um mês

após a cirurgia. Não houve melhora significativa nos desfechos primários, o

escore motor da Escala Européia de AVC (European Stroke Scale) ou Avaliação

de Fugl-Meyer, mas houve melhora no Teste da Ação da Extremidade Superior

(Action Research Arm Test) em comparação com os valores basais.

2.4.1.2. Células fetais porcinas

Savitz e cols.155 efetuaram o implante estereotáxico de células fetais

porcinas em 5 pacientes com AVCs dos gânglios da base. Não foram

administrados imunossupressores. Um paciente apresentou deterioração

transitória dos déficits motores 3 semanas após o implante de células e outro

paciente teve convulsões uma semana após a terapia. O estudo foi inicialmente

concebido para incluir 12 pacientes, mas a FDA terminou o mesmo em função de

preocupações com a segurança.

2.4.1.3. Células mononucleares de medula óssea autóloga

Suarez-Monteagudo e cols.169 realizaram um ensaio clínico com o

transplante intracerebral de CMN de medula óssea, que incluiu 3 pacientes com

AVC isquêmico no tálamo, estriado ou córtex, e 2 pacientes com AVC

hemorrágico no tálamo ou estriado, de 3 a 8 anos após a lesão. Um total de 1,4 x

107 a 5,5 x 107 CMN de medula óssea foram estereotaxicamente implantadas ao

longo de vários sítios de injeção em torno da lesão. Não houve efeitos adversos

importantes durante o seguimento de 1 ano. Os autores também relataram

melhora neurológica significativa após 12 meses, com uma redução no déficit

motor avaliado pela Escala de Ashworth para Espasticidade; capacidade funcional

aumentada avaliada pelo Índice de Barthel; e melhora na condição neurológica

avaliada pela Escala NIHSS e Escala Escandinava de AVC, e melhor equilíbrio e

locomoção, avaliada pela Escala Tinneti. O mesmo grupo25 relatou

posteriormente o seguimento neuropsicológico de 5 anos de um dos pacientes do

21

estudo anterior e avaliou que as alterações cognitivas positivas em funções

verbais e executivas foram mantidas e pareciam estar relacionadas com aumento

do fluxo sanguíneo para as áreas pré-frontais. No entanto, a ausência de

cegamento, a falta de um grupo controle e o pequeno tamanho da amostra não

permite conclusões definitivas em relação à eficácia.

No maior ensaio clínico até agora, Li e colegas106 descreveram um estudo

de fase I, não-randomizado, duplo-cego no qual 60 pacientes receberam uma

injeção intraparenquimatosa de CMN de medula óssea 5 a 7 dias após AVC

hemorrágico em gânglios da base, e 40 pacientes formaram o grupo controle.

Doses administradas variaram de 2,5 x 108-2,3 ! 109 células. Seis meses após o

transplante, a pontuação NIHSS nos pacientes tratados foi significativamente

menor do que no grupo controle, enquanto que as pontuações no Índice de

Barthel foram maiores. Além disso, houve melhora neurológica e funcional

significativa nos pacientes tratados com CMN de medula óssea (86,7% versus

42,5% no grupo controle, p = 0,001).

2.4.2. Ensaios com administração intratecal

2.4.2.1. Células fetais humanas

Rabinovich e cols.146 relataram uma série de casos, não-randomizados,

abertos, que incluiu três pacientes com AVC hemorrágico no território da ACM e 7

pacientes com AVC isquêmico no território da ACM, com ou sem envolvimento

adicional do território da artéria cerebral anterior (ACA). Injeções subaracnóides

de 2 ! 108 células fetais humanas foram feitas entre 4 e 24 meses após o início

da doença. As células foram obtidas a partir de fetos humanos após aborto

espontâneo ou induzido por prostaglandinas, e foram descritas como uma razão

de 10:1 de células nervosas para células hematopoiéticas hepáticas. Os autores

relataram que alguns pacientes tiveram febre e meningismo 48 h após o

transplante. Embora um grupo de controle retrospectivo de 11 pacientes tenha

sido descrito, os parâmetros de melhora não foram devidamente explicados, não

permitindo comparações entre os dois grupos. Além disso, o estudo não teve uma

caracterização detalhada do fenótipo das células transplantadas.

22


Sharma e cols.160 descreveram um relato de caso em que 5 ! 107 CMN de

medula óssea foram injetadas por via intratecal em um paciente 1 ano após um

AVC hemorrágico. Mesmo não havendo um grupo controle e com apenas 1

paciente incluído, os autores atribuíram melhorias na cognição, função motora, e

atividades da vida diária ao transplante de células e o período de

acompanhamento não foi especificado.

2.4.2.3. Células-tronco mesenquimais derivadas de cordão umbilical

alogênico

Han e cols.75 realizaram uma injeção intratecal de 3,6 ! 107 CTM de cordão

umbilical em um paciente 35 dias após dissecção da artéria basilar que causou

um infarto na ponte, mesencéfalo e cerebelo. Duas outras injeções foram

realizadas 15 e 41 dias após o primeiro tratamento. Embora as neuroimagens e o

acompanhamento tenham sido realizados em apenas um paciente e por apenas 2

meses, os autores concluíram sem fundamentos que a melhora dos sintomas

clínicos e uma recanalização da artéria basilar foram ajudadas pelo transplante de

células.

2.4.3. Ensaios com administração intra-arterial


Os primeiros relatos de estudos utilizando terapias com CMN de medula

óssea para o AVC foram publicados de 2005 a 200738, 39, 121 e faziam parte de um

estudo de fase I, não-randomizado, aberto. No primeiro relato de caso38, 121, uma

paciente de 54 anos foi tratada com injeção intra-arterial de 3 ! 107 CMN de

medula óssea 5 dias após um AVC isquêmico na ACM. O PET realizado 7 dias

após o transplante com CMN de medula óssea demonstrou metabolismo

23

aumentado no córtex parietal esquerdo, o que pode ter ocorrido na presença das

células transplantadas ou devido a processos inflamatórios locais. No segundo

relato de caso39 um paciente de 37 anos de idade recebeu 3 ! 107 CMN de

medula óssea 9 dias após um AVC isquêmico na ACM. Cerca de 1% das células

foram marcadas com 99mTc por incubação com hexametilpropilenoaminooxima e

injetadas com o restante das células. Imagens do corpo inteiro demonstraram

migração elevada para o hemisfério esquerdo, baço e fígado. O SPECT 8 h após

o transplante de células mostrou que a migração de células marcadas ocorreu

principalmente para o território do ramo anterior da ACM, enquanto o AVC era no

ramo posterior da ACM esquerda. Isso aconteceu provavelmente devido à

oclusão do ramo posterior. É importante notar que estes pacientes foram

transplantados nos primeiros 10 dias após o AVC, no período agudo. A

experiência obtida com este estudo permitiu a implementação do presente

protocolo em pacientes com AVC não-agudo. e o resultados clínicos dos

primeiros 6 pacientes do grupo intra-arterial indicaram a segurança e

exequibilidade da terapia celular nesta fase do AVC12, 13.

Em um estudo realizado por Friedrich e cols.59, 20 pacientes com AVC

isquêmico moderado a grave na ACM receberam CMN de medula óssea por via

intra-arterial entre 3 e 7 dias após o AVC. A dose injetada foi de 5 x 107 a 6 x 108

células. Não houve eventos adversos relacionados ao procedimento, e 8

pacientes (40%) apresentaram boa evolução clínica, definida como uma

pontuação na escala modificada de Rankin " 2 após 90 dias. Embora o nível de

mortalidade tenha sido inferior ao nível esperado para populações semelhantes,

não havia grupo controle, e os autores não puderam excluir a possibilidade de

que os bons resultados tenham ocorrido por acaso.

Moniche e cols.127 realizaram um estudo de fase I / II não-randomizado,

simples-cego, em que 10 doentes receberam uma injeção intra-arterial de CMN

de medula óssea 5-9 dias depois de um AVC isquêmico na ACM, com um grupo

controle de 10 pacientes. A dose média infundida foi de 1,6 ! 108 células. Dois

indivíduos que receberam CMN de medula óssea apresentaram convulsões

parciais isoladas 3 meses após o transplante, que foi considerado um evento

adverso grave. Em ambos os pacientes uma medicação anticonvulsivante foi

iniciada, sem crises recorrentes. Não ocorreram outros eventos adversos graves

24

durante os 6 meses de seguimento. Não houve melhora significativa na avaliação

neurológica, em comparação com o grupo controle. Mesmo não tendo ocorrido

associação entre melhora neurológica e o número de CMN de medula óssea

injetadas, os autores relataram uma tendência à melhora um mês após a terapia,

principalmente no Índice de Barthel, quando uma quantidade maior de células

CD34+ foi injetada. Além disso, concentrações mais elevadas de fator de

crescimento do nervo foram observadas no soro de pacientes tratados 8 dias

após o transplante de células.

2.4.3.2. Células-tronco mesenquimais derivadas de cordão umbilical

alogênico

Jiang e cols.85 incluíram 3 pacientes com AVC isquêmico e 1 com AVC

hemorrágico da ACM. Uma dose de 2 ! 107 CTM derivadas de cordão umbilical

alogênico foram injetadas na ACM 11-50 dias após o início da doença. Não foi

realizada imunossupressão e o acompanhamento neurológico não foi claramente

definido, sendo a pontuação na escala modificada de Rankin a única escala

neurológica analisada. Nenhum AVC novo, febre ou morte foram observados

durante os 6 meses de seguimento. Os autores relataram que 2 dos pacientes

isquêmicos demonstraram melhora nos escores da Escala Modificada de Rankin,

enquanto não houve melhora nos outros 2 pacientes. Os autores interpretaram

esses achados como uma indicação de que as células-tronco melhoraram a

função neurológica após o AVC isquêmico, mas não depois de AVC hemorrágico.

No entanto, o pequeno número de pacientes e a ausência de um grupo controle

não permitem tal conclusão acerca da eficácia da abordagem.

2.4.4. Ensaios com administração intravenosa

2.4.4.1. Células monunucleares de sangue de cordão umbilical alogênico

Man e cols.117 incluíram 6 pacientes com isquemia e 4 com AVC

hemorrágico que ocorreram 3 a 7 anos antes do transplante, em um ensaio clínico

utilizando infusão intravenosa de CMN de sangue de cordão umbilical humano

25

alogênico. Cada paciente recebeu 6 infusões de # 1 ! 108 células, de 1 a 7 dias

de intervalo. Drogas imunossupressoras não foram utilizadas, e não houve

eventos adversos relacionados às células durante os 3 meses de seguimento. Os

pacientes tiveram uma melhora significativa no déficit neurológico, pela Avaliação

de Fugl-Meyer e Índice de Barthel, mas não havia grupo controle para

comparação.

