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EXPRESSÃO DIFERENCIAL DE GENES ENVOLVIDOS NA RESPOSTA AO ESTRESSE SALINO EM CANA-DE-AÇÚCAR (Saccharum sp.) E ARROZ (Oryza sativa) BEATRIZ DOS SANTOS FERREIRA UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO – UENF CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ JANEIRO – 2008
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EXPRESSÃO DIFERENCIAL DE GENES ENVOLVIDOS NA
RESPOSTA AO ESTRESSE SALINO EM CANA-DE-AÇÚCAR
(Saccharum sp.) E ARROZ ( Oryza sativa)
BEATRIZ DOS SANTOS FERREIRA
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE
DARCY RIBEIRO – UENF
CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ
JANEIRO – 2008
EXPRESSÃO DIFERENCIAL DE GENES ENVOLVIDOS NA
RESPOSTA AO ESTRESSE SALINO EM CANA-DE-AÇÚCAR
(Saccharum sp.) E ARROZ ( Oryza sativa)
BEATRIZ DOS SANTOS FERREIRA
“Tese apresentada ao Centro de
Biociências e Biotecnologia, da
Universidade Estadual do Norte
Fluminense Darcy Ribeiro como parte
das exigências para obtenção do título
de doutor em Biociências e
Biotecnologia”
Orientador: Prof. Dr. Gonçalo Apolinário de Souza Filho
CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ
JANEIRO – 2008
IV
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Gonçalo Apolinário de Souza Filho, pela orientação durante a
realização deste trabalho e pelo apoio e amizade demonstrados durante todos esses
anos de agradável convivência.
Aos professores Vanildo Silveira, Marcio Alves Ferreira e Valdirene M.
Gomes, por aceitarem compor minha banca de defesa de tese de outorado.
Aos professores e funcionários do Laboratório de Biotecnologia pelos
ensinamentos e agradável convívio dentro e fora do laboratório.
A todos os membros da equipe de pesquisa da qual fiz parte durante todos
esses anos, todos ótimos companheiros de bancada, e alguns verdadeiros amigos,
muito obrigado por toda a ajuda, por todo o carinho e pela amizade.
Á minha mãe Télia, ao meu pai Isaías (in memorian), meus irmãos Marcelo,
Giseli, Cristina e Ítalo. Por serem minha viga de sustentação, por serem minha fonte
de energia, minha reserva de carinho, minha razão para prosseguir. Obrigado por
estarem aqui comigo, por me terem feito vencer.
À minha “dindinha”, Terezinha de Figueiredo, por ter acreditado em meu
potencial, por ter investido em meus estudos, visando como único lucro a minha
vitória. Obrigado por sua presença em minha vida.
Agradeço o apoio financeiro das entidades de fomento CAPES, CNPQ e
FAPERJ para a realização deste trabalho.
À todos aqueles que de alguma forma, me apoiaram e incentivaram para
a realização deste trabalho.
V
SUMÁRIO
Capa.................................................................................................. I
Página de Rosto................................................................................ II
Página de Aprovação........................................................................ III
Agradecimentos................................................................................ IV
Sumário............................................................................................. V
Lista de Figuras................................................................................ IX
Lista de Esquemas............................................................................ XI
Lista de Tabelas................................................................................ XII
Abreviaturas...................................................................................... XIII
Resumo............................................................................................. XIV
Abstract............................................................................................. XVI
1. INTRODUÇÃO GERAL .................................................................... 1
1.1. Aspectos gerais................................................................................. 1
1.2. O Estresse Salino............................................................................. 2
1.3. Tolerância vegetal ao estresse salino............................................... 4
1.4. Mecanismos de resposta vegetal ao estresse salino........................ 6
1.4.1. Mecanismos de resposta ao efeito osmótico.................................... 7
1.4.2. Mecanismos de resposta ao efeito iônico......................................... 9
1.4.2.1. Mecanismos de aquisição de sódio.................................................. 11
1.4.2.2. Mecanismos de exclusão de sódio................................................... 13
1.4.2.3. Mecanismos de compartimentalização de sódio e cloro................... 16
1.5. Plantas de arroz e cana-de-açúcar como modelos de estudo…….. 17
1.5.1. A cana-de-açúcar (Saccharum sp.)................................................... 17
1.5.2. O arroz (Oryza sativa L.).................................................................... 20
2. BIBLIOGRAFIA ................................................................................ 22
CAPÍTULO 1 ESTUDO DA REGULAÇÃO DE GENES EM RESPOSTA AO ESTRESSE SALINO EM CANA-DE-AÇÚCAR E ARROZ ATRAVÉS DE ENSAIOS DE HIBRIDAÇÃO HERERÓLOGA .. 35
1. INTRODUÇÃO.................................................................................. 36
2. OBJETIVOS ...................................................................................... 38
2.1. Objetivos Específicos........................................................................ 38
3. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................ 39
VI
3.1. Material Biológico.............................................................................. 39
3.1.1. Material Vegetal e Condições de cultivo........................................... 39
3.1.2. Condições de tratamentos das plantas de arroz e cana-de-açúcar
para ensaios de RT-PCR e fisiologia.................................................... 39
3.1.2.1. Tratamentos para os ensaios de RT-PCR............................................ 39
3.1.2.2. Tratamentos para os ensaios de fisiologia........................................... 40
3.2. Análise fisiológica e bioquímica das plantas tratadas com estresse
salino................................................................................................. 40
3.2.1. Medidas de Eficiência Fotoquímica do Fotossistema II.................... 40
3.2.2.. Determinação da Peroxidação de Lipídeos...................................... 41
3.3. Análises do padrão de expressão gênicas das plantas submetidas
ao estresse salino............................................................................. 42
3.3.1. Hibridação das membranas de cDNA............................................... 42
3.3.2. Extração de RNA total e Síntese de cDNA....................................... 42
3.3.3. Análise de dados das membranas de Macroarranjo......................... 42
3.3.4. TR e PCR semiquantitativo................................................................ 43
4. RESULTADOS ................................................................................. 45
4.1. Efeito do estresse salino sobre eficiência fotoquímica e a
peroxidação de lipídios em arroz e cana-de-açúcar......................... 45
4.2. Identificação de genes de arroz e cana-de-açúcar induzidos por
estresse salino através de hibridação heteróloga............................. 45
4.3. Expressão dos genes SsEno1, SsNAC23 e SsADH1 de cana-de-
açúcar em resposta a diferentes tempos de exposição a NaCl........ 50
4.4. Efeito de diferentes estresses abióticos sobre o padrão de
expressão dos genes que codificam SsENO1, SsNAC23 e
SsADH1 de cana-de-açúcar............................................................. 53
5. DISCUSSÃO..................................................................................... 55
6. CONCLUSÕES................................................................................. 59
7. BIBLIOGRAFIA ................................................................................ 60
CAPÍTULO 2 IMPLEMENTAÇÃO DA TÉCNICA DE MACROARRANJO
PARA O ESTUDO DA REGULAÇÃO DEGENES DE CANA-
DE-AÇÚCAR EM RESPOSTA AO ESTRESSE SALINO........ 67
1. INTRODUÇÃO.................................................................................. 68
2. OBJETIVOS ...................................................................................... 71
VII
2.1. Objetivos Específicos........................................................................ 71
3. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................ 72
3.1. Identificação de ESTs de cana-de-açúcar dentro do banco de
dados do SUCEST............................................................................ 72
3.2. Material biológico.............................................................................. 74
3.2.1. Material vegetal e condições de cultivo............................................ 74
3.2.2. Ensaios de estresse.......................................................................... 74
3.2.3. Bactérias contendo os clones do SUCEST....................................... 74
3.3. Ensaio de macroarranjo........................................................................ 75
3.3.1. Extração de RNA total de folha e raiz de plantas de cana-de-
açúcar............................................................................................... 75
3.3.2. Síntese da sonda de cDNA de folhas e raízes de cana-de-açúcar.. 75
3.3.3. Crescimento de bactérias para extração de DNA plamidial.............. 76
3.3.4. Extração de DNA Plasmidial contendo os 370 clones de cDNA do
SUCEST............................................................................................ 77
3.3.5. Preparo das membranas de macroarranjo....................................... 77
3.3.6. Hibridação das membranas de macroarranjo................................... 78
3.3.6.1. Pré-Hibridação.................................................................................. 78
3.3.6.2. Hibridação das membranas com sonda radioativa........................... 78
3.3.6.3. Lavagens e exposição das membranas............................................ 78
3.3.6.4. Análise das imagens geradas a partir dos ensaios de
macroarranjo..................................................................................... 759
4. RESULTADOS ................................................................................. 80
4.1. Identificação de ESTs de cana-de-açúcar relacionados ao
transporte de íons, osmoproteção, estresse oxidativo e transporte
de água............................................................................................. 80
4.2. Implementação da metodologia de Arranjos de DNA em
Membrana......................................................................................... 89
4.2.1. Obtenção de DNA plasmidial contendo os 370 clones de cDNA de
cana-de-açúcar................................................................................. 89
4.2.2. Organização dos clones do SUCEST nas membranas de
macroarranjo..................................................................................... 94
4.2.3. Obtenção de RNA total de tecido foliar e radicular de cana-de-
açúcar (cv CB47-89)......................................................................... 97
VIII
4.3. Ensaios de Macroarranjo.................................................................. 102
4.3.1. Monitoramento da qualidade das membranas por hibridação com
plasmídio [32P]pSPORT1.................................................................. 102
4.3.2. Monitoramento da qualidade de hibridação por sonda [32P]cDNA 104
4.3.3. Identificação de genes de cana-de-açúcar expressos em resposta
ao estresse salino através de macroarranjo..................................... 107
4.3.3.1. Identificação de genes de cana-de-açúcar expressos em tecido
radicular............................................................................................. 107
4.3.3.2. Identificação de genes de cana-de-açúcar expressos em tecido
foliar.................................................................................................. 109
5. DISCUSSÃO..................................................................................... 117
5.1. Identificação de ESTs de cana-de-açúcar relacionados a
processos de resposta ao estresse salino........................................ 117
5.2. Implementação da metodologia de Arranjos de DNA em
Membrana......................................................................................... 118
5.3. Investigação do padrão de expressão de 370 clones do SUCEST
em resposta a estresse salino em cana-de-açúcar.......................... 122
6. CONCLUSÕES................................................................................ 126
7. BIBLIOGRAFIA ................................................................................ 127
IX
LISTA DE FIGURAS
INTRODUÇÃO GERAL
Figura 1. Thellungiella halophila é um modelo de plantas ideal para
estudos de tolerância a salinidade................................................. 6
CAPÍTULO 1
Figura 1. Efeito do estresse salino sobre funções fisiológicas em arroz e
cana-de-açúcar.............................................................................. 46
Figura 2. Representação da membranas utilizadas para os ensaios de
Macroarranjos................................................................................. 48
Figura 3. Validação dos dados de Macroarranjo através de ensaios de RT-
PCR semiquantitativo..................................................................... 51
Figura 4. Análise do padrão de expressão temporal dos genes SsENO1,
SsNAC23 e SsADH1 em resposta ao estresse salino em folhas
de cana-de-açúcar (CB4789). ....................................................... 52
Figura 5. Perfil de expressão dos genes SsENO1, SsNAC23 e SsADH1
em resposta diferentes estresses abióticos em folhas de cana-
de-açúcar (CB4789)....................................................................... 54
CAPÍTULO 2 Figura 1. Seleção inicial do “Clusters” de cana-de-açúcar relacionados à
resposta ao estresse salino............................................................ 73
Figura 2. Visualização do padrão eletroforético do DNA plasmidial
contendo os clones de cDNA do SUCEST..................................... 90
Figura 3. Visualização do padrão eletroforético do DNA plasmidial
contendo os clones de cDNA do SUCEST..................................... 91
Figura 4. Visualização do padrão eletroforético do DNA plasmidial
contendo os clones de cDNA do SUCEST..................................... 92
Figura 5. Visualização do padrão eletroforético do DNA plasmidial
contendo os clones de cDNA do SUCEST..................................... 93
Figura 6. Análise da integridade de amostras de RNA total de folhas de
cana-de-açúcar (cv. CB47-89)....................................................... 96
Figura 7. Análise da integridade e concentração de amostras de RNA total
de raiz de cana-de-açúcar extraídas por TRIZOL.......................... 99
Figura 8. Análise da integridade e concentração de amostras de RNA total
de raiz de cana-de-açúcar extraídas por LiCl-Fenol...................... 101
X
Figura 9. Análise da qualidade das membranas de macroarranjo através
de hibridação com plasmídio pSPORT1 marcado com 32P............ 103
Figura 10. Destaque dos controles internos fixados nas membranas de
Macroarranjo.................................................................................. 105
Figura 11. Análise da expressão dos genes para os controles internos......... 106
Figura 12. Análise do perfil de expressão de genes de resposta à salinidade
em raízes de cana-de-açúcar......................................................... 108
Figura 13. Identificação de genes expressos em resposta ao estresse
salino em tecido radicular de plantas de cana-de-açúcar.............. 110
Figura 14. Análise do perfil de expressão de genes de resposta à salinidade
em folhas de cana-de-açúcar......................................................... 112
Figura 15. Identificação de genes expressos em resposta ao estresse
salino em tecido foliar de plantas de cana-de-açúcar.................... 116
XI
LISTA DE ESQUEMAS
INTRODUÇÃO GERAL
Esquema 1. Modelo descrevendo as funções possíveis de OsHKT1, OsHKT2
e OsVHA na homeostáse da regulação citosólica de
Na+/K+............................................................................................. 12
Esquema 2. Mecanismo de funcionamento da via SOS na resposta ao
estresse salino................................................................................ 15
Esquema 3. Transportadores de íons localizados na membrana plasmática e
na membrana de vacúolo em células vegetais.............................. 18
CAPÍTULO 2
Esquema 1. Representação do esquema de disposição dos clones de cDNA
do SUCEST em membrana de macroarranjo................................. 95
Esquema 2. Disposição dos clones nas membranas de macroarranjo.............. 96
XII
LISTA DE TABELAS
INTRODUÇÃO GERAL
Tabela 1. Vários sinais de estresses abióticos e bióticos para plantas.......... 2
Tabela 2. Definição de solos salinos e sódicos, classificação segundo o
Laboratório de Salinidade da USDA............................................... 3
Tabela 3. Várias plantas cultivadas são susceptíveis à salinidade do solo... 4
Tabela 4. Desenvolvimento fisiológico relevante em condições de estiagem........ 8
CAPÍTULO 1 Tabela 1 Lista dos iniciadores usados durante os ensaios de RT-PCR
semiquantitativo............................................................................. 44
Tabela 2. Estresse salino induzido por genes em arroz e cana-de-açúcar
por macroarranjo............................................................................ 49
CAPÍTULO 2
Tabela 1. ESTs de cana-de-açúcar associados à resposta ao estresse
salino identificados após mineração de dados no banco de
seqüências do SUCEST. Os ESTs estão dispostos na tabela em
grupo por assunto. Na primeira coluna estão relacionadas as
proteínas utilizadas para as buscas. Na segunda coluna estão os
ESTs encontrados para cada proteína. Na coluna 3 está
representado um código numérico associado a cada seqüência
para facilitar a identificação das mesmas durante os ensaios
posteriores...................................................................................... 81
Tabela 2. Genes diferencialmente expressos em raízes de cana-de-
açúcar............................................................................................. 111
Tabela 3. Genes diferencialmente expressos em folhas de cana-de-
açúcar............................................................................................. 114
XIII
ABREVIATURAS
ATPase Adeosina trifosfatase BCCC Centro brasileiro de coleção de clones CDNA Ácido desoxirribonucléico complementar CLC Transportador de cloro DATP Dideoxi adenosina trifosfato DEPC Dietilpirocarbonato DGTP Deoxi guanosina trifostato DNA Ácido desoxirribonucléico DTTP Deoxi timidina trifosfato EDTA Ácido acético etileno tetra diamino EST Etiquetas de sequências espressas FAO Organização das Nações Unidas para a Agricultura e
Alimentação Fv/Fm Rendimento quântico do PSII HAK Transportador de íon potássio de alta afinidade H+-ATPase Bomba prótons dependente de Adenosisa trifosfatase Hz Hertz HKT1 Transportador de alta afinidade a potássio H+-Ppases Pirofosfatase-H+ de vacúolo KAT1 K+ Arabidopsis thaliana channel 1 MDA Malondialdeído MIP “Major intrinsic protein super-family” MS Meio Murashige Skoog PCR Reação da polimerase em cadeia PEG Polietilenoglicol PSII Fotossistema II PVPP Polivinil poli pirrolidona RNA Ácido ribonucléico RNAse Enzima ácido ribonuclease ROS Espécies reativas de oxigênio TBA Äcido tiobarbitúrico TCA Ácido tricloroacético TENS Solução de Tris, EDTA, NaOH e SDS TE RNAse Solução de Tris EDTA e RNAse UV Ultra violeta V-ATPase Adenosina trifosfatase de vacúolo V-H+-ATPases Adenosina trifosfatase - H+ de vacúolo V-Ppase Pirofosfatases de vacúolo
XIV
RESUMO
A salinidade dos solos é um dos estresses ambientais mais importantes para
a agricultura, reduzindo a produtividade de inúmeras espécies vegetais. Portanto,
uma regulação precisa da resposta ao estresse salino representa um passo chave
para a adaptação e sobrevivência vegetal. O presente trabalho teve como objetivo
geral a identificação de genes envolvidos na resposta ao estresse salino, através de
macroarranjo, em plantas de arroz e cana-de-açúcar. A primeira parte deste trabalho
teve como objetivo a identificação de genes de arroz e cana-de-açúcar, envolvidos
na resposta a salinidade através de hibridação heteróloga e validação da expressão
dos genes identificados através de RT-PCR semiquantitativo. Para tanto, foi
analisada a expressão de 2.304 clones de cDNA de cana-de-açúcar através de
hibridação heteróloga contra a33P-cDNA de folhas de arroz expostas a 150mM de
NaCl por 24h e controle (sem NaCl). Foram identificados 14 genes induzidos por
estresse salino. Tais genes, estão envolvidos no desenvolvimento vegetal,
bioenergética, metabolismo de ácidos nucléicos, metabolismo de proteínas,
dinâmica celular e resposta a estresses. Seis desses genes apresentaram função
desconhecida. Os resultados de indução dos macrorranjos foram confirmados, para
os genes Enolase (SsENO1), SsNAC23 e Álcool Desidrogenase (SsADH1), através
de RT-PCR semiquantitativo em arroz e cana-de-açúcar. Adicionalmente, ensaios de
RT-PCR demonstraram que os genes SsENO1 e SsNAC23 são induzidos por
estresse osmótico, ferimento e KCl, em folhas de cana-de-açúcar. O gene SsADH1
foi induzido por ferimento e reprimido pelos estresses osmótico e iônio. Esses
resultados permitiram identificar genes responsivos a salinidade em arroz e cana-de-
açúcar. Além da caracterização da resposta, de três destes genes, a outros
estresses ambientais em cana-de-açúcar. Durante a segunda parte do presente
trabalho objetivo principal foi a implementação da técnica de macroarranjo, para a
análise de genes de cana-de-açúcar (cv. CB47-89), diferencialmente expressos
durante a exposição à NaCl. Para esse fim, através de trabalhos de bioinformática
dentro do banco de dados do SUCEST, foram identificados 370 ESTs de cana-de-
açúcar, ortólogos a genes de outras espécies vegetais, previamente descrito como
responsivos ao estresse salino. Os clones de cDNA correspondentes aos 370 ESTs
de cana-de-açúcar foram adquiridos do BCC Center, e utilizados para construção de
membranas de macroarranjo. As membranas foram, então, hibridadas contra
XV
sondas de α32P-cDNA provenientes de folhas e raízes de plantas de cana-de-açúcar
(cv. CB4789) controle (sem NaCl) e tratadas (175mM de NaCl por 48h). As etapas
inerentes à padronização mostraram que a metodologia é de difícil implementação,
onde variações no sistema de confecção e hibridação das membranas dificultam a
reprodutibilidade dos ensaios e a análise dos dados. Apesar, dos problemas
inerentes à implementação da técnica, foi possível a identificação de 19 genes em
folhas e 12 genes em raiz que tiveram seu perfil de expressão alterado em resposta
ao estresse salino. Dentre os genes analisados em folha, apenas o gene para
Catalase foi induzido, os outros 18 genes foram reprimidos por estresse salino. Em
raiz cinco genes envolvidos com transporte de íons e estresse oxidativo foram
reprimidos, enquanto que 2 genes para AcPMP3 foram induzidos. Análises que
permitam o aumento da sensibilidade da técnica de macroarranjo, viabilizarão a
detecção de um maior número de genes expressos em resposta ao estresse salino,
em estudos futuros. Em conclusão, todos os resultados obtidos durante a realização
deste projeto permitiram a identificação, através da implementação da técnica de
macroarranjo, de novos genes de resposta ao estresse salino em cana-de-açúcar e
arroz, sendo 31 genes identificados em cana-de-açúcar e mais 14 genes
identificados em arroz/cana-de-açúcar. Adicionalmente, foi possível analisar, por RT-
PCR semiquantitativo em plantas de cana-de-açúcar, o padrão de expressão de
genes de resposta a estresse salino, quando submetidos a diferentes estresses
abióticos. Esse conjunto de dados permitirá uma maior compreensão dos
mecanismos de resposta ao estresse salino em cana-de-açúcar e arroz,
possibilitando a obtenção de maiores elucidações acerca dos processos de
resistência e adaptação dessas espécies vegetais ao estresse salino.
Palavras-chave do assunto: Cana-de-açúcar; Arroz; RT-PCR semiquantitativo;
Estresse Salino; Macroarranjo
XVI
ABSTRACT
Soil salinity is one of the most important environmental stresses for agriculture,
reducing the productivity of several species. Therefore, the efficient response to the
stressful condition represents a critical step for plant adaptation. This work ware
major aim to identification of genes involved in salt stressed response in sugarcane
and rice plants by macroarray. In the first step for this study, salt-responsive genes
were identified in sugarcane and rice plants, by using a heterologous hybridization
approach. Then macroarray assays were performed by using transcripts, obtained
from leaves of salt-stressed (150 mM/ 24h) and control rice plants, hybridized onto
nylon filters containing 2.304 sugarcane expressed sequence tags (ESTs). Fourteen
up regulated ESTs were identified in salt-stressed condition, including clones
corresponding to genes related to nucleic acid metabolism, bioenergetics and abiotic
stress. Four genes of unknown function were also identified. The macroarray data of
3 selected salt-responsive ESTs (Enolase (SsENO1), SsNAC23 and Alcohol
dehydrogenase (SsADH1)) were confirmed by semiquantitative RT-PCR. In addition,
such ESTs had their expression characterized, in sugarcane leaves, during the
temporal response to NaCl, and after exposure to drought, wounding and 150 mM
KCl. The results revealed that SsENO1 and SsNAC23 ware induced by osmotic
stress, wound and KCl. SsADH1 gene was induced by wound, but repressed by
osmotic and ionic stress. The similarity of the response to salinity in sugarcane and
rice, and the applicability of heterologous hybridization systems for gene expression
analyses in these species ware demonstrated. A second moment of this work ware
aimed the implementation of macroarray technology for analysis of genes
differentially expressed in sugarcane plants (cv. CB47-89) exposed to NaCl. For this
end, bioinformatics analyses of the Sugarcane Est Project (SUCEST) data bank
allowed to identify 370 sugarcane ESTs, ortologues to salt stress responsive genes
of several plant species. These 370 cDNA clones were acquired from BCC Center
and used for macroarray membrane confection. Membranes were hybridized with
the �32P-cDNA probes from control and treated (NaCl 1%/ 48h) leaves and root of
sugarcane plants. The steps for macroarray implementation were difficulty, where,
membrane confection and hybridization variations influence in assay reproducibility
and date analysis. Nevertheless, the methodology permits the identification of 19 salt
regulated genes in leaves and 12 genes in roots. In leaves catalase gene was
XVII
induced and the others 18 genes were repressed. In roots five genes involved in ion
transport and oxidative stress were repressed, in other rand two AcPMP3 genes
were induced by salt stress. Analysis that increases the sensibility of macroarray
assay will leave to detection more salt regulated genes in the future work. In
conclusion, all results make possible the identification of new salt stress regulated
genes in sugarcane and rice, where 31 genes ware identified in sugarcane and 14
genes in rice/sugarcane. Additionally, the expression patterns of some these genes
ware analyzed by semiquantitative RT-PCR in sugarcane plants expose to others
abiotic stresses. This group of dates conduces to better understanding about
response mechanisms to salt stress in sugarcane and rice. Thus more elucidation
about the resistance and adaptation process in these plant species would be
obtained.
Introdução_________________________________________________________________1
Ferreira, B.S.
1- INTRODUÇÃO GERAL
1.1- Aspectos gerais
Com o surgimento e desenvolvimento dos seres humanos na Terra, as
modificações ambientais foram gradativamente acentuadas. Como conseqüências
da atividade antropogênica, surgiram artefatos, fábricas e indústrias que contribuem
para a poluição gradual do ar, água e terra (Tamaoki et al., 2004).
A intensa industrialização e o uso indevido dos recursos naturais provocam
fenômenos como o aquecimento global e a destruição da camada de ozônio.
Alterações ambientais como aumento da radiação ultravioleta (UV) na superfície da
Terra, alta intensidade luminosa e temperaturas extremas afetam o metabolismo e
desenvolvimento dos organismos vivos (Mahajam e Tuteja 2005; Sreenivasulu et al.,
2007). Dentre esses organismos, as plantas, são diretamente prejudicadas, uma vez
que elas estão diretamente expostas a todo tipo de alterações ambientais (Ashraf,
2004).
Quando uma condição desfavorável se prolonga ou se intensifica pode causar
grandes danos à vegetação nativa e às culturas agrícolas (Tamaoki et al., 2004). A
ação dos fatores ambientais desfavoráveis sobre as plantas provoca modificações
em sua fisiologia e vias bioquímicas, acarreta toxicidade metabólica, indução de
espécies reativas de oxigênio (ROS), desequilíbrio iônico e osmótico, e alteração da
expressão gênica a níveis transcricional e pos-transcricional (Valliyodan e Nguyen,
2006; Sreenivasulu et al., 2007).
É considerado um estresse ou distúrbio ambiental qualquer fator no ambiente
que limite a produção de biomassa e reduza o rendimento de uma espécie vegetal
(Ashraf e Harris, 2004). Na tabela 1 estão listados alguns dos estresses ambientais
mais estudados (Mahajan e Tuteja, 2005). Dentre os diferentes estresses ambientais
a desidratação, temperatura extrema e a salinidade destacam-se como os mais
severos, pois seus efeitos adversos são responsáveis por grandes perdas da
produtividade agrícola (Andjelkovic e Thompson, 2006; Yamaguch-Shinozaki e
Shinozaki, 2006; Lal et al., 2007).
O estresse salino, sozinho, é um dos mais importantes estresses abióticos.
Esse estresse reduz a produtividade de uma grande quantidade de espécies
cultiváveis em todo o mundo (Mansour et al., 2003, Lutts et al., 2004).
Introdução_________________________________________________________________2
Ferreira, B.S.
1.2- O Estresse Salino
As inúmeras regiões áridas e semi-áridas existentes no planeta não
constituem áreas próprias ao desenvolvimento de lavouras de interesse econômico,
a produtividade agrícola nestas áreas é muito baixa (de Souza-Filho, 2003; Ashaf,
2004). Além desse fato, um problema de grande interesse agrícola, é a progressiva
salinização de solos agriculturáveis. O processo de salinização dessas terras limita a
distribuição de plantas por diversas áreas naturais e diminui as opções de espaços
cultivaveis (Demiral e Türkan, 2004).
Estudos realizados pela FAO (Organização das Nações Unidas para a
Agricultura e Alimentação) em 2005, demonstram que de toda a crosta terrestre um
percentual de 6% (800 milhões de hectares) é afetado pela salinidade ou pela
ocorrência de sodicidade. Grande parte dos eventos de salinização e sodificação
dos solos ocorrem naturalmente, em um processo conhecido como salinização
primária (Munns, 2005). A salinização primária ocorre em decorrência de eventos
como a utilização de águas salinas para irrigação, erosão de rochas nativas, altos
níveis de evaporação e/ou baixos índices de precipitação. Esses eventos contribuem
isoladamente ou em conjunto para aumentar a salinidade de uma região (Ashaf e
Foolad, 2007). A definição de salinidade e sodicidade, bem como a descrição de
seus efeitos sobre os tecidos vegetais estão descritos na Tabela 2 (Munns, 2005).
