BIBIANA SAGRILLO GINDRI

CONTRIBUIÇÃO AO ESTUDO CITOGENÉTICO EM LORICARIINAE (Siluriformes, Loricariidae) DA REGIÃO DO ALTO TAQUARI

MARINGÁ PARANÁ – BRASIL FEVEREIRO – 2009

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BIBIANA SAGRILLO GINDRI

CONTRIBUIÇÃO AO ESTUDO CITOGENÉTICO EM LORICARIINAE

(Siluriformes, Loricariidae) DA REGIÃO DO ALTO TAQUARI

Dissertação apresentada à Universidade Estadual de Maringá, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento, para obtenção do título de Mestre.

MARINGÁ

PARANÁ – BRASIL FEVEREIRO – 2009

ii

iii

À minha mãe.

Ao Pedro.

Ao Marcos.

Ao João Itsuo.

Com carinho, dedico.

iv

AGRADECIMENTOS

A Deus, fonte inesgotável de força para enfrentar as dificuldades e, acima

de tudo, de saúde para seguir em frente.

Ao Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento - PGM,

pelo auxílio na realização deste curso.

À Universidade Estadual do Mato Grosso do Sul – Unidade de Coxim, por

disponibilizar o laboratório para o processamento dos peixes, material em estudo

desta Dissertação.

À minha orientadora, professora doutora Isabel Cristina, que me ensinou a

ser crítica e a ter confiança em minhas decisões. Por você tenho um carinho todo

especial. Obrigada Isabel! Se não fosse você, com certeza, não chegaria aqui.

À professora doutora Ana Luisa de Brito Portela, que contribuiu com meu

trabalho, sempre disposta a ajudar nas fotos e interessada no andamento das

pesquisas.

À professora doutora Luciana Borin, espelho para os novos

pesquisadores, sempre feliz e de bem com a vida.

À minha mãe, Terezinha Inez Sagrillo, que nunca mediu esforços para

que meus sonhos se realizassem.

Ao meu filho, João Itsuo Gindi Sonohata, que, mesmo pequenino,

conseguiu compreender os motivos da minha ausência.

Ao meu grande amor, Marcos Mitsuo, que sempre teve a capacidade de

incentivar, dar forças, compreender meus choros e minha ausência.

Ao senhor Itsuo Sonohata, dona Maria Madalena Baldin Sonohata,

Maritsa Missae Sonohata e Roberto Itsuo Sonohata que, com muito carinho,

cuidaram do meu filho e sempre torceram pela minha vitória.

À tia Maria Gorete Sagrillo Machado, que abandonou tudo para que eu

pudesse crescer.

Aos colegas do Núcleo de Estudos de Citogenética de Peixes -

Nuclescipe da Universidade Estadual do mato Grosso do Sul – Unidade de

Coxim, Elis Aparecida Morita Melo, Greicy Ellen de Brito Ferreira, Josimar Lara da

Silva e Aline Motta, que sempre estiveram disponíveis no processamento dos

peixes e, principalmente, nas divertidas coletas.

v

Ao técnico de laboratório, Márcio Tomaz, que sempre esteve disposto a

colaborar com o trabalho.

Ao Manoel Gaspar Manso Perez e à Ângela Manso Perez, que

gentilmente disponibilizaram o local de coleta.

À família Vinas Vieira, pela acolhida e ajuda nos momentos difíceis em

Maringá.

À Maria José Barros, exemplo de pessoa, garra e força, sempre cuidando

de mim, dividindo alegrias e tristezas.

Ao Leonardo Garcia Mommensohn, que incansavelmente e gentilmente

foi prestativo em todas as minhas necessidades no laboratório.

À Suzana Paiva, que me mostrou como as pessoas são diferentes e o

quanto precisamos aprendê-las e amá-las como são. Obrigada por me mostrar o

outro lado das coisas e aprender como é gratificante aprender a respeitar a forma

de pensar de cada um.

Ao Paulo Emilio Botura, que me fazia rir no laboratório, sempre me

ensinando a ter paciência para fazer Banda C.

Ao Renan Okawara, por ter me ensinado que a humildade é uma das

maiores virtudes do ser humano.

À Fernanda Errero Porto, pela paciência em me ensinar, por saber me

ouvir e por chorar tantas vezes comigo. Obrigada Fer! Você é uma grande amiga!

Existem pessoas que hoje são parte da minha vida e com as quais eu

descobri, tanto profissionalmente como pessoalmente, que não existem palavras

capazes de expressar o significado delas para mim. Aos céus eu faço uma prece

de agradecimento a Deus por tantas pessoas valiosas que passaram pela minha

vida.

vi

BIOGRAFIA

Bibiana Sagrillo Gindri, filha de Carlos Gilberto Gindri e Terezinha Inez

Sagrillo, nascida no dia 25 de abril de mil novecentos e oitenta e dois, na cidade

de Campo Grande - MS.

Concluiu o Ensino Fundamental, no ano de 1996, no Colégio Estadual

Medianeira, em Santiago – RS, e o Ensino Médio, em dezembro de 1999, na

Escola Estadual de Ensino Médio Carlos Kluwe, em Bagé - RS.

Ingressou, em 2001, no curso de Ciências Biológicas da Universidade

Estadual de Mato Grosso do Sul, concluindo o curso em 2005. Durante a

graduação, participou, dentre outras atividades, de estágios, projetos de pesquisa

e projetos de extensão.

Em março de 2008, matriculou-se no curso de Mestrado do Programa de

Pós-Graduação em Genética e Melhoramento da Universidade Estadual de

Maringá.

vii

ÍNDICE

RESUMO ............................................................................................................ VIII ABSTRACT ........................................................................................................... X 1. INTRODUÇÃO .................................................................................................... 1 2. REVISÃO DA LITERATURA .............................................................................. 4 2.1. A bacia do Alto Taquari ................................................................................. 4

2.2.1. Família Loricariidae ................................................................................... 7

2.2.2. Subfamília Loricariinae .............................................................................. 8

3. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................ 11 3.1. Material .......................................................................................................... 11 3.2. Métodos ........................................................................................................ 12

3.2.1. Análises citogenéticas ............................................................................. 12

3.2.1.1. Preparação de cromossomos mitóticos ............................................ 12

3.2.1.1.1. Estimulação de metáfases.......................................................... 12

3.2.1.1.2. Técnica air drying ....................................................................... 12

3.2. Bandamentos cromossômicos ................................................................... 13 3.2.1. Estudo da região organizadora do nucléolo ............................................ 13

3.2.1.1. Técnica de nitrato de prata (AgNOR) ................................................ 13

3.2.2.2. Cromomicina a3 e mitramicina a (GC-específicos) ............................ 14

3.2.3. Estudo da heterocromatina constitutiva ................................................... 15

3.2.3.1. Bandamento C .................................................................................. 15

3.2.4. Medidas cromossômicas ......................................................................... 15

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................ 19 5. CONCLUSÕES ................................................................................................. 33 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................. 34

viii

RESUMO

GINDRI, Bibiana Sagrillo M.Sc. Universidade Estadual de Maringá, fevereiro de 2009. Contribuição ao estudo citogenético em Loricariinae (Siluriformes, Loricariidae) da região do Alto Taquari. Orientadora: Profª. Drª. Isabel Cristina Martins dos Santos. Conselheiros: Profª. Drª. Margarida Maria de Rossi Vieira e Profª. Drª. Ana Luisa de Brito Portela Castro. A família Loricariidae constitui uma das maiores famílias da ictiofauna mundial

distribuídas na região neotropical. Na família Loricariidae, encontra-se a

subfamília Loricariinae e, dentro dessa, os gêneros: Farlowella, Sturisoma,

Loricaria e Pyxiloricaria. Estudos citogenéticos foram realizados em exemplares

de Farlowella amazona, por meio da técnicas de coloração usual com Giemsa e

de bandamentos NOR e C. A análise do cariótipo de Farlowella amazona revelou

a presença de 2n=58 cromossomos, fórmula cariotípica 18m+20sm+12st+8a e

NF=96, sem diferenças entre os sexos. A análise pela coloração usual por

Giemsa revelou a presença de uma constrição secundária, polimórfica em

tamanho, coincidente com a região organizadora do nucléolo (NOR). Esta região

foi detectada pela técnica de coloração com nitrato de prata, em posição

subterminal do braço longo do par número 26. Além deste par, o rDNA esteve

presente no braço curto de outro par de acrocêntrico, provavelmente o 27. O

padrão de banda C mostrou presença de heterocromatina centromérica na

maioria dos cromossomos e seis pares marcadores com bandas intersticiais e/ou

proximal ao centrômero, presentes no braço longo dos pares 11, 12, 20, 23, 25 e

26. A análise de exemplares de Sturisoma robustum mostrou 2n= 66

cromossomos, fórmula cariotípica 18m+22sm+10st+16a, NF = 116 e também não

houve diferenças quanto ao sexo. A coloração pela prata mostrou marcação no

braço curto do par 21, evidenciando um sistema de NOR simples. O padrão de

bandamento C revelou a presença de marcação na região pericentromérica de

alguns pares cromossômicos e a região da NOR apresentou-se BC positiva.