2.4.4.2. Células-tronco mesenquimais derivadas de medula óssea autóloga

Bang e cols.8 descreveram o primeiro ensaio com CTM de medula óssea

autóloga. No primeiro relatório deste estudo de fase I/II, randomizado e

controlado, 30 pacientes foram prospectivamente e aleatoriamente alocados no

sétimo dia de internação após o AVC. Cinco pacientes receberam duas injeções

intravenosas de 5 ! 107 células, após expansão em cultura em soro bovino fetal,

de 4 a 5 e de 7 a 9 semanas após o AVC isquêmico em ACM. Vinte e cinco

pacientes serviram como controle, e todos os pacientes foram submetidos a

terapia de reabilitação. Em 1 ano de acompanhamento, não houve efeitos

adversos relacionados ao transplante e houve uma tendência não significativa

para melhora do Índice de Barthel e da Escala Modificada de Rankin. Mais tarde,

o mesmo grupo99 incluiu um número maior de pacientes no mesmo protocolo de

tratamento, com 5 anos de acompanhamento. Dezesseis pacientes foram

tratados e 36 doentes serviram como controles. Nenhum efeito colateral

significativo foi observado durante o acompanhamento, e eventos como

convulsões e AVCs recorrentes foram semelhantes entre os grupos. Verificou-se

uma diminuição na Escala Modificada de Rankin dos pacientes tratados em

comparação com o grupo controle. Também foi notado que a recuperação

neurológica em pacientes tratados estava relacionada com o grau de

envolvimento da zona subventricular do ventrículo lateral e com os níveis

plasmáticos de SDF-1.

Em outro estudo, Honmou e cols.79 incluíram 12 pacientes com isquemia

de substância cinzenta, branca, e lesões mistas em um ensaio não-randomizado

e aberto para analisar os efeitos das CTM de medula óssea autóloga expandidas

em soro humano, sem um grupo de controle. Eles verificaram que a expansão

26

das células no soro humano foi maior do que no soro bovino fetal, o que reduziu o

tempo de preparação das células. Além disso, salientaram que a utilização de

soro humano reduziu o perigo de transmissão de doenças tais como encefalopatia

espongiforme bovina. CTM de medula óssea foram infundidas 36-133 dias após o

infarto cerebral. Não foram observados efeitos secundários relacionados com as

células. As análises indicaram que o volume médio da lesão avaliada por RM

diminuiu em 20% ou mais 1 semana após a terapia celular. Além disso, a taxa

média diária de mudança na NIHSS aumentou na primeira semana após o

transplante de células, e houve tendência à correlação com a diminuição do

volume da lesão.

Bhasin e cols.17 conduziram um estudo de Fase I, não-randomizado,

simples-cego (para interpretação de imagens funcionais), onde 6 pacientes com

AVC isquêmico ou hemorrágico de ACM variando de 7 a 12 meses antes foram

incluídos, enquanto 6 pacientes serviram como grupo controle. Após cultura das

células durante 3 semanas, em meio isento de soro animal (Stem Pro SFM), uma

injeção intravenosa de CTM de medula óssea autóloga foi administrada. Não

houve eventos adversos relacionados às células durante os 6 meses de

acompanhamento. Embora tenha havido uma melhora na Escala de Fugl-Meyer e

Índice de Barthel modificado aos 2 e 6 meses, não foram observadas diferenças

estatisticamente significativas entre o grupo tratado e o grupo controle. Também

não houve diferença estatística na análise de RM funcional entre o pacientes

tratados e o grupo controle.


Savitz e cols.156 relataram os resultados de um estudo no qual 10 pacientes

receberam uma infusão intravenosa de 7 ! 106/kg a 1 ! 107/kg CMN de medula

óssea 24 a 72 horas após acidentes vasculares cerebrais isquêmicos em ACM.

Dois pacientes foram submetidos a hemicraniectomia após o transplante das

células, devido a expansão do AVC entre a inscrição no protocolo e a coleta de

medula óssea. Um doente morreu de embolia pulmonar, 40 dias após a terapia

celular, o que foi considerado como não relacionado com o procedimento. Não

houve eventos adversos graves relacionados com o estudo.

27

Prasad e cols.143 realizaram um estudo de Fase I, não-randomizado,

aberto, onde 11 pacientes receberam uma infusão intravenosa de CMN de

medula óssea entre 8 e 29 dias após AVC em ACM com ou sem lesão em ACA.

Não houve grupo de controle e a dose injetada foi de 1,9 x 108-1,9 ! 109 células.

Nenhum evento adverso grave foi observado durante o estudo. Sete pacientes

tiveram uma evolução clínica favorável, definida como escala modificada de

Rankin " 2 ou pontuação do Índice de Barthel de 75 a 100 seis meses após o

transplante de células.

Após um primeiro relato de casos sobre o transplante de CTM de medula

óssea para 6 pacientes com AVC isquêmico ou hemorrágico de ACM17, Bhasin e

cols. descreveram o transplante intravenoso de CMN de medula óssea para 12

pacientes, entre 3 e 14 meses após um AVC isquêmico em ACM 16. Doze

pacientes serviram como controles. Melhora estatisticamente significativa foi vista

no Índice de Barthel modificado em 6 meses. O mesmo grupo publicou também

um estudo onde analisou em conjunto os 6 pacientes tratados com CTM de

medula óssea com 14 pacientes tratados com CMN de medula óssea e seus

respectivos grupos controles15. Neste estudo, eles também encontraram melhora

estatisticamente significativa no Índice de Barthel modificado dos pacientes

tratados com CMN de medula óssea em relação aos controles 6 meses após a

terapia. Nenhuma diferença estatística foi encontrada entre os grupos CMN de

medula óssea e CTM de medula óssea. Não se observaram reações adversas em

qualquer dos grupos, durante o seguimento.

2.4.4.5. Células-tronco progenitoras hematopoiéticas CD34+ autólogas

England e cols.51 publicaram um estudo em que 40 pacientes foram

incluídos 3 a 30 dias depois de um AVC isquêmico ou hemorrágico, para receber

injeções subcutâneas de G-CSF uma vez por dia durante 5 dias, e 20 doentes

foram tratados com placebo. Oito pacientes (6 do grupo G-CSF e 2 do grupo

placebo) com AVCs isquêmicos concordaram em participar num sub-estudo e, no

6o dia após a injeção de G-CSF foram submetidos a coleta de sangue periférico

com separação imunomagnética subsequente de células CD34+ com anticorpos

contendo nanopartículas de óxido de ferro revestidas com dextran. Estas CTH de

28

sangue periférico foram injetadas por via intravenosa. Devido à marcação com

nanopartículas, foi possível realizar o rastreamento das células por RM. Os

pacientes do grupo G-CSF receberam 5,0 x 105-4,3 x 106 CTH de sangue

periférico, enquanto o grupo placebo recebeu 2-7 ! 104 células. Hipodensidade

consistente com deposição de ferro na região do AVC foi observada em um

paciente tratado com G-CSF, após 10 e 90 dias.

2.5. Estudos clínicos registrados em terapia celular para o AVC

Uma pesquisa no registro de ensaios clínicos do National Institutes of

Health (http://www.clinicaltrials.gov) indicou 25 estudos concluídos (mas não

publicados) ou em curso, com previsão de incluir 1.046 pacientes (Tabela 2).

Destes, uma administração exclusivamente intravenosa, intracerebral ou intra-

arterial foi escolhida por 13, 7 e 3 estudos, respectivamente, enquanto um estudo

optou pelas vias intravenosa e intratecal, e outro pelas vias intravenosa ou intra-

arterial. A maioria dos estudos está sendo conduzida nos Estados Unidos e na

China, e 16 dos 25 estudos foram iniciados em 2011 e 2012.

29

Tabela 2. Ensaios clínicos registrados no site Clinicaltrials.gov

No de registro / País

Via de injeção

Desenho do estudo Tipo celular Tipo de AVC Idade Tempo entre AVC e terapia

No de tratados (controles)

No de células injetadas

Início Estágio atual

NCT00950521 / Taiwan

IC Fase II, randomizado, aberto

CTHs autólogas Isquêmico na ACM 35-70 6 - 60 meses 15 (15 controles)

2!106 a 8!106 06/2009 Completo

NCT01151124/ Reino Unido

IC Fase I, não randomizado, aberto

CTN alogênicas (CTX0E03)

Isquêmico (substância branca subcortical ou gânglios da base)

60-85 6 meses–5 anos

12 (sem controles)

4 grupos: 2, 5, 10 ou 20!106

06/2010 Recrutando

NCT01287936 / Estados Unidos

IC Fase I/IIA, não randomizado, aberto

SB623 (CTM de medula óssea alogênica modificadas)

Isquêmico na ACM ou lenticuloestriadas

18-75 6 - 36 meses 18 (sem controles)

3 grupos: 2.5, 5 ou 10!106

01/2011 Recrutando

NCT01327768 / Taiwan

IC Fase I, randomizado, simpes-cego

Células-tronco olfativas autólogas

Isquêmico na ACM 35-70 6 - 60 meses 6 (sem controles)

2!106 a 8!106 01/2011 Recrutando

NCT01438593 / China


CMN de sangue de cordão alogênico

Isquêmico na ACM 35-75 6 - 60 meses 6 (sem controles)

5!106 01/2013 Não recrutando

NCT01673932 / China

IC Fase I, randomizado, aberto

CMN de sangue de cordão alogênico

Isquêmico na ACM 35-65 6 - 60 meses 12 (no de controles não especificado)

1!107± a 4!107 10/2012 Não recrutando

NCT01714167 / China


CTM de medula óssea autóloga

Isquêmico ou hemorrágico 40-70 3 - 60 meses 30 (no de controles não especificado)

2!106 a 4!106 06/2012 Recrutando

NCT00535197 / Reino Unido

IA Fase I/II, não randomizado, aberto

CMN de medula óssea autóloga

Isquêmico na ACM 30-80 7 dias 10 (sem controles)

Não especificado

09/2007 Recrutando


IA Fase II, randomizado, duplo-cego

ALD-401 (separadas de medula óssea autóloga)

Isquêmico na ACM 30-83 13 - 19 dias 60 (40 controles)

