AVALIAÇÃO DO GRAU DE TORREFAÇÃO E DA QUALIDADE DOS … Carina Quintanilha... · CARINA...

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

FACULDADE DE FARMÁCIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS APLICADAS A PRODUTOS

PARA SAÚDE

CARINA QUINTANILHA DA SILVA

AVALIAÇÃO DO GRAU DE TORREFAÇÃO E DA QUALIDADE DOS GRÃOS DE

CAFÉ NOS SEUS IMPACTOS SOBRE A SAÚDE HUMANA

Niterói, RJ

2019




Dissertação apresentada ao Curso de Pós-

graduação em Ciências Aplicadas a

Produtos para Saúde da Faculdade de

Farmácia da Universidade Federal

Fluminense como requisito parcial à

obtenção do título de Mestre.

Campo de Confluência: Toxicologia

Orientadora:

Profª. Drª. Deborah Quintanilha Falcão – UFF

Coorientadora:

Profª. Drª. Elisa Raquel Anastácio Ferraz Avelino – UFF

Niterói, RJ

2019

Ficha catalográfica automática - SDC/BFF Gerada com informações fornecidas pelo autor

S586a Silva, Carina Quintanilha da Avaliação do grau de

torrefação e da qualidade dos grãos de café nos seus

impactos sobre a saúde humana / Carina Quintanilha da

Silva ; Deborah Quintanilha Falcão, orientador ; Elisa

Raquel Anastácio Ferraz Avelino, coorientador. Niterói,

2019. 101 f. : il.

Dissertação (mestrado)-Universidade Federal Fluminense,

Niterói, 2019.

DOI: http://dx.doi.org/10.22409/PPG-CAPS.2019.m.14759496777

1. Toxicologia. 2. Café. 3. Produção intelectual. I.

Quintanilha Falcão, Deborah, orientador. II. Raquel

Anastácio Ferraz Avelino, Elisa, coorientador. III.

Universidade Federal Fluminense. Faculdade de Farmácia. IV. Título.

CDD -

Bibliotecária responsável: Marcos Vinicius Mendonça - CRB7/4773




Dissertação apresentada ao Curso de Pós-

graduação em Ciências Aplicadas a

Produtos para Saúde da Faculdade de

Farmácia da Universidade Federal

Fluminense como requisito parcial à

obtenção do título de Mestre.

Campo de Confluência: Toxicologia

BANCA EXAMINADORA

Profª. Drª. Elisa Raquel Anastácio Ferraz Avelino – UFF

Prof. Dr. Israel Felzenszwalb – UERJ

Drª. Silvia Siag Oigman – Instituto D’Or de Pesquisa e Ensino

Niterói, RJ

2019

AGRADECIMENTOS

Primeiramente, a Deus, por me fazer crescer com as dificuldades enfrentadas, dando-me

saúde, sabedoria e força para seguir em frente.

Aos meus pais, Ivonette e Carlos; às minhas irmãs, Carla e Camila; ao meu cunhado Flávio,

por acreditarem em mim, pelas palavras de conforto, orações e por todo amor. Aos meus

sogros e às minhas cunhadas, sem vocês eu não teria conseguido!

Ao meu namorado Rodrigo, pela ajuda e compreensão, pelo companheirismo e amor.

Obrigada por ter sido meu parceiro e maior incentivador!

À Universidade Federal Fluminense e Universidade do Estado do Rio de Janeiro pela

oportunidade de desenvolver este trabalho.

À CAPES e FAPERJ pelo fomento oferecido.

À minha orientadora Deborah e minha coorientadora Elisa pela dedicação, pelos

ensinamentos e por toda disponibilidade que me ofereceram.

Ao Israel Felzenszwalb, à Andréia Campos e às colaboradoras Mônica Marques e Silvia

Oigman por terem possibilitado a execução dos ensaios desenvolvidos neste trabalho.

Aos colegas do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica da Faculdade de Farmácia da UFF e

do Laboratório de Mutagênse Ambiental do Departamento de Biofísica e Biometria da UERJ

pela companhia e apoio.

Às técnicas do Laboratório de Toxicologia da Faculdade de Farmácia da UFF, Leila e Natália,

que se tornaram amigas e fizeram a diferença durante a minha caminhada. Obrigada pelos

conselhos, pela amizade e por todo carinho!

Às amigas que fiz durante o Mestrado, Gabriela, Daiana e Júlia. Obrigada pelo

companheirismo e incentivo, pela amizade e alegrias compartilhadas que foram fundamentais

para o cumprimento desta etapa.

À banca examinadora e a todos que contribuíram, direta ou indiretamente, para a conclusão

deste trabalho.