Loricaria sp. mostrou a presença de 2n=64 cromossomos, fórmula cariotípica

12m+ 8sm+2st+42a e NF=84. A técnica pelo nitrato de prata mostrou marcação

intersticial evidente no braço longo do par 13, um dos maiores cromossomos

acrocêntricos. O padrão de bandeamento C apresentou marcação evidente na

região da NOR e pericentromérica em alguns cromossomos. A análise

ix

citogenética de Pyxiloricaria menesezi revelou 2n=68 cromossomos, fórmula

cariotípica 8m+6sm+4st+50a, NF=86. A região organizadora do nucléolo (NOR)

revelou marcação na região terminal do braço curto do par 9. O bandamento C

mostrou marcações centroméricas e pericentroméricas na maioria dos

cromossomos e no braço curto do par 9, portanto, NOR banda C positiva. A

coloração por cromomicina foi aplicada para os gêneros Pyxiloricaria, Loricaria e

Sturisoma e marcou a região coincidente com a região da NOR. Os resultados

deste estudo foram discutidos e corroboraram a proposição de filogenia proposta

para a subfamília, quando analisados o alto número de cromossomos do tipo

meta/submetacêntricos observados em Farlowella amazona e a pouca ocorrência

desses tipos cromossômicos observado em Pyxiloricaria menezesi e Loricaria sp.

Palavras-chave: Citogenética de peixes, Loricariidae, evolução.

x

ABSTRACT

GINDRI, Bibiana Sagrillo M. Sc. Universidade Estadual de Maringá, february, 2009. Contribution to the cytogenetic study in Loricariinae (Siluriformes, Loricariidae) in the region of Alto Taquari. Supervisor: Profª. Drª. Isabel Cristina Martins dos Santos. Assistant professors: Profª. Drª. Margarida Maria de Rossi Vieira and Profª. Drª. Ana Luisa de Brito Portela Castro.

The Loricariidae family constitutes one of the major ichtyophauna families

distributed from neotropical region. Among the Loricariidae there are the

Farlowella, Sturisoma, Loricaria e Pyxiloricaria genus. Cytogenetic studies were

made in Farlowella amazona, by Giemsa techniques and banding NOR and C.

The karyotype analysis revealed the presence of 2n = 58 chromosomes,

karyotypic formula 16m+26sm+8st+8a e NF = 96, without differences between

female and male sex. The analysis by Giemsa revealed the presence of a very

evident secondary constriction, polymorphic in size, coincident with the nucleolus

organizing region (NOR). This region was detected by silver nitrate technique in

terminal region of the long arm of the pair 26. Besides this pair the rDNA had been

present in the short arm of another pair of acrocentric, probably the number 27.

The standard of C band showed the presence of centromeric heterochromatin in

the majority of the chromosomes and six marker pair with interstitial bands and/or

proximal to the centromere in the long arm of the pairs 11, 12, 20, 23, 25, 26. The

analysis of exemplaries of Sturisoma robustum, revealed the presence of 2n=66

chromosomes, with karyotypic formula of 18m+22sm+10st+16a, NF = 116 and

also there weren’t differences between male and female sex. The staining by silver

showed marking in the short arm of the pair number 21, evidencing a system of

simple NOR. The standard of C banding revealed the presence of few blocks of

constitutive heterochromatin with marking at the pericentromeric region of some

chromosome pairs and NOR positive C-banding. Loricaria sp. showed the

presence of 2n=64 chromosomes, karyotypic formula 12m+8sm+2st+42a, NF =

84. The silver nitrate technique revealed an evident interstitial marking at the long

arm of the pair number 6, one of the biggest acrocentric chromosome. The

standard of C banding presented evident marking at the same region of NOR and

pericentromeric of some chromosome. The cytogenetic analysis of the

xi

Pyxiloricaria menesezi revealed 2n=68 chromosome, karyotypic formula

8m+6sm+4st+50a, NF=86. The NOR revealed marking in the terminal region of

the short arm of the par 9. The C-banding showed marking some centromeric and

pericentromeric marking in a great of the chromosomes and at the short arm of the

pair 9, being this, band C positive NOR. The coloring by CMA3 in Pyxiloricaria,

Loricaria and Sturisoma marked the coincident region with the NOR region. The

results of this study were discussed and corroborate the position of phylogeny

propose a for the subfamily, when analyzed the high chromosomes number of the

meta / submetacentric type observed in Farlowella amazona and low occurrence

of these chromosomal types observed in Pyxiloricaria menezei and Loricaria sp.

Key words: Fishes cytogenetic, Loricariidae, Evolution.

1

1. INTRODUÇÃO

O Pantanal é uma planície sedimentar com superfície de 147.574 km2

(Brasil, 2004). Está inserido na bacia do Alto Paraguai (BAP), que se localiza no

oeste do Brasil. A BAP, em território nacional, possui uma superfície de

362.376km2 (Brasil, 2004). A bacia do Alto Taquari – BAT, com área aproximada

de 28.000 km2, é uma das principais áreas da rede de drenagem da bacia do Alto

Paraguai (BAP). A maior parte da superfície da BAT está localizada no estado de

Mato Grosso do Sul (86,5%) e o restante no Mato Grosso (13,5%) (Galdino et al.,

2006). Essa bacia exerce grande influência sobre os ecossistemas aquáticos da

planície do rio Taquari no Pantanal.

Os peixes constituem cerca de metade do grupo dos vertebrados, daí

ocuparem uma posição básica na filogenia do grupo (Nelson, 1994). A última

revisão sobre a ictiofauna neotropical de água doce (Reis et al., 2003) revelou-se

ser bastante rica, incluindo 71 famílias e 4475 espécies reconhecidamente

válidas. Este número poderia chegar a 8000 espécies de peixes de água doce

neotropicais, o que corresponderia a 25% de todas as espécies de peixes e toda

esta diversidade estaria presente em menos de 0,003% da água doce do planeta

(Vari e Malabarba, 1998).

A superordem Ostariophysi engloba peixes ósseos, que constituem em

torno de 3/4 dos peixes de água doce do mundo todo, sendo, portanto, foco de

muitos estudos devido a sua enorme diversidade ecológica e evolucionária (de

Pinna, 1998; Britto, 2003). Dentro dessa superordem está a ordem Siluriforme que

compreende um grupo de peixes extremamente grande, diverso e amplamente

distribuído nas regiões tropicais de todo o mundo (Burges, 1989; Ferraris, 1998),

por esse motivo são peixes com grande complexidade taxonômica. Na ordem

Siluriforme está inclusa a família Loricariidae que, em função da morfologia

altamente especializada, foram reconhecidos como um grupo monofilético na

classificação recente dos Siluriformes (Schaefer, 1987; Armbruster, 2004).

A família Loricariidae apresenta cerca de 690 espécies e estava até então

dividida em seis subfamílias (Reis et al., 2003). Armbruster (2004) incluiu

Ancistrinae dentro de Hypostominae, totalizando então 5 subfamílias dentro da

família Loricariidae, sendo a nova subfamília Hypostominae a ser composta por

2

cinco tribos: Hypostomini, Pterygoplichithini, Corymbophanini, Ancistrini e

Rhinelepini. Recentemente, Reis et al. (2006), com análises de Delturus e

Hemipsilichthys, descreveu uma nova subfamília, Delturinae, passando então a

família Loricariidade voltar a possuir seis subfamílias: Hypoptomatinae,

Loricariinae, Hypostominae, Neoplescotominae, Lithogeninae e Delturinae.

Nessas seis subfamílias, duas exibem baixo número de espécies e sua

distribuição é restrita: Lithogeneinae (2 spp.) e Delturinae (7 ssp.); uma contendo

um moderado número de espécies: Neoplecostominse (33 ssp.); e três são ricas

em espécies bem distribuídas (mais que 60 spp.): Hypoptopomatinae, Loricariinae

e Hypostominae (Chiachio et al. 2008). Covain e Fisch-Muller (2007) dividem esta

subfamília em duas tribos: tribo Hartiini, onde podem ser encontrados os gêneros

Farlowella e Sturissoma, e tribo Loricariini, que inclui os gêneros Pyxiloricaria e

Loricaria.

Farlowella e Sturisoma são peixes que possuem adaptações especiais

para se alimentarem de detritos, apresentando importante papel na cadeia

alimentar e no processo de remineralização em águas tropicais. Três são as

peculiaridades que chamam a atenção nos gêneros em questão. Primeiro,

constituem peixes que apresentam requisitos alimentares especiais, são de

distribuição gregária e são extremamente sensíveis a alterações da

disponibilidade de algas, servindo como bons bioindicadores. A presença destas

espécies, bem como aspectos de seu comportamento alimentar, reprodutivo e

social constitui indicadores do estado de conservação ambiental. Segundo, não

existe dados citogenéticos no gênero Farlowella descritos na literatura até o

momento e apenas uma das 15 espécies válidas de Sturisoma tem o seu cariótipo

descrito. Terceiro, são peixes que possivelmente estão em vias de extinção

devido à extrema sensibilidade ao meio ambiente e como se trata de espécies

dóceis, que possuem o hábito de ficarem horas paradas, imóveis e aparência

exótica são capturados excessivamente para aquariofilia.