Visando a expansão da área plantada, sistemas de irrigação são utilizados no
intuito de tornar solos áridos viáveis ao plantio. No entanto, o uso inadequado das
técnicas de irrigação, freqüentemente, culmina na elevação dos teores de sais na
superfície do solo, acentuando o problema da indisponibilidade de áreas viáveis para
Tabela 1: Vários sinais de estresses abióticos e bióticos para plantas
Estresses abióticos 1. Frio (temperatura baixa e geada) 2. Calor (alta temperatura) 3. Salinidade (sal) 4. Seca (déficit da condição de água) 5. Excesso de água (inundação) 6. Radiação (alta intensidade de luz ultravioleta e visível) 7. Químicos e poluentes (metais pesados, pesticidas e aerossóis) 8. Estresse oxidativo (espécies reativas de oxigênio, ozônio) 9. Vento (partículas de areia e poeira no vento) 10. Privação de nutrientes no solo Estresses bióticos 1. Patógenos (vírus, bactérias e fungos) 2. Insetos 3. Herbívoros
Adaptada de Mahajan e Tuteja , 2005.
Introdução_________________________________________________________________3
Ferreira, B.S.
cultivo (Sahi et al., 2003; Ashraf e Foolad, 2007). O acumulo de sal proveniente da
utilização incorreta de técnicas de irrigação e drenagem caracteriza o processo de
salinização secundária (Munns, 2005; Chinnusamy et al., 2005).
É estimado que ocorra a salinização de, aproximadamente, 25% das terras
agriculturáveis do planeta dentro dos próximos 25 anos, chegando a 50% até
meados do século XXI (Wang et al., 2003; Mahajam e Tuteja, 2005).
A salinidade do solo pode ser medida pela chamada condutividade elétrica do
extrato de saturação (ECe), que se refere a quantidade total de sais dissolvidos no
solo. Um solo para ser considerado salino deve ter uma ECe de 4 dS m-1, que
corresponde a cerca de 40mM de NaCl (Maas, 1990; Chinnusamy et al., 2005).
Muitas espécies vegetais se mostram sensíveis a valores de condutividade
elétrica de 3 dS m-1, sendo, essa quantidade de sal no ambiente, suficiente para
promover queda de sua produtividade agrícola. Espécies como sorgo, milho e trigo
Tabela 2. Definição de solos salinos e sódicos, cla ssificação segundo o Laboratório de Salinidade da USDA (2005).
Termo Definição Descrição Efeitos no
crescimento da planta
Comentários
Salinidade Solos salinos têm uma alta concentração de sais solúveis. Eles são classificados como salinos quando o ECe é ≥ 4 dS.m-1
Esta definição de salinidade deriva do ECe que fornecerá a redução da maioria da colheita. Entretanto, muitas colheitas são afetadas por um ECe < 4 dS.m-1
Componentes osmóticos e salinos específicos inibem o crescimento de raiz e broto.
ECe é a condutividade elétrica de estratos, e reflete a concentração de sal em solos saturados. A condutividade de 4 dS.m-1 é equivalente a 40 mM de NaCl.
Sodicidade Solos sódicos têm uma baixa concentração de sais solúveis, mas uma alta porcentagem de Na+ permutável (ESP). Eles são classificados como sódicos quando o ESP é ≥ 15.
Esta definição de sodicidade deriva do ESP que causa degradação da estrutura de solos argilosos, causados pelo deslocamento de Na+ e cátions divalentes ligados por cargas negativas em partículas de argila.
A estrutura de solos pobres inibe o crescimento de raízes.
Altos ESP, separam partículas de argila. O solo pobremente drenado , quando molhado, torna-se alagado. Este também se torna muito endurecido quando seco.
Alcalinicidade Solos alcalinos são um tipo de solo sódico com um alto pH. Eles são definidos como tendo um ESP ≥ 15 com um pH de 8,5-10.
O alto pH é causado pelo sal de carbonato em material de origem.
Alto pH afeta a reabsorção de nutrientes
Adaptado de Munns, 2005.
Introdução_________________________________________________________________4
Ferreira, B.S.
são consideradas moderadamente tolerantes ao estresse salino, pois sobrevivem e
são produtivas em solos com ECe de 10 dS m-1 (100mM NaCl), enquanto que
cevada é produtiva em concentrações de sal 2,5 vezes maiores, sendo classificada
como uma espécie tolerante (Maas e Hoffman, 1977; Munns et al., 2006). Na Tabela
3 estão representadas espécies economicamente importantes e um limite de
salinidade até o qual essas plantas são produtivas. Acima de tais valores de ECe a
produtividade dessas lavouras decai até a morte (Mass, 1990).
1.3- Tolerância vegetal ao estresse salino
A tolerância ao estresse salino pode ser definida como a capacidade de uma
espécie vegetal de crescer, se desenvolver e completar seu ciclo de vida em um
substrato contendo altas concentrações de sal (Parida e Das, 2005).
As espécies vegetais são classificadas quanto à tolerância ao estresse salino
como: 1) sensíveis, 2) moderadamente tolerantes ou 3) tolerantes ao sal. A
classificação leva em consideração parâmetros como desenvolvimento, tempo de
sobrevivência, índices de produtividade em ambiente salino, e, adicionalmente,
concentrações de sais suportadas pela espécie vegetal em questão (Parida e Das,
Tabela 3: Várias plantas cultivadas são susceptíveis à salinidade do solo
Espécie Salinidade (dS m-1) Perda (% por dS m-1)
feijão (Phaseouls vulgaris L.) 1.0 19.0
cebola (Allium cepa L.) 1.2 16.0
pimenta (Capsicum annuum L.) 1.5 14.0
milho (Zea mays L.) 1.7 12.0
cana-de açúcar (Saccharum oficinarum L.) 1.7 5.9
batata (Solanum tuberosum L.) 1.7 12.0
alface (Brassica oleracia var. capitata L.) 1.8 9.7
Tomate (Lycopersicon esculentum Mill.) 2.5 9.9
arroz (Oryza sativa L.) 3.0 12.0
amendoim (Arachis hypogea L.) 3.2 29.0
soja (Glycine max (L.) Merr.) 5.0 20.0
trigo (Triticum aestivum L.) 6.0 7.1
beterraba (Beta vulgaris L.) 7.0 5.9
algodão (Gossypium hirsutum L.) 7.7 5.2
Cevada (Hordeum vulgare L.) 8.0 5.0
Falta de uma correlação direta entre o limite de salinidade e a diminuição da produtividade por
unidade aumentada na salinidade pode ser atribuída a diferenças na exclusão, entrada,
compartimentalizção e outros mecanismos de tolerância de sal entre as diferentes espécies.
Adaptada de Mass, 1990.
Introdução_________________________________________________________________5
Ferreira, B.S.
2005; Munns et al., 2006; Cuartero et al., 2006). Geralmente, para quantificar a
resistência vegetal à salinidade são realizadas medidas tais como: a) parâmetros
tipicamente agronômicos: razão de sobrevivência, habilidade de crescimento, peso,
área foliar, taxas de redução de crescimento, necrose foliar; e b) parâmetros
celulares e fisiológicos: supressão da atividade meristemática, perda de tugor,
relação de acúmulo/perda de água, taxas de atividade fotossintética, acúmulo de
íons orgânicos, acúmulo de metabólitos (Ashraf e Harris, 2004; Lutts et al., 2004).
Os primeiros estudos para compreender a natureza da tolerância de espécies
vegetais ao estresse salino datam de duas décadas, quando Flowers e
colaboradores, em 1977, realizaram pesquisas sobre os mecanismos de tolerância
ao sal em halofitas. Essas plantas são capazes de sobreviver e se desenvolver com
altas concentrações de sais em sua rizosfera. Pesquisas indicam que a tolerância
das halófitas ao sal está associada a dois mecanismos: 1) controle da concentração
intracelular de íons, uma vez que essa espécie possui transportadores de K+/Na+
altamente específicos; 2) controle da omesostase osmótica, pelo acúmulo de altos
níveis de açúcares e aminoácidos no citoplasma celular durante a exposição ao sal
(Volkov et al., 2003; Inan et al., 2004; Taji et al., 2004; Vinocur e Altman, 2005). A
Figura 1 mostra a resistência da espécie halófita Thellungiella halophila a altas
concentrações de sais em comparação com a Arabdopisis thaliana (Vinocur e
Altman, 2005). As plantas foram submetidas a concentrações de 0, 200 e 600mM de
NaCl durante 7 dias. Nota-se que a T. halophila foi a espécie que apresentou melhor
performance quando submetida ao estresse.
Durante pesquisas realizadas por Wang e colaboradores em 2004, eles
identificaram 163 genes induzidos por estresse salino em T. halophila. Essa halófita
é evolutivamente muito próxima da Arabdopsis thaliana, que é utilizada como
modelo experimental para o estudo vegetal. Os pesquisadores sugerem a utilização
de T. halophila como um sistema modelo para o estudo de genética molecular em
resposta ao estresse salino em plantas. No entanto, as halofitas Thinopyrum
ponticum e Hordeum marinum, evolutivamente próximas do trigo e cevada, apesar
de seu potencial como modelos de estudo de tolerância a salinidade, não puderam
ser utilizadas para melhorar a tolerância em espécies relacionadas. A
impossibilidade está no fato de a natureza dos mecanismos de tolerância dessas
halófitas não serem completamente conhecidos (Garthwaite et al,. 2005; Colmer et
al., 2005; Colmer et al., 2006).
Introdução_________________________________________________________________6
Ferreira, B.S.
Figura 1. Thellungiella halophila é um modelo de plantas ideal para estudos de tolerância a salinidade. A figura mostra o perfil de resposta de plantas T. halophila e A. thaliana crescidas por sete dias em potes com meio saturado com 0, 200 e 600mM de NaCl (Fotografia original de A. Altman)
Adaptado de Vinocur e Altman, 2005.
Para tentar compreender o processo de tolerância, devem ser levadas em
consideração as variações ficológicas, bioquímicas e genéticas para as cultivares
dentro de uma mesma espécie, e entre diferentes espécies (Zhu 2002; Royo e Abió,
2003; Steppuhn et al., 2005). Associados aos processos metabólicos inerentes a
cada espécie estão as constantes modificações do meio, propriedades físicas e
químicas de solo, manutenção da irrigação e forma de tratamento da cultura
(Rengasamy, 2002; Munns et al., 2006). A relação entre esses parâmetros torna
complexa a tarefa de desvendar os mecanismos de tolerância vegetal à salinidade
(Ashaf e Foolad, 2007). Portanto, o primeiro passo para a obtenção de espécies
tolerantes é o entendimento dos efeitos causados pelo estresse salino aos tecidos
vegetais e como as plantas respondem a esse estímulo ambiental.
1.4- Mecanismos de resposta vegetal ao estresse sal ino
A salinidade exerce basicamente dois efeitos tóxicos sobre os tecidos
vegetais: 1) o estresse osmótico, que é resultado das altas concentrações de soluto
no solo e do baixo potencial hídrico no meio radicular; e 2) o estresse íon-específico,
que resulta da alteração da razão K+/Na+ e do aumento das concentrações dos íons
Na+ e Cl- nas células devido a aquisição excessiva desses íons (Blumwald, 2000;
Zhu, 2002; Arndt et al., 2004).
Introdução_________________________________________________________________7
Ferreira, B.S.
Como conseqüências da exposição de plantas ao estresse salino, ocorrem
alterações celulares como, mudanças no potencial osmótico, formação de ROS,
inibição da fotossíntese, modificações na permeabilidade e composição de lipídios
da membrana plasmática e deficiência nutricional (Hasegawa et al., 2000; Mansour
et al., 2003; Sahi et al., 2006; Kim et al., 2007).
1.4.1- Mecanismos de resposta ao efeito osmótico
Quando plantas são expostas a um ambiente salino, a membrana plasmática
das células do sistema radicular entra em contato imediato com os íons livres no
ambiente (Mansour et al., 2003). Como conseqüência deste contato, as células
radiculares perdem água para o meio, uma vez que no solo há uma alta
concentração de solutos (Serrano, 1996; Arndt et al., 2004). Além disso, o sistema
de absorção de água pela planta fica debilitado, causando deficiência hídrica que
culmina em desidratação (Munns et al., 2006).
Uma vez estabelecido o efeito osmótico como conseqüência do estresse
salino, a planta aciona os mesmos mecanismos e vias de resposta de quando é
exposta ao estresse hídrico. Considerando que, o mecanismo chave para a
manutenção da absorção hídrica e do turgor celular é o ajuste osmótico (Moinuddin
et al., 2005; Turner et al., 2007). Nesse contexto, pode-se considerar que os
mecanismos de resposta para estresse hídrico são também aplicados para a
resposta ao efeito osmótico. Uma vez que o balanço hídrico foi alterado, uma série
de modificações metabólicas é iniciada (Lawlor e Cornic 2002; Reddy et al., 2004;
Walter e Shurr, 2005; Richards, 2006). Algumas dessas modificações são
conseqüência direta do potencial osmótico, e outras são resultado da ativação de
cascatas de sinalização e desbalanço hormonal disparados pelo efeito osmótico
(Chaves et al., 2003; Cattivelili et al., 2008). A Tabela 4 mostra uma coletânea de
dados sobre alterações fisiológicas e padrões de resposta de diferentes espécies
vegetais ao estresse hídrico (Cattivelili et al., 2008).
Introdução_________________________________________________________________8
Ferreira, B.S.
Tabela 4. Desenvolvimento fisiológico relevante em condições de seca. Características Vegetais Efeitos relevantes para
produção Modulação sob estresse Referências
Condutância estomática/temperatura foliar
Consumo de água mais ou menos rápido.
Temperatura foliar reflete a evaporação é função da
condutância estomatal
Aumento da resistência estomatal sob estresse
Jones (1999), Lowlor e Cornic
(2002)
Capacidade fotossintética A modulação da concentração de enzimas
do ciclo de Calvin e elementos de reações de
fase clara
Redução sob estresse Lowlor and Comic (2002)
Tempo de fases fenológicas Tempo de floração. Duração de crescimento e maturidade. Redução no
número de grãos
Avanço da floração de trigo e cevada, atraso em arroz e
assincronia em milho
Slafer et al., (2005), Richards
(2006)
Disponibilidade de amido durante o desenvolvimento
do ovário/embrião
A redução da disponibilidade de amido
leva a redução no número de grãos
Inibição da atividade fotossintética reduz a
disponibilidade de amido
Boyer e Westgate (2004)
Divisão e utilização da reserva no caule
Baixa/alta remobilização de reservas do caule para
o suplemento de sementes, afetando o
peso do grão
Compensação da redução da fotossíntese da folha pelo aumento da remobilização
Blum (1988), Slafer et al.,
(2005)
Aparência verde Atraso de senescência Rajcan e Tollenaar (1999)
Área foliar Tamanho da planta e produtividade relativa
Redução sob estresse (murcha, senescência,
abcissão)
Walter e Shurr (2005)
Profundidade de enraizamento
Alto/baixo extração de água do solo
Redução da massa total, mas aumento da razão raiz/broto,
crescimento no interior do solo úmido, renascimento em
ausência de estresse
Hoad et al., (2001), Sharp et
al., (2004)
Resistência cuticular e gramatura de superfície
Alta ou baixa perda de água
Kerstiens (1996)
Vias fotossintéticas C3/C4/CAM, altamente WUE e com grande
tolerância ao calor de C4 e CAM
Cushman (2001)
Ajuste osmótico Acumulação de solutos: íons, açucares, poli-
açucares, aminoácidos, glicina-betaía
Lenta resposta ao potencial hídrico
Serraj e Sinclair (2002)
Composição de membrana Aumento da estabilidade da membrana e
modificações nas função de aquoporinas
Regulação em resposta a variações do potencial hídrico
Tyerman et al., (2002)
Defesa antioxidante Proteção contra espécies ativas de oxigênio
Aclimatação de sistemas de defesa
Reddy et al., (2004)
Acúmulo de proteínas relacionadas ao estresse
Envolvimento na proteção da estrutura celular e atividade de proteínas
Acúmulo sob estresse Ramanjulu e Bartels (2002), Caltivelli et al.,
(2002)
Adaptado de Cattivelili e colaboradores, 2008.
Como um dos mecanismos de resposta às mudanças no potencial osmótico
do meio, as plantas sintetizam e acumulam metabólitos de baixo peso molecular,
definidos como osmólitos, osmoprotetores ou solutos compatíveis (Hasegawa et al.,
2000; Serraj e Sinclair, 2002; Munns, 2005). Esses compostos quando em altas
Introdução_________________________________________________________________9
Ferreira, B.S.
concentrações na célula, atuam auxiliando no ajuste osmótico, e em baixas
concentrações atuam na proteção celular (Rhodes et al., 2002; Ashaf e Foolad,
2007).
O termo “soluto compatível” faz referência a solutos que não são tóxicos para
a célula vegetal e que, mesmo em altas concentrações no citosol, são compatíveis
com a atividade metabólica (Wyn Jones et al., 1977). Esses solutos aumentam o
volume do citosol mantendo o turgor e promovendo o balanço osmótico (Munns,
2005). O movimento da água ocorre do compartimento com maior potencial hídrico
para o compartimento de menor potencial hídrico. Os osmoprotetores aumentam a
concentração intracelular inibindo a perda de água pela célula e propiciando sua
aquisição (Mahajan e Tuteja, 2005). Os osmoprotetores mais comumente
observados em plantas são: sacarose, prolina, glicina-betaína, manitol, poliois e
sorbitol (Serrano, 1996; Taji et al., 2002; Bartels e Sunkar, 2005).
Um outro mecanismo de ajuste osmótico consiste no aumento do processo de
síntese de proteínas de membrana envolvidas no movimento da água entre os meios
intracelular e extracelular (Hasegawa et al., 2000; Smart et al., 2001). Tais proteínas
são denominadas aquaporinas e fazem parte de uma superfamília de proteínas
altamente conservadas no reino vegetal, conhecidas como MIP (“major intrinsic
protein super-family”), tais proteínas se apresentam sob múltiplas isoformas (Luu e
Maurel, 2005; Zhang et al., 2007). As aquaporinas aumentam a permeabilidade das
membranas, e atuam mediando o transporte de moléculas de água a favor do
gradiente hídrico. Essas proteínas podem transportar também pequenas moléculas
como glicerol, solutos e íons (Quigley et al., 2002; Tyerman et al., 2002; Zhang et al.,
2007). Os estresses provocados por seca e salinidade afetam a regulação da
quantidade das aquaporinas, bem como de sua distribuição no tonoplasto, em
vesículas internas e na membrana plasmática de células vegetais. A ativação e
regulação das aquaporinas constituem mecanismos de controle do fluxo de água e
consequentemente do potencial osmótico nas células vegetais (Hasegawa et al.,
2000; Smart et al., 2001).
1.4.2- Mecanismos de resposta ao efeito iônico
Além das alterações no potencial osmótico, as células vegetais ainda têm seu
estado iônico modificado como resultado da exposição ao estresse salino. O efeito
iônico ocorre como conseqüência da elevada quantidade de íons dispersos no solo.
Introdução_________________________________________________________________10
Ferreira, B.S.
A planta internaliza tais íons o que resulta na alteração da razão Na+/K+, que, por
sua vez, aumenta a concentração dos íons Na+ e Cl- no citoplasma. Esse
desbalanço iônico afeta a atividade enzimática, a regulação gênica e inúmeros
outros processos celulares (Flowers 2004; Munns 2005; Vinocur e Altman 2005; Sahi
et al., 2006).
Para diminuir os níveis citosólicos de Na+, as células vegetais restringem a
aquisição de Na+, acionam mecanismos de compartimentalização de Na+ no vacúolo
e, ainda, ativam proteínas responsáveis por excluir o íon do citoplasma (Hasegawa
et al., 2000; Tester e Davenport, 2003; Davenport et al., 2005; Gepstein et al., 2006).
Desta forma, uma regulação precisa do sistema de transporte de íons, através da
membrana citoplasmática e da membrana do vacúolo, é crítico para a tolerância ao
estresse salino (Chinnusamy et al., 2005).
Para eliminar as altas concentrações intracelulares de íons é realizada a
regulação de proteínas transportadoras de íons que integram a membrana
plasmática e a membrana do vacúolo (Mansour et al., 2003; Ashaf e Harris, 2004).
Tais proteínas têm sido denominadas transportadores de membrana ou proteínas
transportadoras de íons e estão envolvidas com o controle do potencial de
membrana e com a transdução de sinais em plantas (Zimmermann et al., 1999;
Zimmermann e Sentenac, 1999).
Em ambientes hipersalinos as concentrações extracelulares de Na+ são
elevadas, isso favorece a formação de um gradiente eletroquímico, o que possibilita
o transporte passivo de do íon para o interior celular (Blumwald, 2000). A entrada de
Na+ na célula dissipa o potencial da membrana plasmática, o que facilita a entrada
de Cl- contra o gradiente eletroquímico. Esse fenômeno não ocorreria em condições
normais, onde o gradiente eletroquímico na região interna da membrana plasmática
é negativo (-100 a -120mV). Nessas condições, a entrada de Cl- seria mediada por
um transportador ativo. Os mecanismos de entrada de Na+ na célula não são
totalmente esclarecidos, porém, dados fisiológicos indicam que o Na+ compete com
o K+ pelos sítios de ligação localizados nas proteínas transportadoras (Hasegawa et
al., 2000; Munns, 2005).
Introdução_________________________________________________________________11
Ferreira, B.S.
1.4.2.1- Mecanismos de aquisição de Sódio
Em condições fisiológicas as células vegetais tendem a manter uma alta
razão entre os íons K+ /Na+ no citosol, onde os níveis de K+ são relativamente altos e
os níveis de Na+ são baixos (Tester e Davenport, 2003; Munns et al., 2006).
Em seu estado normal as células vegetais possuem uma concentração de K+
de 100-200mM, enquanto que as concentrações de Na+ são cerca de 20 vezes
menores, variando de 1-10mM (Taiz e Zeiger, 2002). O K+ é um dos íons mais
abundantes no meio intracelular, e é um nutriente essencial para as plantas,
enquanto que o íon Na+, se passar da concentração basal, torna-se tóxico para o
sistema vegetal (Takahashi et al., 2007). É de grande importância se elucidar os
mecanismos de seletividade de transporte entre os íons Na+ e K+, uma vez que uma
das rotas para a entrada de Na+ na célula é através de transportadores de K+ (Maser
et al., 2002).
Dentre as primeiras proteínas transportadoras de íons identificadas em
plantas estão duas proteínas para transporte de K+. Tais proteínas foram
identificadas em plantas de Arabidopsis e denominadas: AKT1 (Arabidopsis K+
transporter 1) e KAT1 (K+ Arabidopsis thaliana channel 1). Os genes para essas
proteínas foram clonados e utilizados para ensaios de complementação funcional em
cepas de leveduras mutantes defectivas para transporte de K+ (Sentenac et al.,
1992; Basset et al., 1995; Spalding et al., 1999). Para concentrações fisiológicas
normais dos íons Na+ e K+ no meio extracelular, tais proteínas são seletivas para K+.
Porém quando ocorre um aumento nos níveis de Na+ no meio externo, tais
carreadores passam a transportar Na+ em vez de potássio, para dentro das células
(Blumwald et al., 2000; Munns, 2005).
Outra proteína transportadora para a aquisição de K+, HKT1, foi inicialmente
caracterizada como um transportador de alta afinidade a K+ (Schachtman e
Schroeder, 1994). Posteriormente, essa proteína foi definida como um simporter
para Na+/K+ em uma variedade de espécies vegetais (Uozumi et al., 2000; Rus et al.,
2001; Golldack et al., 2002). Ensaios demonstraram que baixas concentrações de
Na+ no meio externo estimulam o transporte de K+ pela proteína transportadora e, ao
contrário, o aumento dos níveis de Na+ no meio extracelular, inibe o transporte de K+
pela proteína HKT1, induzindo a aquisição de Na+ para o meio intracelular (Rubio et
al., 1995; Horie et al., 2001; Golldack et al., 2002).
Introdução_________________________________________________________________12
Ferreira, B.S.
Durante estudos realizados por Kader e colaboradores (2006) eles mostraram
que os genes OsHKT1, OsHKT2 e OsVHA (um transportador de H) são regulados
diferencialmente sob variados tempos de exposição a NaCl e têm padrões de
expressão distintos para duas cultivares de arroz, uma sensível e outra tolerante.
Associando seus dados com resultados obtidos por outros pesquisadores para os
mesmos genes, Kader e seus colaboradores (2006), propõem um modelo (Esquema
1) que descreve as possíveis funções para os genes OsHKT1, OsHKT2 OsHKT8 e
OsVHA na manutenção dos níveis intracelulares de Na+ e K+, demonstrando o
importante papel desses transportadores na detoxificação celular e manutenção da
razão Na/K sob estresse salino.
Uma outra família de transportadores com alta afinidade ao íon K+, é a família
de proteínas Kup/Hak, essas proteínas já foram isoladas e caracterizadas em
bactérias, fungos e vegetais superiores (Blumwald, 2000).
Esquema 1. Modelo descrevendo as funções possíveis de OsHKT1, OsHKT2 e OsVHA na homeostáse da regulação citosólica de Na+/K+. OsHKT1 (círculos vermelhos) funciona como um sistema de importação de Na+ (Garciadeblás et al., 2003), OsHKT2 (círculos azuis) funciona como um simporter do par K+-Na+ (Horie et al., 2001), OSHKT8 (círculos verdes) funciona como um transportador de Na+ (mas desempenham um importante papel na manutenção da homeostase de K+ na folha; Rus et al., 2005) e OsVHA (circulos amarelos) energiza o antiporter tonoplastídico de Na+/H+ para compartimentalizar Na+ citosólico dentro dod vacúolos (Golldack e Dietz, 2001). Abreviações: EC- célula epidermal; CC- célula cortical; EnC- célula endodermal; VAC - célula associada aos vasos; BSC - célula do feixe da bainha; MC - célula do mesófilo; CoC - célula companheira.
Adaptado de Kader e colaboradores, 2006.
Xilema Floema
Folha
Faixa de Casparina
Raiz
Introdução_________________________________________________________________13
Ferreira, B.S.
Em plantas, as proteínas HAK (“High Affinity K+ Transporter”) e KUP (K+
Uptake) foram os primeiros transportadores de K+ a serem caracterizados, eles
foram isolados de cevada (Santa-Maria et al., 1997) e Arabdopisis (Quintero e Blatt,
1997), respectivamente, e mostraram similaridade com transportadores de K+ de E.
coli e levedura. Posteriormente, seqüências para HAK e para KUP foram isoladas e
caracterizadas e várias outras espécies vegetais (Rubio et al., 2000; Banuelos et al..
2002; Su et al., 2002; Martinez-Cordero et al., 2004). Apesar de apresentarem uma
afinidade maior ao K+, esses transportadores são permeáveis a íons Na+ quando em
ambientes salinos (Takahashi et al., 2007).
1.4.2.2- Mecanismos de exclusão de sódio
Um dos mecanismos de tolerância à salinidade, desenvolvido pelas plantas é
a exclusão de Na+ do citoplasma de suas células (Zhu, 2002; Mahajam e Tuteja
2005; Sahi et al., 2006). Os altos níveis de Na+ no citosol, adquiridos em função da
alta concentração de cátions do ambiente salinizado, são eliminados por meio de
proteínas transportadoras de íons localizadas na membrana plasmática (Blumwald et
al., 2000; Parida e Das, 2005).
Um dos principais componentes envolvidos na tolerância ao estresse salino é
a via de sinalização SOS (“Salt Overly Sensitive”). Essa via é composta por três
proteínas, SOS1, SOS2 e SOS3, que ao interagirem culminam na exclusão de Na+
do citoplasma e, ainda, influenciam na ativação de outras proteínas transportadoras
atuando para o restabelecimento da omeostase iônica (Mahajan e Tuteja, 2005;
Munns, 2005). Essas proteínas foram identificadas por Liu e Zhu em 1998, durante
ensaios de caracterização de mutantes de Arabdopisis.