RESUMO

O café é uma das bebidas mais comercializadas mundialmente. Segundo dados de 2018 da

Organização Internacional do Café, o Brasil é o maior produtor e exportador mundial. Embora

alguns estudos apontem os benefícios do café para a saúde humana, as propriedades tóxicas

dessa bebida ainda não estão totalmente elucidadas. Sabe-se que durante o processo de

torrefação dos seus grãos pode ocorrer a formação de diversas substâncias potencialemente

tóxicas, dentre elas os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs), os quais estão

associados à incidência de câncer em seres humanos devido ao seu potencial mutagênico e

carcinogênico. Além disso, é importante ressaltar que as variações da qualidade dos grãos

alteram a composição química do café, influenciando no seu potencial citotóxico, mutagênico

e genotóxico. Esse estudo objetivou avaliar a influência da qualidade dos grãos de café e do

grau de torrefação no que diz respeito à mutagenicidade, citotoxicidade e genotoxicidade.

Foram utilizadas seis amostras de grãos de café moídos e torrados, divididas em grãos de

qualidade comercial e especial e torras clara, média e escura. As amostras foram enumeradas

com códigos a fim de se realizar ensaios cegos (café de qualidade comercial: 445 (torra clara

– Agtron 95), 659 (torra média – Agtron 65) e 762 (torra escura – Agtron 45); café de

qualidade especial: 917 (torra clara – Agtron 75), 823 (torra média – Agtron 55) e 935 (torra

escura – Agtron 35)). Todas as amostras pertencem à espécie Coffea arabica. O preparo das

bebidas foi feito com água destilada em cafeteira elétrica. As amostras foram liofilizadas e o

resíduo seco foi ressuspendido em água destilada estéril em concentrações apropriadas para os

ensaios. De acordo com o teste de mutagenicidade Salmonella/microssoma, a maior

concentração avaliada da amostra 762 induziu mutagenicidade quando testada com a cepa

TA98 em ausência de um sistema metabolicamente ativo. Pelo ensaio de viabilidade

utilizando Water Soluble Tetrazolium salt -1 (WST-1), pode-se observar que houve uma

redução dose-dependente da viabilidade das células de hepatocarcinoma HepG2 após a

exposição ao extrato de todas as amostras de café. Segundo o ensaio de micronúcleo (MN),

nenhuma das amostras avaliadas foi capaz de induzir clastogenicidade ou aneugenicidade nas

células cancerosas de fígado nas condições empregadas. Os resultados foram estatisticamente

avaliados usando ANOVA, seguida da análise de Dunnett (análise de significância a 5%). As

amostras 445, 659, 762 e 823 apresentaram naftaleno na sua composição química e todas as

seis amostras analisadas contêm cafeína. Através dos resultados obtidos, identificou-se uma

correlação entre a qualidade dos grãos, o grau de torrefação e os efeitos prejudiciais do café

para a saúde humana.

Palavras-chave: Torrefação. Coffea arabica. Mutagenicidade. Citotoxicidade.

Genotoxicidade.

ABSTRACT

Coffee is one of the most commercialized beverages in the world. According to 2018 data

from the International Coffee Organization, Brazil is the world's largest producer and

exporter. Although some studies point to the benefits of coffee to human health, the toxic

properties of this beverage are not yet fully elucidated. It is known that during the process of

roasting of its grains may occur the formation of several potentially toxic substances, among

them polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), which are associated with the incidence of

cancer in humans due to its mutagenic and carcinogenic potential. In addition, it is important

to note that variations in grain quality alter the chemical composition of coffee, influencing its

cytotoxic, mutagenic and genotoxic potential.This study aimed to evaluate the influence of

coffee bean quality and degree of roasting with regard to mutagenicity, cytotoxicity and

genotoxicity. Six samples of ground and roasted coffee beans were used, divided into grains

of commercial and special quality and light, medium and dark roasted beans. The samples

were enumerated with codes to perform blind tests (coffee of commercial quality: 445 (light

roast - Agtron 95), 659 (medium roast - Agtron 65) and 762 (dark roast - Agtron 45); coffee

of special quality: 917 (light roast - Agtron 75), 823 (medium roast - Agtron 55) and 935

(dark roast - Agtron 35)). All samples belong to the species Coffea arabica. The drinks were

prepared with distilled water in an electric coffee maker. The samples were lyophilized and

the dried residue was resuspended in sterile distilled water at appropriate concentrations for

the assays. According to the Salmonella/microsome mutagenicity test, the highest assessed

concentration of sample 762 induced mutagenicity when tested with strain TA98 in the

absence of a metabolically active system. By the viability assay using Water Soluble

Tetrazolium salt -1 (WST-1), it can be seen that there was a dose-dependent reduction of the

viability of HepG2 hepatocarcinoma cells after exposure to the extract of all coffee samples.