O gênero Loricaria apresenta cauda achatada com fortes quilhas laterais

e, frequentemente, um entalhe na parte posterior da órbita, sendo constituída por

11 espécies restritas à América do Sul. Caracteriza-se por apresentar o abdômen

revestido de placas pequenas ou ser parcialmente nu, pela presença de

filamentos no lábio inferior e os dentes da maxila superior ter o dobro do tamanho

dos dentes da mandíbula (Isbrucker, 1981).

3

O gênero Pyxiloricaria é considerado um gênero monotípico: Pyxiloricaria

menezesi. Esta espécie caracteriza-se por apresentar as bordas da cabeça retas,

formando um ângulo de aproximadamente 80 graus, olho com entalhe orbital raso

e muito pequeno e raio mais superior da caudal prolongado em longo filamento.

O presente trabalho tem por objetivo analisar citogeneticamente as

espécies Farlowella amazona, Sturisoma robustum, Loricaria sp. e Pyxiloricaria

menezesi, estabelecendo os principais mecanismos de rearranjos cromossômicos

envolvidos durante a diversificação dos diferentes grupos, bem como discutir as

relações de proximidade evolutiva entre eles.

4

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1. A bacia do Alto Taquari

O rio Taquari, com seus 801 km de extensão total, possui suas nascentes

nas terras altas entre a Serra da Saudade e a Serra de Maracaju, no estado de

Mato Grosso (Brasil, 1974). Após percorrer aproximadamente 34 km no estado de

Mato Grosso e 134 km como divisor deste estado com o de Mato Grosso do Sul,

o rio Taquari entra em território sul mato-grossense (Galdino et al., 2006).

Próximo à cidade de Coxim, o rio Taquari recebe as águas do seu

principal tributário, o rio Coxim, e logo adentra o Pantanal, seguindo uma direção

Leste- Oeste (Galdino et al., 2006).

A bacia do Alto Taquari (BAT), com superfície aproximada de 28.000 km,

compreende a área do planalto drenado pelo rio Taquari e seus afluentes até a

escarpa cuestiforme da bacia sedimentar do Paraná, próxima à cidade de Coxim.

(SEMAC, 1992; Santos e Crepani, 1993). A maior parte da superfície da bacia do

Alto Taquari está localizada no estado de Mato Grosso do Sul (86,5%) e o

restante em Mato Grosso (Galdino et. al., 2006).

Esta bacia é conhecida pela grande quantidade de peixes existentes em

seus cursos d’água. Este fato se deve ao fenômeno da subida de cardumes

migratórios que usam parte da bacia como área de reprodução (Resende et al.,

1995). Entretanto, dados recentes mostram acentuada queda da produção

pesqueira nessa bacia, pois o aumento do aporte de material em suspensão nos

corpos d’água, fato amplamente documentado na bacia, é prejudicial à qualidade

da água e às comunidades aquáticas em dois aspectos: por assorear o leito do

rio, o que influi na mobilidade e dinâmica do fundo do seu leito, e, principalmente,

por alterar as características físicas e químicas da água.

A bacia hidrográfica do rio Taquari (BHT), pela sua extensão territorial (84

mil km), posição geográfica estratégica em relação à planície, características

geológicas, pedológicas, edafo-climáticas e socioeconômicas, exerce grande

influência na conservação do Pantanal (Brasil, 1997b). Isso a caracteriza como

uma das mais importantes bacias hidrográficas da bacia do Alto Paraguai-BAP.

5

Devido à pesca esportiva e comercial, a ictiofauna possui grande

importância socioeconômica para o estado do Mato Grosso do Sul (MS),

principalmente dentro da BAP (Resende, 1988). No Pantanal, foram identificadas

mais de 260 espécies de peixes (Britski et al., 1999). A maioria dessas espécies

certamente ocorre na BAT, dada a sua dimensão e falta de barreiras que

impeçam a livre dispersão.

Além da divisão geopolítica, a BAT também pode ser dividida em sub-

bacias. Galdino et al. (2006) dividiram a BAT em quatro sub-bacias: sub-bacia do

rio Taquari, compreendendo a área de drenagem do rio Taquari a montante da

confluência com o seu principal afluente, o rio Coxim; sub-bacia do rio Coxim,

com seção de controle a montante do seu mais importante tributário, o rio Jauru;

sub-bacias são as do rio Jauru e do Taquari-Mirim.

Os principais cursos de água que cortam o município de Coxim Mato no

Grosso do sul são os rios Taquari, Taquari-mirim e Jaurú, além dos córregos do

Onça, Sítio, Fortaleza e Criminoso. O córrego do Onça se situa ao norte do

estado de Mato Grosso do sul, no município de Coxim, no distrito de Silviolândia.

Trata-se de um dos afluentes da margem esquerda do rio Taquari, percorrendo

uma extensão de aproximadamente 35 km inteiramente no município, com sua

nascente próxima ao distrito de Jaurú, do lado direito da Cadeia de Serras de

Maracajú. O referido córrego, cuja largura não ultrapassa 11 metros desde sua

nascente até a foz, em toda a sua extensão, apresenta uma área plana e recebe

muitos sedimentos provenientes de trechos superiores formados por morros e

colinas de onde provêem seus poucos e pequenos tributários. Apresenta águas

ligeiramente turvas, mesmo na ausência de chuva, sendo que os sedimentos de

fundo variam entre rochoso, pedregoso, cascalho e arenoso com maior

predominância de areia. Não apresenta corredeiras intensas, alternando trechos

com velocidade de pouca intensidade e remansos com deposição de sedimentos

como matéria orgânica em decomposição em fundos lodosos, onde há menor teor

de oxigênio dissolvido (Galdino et al.,2006).

2.2. Peixes neotropicais: características gerais e citogenéticas

A fauna neotropical de peixes de água-doce é consideravelmente rica,

porém nenhum levantamento completo está ainda disponível para estudos

6

quantitativos. Os levantamentos ictiofaunísticos realizados na bacia do rio Paraná,

assim como nas outras bacias hidrográficas brasileiras, ainda estão incompletos

(Agostinho e Júlio Jr., 1999).

Os peixes, comparados aos demais grupos de vertebrados, apresentam

poucos dados sobre a sistemática, evolução, ecologia, fisiologia e genética

(Centofante, 2003). Uma das principais razões para essa carência é o elevado

número de espécies, que chega a cerca de 24.600 (Nelson, 1994), o que

equivale, aproximadamente, ao número de espécies dos demais vertebrados

juntos. Além disso, o habitat desses peixes dificulta seu estudo quando levado em

conta a captura, observação e determinação dos padrões biológicos (Bohlke et.

al, 1978). Por outro lado, os peixes constituem um grupo bastante favorável ao

estudo citogenético e evolutivo, uma vez que ocupam uma posição basal na

filogenia dos vertebrados (Nelson, 1994).

Estudos citogenéticos em peixes neotropicais iniciaram-se, na década de

60, por pesquisadores europeus e, no início da década de 70, por pesquisadores

brasileiros, com publicações para duas populações de Astyanax. (Jim e Toledo,

1975), seguido por Pimelodidae (Toledo; Ferrari, 1976), Cichlidae e Loricariidae

(Michele et al.,1977a, b) respectivamente (Artoni et al., 2000).

Na América do Sul, de acordo com Bolhke et al. (1978), existe cerca de

2500 a 3000 espécies de peixes de água doce, podendo chegar a 5000. Esta,

juntamente com a América Central, representam uma das mais diversificadas e

ricas ictiofaunas do mundo, englobando aproximadamente 8000 espécies

descritas, representando aproximadamente 25% de toda a diversidade de peixes.

Na região neotropical de água doce, as duas ordens mais representativas

em número de espécies conhecidas são os Characiformes e os Siluriformes

(Artoni et al., 2001), sendo que, estudos desenvolvidos em citogenética de peixes

brasileiros concentram-se basicamente nessas duas ordens. Estas análises têm

levado à caracterização do número cromossômico e do cariótipo de muitas

espécies, levantado uma considerável soma de informações relativas à presença

e distribuição da heterocromatina constitutiva e das regiões organizadoras de

nucléolo (Ag-NORs). Estes estudos constituem uma importante ferramenta na

abordagem de questões evolutivas, sistemáticas, além de estudos de

polimorfismo e poliploidia cromossômica (Araújo et al., 1998). A análise

citotaxonômica tem trazido uma grande contribuição ao estudo da evolução,

7

principalmente pelo fato de que os cromossomos constituem o próprio material

genético e, portanto, alterações desses parâmetros são quase sempre

significativas para o rumo evolutivo das espécies (Guerra, 1988).