A descoberta da via SOS foi muito importante para a compreensão dos
mecanismos de resposta ao estresse salino, uma vez que possibilitou a associação
das vias de transporte iônico com a sinalização induzida por Ca2+ (Zhu, 2002).
Vários trabalhos apontam para um aumento da concentração de Ca2+ no meio
intracelular como resposta à salinidade. As moléculas de Ca2+ são carreadas para o
interior celular vindas do apoplasto, o aumento transiente da concentração do íon
dispara uma cascata de sinalização que inicia o processo de adaptação celular ao
estresse (Cramer et al., 1987; Lauchli e Schubert, 1989; Knight et al., 1997; Liu e
Zhu, 1998).
Introdução_________________________________________________________________14
Ferreira, B.S.
O gene SOS3 codifica uma proteína que possui um domínio de ligação ao
Ca2+. Quando os níveis intracelulares de Ca2+ estão altos, esses íons se ligam à
SOS3 e a proteína altera sua conformação. Essa mudança conformacional habilita
SOS3 a interagir com a próxima proteína da via, a SOS2 (Ishitani et al., 2000).
O gene SOS2 codifica uma proteína do tipo serina/treonina quinase que
possui um domínio catalítico amino-terminal e um domínio regulatório carboxi-
terminal. Em uma situação normal a proteína SOS2 permanece em estado inativo,
em um sistema de auto-inibição (Albrecht et al., 2001). A proteína SOS3 interage
com a SOS2 retirando-a de seu estado de auto-inibição e tornando-a uma proteína
quinase ativa, em um sistema dependente de Ca2+ (Halfter et al., 2000).
No próximo passo da via a proteína SOS2 fosforila a proteína SOS1 ativando-
a. SOS1 e uma proteína que possui domínios transmembrana e tem atividade
antiporter de Na+/H+, uma vez ativada essa proteína inicia um mecanismo de
exclusão de Na+ do citoplasma (Shi et al., 2000).
Além da ativação de SOS1, é proposto que o complexo SOS2-SOS3
influenciem na atividade de outros transportadores de íons. Zhu (2002) sugeriu que
o complexo SOS2-SOS3 atue inibindo a expressão do gene HKT1 ou inativando a
proteína. HKT1 media o transporte de Na+ para o citoplasma durante o estresse
salino, uma vez que o sistema SOS2-SOS3 inative esse transportador contribui para
o restabelecimento da omeostase iônica. Trabalhos realizados por Quintero e
colaboradores (2002) demonstraram que SOS2-SOS3 interagem com proteínas
antiporter de Na+/H+ localizados no vacúolo e contribuem para o processo de
compartimentalização do Na+. O esquema 2 resume o mecanismo de funcionamento
da via SOS e sua atuação na resposta ao estresse salino (Mahajan e Tuteja, 2005).
O mecanismo de exclusão de Na+ depende de um gradiente eletroquímico
gerado por proteínas de membrana plasmática conhecidas como H+-ATPase. Tais
proteínas são codificadas por uma família multigênica (Hasegawa, 2000). Em
Arabdopisis thaliana foram identificados 10 genes que codificam diferentes
subunidades de H+-ATPases. Genes para essas ATPases têm sido clonados de
diferentes espécies vegetais (Morsomme e Boutry, 2000).
Introdução_________________________________________________________________15
Ferreira, B.S.
Esquema 2. Regulação da omeostase iônica por SOS e vias relacionadas à adaptação ao estresse salino. O estresse salino é percebido por receptores desconhecidos (?) presentes na membrana plasmática (PM) da célula. Isto inclui uma perturbação citosólica de cálcio, a qual é sentida por SOS3, que modifica sua conformação de uma maneira dependente de Ca2+ e interage com SOS2. Essa interação libera SOS2 de sua auto-inibição resultando em sua ativação. SOS2 ativada e em complexo com SOS3, fosforila SOS1, um antiporter Na+/H+, resultando em efluxo do excesso de Na+. O complexo SOS3-SOS2 interage e influencia outras vias de resposta a sal, resultando em omeostase iônica. Este complexo inibe a atividade de HKT1 (transportador de Na+ de baixa afinidade) restringindo a entrada de Na+ para o citosol. SOS2 interage com NHX (antiporter Na+/H+ de vacúolo), ativando-o, o que resulta no seqüestro do excesso de íons Na+, contribuindo, mais uma vez, para a omeostase iônica. CAX1 (antiporter H+/Ca2+) foi identificado como um alvo adicional para SOS2, sua atividade contribui para a restauração da omeostase de Ca2+.
Adaptado de Mahajan e Tuteja, 2005.
Estresse salino (excesso de Na +)
Sensor de sal?
Aumento de Ca +2
Proteínas motoras?
?
SOS3 (CBL) (Sensor de Ca +2)
SOS2 (CIPK)
SOS3 + SOS2 CAX1
Homeostase de Ca+2
(Antiporter de V-Ca+/H+)
?
HKT (Transportador de Na +
de baixa afinidade) NHX
(Antiporter de V-Na +/H+) SOS1
(Antiporter de PM-Na +/H+)
Efluxo de PM-Na + Bloqueio da entrada de Na + Na+ no vacuolo
Na+ CITOPLASMÁTICO BAIXO
TOLERÂNCIA Á SALINIDADE
TRANSPORTADORES
Introdução_________________________________________________________________16
Ferreira, B.S.
1.4.2.3- Mecanismos de compartimentalização de sódi o e cloro
As plantas são capazes de compartimentalizar o Na+ dentro do vacúolo, e
esse pode constituir um mecanismo de tolerância à salinidade (Blumwald et al.,
2000). O processo de compartimentalização de Na+ no vacúolo requer transporte
dependente de energia. Observa-se que um dos efeitos imediatos do tratamento
com NaCl é a alcalinização do vacúolo. Proteínas antiporter de Na+/H+ associadas a
vesículas tonoplastídicas foram indicadas como parcialmente responsáveis por essa
alcalinização (Hasegawa et al., 2000).
As proteínas antiporter de Na+/H+ promovem o transporte de Na+ para o
interior do vacúolo utilizando a energia do gradiente eletroquímico gerado por
proteínas de membrana de vacúolo que translocam prótons H+ (Blumwald, 1987;
Hasegawa et al., 2000). Transportadores do tipo antiporter de Na+/H+ têm sido
caracterizados em levedura. Foi demonstrado que um transportador denominado
NHX1, tem participação no seqüestro intracelular de Na+, nesses organismos (Nass
et al., 1997).
A primeira proteína antiporter de Na+/H+ identificada em plantas foi
encontrada em Arabdopisis thaliana e denominada AtNHX1 (Apse et al., 1999;
Gaxiola et al., 1999). O gene AtNHX1 codifica uma proteína de tonoplasto que atua
compartimentalizando íons Na+ dentro do vacúolo (Gaxiola et al., 1999). A expressão
de AtNHX1 sofre aumentos consideráveis sob estresse mediado por NaCl e KCl,
sugerindo uma rota na resposta à estresse osmótico e iônico (Schachtman e Liu,
1999). A atividade desses antiporteres tem sido relacionada a várias espécies
vegetais como: arroz (Fukuda et al., 1999), algodão (Wu et a.,l 2004), trigo (Brini et
al., 2005), Atriplex gmelini (Hamada et al., 2001) e Brassica napus (Wang et al.,
2003).
As proteínas transportadoras responsáveis por gerar o gradiente de prótons
no vacúolo são as H+-ATPases (V-ATPase) e as H+-PPases (VPPase) (Blumwald,
1987). As V-ATPases constituem um complexo multienzimatico composto por 10
subunidades. Essa holoenzima é caracterizada em plantas e as subunidades que a
compõe são: A, B, C, D, E, F, G, H, subunidade Proteolipídica e subunidade c
(Ratajczak, 2000). As V-PPase são bombas de H+ encontradas em membranas de
vacúolo de plantas. Dois clones de cDNA codificando V-PPases de arroz (OVP1 e
OVP2) foram isolados e seqüenciados. As V-PPases têm sido encontradas
unicamente em plantas vasculares e algas (Sakakibara et al., 1996). Foram
Introdução_________________________________________________________________17
Ferreira, B.S.
encontradas algumas diferenças quanto a sensibilidade entre as V-PPases e as
demais bombas de prótons H+. As V-ATPases são seletivamente inibidas por azida,
vanadato e bafilomicina. É sabido que nenhum desses compostos inibe as V-
PPases, sendo estas inibidas especificamente por aminometilendifosfanato e
3,3’,4’,5-tetrachorosalicilamida (Sakakibara et al., 1996).
Além da compartimentalização do Na+, a planta envia os íons Cl- excedentes
no citoplasma para o interior do vacúolo. Este transporte é mediado por proteínas
transportadoras ou carreadores de membrana que se acoplam ao Cl- e movimentam
este íon através do vacúolo a favor do gradiente de prótons. É sugerido que
transportadores antiporter de Cl-/H+ também estejam envolvidos nos processos de
compartimentalização deste ânion no vacúolo (Hasegawa et al., 2000).
Transportadores de cloro têm sido isolados em algumas espécies e uma família
conhecida como CLC tem sido mais estudada (Barbier-Brygoo et al., 2000).
Com base nos trabalhos de identificação e caracterização dos diferentes
canais, bombas e transportadores de íons envolvidos nos mecanismos de resposta
vegetal ao estresse salino, nós apresentamos um modelo (Esquema 3) que
representa a distribuição e localização, na célula vegetal, dos principais
transportadores envolvidos com os mecanismos de aquisição, efluxo e
compartimentalização de íons durante o estresse salino.
1.5 – Plantas de arroz e cana-de-açúcar como modelo s de estudo
1.5.1- A cana-de-açúcar ( Saccharum sp.)
Estudos indicam que a cana-de-açúcar é originária da Nova Guiné, no início
do século XX existiam 167 variedades nativas dessa espécie na região (Lima 1984;
Cesnik e Miocque, 2004; Barbosa, 2007). No Brasil a cana-de-açúcar foi introduzida
dois anos após o descobrimento do país, Martin Afonso de Souza iniciou a cultura
em 1502 na Capitania de São Vicente (Barbosa, 2007).
A cana-de-açúcar pertence à família Poaceae, uma família economicamente
importante da qual também fazem parte os cereais: milho, trigo, arroz, sorgo, entre
outros. As cultivares modernas de cana-de-açúcar são híbridos derivados do
cruzamento de Saccharum officinarum e Saccharum spontaneum.
Essa espécie se desenvolve em forma de touceiras, possui uma parte
subterrânea representada por raízes e rizomas e uma parte aérea, composta por
Introdução_________________________________________________________________18
Ferreira, B.S.
Altas concentrações de NaCl
Citosol
Vacúolo
Esquema 3- Transportadores de íons localizados na membrana plasmática e na membrana de vacúolo em células vegetais. Proteínas transportadoras de sódio, cloro e hidrogênio envolvidas nos mecanismos de aquisição, efluxo e compartimentalização de íons.
Introdução_________________________________________________________________19
Ferreira, B.S.
colmos, onde se alternam folhas formando uma bainha. Ainda compõe a parte aérea
uma inflorescência do tipo panícula, onde se encontram as flores, que são
hermafroditas (Lima, 1984; Cesnik e Miocque, 2004).
A cultura canavieira está distribuída em cerca de 20 milhões de hectares em
mais de 90 países, a maioria destes localizados no terceiro mundo. Essa
monocotiledônea vem sendo amplamente cultivada e utilizada na economia
agroindustrial, o seu principal produto é a sacarose que é acumulada no colmo da
planta (Vettore et al., 2003).
No Brasil, essa cultura ocupa um papel de destaque desde o período colonial,
quando produtos extraídos, como o açúcar, o álcool, a aguardente, e os resíduos
industriais, já apresentavam valor comercial (Figueiredo, 2000; Meirelles, 2006).
O maior responsável pelo substancial aumento da cultura açucareira no Brasil
foi um programa nacional criado há 26 anos, chamado PROÁLCOOL (Programa
Nacional do Álcool) (Bocado, 1998). O PROÁLCOOL foi um importante programa de
incentivo ao uso de um combustível alternativo ao petróleo, o álcool.
Conseqüentemente, este programa incentivou a cultura canavieira, já que dessa
cultura é possível obter-se bilhões de litros de álcool, um combustível de baixa
emissão de carbono (Masuda, 2001). Segundo dados do IBGE, o Brasil, que é o
maior produtor mundial de cana-de-açúcar, possuindo uma área plantada de 7,04
milhões de hectares e produção de cerca de 442 milhões de toneladas da planta. De
acordo com as estimativas de mercado a exportação de açúcar e álcool foi
responsável por, aproximadamente, 53% do valor total de agroprodutos exportados
pelo país (Brasil, 2006a; Brasil, 2007).
Em 1999, elevado volume de recursos foi investido em pesquisas para o
conhecimento do genoma da cana-de-açúcar. Foi criado o projeto SUCEST
(“Sugarcane EST Genome Project”) financiado pela FAPESP e FAPEPE. Esse
projeto visou seqüênciar genes transcritos em diferentes tecidos de cana-de-açúcar
sob variadas condições fisiológicas (Vettore et al., 2001). O resultado deste projeto
foi a obtenção de 291,689 ESTs (“Expressed Sequence Tags”), que foram
agrupados em 43,141 “Clusters” (Vettore et al., 2003).
Os dados de seqüências gerados pelo projeto SUCEST, somados a utilização
de ferramentas como bioinformática, macro e microarranjos, têm sido de primordial
importância para a identificação de novos genes de cana-de-açúcar, bem como para
estudos de genômica funcional, transcriptoma e expressão gênica (Vettore et al.,
Introdução_________________________________________________________________20
Ferreira, B.S.
2001; Drummond et al., 2001; Ferreira, 2002; Nogueira et al., 2003; Vettore et al.,
2003; Araújo et al., 2005; De Rosa Jr et al., 2005; Nogueira et al., 2005; Camargo et
al., 2007; Rocha et al., 2007).
1.5.2- O arroz ( Oryza sativa L.)
O arroz é o principal componente da dieta de mais da metade da população
mundial, e é amplamente cultivado tanto em regiões tropicais quanto naquelas de
clima temperado. O arroz, juntamente com o trigo, cevada e milho, pertence à
família Poaceae, uma família de monocotiledôneas em Angiospermae. Tal família,
subdivide-se em três subfamílias: Bambuscoideae (ex. arroz e bambu),
Festucoideae (ex. trigo e cevada) e Pinacoideae (ex. Milho e Sorgo). Na subfamília
Bambuscoideae, todos os membros são primariamente adaptados às áreas
chuvosas ou regiões pantanosas tropicais. O gênero Oryza compreende cerca de 20
espécies, dentre as quais apenas 2 são cultivadas, Oryza sativa L. e Oryza
glaberrima Steud. A primeira delas é amplamente cultivada, em regiões tropicais e
temperadas, enquanto a segunda é endêmica do leste da África.
Cultivares de arroz, Oryza sativa foram classificados inicialmente em 2
principais tipos, designados Indica e Japônica. A diferenciação envolveu caracteres
morfológicos e sorológicos (Kato et al., 1928). Um terceiro tipo foi identificado por
Matsuo (1952), designado como tipo C e, posteriormente denominado Javânica
(Morinaga, 1954).
O ciclo de vida do arroz varia entre 100 e 210 dias. Em climas temperados, a
duração média entre o plantio e a colheita é de aproximadamente 140 dias. A
temperatura e o comprimento do dia são os fatores ambientais que exercem mais
influencia sobre o desenvolvimento de plantas de arroz. Segundo Vergara (1970), o
desenvolvimento de plantas de arroz pode ser dividido em 3 fases: A fase vegetativa
(compreendida entre a germinação da semente e o inicio da formação da panícula);
a fase reprodutiva (entre a formação da panícula e a antese) e a fase de
amadurecimento (entre a antese e a completa maturação). A diferença na duração
total do desenvolvimento deve-se principalmente a fase vegetativa, cuja duração
depende da sensibilidade do cultivar ao comprimento de dia e à temperatura
(Vergara, 1970; Vergara e Chang, 1976).
Cerca de 73% da produção mundial de arroz é obtida por meio de cultivo com
Introdução_________________________________________________________________21
Ferreira, B.S.
irrigação. Em contrapartida, sabe-se que o mau uso das técnicas de irrigação aumenta
a salinidade dos solos a níveis prejudiciais às plantas. Assim, faz-se necessário o
desenvolvimento de cultivares de arroz que apresentem tolerância ao estresse salino,
para compensar o aumento da salinidade nesses solos.
A progressiva salinização de solos agriculturáveis limita a distribuição de
plantas por diversas áreas naturais e diminui as opções de espaços cultiváveis.
Adicionalmente, o estresse salino é responsável por grandes quedas da
produtividade agrícola de espécies vegetais economicamente importantes. Tal
estresse, promove modificações na fisiologia vegetal, alteração de vias
bioquímicas, acarreta toxicidade metabólica, indução de espécies reativas de
oxigênio (ROS), desequilíbrio iônico e osmótico, e alteração da expressão
gênica a níveis transcricional e pos-transcricional. Diante aos danos causados
pela salinidade aos tecidos vegetais, uma regulação precisa da resposta ao
estresse salino representa um passo chave para a adaptação e sobrevivência
vegetal. Assim, a compreenção dos mecanimos de regulação gênica em
resposta ao estresse salino torna-se uma linha de investigação de grande
relevância para desvendar as rotas de resposta de espécies vegetais ao
estresse salino. Dentro deste contexto, o presente trabalho teve como objetivo
geral a identificação de genes envolvidos na resposta ao estresse salino,
através de macroarranjo, em plantas de arroz e cana-de-açúcar. Para tanto
este estudo foi dividido em duas partes. A primeira parte foi dedicada à
identificação de genes de arroz e cana-de-açúcar, envolvidos na resposta a
salinidade através de hibridação heteróloga e validação da expressão dos
genes identificados pela utilização da técnica de RT-PCR semiquantitativo,
neste manuscrito a primeira parte foi referida como Capítulo 1 e intitulada
“Estudo da regulação de genes em resposta ao estresse salino em cana-de-
açúcar e arroz através de ensaios de hibridação hereróloga.” Durante a
segunda parte do presente trabalho o objetivo principal foi à implementação da
técnica de macroarranjo, para a análise de genes de cana-de-açúcar (cv.
CB47-89), diferencialmente expressos durante a exposição à NaCl, essa parte
foi referida como Capítulo 2 e recebeu o título “Implementação da técnica de
macroarranjo para o estudo da regulação degenes de cana-de-açúcar em
resposta ao estresse salino”.
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Ferreira, B.S.
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ZIMMERMANN, S.; SENTENAC, H. Plant ion channels: from molecular structures to
physiological functions. Current Opinion in Plant Biology, v. 2, p. 477-482, 1999.
Capítulo 1
ESTUDO DA REGULAÇÃO DE GENES EM RESPOSTA AO ESTRESSE SALINO EM CANA-DE-AÇÚCAR E ARROZ ATRAVÉS D E
ENSAIOS DE HIBRIDAÇÃO HERERÓLOGA
Introdução _____________________________________________________________ Capítulo 1_ 36
1- INTRODUÇÃO
A identificação e caracterização de genes de resposta e/ou resistência ao
estresse salino em plantas tem sido alvo de diversas pesquisas em todo o mundo.
Nos últimos anos, têm se destacado as análises comparativas de genomas
(Nogueira et al., 2003; Guillaumie et al., 2007); o uso de bibliotecas de subtração
(Sahi et al., 2003; Shiozaki et al., 2005); e a análise da expressão de conjuntos
gênicos, em larga escala, através de macroarranjos e microarranjos de DNA (Rocha,
2007; Guillaumie et al., 2007). Investigações utilizando macroarranjos permitiram
caracterizar genes de reposta em Zea mays, Arabidopsis thaliana, Oryza sativa,
Medicago truncatula, entre outras espécies (Boursiac et al., 2005, Sahi et al., 2006,
Jia et al., 2006, Merchan et al., 2007).
Dentre as espécies vegetais de interesse econômico, o arroz tem sido
bastante caracterizado quanto a sua reposta a salinidade (Kim et al., 2007; Chitteti e
Peng, 2007). Diversos trabalhos têm permitido a identificação de genes e vias
ativados durante a resposta ao estresse salino, em variedades de arroz sensíveis e
tolerantes (De Souza-Filho et al., 2003; Kader et al., 2006). A cana-de-açúcar, por
sua vez, é uma monocotiledônea que tem despertado crescente interesse em todo o
mundo, como uma importante matéria-prima para a produção de biocombustíveis
(Schubert, 2006; Somerville, 2007). Entretanto, os conhecimentos acerca dos
mecanismos de resposta a estresses ambientais, incluído a salinidade, são
escassos nesta espécie (Joshi e Naik, 1980; Plaut et al., 2000).
Os trabalhos de seqüênciamento e análise do transcriptoma da cana-de-
açúcar têm fornecido novas ferramentas para a identificação de genes de interesse
(Vettore et al., 2003; Vincentz et al., 2004; Rocha et al., 2007). A comparação entre
o transcriptoma de cana-de-açúcar e as seqüências do genoma de arroz revelou que
81,6% dos genes apresentam similaridade (Vincentz et al., 2004). A similaridade de
seqüências entre os genes das duas espécies torna viável o estudo comparativo da
expressão gênica pela aplicação da técnica de hibridação heteróloga. Essa
abordagem tem sido amplamente utilizada para estudos comparativos da expressão
gênica entre diferentes espécies de mamíferos (Hitell e Storey, 2001), peixes (Renn
et al., 2004), insetos (Meiklejohn et al., 2003) e plantas (Tasseva et al., 2004). Esses
trabalhos têm permitido a identificação de vários genes de plantas, regulados em
resposta a diferentes condições ambientais e envolvidos em variadas vias
Introdução _____________________________________________________________ Capítulo 1_ 37
metabólicas (Girke et al., 2000; Amagai et al., 2003; Tasseva et al., 2004). Uma vez
detectados, os genes expressos diferencialmente são, então, validados em seus
sistemas homólogos (Amagai et al., 2003).
O presente trabalho teve como objetivo a identificação de genes de resposta
à salinidade através da utilização de um sistema de hibridação heteróloga.
Inicialmente, realizou-se uma caracterização de atividade fotossintéticas através da
medida de Fv/Fm e uma caracterização dos danos provocados pelo estresse salino
em ambas as espécies através de ensaios para mensurar a peroxidação de lipídios.
Em seguida, transcritos obtidos de folhas de plantas de arroz, em condição controle
ou tratada com 150 mM de NaCl, foram utilizados como sonda em um ensaio de
hibridação contra membranas de macroarranjo contendo 2.304 clones de cDNA de
cana-de-açúcar. Dentre os clones induzidos, três foram selecionados para validação
via RT-PCR semiquantitativo, com iniciadores homólogos, tanto em amostras de
arroz quanto de cana-de-açúcar. Adicionalmente, tais genes tiveram sua expressão
avaliada, em cana-de-açúcar, quanto à resposta temporal ao estresse salino, bem
como aos estresses promovidos por estresse osmótico PEG (polietilenoglicol),
ferimento e KCl.
Objetivos_______________________________________________________________Capítulo 1_ 38
2- OBJETIVOS
O ojetivo da primeira parte do presente trabalho (Capítulo 1) foi a
identificação de genes de resposta à salinidade através da utilização de um
sistema de hibridação heteróloga.
2.1- OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1- Caracterizar a Fv/Fm e a peroxidação de lipídios de tecido foliar de plantas
de cana-de-açúcar e arroz, para avaliação dos danos provocados pelo
estresse salino em ambas as espécies;
2- Hibridar membranas de macroarranjo contendo 2.304 clones de cDNA de
cana-de-açúcar transcritos contra sonda de cDNA obtido de folhas de plantas
de arroz, em condição controle ou tratada com 150 mM de NaCl;
3- Validar os dados obtidos por macroarranjo, via RT-PCR semiquantitativo,
com iniciadores homólogos, tanto em amostras de arroz quanto de cana-de-
açúcar;
4- Avaliar a expressão, em cana-de-açúcar, dos genes SsENO1, SsNAC23 e
SsADH1 quanto à resposta temporal ao estresse salino, bem como aos
estresses promovidos por PEG, ferimento e KCl.
Materiais e Métodos ________________________________________________Capítulo 1_
Ferreira, B.S.
39
3- MATERIAL E MÉTODOS
3.1- Material Biológico
3.1.1. Material vegetal e condições de cultivo
Sementes de arroz (Oryza sativa L., cv Taichung Native 1) foram obtidas do
International Rice Institute, Los Baños, Filipinas. As sementes foram germinadas em
substrato (Plantmax) e mantidas em casa de vegetação, com fotoperíodo de 12h, até
a idade de 14 dias.
Plântulas de cana-de-açúcar, cv CB47-89, cultivadas in vitro foram cedidas pelo
pesquisador Josil Carneiro- Biofábrica- UFRRJ- Campos Leonael Miranda. As
plântulas de cana-de-açúcar, com 15 dias, foram mantidas in vitro em meio MS
(Murashige e Skoog, 1962) e repassadas para frascos estéreis contendo MS a cada
15 dias. As plântulas foram utilizadas com 60 dias de idade.
Plantas de cana-de-açúcar, cv CB47-89, cultivadas em solo por 120 dias, foram
cedidas pelo pesquisador Josil Carneiro- Biofábrica- UFRRJ- Campos Leonael
Miranda. As plantas foram mantidas em casa de vegetação por 48h e, então utilizadas
para ensaios de fisiologia.
3.1.2- Condições de tratamento das plantas de arroz e cana-de-açúcar para ensaios de
RT-PCR e fisiologia
3.1.2.1- Tratamentos para os ensaios de RT-PCR
Plantas de arroz com 14 dias, foram transferidas do substrato (Plantmax), para
vermiculita e embebidas em solução nutritiva (Yoshida, 1976). A um grupo de plantas
foi adicionado 150 mM de NaCl (tratado) e outro grupo não recebeu o agente
estressante (controle), após 24h as plantas foram coletadas, divididas em folhas,
bainhas e raízes e, então, armazenadas a -20oC. As plântulas de cana-de-açúcar, com
60 dias, foram transferidas para meio MS acrescido (tratadas) ou não (controles) de
150 mM de NaCl. As plantas foram coletadas após 0, 3, 24 e 48 h de exposição a
NaCl, separadas em folhas, bainhas, e raízes, e armazenadas a -20oC. Um outro grupo
de plântulas foi submetido aos seguintes estresses: 150 mM de NaCl, 150 mM de KCl,
PEG 15% e ferimento durante 24 h. Após esse período, as plântulas foram separadas
Materiais e Métodos ________________________________________________Capítulo 1_
Ferreira, B.S.
40
em folhas, bainhas, e raízes, e armazenadas a -20oC. Todos os ensaios de estresse
foram realizados em duplicata.
3.1.2.2- Tratamentos para os ensaios de fisiologia
Plantas de arroz com 14 dias, foram transferidas do substrato (Plantmax), para
vermiculita e embebidas em solução nutritiva (Yoshida, 1976). A um grupo de plantas
foi adicionado 150 mM de NaCl (tratado) e outro grupo não recebeu o agente
estressante (controle). As plantas foram mantidas em NaCl durante 24 horas, e, tanto
as tratadas como a controle, foram utilizadas para leituras de FV/Fm nos intervalos de
0, 2, 4, 6, 8, 12, 18 e 24 h. As plantas controle e tratadas tiveram suas folhas
coletadas no tempo 24h para a realização dos ensaios de peroxidação.
Plantas de cana-de-açúcar, com 120 dias, mantidas em solo, foram embebidas
em solução nutritiva (Yoshida, 1976) contendo 150mM de NaCl (tradada) ou sem NaCl
(controle). As plantas foram mantidas em NaCl durante 24 horas, e, tanto as tratadas
como a controle, foram utilizadas para leituras de FV/Fm nos intervalos de 0, 2, 4, 6, 8,
12, 18 e 24 h. As plantas controle e tratadas tiveram suas folhas coletadas no tempo
24h para a realização dos ensaios de peroxidação. Todos os ensaios foram realizados
em seis réplicas. Apenas três das réplicas foram utilizadas para os ensaios de
peroxidação de lipídios.