According to the micronucleus (MN) assay, none of the samples tested was able to induce

clastogenicity or aneugenicity in liver cancer cells under the conditions applied. The results

were statistically evaluated using ANOVA, followed by the Dunnett analysis (5%

significance analysis). Samples 445, 659, 762 and 823 showed naphthalene in their chemical

composition and all six samples analyzed contained caffeine. Through the results obtained, a

correlation was found between the quality of the beans, the roasting degree and the harmful

effects of coffee on human health.

Keywords: Roasting. Coffea arabica. Mutagenicity. Cytotoxicity. Genotoxicity.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 Frutos do café em seus diferentes estágios de maturação, p. 22

Figura 2 Café arábica, p. 23

Figura 3 Planta do tipo “conilon” (A) e planta do tipo “robusta” (B)

pertencentes ao genótipo da Coffea canephora, p. 24

Figura 4 Baga ou cereja do café, p. 26

Figura 5 Discos do sistema Agtron/SCAA (Specialty Coffee Association of

America) Roast Classification Color Disk apresentados frente (A e

C) e verso (B e D), p. 29

Figura 6 A ativação enzimática do benzo(a)pireno em diol epóxidos na

formação de adutos de DNA, p. 36

Figura 7 Cromatograma total de íons da amostra 445, p. 51






Figura 13 Curva dose-resposta para a amostra de café 445 testada com a cepa

TA98 na presença e ausência de metabolização exógena (S9), p. 57


TA100 na presença e ausência de metabolização exógena (S9), p.

58





60





62





64





66





68

Figura 25 Porcentagem de viabilidade das células HepG2 tratadas com

diferentes concentrações da amostra de café 445 por 24, 48 e 72

horas, p. 69



horas, p. 70



horas, p. 71



horas, p. 72



horas , p. 73



horas, p. 74

Figura 31 Número de micronúcleos (MN) por 700 células (HepG2)

binucleadas tratadas com diferentes concentrações das amostras de

café 445, 659 e 762, respectivamente, por 24 horas, p. 76

Figura 32 Número de micronúcleos (MN) por 700 células (HepG2)

binucleadas tratadas com diferentes concentrações das amostras de

café 917, 823 e 935, respectivamente, por 24 horas, p. 77

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 As características do café arábica e robusta, p. 25

Tabela 2 Estrutura dos principais hidrocarbonetos policíclicos aromáticos

(HPAs) de baixa massa molecular, p. 32

Tabela 3 Estrutura dos principais hidrocarbonetos policíclicos aromáticos

(HPAs) de alta massa molecular, p. 33

Tabela 4 Potencial carcinogênico dos principais hidrocarbonetos policíclicos

aromáticos (HPAs), p. 35

Tabela 5 Limite máximo tolerado (LMT) de hidrocarbonetos policíclicos

aromáticos em alimentos em diferentes países, p. 39

Tabela 6 Níveis de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos estabelecidos

pelo FDA (Food and Drug Administrarion) em frutos do mar, p. 40

Tabela 7 Características genéticas das linhagens de Salmonella

Typhimurium, p. 46

Tabela 8 Taxa de reversão/placa esperada para cada linhagem de Salmonella

Typhimurium, p. 46

Tabela 9 Rendimento dos extratos das amostras de café após a liofilização,

p. 50

Tabela 10 Valores de IC50 (inhibitory concentration of 50%) das amostras de

café usadas no tratamento das células HepG2 durante 72 horas, p.