Os dados sobre a estrutura cariotípica dos peixes neotropicais de águas

continentais foram revistos pela primeira vez por Almeida-Toledo (1978), que

listou o número cromossômico haplóide e/ou diplóide de 252 espécies de água

doce da América do Sul e Central. Oliveira et al. (1988) verificaram a presença de dados citogenéticos de 433 espécies. Uma revisão mais recente mostrou

números diplóides e/ou haplóides para 921 espécies distribuídos em 252 gêneros

e 44 famílias, com registro de grande diversidade cariotípica (Oliveira et al., 2000).

Nos últimos anos, devido basicamente à utilização de novas técnicas de

análises cromossômicas, a citogenética apresentou um razoável desenvolvimento

que possibilitou uma contribuição mais efetiva não só para os estudos

filogenéticos e taxonômicos, como, também, uma maior compreensão da

estrutura cromossômica dos peixes (Andreatta,1991).

2.2.1. Família Loricariidae

A família Loricariidae, pertencente à ordem Siluriformes, apresenta cerca

de 600 espécies, 70 gêneros, distribuídos em 7 subfamílias. (Isbrucker, 1980;

Burguess, 1989; Armbruster, 2004),

Os loricarídeos são popularmente conhecidos por "cascudos" devido à

couraça que recobrem seus corpos, sendo estas pequenas placas ósseas

adaptadas, em forma de escamas,0 que recobrem o corpo com várias fileiras (de

três a quatro), e lhes conferem aparência visual e sensação tátil de uma lixa. Essa

"armadura" geralmente recobre apenas a região dorsal deixando a região ventral

lisa (Britski, 2007).

Dentro da ordem Siluriforme, a superfamília Loricariodea é considerada

um grupo monofilético, cujo relacionamento é bem determinado, (de Pinna, 1998;

Britto, 2003) e estão incluídas as famílias: Loricariidae, Astroblepidae,

Scoloplacidae, Callichthyidae, Trichomycteridae e Nematogenyidae (Schaefer,

1991). A família Loricariidae apresenta cerca de 690 espécies e estava, até então,

dividida em seis subfamílias (Reis et al., 2003): Hypoptomatinae, Loricariinae Hypostominae, Ancistrinae, Neoplescotominae e Lithogeninae. Mais

8

recentemente, Armbruster (2004) incluiu os Ancistrinae dentro dos Hypostominae,

totalizando, então, cinco subfamílias dentro da família Loricariidae. A nova

subfamília Hypostominae passou a ser composta por cinco tribos: Hypostomini,

Pterygoplichithini, Corymbophanini, Ancistrini e Rhinelepini.

A família Loricariidae, embora componha uma das maiores famílias de

peixes do mundo, com aproximadamente 683 espécies distribuídas na região

neotropical (Reis et al., 2003) e com maior número de relatos citogenéticos, é

pouco estudada devido ao grande número de espécies que possui. Dentro desta

família, a subfamília Hypostominae é a mais estudada do ponto de vista

citogenético, com aproximadamente 53 espécies, seguida pela subfamília

Loricariinae, com aproximadamente 19 espécies (Alves et al., 2003).

Do ponto de vista citogenético, a família Loricariidae se caracteriza por

apresentar uma ampla variação no número diplóide, de 2n=36 cromossomos para

Rineloricaria latirostris (Giuliano-Caetano, 1998), chegando a 2n=96

cromossomos para Upsilodus sp. (Kavalco et al., 2005). A presença de

cromossomos sexuais do tipo XX/XY e ZZ/ZW, ocorrência de cromossomos B

(supranumerários) e grande diversidade cariotípica devido a rearranjos

cromossômicos (rearranjos Robertsonianos e inversões pericêntricas) fazem

desta família um material extremamente rico do ponto de vista citogenético

(Giuliano-Caetano, 1998).

Para a região do Pantanal, estudos citogenéticos na família Loricariidae

estão restritos ao gênero Otocinclus: Otocinclus vittatuso (rio Taquari, Coxim,

MS), Liposarcus anisitsi (rio Miranda, Mato Grosso do Sul) e no rio Araguaia, Mato

Grosso, onde foram analisados Hemiancistrus sp, Panaque cf. nigrilineatus,

Hypostomus emarginatus, Hypostomus sp G, Hypostomus sp, e Sturisoma cf.

nigrirostrum (Alves, 2005).

2.2.2. Subfamília Loricariinae

A principal característica dos loricariíneos é o achatamento do corpo. As

placas ao longo da linha lateral formam duas quilhas paralelas na porção anterior

do corpo que vão se aproximando progressivamente para trás, até se unirem

formando uma quilha única sobre o pedúnculo caudal.

9

Isbrücker (1979) listou 27 gêneros para Loricariinae, descrevendo oito

novos gêneros, com quatro tribos e oito subtribos, através de dados morfológicos,

sem interfaces filogenéticas. Estas incluem: 1) Loricariini, com seis subtribos

(Loricariina, Planiloricariina, Reganellina, Rineloricariina, Loricariichthyina e

Hemiodontichthyina), 2) Harttiini, incluindo duas subtribos (Harttiina e

Metaloricaria), 3) Farlowellini; e, finalmente, 4) Acestridiini.

De acordo com a base de dados on line Fish Base, o gênero Loricaria

passou por alterações quanto à classificação taxonômica de algumas espécies

inseridas nesse gênero. O número de 112 nomes científicos no grupo foi reduzido

para apenas 14 espécies validas. Assim, as espécies registradas como L.

carinata, L. parva, L. prolixa, L. macrodon passaram a ser denominadas de

Loricaria cataphracta, Loricaria cataphracta, Rineloricaria parva, Proloricaria

prolixa e Brochiloricaria macrodon, respectivamente.

Estudos citogenéticos têm sido relatados para os loricarideos com

informações nas subfamílias Loricariinae (Scavone e Júlio Jr., 1994; Giuliano-

Caetano, 1998; Artoni e Bertollo, 2001), Hypoptopomatinae (Andreata et al., 1992;

Andreata et al., 1993; Andreata et al., 1994), Hypostominae (Artoni et al., 1998;

Artoni et al., 1999; Artoni e Bertollo, 1996, 1999, 2001; Lara-Kamei e Júlio Jr.,

2002), Ancistrinae ( Lara, 1998; Artoni e Bertollo, 2001) e Neoplecostominae

(Alves, 2000; Kavalco, et al., 2005). Estes estudos têm mostrado uma ampla

variabilidade cariotípica em Hypostominae e Loricariinae, diferente de

Neoplecostominae e Hypoptomatinae, que apresentam, aparentemente, uma

estrutura mais conservada (Alves, 2005).

Na subfamília Loricariinae, apenas exemplares dos gêneros Harttia,

Loricaria, Loricariichthys, Rineloricaria e Sturisoma foram analisados

citogeneticamente e não existem dados citogenéticos nem moleculares para a

maioria das espécies da subfamília (Artoni e Bertollo, 1996; Alves, 2005). Uma

ampla variação no número diplóide tem sido observada com 2n= 36 cromossomos

em Rineloricaria latirostris (Giuliano-Caetano, 1998) a 2n=74 cromossomos para

Sturisoma cf. nigrirostrum (Artoni, 2001). A variabilidade cariotípica observada na

subfamília tem sido atribuída a rearranjos cromossômicos do tipo fusões-fissões

cêntricas, bem como de inversões, os quais têm desempenhado importante papel

na evolução (Alves, 2005).

10

Com relação às regiões organizadoras de nucléolo, na maioria das

espécies da subfamília Loricariinae, estão localizadas na região terminal, exceto

para duas espécies de Harttia que apresentam NOR intersticial. Portanto, NOR

simples tem sido considerada como uma característica primitiva dentro do grupo

(Artoni e Bertollo, 2001; Alves et al., 2003). Enquanto esta região tem se mantido

mais conservada, estudos que evidenciam a heterocromatina constitutiva têm

indicado diferentes caminhos evolutivos, com gêneros onde se observa poucos

blocos heterocromáticos e outros com blocos mais conspícuos e distribuídos em

vários pares de cromossomos.

11

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Material

Os exemplares de Pyxiloricaria menezesi, Loricaria sp. e Sturisoma

robustum foram coletados no córrego do Onça, afluente do rio Taquari, localizado

no município de Coxim, MS. Os exemplares da espécie Farlowella amazona

foram coletados no córrego do Ribeirão, do rio Taquari. As espécies analisadas, de acordo com Britski, 2007, apresentam a

seguinte posição taxonômica:

Classe: Osteichthyes Ordem: Siluriformes Família: Loricariidade Subfamília: Loricariinae Gênero: Farlowella Espécie:Farlowella amazona

Classe: Osteichthyes Ordem: Siluriformes Família: Loricariidade Subfamília: Loricariinae Gênero: Pyxiloricaria Espécie: Pyxiloricaria menezes

Classe: Osteichthyes Ordem: Siluriformes Família: Loricariidade Subfamília: Loricariinae Gênero: Loricaria sp Espécie: Loricaria sp.