3.2- Análise fisiológica e bioquímica das plantas t ratadas com estresse salino
3.2.1- Medidas de eficiência fotoquímica do fotossistema II
A análise da eficiência fotoquímica foi feita por meio de um fluorímetro portátil
de luz modulada (MINI-PAM, Walz, Alemanha). A eficiência fotoquímica do
fotossistema II (Fv/Fm) foi estimada pela razão variável (Fv=Fm-Fo) para o campo
de fluorescência máxima. As amostras foram adaptadas ao escuro por 20 min e a
fluorescência mínima (F0) foi obtida com medições dentro da freqüência de 600 Hz,
onde o campo de máxima fluorescência (Fm) foi determinado após exposição a um
pulso de luz saturante de 0,8 s. Todas as leituras foram feitas na região mediana da
primeira folha intacta completamente expandida, abaixo do cartucho foliar, foram
realizadas seis repetições. As medidas de Fv/Fm foram realizadas a partir do início
do estresse (tempo 0) e após 2, 4, 6, 8, 12, 18 e 24 h de exposição a 150 mM de
Materiais e Métodos ________________________________________________Capítulo 1_
Ferreira, B.S.
41
NaCl para arroz e cana-de-açúcar.
3.2.2- Determinação da peroxidação de lipídeos
A peroxidação lipídica foi determinada pelo conteúdo de MDA
(malondialdeido), baseado na metodologia proposta por Dhindsa e Matowe (1981).
Foram utilizados para os ensaios 500 mg de tecido foliar de cana-de-açúcar e 73 mg
de tecido foliar arroz de amostras tratadas (150 mM de NaCl por 24 h) e controles
(sem NaCl). As amostras foram homogeneizadas em 5 mL de uma solução contendo
TCA (ácido tricloroacético) 0,175mM e PVPP (polivinil poli pirrolidona) 0,0175mM. O
homogenato foi centrifugado a 10000Xg por 5 min e o sobrenadante usado para o
experimento. Para cada alíquota de 1 mL do sobrenadante foram adicionados 4 mL
da solução de TCA 20% contendo TBA (ácido tiobarbitúrico) 0,5%. A mistura foi
aquecida a 95 °C por 30 min e então resfriada rapid amente em gelo. Após
centrifugação de 10000 x g por 10 min, a absorvância do sobrenadante foi lida a 535
nm e corrigida pela subtração da absorbância não-específica a 600 nm. Devido a
limitada especificidade do método, a concentração de espécies reativas de TBA foi
calculada usando o coeficiente de extinção de 155 mM-1 cm-1, e os resultados foram
expressos como nmol TBARs por grama de tecido fresco.
3.3- Análises do padrão de expressão gênica das pla ntas submetidas ao
estresse salino
3.3.1- Hibridação das membranas de cDNA
As membranas de nylon Hybond-N (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)
contendo os 2.304 clones de cDNA de cana-de-açúcar foram confeccionadas de
acordo com metodologia descrita por Nogueira et al., (2003) a partir de diferentes
bibliotecas de cDNA: calos tratados e não tratados por frio (CL6), cartucho foliar
(LR1/LR2), meristema apical (AM1/AM2), plântulas infectadas com H.
rubrisubalbicans (HR1) ou A. diazotroficans (AD1) e inter-nó (ST1/ST2) de cana-de-
açúcar. Os clones foram adquiridos do Centro de Brasileiro de Coleção de Clones
(BCCCenter, UNESP, Jaboticabal, Brasil). Cada EST foi fixado duas vezes em cada
membrana.
Materiais e Métodos ________________________________________________Capítulo 1_
Ferreira, B.S.
42
Para estimar variações na quantidade de DNA nos pontos de hibridação da
membrana foi marcada uma sonda de oligonucleotídeos que reconheciam a
seqüência do gene Ampr contida no vetor pSPORT (Invitrogen) usado nas
bibliotecas de cDNA (Vettore et al., 2001). Esta sonda foi sintetizada por PCR com
os iniciadores ‘5-GTGGTCCTGCAACTTTATCCGC-3’ e ‘5-
TAGACTGGATGGAGGCGGATAA-3’ na presença de [33P]CTP. Após hibridação e
lavagens as membranas foram expostas por 96 h em “imaging plates” e então foram
escaneadas em phosphorimager FLA3000-G (Fujifilm,Japão).
Após registro da imagem, a sonda foi removida das membranas através de
fervura em solução contendo 0,175mM de SDS. Em um segundo momento, as
membranas foram hibridadas com a sonda de cDNA de arroz tratado e controle. A
hibridação ocorreu durante 18 h a 42 oC seguindo as especificações descritas pelo
protocolo de Schummer et al., (1997), salvo pequenas alterações. Após a hibridação
foram efetuadas duas lavagens com 2x SSC (60mM de citrato de sódio e 600mM de
NaCl), 0,175mM SDS, uma com 1x SSC, 0,175mM SDS e duas lavagens com 0,1x
SSC, 0,175mM SDS, todas a 65 oC por 15 min (Desprez et al., 1998). Após as
lavagens as membranas foram expostas por 96 h em “imaging plates” e então
escaneadas em “PhosphorImager” FLA3000-G (Fujifilm, Japão).
3.3.2- Extração de RNA total e síntese de cDNA
RNA total foi extraído de tecido foliar de plantas de arroz controle e tratado com
150 mM de NaCl por 24 h pelo método de extração baseado em LiCl-Fenol (Prescott
e Martin, 1987). As reações de transcrição reversa foram realizadas usando 30 µg
de RNA total, 156 pmoL de Oligo (dT18v), 0,5 x Tampão de Primeira Fita (Gibco-
BRL); 5 mM DTT; 20 U RNAguard; 0,5 mM ATG; 50 µCi α33P-dCTP; 250 U
SuperScript II (Gibco - BRL). Foi realizada uma incubação a 42 ºC por 20 min, em
seguida foi feito um acréscimo de 0,25 mM dCTP e incubação por mais 1 h. A sonda
foi purificada em coluna G-50 (AP-Biotech, U.S.A.) de acordo com recomendações
do fabricante. A incorporação de α33P-dCTP na sonda marcada foi medida em um
contador de cintilação líquida (1217 Rack Beta).
3.3.3- Análise de dados das membranas de Macroarranjo
O programa ArrayVision (Imaging research, Canadá) foi usado para
quantificação dos sinais nos pontos de hibridação das membranas. As áreas para
Materiais e Métodos ________________________________________________Capítulo 1_
Ferreira, B.S.
43
analise foram delimitadas manualmente ao redor de cada ponto de hibridação e o
“background” local foi subtraído automaticamente. Para a normalização da
inetensdade de sinal entre as membranas replica, foi criado um fator de correção
correspondente à média dos valores de intensidade de sinal de todos os pontos de
hibridação de cada membrana. Os fatores foram aplicados aos valores de
intensidade de cada ponto de hibridação, resultando em uma razão correspondente
ao valor do sinal corrigido (Schummer et al., 1999). Em cada filtro, a variação de
sinal entre os pontos replica foi medido como a razão entre sua intensidade de sinal.
Para calcular a hibridação não-específica nos filtros, 12 pontos representando o
plasmidio vazio foi usado, em cada membrana, como um controle negativo para a
hibridação. Os ESTs de cana-de-açúcar com valores de intensidade maiores do que
a média de intensidade do controle negativo, mais 2 vezes o desvio padrão foram
considerados para análise. O desvio padrão e a média da razão de expressão (log2
transformado) para membranas tratadas por NaCl formam estimados, para
estabelecer a base na qual, um dado ponto de hibridação representaria uma
alteração na expressão gênica. ESTs mostrando um padrão de expressão com
valores de pelo menos 1,5 SD acima da média da razão de expressão do tratamento
em comparação ao controle foram usados (p>0,05) (Nogueira et al., 2003; De Rosa
Jr et al., 2005).
3.3.4- RT e PCR semiquantitativo
RNA total de folhas de plântulas de cana-de-açúcar e plantas de arroz foi
extraído com Trizol (Invitrogen), seguindo as recomendações do fabricante.
Aproximadamente 30 µg de RNA total foi utilizado para purificação de mRNA usando
o kit PolyAT tract mRNA Isolation System IV (Promega).
Para a reação de transcrição reversa 0,5 µg de mRNA foram adicionados de
70 pmoL de Oligo (dT18v), 1x Tampão de Primeira Fita (Invitrogen), 10 mM de DTT,
20 U de RNAse Out (Invitrogen), 1,0 mM de dNTPs e 100 U da enzima Superscript II
(Invitrogen). A reação foi incubada a 42 ºC por 90 min.
Para a PCR foram utilizados 0,5 µl de cDNA, 0,2 mM dNTPs, 1,5 mM MgCl2,
1X Taq buffer (MBI Fermentas, Lituânia), 10 pmol de iniciadores (Tabela 1), 2 U de
Taq DNA polimerase I (MBI Fermentas, Lithuania) em um programa (94 oC por 45 s,
Tm oC [Tabela 1] por 45 s, 75 oC por 1 min e 30 s). As condições de PCR para cada
gene foram estão listadas na Tabela 1.
Materiais e Métodos ________________________________________________Capítulo 1_
Ferreira, B.S.
44
As amostras da PCR foram separadas em gel de agarose 1,2% e coradas em
SYBR Gold Nucleic Acid Stain (Invitrogen), segundo recomendações do fabricante.
A intensidade das bandas foi determinado através do software TotalLab-TL100
(Nonlinear Dynamics). A intensidade relativa de cada banda foi normalizada pelos
valores de intensidade de banda da actina (controle interno), gerando-se, assim uma
razão numérica corrigida.
Tabela 1: Lista dos iniciadores usados durante os ensaios de RT-PCR semiquantitativo
Espécie vegetal Gene Iniciadores (forward-F e reverse-R) Tm (ºC) ciclos
cana-de-açúcar SsENO1 F 5’-TGGAAAGGGTTGTCATTGGA-3’
R 5’-GTAGACAGCAGCAGCACCAA-3’ 55 28
cana-de-açúcar SsADH1 F 5’-AGCTAGGAAGTTTGGTTGTA-3’
R 5’-CAGCATTGACTCTTTTATTA-3’ 57 33
cana-de-açúcar Actina F 5’-TGGTGCAGAGAGGTTCAGGT-3’
R 5’-TCACAAACAGGTCACGAAGC-3’ 55 28
cana-de-açúcar/
arroz SsNAC23
F 5’-CAGAGCCAGCCCAAGAT-3’
R 5’-GCACTACCTACCCCCATT-3’ 55 27
arroz SsENO1 F 5’-CTTCTTAGGATTGAGGAGG-3’
R 5’-GCCATAATAACAAAAGCCAT-3’ 55 23
arroz SsADH1 F 5’-TTGGAGAGGGTGTGACTGAT3’
R 5’-CATACCGTACTATTACTGATTGA-3’ 60 35
arroz Actina F 5’-TCCATCTTGGCATCTCTCAG-3’
R 5’-GTACCCGCATCAGGCATCTG-3’ 55 25
Resultados _______________________________________________________Capítulo 1_
Ferreira, B.S.
45
4- RESULTADOS
4.1- Efeito do estresse salino sobre eficiência fot oquímica e a peroxidação de
lipídios em arroz e cana-de-açúcar
O efeito fisiológico do tratamento com 150 mM de NaCl em plantas de arroz e
cana-de-açúcar foi avaliado pela estimativa do dano causado no rendimento
quântico do fotossistema II (PSII) (Fv/Fm). Conforme apresentado na Figura 1A, o
estresse ocasionado pelo NaCl durante as primeiras 18 h de exposição afeta
severamente o rendimento quântico do PSII em plantas de arroz. Após as primeiras
18 h os níveis de rendimento quântico do PSII começam a subir, revelando uma
tendência ao restabelecimento dos valores iniciais de Fv/Fm, chegando a uma
recuperação quase total às 24 h de exposição ao NaCl. Em contrapartida, para
cana-de-açúcar, o tratamento com 150 mM de NaCl, durante 24 h, não promoveu
danos detectáveis ao rendimento quântico do fotossistema II (Figura 1A).
Amostras das mesmas plantas foram utilizadas para avaliação dos níveis de
peroxidação de lipídeos, representados pela concentração TBARS. Como pode ser
observado na Figura 1B, o nível de peroxidação é aproximadamente 63% maior em
plantas de arroz sob estresse salino, e aproximadamende 67% maior em plantas de
cana-de-açúcar tradadas com NaCl.
Juntos, os resultados fornecidos pelas análises de Fv/Fm e peroxidação de
lipídios revelam que, em cana-de-açúcar, embora o estresse não seja suficiente para
promover perdas de rendimento quântico da fotossíntese, danos ao sistema de
membranas podem ser observados.
4.2- Identificação de genes de arroz e cana-de-açúc ar induzidos por estresse
salino através de hibridação heteróloga
A identificação de genes induzidos em resposta ao estresse salino foi
realizada através de um ensaio de macroarranjos, via hibridação heteróloga.
Membranas contendo clones de cDNA de cana-de-açúcar, provenientes de
bibliotecas de cDNA de calos tratados por frio e calor (CL6), plantas de cana-de-
açúcar infectadas por H. rubrisubalbicans (HR1) ou A. diazotroficans (AD1), cartucho
foliar (LR1/LR2), inter-nó (ST1/ST2) e meristema apical (AM1/AM2), foram
hibridadas contra sonda de cDNA obtidas a partir de tecido foliar de plantas de arroz
Resultados _______________________________________________________Capítulo 1_
Ferreira, B.S.
46
Figura 1- Efeito do estresse salino sobre funções f isiológicas em arroz e cana-de-açúcar . (A) Variação de Fv/Fm em plantas de arroz (TN-1) e cana-de-açúcar (CB47-89) medida em diferentes tempos de exposição a estresse mediado por 150mM de NaCl. Cada ponto corresponde ao valor médio de 6 experimentos independentes para cada tratamento. As medições foram efetuadas por um fluorímetro de luz modulada. As barras verticais representam o desvio padrão entre as 6 repetições independentes (B) A peroxidação de lipídeos foi determinada, indiretamente, pelo conteúdo de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) em nmol/g de tecido vegetal. Resultados de peroxidação para plantas de arroz (TN-1) e cana-de-açúcar (CB47-89) controle (barras pretas) e tratada com 150mM de NaCl por 24h (barras cinzas). As barras verticais representam o desvio padrão entre as médias de 3 repetições independentes.
0
1 0
2 0
3 0
4 0
5 0
6 0
7 0
8 0
9 0
1 0 0
1 1 0
TB
AR
S (
nmo
l g-1 F
W)
0
1 0
2 0
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4 0
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7 0
8 0
9 0
1 0 0
1 1 0
TB
AR
S (
nmo
l g-1 F
W)
0 4 8 1 2 1 6 2 0 2 4 2 80 ,0
0 ,1
0 ,2
0 ,3
0 ,4
0 ,5
0 ,6
0 ,7
0 ,8
Fv/
Fm
T im e (H o u r s )
C o n tro l N a C l 1 5 0 m M
A Arroz Cana-de-açúcar
B
Controle NaCl 150 mM Controle NaCl 150 mM
0 2 4 6 8 1 2 1 8 2 40 , 0
0 , 1
0 , 2
0 , 3
0 , 4
0 , 5
0 , 6
0 , 7
0 , 8
Fv/
Fm
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C o n t r o l N a C l 1 5 0 m M
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l g-1 F
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0 4 8 1 2 1 6 2 0 2 4 2 80 ,0
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0 ,2
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0 ,7
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Fv/
Fm
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A Arroz Cana-de-açúcar
B
Controle NaCl 150 mM Controle NaCl 150 mM
0 2 4 6 8 1 2 1 8 2 40 , 0
0 , 1
0 , 2
0 , 3
0 , 4
0 , 5
0 , 6
0 , 7
0 , 8
Fv/
Fm
T im e ( H o u r s )
C o n t r o l N a C l 1 5 0 m M
Arroz Cana-de-açúcar
Tempo (horas) Tempo (horas)
Controle Controle
Resultados _______________________________________________________Capítulo 1_
Ferreira, B.S.
47
expostas a NaCl (24 h) ou não (controle). Foram analisados 2.304 clones de cDNA
de cana-de-açúcar distribuídos em três membranas distintas, o ensaio foi realizado
em duplicata (Figura 2).
A análise das membranas permitiu identificar 14 genes induzidos por estresse
salino. A Tabela 2 apresenta os clones identificados, os níveis de significância, os
valores de indução e o grau de similaridade das seqüências com genes já
caracterizados em diferentes espécies. Os genes induzidos foram agrupados
segundo o sistema de categorização descrito por Vettore e colaboradores (2003),
como se segue: três genes envolvidos no metabolismo de RNA e transcrição
(endoribonuclease E, helicase, “RING Zinc Finger Protein”), três envolvidos com
bioenergética (S-adenosilmetionina decarboxilase, álcool desidrogenase, enolase).
Quatro seqüências não apresentaram função conhecida quando comparadas em
bancos de dados internacionais de seqüências e apresentaram similaridade com
seqüências de O. sativa. Foi identificada, ainda, uma seqüência similar ao gene
SsNAC23, previamente identificado em cana-de-açúcar como responsivo a
estresses ambientais. Os demais genes encontrados estão envolvidos com o
crescimento e desenvolvimento vegetal, dinâmica celular e metabolismo de
proteínas.
Três genes foram escolhidos para validar os dados de macroarranjo, através
de RT-PCR semiquantitativo, em arroz e cana-de-açúcar. Os genes que codificam
uma enolase (denominado SsENO1), SsNAC23 e álcool desidrogenase
(denominado SsADH1) tiveram seu padrão de expressão avaliado em folhas
controle e tratadas (24 h de exposição a 150 mM de NaCl). Na Figura 3, estão
representados os gráficos de expressão para os três genes, em ambas as espécies.
Resultados _______________________________________________________Capítulo 1_
Ferreira, B.S.
48
Figura 2- Representação da membranas utilizadas para os ensai os de Macroarranjos. Membranas réplicas (contendo os mesmos ESTs nas mesmas posições) foram hibridadas com cDNA de tecido foliar de plantas de arroz não estressadas por NaCl controle e submetidas a 24h de estresse com 150mM NaCl. Três membranas contendo 768 clones de cDNA cada foram hibridadas, totalizando 2.304 clones investigados. O ensaio foi realizado em triplicata.
Controle NaCl 150mM
(Replica 1)
(Replica 2)
(Replica 3)
Controle NaCl 150mM
(Replica 1)
(Replica 2)
(Replica 3)
Resultados _______________________________________________________Capítulo 1_
Ferreira, B.S.
49
Tabela 2- Genes induzidos por estresse salino em cana-de-açúcar e arroz identificados por macroarranjo
a Número de acesso no GenBank b Função esperada segundo resultados de similaridade de seqüência no GenBank (BLASX) c Indução estimada de níveis estatisticamente significantes d Taxas de expressão entre a intensidade normalizada relativa a tratamento (NaCl) e o controle
Acesso a Provável Função b E-Value Similaridade Indução exp. 1 c
Inducão exp. 2 c Pd
Bioenergética
CA096227 S-Adenosilmetionina
Decarboxilase 1E-09
Narcissus pseudonarcissus 3,1 2,1 <0,04
CA180022 Álcool Desidrogenase 1E-77 Zea mays 3,4 2,0 <0,04
CA097056 Enolase 2 1E-95 Zea mays 2,1 12,7 <0,04
Metabolismo de ácidos nucléicos
CA120545 Helicase 4E-51 Arabidopsis thaliana 2,8 3,0 <0,01
CA097046 Endoribonuclease E 5E-72 Oryza sativa 3,5 1,9 <0,04
CA097080 Provável “RING Zinc Finger “ 3E-37 Arabidopsis thaliana 1,8 3,0 <0,04
Metabolismo de proteínas
CA120056 Proteína Ribosomal L9 60S 3E-78 Oryza sativa 3,9 3,9 <0,01
Dinâmica celular
CA119600 Proteína ligada a Calmodulina
Kinesina-like 2E-43 Zea mays 4,2 2,7 <0,01
Resposta ao estresse
CA097882 NAC23 3E-117 Saccharum sp 2,1 3,4 <0,04
Desenvolvimento da planta
CA096206 Fator de resposta a Auxina
(ARF1) 2E-38
Phyllostachys praecox 2,3 2,7 <0,01
Função desconhecida
CA096459 Proteína hipotética 3E-32 Oryza sativa 1,8 2,6 <0,04
CA096434 Proteína hipotética 2E-31 Oryza sativa 1,8 2,0 <0,04
CA096435 Proteína hipotética 1E-48 Oryza sativa 1,8 5,6 <0,04
CA096025 Proteína hipotética 2E-04 Oryza sativa 2,1 1,8 <0,04
Resultados _______________________________________________________Capítulo 1_
Ferreira, B.S.
50
Na Figura 3A estão representados os resultados de indução para o gene
SsENO1. Os valores de indução encontrados por RT-PCR confirmam os resultados
encontrados nos ensaios de macroarranjo. A exposição ao estresse provocou uma
indução do gene em 3,5 vezes para cana-de-açúcar e em 2,8 vezes para arroz, com
relação às plantas controle. Similarmente, o gene SsNAC23 é induzido por NaCl em
arroz e cana-de-açúcar, mostrando uma resposta mais acentuada em cana-de-
açúcar (Figura 3B). Os resultados para os genes SsENO1 e SsNAC23 mostraram
que esses genes são induzidos em cana-de-açúcar e arroz confirmando os dados de
macroarranjos (Figura 3A e 3B). No entanto, o gene para SsADH1 apresentou
resultados diferentes para cana-de-açúcar e arroz (Figura 3C). Em arroz o gene
demonstrou uma indução de 5,3 vezes sob estresse salino, esse dado está de
acordo com os resultados de macroarranjo, onde houve uma indução de 2,7 vezes.
Em contraste, para cana-de-açúcar, o gene foi reprimido em resposta ao estresse
salino.
4.3- Expressão dos genes SsEno1, SsNAC23 e SsADH1 de cana-de-açúcar em
resposta a diferentes tempos de exposição à NaCl
Foi realizado um ensaio de RT-PCR semiquantitativo para investigar a
expressão dos genes SsENO1, SsNAC23 e SsADH1 em folhas de cana-de-açúcar,
após exposição a 150 mM de NaCl durante 0, 3, 24 e 48 h (Figura 4). O gene
SsENO1 apresenta uma indução de 1,4 vezes nas primeiras 3 h de exposição da
planta ao estresse salino, chegando a 2,2 vezes dentro de 24 h (Figura 4A). Após 24
h, a expressão do gene entra em declínio.
O gene SsNAC23 é fortemente induzido por estresse salino em folhas de
cana-de-açúcar, com o maior nível de indução dentro das primeiras 3 h de
exposição. Mesmo após 48 h, o gene apresenta níveis de indução 1,3 vezes
maiores que o controle (Figura 4B).
O gene SsADH1 apresenta uma discreta indução nas primeiras 3 h de
estresse (Figura 4C). Após esse período os níveis de expressão tendem a se reduzir
chegando, após 48 h, a valores inferiores aos observados na condição controle.
Novamente, os dados confirmam que, em cana-de-açúcar, o gene SsADH1 é
reprimido após 24 h de estresse salino.
Resultados _______________________________________________________Capítulo 1_
Ferreira, B.S.
51
Figura 3- Validação dos dados de Macroarranjo atrav és de ensaios de RT-PCR semiquantitativo . Produtos de RT-PCR para os genes SsENO1 (A), SsNAC23 (B) SsADH1 (C), de tecido foliar plantas de cana-de-açúcar e arroz controle e tratadas (NaCl 150mM/24h) foram separados em gel de agarose 1,2%. Os gráficos comparam a indução dos genes em ensaios de RT-PCR de arroz, RT-PCR de cana-de-açúcar e Macroarranjo. Os valores representam a média de indução em 2 ensaios independentes.
Controle NaCl 24h Controle NaCl 24h Controle NaCl 24hACTIN
SsENO1
SsENO1RT-PCR Cana RT-PCR Arroz
AArray
SsNAC23
ACTIN
SsNAC23
Controle NaCl 24h Controle NaCl 24h Controle NaCl 24h
BRT-PCR Cana RT-PCR Arroz Array
SsADH1RT-PCR Cana RT-PCR Arroz
ACTIN
SsADH1
C
Controle NaCl 24h Controle NaCl 24h Controle NaCl 24h
Array
1,0
3,52,8
1,0
7,0
1,0
1,0
7,7
1,0
4,2
1,02,8
1,0 0,7 1,0
5,3
1,02,7
Controle NaCl 24h Controle NaCl 24h Controle NaCl 24hACTIN
SsENO1
SsENO1RT-PCR Cana RT-PCR Arroz
AArray
SsNAC23
ACTIN
SsNAC23
Controle NaCl 24h Controle NaCl 24h Controle NaCl 24h
BRT-PCR Cana RT-PCR Arroz Array
SsADH1RT-PCR Cana RT-PCR Arroz
ACTIN
SsADH1
C
Controle NaCl 24h Controle NaCl 24h Controle NaCl 24h
Array
1,0
3,52,8
1,0
7,0
1,0
1,0
7,7
1,0
4,2
1,02,8
1,0 0,7 1,0
5,3
1,02,7
Resultados _______________________________________________________Capítulo 1_
Ferreira, B.S.
52
Figura 4- Análise do padrão de expressão temporal d os genes SsENO1, SsNAC23 e SsADH1 em resposta ao estresse salino em folhas de cana-de-açúcar (CB4789). Produtos de RT-PCR semiquantitativo para os genes SsENO1 (A), SsNAC23 (B) e SsADH1 (C) foram separados em gel de agarose 1,2%. A RT-PCR foi realizada a partir de de tecido foliar de plantas de cana-de-açúcar (CB4789) submetidas a NaCl 150mM em diferentes tempos de exposição. Valores de densitometria das bandas foram utilizados para gerar os gráficos de expressão dos genes estudados. Os valores representam a média de indução em 2 ensaios independentes.
0
5 0
1 0 0
1 5 0
2 0 0
2 5 0
SsADH1
(C)
ACTINA
SsADH1
0
8 0
1 6 0
2 4 0
3 2 0
4 0 0
SsNAC23(B)
ACTINA
SsNAC23
SsENO1
(A) SsENO1
ACTINA
0
2 5
5 0
7 5
1 0 0
1 2 5
1 5 0
0h 3h 24h 48h
1.0 1.42.2
0.5
0h 3h 24h 48 h
1.0
3.1 2.81.3
0h 3h 24h 4 8h
1.0 1.30.7 0.4
Nív
el d
e E
xpre
ssão
Nív
el d
e E
xpre
ssão
Nív
el d
e E
xpre
ssão
0
5 0
1 0 0
1 5 0
2 0 0
2 5 0
SsADH1
(C)
ACTINA
SsADH1
0
8 0
1 6 0
2 4 0
3 2 0
4 0 0
SsNAC23(B)
ACTINA
SsNAC23
SsENO1
(A) SsENO1
ACTINA
0
2 5
5 0
7 5
1 0 0
1 2 5
1 5 0
0h 3h 24h 48h
1.0 1.42.2
0.5
0h 3h 24h 48 h
1.0
3.1 2.81.3
0h 3h 24h 4 8h
1.0 1.30.7 0.4
Nív
el d
e E
xpre
ssão
Nív
el d
e E
xpre
ssão
Nív
el d
e E
xpre
ssão
Resultados _______________________________________________________Capítulo 1_
Ferreira, B.S.
53
4.4- Efeito de diferentes estresses abióticos sobre o padrão de expressão dos
genes que codificam SsENO1, SsNAC23 e SsADH1 de cana-de-açúcar
Ensaios de RT-PCR foram realizados com o intuito de avaliar a expressão dos
genes SsENO1, SsNAC23 e SsADH1, em folhas de plântulas de cana-de-açúcar
expostas a ferimento, estresse osmótico (PEG 15%), estresse salino mediado por
150 mM de NaCl e estresse salino mediado por 150 mM de KCl durante 24 horas
(Figura 5).
O gene SsENO1 mostrou indução para todos os estresses testados (Figura
5A). Ocorreu uma indução de aproximadamente 1,9 vezes para ferimento, 2,1 vezes
para estresse osmótico (PEG 15%), 1,6 vezes para NaCl e 1,1 vezes para KCl.
O gene SsNAC23 também apresentou indução em resposta a todos os
tratamentos (Figura 5B), apresentando uma indução de 1,8 vezes em resposta a
ferimento, indução de 2,4 vezes para estresse osmótico (PEG 15%) e uma indução
de 2,2 vezes para os dois sais testados, NaCl e KCl.