Não especificado

03/2011 Recrutando

NCT01518231 / China

IA Fase I, randomizado, aberto

CTHs autólogas Isquêmico 40-70 < 1 ano 20 (20 controles)

4!106 01/2012 Recrutando


IV Fase I/IIa, não randomizado, aberto


Isquêmico 18-83 24 – 72 h 30 (no de controles não especificado)

Não especificado

01/2009 Não recrutando

NCT00875654 / França

IV Fase I/IIa, randomizado, aberto


Isquêmico 18-65 <6 semanas 30 (no de controles não especificado)

Não especificado

08/2010 Recrutando


IV Fase I, randomizado, duplo-cego

CMN ou CTM de medula óssea autóloga

Isquêmico supratentorial 18-85 4 dias (CMN de medula óssea) 23 dias (CTM)

33 (no de controles não especificado)

Não especificado


NCT01028794 / Japão

IV Fase I/II, não randomizado, aberto


Isquêmico 20-75 7-10 dias 12 (no de controles não especificado)

Não especificado

05/2008 Recrutando

ACM, artéria cerebral média; ACA, artéria cerebral anterior; CMN, células mononucleares; CTM, células tronco mesenquimais; CTH, células tronco/progenitoras hematopoiéticas; CTN, células tronco/progenitoras neurais; IA, intra-arterial; IC, intracerebral; IT, intratecal; IV, intravenosa; NT2N, neurônios derivados de teratocarcinoma humano

30

Tabela 2. Ensaios clínicos registrados no site Clinicaltrials.gov (continuação)

No de registo / País

Via de injeção

Desenho do estudo

Tipo celular Tipo de AVC Idade Tempo entre AVC e terapia

No de tratados (controles)

No de células injetadas

Início Estágio atual

NCT01091701 / Malásia

IV Fase I/II, randomizado, duplo-cego

CTM alogênicas Isquêmico 20-80 <10 dias 78 (no de controles não especificado)

4!106/kg 12/2011 Não recrutando


IV Fase I/II, não randomizado, aberto

CTM de medula óssea alogênica

Isquêmico >18 >6 meses 35 (no de controles não especificado)

0.5!106/kg a 1.5!106/kg

02/2011 Recrutando


IV Fase IIa, randomizado, duplo-cego

PDA001 (derivadas de placenta humana)

Isquêmico na ACM

18-80 Agudo (não especificado)

34 (10 controles)

2!108 a 8!108; 1-2 injeções


NCT01389453 / China

IVe IT Fase II/ não randomizado, aberto

CTM de cordão umbilical alogênico

Isquêmico ou hemorrágico

40-65 IV, 7–21 dias; IT, 1 semana após IV

100 (20 controles)

Não especificado

04/2011 Recrutando


IV Fase II, randomizado, duplo-cego

MultiStem® (fonte não especificada)

Isquêmico cortical

18-79 24-48 h 140 (no de controles não especificado)

Não especificado

10/2011 Recrutando

NCT01453829 / México

IV ou IA Fase I/II, não randomizado, aberto

CTM autólogas derivadas de tecido adiposo

Isquêmico ou hemorrágico

18-80 Não especificado 10 (sem controles)

Não especificado

05/2011 Recrutando

NCT01461720 / Malásia

IV Fase II, randomizado, aberto


Isquêmico 30-70 1 - 8 semanas 50 (no de controles não especificado)

Não especificado

03/2011 Recrutando

NCT01468064 / China

IV Fase I/II, randomizado, duplo-cego

CTM de medula óssea autóloga; células progenitoras endoteliais

Isquêmico na ACM

18-80 5 semanas 90 (no de controles não especificado)

2.5!106/kg 11/2011 Recrutando

NCT01501773 / Índia

IV Fase II, randomizado, aberto


Isquêmico na ACM ou ACA

18-70 Não especificado 60 (60 controles)

3!107 a 5!108 10/2008 Completo

NCT01678534 / Bolívia

IV Fase IIa, randomizado, duplo-cego

CTM alogênicas derivadas de adipócitos

Isquêmico na ACM

60-80 < 14 dias 20 (no de controles não especificado)

1!106/kg 10/2012 Recrutando

NCT1716418, Coreia do Sul

IV Fase III, randomizado, aberto


Isquêmico na ACM

30-75 < 90 dias 60 (no de controles não especificado)

Não especificado

11/2012 Recrutando

ACM, artéria cerebral média; ACA, artéria cerebral anterior; CMN, células mononucleares; CTM, células tronco mesenquimais; CTH, células tronco/progenitoras hematopoiéticas; CTN, células tronco/progenitoras neurais; IA, intra-arterial; IC, intracerebral; IT, intratecal; IV, intravenosa; NT2N, neurônios derivados de teratocarcinoma humano

31

3. PACIENTES, MATERIAL E MÉTODO

3.1. Pacientes

Este ensaio clínico Fase I, aberto e não-randomizado foi aprovado pelo Comitê

de Ética em Pesquisa do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho (CEP no

169/03) e pela Comissão Nacional de Ética em Pesquisa (Protocolo de Pesquisa

no 10385 - CONEP) sob o título “Terapia celular pelo transplante autólogo de

células-tronco de medula óssea em pacientes com AVC isquêmico”. O estudo

também foi registrado no Portal Clinicaltrials.gov sob o número NCT00473057.

Todos os pacientes assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

(anexos 5 e 6). Os pacientes foram incluídos se apresentassem os seguintes

critérios:

a) Idade entre 18 e 75 anos;

b) AVC isquêmico acometendo o território da ACM, com até 90 dias de

evolução;

c) Exame de neuroimagem com sinais de infarto cerebral envolvendo o

território da ACM;

d) Doppler transcraniano evidenciando patência do vaso relacionado à área

isquêmica,

e) Pontuação na escala NIHSS entre 4 e 20;

f) Assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido; no caso de

incapacidade do paciente assinar o Termo de Consentimento (ex. afasia,

diminuição do nível de consciência), a assinatura foi realizada por seu

representante legal.

Os pacientes foram excluídos se apresentassem as seguintes características:

a) Piora na escala NIHSS em 4 ou mais pontos, no período de 24 horas,

atribuíveis a edema e/ou hemorragia cerebral;

b) Sepse;

c) Neoplasias malignas;

32

d) Desordens auto-imunes,

e) Doenças neurodegenerativas;

f) Insuficiência cardíaca aguda ou descompensada;

g) Doenças hematológicas primárias;

h) Osteopatias com aumento de risco à punção medular;

i) Coagulopatias;

j) Insuficiência hepática;

k) Insuficiência renal moderada (creatinina acima de 2 mg/dl);

l) Dependência de suporte orgânico, como circulatório ou ventilatório;

m) Gravidez;

n) Participação em outro ensaio clínico.

3.2. Aspirado da medula óssea e marcação com Tecnécio-99m

O aspirado da crista ilíaca posterior da medula óssea (80 mL) foi realizado

sob anestesia local em centro cirúrgico. As CMN foram isoladas por gradiente de

densidade Ficoll a 400 x g por 30 minutos (Ficoll-Hypaque Plus 1.077, 1:2,

Amersham Biosciences, São Paulo, Brasil). As CMN foram lavadas em solução

salina contendo 5% de seroalbumina humana e passadas através de um filtro de

100 !m para remover agregados celulares. Após lavagem, contagem e testes de

viabilidade celular, as células foram ressuspendidas em 10 mL de solução salina

com 5% de soro autólogo. Para cada paciente, 2 x 107 células foram marcadas

com 99mTc de acordo com protocolos publicados previamente 30, 69, 70, 111, 144.

Todos os procedimentos para separação e marcação celular foram realizados em

capela de fluxo laminar. Para marcação das células, 500 µl de solução estéril de

SnCl2 foram adicionadas à suspensão de células em solução salina, e a mistura

foi incubada em temperatura ambiente por 10 minutos. Então, 45 mCi de 99mTc

foram adicionados e a incubação continuou por mais 10 minutos. Após

centrifugação (500 x g por 5 minutos), o sobrenadante foi removido e as células

foram lavadas novamente em solução salina. O precipitado foi ressuspendido em

33

solução salina. A viabilidade das células foi avaliada pelo teste de exclusão vital

com azul de tripan, e foi estimada como superior a 93% em todos os casos. A

eficiência de marcação foi calculada através da atividade no precipitado dividida

pela soma da radioatividade no precipitado mais o sobrenadante, e foi estimada

como sendo maior que 90% em todos os casos.

3.3. Citometria de fluxo

As CMN isol+adas foram caracterizadas por análise por citometria de fluxo

de antígenos de superfície específicos. As células foram incubadas por 20

minutos a temperatura ambiente com anticorpo primário conjugados com

isotiocianato de fluoresceína, ficoeritrina, aloficocianina e proteína peridinina-

clorofila. Após a marcação, os eritrócitos foram lisados com solução tampão de

lise B&D. A aquisição dos dados foi realizada em um citômetro BD FACS CANTO

(Becton Dickinson, Heidelberg, Alemanha) e analisada com um software “Paint-a-

Gate”.

3.4. Terapia celular

As células marcadas foram adicionadas ao restante da suspensão de CMN

(volume final de 10 mL). No grupo intra-arterial, punções de artéria femoral foram

realizadas utilizando um cateter guia 6F (Envoy®, Cordis, Miami, Florida ou

Guider Softip®, Boston Scientific, Fremont, Califórnia). Uma injeção intravenosa

de heparina foi utilizada para obter anticoagulação com tempo de coagulação de

2 a 3 vezes o normal. Uma angiografia cerebral digital (Angiostar®, Siemens

Medical Systems, Erlangen, Alemanha) foi realizada para possibilitar a

visualização da vasculatura intracraniana antes da infusão e para o

monitoramento da normalidade do fluxo e patência vascular. Um micro cateter (SL

1018®, Boston Scientific, Fremont, Califórnia) foi então posicionado na porção M1

da ACM. No grupo intravenoso, as células foram administradas na veia cubital

mediana. Em ambos os grupos a injeção foi realizada na velocidade de 1 mL por

minuto.

34

3.5. Exames de imagem

Imagens cintilográficas foram realizadas em uma gama câmera Millenium

GE de duas cabeças com colimador de alta resolução e baixa energia (General

Electric Medical Systems, Milwaukee, Wisconsin). Imagens foram adquiridas 2 e

24 horas após a terapia celular, com o paciente em posição supina. Imagens de

corpo inteiro foram adquiridas por 20 minutos nas projeções anterior e posterior.