Classe: Osteichthyes Ordem: Siluriformes Família: Loricariidade Subfamília: Loricariinae Gênero: Sturisoma Espécie: Sturisoma robustum

12

3.2. Métodos

3.2.1. Análises citogenéticas

3.2.1.1. Preparação de cromossomos mitóticos

As preparações do material para análise dos cromossomos mitóticos foram

feitas utilizando-se a porção cefálica do rim, de acordo com a técnica “air drying”,

modificada para peixe por Bertollo et al. (1978).

3.2.1.1.1. Estimulação de metáfases

Para obtenção de maior número de mitoses, foi utilizada a técnica de

estimulação celular através da injeção de uma solução de fermento biológico,

descrita inicialmente por Cole e Leavens (1971) para anfíbios e répteis, utilizada

por Lee e Elder (1980) para pequenos mamíferos e, posteriormente, por Oliveira

et al. (1988) para peixes. O procedimento utilizado foi o seguinte:

1. Preparou-se uma solução de fermento biológico (Fleischmann) na seguinte

proporção: 0,5g de fermento, 0,5g de açúcar e 7ml de água destilada.

2. Incubou-se a solução em banho-maria (40°C) por cerca de 20 minutos.

3. Injetou-se a solução dorso-lateralmente no peixe na proporção de 1ml por 100g

de peso do animal.

4. Deixou-se o animal em aquário bem aerado por 48 ou 72horas.

3.2.1.1.2. Técnica air drying

Esta técnica desenvolvida por Bertollo et al. (1978) consiste em:

1. Injetar intraperitonialmente solução aquosa de colchicina (0,0025%) na

proporção de 1 ml/100g do peso do animal.

2. Deixar o peixe em aquário bem aerado por 30 a 60 minutos, sacrificando-o e

retirando os órgãos desejados.

3. Lavar rapidamente os fragmentos dos órgãos em solução hipotônica de KCl

(0,075), em uma cuba de vidro.

4. Transferir o material rapidamente para outra cuba de vidro, contendo 8 a 10 ml

de solução hipotônica (KCl a 0,075M).

13

5. Dissociar muito bem o material com o auxílio de pinças de dissecação e, em

seguida, com uma seringa hipodérmica desprovida de agulha, suspender o

material, por meio de movimentos suaves de aspiração e expiração.

6. Logo após, colocar a solução celular obtida em estufa à temperatura de 36-

37°C, por um período de 30 minutos.

7. Ressuspender o material com o auxílio de uma pipeta Pasteur e transferi-lo

para um tubo de centrífuga, descartando os pedaços de tecidos não desfeitos.

8. Centrifugar durante 10 minutos a 900 rpm.

9. Descartar o sobrenadante com pipeta Pasteur e adicionar, vagarosamente, 5 a

6 ml de fixador (3 partes de álcool metílico: 1 parte de ácido acético) recém

preparado.

10. Resuspender o material cuidadosamente com pipeta Pasteur.

11. Repetir os itens 8 a 10 por mais 2 vezes. Após a última centrifugação, eliminar

o sobrenadante e adicionar 1 ml de fixador, resuspender o material, guardando-o

em refrigerador por um período aproximado de um mês, acondicionando-os em

pequenos frascos tipo “Ependorff”. Caso seja guardado em freezer, a suspensão

terá uma durabilidade bem maior, desde que o fixador seja renovado a cada 60

dias em média, ou então pode ser trabalhado conforme segue:

12. Pingar 3 a 4 gotas da suspensão celular em regiões de uma lâmina

previamente limpa guardada em álcool etílico. Deixar secar diretamente ao ar.

13. Corar com Giemsa diluído a 5% em tampão fosfato pH 6,8, durante 5 minutos.

14. Lavar em água corrente e secar ao ar.

3.2. Bandamentos cromossômicos

3.2.1. Estudo da região organizadora do nucléolo

3.2.1.1. Técnica de nitrato de prata (AgNOR)

Esta técnica desenvolvida por Howell e Black (1980) consiste em:

1. De posse da lâmina já contendo o material para análise, hidrolisar por 3

minutos em HCl 1N a 60°C, em estufa.

2. Lavar em água corrente e secar ao ar.

14

3. Pingar uma gota de solução aquosa de gelatina em dois pontos distintos da

lâmina, sobre estas gotas adicionar uma gota de água deionizada.

4. Adicionar sobre as gotas anteriores, duas gotas de solução de nitrato de prata

(AgNO3), e cobrir a lâmina com lamínula.

5. Incubar em estufa a 60°C por um período de 3-5 minutos, ou até que a solução

adquira uma coloração caramelada.

6. Lavar em água corrente, secar ao ar e analisar em microscópio.

3.2.2.2. Cromomicina a3 e mitramicina a (GC-específicos)

Foi empregado o método descrito por Schweizer (1980) e modificado por Schmid (1980) e Galetti Jr. e Rasch (1993):

1. Sobre a lâmina, preparada segundo a técnica descrita para cromossomos

mitóticos, colocar 150µl de solução de distamicina A recém preparada, utilizando-

se uma micropipeta.

2. Cobrir com uma lamínula e deixar agindo por 15 minutos em temperatura

ambiente.

3. Lavar a lâmina com tampão McIlvaine (ou água corrente) de modo que a

lamínula deslize e saia da lâmina e deixar secar por poucos minutos.

4. Colocar sobre a lâmina 150 µl da solução de cromomicina A3 ou mitramicina

A, com o auxílio de uma micropipeta, sobre a lâmina. Cobri-la novamente com

uma lamínula e deixar corando por 60 minutos, no escuro, a temperatura

ambiente.

5. Repetir o item 3.

6. Montá-la com uma lamínula, utilizando duas gotas de solução de sacarose

saturada e previamente filtrada.

7. Estocar a lâmina à temperatura ambiente ou na geladeira, no escuro, por no

mínimo 30 dias antes de analisá-la (para prolongar o tempo de emissão de

fluorescência desses corantes).

8. Analisar em fotomicroscópio de fluorescência, com filtro de 450-490 nm (zona

de excitação do azul).

15

3.2.3. Estudo da heterocromatina constitutiva

3.2.3.1. Bandamento C

Esta técnica desenvolvida por Summer (1972) consiste em:

1. Tratar a lâmina já contendo as gotas do material para análise, com HCl em

temperatura ambiente em estufa, por 15 minutos.

2. Lavar a lâmina em água corrente e secar ao ar.

3. Incubar em solução salina de 2xSSC, a 60°C em banho-maria por 15 minutos.

4. Lavar em água corrente e secar ao ar.

5. Incubar a lâmina por 30 segundos em solução de hidróxido de bário (BaOH),em

banho-maria a 42°C, com o BaOH, sendo recém preparado e filtrado.

6. Lavar a lâmina rapidamente em solução de HCl e depois em água deionizável e

deixar secar ao ar.

7. Incubar a lâmina em solução salina de 2xSSC a 60°C por 1 hora.

8. Lavar em água corrente e secar ao ar.

9. Corar com Giemsa 5% durante 5-10 minutos.

10. Lavar em água corrente, secar ao ar e analisar a lâmina em microscópio.

3.2.4. Medidas cromossômicas

Os cromossomos tiveram sua morfologia estabelecida de acordo com a

relação de braços (RB), segundo as proporções propostas por Levan et al. (1964)

e classificados em: metacêntricos (RB de 1,00 a 1,70), submetacêntricos (RB de

1,71 a 3,00), subtelocêntrico (RB de 3,01 a 7,00) e acrocêntricos (RB maior que

7,00).

O método utilizado para realizar as medidas cromossômicas foi o seguinte:

1. Copiar todas as metáfases a serem analisadas na mesma escala.

2. Fazer uma fotocópia ampliada de cada metáfase, também na mesma escala.

3. Numerar os cromossomos na fotocópia.

4. Delimitar o centrômero e traçar uma linha mediana no interior de cada

cromátide.

16

5. Medir o comprimento de cada linha mediana com um paquímetro e calcular o

tamanho do braço maior e do braço menor, calcular o comprimento total e a

relação de braços de cada cromossomo.

6. Calcular o número de cromossomos metacêntricos, submetacêntricos,

subtelocêntrico e acrocêntrico de cada metáfase.

7. Repetir os itens de 3 a 6 até que o valor de cada tipo cromossômico (m, sm, st,

a) apresente um valor modal nítido.

8. Recortar os cromossomos das fotografias e numerá-los da mesma forma que

nas fotocópias.

9. Montar preliminarmente os cariótipos de acordo com as categorias

cromossômicas encontradas.

10. Quando padronizados todos os cariótipos, calcular os valores médios do braço

maior (BM), braço menor (Bm), comprimento total (CT), comprimento relativo

(CR), e relação de braços (RB), de cada par cromossômico.

17

Figura 1 - Foto ilustrativa do córrego do Onça onde foram coletados os exemplares de Pyxiloricaria menezesi, Sturisoma robustum e Loricaria sp.

Figura 2 - Foto ilustrativa do córrego do Ribeirão de onde foram coletados os exemplares de Farlowella amazona.