O gene SsADH1 foi induzido 1,2 vezes em resposta a ferimento. Entretanto,
este gene é reprimido em plântulas de cana-de-açúcar expostas, durante 24 h, a
PEG 15%, 150 mM de NaCl e 150 mM de KCl (Figura 5C).
Resultados _______________________________________________________Capítulo 1_
Ferreira, B.S.
54
Figura 5- Perfil de expressão dos genes SsENO1, SsNAC23 e SsADH1 em resposta diferentes estresses abióticos em folhas d e cana-de-açúcar (CB47-89). Produtos de RT-PCR semiquantitativo para os genes SsENO1 (A), SsNAC23 (B) e SsADH1 (C) foram separados em gel de agarose 1,2%. A RT-PCR foi realizada a partir de tecido foliar de plantas de cana-de-açúcar (CB47-89) submetidas diferentes agentes estressantes. Valores de densitometria foram utilizados para gerar os gráficos de expressão dos genes estudados. Os valores representam a média de indução em 2 ensaios independentes.
Nív
el d
e E
xpre
ssão
0
4 0
8 0
1 2 0
1 6 0
SsADH1
(C)
ACTINA
SsADH1
0
7 0
1 4 0
2 1 0
2 8 0
(B)
ACTINA
SsNAC23
SsNAC23
0
1 0 0
2 0 0
3 0 0
(A)
ACTINA
SsENO1
SsENO1
Controle Ferida PEG NaCl KCl
1.01.9 2.1 1.6 1.1
Controle Ferida PEG NaCl KCl
1.01.8
2.4 2.2 2.2
Controle Ferida PEG NaCl KCl
1.0 1.2
0.4 0.50.9
Nív
el d
e E
xpre
ssão
Nív
el d
e E
xpre
ssão
Nív
el d
e E
xpre
ssão
0
4 0
8 0
1 2 0
1 6 0
SsADH1
(C)
ACTINA
SsADH1
0
7 0
1 4 0
2 1 0
2 8 0
(B)
ACTINA
SsNAC23
SsNAC23
0
1 0 0
2 0 0
3 0 0
(A)
ACTINA
SsENO1
SsENO1
Controle Ferida PEG NaCl KCl
1.01.9 2.1 1.6 1.1
Controle Ferida PEG NaCl KCl
1.01.8
2.4 2.2 2.2
Controle Ferida PEG NaCl KCl
1.0 1.2
0.4 0.50.9
Nív
el d
e E
xpre
ssão
Nív
el d
e E
xpre
ssão
0
4 0
8 0
1 2 0
1 6 0
SsADH1
(C)
ACTINA
SsADH1
0
7 0
1 4 0
2 1 0
2 8 0
(B)
ACTINA
SsNAC23
SsNAC23
0
1 0 0
2 0 0
3 0 0
(A)
ACTINA
SsENO1
SsENO1
Controle Ferida PEG NaCl KCl
1.01.9 2.1 1.6 1.1
Controle Ferida PEG NaCl KCl
1.01.8
2.4 2.2 2.2
Controle Ferida PEG NaCl KCl
1.0 1.2
0.4 0.50.9
Nív
el d
e E
xpre
ssão
Nív
el d
e E
xpre
ssão
Discussão _______________________________________________________Capítulo 1_
Ferreira, B.S.
55
5- DISCUSSÃO
O dano ocasionado pela salinidade sobre a eficiência fotoquímica em
diferentes espécies vegetais tem sido demonstrado por muitos trabalhos (Jiang et
al., 2006, Broetto et al., 2007). Neste contexto, a fluorescência da clorofila a é um
parâmetro fisiológico amplamente utilizado para se avaliar o efeito de estresses
ambientais sobre as plantas (Lu et al., 2003, Poulson et al., 2006). No intuito de
avaliar o efeito do estresse salino sobre a eficiência fotoquímica, plantas de cana-de-
açúcar e arroz foram tratadas com 150 mM de NaCl durante um período de 24 h.
Para a razão Fv/Fm, os resultados revelaram que, em arroz, o estresse provocou
forte redução no rendimento quântico da fotossíntese (Figura 1A). Esses dados
estão de acordo com De Souza-Filho e colaboradores (2003) que avaliaram a
eficiência fotossintética de quatro cultivares de arroz e demonstraram que o estresse
salino promove queda na razão Fv/Fm em um período de 24 h. Em cana-de-açúcar,
entretanto, tal condição não foi suficiente para promover inibição, sugerindo maior
tolerância desta espécie, no aspecto avaliado.
Diversos trabalhos têm demonstrado a produção de espécies reativas de
oxigênio (ROS) como resposta ao estresse salino em plantas (Ashaf e Harris, 2004).
O acúmulo de ROS nos tecidos vegetais promove diversos danos ao metabolismo
celular, afetando a estrutura e atividade de enzimas, promovendo quebras em
ácidos nucléicos e gerando a peroxidação de lipídios de membrana (Parida e Das
2005). Nossos trabalhos permitiram verificar que cana-de-açúcar e arroz apresentam
aumento nos níveis de peroxidação lipídica quando expostas ao estresse salino
(Figura 1B), sugerindo a ocorrência de danos oxidativos em ambas as espécies. A
peroxidação de lipídios induzida por estresse em cana-de-açúcar já foi demonstrada
por Molinari e colaboradores (2007), quando expuseram plantas á seca. Portanto,
embora as análises do rendimento quântico da fotossíntese tenham apresentado
dados distintos para arroz e cana-de-açúcar, os dados de peroxidação de lipídios
revelam que a exposição a 150 mM de NaCl promove estresse em ambas espécies.
Muitos estudos têm utilizado arranjos de cDNA para avaliar modificações na
expressão gênica em resposta a estresses, em plantas (Seki et al., 2002, Zheng et
al., 2004, Wang et al., 2004, Sreenivasulu et al., 2006). Similarmente, vários estudos
têm utilizado abordagens de hibridação heteróloga, em arranjos de DNA e cDNA,
Discussão _______________________________________________________Capítulo 1_
Ferreira, B.S.
56
entre espécies geneticamente próximas (Renn et al., 2004; Hittel e Storey, 2001;
Rise et al., 2004; Tasseva et al., 2004; Amagai et al., 2003). Em nossos trabalhos de
macroarranjos, membranas contendo 2.304 ESTs de cana-de-açúcar foram
hibridadas contra sondas de cDNA obtidas de plantas de arroz, expostas ao estresse
salino (Figura 2). Nossos dados revelaram a aplicabilidade de trabalhos de
hibridação heteróloga para a detecção de genes induzidos por estresses entre estas
espécies. Um total de 14 genes mostrou-se induzido em resposta ao estresse
(Tabela 2). A pequena porcentagem de genes identificados pode ser explicada pela
escolha aleatória dos ESTs usados para confecção das membranas. Resultados
semelhantes foram obtidos durante os ensaios realizados por Nogueira e
colaboradores (2003) e De Rosa Jr e colaboradores (2005) que, ao analisarem o
mesmo conjunto de clones de cDNA, encontraram 59 genes induzidos por frio e 26
genes induzidos por metil-jasmonato, respectivamente. Além disso, tais bibliotecas
de cDNA foram construídas a partir de plantas cultivadas em condições normais, ou
seja, não estressadas.
Os ESTs SsENO1, SsNAC23 e SsADH1 foram selecionados para validação
dos macroarranjos via ensaios de RT-PCR semiquantitativo, utilizando
oligonucleotíedeos específicos para cada uma das duas espécies. Os resultados
foram consistentes com os dados obtidos para macroarranjo para os genes SsENO1
e SsNAC23 (Figura 3A e 3B). Para o gene SsADH1 foram encontrados resultados
contrastantes entre macroarranjo e RT-PCR. Tais resultados podem ser explicados
porquê, nos testes de macroarranjo foram utilizadas sondas provenientes de plantas
de arroz, onde a expressão do gene SsADH1 é induzida pelo estresse (Figura 3C).
Enquanto, para os testes de RT-PCR foram utilizados transcritos de cana-de-açúcar,
onde a expressão desse gene é reprimida pelo estresse, conforme demonstrado nas
Figuras 3C, 4C e 5C.
Vários trabalhos demonstram a indução dos genesSsENO1, SsNAC23 e
SsADH1 em resposta a diferentes estresses ambientais em plantas (Minhas e
Grover 1999, He et al., 2005). A enolase (2-phospho-d-glycerate hydratase; 4.2.1.11)
é uma enzima chave na via glicolítica, extensivamente estudada e caracterizada em
várias espécies de fungos, plantas e animais (Giallongo et al., 1986, Lebioda et al.,
1989, Lal et al., 1998). Adicionalmente, esta enzima têm sido associada à resposta
vegetal a estresses ambientais como salinidade, frio, estresse hídrico e hipoxia
(Minhas e Grover 1999, Lal et al., 1998, Lee et al., 2002). Em nossos trabalhos, o
Discussão _______________________________________________________Capítulo 1_
Ferreira, B.S.
57
gene SsENO1 foi induzido em folhas de cana-de-açúcar, em resposta ao estresse
provocado por 150 mM de NaCl, ferimento, PEG 15% e 150 mM de KCl (Figura 5A).
Vários trabalhos têm demonstrado a ativação deste gene em resposta a diferentes
estresses ambientais em Arabidopsis (Lee et al., 2002), milho (Riccardi et al., 1998)
e arroz (Minhas e Grover, 1999), corroborando nossos resultados obtidos em cana-
de-açúcar.
O gene SsNAC23 pertence à família NAC (Nogueira et al., 2005), uma classe
de reguladores transcricionais amplamente caracterizada no reino vegetal (Tran et
al., 2004; Meng et al., 2006). Os membros da família NAC têm sido associados a
mecanismos de desenvolvimento vegetal (Olsen et al., 2005), sinalização hormonal
(Greve et al., 2003), resposta à infecção por patógenos (Selth et al., 2005) e reposta
a diversos estresses ambientais (Tran et al., 2004; Nogueira et al., 2005).
Adicionalmente, genes da família NAC de outras espécies vegetais, como AtNAC em
Arabidopsis e OsNAC em arroz, têm sido descritos como induzidos por estresses
salino (He et al., 2005; Kim et al., 2007). Nossas análises demonstraram que o gene
SsNAC23, em cana-de-açúcar, apresenta forte indução em resposta à ferimento,
PEG 15%, 150 mM de NaCl e 150 mM de KCl (Figura 5B), reforçando as indicações
de que os membros da família NAC estão envolvidos com a resposta a uma série de
estresses ambientais. Nogueira e colaboradores (2005) demonstraram que o gene
SsNAC23 é induzido em cana-de-açúcar em resposta a estresses ambientais como
frio, estresse hídrico e herbivoria.
O gene SsADH1 é induzido em resposta estresses ambientais como frio,
hipoxia, anoxia e estresse osmótico, em diferentes espécies vegetais (Conley et al.,
1999; Tesniere et al., 2006). Nossos resultados permitiram verificar que o gene
SsADH1 foi induzido em arroz em resposta a estresse salino (Figura 3C). Porém, em
cana-de-açúcar o mesmo gene sofre repressão em resposta à salinidade (Figura 3C
e 4C). A indução deste gene por estresse salino foi demonstrada em plantas de
arroz por Minhas e Grover (1999). No entanto, Zhao e colaboradores (2004),
demonstraram que o mesmo gene foi reprimido em resposta a estresse salino em
Brassica campestris. Os dados contrastantes destes dois trabalhos ajudam a
compreender os resultados observados durante nosso trabalho, onde arroz e cana-
de-açúcar apresentaram um padrão diferenciado de expressão do gene SsADH1 em
resposta ao estresse salino.
Discussão _______________________________________________________Capítulo 1_
Ferreira, B.S.
58
Os resultados obtidos no presente trabalho permitiram identificar genes
associados à resposta à salinidade em cana-de-açúcar e arroz, e a caracterização
da expressão de três deles em resposta a outros estresses ambientais. A detecção
de cDNAs de cana-de-açúcar para os quais não existem seqüências similares nos
bancos de dados, abre a perspectiva para a descoberta de novas proteínas de
resposta à salinidade. Adicionalmente, o presente trabalho demonstra a
funcionalidade do uso de sistemas de hibridação heteróloga, em ensaios de
macroarranjos, para estudos de expressão gênica entre arroz e cana-de-açúcar.
Conclusões_______________________________________________________Capítulo 1_
Ferreira, B.S.
59
6- CONCLUSÕES
1- Os ensaios de eficiência quântica do PSII não permitiram avaliar os danos
causados pelo estresse salino ao sistema fotossintético de cana-de-açúcar.
Os dados sugerem uma maior tolerância dessa espécie aos danos causados
ao PS II durante as primeira 24 h de exposição ao estresse salino;
2- Foi possível verificar que cana-de-açúcar e arroz apresentam aumento nos
níveis de peroxidação lipídica quando expostas ao estresse salino. Tais dados
sugerem a ocorrência de danos oxidativos em ambas as espécies;
3- Os ensaios de macroarranjo permitiram identificar 14 genes induzidos por
estresse salino em cana-de-açúcar e arroz;
4- Os dados de indução encontrados durante os ensaios de macroarranjo foram
validados por RT-PCR semiquantitativo nos sistemas homólogos;
5- Os genes SsENO1 e SsNAC23 são induzidos por NaCl, PEG, ferimento e KCl
em cana-de-açúcar. Entretanto, o gene SsADH1 foi reprimido e resposta aos
mesmos estresses.
Bibliografia_______________________________________________________Capítulo 1_
Ferreira, B.S.
60
7- BIBLIOGRAFIA
AMAGAI, M; ARIIZUMI, T; ENDO, M.; HATAKEYAMA, K.; KUWATA, C.; SHIBATA,
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Capítulo 2
IMPLEMENTAÇÃO DA TÉCNICA DE MACROARRANJO PARA O ESTUDO DA REGULAÇÃO DE GENES DE CANA-DE AÇÚCAR EM
RESPOSTA AO ESTRESSE SALINO
Introdução________________________________________________________Capítulo 2_
Ferreira, B.S.
68
1- INTRODUÇÃO
O estresse salino é considerado um dos estresses ambientais mais deletérios
para as plantas, pois seus efeitos afetam quase todas as funções vegetais (Bohnert
e Jensen, 1996). A salinidade impõe grandes danos às lavouras ocasionando perdas
significativas na produtividade agrícola (Mansour et al., 2003; Munns, 2005; Sahi et
al., 2006).
Por sua severidade, os efeitos do estresse salino sobre os tecidos vegetais,
têm sido alvo de estudos e pesquisas desde a década de 70 (Flowers et al., 1977).
Durante os últimos 30 anos muito foi elucidado sobre os complexos mecanismos de
tolerância e suscetibilidade das plantas ao estresse salino. Porém, ainda não se
compreende com exatidão os eventos fisiológicos, morfológicos, bioquímicos e
genéticos que fazem parte dos processos de resistência e adaptação ao estresse.
A resistência e adaptação vegetal ao estresse salino é conseqüência da
alteração de diversas características, geneticamente complexas e multigênicas
(Wang et al., 2003; Denby e Gehring, 2005; Vinocur e Altman, 2005; Valliyodan e
Nguyen, 2006). Pesquisas em transcriptomica e genômica têm contribuído
significativamente para a identificação e avaliação de tais características genéticas,
revelando uma grande quantidade de genes regulados por estresse salino.
A compreensão do funcionamento desses genes, bem como a análise de seu
perfil de expressão pode ajudar a elucidar os mecanismos de tolerância ao estresse
salino. Neste sentido, ferramentas de biologia molecular e engenharia genética, tais
como bioinformática, macroarranjos, microarranjos, RT-PCR semiquantitativo e Real
Time PCR, têm sido amplamente utilizadas.
A bioinformática possibilita análises comparativas de genomas através de
manipulação de bancos de dados de seqüências (Vettore et al.,, 2003; Guillaumie et
al. 2007), além da análise da ocorrência de genes de interesse em diferentes
bibliotecas de cDNA tecido-específicas, em uma abordagem conhecida como
“análise de expressão in silico” ou “Northern eletrônico” (Nogueira et al., 2003;
Araújo et al., 2005; Cavalcante et al., 2007). A utilização da bioinformática permite,
ainda, a identificação de novos genes dentro de bancos de dados de diferentes
espécies, abordagem conhecida como mineração de dados (Drummond et al., 2001;
Ferreira, 2002; Araújo et al., 2005; Nogueira et al., 2005).
Para analise de expressão gênica em larga escala e investigação de
Introdução________________________________________________________Capítulo 2_
Ferreira, B.S.
69
bibliotecas de subtração a abordagem mais utilizada é aquela baseada em arranjos
de DNA em membrana (macroarranjo) (Zheng et al., 2004; Sahi et al., 2006; Walia et
al., 2006;). Essa metodologia tem sido utilizada para estudos de expressão gênica
em muitas áreas de pesquisa variando da biotecnologia a biomedicina (Hittel e
Storey, 2001; Lombardi et al., 2006; Rocha et al., 2007).
A técnica de macroarranjo consiste, basicamente, na imobilização de
seqüências de DNA gene-específicas (os clones de uma biblioteca de cDNA, por
exemplo) em uma matriz sólida (membrana de nylon) para a hibridação com
moléculas de DNA marcadas, as sondas (Freeman et al., 2000; Tamaoki et al., 2004,
Dawes e Glassey, 2007). A análise dos “pontos de hibridação” possibilita inferências
acerca de quais genes estão sendo regulados nas condições de realização do
ensaio (De Rosa Jr et al., 2005; Zheng et al., 2006). Investigações utilizando
macroarranjos têm permitido identificar muitos genes que são induzidos em resposta
a estresses abióticos e bióticos em diferentes espécies vegetais (Seki et al., 2002;
Frank et al., 2005; Jia et al., 2006; Camargo et al., 2007).
No Brasil, dentre as diversas espécies vegetais economicamente importantes,
tem sido dado grande destaque às pesquisas com cana-de-açúcar, onde os
trabalhos visam à elucidação dos mecanismos de resposta, dessa monocotiledônea,
a estresses bióticos e abióticos, através da aplicação de tecnologias bioquímicas e
de biologia molecular.
A cana-de-açúcar é uma espécie vegetal de grande importância econômica
para o Brasil. Dentro do estado do Rio de Janeiro, a cultura canavieira tem sua maior
produção no município de Campos dos Goytacazes. O município é o segundo maior
produtor nacional de cana-de-açúcar, tendo alcançado cerca de 95 mil ha de área
colhida e 89 milhões de reais de faturamento em 2005 (Brasil, 2006). Mesmo com
números tão promissores, um grave problema vem prejudicando a produtividade da
cultura canavieira na região, o estresse salino. Apesar, de uma considerável
quantidade de dados científicos que vem sendo gerada, pouco ainda é entendido
sobre os processos de tolerância e adaptação da cana-de-açúcar ao estresse salino.
Assim, faz-se necessário um maior esforço na tentativa compreender e elucidar os
mecanismos de resposta da planta a este estresse.
Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivo a identificação de
genes de resposta ao estresse salino em cana-de-açúcar (cv CB47-89). Utilizando
ferramentas de bioinformática foram identificados 370 ESTs de cana-de-açúcar
Introdução________________________________________________________Capítulo 2_
Ferreira, B.S.
70
envolvidos com os processos de resposta à salinidade. Foram realizados ensaios de
macroarranjo para investigar o perfil de expressão gênica dos 370 genes em tecido
radicular e tecido foliar de plantas de cana-de-açúcar submetidas a 175mM de NaCl
durante 48h.
Objetivos_________________________________________________________Capítulo 2_
Ferreira, B.S.
71
2- OBJETIVO
A segunda parte deste trabalho (Capítulo 2) teve como objetivo a identificação
de genes de cana-de-açúcar (cv CB47-89) regulados em resposta ao estresse salino
através de ensaios de macroarranjo.
2.1- OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1- Identificar ESTs de cana-de-açúcar ortólogos a genes associados aos
mecanismos de resposta ao estresse salino em plantas;
2- Implementar a metodologia de arranjos de DNA em membrana para análise
da expressão de genes de cana-de-açúcar em resposta ao estresse salino;
3- Identificar de regulados em resposta a exposição a 175mM de NaCl em tecido
radicular e foliar de plantas de cana-de-açúcar cultivar CB47-89.
Materiais e Métodos_________________________________________________Capítulo 2_
Ferreira, B.S.
72
3- METODOLOGIA
3.1- Identificação de ESTs de cana-de-açúcar dentro do banco de dados do
SUCEST
Foram selecionadas em diferentes espécies vegetais diversas proteínas, cuja
resposta estava relacionada ao estresse salino. Essas proteínas foram utilizadas
para a identificação de seqüências ortologas de cana-de-açúcar, dentro do banco de
dados do SUCEST (http://sucest.lad.dcc.unicamp.br/en/).
Uma vez escolhidas as diferentes proteínas alvo, seu nome ou sigla foi
utilizado como chave para as buscas dentro do SUCEST, através da utilização da
ferramenta busca por palavra chave (cluster by Keyword)
(http://sucest.lad.dcc.unicamp.br/cgi-bin/prod/blastkwsearch/blastkwsearch.pl) Figura
1A e B). Essa ferramenta realiza a seleção de todas as seqüências contidas no
banco de dados do genoma da cana-de-açúcar que tenham relação com o nome,
sigla ou código de acesso da proteína alvo. Como resultado, o programa gerou uma
lista com todos os “Clusters” (arquivo contendo seqüências similares para um
mesmo gene) relacionados a cada proteína alvo, seqüências essas com diferentes
níveis de similaridade entre as diferentes espécies (Figura 1C). Foi necessário
assim, um refinamento para seleção dos “Clusters” que seriam analisados.
Com esse fim, uma segunda abordagem foi utilizada. Foram obtidas
seqüências de aminoácidos das proteínas selecionadas de espécies evolutivamente
próximas à cana-de-açúcar. Com essas seqüências foi utilizada a ferramenta
“tblastn” do SUCEST. Tal ferramenta analisa e traduz uma seqüência de
aminoácidos, fornecida como dado de entrada, na seqüência de nucleotídeos, a ela
correspondente. Por fim, a ferramenta “tblastn” utiliza a seqüência deduzida de
nucleotídeos para busca comparativa com seqüências nucleotídicas armazenadas
no banco de dados. Deste modo, o tblastn/SUCEST fornece como saída, o
alinhamento de todos os “Clusters” de cana-de-açúcar similares a seqüência da
proteína alvo.
Após comparação dos resultados obtidos do uso das ferramentas “busca por
palavra chave” e “tblastn” a seleção final ESTs foi baseada em dois critérios: 1)
“Clusters” que ocorreram durante a utilização de ambas as ferramentas ao mesmo
tempo e 2) “Clusters” com valores de e-value (similaridade) até 1e-10.
Materiais e Métodos_________________________________________________Capítulo 2_
Ferreira, B.S.
73
Figura 1- Seleção inicial do “Clusters” de cana-de- açúcar relacionados à resposta ao estresse salino. Para identificação dos ESTs de cana-de-açúcar foi realizada mineração no banco de dados do SUCEST. Com esse fim o banco de dados do projeto SUCEST foi acessado, na opção serviços (seta preta) (A)e a ferramenta de busca por palavra-chave (keyword) foi utilizada para identificação de “Clusters” relacionados às proteínas alvo (seta vermelha) (B), como resultado foi gerada uma lista de todos os “Clusters” de cana-de-açúcar associados à palavra chave utilizada (C).
(A) (B)
(C)
Materiais e Métodos_________________________________________________Capítulo 2_
Ferreira, B.S.
74
Os experimentos realizados nesta estapa foram baseados na metodoogia
descrita por Ferreira, 2002.
3.2- Material biológico
3.2.1- Material vegetal e condições de cultivo
Plantas de cana-de-açúcar (Saccharum sp.), cultivar CB47-89, foram obtidas
da UFRRJ-Campus Leonel Miranda-Campos dos Goytacazes. As plantas de cana-
de-açúcar foram fornecidas com 120 dias de idade e foram imediatamente usadas
para o experimento.
3.2.2- Ensaios de estresse
Para submeter as plantas ao estresse salino, estas foram cuidadosamente
retiradas da substrato de suporte (mistura de solo e adubo) e tiveram suas raízes
lavadas em água destilada. Em seguida foram transferidas para solução nutritiva
(Yoshida, 1976). Um grupo de plantas teve o agente estressante (NaCl 175mM)
acrescido ao meio e outro grupo, considerado como controle, não recebeu o agente
estressante. As raízes das plantas foram mantidas sob aeração constante. Os ensaios
foram realizados em duplicata. As plantas foram mantidas no ambiente estressante e
não estressante (sem NaCl) durante 48 h. Decorrido esse período as plantas tiveram
suas folhas, caules e raízes separadamente coletadas e imediatamente armazenadas
a -20oC.
3.2.3- Bactérias contendo os clones do SUCEST
Bactérias Echirichia coli contendo os clones de cDNA do SUCEST foram
adquiridas do BCC Center- Jaboticabal. As bactérias foram inoculadas em meio
CircleGrown (Q-Biogene) líquido contendo 60 µg/ml de amplicilina. O inóculo foi
incubado a 37oC sob agitação durante 16h. Todos os clones foram armazenados em
culturas permanentes. Para tanto, 700 µl de cultura foram acrescidos de 300 µl de
glicerol 50%, as amostras foram homogeneizadas e armazenados a -70oC.
Materiais e Métodos_________________________________________________Capítulo 2_
Ferreira, B.S.
75
3.3- Ensaio de macroarranjo
3.3.1- Extração de RNA total de folha e raiz de plantas de cana-de-açúcar
Toda a vidraria utilizada para extração de RNA foi levada a estufa a 180 ºC
por 12 h e as soluções utilizadas foram tratadas com dietilpirocarbonato (DEPC) e
autoclavadas, tais procedimentos visam garantir a eliminação da atividade de
RNAses.
Para extração de RNA de folhas foram macerados 0,5 gramas do tecido em
almofariz, na presença de nitrogênio líquido. Todo o produto macerado foi
transferido para tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Em seguida foi adicionado 1 mL
de Trizol (GibcoBRL) e a amostra foi agitada vigorosamente, e, em seguida,
centrifugada a 12000 Xg durante 10 min a 8 ºC. O sobrenadante foi coletado e
incubado a 30 ºC por 5 min e em seguida acrescido de 200 µL de clorofórmio. A
amostra foi vigorosamente agitada e incubada à 30 ºC por mais 3 min, e centrifugada a
12000 Xg durante 15 min a 8 ºC. A fase superior foi transferida para outro tubo de
1,5 mL e a ela foram adicionados 500 µL de isopropanol. Após misturar por inversão,
a amostra foi incubada por 10 min a 30 ºC e centrifugada durante 10 min a 12000 Xg
a 8 ºC. O precipitado, resultante, foi lavado em etanol 75% e centrifugado a 7500 Xg
por 5 min a 8 ºC. Após centrifugação o precipitado foi seco e ressuspenso em 50 µL
de água DEPC.
Para extração de RNA de raízes foi utilizado o método de extração por LiCl-
Fenol (Prescott e Martin, 1987).
Após extração do RNA total dos dois tecidos, as amostras ressuspensas
foram, então, submetidas à eletroforese em gel de agarose 0,8% para quantificação
e registro. A cada amostra de RNA (1 µL) foram adicionados 14 µL de tampão de
amostra (glicerol 10%, tris-HCl 50 mM pH 7.0, azul de bromofenol 0,02% e água
DEPC) e a amostra foi aplicada em gel de agarose. Após a eletroforese, o gel foi
visualizado sob luz UV e registrado com o auxílio de um fotodocumentador (VDS-
Eagle Eye II).
Aproximadamente 30 µg de RNA total, de folhas e raízes de cana-de-açúcar,
foram utilizados para purificação de RNA mensageiro usando o kit “PolyAT tract
mRNA Isolation System IV” (Promega), seguindo as recomendações do fabricante.
3.3.2- Síntese da sonda de cDNA de folhas e raízes de cana-de-açúcar
Materiais e Métodos_________________________________________________Capítulo 2_
Ferreira, B.S.