Imagens planares da cabeça foram adquiridas por 10 minutos, em matriz de

256x256 em projeções laterais esquerda e direita, anterior e posterior. Imagens

SPECT foram feitas com 2,5 horas através da rotação dos 2 detectores

posicionados a 180°. O software e hardware usados para reconstrução das

imagens SPECT foram o da estação de processamento Xeleris-GE. Cada

detector rodava 180o para completar 360o em órbita circular, e as projeções foram

adquiridas em 24 minutos. O algoritmo de Maximização de Expectativa de

Subconjunto (OSEM, do inglês Ordered Subset Expectation Maximization) foi

usado para reconstruir as imagens volumétricas com suavização axial e filtro

Butterworth com ordem de 5 e corte de 0.45. Imagens volumétricas eram

compostas de voxels de 64 x 64 x 64 com 4.38 mm3 cada. A distância para o

detector variava de 14 cm a 20 cm durante a rotação, o que resultou em uma

resolução espacial full width at half-max de aproximadamente 12 mm. Não foi

possível obter imagens SPECT para todos os pacientes no tempo de 24 horas

devido ao baixo número de contagens.

Regiões de interesse foram desenhadas para o cérebro, fígado, pulmões,

baço, rins e para o corpo inteiro, e as contagens radioativas foram

automaticamente quantificadas para essas regiões nas imagens planares

anteriores e posteriores do corpo inteiro 2 e 24 horas após a infusão das células.

A média geométrica das projeções anterior e posterior foi calculada para obter o

número de contagens por órgão. Nas imagens SPECT de 2,5 horas, regiões de

interesse correspondendo aos hemisférios direito e esquerdo foram selecionadas

e as contagens radioativas automaticamente quantificadas. As migrações para os

hemisférios ipsi e contralateral à lesão foram definidas como a porcentagem das

contagens originadas do hemisfério analisado em comparação com o total de

contagens nos dois hemisférios.

35

TC ou RM foram realizadas antes dos procedimentos e com 7, 30, 90 e

180 dias. As TC foram realizadas em um aparelho de 40 detectores (Brilliance-40,

Philips Medical Systems, Cleveland, Ohio). As RM foram realizadas em um

aparelho de 1.5T (Magnetom Avanto, Siemens, Erlangen, Alemanha). As imagens

de SPECT, TC e RM foram exportadas por protocolo de comunicação de imagens

digitais em medicina (DICOM, do inglês Digital Imaging Communications in

Medicine) e a fusão de SPECT/CT ou SPECT/RM foi realizada em um software

dedicado de processamento de imagens (Leonardo, Siemens, Erlangen,

Alemanha).

Além das imagens de TC e RM, foram realizadas também na admissão e

180 dias após a terapia celular cintilografias para avaliação da perfusão cerebral

com etilenodicisteína dietil éster marcado com 99mTc (ECD-99mTc).

3.6. Avaliação neurológica

Todos os pacientes foram avaliados por um neurologista na admissão, no

dia do transplante de células e com 1, 7, 30, 60, 90, 120 e 180 dias após a injeção

das células, aplicando a escala NIHSS, o Índice de Barthel e a Escala Modificada

de Rankin. Análises laboratoriais (hemograma completo e análises bioquímicas

da úreia, creatinina e eletrólitos) também foram feitas nos mesmo momentos. Um

eletroencefalograma foi realizado dentro de 7 dias da terapia celular e em

qualquer momento que houvesse piora do estado neurológico.

3.7. Análise estatística

A análise foi principalmente descritiva. O teste Ranksum foi usado para

comparar diferentes variáveis entre os grupos intra-arterial e intravenoso (idade,

NIHSS na admissão, volume da lesão, tempo do AVC até a injeção, número de

células injetadas e migração para os diferentes órgãos com 2 e 24 horas). Os p

valores abaixo de 0.05 foram considerados estatisticamente significativos. O

software R foi usado para a análise dos dados 145.

36

4. RESULTADOS

4.1. Características dos pacientes

Doze pacientes foram incluídos no estudo, sendo 7 no grupo intra-arterial e

5 no grupo intravenoso. As características dos pacientes estão listadas na Tabela

3. A terapia celular ocorreu 19 a 89 dias após o AVC, e a dose de células

injetadas variou de 1 x 108 a 5 x 108. A fração mononuclear continha uma

mediana de 1,33% CTH, 0,02% CTM e 0,01% células progenitoras endoteliais.

Tabela 3. Características dos pacientes

Paciente Gên. Hemisf. do AVC

Fator de

risco

Subtipo de AVC

(TOAST) Idadeee NIHSS

admissão

Volume de lesão

(cc)

Tempo do AVC à terapia (dias)

No de

CMN (x108)

IA 1 M E FOP Cardioemb. 24 7 116 67 5,00

IA 2 M D DM, HAS

Grande artéria 65 9 47 82 1,25

IA 3 M E HAS Outro* 47 4 17 62 3,90

IA 4 M E DM, FA Cardioemb. 65 13 71 72 4,00

IA 5 M D HAS Grande artéria 57 9 181 59 3,20

IA 6 M D DM, HAS

Grande artéria 47 13 213 73 1,00

IA 7 M D DM, HAS Criptogênico 60 12 2 19 1,30

IV 1 M E DM, HAS Cardioemb. 63 19 162 89 3,00

IV 2 M E HAS Cardioemb. 63 16 106 89 5,00

IV 3 M D HAS Criptogênico 68 11 95 39 1,40

IV 4 F D NDN Criptogênico 39 15 144 20 1,50

IV 5 F E HAS, DM Cardioemb. 57 11 39 25 5,00

Grupo IA 57 (47-62,5)

9 (8-12,5)

71 (32-148,5)

67 (60,5-72,5)

3,2 (1,3-4)

Grupo IV 63 (57-63)

15 (11-16)

106 (95-144)

39 (25-89)

3 (1,5-5)

Ambos os grupos 58,5

(47-63,5) 11,5

(9-13,5) 100,5

(45-148,5) 64,5

(35,5-75,2) 3,1

(1,4-4,2)

p valor 0,567 0,073 0,745 1 0,513

Resultados expressos como mediana (IQR). O teste Ranksum foi usado para comparar os grupos intra-arterial e intravenoso. Gên: Gênero; Hemisf: Hemisfério; Cardioemb: Cardioembólico; FA: Fibrilação atrial; CMN: células mononucleares; DM: Diabetes Mellitus; F: Feminino; IQR: Intervalo interquartil; IA: Intra-arterial; IV: Intravenoso; M: Masculino; E: Esquerda, D: Direita; Outro*: Durante clipping de aneurisma; FOP: Forame oval patente.

37

4.2. Exames de imagem

A quantificação das imagens de corpo inteiro 2 e 24 horas após a terapia

celular indicou que a via intra-arterial resultou em maior migração para o fígado e

baço e menor migração para os pulmões em comparação com a via intravenosa

(Tabelas 4, 5 e 6). Além disso, o grupo intravenoso teve um aumento na

porcentagem de biodistribuição no fígado e baço e uma redução nos pulmões nas

imagens de 24 horas em comparação com as imagens de 2 horas (Tabelas 4, 5 e

6).

Tabela 4. Quantificação da captação em diferentes regiões 2 horas após a terapia celular IA1 IA2 IA3 IA4 IA5 IA6 IA7 IV1 IV2 IV3 IV4 IV5

Captação nas imagens de corpo inteiro (%)

Cérebro/ Corpo inteiro 5,2 0,8 0,6 0,8 0,4 0,8 1,1 0,7 0,9 0,7 0,8 1,1

Fígado/ Corpo inteiro 29,1 40,7 48,4 40,6 48,9 35,8 25,7 13,5 14,0 11,6 13,4 15,3

Baço/ Corpo inteiro 13,0 6,0 5,8 6,5 5,7 5,5 4,1 2,3 2,2 1,6 2,0 1,7

Pulmões/ Corpo inteiro 8,2 7,1 6,6 7,3 6,5 6,8 9,7 21,2 20,9 14,6 21,1 18,2

Rins/ Corpo inteiro 3,2 4,6 5,0 2,5 4,2 9,3 4,2 3,9 2,8 3,3 7,2 1,9

Captação nas imagens SPECT (%)

Hemisfério Ipsilateral/ Cérebro 97,0 54,2 79,4 68,1 57,9 77,0 65,1 50,5 53,1 53,4 60,5 56,5

Tabela 5. Quantificação da captação em diferentes regiões 24 horas após a terapia

celular IA1 IA2 IA3 IA4 IA5 IA6 IA7 IV1 IV2 IV3 IV4 IV5


Cérebro/ Corpo inteiro 2,2 0,6 0,5 0,4 0,3 0,8 1,0 0,8 1,0 1,1 0,9 0,7

Fígado/ Corpo inteiro 38,7 42,4 54,7 47,5 53,2 46,9 27,5 17,3 18,5 13,7 22,9 26,3

Baço/ Corpo inteiro 15,5 5,7 8,1 7,4 6,5 5,1 4,7 3,4 1,9 3,2 3,4 3,2

Pulmões/ Corpo inteiro 4,0 4,2 3,3 4,9 4,3 4,4 5,1 7,9 6,6 7,8 8,6 6,0

Rins/ Corpo inteiro 6,6 9,8 7,3 6,4 7,6 10,3 10,5 7,9 7,0 6,9 7,0 4,8

38

Tabela 6. Comparação entre a captação em diferentes regiões 2 e 24 horas após a

terapia celular

2 h 24 h

IA IV p valor IA IV p valor


Cérebro/ Corpo inteiro 0,8 (0,7-1) 0,8 (0,7-0,9) 1 0,6 (0,4-0,9) 0,9 (0,8-1) 0,254

Fígado/ Corpo inteiro 40,6 (32,5-44,5)

13,5 (13,4-14)

0,006 46,9 (40,5-50,4)

18,5 (17,3-22,9)

0,006

Baço/ Corpo inteiro 5,8 (5,6-6,2) 2 (1,7-2,2) 0,006 6,5 (5,4-7,8) 3,2 (3,2-3,4) 0,006

Pulmões/ Corpo inteiro 7,1 (6,7-7,8) 20,9 (18,2-21,1)

0,006 4,3 (4,1-4,7) 7,8 (6,6-7,9) 0,006

Rins/ Corpo inteiro 4,2 (3,7-4,8) 3,2 (2,8-3,9) 0,329 7,6 (6,9-10,1)

7 (6,9-7) 0,255

Captação nas imagens SPECT (%)

Hemisfério Ipsilateral/ Cérebro 68,1 (61,5-78,2)

53,4 (53,1-56,5)

0,023 NA NA NA

Resultados expressos como mediana (IQR). O teste Ranksum foi usado para comparar os grupos intra-arterial (IA) e intravenoso (IV). NA: não aplicável–não foi possível obter imagens SPECT para todos os pacientes com 24h devido ao baixo número de contagens neste momento.