18

Figura 3 - Mapa esquemático do córrego da Onça de onde foram coletados os exemplares de Sturisoma robustum, Loricaria sp. e Pyxiloricaria menezesi.

Figura 4 - Mapa esquemático do córrego do Ribeirão de onde foram coletados os exemplares de Farlowella amazona.

19

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

No presente trabalho, foram citogeneticamente analisados exemplares de

quatro espécies pertencentes a quatro gêneros da subfamília Loricariinae:

Farlowella amazona, Sturisoma robustum, Pyxiloricaria menezese, e Loricaria sp. O Quadro 1 mostra dados citogenéticos de número diplóide, fórmula cariotípica,

número fundamental e bandamentos NOR, C e CMA3 para as espécies

analisadas, bem como de outras espécies da subfamília Loricariinae, indicando

uma variação de número diplóide com 2n=36 cromossomos em Rineloricaria

latirostris a 2n=74 cromossomos em Sturisoma nigrirostrum. Esta ampla variação

cariotípica é característica da família Loricariidae, uma das mais complexas da

ictiofauna neotropical (Artoni e Bertollo, 1996; Alves et al., 2003).

A análise cariotípica de oito exemplares de F. amazona, quatro

exemplares fêmeas e quatro machos, revelou a presença de número diplóide de

2n=58 cromossomos, fórmula cariotípica com 18m+20sm+12st+8a, número

fundamental (NF) igual a 96 (Figura 5) e ausência de mecanismo de

cromossomos sexual. A região subterminal do braço longo do par número 26

(acrocêntrico grande) apresentou uma constrição secundária bem evidente, com

heteromorfismo de tamanho entre os homólogos (Figura 5).

A análise das regiões organizadoras nucleolares (NORs) de F. amazona

pela técnica de nitrato de prata revelou a presença de marcação em dois pares de

cromossomos, evidenciando, portanto, um sistema de NOR múltipla (Figura 6a e

6c). O par 26, organizador nucleolar principal, com marcação coincidente com a

constrição secundária, e um cromossomo acrocêntrico, provavelmente o par 27,

com a AgNOR na região terminal do braço curto. Um polimorfismo de NOR

parece estar presente no par 26, no qual se observa AgNOR subterminal em um

dos homólogos e terminal no outro.

Para a maioria das espécies de Loricariinae, as NORs estão localizadas

em posição terminal em um único par de cromossomos. Portanto, a condição de

NOR múltipla e em região intersticial, observada em F. amazona, caracteriza uma

condição derivada na subfamília. Entre as espécies de Loricariinae, NOR múltipla

tem sido encontrada em F. amazona e em uma população de Rineloricaria

pentamaculata do córrego Tatupeba pertencente à bacia do rio Paraná (Quadro

20

1). NORs intersticiais foram observadas no gênero Harttia (H. kronei, H. carvalhoi

e Harttia sp).

A análise de onze exemplares de Sturisoma robustum (cinco fêmeas, seis

machos) revelou a presença de 2n=66 cromossomos, sendo a fórmula cariotípica

18m+22sm+10st+16a, NF=116 (Figura 7a). A coloração pela prata mostrou

marcação de um único par organizador nucleolar, com marcação em todo o braço

curto do par de número 21 (Figura 8a). Sturisoma cf. nigrirostrum do rio Araguaia,

Mato Grosso, Brasil, é a espécie com maior número diplóide dentro da família

(2n= 74 cromossomos (Artoni e Bertollo, 2001) e difere em relação número

diplóide de S. robustum. Esta diferença pode ser observada principalmente no

número de subtelo-acrocêntrico (36 e 26, respectivamente, conforme Quadro 1), o

que nos permite inferir que rearranjos do tipo fissões cêntricas estiveram

presentes durante o processo de diversificação das espécies do grupo.

Farlowella amazona e H. kronei apresentam o mesmo número diplóide

(2n=58) com muitos cromossomos meta e submetacêntricos. Contudo, diferem

em relação à constituição cariotípica, especialmente no que se refere ao número

de cromossomos st/a (Quadro 1). Para H. loricariformis foram observados dois

números diplóides diferentes (Quadro 1), sendo 2n=52 cromossomos para a

população do rio Grande (Alves, 2000) e 2n=56 para população do rio Paraíba do

Sul (Kavalco et al., 2004). Outros representantes de Loricariinae analisados

citogeneticamente apresentam um número grande de cromossomos subtelo-

acrocênticos, Loricaria, Pyxiloricaria, Proloricaria e Rineloricaria (Quadro 1), o

oposto de Farlowella e Harttia, que dentro da subfamília são os que apresentam

os menores números de subtelo-acrocêntricos (20 e 16, respectivamente).

Contudo, as espécies do gênero Sturisoma analisadas citogeneticamente

(Sturisoma cf nigrirostrum e S. robustum) apresentam número de cromossomos

acrocêntricos intermediários entre Farlowella e Harttia e os demais Loricariinae.

Portanto, o gênero Farlowella parece estar mais relacionado cariotipicamente aos

gêneros Harttia e Sturissoma dentro da subfamília, indicando estarem mais

próximos evolutivamente, constituindo a tribo Hartiini, como proposto por Covain e

Fisch-Muller (2007) em estudos morfológicos (Quadro 2).

Montoya-Burgos et al. (1998), por meio de dados moleculares,

demonstraram que Harttia é grupo irmão para dois clados, sendo o primeiro

consistindo de Farlowella e Sturisoma, dois representantes de Harttiini, e o

21

segundo incluindo os representantes dos Loricariini. Os dados citogenéticos de

número diplóide e de cromossomos subtelo-acrocêntricos corroboram esta

proposição, além de inferir que o gênero Loricaria pode estar mais próximo dos

representantes de Harttiini do que os demais integrantes da tribo Loricariini.

O padrão de banda C (Figura 6b e 6d) em Farlowella amazona mostrou

presença de heterocromatina centromérica na maioria dos cromossomos e seis

pares marcadores com bandas intersticiais e/ou proximal ao centrômero

presentes no braço longo dos pares 11, 12, 20, 23, 26 e proximal ao centrômero e

telomérica no braço longo do par 27. O gênero Harttia apresenta um baixo

conteúdo de heterocromatina constitutiva, sem regiões de bandas C conspícuas,

exceto para o braço longo do quarto par de metacêntrico em H. carvalhoi e na

região telomérica do braço longo dos pares 1 e 25 de H. loricariformis. Estes

dados comparados com o do presente estudo evidenciam que uma variabilidade

estrutural dos cromossomos nestes dois gêneros foi acompanhada pela

diversidade do padrão de heterocromatina nestes gêneros.

Em relação aos demais gêneros do grupo, estes resultados são

consistentes com a proposição de Artoni e Bertollo (2001) e apontam uma grande

diversidade em quantidade de heterocromatina entre os Loricaridae.

O padrão de bandamento C em Sturisoma robustum revelou a presença

de poucos blocos de heterocromatina constitutiva (Figura 8b), com marcação na

região pericentromérica de alguns pares cromossômicos e a região da NOR

apresentou Banda C positiva.

O gênero Loricaria tem sido revisado quanto à classificação taxonômica

de algumas espécies inseridas nesse gênero. O número de 112 nomes científicos

no grupo foi reduzido para apenas 14 espécies válidas (Fish base, 2008). Assim,

as espécies registradas como L. carinata, L. parva, L. prolixa, L. macrodon

passaram a ser denominadas de Loricaria cataphracta, Rineloricaria parva,

Proloricaria prolixa e Brochiloricaria macrodon, respectivamente. Desta forma,

poucas espécies foram estudadas citogeneticamente, com apenas L. cataphracta

(Roncati et al. 1999), espécie tipo, única espécie tipo válida analisada do ponto de

vista citogenético, com número diplóide definido (2n=64). Além desta, outras 2

espécies não denominadas de Loricarias sp. (Della-Rosa et al., 1980 e Oliveira et

al., 1998) tiveram número cromossômico, fórmula cariotípica, marcação AgNOR e

padrão de banda C determinados (Quadro 1). Loricaria sp. rio Jari e do rio

22

Solimões mostraram número diplóide diferente das demais (2n= 52 e 2n= 62,

respectivamente).

A análise de oito exemplares da espécie Loricaria sp. (cinco fêmeas, três

machos), revelou a presença de 2n=64 cromossomos, fórmula cariotípica 10m+

12sm+8st+2st+42a, NF= 84 e sem diferenças quanto ao sexo (Figura 9a). A NOR

revelou uma marcação intersticial no braço longo do par 11, bem evidente,

indicando assim um mecanismo de NOR simples (Figura 10a). O padrão de

bandamento C revelou a presença de pouca heterocromatina constitutiva com

marcação na região intersticial de um dos maiores cromossomos acrocêntricos

(Figura 10b), coincidente com a região da NOR e pericentromérica de alguns

cromossomos.