76
Foram utilizados 5 µg de RNA mensageiro (volume de 6 µL), purificado a
partir de RNA total de folhas ou raízes de plantas de cana-de-açúcar (cultivar CB47-
89) estressadas (NaCl 175mM) e controle (sem agente estressante), ambas em
duplicata (Ensaio 1 e Ensaio 2), para síntese de cDNA. Aos 30 µg de RNA foram
acrescentados 300 pmoL de Oligo (dT18v) e água DEPC q.s.p. 30 µL. Essas
reações foram aquecidas a 75 ºC por 10 min e em seguida incubadas em gelo por 5
min. As reações iniciais foram adicionadas de: 1x First Strand Buffer (Gibco - BRL); 5
mM de DTT; 100U de RNAguard; 1 mM de uma mistura dos nucleotídeos dATP,
dTTP e dGTP; 30 µCi α-nucleotideos dCTP32; 250 U SuperScript II (Gibco - BRL) e
água DEPC q.s.p. 50 µL. As reações foram incubadas a 42 ºC por 20 min, em
seguida foram adicionados 0,25 mM dCTP. As reações de marcação da sonda foram
incubadas a 42oC durante 1 h. A amostra foi desnaturada a 94oC por 5 min. Após
desnaturação foram adicionados às soluções de marcação 0,14 M de NaOH, sendo
essas incubadas por 37oC por 15 min. Em seguida foram acrescentados 0,14 M de
HCl e 0,14M de Tris-HCl pH7,5.
O volume das reações foi ajustado para 100 µL com H2O ultra-pura, para
purificação da sonda em coluna Sephadex G-100 (Amersham Biosciences). O
monitoramento da eficiência de marcação sonda foi realizado por exposição de gel
contendo uma alíquota das amostras à filme de auto-radiografia. Para tanto, uma
parte de cada uma das sondas foi incubada em tampão de amostra desnaturante
(30 mM de NaOH, 1 mM de EDTA, 10% de ficol e 0,0175mM de azul de bromofenol)
e separada em gel de agarose alcalino (1,2% de agarose, 30 mM de NaOH e 1 mM
de EDTA) em tampão de corrida alcalino (30 mM de NaOH e 1 mM de EDTA) a 1
V/cm de gel. Após separação o gel foi seco sobre membrana de nylon e levado a
exposição.
3.3.3- Crescimento de bactérias para extração de DNA plamidial.
As bactérias contendo os 370 clones de cDNA do SUCEST, previamente
adquiridas, foram crescidos em tubos de 50 mL contendo 5 mL do meio de cultura
CircleGrown (Q-Biogene) suplementado com 60 µg/mL de ampicilina. As bactérias
foram incubadas a 37 °C sob agitação constante dura nte 16 h. Em seguida as
células centrifugadas a 2500 Xg, durante 20 min a 8oC . O sedimento foi, então,
utilizado para extração de DNA plasmidial.
Materiais e Métodos_________________________________________________Capítulo 2_
Ferreira, B.S.
77
3.3.4- Extração de DNA Plasmidial contendo os 370 clones de cDNA do SUCEST.
O sedimento resultante da cultura de bactéria foi ressuspesso em 50 µL do
próprio meio de cultura. Foram acrescentados 300 µL de TENS (0,5% de SDS, 100
mM de NaOH, 10 mM de Tris-HCl pH 8,0 e 1 mM de EDTA) ao tubo e a amostra
agitada intensamente durante 3 min. Imediatamente após foram acrescentados 150
µL de acetato de sódio 3 M, pH 5,2, e a amostra foi novamente agitada durante 30 s
e centrifugada à 13.000 Xg por 3 min. A fase superior foi transferida sem a espuma
para um tubo de 1,5 mL e o DNA precipitado com 1 mL de etanol absoluto gelado. A
amostra foi misturada por inversão e centrifugada a 13.000 Xg durante 2 min. O
sobrenadante foi descartado e o precipitado foi lavado com 1 mL de etanol 70%
gelado. O tubo foi agitado lentamente por inversão e em seguida, centrifugado à
13.000 Xg por 2 min. O sobrenadante foi eliminado e o precipitado foi colocado para
secar à 37oC. Após secagem, o precipitado foi ressuspeso em 40 µL de TE RNAse
(10 mM de Tris-HCl pH 8,0, 1 mM de EDTA pH 8,0 e 20 µg/mL de RNAse) e
incubado em banho-maria à 37 ºC por 1 h. Em seguida, para eliminar proteínas, a
amostra foi purificada com igual volume de fenol:clorofórmio:alcool isoamílico
(25:24:1). Para separar as fases, o tubo foi centrifugado a 12.000 Xg durante 5 min.
Em seguida, a fase aquosa foi recuperada, o excesso de fenol eliminado e a
amostra foi tratada com igual volume de clorofórmio. Para separar as fases, o tubo
foi centrifugado, nas mesmas condições, e o sobrenadante coletado. Posteriormente
a amostra foi armazenada a -20 ºC.
3.3.5- Preparo das membranas de macroarranjo
O DNA plasmidial para os 370 clones de cDNA foram quantificados e
normalizados para 100 ng/µL. As amostras foram distribuídas em placas e 96 poços
e desnaturadas com NaOH para concentração final de 0,2 M. A proporção utilizada
foi de 30 µL de DNA (100 ng/µL) mais 1 volume de NaOH 0,4 M, assim a
concentração das amostras de DNA foi modificada para 50 ng/µL. As amostras
foram incubadas por 15 min a 37 °C. Após incubação, o DNA desnaturado foi
transferido para membrana de nylon Hybond-N (Amersham Biosciences,
Piscataway, NJ) com o transferidor manual (V&P Scientific) de 96 pinos. Cada
amostra foi adicionada à membrana duas vezes de modo a ter-se 100 ng de cada
Materiais e Métodos_________________________________________________Capítulo 2_
Ferreira, B.S.
78
amostra na membrana. Foram colocados os 370 clones, identificados previamente,
em duplicata. O DNA foi fixado nas membranas por aquecimento a 80 ºC por 2 h. As
membranas de macroarranjo foram confeccionadas de acordo com metodologia
descrita por Nogueira e colaboradores (2003).
3.3.6- Hibridação das membranas de macroarranjo
3.3.6.1- Pré-Hibridação
As membranas foram pré-hibridadas a 42oC durante 4 h. Foram utilizados
cilindros de hibridação, calculando um volume de solução de pré-hibridização de 10
mL por membrana. A solução de pré-hibridação utilizada foi a mesma utilizada para
Southerns e continha (5x SSC, 10x Denhardt’s, 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 175mM
SDS, 50% formamida e 100 µg/mL DNA de esperma de salmão denaturado), de
acordo com Sambrook e colaboradores (1989).
3.3.6.2- Hibridação das membranas com sonda radioativa
Foram utilizados cilindros de hibridação, calculando um volume de 5 mL de
solução de hibridação por membrana. A solução de hibridação utilizada foi a mesma
para Southerns contendo (5x SSC, 2x Denhardt’s, 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 175mM
SDS, 50% formamida, 5% Dextran e 100 µg/mL DNA de esperma de salmão
denaturado), de acordo com Sambrook e colaboradores (1989). Após a purificação e
denaturação (94oC por 3 min, pulso de centrifugação, gelo), a sonda foi adicionada a
um tubo de 15 mL contendo solução de hibridação pré-aquecida a 42oC. As
membranas em solução de pré-hibridação, tiveram essa solução descartada, e então
foram embebidas em solução de hibridização pré-aquecida, também, a 42 ºC
contendo a sonda marcada. O processo de hibridação ocorreu a 42 ºC durante 18 h.
3.3.6.3- Lavagens e exposição das membranas
Após hibridação, as sondas foram descartadas e as membranas lavadas em
condições de alta estringência, de acordo com protocolo de Desprez e colboradores
(1998). Foram realizadas duas lavagens com aproximadamente 200 mL de 2x SSC,
0,175mM SDS, uma lavagem com 1x SSC, 0,175mM SDS e duas lavagens com
0,1x SSC, 0,175mM SDS. Todas as lavagens foram feitas a 65oC por 15 min.
Após as lavagens, as membranas foram envolvidas em plástico de PVC,
seladas e expostas durante 72 h em cassetes apropriados do PhosphorImager.
Materiais e Métodos_________________________________________________Capítulo 2_
Ferreira, B.S.
79
Posteriormente as imagens foram registradas utilizando “scanner” a laser Storm
(Amersham Biosciences).
3.3.6.4- Análise das imagens geradas a partir dos ensaios de macroarranjo
As imagens digitalizadas foram analisadas através do software ArrayVision.
As membranas foram normalizadas em função da média dos valores sARVOL dos
controles internos e, após normalização, clones que apresentaram diferenças entre
as replicas maiores ou iguais a 2 foram descartados. Os demais clones foram
avaliados pelo algoritmo ISER (Drummond et al., 2005). Adicionalmente, o logaritmo
dos valores sARVOL foram aplicados ao teste t de student de forma bi-caudal e
impareada. Clones com p < 0,05 foram considerados válidos. Clones selecionados
pelo ISER e/ou teste t foram avaliados e somente os clones que apresentaram uma
razão sinal/ruído maior ou igual a 2 foram aceitos.
Resultados_______________________________________________________Capítulo 2_
Ferreira, B.S.
80
4- RESULTADOS
4.1- Identificação de ESTs de cana-de-açúcar relaci onados à fotossíntese,
transporte de íons, metabolismo de osmoprotetores, estresse oxidativo e
transporte de água
Para este trabalho foram identificados ESTs associados a cinco processos
relacionados a resposta ao estresse salino: 1) transporte de íons; 2) osmoproteção;
3) fotossíntese 4) transporte de água; 5) estresse oxidativo.
Foram identificados “Clusters” de cana-de-açúcar, dentro do banco de dados
do SUCEST, (Materiais e Métodos) para as proteínas envolvidas em cada um dos
processos. Cada “Cluster” é um arquivo de dados onde ESTs (seqüências em pares
de bases, proveniente do seqüênciamento dos diferentes clones de cDNA) de
seqüências similares são aqrupados e armazenados. Teoricamente, os ESTs
contidos dentro de um mesmo “Cluster” correspondem aos transcritos para um
mesmo gene.
Durante nossos trabalhos os 370 “Clusters” resultantes das buscas no
SUCEST (descritas em Mat. e Met) foram acessados, e cada ESTs que o constituía
foi analizado. O EST que apresentou maior seqüência, em pares de base, e que
apresentou a melhor qualidade de bases seqüenciadas foi selecionado. Neste
contexto, 370 ESTs de cana-de-açúcar correspondentes a diferentes proteínas
relacionadas aos estresses abióticos foram selecionados. A Tabela 1 reúne todos os
ESTs selecionados com os respectivos IDs no SUCEST. Os ESTs estão agrupados
na Tabela 1 de acordo com o processo de resposta a salinidade no qual se
enquadram. Para facilitar a posterior manipulação dos clones de cDNA
correspondente a cada EST, foram lhes atribuídos números de 1 a 370, como
representado na terceira coluna da Tabela 1. Observando-se a Tabela 1 é possível
verificar a ocorrência de vários ESTs para uma mesma proteína.
Resultados_______________________________________________________Capítulo 2_
Ferreira, B.S.
81
Tabela 1 - ESTs de cana -de-açúcar associados à resposta ao estresse salino ide ntificados após mineração de
dados no banco de seqüências do SUCEST. Os ESTs estão di spostos na tabela em grupo por assunto. Na primeira
coluna estão relacionadas as proteínas utilizadas p ara as buscas. Na segunda coluna estão os ESTs encont rados
para cada proteína. Na coluna 3 está representado u m código numérico associado a cada seqüência para f acilitar a
identificação das mesmas durante os ensaios posteri ores.
TRANSPORTE DE ÍONS
Proteína Alvo Identificação do EST no SUCEST Número do clone
HAK/KUP
SCAGCL6014H02.g 31
SCEPSB1134B09.g 32
SCEQLB2018H04.g 33
SCRUAD1060F12.b 34
SCCCAM1001B09.g 35
SCJFRT1012G08.g 36
SCSFLR2024B07.g 37
SCCCLB2002G07.g 38
SCJLAM2095C08.g 39
SCRLFL4104E03.g 40
SCQSST3116H07.g 41
SCRLSB1044D12.g 42
SCRFFL4008H11.g 43
SCJLRT1023E09.g 44
AKT1
SCCCRT2C03F06.g 45
SCEPRZ3087G03.g 46
SCSGAD1142D01.b 47
LCT1 SCAGCL6013E07.g 48
SCAGCL6016C02.g 49
PMA1
SCBFSD1036C08.b 50
SCACAD1035F06.b 51
SCUTAM2010B10.g 52
SCEZFL4039F06.g 53
SCMCFL8029D07.g 54
SCRUAD1132E10.b 55
SCJFRZ3C03H01.g 56
SCSGCL6072D03.g 57
SCJFRZ3C03H01.b 58
SOS1
SCCCCL3003G02.b 59
SCEQFL5050C02.g 60
SCEQRZ3092F10.g 61
VHATPase A
SCSGHR1067G03.g 62
SCEQSB1016B01.g 63
SCJFLR1074G03.g 64
SCJFRZ3C08G05.b 65
VHATPase B SCSBHR1051F02.g 66
Resultados_______________________________________________________Capítulo 2_
Ferreira, B.S.
82
SCQSAD1056E10.b 67
SCMCRT2086F06.g 68
VHATPase C SCQSAM1031A03.b 69
SCQGAD1065E01.g 70
VHATPase D
SCUTFL1055G11.g 71
SCAGFL8009G05.g 72
VHATPase E SCAGFL8006C12.g 73
SCCCFL8001F09.g 74
VHATPase F
SCEZAM1083F12.g 75
SCSFSD1066C05.g 76
SCSBAD1053H05.g 77
VHATPase G
SCBFSD2034B11.g 78
SCBGLR1114E02.g 79
SCEPSB1135E11.g 80
VHATPase H SCQGAM1046A07.g 81
SCAGLB2049E07.g 82
VHATPase PROTEOLIPID
SCRULB2064A05.g 83
SCQGSD1046C06.g 84
SCSGHR1066F08.g 85
SCCCST3C03H07.g 86
SCQSFL3039A06.b 87
SCJFLR1074C03.g 88
SCQGHR1011F01.g 89
SCEPSB1128E07.g 90
SCSFFL4084G08.b 91
AVP1
SCACSB1120H07.g 92
SCSGRT2061E10.b 93
SCCCRT2C07F03.g 94
SCVPFL3049D09.g 95
SCSFSD1065B09.g 96
SCRLFL4029C12.g 97
SCSFAD1124C03.g 98
SCSGFL1078H09.b 99
NHX1
SCRLAD1100F12.g 100
SCEQRT3C04C02.g 101
SCRFSB1022H11.g 102
SCJFLR2036G10.g 103
SCCCRZ3C09D02.g 104
SCUTAM2086G02.g 105
CLC1
SCVPCL6039D09.g 106
SCQSRT2033A12.g 107
SCRURZ3082A02.b 108
SCQGLB2044A10.g 109
SCCCST3005C10.g 110
Resultados_______________________________________________________Capítulo 2_
Ferreira, B.S.
83
SCJLFL1048A02.g 111
SCEQLB2018B05.g 112
SCRUFL1117H01.g 113
SCEZHR1048H09.g 114
OSMOPROTEÇÃO
DELTA 1-PIRROLINE-5-
CARBOXILATO SINTETASE
(P5CS)
SCCCLR2001F05.g 117
SCJFLR1073H12.g 116
SCQSRT1034H05.g 115
PIRROLINE-5-CARBOXLATO
REDUTASE (P5CR) SCEPRZ1011H03.g 118
PROLINA OXIDASE SCSBSD2058F06.g 119
TREALOSE-6-FOSFATO SINTASE
SCCCAM2001C04.g 120
SCCCCL3002E04.b 121
SCBGLR1115H11.g 123
SCEZHR1083A02.g 126
SCCCLR1070E10.g 122
SCCCCL4003E08.g 130
SCCCCL2001H04.b 124
SCJFST1048E05.g 127
SCRFAM2128E12.g 125
SCEZRZ1015H08.g 128
SCEPCL6021E07.g 133
SCJLRZ1018C05.g 131
SCCCLB2003E11.g 129
SCAGCL6016B11.g 134
TREALOSE-6-FOSFATO FOSFATASE
SCEZHR1055G12.g 136
SCEZRZ3019C12.g 135
SCEPLR1051A07.g 137
SCVPCL6064B03.g 142
SCEZRT2015D05.g 140
SCSGFL5C04C01.g 144
SCVPRZ2039F06.g 141
SCEQRT1025B07.g 139
SCQGAM1049F10.g 138
SCCCLR2003H06.g 143
TREALASE SCEZRZ1017E02.g 146
SCMCRT2104F04.g 145
BETAINA-ALDEIDO DESIDROGENASE
(BADH)
SCCCCL3002F02.b 149
SCJFRZ1007A10.g 150
SCQGHR1013A09.g 151
SCAGFL3025H03.g 152
SCAGRT2039C01.g 153
SCEPRZ1010D06.g 154
SCBGAD1027G02.g 155
Resultados_______________________________________________________Capítulo 2_
Ferreira, B.S.
84
COLINA MONOOXIGENASE SCJFHR1030B02.g 147
SCCCRT1C04E12.g 148
SORBITOL DESIDROGENASE (S6PDH)
SCEQLR1091F06.g 156
SCAGLR1021G01.g 157
XILOSE ISOMERASE
SCCCCL3140B03.g 159
SCSBAD1085A06.g 160
SCQSLB1049B07.g 161
SCJLFL1053B01.g 162
ALDOSE REDUTASE (AR) SCEPSD2070C10.g 158
FOTOSSÍNTESE
psaD SCEQSD1074G01.g 1
psaE SCRFSB1021D02.g 2
psaF SCCCLR1001F08.g 3
psaK SCRFSD1020G02.g 4
psaL SCCCSD2089E12.g 5
psaG SCRFSD1023A11.g 6
psaH SCEQSB1C10H08.g 7
ihca1 SCCCNR1004C03.g 8
ihca2 SCAGLV1042D08.g 9
ihca3 SCQGST3124E01.g 10
ihca4 SCCCST2002A11.g 11
psbO SCSBAD1084F09.g 12
psbX SCRLSD1011D03.b 13
psbP SCEPLR1051B02.g 14
psbQ SCCCSD1095H02.g 15
psbR SCBGSD2051H03.g 16
psbW SCBFSD1034C05.g 17
ihcb1 SCACSB1035C12.g 18
ihcb2 SCBFSD1036F03.g 19
ihcb3 SCSBST3096E08.g 20
ihcb4 SCBGSD2052H09.g 21
ihcb5 SCMCSD1059B11.g 22
ihcb6 SCACLR2007B05.g 23
psbS SCAGSD1041C03.g 24
petC SCJLRT1021H09.g 25
petM SCMCSD1059A05.g 26
atpC SCJFRT1010C10.g 27
atpD SCUTSD1086A10.g 28
atpG SCACSD2014C10.g 29
AQUAPORINAS
MIP (Major Intrinsic Protein)
SCEZAD1081G11.g 239
SCVPRT2080H01.g 282
SCJFST1014F03.b 358
SCQSHR1022D04.g 174
Resultados_______________________________________________________Capítulo 2_
Ferreira, B.S.
85
SCMCFL8029B05.g 173
TIP (Tonoplast Intrinsic Protein)
SCBGRT1052E01.g 342
SCJFRT1010H07.g 328
SCSFSB1106E08.g 369
SCJFRT1010C08.g 294
SCSGAM2105B05.b 212
SCEQRT3017C07.g 313
SCMCST1050F05.g 288
SCCCCL7C01B07.g 356
SCSFSD1066H08.g 296
SCRFFL1025H07.g 203
SCBFSD2037H07.g 344
SCQGAM2107E10.g 233
PIP (Plasma Membrane Intrinsic
Protein)
SCJFRT1059C11.g 289
SCJFLR1035D09.g 236
SCSGFL1077C11.g 234
SCRUFL1019B02.g 247
SCCCLR1C01A12.g 280
SCRLLV1025G05.b 338
SCCCSD2C06H07.g 319
SCJLRT1018G06.b 315
SCCCRT2003E09.g 318
SCBGRT3073C08.g 295
SCVPST1061H08.g 357
SCJLFL3014B02.g 235
SCSBRT3036G12. 335
SCSFFL4081B01.g 214
SCSBSD1056C01.g 278
SCRUFL1116B09.g 248
SCRLAD1101D10.g 175
NODULIN
SCJFST1015B09.g 209
SCVPHR1091D10.g 260
SCAGFL3020G01.g 191
SCCCCL1002C09.b 195
SCAGAD1075C03.g 172
SCSGRZ3060B12.g 336
SCSGHR1070C02.b 210
SCEZST3147C05.g 266
SCMCAM2081H09.b 184
SCBGHR1060B11.g 215
SCUTFL3073H07.b 249
SCQSHR1020D07.g 189
SCMCRZ3066B06.g 307
SCACHR1038D02.g 252
Resultados_______________________________________________________Capítulo 2_
Ferreira, B.S.
86
SCVPFL3042E06.g 269
SCUTSD1087C03.g 223
SCBFST3132H06.g 279
SCCCFL4090F04.g 218
SCJLRT1013C12.g 368
SCCCRT1C06G12.g 186
ESTRESSE OXIDATIVO
GPX (Glutathione Peroxidase)
SCSGLV1011C12.b 309
SCSBAD1050E11.b 244
SCVPRT2081E08.g 337
SCCCAD1004H02.g 263
SCSGAD1005A06.b 264
SCUTFL1062D04.b 176
SCCCLR2001F02.g 284
SCSFAD1113G04.g 182
SCEZFL5087G10.g 256
SCJLLR1054G10.g 259
SCQSFL1126D02.g 170
SOD (Superoxide Dismutase)
SCEPRT2043A11.g 310
SCJLRT3078G02.g 275
SCJFFL3C04E06.g 200
SCRFAM1029A02.g 257
SCEPSD2072G01.g 361
SCCCCL3120C04.g 188
SCEZAM1081C12.g 219
SCJLFL3012G11.g 221
SCCCSD2089D09.g 299
SCJLRT1019C03.g 360
SCRURT2013F04.g 300
APX (Ascorbate Peroxidase)
SCJFST1018A10.g 230
SCUTSD2087E06.g 351
SCQSRT2035H09.b 287
SCSBLB1033F06.g 304
SCJFFL3C06F05.g 349
SCRLFL4026H03.g 220
SCSBRZ3119B12.g 333
SCCCRT2C04G04.g 347
SCVPFL3047H12.g 251
SCRULB2063E06.b 229
SCSGSB1008B01.g 367
SCEQRT2093F11.g 364
SCAGFL3025E09.g 205
GR (Glutathione Reductase) SCVPRT2084G04.g 354
SCSFFL4018A12.g 181
Resultados_______________________________________________________Capítulo 2_
Ferreira, B.S.
87
SCJFRT1062B07.g 226
SCMCRT2103H04.g 331
SCJFAD1C10G11.g 359
GST (Glutathione Transferase)
SCSGST1071E06.g 292
SCMCAM1101H04.b 217
SCAGFL3024F08.g 245
SCJLRT1018E06.g 306
SCEZRZ3098D12.g 363
SCJLRT1013F06.b 365
SCJLRT1022G10.b 325
SCCCCL5004F05.g 196
SCAGHR1019E10.g 250
SCSGAD1005H04.g 262
SCCCRT2C08G10.g 301
SCEZAD1C08G12.g 343
SCCCST3C13C04.g 286
SCEPFL3081D07.g 224
SCJFRT2059B02.b 346
SCJFLR1073H08.g 281
SCJLFL4097A07.g 238
SCJFRT1008A09.b 241
SCCCCL7C02B05.g 285
SCJLRT1022F09.g 332
SCCCAM1003E11.g 261
SCRUHR1077B04.g 190
SCJFRT1012A11.g 303
SCEZRZ3049E06.g 312
SCCCCL6002F05.g 179
SCCCRT2C09E05.g 314
SCCCCL4014B12.g 225
SCQGFL1095G02.g 227
SCBGLR1027B03.g 216
SCSFCL6066C07.g 180
SCAGRT2040B07.g 353
SCCCLB1026B07.g 341
SCRFST1041E04.g 206
SCBGHR1060E07.g 211
SCBFRT1070G05.g 290
SCMCCL6060H03.g 193
SCQSST3114C09.b 322
SCBFST3135E09.g 272
SCSGHR1072F02.g 240
SCBFST3134D06.g 178
SCUTAM2009H11.g 177
SCCCRT2003F07.g 355
Resultados_______________________________________________________Capítulo 2_
Ferreira, B.S.
88
SCJLRT2052F01.b 324
SCJLLR1033A08.b 231
SCCCST3C02C10.g 320
SCQGFL4075C03.g 246
SCJLFL1051E02.g 251
SCRLSD1009A04.b 321
SCVPRT2084E10.g 345
SCVPCL6061C06.g 197
SCSGSB1006H06.g 273
SCJFRT2057E12.g 366
SCQSAM2046C10.b 254
SCEQRT1024D03.g 271
SCEPAM2056G07.g 207
SCCCLR1C09D11.g 222
SCVPHR1093F05.g 232
SCQGSD1045C04.g 340
DHAR (Dehydroascorbate
Reductase)
SCRURT2005F01.g 339
SCEZST3149B05.g 267
SCEZRZ3017A05.g 330
MDAR (Monodehydroascorbate Reductase)
SCJFAD1C11F08.g 350
SCBFAD1067G09.g 198
SCCCFL4003G11.g 199
SCRFSB1023H09.g 362
SCJLRT1014H01.g 326
SCVPFL1072A07.g 258
SCCCAM1003E04.g 171
CONTROLES INTERNOS
Actina SCEZHR1084A03.g 268
B-Tubulina SCCCRZ3001D10.g 291
Ubiquitina SCUTAD1031E08.g 270
Glyceraldehyde -3-phosphate
dehydrogenase SCMCST1055E12.g 348
Resultados_______________________________________________________Capítulo 2_
Ferreira, B.S.
89
4.2- Investigação do padrão de expressão dos 370 cl ones do SUCEST em
resposta ao estresse salino em cana-de-açúcar
4.2.1- Obtenção de DNA plasmidial contendo os 370 clones de cDNA de cana-de-
açúcar
Uma vez finalizada a etapa de identificação dos ESTs de cana-de-açúcar
associados a resposta ao estresse salino, os 370 clones de cDNA a eles
correspondentes, foram comprados do Centro Brasileiro de Coleção de Clones-
Jaboticabal-SP (BCC Center). Os clones seguem a identificação numérica
apresentada na terceira coluna da Tabela 1.
Bactérias contendo plasmídios com os 370 clones foram enviadas pelo BCC
Center. Essas bactérias foram inoculadas e utilizadas para extração de DNA
plasmidial. O padrão eletroforético das amostras de DNA plasmidial para os 370
clones de cDNA está representado nas Figuras 2, 3, 4 e 5. Pela observação das
figuras pode-se afirmar que o protocolo de extração de DNA plasmidial foi eficiente
para todas as amostras, permitindo a obtenção de DNA concentrado e íntegro para
a maioria dos clones.
Para estimar a quantidade de DNA das amostras, foram aplicados, em cada
gel, 150 ng do plasmídio pGEM (Promega), utilizado como referência de
concentração de DNA (indicado nas Figuras 2 a 5 pelas setas pretas). Quando
comparados ao padrão de concentração (pGEM/150 ng), aproximadamente 60%
das amostras de DNA plasmidial apresentaram uma concentração estimada, de
cerca de duas a três vezes maior que 150 ng/µL (Figura 2A e B; Figura 4A; Figura
5A e B). O restante das amostras apresenta uma concentração próxima de 150
ng/µL, como pode ser observado nas Figuras 3A, 3B e 4B. Apesar da eficiência do
protocolo de extração algumas amostras apresentaram rendimento de DNA muito
baixo, como é o caso dos clones 125 e 127 (Figura 3A, setas vermelhas); 237 e 239
(Figura 4A, setas vermelhas); 350 (Figura 5B, seta vermelha). Não foi possível a
obtenção de três dos 370 clones, pois as bactérias contendo os clones 80, 84
(Figura 2B, setas brancas) e 153 (Figura 3B, setas brancas) não cresceram quando
inoculadas.
Resultados________________________________________________________________________________________________Capítulo 2_
Ferreira, B.S.
