Centro Universitário de Belo Horizonte

Biomedicina Microbiologia Clínica

Profª: Carla Pataro

Relatório de aula prática n°07

Identificação de BGN não fermentadores:

Pseudomonas aeruginosas

Liana Leuck

Leticia Oliveira

Belo Horizonte

2017/1

1. Introdução

As Pseudomonas aeruginosas são bacilos Gram-negativos, móveis e aeróbicos,

alguns dos quais produzem pigmentos hidrossolúveis. São amplamente distribuídas

na natureza, e costuma ser encontrada em ambientes úmidos nos hospitais. Pode

colonizar seres humanos normais, nos quais atua como saprófito. Provoca doença em

indivíduos com defesas anormais do hospedeiro.

1.2 Morfologia e identificação

A P. aeruginosa é um microrganismo móvel, em forma de bastonete, que mede cerca

de 0,6x2m. É Gram-negativa e ocorre como bactérias isoladas, em pares, e

ocasionalmente, em cadeias curtas. É um aeróbio obrigatório, que cresce facilmente

em muitos tipos de meio de cultura, produzindo, às vezes um odor adocicado ou

semelhante ao de uva ou milho. Formam colônias lisas e redondas, de coloração

esverdeada fluorescente, produzem pioverdina, que conferem ao ágar a coloração

esverdeada. Com frequência produz um pigmento azulado não fluorescente,

denominado piocianina, que se difunde em ágar.

2. Objetivo

Realizar provas presuntivas e definitivas de identificação de BGN não fermentadores

da espécie Pseudomonas aeruginosa.

3. Metodologia

3.1 Materiais

Lâminas de microscopia

Alça de platina

Cultura bacteriana a ser analisada;

Óleo de imersão

Microscópio

Bico de Bunsen

Água destilada

Solução de cristal violeta

Solução de lugol;

Solução de éter-acetona

Solução de fucsina

Fita de teste de Oxidase

Teste O/F

Ágar TSI

3.2 Método

3.2.1 Teste de oxidase

O teste de oxidase é baseado na identificação da produção intracelular da enzima

oxidase por determinada bactéria. Um teste positivo para oxidase indica a presença

de citocromo oxidase C na célula bacteriana. É utilizado rotineiramente na

microbiologia como método importante na triagem para identificação de bactérias,

ajuda na distinção entre microrganismos não fermentadores (oxidase positiva) de

enterobactérias (oxidase negativa; Quinn et al., 2005).

Com auxílio da alça de platina, espalhar a colônia a ser testada sobre o papel de filtro,

e observar se há formação de cor roxa imediata.

INTERPRETAÇÃO

Cor original: branca ou levemente azulada.

Oxidase positiva: produção de cor roxa imediatamente no local da inoculação

da bactéria.

Oxidase negativa: não há mudança da cor do papel no local da inoculação da

bactéria.

Não se deve considerar alteração de cor tardia.

3.2.2 Teste OF: Oxidação/Fermentação

O teste da oxidação/fermentação da glicose (O/F) em meio Ágar Hugh & Leifson®

permite determinar o uso da via oxidativa ou fermentativa da glicose. É considerado

método simples e eficaz para identificação de bactérias que utilizam a glicose em

presença ou na ausência de oxigênio, e baseia-se na produção de ácido quando a

glicose é metabolizada (Oliveira, 2000).

Com o auxílio da agulha de platina, inoculou-se em picada a colônia de bactérias a

ser testada nos dois tubos.

3.2.3 Teste Ágar TSI

O Ágar TSI® é rotineiramente utilizado para a diferenciação de membros da família

Enterobacteriaceae através da fermentação de três açúcares (glicose, sacarose e

lactose) e produção de sulfeto de hidrogênio. Possui em sua composição: 0,1% de

glicose, 1,0% de lactose, 1,0% de sacarose, além de substratos químicos para indicar

a produção de ácido sulfídrico (H2S) e indicador de pH vermelho de fenol (Quinn et

al.,1994). Esse meio permite o reconhecimento e exclusão das espécies

fermentadoras de sacarose. Tais microrganismos podem fermentar a lactose

lentamente, ou não fermenta-las, durante a incubação, mas utilizam facilmente a

sacarose (OXOID, 2000).

Com o auxílio da agulha de platina, foi inoculada a colônia de bactérias a ser analisada

na superfície do ágar e depois em picada, na profundidade do meio.

4. Resultados e discussão

4.1.Teste de oxidase

No teste de oxidase, após a inoculação, observou-se uma ligeira mudança na

coloração do esfregaço, indicando resultado positivo para o teste.

Imagem 1: Fita de oxidase com inoculo de colonia oxidase positiva. Fonte: laboratório de microbiologia-UNIBH.

4.2 Teste OF: Oxidação/Fermentação

Considerou-se bactéria oxidativa aquela que após decorrido o período de incubação

no tubo que se encontrava sem óleo, e consequentemente em aerobiose, adquiriu

coloração amarelada indicando oxidação da glicose e acidificação do meio (Imagem

2). Já o tubo que continha óleo, que deveria estar em anaerobiose e manter a

coloração original, sem alteração, também fermentou e mudou de cor. Isso devido ao

fato de a quantidade de óleo no tubo não ser suficiente para isolar o ar do meio,

conforme Imagem 3.

Imagem 2:(esquerda) tubos para teste O/F antes da inoculação. (direita) tubos inoculados e incubados por tempo prolongado (uma semana). Fonte: laboratório de microbiologia-UNIBH.

Imagem 3: tubo (direita) com quantidade muito pequena de óleo na superfície. Fonte: laboratório de

microbiologia-UNIBH.

4.3 Teste Ágar TSI

No Ágar TSI, o inóculo realizado não apresentou nenhuma alteração no meio de

cultura, mostrando ser de um grupo de bactérias não fermentadoras.

Imagem 3: Meio de cultura Ágar TSI inoculado com bactéria não fermentadora. Fonte: laboratório de

microbiologia-UNIBH.

5. Conclusão

Através dos testes realizados em laboratório e identificação das características, foi

possível definir que as bactérias estudadas se tratam de Pseudomonas aeruginosas.

São microrganismos que crescem bem a uma temperatura de 37 a 42°C, onde seu

crescimento a 42°C ajuda a diferenciá-la das outras espécies de Pseudomonas do

grupo fluorescente. São oxidase positivas. Não fermentam carboidratos, porém muitas

cepas oxidam a glicose.

A morfologia da colônia, a positividade da oxidase, a presença de pigmento e cheiro

característico e o crescimento a 42°C, foram itens essenciais para a identificação da

Pseudomonas aeruginosa.

Referências Bibliográficas

Microbiologia Médica de Jawetz, Melnick e Adelberg / Geo. F. Books… [et

al]; [tradução técnica: José Procópio Moreno Senna]. - 25. ed. - Porto Alegre: AMGH,2012.

QUINN, P.J., CARTER, M. E., MARKEY, B., CARTER, G. R. Clinical

Veterinary Microbiology. Dublin: Wolfe, 1a Edição, 1994. 648p.

QUINN, P. J., MARKEY, B. K., CARTER, M. E., DONNELEY, W. J. C., LEONARD, F. C., MAGUIRE, D. Microbiologia Veterinária e Doenças Infecciosas. Porto Alegre: Artmed, 1a Edição, 2005. 512p.

OLIVEIRA, S. J. Microbiologia Veterinária, Guia Bacteriológico Prático.

Canoas: ULBRA, 2 a Edição, 2000.

OXOID. Manual Oxoid. Hampshire: Oxoid Brasil Ltda.,1a Edição, 2000.