Loricaria sp. do rio Paraná, PR, e do córrego do Onça, MS, apresentaram

mesmo número diplóide, mas com fórmulas cariotípicas diferentes, mostrando um

grande número de cromossomos acrocêntricos (Quadro 1). Números de

cromossomos subtelo-acrocêntricos altos também podem ser observados entre

as espécies dos gêneros Pyxiloricaria, Proloricaria, Rineloricaria. Dadas estas

características, estes parecem constituir grupos derivados dentro da subfamília.

A análise de todas as espécies de Loricariidae cariotipadas até o presente

revela uma predominância de cromossomos do tipo acrocêntricos e número

diplóide alto, comum na referida família, principalmente nas espécies do gênero

Hypostomus, o gênero de maior variação em número diplóide (Alves, 2005). Outro

aspecto na família é o número diplóide inversamente proporcional ao número de

cromossomos metacêntricos (Artoni e Bertollo, 2001). A condição cariotípica de

número diplóide alto é considerada derivada nos representantes da ordem

Siluriformes, sendo então o gênero Hypostomus o mais derivado em termos

cariotípicos na família Loricariidae, seguido de Loricariinae (Oliveira e Gosztonyi,

2000).

Para a família, observou-se, ainda, a presença de cromossomos

supranumerários em Microlepdogaster leucofrenatus (Andreata et al., 1993),

polimorfismos cromossômicos numéricos em Rineloricaria latirostris (Giuliano-

Caetano, 1998) e presença de sistemas de determinação de sexo em

Microlepdogaster leucofrenatus (Andreata et al., 1993), Hypostomus sp. (Artoni et

al., 1998) e Harttia carvalhoi (Centofanti et al., 2006).

23

A análise de Pyxiloricaria menezesi (oito fêmeas e quatro machos)

revelou a presença de 2n=68 cromossomos, fórmula cariotípica com

8m+6sm+4st+50a, NF=86 e não houve diferenças quanto ao sexo (Figura 11a).

Em relação à subfamília, esta espécie mostrou alto número diplóide e de

cromossomos subtelo-acrocêntricos, portanto, mais próxima dos gêneros

Loricaria, Proloricaria e Rineloricaria. Schaefer (1987) e de Pinna (1998) têm

considerado a subfamília Loricariinae um grupo monofilético bem definido e

grupo-irmão das subfamílias Ancistrinae e Hypostominae. Pyxiloricaria é um

gênero monotípico (P. menezesi) e, na família, esta espécie é mais semelhante

aos Hypostominae, em especial ao gênero Hypostomus, por apresentar alto

número de cromossomos subtelo-acrocêntricos, bem como de número diplóide.

Entre os espécimes de Hypostomus analisados o número diplóide tem variado

entre 52 a 80 cromossomos e com variação de 26 a 62 de cromossomos do tipo

subtelo-acrocêntricos (Artoni e Bertollo, 2001).

Em Pyxiloricaria, o bandamento C mostrou marcações centroméricas e

pericentroméricas na maioria dos cromossomos e no braço curto do par de

número 9, sendo este também marcado pela prata (NOR banda C positiva)

(Figura 12a e 12b, respectivamente). Estes dados mostram uma quantidade de

heterocromatina semelhante ao observado em Farlowella analisada no presente

trabalho, bem como na maioria das espécies da subfamília.

A região organizadora do nucléolo (NOR) em Pyxiloricaria menezesi

mostrou marcação na região terminal do braço curto do par número nove (Figura

12a), coincidente com a contrição observada na análise de Giemsa deste par

(Figura 11a). Portanto, um sistema de NOR simples localizado na região terminal

do braço curto, como observado para a maioria das espécies da família. Segundo

Artoni (2001), esta é uma característica plesiomórfica entre os Loricarideos.

Pyxiloricaria e Loricaria apresentaram NOR simples, mas em Pyxiloricaria

esta se apresentou terminal e para Loricaria esta foi intersticial. Deve ser

ressaltada a semelhança entre os cariótipos de ambas as espécies, inclusive

apresentando mesmo NF, demonstrando assim serem próximas evolutivamente.

A maioria das espécies de Loricariinae analisados citogeneticamente até

o momento apresentou NOR simples na região terminal, mas NORs múltiplas já

foram encontradas para Rineloricaria pentamaculata (Errero-Porto, 2007) e NORs

simples e intersticiais foram encontradas em Harttia carvalhoi (Centofante et al.,

24

2006). No presente estudo foram encontradas NORs interesticiais e múltiplas no

gênero Farlowella (Quadro 1).

O gênero Farlowella, juntamente com o gênero Harttia, são

caracterizados por pouco número de cromossomos acrocêntricos (o menor em

Loricariinae), quatro pares somente e grande número de cromossomos meta e

submetacêntricos. Estes dados nos permite concluir a respeito de uma condição

mais conservada para o cariótipo de Farlowella, o que os aproxima da condição

basal dos Loricaridae. A bem da divergência de vários gêneros, a condição basal

do cariótipo de Farowella indica que o aumento do 2n e eventos de fissão

cêntricas, como proposto por Bertollo e Artoni (2001), devem ter desempenhado

um importante papel evolutivo entre os Loricariinae a exemplo do que ocorreu

com outros grupos de Loricaridae.

Uma possível estrutura cariotípica basal de Loricariidae tem sido sugerida

por Artoni e Bertollo (2001), analisando exemplares de Hypostomini, Ancistrinae,

Loricariinae e Hypoptopomatinae e por (Alves et al. (2003), pela análise de

exemplares de Neoplecostominae, propõem que o cariótipo seria composto por

2n=54 cromossomos, com NORs simples em posição subterminal e intersticial,

respectivamente, como sendo condição plesiomórfica para a família.

Portanto, a subfamília Loricariinae tem mostrado grande diversidade de

fórmula cariotípica caracterizando grupos de espécies de acordo com número de

cromossomos meta-submetacêntricos: a) aqueles com o maior destes

cromossomos (Farlowella e Harttia), b) outros nos quais estes tipos

cromossômicos são menores (Pyxiloricaria, Loricaria, Proloricaria, Rineloricaria e

Brochiloricaria), e c) aqueles com semelhança entre os cromossomos meta-

submetacêntricos e subtelo-acrocêntricos (Loricariichthys e Sturuisoma). Estes

dados, associados às diferenças de número diplóide, indicam tendências

evolutivas diferentes dentro desta subfamília e comprovam os dados do

dendograma proposto por Covain e Fish-Muller (2007), onde o primeiro grupo são

os mais basais, pertencentes à tribo Hartiini, e os dois últimos pertencentes à tribo

Loricariini, os quais são subdivididos em subgrupos morfológicos (Loricarichthys,

Rineloricaria, Loricaria e Pseudohemiodon). No dendograma, os Loricariichthys

são os mais basais dentro da tribo e, portanto, intermediários entre Hartiini e

Loricariini, indicando uma congruência entre os dados morfológicos e

citogenéticos (Quadro 2).

25

Alves (2005) resume que, possivelmente, podem ocorrer três tendências

evolutivas para o cariótipo basal de Loricariidae: uma levaria à manutenção das

condições basais, ou seja, 2n=54 cromossomos e Ag-NORs intersticiais (em

Neoplecostominae e Hypoptomatinae). Outra tendência levaria ao aumento do

número diplóide, seguido por um grande acréscimo de cromossomos

acrocêntricos, levando à evolução cariotípica por fissões cêntricas (Hypostominae

e Loricariinae), e finalmente, uma terceira tendência, que consideraria a

diminuição no número diplóide, com predominância de cromossomos meta e

submetacêntricos, sugerindo eventos de fusões cêntricas (também em

Hypostominae e Loricariinae). Com base nisso, durante sua evolução cariotípica

dos gêneros das subfamilia Loricariinae, os principais rearranjos foram os de

fusão e fissão. Os resultados obtidos no presente estudo indicam que

Pyxiloricaria, assim como Loricaria parecem constituir grupos derivados, pois

apresentam número diplóide alto e grande número de cromossomos

acrocêntricos.

A análise pela técnica do fluorocromo cromomicina CMA3 foi realizada

para as três espécies analisadas: Sturisoma robustum, Loricaria sp. e Pyxiloricaria

menezes. Mostrou marcação coincidente com a região da NOR, indicando ser

esta região rica em bases CG (Figura 8c, 10c, 12c respectivamente), enquanto os

demais blocos de banda C não mostraram marcação fluorescente, o que indica

uma constituição de bases diferentes entre a heterocromatina da região

organizadora do nucléolo e os de outras localidades. Em peixes NOR, CMA3 e

banda C positiva tem sido comum, com a maioria mostrando esta diferença na

composição de bases da banda C. Contudo isto não tem sido uma regra geral

(Artoni et al., 1996).

Estudos cariotípicos nos gênero Farlowella e Pyxiloricaria ainda não

haviam sido realizados até o presente trabalho e ainda são escassos os estudos

nos gêneros Loricaria e Sturisoma. No Pantanal, bioma de importância

indiscutível, onde os peixes desempenham papel fundamental no equilíbrio

ecológico do bioma, só há o relato de um trabalho na subfamília Loricariinae,

enfocando estudos citogenéticos, referente ao gênero Sturisoma da população do

rio Araguaia, estado de Mato Grosso.