90
Figura 2. Visualização do padrão eletroforético do DNA plasmidial contendo os clones de cDNA do SUCEST . Amostras de DNA plasmidial contendo os clones de cDNA do SUCEST foram separadas em gel de agarose 1%. As setas pretas indicam bandas correspondentes ao plasmidio pGEM (Promega) na concentração de 150 ng. Em (A) estão representados os clones de cDNA de 1 a 47. Em (B) estão representados os clones de 48 a 94. Foram mostrados apenas os números ímpares para acilitar a visualização. As setas brancas indicam, respectivamente, os locais reservados aos clones 80 e 84, que não cresceram quando inoculados. M, marcador de peso molecular 1 kb ladder (Fermentas).
(A)
(B)
250
500750
1000
1500
250
500750
1000
1500
2500
600010000
2500
600010000
M 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 pGEM
M 49 51 53 55 57 59 61 63 65 67 69 71 73 75 77 79 81 83 85 87 89 91 93 pGEM
(A)
(B)
250
500750
1000
1500
250
500750
1000
1500
2500
600010000
2500
600010000
M 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 pGEM
M 49 51 53 55 57 59 61 63 65 67 69 71 73 75 77 79 81 83 85 87 89 91 93 pGEM
Resultados________________________________________________________________________________________________Capítulo 2_
Ferreira, B.S.
91
Figura 3. Visualização do padrão eletroforético do DNA plasmidial contendo os clones de cDNA do SUCEST . Amostras de DNA plasmidial contendo os clones de cDNA do SUCEST foram separadas em gel de agarose 1%. As setas pretas indicam bandas correspondentes ao plasmídio pGEM (Promega) a 150 ng. Em (A) estão representados os clones de 95 a 141. Em (B) os clones de 142 a 192. Foram mostrados os números ímpares para melhor visualização. Destacado em amarelo um conjunto de plasmídios que representa a grande variação no tamanho dos clones de cDNA do SUCEST. As setas vermelhas indicam dois clones que apresentaram baixa eficiência de extração (clones 125 e 127). A seta branca indica o local reservado ao clone 153, que não cresceu quando inoculado. A seta horizontal indica as canaletas vazias entre as amostras 162 e 170. M, marcador de peso molecular 1 kb ladder (Fermentas).
250
500750
1000
1500
2500
600010000
250
500750
1000
1500
2500
600010000
(A)
(B)
M 95 97 99 101 103 105 107 109 111 113 115 117 119 121 123 125 127 129 131 133 135 137 139 141 pGEM
M 143 145 147 149 151 153 155 157 159 161 171 173 175 177 179 181 183 185 187 189 191 pGEM
250
500750
1000
1500
2500
600010000
250
500750
1000
1500
2500
600010000
(A)
(B)
M 95 97 99 101 103 105 107 109 111 113 115 117 119 121 123 125 127 129 131 133 135 137 139 141 pGEM
M 143 145 147 149 151 153 155 157 159 161 171 173 175 177 179 181 183 185 187 189 191 pGEM
Resultados________________________________________________________________________________________________Capítulo 2_
Ferreira, B.S.
92
Figura 4. Visualização do padrão eletroforético do DNA plasmidial contendo os clones de cDNA do SUCEST . Amostras de DNA plasmidial contendo os clones de cDNA do SUCEST foram separadas em gel de agarose 1%. As setas pretas indicam bandas correspondentes ao plasmidio pGEM (Promega) na concentração de 150 ng. Em (A) estão representados os clones de cDNA de 193 a 239. Em (B) foram separados os clones de 240 a 286. Foram mostrados apenas os números ímpares para melhor visualização. As setas brancas indicam dois clones que apresentaram baixa eficiência de extração (clones 237 e 239). M, marcador de peso molecular 1 kb ladder (Fermentas).
250
500750
1000
1500
250
500750
10001500
2500
600010000
2500
600010000
(A)
(B)
M 193 195 197 199 201 203 205 207 209 211 213 215 217 219 221 223 225 227 229 231 233 235 237 239 pGEM
M 241 243 245 247 249 251 253 255 257 259 261 263 265 267 269 271 273 275 277 279 281 283 285 pGEM
250
500750
1000
1500
250
500750
10001500
2500
600010000
2500
600010000
(A)
(B)
M 193 195 197 199 201 203 205 207 209 211 213 215 217 219 221 223 225 227 229 231 233 235 237 239 pGEM
M 241 243 245 247 249 251 253 255 257 259 261 263 265 267 269 271 273 275 277 279 281 283 285 pGEM
Resultados________________________________________________________________________________________________Capítulo 2_
Ferreira, B.S.
93
Figura 5. Visualização do padrão eletroforético do DNA plasmidial contendo os clones de cDNA do SUCEST . Amostras de DNA plasmidial contendo os clones de cDNA do SUCEST foram separadas em gel de agarose 1%. As setas pretas indicam bandas correspondentes ao plasmidio pGEM (Promega) na concentração de 150 ng. Em (A) estão representados os clones de cDNA de 287 a 333. Em (B) foram separados os clones de 334 a 370. Foram mostrados apenas os números ímpares para facilitar a visualização. A seta branca indica o clone 350 que apresentou baixa eficiência de extração resultando em baixa concentração. M, marcador de peso molecular 1 kb ladder (Fermentas).
250500750
1000
1500
250
500750
1000
1500
2500
600010000
2500
600010000
(A)
(B)
M 287 289 291 293 295 297 299 301 303 305 307 309 311 313 315 317 319 321 323 325 327 329 331 333 pGEM
M 335 337 339 341 343 345 347 349 351 353 355 357 359 361 363 365 367 369 pGEM
250500750
1000
1500
250
500750
1000
1500
2500
600010000
2500
600010000
(A)
(B)
M 287 289 291 293 295 297 299 301 303 305 307 309 311 313 315 317 319 321 323 325 327 329 331 333 pGEM
M 335 337 339 341 343 345 347 349 351 353 355 357 359 361 363 365 367 369 pGEM
Resultados_______________________________________________________Capítulo 2_
Ferreira, B.S.
94
O plasmídio pSPORT1, que foi utilizado para a construção das bibliotecas do
SUCEST, possui 4.109 pb, no entanto quando se observa o padrão eletroforético
dos plasmídios contendo os clones de cDNA do SUCEST, nota-se uma grande
variação no tamanho desses clones (ex.: Figura 3A e 3B, destaques em verde).
Durante a construção das bibliotecas de cDNA do projeto SUCEST foram geradas
muitas moléculas de cDNA incompletas que quando clonadas originaram clones
parciais. Assim a variação no tamanho das moléculas de cDNA clonadas pode
justificar a diversidade de tamanho dos plasmídios. Além, disso, saba-se que própria
variação no tamanho dos genes e, consequentemente, de seus transcritos, pode
explicar a heterogeneidade no tamanho dos plasmídios analisados.
4.2.2- Organização dos clones do SUCEST nas membranas de macroarranjo
Uma vez obtidos os plasmídios contendo os clones de cDNA de cana-de-
açúcar, os mesmos tiveram sua concentração estimada e normalizada. Em seguida,
os plasmídios de concentração normalizada foram utilizados na confecção de cinco
membranas idênticas, para os ensaios de macroarranjos. As membranas foram
confeccionadas manualmente com o auxílio de um transferidor manual de 96 pinos.
Os 370 clones de cDNAs seguiram duas formas de organização para serem
fixados às membranas de nylon. Primeiro, os clones foram divididos em blocos de
acordo com um dos cinco processos de resposta ao estresse salino: 1) transporte de
íons; 2) osmoproteção; 3) fotossíntese 4) transporte de água; 5) estresse oxidativo.
Em seguida, os clones pertencentes a cada bloco foram subdivididos em função da
proteína codificada. Dessa forma todos os clones associados a uma mesma proteína
foram dispostos em seqüência. Assim, cada processo de resposta ocupou uma
região da membrana. A organização dos clones na membrana, por tipo de respota
ao estresse salino, está representada no Esquema 1.
No Esquema 2 está representada a disposição de cada clone de cDNA na
membrana, a numeração corresponde a identificação numérica disposta na Tabela
1. Como pode ser observado neste esquema, cada clone foi fixado na membrana em
duplicata, ou seja, um mesmo clone foi colocado na membrana duas vezes, sendo
disposto lado a lado (ex.: Esquema 1, círculos amarelos).
Resultados_______________________________________________________Capítulo 2_
Ferreira, B.S.
95
Esquema 1. Representação do esquema de disposição d os clones de cDNA do SUCEST em membrana de macroarranjo . Os 370 clones de CDNA foram agrupados de acordo com as cinco processos de respostas ao estresse salino, como mostrado em (A). A mesma distribuição foi usada para a confecção das membranas de nylon como mostrado em (B). Os diferentes clones para uma mesma proteína foram distribuídos em seqüência (B, colchetes). Os círculos amarelos indicam que cada clone foi fixado em duplicata, lado a lado.
Resultados____________________________________________________________________________________________Capítulo 2_
Ferreira, B.S.
96
Esquema 2. Disposição dos clones nas membranas de m acroarranjo . Os números indicados correspondem à
identificação dos clones de acordo com a tabela 1. Em cada espaço foram fixados dois pontos por clone, duplicata
05 8
61 087
94
128 152
159 009
21 313
289 266
223 188
351 196
281 272
246
352 183 31 62 95 129 160 236 279 287 238 251 201
32 63 96 130 161 22 234 218 304 241 321 327 33 0
45
64 088
97 120
131
162 010
23 288
247 184
368 219
349 250
285 240
345 213
204 308 34 65 98 132 115 24 280 186 220 332 197 276
35 66 99 133 117 25 338 333 261 273 202 36 0
46
67 089
100 121
134 154
118 011
26 356
319 215
221
347 262
190 178
366 265
198 311 37 68 101 135 119 27 315 329 255 303 254 305
38 69 102 136 28 318 309 229 312 271 39 0
47
70 090
103 122
137 155
012
29 296
295 249
244 299
367 301
179 177
207 277
242
40 71 104 138 357 337 364 314 222 192
41 72 105 139 01 235 263 205 225 232 274 42 0
48
73 091
106 123
140 156
02 013
203
335 189
264 360
354 343
227 355
340 316
187
43 74 107 141 03 239 214 176 181 216 339 317
44 75 108 142 04 282 278 284 226 180 267 202 0
49
76
109 125
143 157
05 018
358 344
248 307
182 300
331 286
324
330 228
323
50 77 110 144 06 174 175 256 359 283 350 237
51 78 111 145 07 173 209 259 292 353 198 243
52 059
79 092
112 126
146
14 019
233
260 252
170
217 224
341 231
199 297
293
53 81 113 147 15 342 191 310 245 206 362 253
54 82 114 148 16 328 195 275 306 211 326 302 55 0
60
83 093
348 127
149 158
020
369
172 269
200 230
363 346
290 320
258 208
56 85 150 17 294 336 257 365 193 171 370
57 86 151 08 212 210 361 325 322 194
Resultados_______________________________________________________Capítulo 2_
Ferreira, B.S.
97
4.2.3- Obtenção de RNA total de tecido foliar e radicular de cana-de-açúcar (cv
CB47-89)
Foram escolhidos dois tecidos de cana-de-açúcar (cv. CB47-89) para a
avaliação da expressão gênica em resposta ao estresse salino utilizando
macroarranjo. Como o tecido radicular é o primeiro a entrar em contato com o
excesso de sal no ambiente e, sendo o responsável primário pelo transporte de
solutos e água, esse foi o primeiro tecido escolhido para o estudo da resposta a
salinidade. O outro tecido selecionado foi o tecido foliar, uma vez que é o principal
responsável pelo processo de fotossíntese, retenção/liberação de água e respiração.
Escolhidos os tecidos, o primeiro passo para a excussão do ensaio foi a obtenção de
RNA total de qualidade.
Em um primeiro momento, foi realizada a extração de RNA total para os dois
tecidos com o reagente TRIZOL (Invitrogen), seguindo as recomendações do
fabricante.
Na Figura 6 é apresentado o padrão de RNA total para as amostras de folha
de cana-de-açúcar (cv CB47-89) controle e tratada com 175mM de NaCl por 48 h
Ensaio 1 (raias 1 e 2) e Ensaio 2 (raias 3 e 4). A extração de RNA total de folhas de
cana-de-açúcar foi eficiente, a integridade do RNA total pode ser verificada pela
observação das duas bandas correspondentes ao RNA ribossomal indicada pelas
setas pretas. Além disso, pode ser observada uma banda correspondente ao RNA
transportador (seta vermelha).. Foi obtido RNA total em quantidade suficiente para
os ensaios posteriores. Pode-se notar que o rendimento de RNA total das amostras
controle (raias 1 e 3) foi maior que das amostras tratadas (raias 2 e 4).
Diferentemente da extração para tecido foliar, o reagente TRIZOL não foi
eficiente para a extração de RNA total de tecido radicular de cana-de-açúcar. A
Figura 7 representa o padrão de RNA total para as amostras de raiz de cana-de-
açúcar (cv CB47-89) controle e tratada com 175mM NaCl por 48 h Ensaio 1 (raias 1
e 2) e Ensaio 2 (raias 3 e 4). Observando a Figura 7 é possível verificar a existência
de RNA ribossomal (seta), porém a integridade do RNA está comprometida, como é
indicado pelo arraste da amostra durante a eletroforese (colchete). Outro fator de
grande relevância foi o rendimento da extração. A concentração do RNA total obtido
foi muito baixa, o que impossibilitou ensaios posteriores.
Resultados_______________________________________________________Capítulo 2_
Ferreira, B.S.
98
1 2 3 41 2 3 4
Figura 6. Análise da integridade de amostras de RNA total de folhas de cana-de-açúcar (cv. CB47-89). As amostras de RNA total foram separadas por eletroforese em gel de agarose 1%. As amostras de RNA total foram extraídas de tecido foliar de plantas submetidas aos seguintes tratamentos: (raia1) controle 48 h, Ensaio 1; (raia 2) NaCl 175mM 48 h, Ensaio 1; (raia 3) controle 48 h, Ensaio 2; (raia 4) NaCl 175mM 48 h, Ensaio 2. As setas pretas indicam as bandas correspondentes ao RNA ribossomal. A seta branca indica uma banda correspondente ao RNA transportador.
Resultados_______________________________________________________Capítulo 2_
Ferreira, B.S.
99
Figura 7. Análise da integridade e concentração de amostras de RNA total de raiz de cana-de-açúcar extraídas por TRIZOL. RNA total de tecido radicular de cana-de-açúcar da cultivar CB47-89 foi extraído utilizando o reagente TRIZOL (Invitrogen) e separadas por eletroforese em gel de agarose 175mM. As amostras de RNA total são de plantas submetidas aos seguintes tratamentos: (raia1) controle 48 h, Ensaio 1; (raia 2) NaCl 175mM 48 h, Ensaio 1; (raia 3) controle 48 h, Ensaio 2; (raia 4) NaCl 175mM 48 h, Ensaio 2. As setas indicam as bandas correspondentes ao RNA ribossomal. O colchete destaca um arraste correspondente a RNA degradado.
1 2 3 4
Resultados_______________________________________________________Capítulo 2_
Ferreira, B.S.
100
Neste contexto, uma nova tentativa para a extração de RNA total de raiz de
cana-de-açúcar foi realizada utilizando um novo protocolo. Vários protocolos
propõem extração de RNA total de diferentes tecidos vegetais, no entanto, nenhum
protocolo foi desenvolvido especificamente para extração de RNA em tecidos de
cana-de-açúcar. Um dos métodos mais comuns para extração de RNA de tecidos
vegetais é o método de extração por LiCl-Fenol, desenvolvido por Prescott e Martin
em 1987. Dessa forma, esse método foi aplicado para as amostras de tecido
radicular de cana-de-açúcar. A Figura 8 mostra o padrão de RNA total extraído de
raiz de cana-de-açúcar (cv CB47-89) controle e tratada com 175mM NaCl durante 48
h Ensaio 1 (raias 1 e 2) e Ensaio 2 (raias 3 e 4). Conforme podemos observar o
método foi eficiente para a extração de RNA em raiz. É possível verificar a
integridade do RNA pela observação das bandas correspondentes ao RNA
ribossomal (setas pretas). Os protocolos de extração de ácidos nucléicos
possibilitam a extração de DNA e RNA. O TRIZOL permite a obtenção apenas do
RNA, durante a etapa de precipitação. Já a metodologia de LiCl-Fenol permite a co-
precipitação de DNA ocasionando a contaminação da amostra de RNA com ácido
desoxirribonucléico. Na Figura 8 o contaminação das amostras de RNA total por
DNA é indicada pela seta vermelha. Nota-se a ocorrência de DNA genômico em
todas as amostras. Foi obtido RNA total em quantidade suficiente para os ensaios
posteriores, onde pode-se notar que o rendimento de RNA total entre as amostras foi
equivalente.
Após verificação da integridade e qualidade de RNA total para as amostras de
folha e raiz de cana-de-açúcar, as mesmas foram quantificadas em
espectrofotometro. Posteriormente, cerca 100 ng de RNA total de cada uma das oito
amostras foram utilizados para purificação de RNA mensageiro através da utilização
do kit “Poly AT Tract mRNA Isolation System IV (Promega)”. As amostras de RNAm
foram, então, utilizadas para a produção de moléculas de cDNA marcadas por [α32P]
dCTP para hibridação contra as membranas de macroarranjos contendo clones de
cana-de-açúcar.
Resultados_______________________________________________________Capítulo 2_
Ferreira, B.S.
101
Figura 8- Análise da integridade e concentração de amostras de RNA total de raiz de cana-de-açúcar extraídas por LiCl-Fenol. RNA total de tecido radicular de cana-de-açúcar da cultivar CB47-89 foi extraído utilizando o método LiCl-Fenol (Prescott e Martin, 1987) e separadas por eletroforese em gel de agarose 1%. As amostras de RNA total são de plantas submetidas aos seguintes tratamentos: (raia1) controle 48 h, Ensaio 1; (raia 2) NaCl 175mM 48 h, Ensaio 1; (raia 3) controle 48 h, Ensaio 2; (raia 4) NaCl 175mM 48 h, Ensaio 2. As setas pretas indicam as bandas correspondentes ao RNA ribossomal. A seta branca indica contaminação das amostras por DNA genômico.
1 2 3 4 1 2 3 4
Resultados_______________________________________________________Capítulo 2_
Ferreira, B.S.
102
4.3- Ensaios de macroarranjo
Quatro membranas idênticas foram utilizadas para os ensaios de hibridação.
Em um primeiro ensaio, as membranas foram hibridadas contra amostras de
[32P]cDNA sintetizadas a partir de RNAm extraído de raízes cana-de-açúcar (cv.
CB47-89), nas situações controle e tratada com 175mM de NaCl durante 48 h. Em
um outro ensaio, as membranas foram hibridadas contra [32P]cDNA sintetizadas a
partir de RNAm de tecido foliar controle e tratado com 175mM de NaCl durante 48 h.
Os ensaios foram realizados em duplicata, assim foi obtido um par de membranas
controle e um par de membranas tratadas para cada tecido estudado.
4.3.1- Monitoramento da qualidade das membranas por hibridação com plasmídio
[32P]pSPORT1
Para verificar a homogeneidade da distribuição e fixação dos clones de cDNA
nas membranas de nylon foi realizada uma hibridação utilizando, como sonda o
plasmídio pSPORT1, vazio, marcado por 32P. Dessa forma, foi possível observar a
ocorrência de variações na concentração dos clones e verificar possíveis falhas de
distribuição.
O resultado da hibridação do plasmídio [32P]pSPORT1 contra as quatro
membranas é apresentado na Figura 9. Observando o padrão de hibridação das
membranas é possível notar que ocorreram diferenças de concentração entre as
amostras fixadas. As amostras da região 1, em vermelho, apresentam-se bem
menos concentradas que as amostras fixadas na região 2, em amarelo (Figura 9A).
Essa diferença de concentração dos clones, provavelmente, é resultado de erros
ocorridos durante a manipulação e equalização das amostras, ou ainda, problemas
ocorridos durante as lavagens deestringência.
Através da comparação entre as Figuras 9A, 9B, 9C e 9D pode-se notar que,
apesar das diferenças de concentração entre as amostras, foi mantido um padrão
regular de transferência dos clones para as membranas durante sua confecção.
Portanto, a escolha do transferidor manual de 96 pinos como equipamento para a
confecção das membranas foi adequado. No entanto, a manipulação inadequada do
transferidor manual resultou em falhas na distribuição dos clones, como pode ser
observado na região destacada em verde da Figura 9D.
Resultados________________________________________________________________________________________________Capítulo 2_
Ferreira, B.S.
103
Figura 9- Análise da qualidade das membranas de mac roarranjo através de hibridação com plasmídio pSPOR T1 marcado com 32P. Para verificar a qualidade da transferência e fixação dos 370 clones de cDNA do SUCEST para as membranas de nylon, as cinco membranas foram hibridadas contra o plasmídio pSPORT1 vazio e marcado com [32P]dCTP. Em (A) os quadros amarelo e vermelho destacam dois conjuntos de clones que apresentam diferença de concentração. Em (E) o quadro verde destaca uma falha na transferência dos clones de cDNA em uma região de uma das cinco membranas confeccionadas.
Resultados_______________________________________________________Capítulo 2_
Ferreira, B.S.
104
4.3.2- Monitoramento da qualidade de hibridação por sonda [32P]cDNA
Durante a confecção das membranas foram fixados clones de cDNA
utilizados como controles internos para hibridação. Foram utilizados clones para
actina (clone 268), ubquitina (clone 270), β-tubulina (clone 291) e gliceraldeído-3-
fosfato desidrogenase (clone 348). Esses clones correspondem a genes de
expressão, teoricamente, constante em diferentes tecidos/condições. Neste
contexto, a aplicação de tais controles internos permitiria a equalização de
diferenças de hibridação ocasionadas por variação da marcação das sondas
[32P]cDNA.
Na Figura 10 pode-se observar o padrão de hibridação para os controles
internos em uma das membranas usadas. Os clones correspondentes aos controles
internos estão destacados por círculos. Pode-se observar que ocorreu um padrão
diferenciado de hibridação para os quatro clones utilizados. Os clones para actina e
β-tubulina mostraram ser pouco abundantes (círculos verdes), enquanto os clones
para ubquitina e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase mostraram forte expressão.
Observando a Figura 11 pode-se notar que o padrão de expressão dos
controles internos não sofreu alterações significativas entre as amostras controle e
tratadas em raízes ou folhas. Com base na informação observada nesse resultado
podemos inferir que os controles internos não são influenciados pelo estresse salino.
Porém, a expressão dos controles internos varia para diferentes tecidos. É possível
observar a diferença na intensidade de sinal entre as membranas que foram
hibridadas com [32P]cDNA de raiz e com [32P]cDNA de folha (Figura 11). Em folha,
os genes para os quatro controles internos são pouco abundantes, enquanto
ocorrem em grande quantidade em raiz. Como os ensaios de hibridação foram
realizados separadamente para cada tecido, e a expressão dos controles internos se
mostrou constante para cada tecido foi possível monitorar a qualidade da hibridação
pelas sondas de cDNA para os ensaios realizados.
Resultados_______________________________________________________Capítulo 2_
Ferreira, B.S.
105
Figura 10- Destaque dos controles internos fixados nas membranas de macroarranjo. Para monitorar a qualidade dos ensaios de hibridação quatro clones de cDNA para genes de expressão conhecida foram fixados em diferentes pontos das membranas de nylon. Os clones utilizados como controles internos foram (Act) actina, (Ubq) ubiquitina, (Tub) tubulina e (G3FD) gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase. Os círculos destacam os pontos de hibridação para os controles internos. Em vermelho os clones (Ubq e G3FD) que se mostraram mais abundantes após os ensaios de hibridação e em verde os dois clones (Act e Tub) menos abundantes.
Resultados________________________________________________________________________________________________Capítulo 2_
Ferreira, B.S.
106
Figura 11- Análise da expressão dos genes para os c ontroles internos. O padrão de expressão dos quatro genes utilizados como controles internos foi monitorado em amostras controle e tratada (NaCl 175mM) de raízes e folhas de cana-de-açúcar. Os círculos destacam os pontos de expressão dos controles internos para as diferentes condições. Os círculos vermelhos indicam os clones para ubiquitina e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase e os círculos verdes indicam os clones para actina e β-tubulina.
Resultados_______________________________________________________Capítulo 2_
Ferreira, B.S.
107
4.3.3- Identificação de genes de cana-de-açúcar expressos em resposta ao estresse
salino através de macroarranjo
4.3.3.1- Identificação de genes de cana-de-açúcar expressos em tecido
radicular
Na Figura 12 foram apresentadas as imagens resultantes da hibridação das
membranas contendo os 370 clones do SUCEST contra sondas de [32P]cDNA
provenientes de tecido radicular de plantas de cana-de-açúcar, controle e tratada
(réplica experimental 1), e controle e tratada (réplica experimental 2). Lembrando
que os clones de cDNA foram dispostos nas membranas de acordo com os cinco
processos de resposta ao estresse salino (Esquema 1). Ao observar a Figura 12
pode-se notar que a expressão é distinta para os diferentes grupos de genes. O
quadro amarelo demarca genes envolvidos com o transporte de água e com
estresse oxidativo. Aparentemente, tais genes são mais abundantes em tecido
radicular, que os genes envolvidos com transporte de íons, osmoproteção e
fotossíntese (quadro verde), cujo sinal de hibridação é muito fraco em todas as
réplicas.
As imagens das membranas foram digitalizadas, analisadas através do
programa ArrayVision, normalizadas e os dados foram estatisticamente analisados.
Como resultado, foi gerada uma lista dos genes que são regulados em cana-de-
açúcar após a exposição durante 48 h à 175mM de NaCl. Na Tabela 2 estão listados
os genes que foram regulados em raiz durante os ensaios de macroarranjo. Nesse
tecido, 12 genes foram regulados. Dentre eles, os genes para catalase, glutationa
peroxidase, ascorbato peroxidade e AcPMP3 foram induzidos, enquanto genes que
codificam SOS1, VHATPase, NHX1 e CLC1 foram reprimidos. Na Tabela 2 estão
relacionados os nomes dos genes, o “Read” de identificação no SUCEST,
identificação numérica do clone, regulação em resposta ao estresse e o teste
estatístico aplicado.
Resultados_______________________________________________________Capítulo 2_
Ferreira, B.S.
108
Figura 12- Análise do perfil de expressão de genes de resposta à salinidade em raízes de cana-de-açúcar. Sondas de [32P]cDNA sintetizadas a partir de RNAm de raiz de cana-de-açúcar (CB47-89) foi hibridado contra membranas de macrarranjo contendo os 370 clones de cDNA do SUCEST. As membranas correspondem a replicas de ensaios independentes de plantas controle e estressadas por 175mM de NaCl durante 48 h. O quadro verde destaca o conjunto dos clones envolvidos com transporte de íons, osmoproteção e fotossíntese. O quadro amarelo destaca os clones envolvidos com transporte de água e extresse oxidativo.
Resultados_______________________________________________________Capítulo 2_
Ferreira, B.S.
109
Na Figura 13 foram destacados os genes que, após análise estatística,
tiveram sua expressão alterada em resposta ao estresse salino em raiz. Os círculos
brancos indicam alguns dos genes que foram reprimidos em resposta ao estresse, e
os círculos vermelhos destacam os genes que foram induzidos. Cada clone
destacado foi identificado pelo número a ele correspondente. Tais clones encontram-
se relacionados na Tabela 2. As setas indicam os genes NHX1 e catalase que
tiveram expressão alterada, também, em tecido radicular.
4.3.3.2- Identificação de genes de cana-de-açúcar expressos em resposta ao
estresse salino em tecido foliar
Na Figura 14, pode-se observar as imagens de hibridação das moléculas de
[32P]cDNA de folhas de cana-de-açúcar, controle e tratadas, contra membranas de
macroarranjo. Em tecido foliar de cana-de-açúcar a expressão dos distintos grupos
de genes ocorre de forma diferenciada. Observando a Figura 14, pode-se notar que
os genes envolvidos com a fotossíntese (quadro vermelho) são os mais abundantes.
Tais resultados eram esperados por se tratar de um tecido com alta atividade
fotossintética. Comparando-se visualmente os pontos de hibridação para os genes
da fotossíntese nas membranas controle e tratadas, é possível observar que todos
os genes são reprimidos por estresse salino. Os genes para transporte de água e
estresse oxidativo (quadro amarelo), são menos abundantes que os de fotossíntese
e, aparentemente, tem um nível menor de transcrição em folhas que em raiz (Figura
12). Os genes envolvidos com transporte de íons, osmoproteção e fotossíntese
(quadro verde), apresentam sinal de hibridação extremamente fraco em todas as
réplicas, dificultando a análise para a maioria dos genes.