As Figuras 1 e 2 mostram imagens planares da cabeça representativas de

pacientes dos grupos intra-arterial e intravenoso, respectivamente. As Figuras 3 e

4 mostram imagens de corpo inteiro representativas de pacientes dos grupos

intra-arterial e intravenoso, respectivamente.

A quantificação das imagens SPECT 2,5 horas após a injeção indicou que

a injeção intra-arterial resultou em maior migração para o hemisfério ipsilateral do

que a injeção intravenosa. No entanto, houve grande variação dos valores no

grupo intra-arterial, de 97% do total no cérebro no paciente de maior migração

(IA1) e 54% no paciente de menor migração (IA2). Já nos pacientes do grupo

intravenoso, foi de 60,5% do total no cérebro na paciente de maior migração e

50,5% no paciente de menor migração. As Figuras 5 e 6 demonstram

cintilografias de perfusão cerebral com ECD-99mTc e com CMN de medula óssea

marcadas com 99mTc do paciente IA1, respectivamente.

39

Figura 1. Imagens planares

da cabeça do paciente IA3

nas projeções anterior e

lateral esquerda 2 horas (A

e B, respectivamente) e 24

horas (C e D,

respectivamente) após a

terapia celular. Foi possível

observar migração focal das

células para o hemisfério

esquerdo, onde ocorreu a

lesão isquêmica.

Figura 2. Imagens planares

da cabeça do paciente IV3

nas projeções anterior e

lateral esquerda 2 horas (A

e B, respectivamente) e 24

horas (C e D,

respectivamente) após a

terapia celular. Não foi

possível distinguir área de

migração significativa para o

hemisfério direito, onde

ocorreu o AVC.

C DB

A B

C DB

A B

C DB

40

Figura 3. Imagens do corpo inteiro do

paciente IA5 na projeção anterior 2

horas (A) e 24 horas (B) após a terapia

celular. Não ocorreu migração

significativa para o hemisfério direito,

onde houve a lesão. No entanto, foi

possível observar biodistribuição intensa

para fígado e baço com 2 e 24 horas. A

migração das células após 2 horas foi

menor para o pulmão e sofreu grande

redução nas imagens de 24 horas.

Figura 4. Imagens do corpo inteiro do

paciente IV5 na projeção anterior 2

horas (A) e 24 horas (B) após a terapia

celular. Não foi possível individualizar

migração das células para o hemisfério

esquerdo, onde aconteceu o AVC.

Porém, houve intensa migração para os

pulmões com 2 horas, que diminuiu de

forma significativa nas imagens de 24

horas. A migração para o fígado e baço,

apesar de menor que a pulmonar com 2

horas, sofreu aumento na porcentagem

comparada com o corpo inteiro após 24

horas.

A B

A B

41

Figura 5. Cortes transversais (A),

sagitais (B) e coronais (C) da SPECT

de perfusão cerebral com ECD-99mTc

do paciente IA2 antes da terapia

celular. As imagens indicam área

extensa de hipocaptação do

radiotraçador no hemisfério esquerdo,

onde ocorreu o AVC.

Figura 6: Cortes transversais (A),

sagitais (B) e coronais (C) do SPECT

2 horas após a injeção de CMN de

medula óssea marcadas com 99mTc do

paciente IA1. As imagens indicam a

migração do radiotraçador no

hemisfério esquerdo, onde houve a

lesão isquêmica.

A

BC

CCC

A

BC

CCC

42

As Figuras 7 e 8 demonstram fusões de SPECT/RM representativas de pacientes

dos grupos intra-arterial e intravenoso, respectivamente. A Figura 9 mostra uma

fusão SPECT/CT de um paciente representativo do grupo intra-arterial.

Figura 5. Cortes transversais de

imagens SPECT (A), RM (B) e

fusão SPECT/RM (C) do paciente

IA2. Observou-se migração das

células marcadas para o hemisfério

direito, onde ocorreu a lesão

visualizada na RM.


imagens SPECT (A), RM (B) e

fusão SPECT/RM (C) do paciente

IV2. Não foi possível notar

biodistribuição significativa para o

hemisfério esquerdo, onde houve o

infarto.

A

BC

CCC

A

BC

C

43


imagens SPECT (A), CT (B) e

fusão SPECT/CT (C) do paciente

IA6. Observou-se migração das

células marcadas para o

hemisfério direito, onde ocorreu a

lesão visualizada na RM.

Apesar das imagens SPECT com 2,5 horas demonstrarem maior migração

para o hemisfério ipsilateral, a migração para o cérebro em relação ao corpo

inteiro foi baixa e não apresentou diferença estatística entre os grupos. Com

exceção do paciente IA1, que apresentou biodistribuição no cérebro de 5,2% do

total para o corpo inteiro com 2 horas e 2,2 % com 24 horas, todos os pacientes

apresentaram biodistribuição no cérebro menores ou iguais a 1,1% do total para o

corpo inteiro com 2 e 24 horas (Tabelas 4 e 5).

4.3. Avaliação neurológica

Não houve alterações hemodinâmicas ou clínicas significativas durante a

injeção das células. Não houve óbitos ou recorrência do AVC nos 6 meses de

acompanhamento. No entanto, 2 pacientes do grupo intra-arterial e 5 pacientes do

grupo intravenoso tiveram convulsões que foram controladas com medicação

antiepilética. Uma paciente (IV5) apresentou piora neurológica depois de sofrer

uma convulsão parcial com generalização secundária 111 dias após a terapia

A

BC

CCC

44

celular. A paciente apresentava um NIHSS de 11 que havia reduzido para 3 com

90 dias porém, após a convulsão, retornou para 11 com 120 dias e depois reduziu

para 8 com 180 dias (Figura 10). As escalas NIHSS e modificada de Rankin e o

Índice de Barthel podem ser encontrados nas Tabelas 7, 8 e 9.

Figura 10. Evolução neurológica de acordo com o NIHSS para os grupos intra-

arterial e intravenoso.

Tabela 7. Escala NIHSS

Paciente 1 dia 7 dias 30 dias 60 dias 90 dias 120 dias 180 dias

IA 1

7 5 5 4 4 4 4

IA 2

9 8 6 6 6 6 6

IA 3

4 3 3 3 3 3 3

IA 4

13 12 11 9 10 10 10

IA 5

9 5 3 4 4 1 1

IA 6

13 12 12 12 12 11 11

IA 7

12 12 12 12 11 11 8

IV 1

19 19 15 16 15 15 14

IV 2

16 16 16 14 14 12 11

IV 3

11 11 11 9 9 9 9

IV 4

15 16 9 9 5 4 5

IV 5

11 11 8 4 3 11 8

45

Tabela 8. Índice de Barthel


IA 1

100 100 100 100 100 100 100

IA 2

35 35 50 55 65 75 80

IA 3

95 95 100 100 100 100 100

IA 4

25 25 25 30 35 35 35

IA 5

30 30 50 90 90 100 100

IA 6

10 15 25 30 30 50 50

IA 7

40 40 40 40 40 40 40

IV 1

45 45 70 70 70 70 70

IV 2

10 10 10 35 50 65 65

IV 3

35 70 90 85 85 85 85

IV 4

40 45 70 80 85 85 85

IV 5

35 40 70 75 80 75 80

Tabela 9. Escala Modificada de Rankin


IA 1

2 2 1 1 1 1 1

IA 2

4 4 4 4 3 3 3

IA 3

1 1 1 1 1 1 1

IA 4

5 5 4 4 4 4 4

IA 5

4 4 3 1 1 0 0

IA 6

5 5 5 5 5 3 3

IA 7

4 4 4 4 4 4 4

IV 1

4 4 4 3 3 3 3

IV 2

4 4 4 4 3 3 3

IV 3

4 4 3 2 2 2 3

IV 4

4 4 4 3 3 3 3

IV 5

4 4 3 3 3 3 3

46

5. DISCUSSÃO

Diferentes modelos animais de AVC sugeriram que há melhora funcional

e/ou estrutural após injeção intravenosa, intra-arterial ou intracerebral de

diferentes tipos celulares32, 34, 36, 45, 62, 87, 104, 105. Uma vantagem importante das

células de medula óssea utilizadas no presente estudo é a existência de grande

quantidade de dados de segurança de estudos clínicos com estas mesmas

células em doenças malignas e não-malignas27, 148. Estudos pré-clínicos

mostraram que elas aumentam a recuperação após isquemia cerebral aguda,

subaguda ou crônica, mas não está claro quais tipos celulares são responsáveis

por este efeito, uma vez que a melhora funcional foi relatada com diferentes

células19, 120.

Embora os resultados clínicos com outras doenças isquêmicas e estudos

pré-clínicos até o momento sejam encorajadores, ainda há muitas perguntas

sobre os possíveis mecanismos de ação das células e sobre o protocolo de

tratamento ideal. Um dos principais pontos é qual o tipo celular mais adequado.

Uma recente meta-análise de 117 estudos pré-clínicos de AVC indicou que, para

efeitos estruturais, as células-tronco autólogas foram mais eficazes do que as

células alogênicas, enquanto, para efeitos funcionais, as células alogênicas foram

mais eficazes102. Curiosamente, os autores não encontraram diferença entre

células embrionárias e adultas alogênicas tanto para os resultados estruturais ou

funcionais. Isto reforçaria o uso de células adultas, uma vez que seriam evitadas

as preocupações de ordem ética associadas com as células embrionárias ou

fetais. Além disso, células da medula óssea podem ser colhidas a partir do

paciente para terapia autóloga, evitando a necessidade de agentes

imunossupressores19, 78.

De modo a aperfeiçoar as terapias celulares futuras para o AVC, é

necessário elucidar os mecanismos moleculares que controlam a interação das

células enxertadas com o cérebro isquêmico. A isquemia cerebral é

imediatamente seguida por uma disfunção microvascular, estresse oxidativo,

ruptura da BHE e excitotoxicidade. Estes eventos são acompanhados pela

liberação de sinais endógenos para o meio extracelular, pela ativação do sistema

imune inato e pela infiltração de leucócitos do sangue para o cérebro81. Neste

cenário, a interação das células transplantadas com o tecido isquêmico é mediada

47

por uma vasta gama de receptores, tais como receptores toll-like, receptores de

adenosina e receptores de quimiocinas, que são ativadas após a exposição a

mediadores inflamatórios liberados durante as fases aguda / subaguda do AVC.