26

Quadro 1 - Sumário, modificada de Alves (2005) da Subfamília Loricariinae. 2N = número, diplóide; m = metacêntrico; sm = submetacêntrico; st = subtelocêntrico; a = acrocêntrico, NF = número fundamental, NOR = Região organizadora do nucléolo, (NF# = M/SM= dois braços; ST/A = um braço)

ESPÉCIES LOCALIDADE 2N FÓRMULA CARIOTÍPICA

NF# NOR BANDA C REFERÊNCIAS

Brochiloricaria macrodon* - 58 18m+2sm+38ª,t 78 Michele, et al. (1977)

Farlowella amazona Córrego do Ribeirão, MS, Brasil 58 16m, 26sm, 8st, 8ª 90 2 C-CMA3 Presente trabalho

Harttia carvalhoi Rio Paraíba do Sul , SP, Brasil 52 53

18m,18sm,8st, 8a 19m, 18sm, 8st, 8a

88 90

1 C Centofante et al. 2006

H. kronei Rio Betari, SP, Brasil 58 40m/sm, 18st/a 98 1 - Alves et al. (2003)

H. loricariformis Rio Grande, SP, Brasil 52 32m/sm, 20st/a 84 - Alves et al. (2003)

H. loricariformis Rio Paraitinga , SP, Brasil 56 16m, 22sm, 10 st, 8a 94 - Kavalco et al. (2005)

Harttia sp. Rio Itabapoana, MG, Brasil 56 14sm, 42ª 70 Carneiro et al. (1998)

Loricaria cataphracta** Rio Paraná, Argentina 64 - - - - Roncati et al. (1999)

Loricaria sp. Rio Par aná, PR, Brasil 64 10m, 6sm, 4st, 44ª 80 1 C Scavone e Júlio Jr. (1995)

Loricaria sp. Rio Solimões, AM, Brasil 62 - - - - Della-Rosa et al. (1980)

Loricaria sp. Rio Jari, PA, Brasil 52 - - 1 C Oliveira et al. (1998)

Loricaria sp. Córrego da Onça, MS, Brasil 64 12m, 8sm, 2st, 42ª 84 1 C-CMA3 Presente trabalho

Loricariichthys sp. Rio Paraná, Argentina 54 6m, 26sm, 4st, 18ª 86 1 C Fenocchio (1993)

Loricariichthys sp. Rio Itabapoana, MG, Brasil 54 28m, 26ª 82 1 Carneiro et al. (1998)

L. platymetopom Rio Paraná, PR, Braszil 54 6m, 20sm, 4st, 24a 7m, 20sm, 4st, 23a

80 81

1 1

C C

Scavone e Júlio Jr. (1995)

L. platymetopom Rio Paraná, Posadas, Argentina 54 - - - - Roncati et al. (1999)

L. maculata

Rio Paraná, Posadas, Argentina 56 - - - - Roncati et al. (1999)

27

Quadro 1, Cont...

Pyxiloricaria menezesi Córrego da Onça, MS, Brasil 68 8m, 6sm, 4st, 50ª 82 1 C-CMA3 Presente trabalho

Proloricaria prolixa*** Rio Paraná, PR, Brasil 62 20m, 4sm, 38ª 86 1 C Scavone e Júlio Jr. (1995)

Rineloricaria. Cadeae Rio Guaíba, RS, Brasil 66 2m, 64 st /a 68 1 Alves et al. (2003)

R. kronei Rio Itapocu, SC, Brasil 64 6m/sm, 58st/a 70 1 Alves et al. (2003)

R. latirostris Rio Mogi-Guaçu, SP, Brasil 36-40 24m/sm,12st/a 20m/sm, 20st/a

- 1 C, CMA3, DAPI Giuliano-Caetano (1998)

R. latirostris Rio Três Bocas, PR, Brasil 43-48 17m,sm, 36st/a - 1 C, CMA3, DAPI Giuliano-Caetano (1998)

R. latirostris Rio Passa-Cinco, SP, Brasil 44-47 16m/sm, 28st,a 13m/sm, 34st,a

- 1 C, CMA3, DAPI Giuliano-Caetano (1998)

Rineloricaria parva**** - 48 - - - Gyldenholm e Schell (1971)

R. pentamaculata Rio Keller, PR, Brasil 56 8m/sm, 48st/a 64 1 C, Giuliano-Caetano (1998);

R. pentamaculata Rio Keller, PR Brasil, Rio Tatupeba, PR, Brasil Rio Tauá, PR, Brasil

56 56 56 56

8m/sm+48st/a 8m/sm+48st/a 8m/sm+48st/a 9m/sm+47st/a

64 64 64 65

1 2 1 1

C, CMA3 C, CMA3 C, CMA3 C, CMA3

Errero-Porto (2007)

Rineloricaria n. sp. Rio Betari, SP, Brasil 70 2sm, 68ª 1 - Alves et al. (2003)

Rineloricaria n. sp. Rio vermelho 50 10m,6sm,2st,32a - - - Alves (2005)

Sturisoma cf. nigrirostrum Rio Araguaia, MG, Brasil 74 20m, 18sm, 36st/ a - - Artoni e Bertollo (2001)

Sturisoma robustum Córrego da Onça, MS, Brasil 66 18m, 22sm,10st,16a 106 1 C-CMA3 Presente trabalho

* Citação Loricaria macrodon ** Citação Loricaria carinata *** Citação Loricaria prolixa **** Citação Loricaria parva

28

Quadro 2 - Dendograma, construído por Covain e Fisch-Muller (2007), por

meio da matriz de distância morfológica para o grupo Loricariinae

29

Figura 5 - Cariótipo de Farlowella amazona submetido à coloração com Giemsa.

Figura 6 - A) Metáfase somática, indicando as regiões organizadoras do nucléolo, com impregnação pelo nitrato de prata - AgNOR; B) Metáfase completa indicando os blocos de heterocromatina constitutiva pela técnica de banda C; C) Cromossomos marcados pelo nitrato de prata, indicando a região organizadora do nucléolo; D) Pares de cromossomos mostrando os blocos heterocromáticos.

30

Figura 7 - Cariótipo de Sturisoma robustum submetido à coloração com Giemsa.

Figura 8 - Metáfase somática de Sturisoma robustum, em a) Regiões organizadoras do nucléolo, com impregnação pelo nitrato de prata - AgNOR; b) Banda C e c) Coloração de CMA3.

31

Figura 9 - Cariótipo de Loricaria sp. submetido à coloração com Giemsa.

Figura 10 - Metáfase somática de Loricaria sp. em a) Regiões organizadoras do nucléolo com impregnação pelo nitrato de prata - AgNOR; b) Banda C e c) Coloração de CMA3.

32

Figura 11 - Cariótipo de Pyxiloricaria menezesi submetido à coloração com Giemsa.

Figura 12 - Metáfase somática de Pyxiloricaria menezesi em a) Regiões organizadoras do nucléolo com impregnação pelo nitrato de prata - AgNOR; b) Banda C e d) Coloração de CMA3.

33

5. CONCLUSÕES

a) A análise dos exemplares de Falorwella amazona, Pyxiloricaria menezesi, Sturisoma robustum e Loricaria sp., revelaram, como esperado, uma ampla

variação cariotípica variando de 2n=58 a 2n=68 cromossomos, como também

observado nas espécies já cariotipadas para a subfamília Loricariinae.

b) A fórmula cariotípica nas espécies analisadas mostrou muitos cromossomos

meta-submetacêntricos em Farlowella amazona e muitos cromossomos subtelo-

acrocêntricos em Loricaria sp. Em Pyxiloricaria menezesi e em Sturisoma

robustum, o número de meta-submetacêntrico e subtelo-acrocentrico mostrou-se

equilibrado, indicando diferenças em relação à ocorrência de mecanismos de

rearranjos cromossômicos durante os caminhos evolutivos dos diferentes grupos

em Loricariinae.

c) A análise das regiões organizadoras do nucléolo, detectadas pela impregnação

de nitrato de prata, indicaram marcações simples para a maioria das espécies já

analisadas, sendo esta considerada primitiva dentro da subfamília, exceto para

Farlowella amazona e Rineloricaria pentamaculata que apresentam marcação

múltipla na subfamília.

d) Observando as regiões ricas em heterocromatina constitutiva, por meio de

bandamento C, é possível concluir que as espécies analisadas, assim como as

demais espécies descritas na literatura na subfamília, apresentam variações que

permitem reconhecer marcadores espécie-específicos.

e) A técnica de coloração CMA3 mostrou regiões ricas em CG, coincidentes com a

região organizadora do nucléolo e detectadas pela impregnação da prata.

f) Farlowella e Sturisoma foram caracterizados por apresentar baixo número de

cromossomos subtelo-acrocêntricos, enquanto Loricaria e Pyxiloricaria

apresentam estes tipos de cromossomos em alto número, indicando ser esta uma

característica derivada.

34

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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