Resultados_______________________________________________________Capítulo 2_
Ferreira, B.S.
110
Figura 13- Identificação de genes expressos em resp osta ao estresse salino em tecido radicular de plantas de cana-de-açúcar. As imagens mostram o padrão de hibridação das membranas de macroarranjo com sonda de [32P]cDNA de raízes de cana-de-açúcar (cv. CB47-89) controle e tratadas com 175mM de NaCl por 48 h. Os círculos indicam os genes que tiveram seu padrão de expressão alterado em resposta ao estresse salino. Os círculos brancos destacam os genes que foram reprimidos e os círculos vermelhos genes induzidos por NaCl. As setas indicam genes que foram expressos também em tecido foliar. O número de identificação de cada clone é mostrado ao lado dos círculos.
Resultados_____________________________________________________________________________________________________Capítulo 2_
Ferreira, B.S.
111
Tabela 2: Genes diferencialmente expressos em raízes de cana-de-açúcar.
Gene Read Número do Clone Expressão Seleção test t Seleção ISER
SOS1 SCQSAM1031A03.b 59 - Sim Não
VHATPase B SCMCRT2086F06.g 62 - Sim Não
VHATPase Proteolipidica SCCCST3C03H07.g 86 - Sim Não
NHX1 SCJFLR2036G10.g 103 - Sim Não
CLC1 SCQGLB20044A10.g 109 - Sim Não
Catalase SCCCLR1048H09.g 244 + Sim Não
Catalase SCCCAD1004H02.g 264 + Sim Não
Catalase SCUTFL1062D04.b 176 + Sim Não
Glutationa Peroxidase SCCCLR2001F02.g 284 + Sim Não
Ascorbato Peroxidade SCEQRT1025E05.g 304 + Sim Não
AcPMP3 SCRLST3166A12.g 213 + Sim Não
AcPMP3 SCUTST3084F06.g 265 + Sim Não
Sinal (-) representa genes reprimidos e (+) genes induzidos.
Resultados_______________________________________________________Capítulo 2_
Ferreira, B.S.
112
Figura 14- Análise do perfil de expressão de genes de resposta à salinidade em folhas de cana-de-açúcar. Sondas de [32P]cDNA sintetizado a partir de RNAm de folhas de cana-de-açúcar (CB47-89) foi hibridado contra membranas de macrarranjo contendo os 370 clones de cDNA do SUCEST. As membranas correspondem a replicas de ensaios independentes de plantas controle e estressadas com 175mM de NaCl durante 48 h. O quadro verde destaca o conjunto dos clones envolvidos com transporte de íons e osmoproteção. O quadro vermelho destaca os clones envolvidos com a fotossíntese. O quadro amarelo destaca os clones envolvidos com transporte de água e extresse oxidativo.
Resultados_______________________________________________________Capítulo 2_
Ferreira, B.S.
113
Os genes regulados em resposta ao estresse salino em folhas de cana-de-
açúcar (CB47-89) estão relacionados na Tabela 3. Para esse tecido, 19 genes foram
regulados. Apenas um dos clones, que codifica para catalase, foi induzido. Dos 19
genes regulados, 14 estão relacionados com o aparato fotossintético. Tais genes
foram reprimidos quando submetidos ao estresse salino. Uma coincidência na
regulação gênica para raízes e folhas foi à indução do gene para catalase (clone
264) e a repressão do gene NHX1 em resposta à salinidade. Um fato interessante, é
que clones diferentes para NHX1 foram regulados nos dois tecidos. Em raízes, foi
regulado o clone 103, e em folhas, foi regulado o clone 101. Na Tabela 3, estão
relacionados os nomes dos genes, o “Read” de identificação no SUCEST, a
identificação numérica do clone, a regulação em resposta ao estresse e o teste
estatístico aplicado.
Na Figura 15 foram destacados os genes que, após análise estatística,
tiveram sua expressão alterada em resposta ao estresse salino em tecido radicular
de plantas de cana-de-açúcar submetidas a 175mM de NaCl por 48 h. Os círculos
bancos indicam genes que foram reprimidos em resposta ao estresse e os círculos
vermelhos destacam o único gene que foi induzido por estresse salino em folha.
Cada clone destacado foi identificado pelo número a ele correspondente de acordo
com a Tabela 3. As setas indicam os genes que tiveram expressão alterada em
ambos os tecidos, foliar e radicular.
Resultados_____________________________________________________________________________________________________Capítulo 2_
Ferreira, B.S.
114
Tabela 3: Genes diferencialmente expressos em folhas de cana-de-açúcar.
Gene Read Número do Clone Expressão Seleção test t Seleção ISER
NHX1 SCEQRT3C04C02.g 101 - Sim Não
psaD SCEQSD1074G01.g 1 - Sim Não
psaE SCRFSB1021D02.g 2 - Sim Não
psaL SCCCSD2089E12.g 5 - Sim Não
psaG SCFRSD1023A11.g 6 - Sim Sim
lhca1 SCCCNR1004C03.g 14 - Sim Não
lhca2 SCAGLV1042D08.g 15 - Sim Não
lhca4 SCCCST200A11.g 17 - Sim Sim
psbO SCSBAD1084F09.g 8 - Sim Não
psbR SCCCSD1095H02.g 11 - Sim Não
lhcb1 SCACSB1035C12.g 18 - Sim Não
lhcb3 SCBFSD1036F03.g 19 - Sim Não
lhcb2 SCSBST3096E08.g 20 - Sim Não
atpC SCJFRT1010C10.g 27 - Sim Não
atpD SCUTSD1086A10.g 28 - Sim Não
Resultados_____________________________________________________________________________________________________Capítulo 2_
Ferreira, B.S.
115
TIP SCJLRT1013E08.g 328 - Sim Sim
catalase SCCCCL3080H12.b 264 + Sim Sim
SOD CSJFRZ1007G12.g 361 - Sim Não
peroxidase SCCCLB1004B09.g 206 - Sim Não
Sinal (-) representa genes reprimidos e (+) genes induzidos.
Resultados_______________________________________________________Capítulo 2_
Ferreira, B.S.
116
Figura 15- Identificação de genes expressos em resp osta ao estresse salino em tecido foliar de plantas de cana-de-açúcar. As imagens mostram o padrão de hibridação das membranas de macroarranjo com sonda de [P32]cDNA de folhas de cana-de-açúcar (cv. CB47-89) controle e tratadas por NaCl 175mM por 48 h. Os círculos indicam os genes que tiveram seu padrão de expressão alterado em resposta ao estresse salino. Os círculos brancos destacam os genes que foram reprimidos e os círculos vermelhos genes induzidos por NaCl. As setas indicam genes que foram expressos também em tecido radicular. O número de identificação de cada clone é mostrado ao lado dos círculos.
Discussão________________________________________________________Capítulo 2_
Ferreira, B.S.
117
5- DISCUSSÃO
5.1- Identificação de ESTs de cana-de-açúcar relaci onados a processos de
resposta ao estresse salino
O estresse salino exerce dois efeitos tóxicos sobre as células vegetais: o
efeito osmótico e o efeito íon-específico (Blumwald, 2000). Logo após a exposição
às altas concentrações de sal as células vegetais iniciam um processo de
restabelecimento de seu estado de homeostase, para tanto, inicia-se a biossíntese
de compostos osmoprotetores (Serraj e Sinclair, 2002; Munns, 2005; Turner et al.,
2007). Os osmoprotetores são acumulados no citoplasma e em associação com
proteínas como as aquaporinas, que controlam o transporte de água, contribuem
para o restabelecimento do balanço osmótico (Ashaf e Foolad, 2007). Os
mecanismos de resposta ao efeito íon-específico incluem a ativação e/ou inativação
de proteínas presentes na membrana plasmática e na membrana de organelas como
o vacúolo (Davenport et al., 2005; Zörb et al., 2005; Chinnusamy et al., 2005;
Gepstein et al., 2006). Outros mecanismos de resposta, pela célula vegetal, ao
acúmulo de sal no ambiente intracelular incluem modificação da atividade de
enzimas, ativação de vias de resposta a estresse oxidativo, adaptações fisiológicas e
morfológicas e a alteração da expressão de vários genes (Jebara et al., 2005; Munns
et al., 2006; Sahi et al., 2006; Seki et al., 2007; Xie et al., 2007).
Todo o sistema de resposta da planta ao estresse culmina da alteração do
padrão de expressão de centenas de genes (Kawasaki et al., 2001; Liu e Baird,
2003; Andjelkovic e Thompson, 2006; Sreenivasulu et al., 2007). Portanto, o
conhecimento acerca do sistema de regulação de genes em resposta à salinidade é
de grande importância para a compreensão e elucidação dos mecanismos de
resistência e adaptação vegetal a esse estresse abiótico.
Nesse contexto, genes e proteínas previamente caracterizadas em diferentes
espécies vegetais, como envolvidas em cinco processos de resposta ao estresse
salino (transporte de íons, osmoproteção, fotossíntese, transporte de água e
estresse oxidativo) foram selecionadas para busca de seqüências ortologas de cana-
de-açúcar através de bioinformática.
Ferramentas de bioinformática que permitam acesso, investigação e
manipulação de bancos de seqüências, têm sido cada vez mais utilizadas para a
Discussão________________________________________________________Capítulo 2_
Ferreira, B.S.
118
identificação de genes e verificação de padrões de expressão gênica em diferentes
organismos e condições fisiológicas (Nogueira et al., 2003; Vettore et al., 2003;
Nogueira et al., 2005; Guillaumie et al., 2007). Assim, utilizando ferramentas de
busca dentro do banco de dados do SUCEST foi possível identificar 370 ESTs de
cana-de-açúcar relacionados aos cinco processos de resposta ao estresse salino
(Tabela 1). Com uma abordagem semelhante, Nogueira e colaboradores (2005)
identificaram, por bioinformática, todos os ESTs pertencentes à família NAC em
cana-de-açúcar, e, de posse dos clones de cDNA pala tais ESTs, verificaram seu
padrão de expressão em resposta a herbivoria, frio e estresse hídrico. Dois anos
mais tarde Cavalcante e colaboradores (2007) identificaram, no banco de dados do
SUCEST, ESTs associados a resposta da interação entre plantas de cana-de-açúcar
e bactérias endofíticas. Os ESTs identificados foram utilizados para estudos de
expressão gênica em diferentes condições do processo de interação planta-
patógeno. Da mesma forma, os clones de cDNA, correspondentes aos 370 ESTs
identificados durante nossos trabalhos, foram adquiridos do BCC Center e utilizados
para ensaios de macroarranjos. Tais ensaios tiveram como objetivo a investigação
do padrão de expressão de genes de raízes e folhas de plantas de cana-de-açúcar
(cv. CB47-89) submetidas ao estresse causado pela exposição a 175mM de NaCl
durante 48 h.
5.2- Implementação da metodologia de arranjos de DN A em membrana
Tecnologias como Northern Blot, SAGE (Análise Serial da Expressão de
Genes), macroarranjo, microarranjo e PCR em tempo real têm sido amplamente
utilizadas para análise, em larga escala, da expressão de genes envolvidos com
diferentes processos celulares, genes de resposta a estímulos externos, genes
chave em vias metabólicas e cascatas de sinalização (Martin et al., 2000; Middleton
et al., 2002; Donaldson et al., 2005; Lombardi et al., 2006).
Em comparação as demais metodologias citadas o uso da técnica de
macroarranjo oferece vantagens, pois é mais barata, a confecção das membranas é
mais fácil e a analise dos dados gerados pode ser realizada com equipamentos
convencionais encontrados no laboratório (Sugiyama et al., 2007). A técnica de
macroarranjo permite a identificação de vários genes simultaneamente (Dawea e
Gassey, 2007). A metodologia é baseada na imobilização de genes de interesse em
Discussão________________________________________________________Capítulo 2_
Ferreira, B.S.
119
membranas de nylon para posterior hibridização com sonda de cDNA. A aplicação
da técnica permite a análise do padrão de expressão de um gene ou um grupo de
genes em resposta a uma determinada característica/condição (Nogueira et al.,
2003, De Rosa Jr et al., 2005; Camargo et al., 2007).
Durante nossos trabalhos nós utilizamos a técnica de macroarranjo para a
análise do padrão de expressão de genes em reposta ao estresse salino em plantas
de cana-de-açúcar. O primeiro passo nesse sentido foi a implementação da técnica,
para tanto, membranas de nylon contendo 370 clones de cDNA de cana-de-açúcar,
clonados no plasmídio pSPORT1, foram confeccionadas manualmente com o auxílio
de transferidor manual de 96 pinos. Para verificar a qualidade da distribuição dos
clones nas membranas foi realizada uma hibridação utilizando como sonda o
plasmídio pSPORT1 vazio marcado por 32P. O plasmídio pSPORT1 é parte
integrante de todas as amostras fixadas. Assim, ocorreu hibridação em todos os
pontos da membrana, o que permitiu uma observação global da integridade e
qualidade das mesmas.
Os resultados revelaram que os clones de cDNA não se encontram na
mesma concentração, como era esperado (Figura 9A). As amostras de DNA
plasmidial contendo os 370 clones foram quantificadas por espectrofotômetro e,
posteriormente, quantificadas visualmente em comparação com amostras de
plasmídio pGEM com concentração conhecida (Figuras 2-5). O procedimento de
análise e normalização das amostras foi repetido diversas vezes, contudo, os
resultados da hibridação para monitoramento das membranas mostraram que a
concentração dos clones não estava equalizada.
Pudemos observar que ocorreram falhas durante a confecção das
membranas (Figura 9D), em algumas regiões os clones não foram transferidos com
eficiência. Como o processo de confecção é manual qualquer erro de manipulação
pode culminar em membranas de má qualidade. Um dos procedimentos para a
construção das membranas é a fixação das mesmas em suporte sólido, de modo
que não ocorram deslizamentos em ocasião da utilização do transferidor manual.
Uma possível explicação para a região sem clones encontra em uma das
membranas é a má fixação da mesma no suporte sólido. Outra proposta para a falha
é uma possível desuniformidade no funcionamento dos pinos do transferidor manual,
Discussão________________________________________________________Capítulo 2_
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120
Teoricamente, todos os 96 pinos do equipamento deveriam transferir 1�L de
solução contendo DNA plasmidial para a membrana.
Algumas vezes, observamos um volume diferenciado de solução nas pontas
dos pinos. A quantidade de solução transferida pelos pinos, também estava
relacionada à coluna de solução plasmidial encontrada na placa de 96 poços,
utilizada para organização e distribuição das amostras. Ao longo dos experimentos,
pudemos observar que ocorria evaporação das amostras. Observando os poços
individualmente, notamos que essa evaporação ocorria de forma diferenciada entre
os poços. Esse conjunto de dados pode explicar a heterogeneidade observada nos
pontos de hibridação das membranas.
Sugiyama e colaboradores (2007), durante seus trabalhos, afirmaram que o
sucesso dos ensaios de macroarranjo depende de um desenho experimental
adequado incluindo a fabricação das membranas, o preparo adequado das
amostras, o processo de hibridação e por fim a análise dos dados. As conclusões
desses pesquisadores confirmam que os problemas enfrentados durante a
construção das membranas de macroarranjo são inerentes ao processo de
manipulação.
Na tentativa de minimizar tais problemas propomos alternativas: como a
fixação da membrana, não apenas sobre um suporte sólido, mas na bancada, para
evitar variações de superfície; manter as placas de DNA plasmidial em gelo durante
todo o processo de confecção das membranas, para minimizar a evaporação das
amostras; trabalhar com volumes maiores de amostras para evitar variações na
coluna de solução, o que interfere no volume transferido pelos pinos do transferidor
manual.
Além da qualidade das membranas, também foi monitorada a qualidade da
hibridação das membranas com sonda de [32P]cDNA proveniente dos tecidos de
cana-de-açúcar. Em trabalhos de otimização de hibridação por microarranjos
Relogio e colaboradores (2002) ressaltam a importância da qualidade das moléculas
utilizadas como sonda, tais como as propriedades químicas (tipo e eficiência de
marcação) e físicas (tamanho, composição de CG) da sonda utilizada que afetam a
cinética de hibridação e a sensibilidade de detecção. Assim o monitoramento da
qualidade das sondas é essencial.
Discussão________________________________________________________Capítulo 2_
Ferreira, B.S.
121
Para esse fim foram distribuídos clones de cDNA correspondentes ao
controles internos actina (clone 268), ubquitina (clone 270), β-tubulina (clone 291) e
gliceraldehide-3-fosfato desidrogenase (clone 348) (Figura 10). Os quatro controles
internos apresentaram diferenças de expressão de um para o outro. Actina e
tubulina foram menos abundantes, enquanto que ubiquitina e G3PD apresentaram
maiores níveis de expressão. Teoricamente, esses genes apresentam expressão
inalterada para qualquer tecido/condição, assim variações na concentração da
sonda ou no processo de hibridação dentro de um mesmo ensaio, puderam ser
monitorados pelo acompanhamento dos pontos de hibridação desses genes. O
acompanhamento da hibridação desses genes mostrou que sua expressão não é
afetada pelo tratamento por NaCl (Figura 11). Porém a expressão se apresentou
tecido dependente, pois foi verificada uma variação na expressão desses controles
internos entre raiz e folha (Figura 11). Como os ensaios de hibridação foram
realizados separadamente para cada tecido, e a expressão dos controles não variou
com o tratamento, foi possível monitorar a qualidade da hibridação pelas sondas de
cDNA para os ensaios realizados. A utilização de controles internos para o
monitoramento da qualidade de hibridação, também foi aplicado por Sugiyama e
colaboradores (2006) durante seus ensaios de padronização de um sistema de
macroarranjo adequado para análises múltiplas de expressão gênica.
Em uma etapa posterior os dados de expressão dos controles internos foram
utilizados para processos de normalização das membranas. Durante estudos de
normalização e correção do fundo (ruído), Edwards (2003), afirmam que o processo
de normalização durante ensaios de arranjo é essencial para análises dos dados. A
existência de falhas durante o processo de normalização levam à conclusões
equivocadas. Neste mesmo contexto, Dawes e Glassey (2007) demonstram que a
normalização dos dados de macroarranjos de cDNA é também essencial,
principalmente, durante investigação de interação regulatória e análise funcional em
sistemas biológicos.
Em nossos ensaios de macroarranjo, a normalização e análise das
membranas foram realizadas de acordo a metodologia descrita por Drummond e
colaboradores (2005). A metodologia desenvolvida por Drummond é baseada na
utilização de genes de expressão constante, para gerar fatores de normalização
para cada membrana e entre as membranas. Em nossos ensaios, os controles
Discussão________________________________________________________Capítulo 2_
Ferreira, B.S.
122
internos foram considerados como genes de expressão constante, e foi criado um
critério dependente de intensidade a eles associado, pelo uso do algorítimo ISER.
Essa metodologia foi desenvolvida por Drummond e colaboradores no Laboratório
de Genoma Funcional- CBEMG- UNICAMP e tem sido utilizada para normalização e
análise estatística para vários dos ensaios de macroarranjo com genes provenientes
do SUCEST em estudos de cana-de-açúcar (De Rosa Jr et al., 2005; Camargo et al.,
2007).
A utilização dos controles internos permitiu a normalização das membranas.
Entretanto, os dados de expressão gerados após as etapas de nomalização e
análise estatística dos experimentos foram muito abaixo da expectativas para o
ensaio. Um número pequeno de genes mostrou-se regulado entre os 370
analisados.
Em ensaios futuros, a utilização de quantidades maiores de sonda e a
escolha de controles internos com níveis próximos de expressão, entre si, possam
melhorar a qualidade dos experimentos.
5.3- Investigação do padrão de expressão de 370 clo nes do SUCEST em
resposta a estresse salino em cana-de-açúcar
Após normalização e tratamento estatístico das membranas hibridadas com
[32P]cDNA provenientes de raízes e folhas de cana-de-açúcar (cv. CB47-89) controle
e tratada com 175mM de NaCl durante 48 h, foram identificados genes cuja
expressão foi regulada em resposta ao tratamento. Dos 370 genes investigados 12
foram regulados em raiz e 19 em folha. O número de genes regulados foi muito
menor que o esperado. A maior parte dos genes hibridados apresentou um padrão
de sinal muito baixo, dificultando a análise da membrana e gerando dados
inconsistentes. Durante a aplicação dos algoritmos e testes estatísticos foi verificado
que a maioria dos genes hibridados não apresentava valores de expressão
detectáveis e/ou diferenciados entre as membranas controle e tratadas. Uma
possível explicação para esse padrão de hibridação pode estar na quantidade de
RNA utilizada para a síntese da sonda, aparentemente, a sonda não estava em
concentração suficiente para uma hibridação eficiente. Esta hipótese é corroborada
por estudos realizados por Freeman e colaboradores (2000) que ressaltaram a
necessidade de grandes quantidades de RNA para cada hibridação como fator
Discussão________________________________________________________Capítulo 2_
Ferreira, B.S.
123
limitante da qualidade e reprodutibilidade, especificamente, no caso de ensaios de
macroarranjo. Nessa mesma linha de discussão Lombardi e colaboradores (2006)
mostraram que a limitação da quantidade de RNA influencia na qualidade da
implementação da tecnologia do macroarranjo de cDNA.
Em amostras de raiz, dentre os 12 genes regulados, três foram induzidos e
fazem parte da via de resposta vegetal ao estresse oxidativo. Foram induzidos os
genes para catalase, glutationa peroxidase, ascorbato peroxidade (Tabela 2). Esses
resultados são coerentes com os diversos trabalhos sobre a resposta vegetal ao
estado de estresse. Uma das alterações bioquímicas que ocorrem quando as
plantas são sujeitas ao estresse salino é a produção de espécies reativas de
oxigênio (ROS) (Meloni et al., 2003). As plantas possuem uma série de mecanismos
que atuam na proteção contra os danos mediados pelas ROS. O termo antioxidante
pode ser utilizado para descrever inúmeros compostos capazes de dissipar essas
espécies reativas, sem que a planta passe por danos severos (Dröge, 2002).
Enzimas antioxidantes, como a ascorbato peroxidase (APX), a superóxido dismutase
(SOD) e a catalase (CAT) estão envolvidas nos principais mecanismos de
eliminação de ROS do meio intracelular (Mittler, 2002). Dessa forma o resultado de
indução dos genes para catalase, glutationa peroxidase, ascorbato peroxidade de
cana-de-açúcar em resposta ao estresse mediado por NaCl são relevantes e
sustentados por pesquisas realizadas para outras espécies vegetais.
Um dado interessante foi a indução do gene para AcPMP3 (Tabela 2), Esse
gene codifica uma proteína de membrana que foi descrita por Inada e colaboradores
(2005) como responsiva a estresse salino, desidratação e frio em trigo. Em outro
estudo, Inada (2005), classificou esse gene como de resposta a estresse abiótico, e
altamente induzido por estresse salino. Esses dados fazem bastante compreensível
o padrão de indução de AcPMP3 em cana-de-açúcar em resposta a estresse
mediado por NaCl.
Em folhas vários genes do aparato fotossintético foram reprimidos durante a
exposição das plantas de cana-de-açúcar ao estresse salino. Tal resultado era
esperado uma vez que pesquisas têm demonstrado que o rendimento quântico do
fotossistema II sofre queda em resposta a estresses mediados por salinidade em
diferentes espécies vegetais (De Souza-Filho 2003; Borges, 2004). Trabalhos de
Discussão________________________________________________________Capítulo 2_
Ferreira, B.S.
124
desenvolvidos por Dias em 2004, demonstraram que o estresse salino promove a
repressão de genes do aparato fotossintético em cana-de-açúcar.
O gene NHX1 tem regulação negativa em raízes e folhas de cana-de-açúcar.
Esse gene codifica uma proteína que transloca H+ para fora do vacúolo, ao mesmo
tempo que transloca Na+ para o interior do mesmo, promovendo, assim a
compartimentalização do íon tóxico (Na+) (Apse et al., 1999). Os resultados nos
levam a inferir, que em cana-de-açúcar, ocorre a inibição da expressão do gene
NHX1 ou inativação da proteína NHX1 quando a planta está sob estresse salino. É
relatado que no caso de altas concentrações de sódio no meio intracelular, o gene
para NHX1 é induzido, produzindo grandes quantidades da proteína que agiria na
detoxificação celular, compartimentalizando íons sódio (Gaxiola et al., 1999; Hamada
et al., 2001; Wang et al., 2003; Yu et al., 2007). No entanto, nossos resultados
indicam um sistema de repressão para NHX1. É interessante notar que clones de
cDNA diferentes foram regulados em cada tecido, em raízes foi regulado o clone 103
e em folhas foi regulado o clone 101, isso sugere um sistema de regulação
diferenciado para possíveis alelos desse gene.
Apesar de ser uma metodologia amplamente utilizada para análise de
expressão gênica em larga escala, a técnica de macroarranjo apresenta inúmeros
problemas inerentes a sua padronização e implementação.
Durante a realização deste trabalho, os dados obtidos na fase de
implementação da tecnologia de macroarrajo, nos permitiu definir alguns
parâmetros: 1) variações no sistema de confecção e hibridação das membranas
prejudicam a reprodutibilidade dos ensaios; 2) a seleção de controles internos, de
expressão invariável, é imprescindível para a eficiência de normalização das
membranas; 3) a escolha adequada de ferramentas e softwares, para eleminação de
ruídos e normalização, é essencial para a análise correta dos dados gerados.
Contudo, a despeito dos obstáculos enfrentados durante a implementação da
metodologia de macroarranjo, os resultados obtidos durante nossos trabalhos são
bastante relevantes para a compreensão do sistema de resposta vegetal ao estresse
salino. Nossos ensaios possibilitaram a identificação, através de bioinformática, de
ESTs de cana-de-açúcar envolvidos com diferentes processos relacionados à
resposta ao estresse salino. Bem como a identificação, através de macroarranjo, de
genes cuja expressão gênica é regulada em resposta ao estresse salino em raízes e
Discussão________________________________________________________Capítulo 2_
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125
folhas de cana-de-açúcar. Este trabalho deu inicio à análise, em larga escala, de
genes de resposta ao estresse salino em cana-de-açúcar. O conjunto de dados
gerados permitirá uma maior compreensão dos mecanismos de resposta ao
estresse salino em cana-de-açúcar, possibilitando a obtenção de maiores
elucidações acerca dos processos de resistência e adaptação dessa espécie ao
referido estresse.
Conclusões_______________________________________________________Capítulo 2_
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6- CONCLUSÕES
1 As análises de bioinformática no banco de seqüências do SUCEST
resultaram na identificação de 370 ESTs envolvidos com a resposta ao
estresse salino em cana-de-açúcar.
2 A semelhança dos conjuntos gênicos de resposta à salinidade entre cana e
outras plantas, permitiu concluir que a utilização de genes ortologos para
identificação de seqüências em bancos de dados de diferentes espécies é
uma eficiente metodologia.
3 As etapas de implementação da técnica de macroarranjo permitiram definir
que: a) variações no sistema de confecção e hibridação das membranas
prejudicam a reprodutibilidade dos ensaios; b) a seleção de controles
internos, de expressão invariável, é imprescindível para a eficiência de
normalização das membranas; c) a escolha adequada de ferramentas e
softwares, para eleminação de ruídos e normalização das membranas, é
essencial para a análise correta dos dados gerados; d) grandes quantidades
de RNA são necessárias para a eficiência de hibridação e obtenção de sinais
detectáveis.
4 Apesar dos problemas inerentes a implementação, a técnica de Macroarranjo
permitiu a avaliação da expressão dos 370 genes de cana-de-açúcar resposta
ao estresse salino.
5 Foram identificados 12 genes regulados por estresse salino em tecido
radicular e 19 genes em tecido foliar, através de macroarranjo. A maior parte
dos genes regulados em folha estava relacionada à fotossíntese. Enquanto,
em raiz, os genes regulados estavam relacionados ao estresse oxidativo e ao
transporte de íons.
6 Análises que permitam o aumento da sensibilidade da técnica de
macroarranjo, viabilizarão a detecção de um maior número de genes
expressos em resposta ao estresse salino, em estudos futuros.
Apêndices________________________________________________________________
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127
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