Foi demonstrado que vários receptores de quimiocinas estão envolvidos no

recrutamento de CTM de medula óssea e CTN para o cérebro isquêmico82, 178.

Assim, o ambiente pós-isquêmico pode afetar a função das células-

tronco/progenitoras, o que por sua vez, pode modular a resposta inflamatória do

micro-ambiente local, como discutido acima. Embora tenha sido demonstrado que

CTN e células neuroepiteliais derivadas de iPS humanas podem dar origem a

neurônios funcionais quando transplantadas 48 horas após isquemia cerebral em

ratos122, 138, pouco se sabe ainda sobre como o ambiente pós-isquêmico afeta a

sobrevivência, a proliferação e a diferenciação das CTN transplantadas. Em um

estudo interessante, por exemplo, o pré-condicionamento com interleucina-6

aumentou a sobrevivência de CTN transplantadas na zona de penumbra

isquêmica 6 horas após a lesão152, sugerindo que manipulações farmacológicas

ou genéticas podem ser usadas para melhorar a eficácia de terapias celulares.

Quanto ao momento do transplante, a maioria dos estudos experimentais

realizou o transplante celular nos primeiros 3 dias após a isquemia cerebral. Isto

já representaria um grande avanço no tratamento do AVC porque aumentaria a

janela terapêutica de 4,5 horas necessária para a trombólise com tPA. Além da

fase aguda, os estudos pré-clínicos têm demonstrado que a terapia celular

aumenta a recuperação funcional após o AVC subagudo e crônico 19. Entretanto,

poucos estudos compararam janelas de tempo diferentes, com resultados

divergentes de acordo com o modelo e tipo de célula estudado. Num modelo

animal de isquemia focal, de Vasconcelos dos Santos e cols.45 encontraram uma

melhora significativa no teste de cilindro após a injeção intravenosa de CTM de

medula óssea 1 dia ou de CMN de medula óssea 1 ou 7 dias após a isquemia. No

entanto, a melhora não ocorreu quando os animais foram tratados 30 dias após a

lesão. Em um modelo de oclusão da ACM, Yang e cols.183 descreveram melhora

nos testes de cilindro se a injeção fosse realizada entre 1 e 3 dias, mas não 28

dias após a lesão. Ainda em um modelo de oclusão de ACM, Komatsu e cols. 92

encontraram uma redução de volume da lesão isquêmica se a terapia com CTM

de medula óssea era realizada 7 dias após a lesão mas não aos 14 ou 28 dias,

48

enquanto que a melhora na angiogênese e no teste da esteira ocorreram se as

células eram injetadas até 28 dias após a oclusão da ACM. Além de Komatsu e

cols., Shen e cols.161 e Yasuhara e cols.185 também encontraram efeitos positivos

quando a terapia celular era realizada 1 mês após o AVC. Não obstante, em sua

meta-análise de diferentes estudos pré-clínicos, Lees e cols.102 encontraram uma

redução absoluta na eficácia de 1,5% por cada dia de atraso do tratamento para o

resultado estrutural, enquanto a melhora do resultado funcional ocorreu nas

janelas precoces e tardias102.

A injeção intravascular das células-tronco nas fases aguda e subaguda

pode se beneficiar do período em que a BHE está aberta, o que permitiria a

atração das células por citocinas produzidas na área da lesão20. A abertura da

BHE também facilitaria a entrada das células ou de fatores produzidos por elas20.

Na fase crônica, a utilização de agentes permeabilizadores da BHE como o

manitol poderia ser necessária20. No entanto, um ponto interessante foi que no

presente estudo a migração das CMN de medula óssea para a região do AVC

ocorreu mesmo após quase 3 meses da lesão isquêmica, indicando que ainda

existe estímulo para a migração celular neste momento, apesar da grande

variabilidade entre pacientes. Entretanto, não foi possível esclarecer quais

subtipos celulares da medula óssea migraram para o cérebro ou para os outros

órgãos. É possível que a biodistribuição encontrada no cérebro seja pelos

diferentes subtipos de forma homogênea ou que algum subtipo celular como o

monócito tenha maior afinidade pela área da lesão, e este ponto ainda precisará

ser investigado em futuros estudos.

A dose apropriada que deve ser usada em ensaios clínicos também

permanece indefinida. As diretrizes da Conferência Stem Cell Therapies as an

Emerging Paradigm in Stroke (STEPS) recomendam uma translação da dose de

células por peso baseada nos estudos animais. Em estudos clínicos de infarto

agudo do miocárdio, uma meta-regressão indicou uma correlação dose-resposta

entre a quantidade de células CD34+ injetada e a melhora na fração de ejeção do

ventrículo esquerdo. Uma correlação dose-resposta também foi relatada por

diversos estudos pré-clínicos para o AVC102, 154, 183.

A utilização de técnicas não invasivas de imagem in vivo podem melhorar a

compreensão de várias perguntas não resolvidas na campo da terapia celular,

49

incluindo questões tais como (1) o efeito das diferentes doses e/ou das diferentes

vias de injeção sobre a migração e proliferação celular, (2) reações adversas

como formação de tumores ou novos AVCs; (3) efeitos positivos morfológicos que

podem ser analisados em TC ou RM; (4) efeitos positivos funcionais que podem

ser analisados por RM funcional, SPECT ou PET; (4) a programação do intervalo

entre as doses e o número de células a ser transplantado.

Um pequeno número de estudos pré-clínicos comparou diferentes vias de

injeção, com resultados discordantes, dependendo do modelo experimental e

momento do transplante. O transplante intracerebral pode permitir uma maior

retenção do que a injeção intravascular, porém é um método invasivo e que leva a

distribuição inadequada das células no local da lesão conforme demonstrado em

estudos animais103, 177. Um estudo pré-clínico realizado por Walczak e cols.

indicou que poderia ocorrer oclusão vascular analisada por Doppler e um

aumento na mortalidade após o transplante intra-arterial de CTMs de medula

óssea para um modelo de AVC isquêmico (67% de mortalidade nos animais

tratados em comparação com 7% dos animais não submetidos à terapia

celular)177. Os autores indicaram que o diâmetro das CTMs poderia ter relação

com a retenção das células no lúmen vascular e consequente redução do fluxo

cerebral. De forma similar, Li e cols. observaram uma alta taxa de mortalidade

após administração intra-arterial de CTNs (41%) em comparação com as vias

intracerebral (17%) e intravenosa (8%)103. Por outro lado, células de diâmetros

menores que as CTMs e CTNs apresentaram resultados diferentes. Kamiya e

cols.87 demonstraram que a injeção intra-arterial de CMN de medula óssea

resultou em melhores resultados funcionais em comparação com injeção

intravenosa em um modelo de isquemia transitória. Vasconcelos-dos-Santos e

cols.173 relataram que as infusões intravenosa e intra-arterial dessas células

levaram à recuperações funcionais equivalentes e baixa retenção das células no

cérebro num modelo de isquemia permanente. Zhang e cols.186 também relataram

que injeções intra-arteriais, intravenosas, intracerebrais, intra-cisterna magna e

intratecais de células derivadas do tecido umbilical humano em um modelo de

AVC levaram a melhoras estruturais semelhantes. A única meta-análise de

estudos pré-clínicos para o AVC não encontrou nenhum impacto importante da

via de administração na eficácia da terapia celular 102.

50

Um estudo pré-clínico recente de Janowski e cols.83 trouxe informações

interessantes em relação ao risco de redução no fluxo cerebral após injeção intra-

arterial. Neste artigo foram injetados salina, precursores gliais ou CTM de medula

óssea na carótida comum ou na carótida externa de animais normais. Os autores

concluíram que não só o diâmetro e número de células influenciava na redução

do fluxo cerebral, mas também a velocidade de injeção. Quando foi realizada a

infusão na velocidade de 3mL/min houve ocorrência de AVCs até mesmo com

salina pura. Ao realizar o transplante de 2x106 precursores gliais, a redução na

velocidade de 3mL/min para 0,2 mL/min fez com que o número de AVCs caísse

de 75% para zero. No caso das CTM, houve AVCs mesmo injetando 0,2 mL/min,

mas quando reduziram o número de células para 1x106 o número de AVCs

também foi reduzido, de 87,5% para zero.

Outros aspectos que devem ser esclarecidos são os efeitos da velocidade

de injeção e do uso de heparina ou contraste iodado nas células. Um estudo pré-

clínico por El-Khoury e cols.50 mostrou que taxas de infusão intra-arterial de 5

mL/min reduziram a viabilidade das CMN de medula óssea 19%, enquanto as

taxas de 2 mL/min não afetaram a viabilidade ou produção de citocinas. No

entanto, ainda que o iodo e baixas doses de exposição a heparina não tenham

reduzido a viabilidade das células, doses elevadas de heparina foram citotóxicas.

No que diz respeito à administração por via intravenosa e intracerebral, faltam

informações sobre os efeitos da velocidade de injeção a partir de estudos pré-

clínicos. Além disso, a maioria dos ensaios clínicos publicados até o momento

não reportaram o volume ou a duração da injeção, como mostrado na Tabela 1

desta Tese.

Além dos diferentes aspectos mencionados anteriormente, é extremamente

importante avaliar, acima de tudo, a segurança das terapias celulares. Embora a

maioria dos estudos clínicos publicados indique que as terapias celulares são

seguras e viáveis, há falta de dados científicos robustos e muitas perguntas

continuam sem resposta. Um dos pacientes do grupo intra-arterial deste ensaio

clínico e um do grupo intravenoso haviam apresentado convulsões precoces

(menos de 2 semanas após o AVC) antes de serem incluídos no estudo. Ainda

que não seja possível excluir a possibilidade que as convulsões neste estudo

tenham ocorrido por acaso ou pela presença de fatores de risco, a ocorrência de

51

convulsões em 7 de 12 pacientes (58%) aponta para a necessidade de cautela. A

proporção de convulsões tardias (mais de 2 semanas após o AVC) foi estimada

de 3 a 67%, com grandes variações entre as séries29. Um grande número de

fatores de risco foram relacionados com as convulsões tardias, incluindo

localização cortical, AVCs de grande extensão e a ocorrência de convulsões

prévias18, 29, 97. Os pacientes incluídos neste ensaio clínico apresentavam grandes

infartos, não-lacunares, em território de ACM, o que pode explicar parcialmente a

elevada proporção de convulsões no grupo intravenoso, que apresentava lesões

de maior gravidade do que o grupo intra-arterial. Não obstante, também é

possível que as células injetadas tenham ativado mecanismos de reparação

cerebrais e modificado a excitabilidade nas áreas perilesionais levando às

convulsões, e esta possibilidade merece investigação em estudos futuros. Nesse

sentido, é importante ressaltar as limitações do presente estudo. Além de não ter

sido possível seguir as células marcadas por períodos maiores, o número de

pacientes foi pequeno, como aprovado pela Comissão Nacional de Ética em

Pesquisa para um estudo introdutório. É importante ressaltar também que, em

função do tamanho da amostra e da ausência de grupo controle, este estudo não

teve como objetivo avaliar a eficácia da terapia celular. Qualquer melhora nas

escalas neurológicas pode ser atribuída à recuperação espontânea que pode

ocorrer após um AVC. Portanto, a estudos randomizados e controlados serão

necessários para evitar estas limitações e permitir a análise de fatores como o

número de células injetadas e a via e momento de administração.

Em futuros estudos, também é importante avaliar a influência de variáveis

clínicas, tais como a presença de co-morbidades. Um estudo pré-clínico por Chen

e cols. 33 indicou que a injeção de CTM de medula óssea 24 horas após oclusão

da ACM não melhorou o resultado funcional em ratos diabéticos de tipo 1 e

aumentou a aterosclerose, mas esse aspecto ainda necessita ser melhor

avaliado. Outra faceta que merece atenção é a influência da administração de

fatores tais como G-CSF. Estudos clínicos com a injeção de G-CSF em pacientes

com AVC indicam que o processo parece ser seguro22, 51, 58, 128, 157, 162, 166, mas

somente o estudo de England e cols.51 avaliou os efeitos do transplante de

células CD34 + após a injeção de G-CSF. Outros atributos de segurança, tais

como a estabilidade genética e a imunogenicidade de células também devem ser

52

observados e foram revistos em uma excelente publicação por Goldring e cols.65.

A observância destes aspectos não significará um atraso para a área e, ao

mesmo tempo, vai permitir um desenvolvimento responsável e adequado das

terapias celulares para o AVC.

53

6. CONCLUSÕES

Foi possível realizar o acompanhamento de CMN de medula óssea

marcadas com 99mTc até 24 horas após injeção intra-arterial ou intravenosa em

pacientes com AVC isquêmico.

Foram aperfeiçoados métodos de quantificação para avaliação da

biodistribuição nos diferentes órgãos de interesse. Além disso, através da fusão

de imagens SPECT e TC ou RM, foi possível analisar a biodistribuição das células

no cérebro em correlação com a lesão isquêmica.

Apesar da maior migração relativa nos pacientes do grupo intra-arterial

para o hemisfério isquêmico comparado com o contralateral 2 horas após a

injeção, a migração total para o cérebro comparada com o corpo inteiro foi

pequena e semelhante entre as duas vias de injeção com 2 e 24 horas.

As maiores diferenças na biodistribuição das CMN foram observadas nos

outros órgãos, com a injeção intravenosa demonstrando menor migração para o

fígado e baço e maior migração para os pulmões, nos períodos analisados.

54

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Regen Med 2013;8:145-155.

4. Moraes L, Vasconcelos-dos-Santos A, Santana FC, Godoy MA, Rosado-

de-Castro PH, Jasmin, Azevedo-Pereira RL, Cintra WM, Gasparetto EL,

Santiago MF, Mendez-Otero R. Neuroprotective effects and magnetic

resonance imaging of mesenchymal stem cells labeled with SPION in a rat

model of Huntington's disease. Stem Cell Res 2012;9:143-155.

73

5. Friedrich MA, Martins MP, Araújo MD, Klamt C, Vedolin L, Garicochea B,

Raupp EF, Sartori El Ammar J, Machado DC, Costa JC, Nogueira RG,

Rosado-de-Castro PH, Mendez-Otero R, Freitas GR. Intra-arterial infusion

of autologous bone marrow mononuclear cells in patients with moderate to

severe middle cerebral artery acute ischemic stroke. Cell Transplant

2012;21 Suppl 1:S13-21.

6. Vasconcelos-dos-Santos A, Rosado-de-Castro PH, Lopes de Souza SA, da

Costa Silva J, Ramos AB, Rodriguez de Freitas G, Barbosa da Fonseca

LM, Gutfilen B, Mendez-Otero R. Intravenous and intra-arterial

administration of bone marrow mononuclear cells after focal cerebral

ischemia: Is there a difference in biodistribution and efficacy? Stem Cell

Res 2012;9:1-8.

7. Pimentel-Coelho PM, Rosado-de-Castro PH, da Fonseca LM, Mendez-

Otero R. Umbilical cord blood mononuclear cell transplantation for neonatal

hypoxic-ischemic encephalopathy. Pediatr Res 2012;71:464-473.

8. Battistella V, de Freitas GR, da Fonseca LM, Mercante D, Gutfilen B,

Goldenberg RC, Dias JV, Kasai-Brunswick TH, Wajnberg E, Rosado-de-

Castro PH, Alves-Leon SV, Mendez-Otero R, Andre C. Safety of

autologous bone marrow mononuclear cell transplantation in patients with

nonacute ischemic stroke. Regen Med 2011;6:45-52.

9. Barbosa da Fonseca LM, Xavier SS, Rosado de Castro PH, Lima RS,

Gutfilen B, Goldenberg RC, Maiolino A, Chagas CL, Pedrosa RC, Campos

de Carvalho AC. Biodistribution of bone marrow mononuclear cells in

chronic chagasic cardiomyopathy after intracoronary injection. Int J Cardiol

2011;149:310-314.

74

10. Barbosa da Fonseca LM, Gutfilen B, Rosado de Castro PH, Battistella V,

Goldenberg RC, Kasai-Brunswick T, Chagas CL, Wajnberg E, Maiolino A,

Salles Xavier S, Andre C, Mendez-Otero R, de Freitas GR. Migration and

homing of bone-marrow mononuclear cells in chronic ischemic stroke after

intra-arterial injection. Exp Neurol 2010;221:122-128.

11. Barbosa da Fonseca LM, Battistella V, de Freitas GR, Gutfilen B, Dos

Santos Goldenberg RC, Maiolino A, Wajnberg E, Rosado de Castro PH,

Mendez-Otero R, Andre C. Early tissue distribution of bone marrow

mononuclear cells after intra-arterial delivery in a patient with chronic

stroke. Circulation 2009;120:539-541.

75

ANEXO 2

Escala NIHSS

(http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/consulta_publica_AVC.pdf)

Anexo 2

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ANEXO 3

Índice de Barthel

(http://www.pactoavc.com.br/downloads/anexos.pdf)

116

ANEXO 8

Índice de Barthel Modificado

Alimentação Totalmente dependente 0Necessita de ajuda (para cortar) 5Independente 10

Banho Não pode executar sem assistência 0Executa sem assistência 5

Toalete Pessoal Necessita de ajuda 0Lava o rosto, penteia cabelos e escova os dentes 5

Vestuário Totalmente dependente 0Necessita de ajuda, mas faz pelo menos a metade datarefa dentro de um período de tempo razoável 5Independente, amarra sapatos, fixa fivelas e coloca adaptações 10

Controle de Intestinos Acidentes freqüentes 0Acidentes ocasionais ou necessita auxílio comenema ou supositório 5Sem acidentes e independente no uso de enemasou supositórios, se for necessário 10

Controle da Bexiga Incontinência ou necessidade de uso de catéter 0Acidentes ocasionais ou necessita de ajuda com odispositivo 5Sem acidentes, capaz de cuidar do dispositivo de coleta,se for usado 10

Locomoção até o banheiro Não usa banheiro, restrito ao leito 0Necessita de ajuda para equilibrar-se, colocar as roupas,cortar o papel 5Independente no banheiro 10

Transferência da cama para a cadeira Restrito ao leito não é possível o uso da cadeira 0Capaz de sentar, mas necessita assistência máximana transferência 5Mínima assistência ou supervisão 10Independente, inclusive nas travas da cadeira de rodas elevantar o suporte do pé 15

Mobilidade e deambulação Senta na cadeira de rodas mas não se impulsiona 0Independente na cadeira de rodas por 50 m, nãoconsegue caminhar 5Caminha com ajuda por uma distância de 50 m 10Independente por 50 m, pode usar dispositivos de auxílio,sem ser o andador com rodas 15

Subir escadas Não sobe escadas 0Necessita de ajuda ou supervisão 5Independente, pode usar dispositivo de auxílio 10

TOTAL

80

ANEXO 4

Escala modificada de Rankin

(http://www.pactoavc.com.br/downloads/anexos.pdf)

115

ANEXO 7

Escala de Rankin Modificada

Grau 0 Sem sintomas

Grau 1 Nenhuma incapacidade significante, com capacidade para desempenhartodas as AVDs

Grau 2 Incapacidade leve, incapaz de realizar algumas atividades prévias de AVDs,mas com capacidade de cuidar de suas próprias atividades sem assistência

Grau 3 Incapacidade moderada, requerendo alguma ajuda mas com capacidade decaminhar sem assistência

Grau 4 Incapacidade moderadamente severa, incapacidade de caminhar e para atendera própria necessidade do corpo sem assistência

Grau 5 Incapacidade severa, confinado ao leito, incontinente e requerendo cuidados eatenção de enfermagem constante

Grau 6 Óbito

81

ANEXO 5

Termo de Consentimento Livre e Esclarecido – Protocolo Intra-arterial

ANEXO 1 – TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

Eu fui convidado a participar do estudo "SEGURANÇA DO TRANSPLANTEAUTÓLOGO DE CÉLULAS MONONUCLEARES DA MEDULA ÓSSEA EMPACIENTES COM ACIDENTE VASCULAR CEREBRAL ISQUÊMICOSUBAGUDO". Em relação ao estudo, eu fui informado das seguintes questões:

1. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital (n° 169/03) e pelaComissão Nacional de Ética em Pesquisa (n° 10385).

2. O objetivo deste estudo é avaliar se o transplante de células retirada da medula doosso é seguro no tratamento do AVC (acidente vascular cerebral, ou "derrame") em sereshumanos. O estudo está sendo realizado pois as células-tronco conseguiram ajudar narecuperação do AVC em ensaios em animais. Nesses ensaios, os animais que receberam ascélulas-tronco após o AVC tiveram menos seqüelas do que os animais que não receberamestas células. Não se sabe se as células-tronco se transformam em neurônios ou se produzemsubstâncias que ajudam na recuperação.

3. O estudo irá incluir apenas pessoas entre 18 e 75 anos que tenham apresentado umAVC isquêmico nos últimos 90 dias confirmado pela tomografia computadorizada de crânio.Não poderão ser incluídas pessoas que tenham alguma doença ou condição que possamdificultar a realização do estudo como, por exemplo, câncer, insuficiência do fígado, gravidez.

4. Uma vez que eu concorde em participar do estudo, eu serei submetido (a) aosseguintes procedimentos:a) Será realizada retirada de células através de punção da medula (parte interna) do osso dabacia, sob efeito de sedativos e analgésicos, por um especialista em hematologia. Esteprocedimento é semelhante aos já realizados para transplantes de medula utilizados em largaescala na medicina de hoje. Não constitui nenhuma novidade no meio médico, além deoferecer risco muito baixo de complicações. Estes riscos envolvem perfuração óssea einfecção do osso, e ocorrem em menos de 1% dos casos;b) O implante de células tronco ocorrerá no mesmo dia, e a via de administração será ocateterismo cerebral. O cateterismo consiste na colocação, após anestesia local, de um cateterem uma artéria na região da virilha, o que permite levar esse cateter até as artérias cerebraispara visualização destas e infusão das células-tronco de medula óssea. O cateterismo cerebralé o único procedimento do estudo que é considerado invasivo, porém é um procedimentoseguro, com risco de complicações em cerca de 1,4% dos casos. O cateterismo será realizadopor um especialista em radiologia intervencionista.c) Serão realizados dois exames de cintilografia cerebral para avaliar a "posição" das células-tronco no meu cérebro: 2 e 24horas após a injeção das células.

Eu vou ficar internado (a) no Hospital por dois dias após o implante de células troncoe, neste período serei submetido a novos exames de sangue, tomografia computadorizada (senecessário), eletroencefalograma, assim como escalas neurológicas para verificar o grau deindependência e recuperação. Depois da alta hospitalar, consultas e exames de sangue serãorealizados 7, 30, 60 e 120 dias após o transplante das células.

5. Eu estou consciente de que podem existir alguns efeitos colaterais relacionados aoestudo. Os riscos do implante de células em seres humanos são muito pouco conhecidos.Existem seres humanos que já receberam células parecidas com as da medula óssea nocérebro, em doenças degenerativas, como Doença de Parkinson através de procedimentocirúrgico, com implante direto. Outros pacientes já foram submetidos a implantes de célulasna fase aguda do acidente vascular cerebral. Não houve qualquer complicação relatada até omomento. Observe que apenas poucos pacientes já se submeteram a este procedimentopreviamente, o que é muito pouco para que possamos afirmar qualquer coisa com respeito às

82

complicações. No entanto, existe a possibilidade de algumas complicações, além das acima,ocorrerem: inflamação no cérebro, levando a aumento da lesão e inchaço no mesmo,sangramento cerebral,aparecimento de atividade epiléptica, infecção no cérebro e crescimentode tecidos não cerebrais no cérebro.

6. Eu estou consciente de que não existe remuneração referente à inclusão no estudo,nem ressarcimentos ou indenizações relacionadas às complicações dos procedimentos doestudo. Caso o paciente apresente alguma complicação, os investigadores serão responsáveispelo seu tratamento.

7. Eu estou consciente de que os pesquisadores do estudo terão acesso ao meuprontuário, para verificar doenças passadas ou futuras. A revisão dos prontuários e registrosmédicos será realizada de acordo com a legislação brasileira (resoluções do Conselho Federalde Medicina n° 1605/2000, 1638/2002, 1642/2002).

8. Eu estou consciente que, enquanto o estudo estiver sendo realizado, eu não sereiidentificado por quaisquer pessoas de fora do estudo, e de que os meus resultados serãoconfidenciais.

9.Eu estou consciente que posso me recusar a participar do estudo e que eu posso sairdo estudo quando quiser, e que isto não vai afetar o meu tratamento médico. Se eu apresentaralgum problema que eu suspeite que tenha resultado do meu envolvimento no estudo, euestou ciente que devo falar com meu neurologista. Conheço e posso telefonar, se necessário,para os Drs. Charles André (telefone pessoal: 9989.7937), Gabriel de Freitas (telefonepessoal: 9973.0164) e Valéria Battistella (telefone pessoal:9328.7596).

_____________________________________ _________________Assinatura do paciente ou responsável legal DataEu expliquei ao paciente ____________________________________________________ oprojeto de pesquisa e os efeitos do tratamento. Acredito que ele (a) tenha compreendido aminha explicação e que deu o seu consentimento de livre e espontânea vontade.

__________________________________ _________________ Gabriel R. de Freitas, CRM 52.60589-7 Data Charles André, CRM 52.38570-7 Valéria Battistella, CRM 52.70716-3

83

ANEXO 6

Termo de Consentimento Livre e Esclarecido – Protocolo Intravenoso

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

Eu fui convidado a participar do estudo “TERAPIA CELULAR PELO TRANSPLANTE AUTÓLOGO DE CÉLULAS TRONCO DE MEDULA ÓSSEA EM PACIENTES COM ACIDENTE VASCULAR CEREBRAL ISQUÊMICO”. Em relação ao estudo, eu fui informado das seguintes questões:

1. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital e pela Comissão Nacional de Ética em Pesquisa.

2. O objetivo deste estudo é avaliar se o transplante de células retirada da medula do osso é seguro no tratamento do AVC (acidente vascular cerebral, ou “derrame”) em seres humanos. O estudo está sendo realizado pois as células tronco conseguiram ajudar na recuperação do AVC em ensaios em animais. Nesses ensaios, os animais que receberam as células tronco após o AVC tiveram menos seqüelas do que os animais que não receberam as estas células. Não se sabe se as células tronco se transformam em neurônios ou se produzem substâncias que ajudam na recuperação.

3. O estudo irá incluir apenas pessoas entre 18 e 75 anos que tenham apresentado um AVC isquêmico nos últimos 90 dias confirmado pela tomografia computadorizada de crânio ou por ressonância magnetica. Não poderão ser incluídas pessoas que tenham alguma doença ou condição que possam dificultar a realização do estudo como, por exemplo, câncer, insuficiência do fígado, gravidez.

4. Uma vez que eu concorde em participar do estudo, eu serei submetido(a) aos seguintes procedimentos:

a) Será realizada retirada de células através de punção da medula (parte interna) do osso da bacia, sob efeito de sedativos e analgésicos, por um especialista em hematologia. Este procedimento é semelhante aos já realizados para transplantes de medula utilizados em larga escala na medicina de hoje. Não constitui nenhuma novidade no meio médico, além de oferecer risco muito baixo de complicações. Estes riscos envolvem perfuração óssea e infecção do osso, e ocorrem em menos de 1% dos casos. b) O implante de células tronco ocorrerá no mesmo dia, e a via de administração será intravenosa. Eu vou ficar internado(a) no Hospital por 1 ou mais dias após a infusão de células tronco, e, neste período serei submetido à novos exames de cintilografia, eletrencefalograma, exames de sangue, assim como testes neuropsicológicos para avaliação da sua qualidade de vida e escalas neurológicas para verificarmos o grau de independência e recuperação. Depois da alta hospitalar, consultas, exames de sangue, exames de imagem e eletrencefalograma serão realizados 30, 60 e 120 dias após o transplante das células. 5. Eu estou consciente de que podem existir alguns efeitos colaterais relacionados ao estudo.

Os riscos do implante de células em seres humanos são muito pouco conhecidos. No Brasil 33 pacientes com acidente vascular cerebral isquemico ja receberam células de medula óssea injetadas através da artéria crebral media. Em nenhum destes pacientes houve qualquer complicacao que pudesse ser atribuída as células. Existem seres humanos que já receberam células parecidas com as da medula óssea no cérebro, em doenças degenerativas, como Doença de Parkinson através de procedimento cirúrgico, com implante direto. Outros pacientes já foram submetidos a implantes de células na fase crônica do acidente vascular cerebral. Não houve qualquer complicação relatada até o momento. Observe que apenas poucos pacientes já se submeteram a este procedimento previamente o que é muito pouco para que possamos afirmar qualquer coisa com respeito às complicações. No entanto, existe a possibilidade de algumas complicações, além das acima, ocorrerem: inflamação no cérebro, levando a aumento da lesão e inchaço no mesmo, sangramento cerebral, aparecimento de atividade epiléptica, infecção no cérebro e crescimento de tecidos não cerebrais no cérebro.

84

6. As pessoas que receberão as células tronco através da veia serão comparadas a um grupo que recebeu as células através da artéria cerebral media para avaliar os benefícios e complicações do procedimento. O objetivo e comparar se as células injetadas através da veia também conseguem chegar ate a área do AVC.

7. Eu estou consciente de que não existe remuneração referente à inclusão no estudo, nem ressarcimentos ou indenizações relacionados a complicações dos procedimentos do estudo. Caso o paciente apresente alguma complicação, os investigadores serão responsáveis pelo seu tratamento.

8. Eu estou consciente de que os pesquisadores do estudo terão acesso ao meu prontuário, para verificar doenças passadas ou futuras. A revisão dos prontuários e registros médicos será realizada de acordo com a legislação brasileira (resoluções do Conselho Federal de Medicina nos 1.605/2000, 1.638/2002, 1.642/2002).

9. Eu estou consciente que, enquanto o estudo estiver sendo realizado, eu não serei identificado por quaisquer pessoas de fora do estudo, e de que os meus resultados serão confidenciais.

10. Eu estou consciente que eu posso me recusar a participar do estudo e que eu posso sair do estudo quando quiser, e que isto não vai afetar o meu tratamento médico.

11. Se eu apresentar algum problema que eu suspeite que tenha resultado do meu envolvimento no estudo, eu estou ciente que eu devo falar com o meu neurologista. Conheço e posso telefonar, se necessário, para os Drs. Charles André (telefone pessoal: 9989.7937) e Gabriel de Freitas (telefone pessoal: 9973.0164).

____________________________________ ______________ Assinatura do paciente ou responsável legal data Eu expliquei ao paciente __________________________________________________ o projeto

de pesquisa e os efeitos do tratamento, que leu este termo de consentimento e discutiu comigo detalhes e dúvidas. Acredito que ele (a) tenha compreendido a minha explicação e que deu o seu consentimento de livre e espontânea vontade.

_____________________________________ ________________ Gabriel R. de Freitas, CRM 52 60589-7 data Charles André, CRM 52 38570-7

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