75

Tabela 11 Valores de CBPI (Cytokinesis-Block Proliferation Index), %RI

(Replication Index) e %Citostática para as células HepG2 tratadas

com diferentes concentrações das amostras de café 445, 659 e 762

por 24 horas, p. 78

Tabela 12 Valores de CBPI (Cytokinesis-Block Proliferation Index), %RI

(Replication Index) e %Citostática para as células HepG2 tratadas

com diferentes concentrações das amostras de café 917, 823 e 935

por 24 horas, p. 79

LISTA DE ABREVIATRURAS

ABIC Associação Brasileira da Indústria de Café

ACM Acrilamida

ALARA As Low As Reasonably Achievable

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária

Apr Ampicilina resistente

ATSDR Agency for Toxic Substances and Disease Registry

Δbio Dependência à biotina

B(a)A Benzo(a)antraceno

B(a)P Benzo(a)pireno

B(b)F Benzo(b)fluoranteno

B(j)F Benzo(j)fluoranteno

B(k)F Benzo(k)fluoranteno

CBPI Cytokinesis-Block Proliferation Index

CG-EM Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas

ChR Criseno

CONTAM Panel on Contaminants in the Food Chain

CYP Citocromo

DeP Dibenzo(a,e)pireno

DhA Dibenzo(a,h)pireno

DhP Dibenzo(a,h)pireno

DiP Dibenzo(a,i)pireno

DlP Dibenzo(a,l)pireno

DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium

DNA Deoxyribonucleic acid

Dr. Doutor

Drª. Doutora

EC European Commission

ECC European Consumer Center

EFSA European Food Safety Autority

EPA Environmental Protection Agency

FAO Food and Agriculture Organization

FDA Food and Drug Administrarion

GSH Glutationa

HepG2 Linhagem celular de hepatocarcioma humano

his Mutação responsável pela síntese de histidina

HPAs Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos

IARC International Agency for Research on Cancer

IC50 Inhibitory Concentration of 50%

ICO International Coffee Organization

IcP Indeno(1,2,3-c,d)pireno

IPCS International Programme on Chemical Safety

LDL Low Density Lipoprotein

LMT Limite máximo tolerado

5MC 5-Metilcriseno

MAPA Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento

MN Micronúcleo

MOE Margin of exposure

MSD Mass Spectrometric Detector

NADP Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato

NIST National Institute of Standards and Technology

OECD Organisation for Economic Co-operation and Development

PBS Phosphate Buffered Saline

pKM101 Plasmídeo

Prof. Professor

Profª. Professora

RDC Resolução da Diretoria Colegiada

rfa Permeabilidade da membrana de lipopolissacarídeos

RI Replication Index

RJ Rio de Janeiro

rpm Rotação por minuto

S9 Sistema de ativação metabólica a base de mitocôndrias de células

de fígado de rato

SCAA Specialty Coffee Association of America

SCF Scientific Committeeon Food

TA100 Cepa de Salmonella Typhimurium

TA98 Cepa de Salmonella Typhimurium

ΔuvrB Deleção do gene uvrB

UFF Universidade Federal Fluminense

USDA United State Department of Agriculture

WHO World Health Organization

WST-1 Water Soluble Tetrazolium salt -1

SUMÁRIO

1. Introdução, p. 16

1.1 Justificativa, p. 18

2. Objetivos, p. 19

2.1 Objetivo geral, p. 19

2.2 Objetivos específicos, p. 19

3. Revisão Bibliográfica, p. 20

3.1 História do café, p. 20

3.2 Caracterização do café, p. 21

3.2.1 Coffea arabica L., p. 22

3.2.2 Coffea canephora Pierre ex Froehner, p. 24

3.3 Processamento do café, p. 25

3.3.1 Torrefação dos grãos de café, p. 27

3.4 Formação de compostos tóxicos após a torrefação, p. 30

3.5 Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs), p. 31

3.6 Legislação sobre HPAs em alimentos, p. 37

3.6.1 Brasil, p. 37

3.6.2 União Europeia, p. 38

3.6.3 Estados Unidos, p. 40

3.7 Mutação e câncer, p. 41

4. Material e Métodos, p. 44

4.1 Preparo das amostras, p. 44

4.2 Análise Química, p. 44

4.3 Teste de mutagenicidade Salmonella/microssoma, p. 45

4.4 Cultivo das células, p. 46

4.5 Ensaio de citotoxicidade WST-1, p. 47

4.6 Ensaio de micronúcleo (MN), p. 48

4.7 Análise Estatística, p. 49

5. Resultados, p. 50

5.1 Rendimento dos extratos das amostras de café, p. 50

5.2 Análise Química, p. 50

5.3 Teste de mutagenicidade Salmonella/microssoma, p. 57

5.3.1 Amostra 445, p. 57

5.3.2 Amostra 659, p. 59

5.3.3 Amostra 762, p. 61

5.3.4 Amostra 917, p. 63

5.3.5 Amostra 823, p. 65

5.3.6 Amostra 935, p. 67

5.4 Ensaio de citotoxicidade WST-1, p. 69

5.5 Ensaio de micronúcleo (MN), p. 75

6. Discussão, p. 80

7. Conclusão, p. 86

8. Referências Bibliográficas, p. 87

16

1. Introdução

O cafeeiro pertence à família Rubiaceae e existem mais de 70 espécies do gênero

Coffea L.. Apenas duas espécies são mundialmente comercializadas: Coffea arabica (arábica),

considerada mais nobre e fornecedora de 63% da produção mundial; e Coffea canephora

(robusta) que é considerada mais ácida, mais resistente a pragas e fornece 37% da produção

mundial (ETIENNE, 2005, p. 167-168; BELITZ, GROSCH, SCHIEBERLE, 2009; ICO,

2017a).

O café é uma das bebidas mais comercializadas mundialmente. Em 2016/17, mais de

9 milhões de toneladas foram consumidas no mundo (ICO, 2018a). O setor cafeeiro possui

grande participação no comércio do Brasil. Em 2017, mais de 100 milhões de sacas foram

produzidas (ICO, 2018b), garantindo ao país a primeira posição entre os maiores produtores e

exportadores mundiais de café (ICO, 2018b, c). A estimativa da produção mundial para

2018/19 está prevista em 171,2 milhões devido à produção recorde do Brasil (USDA, 2018).

Muitos estudos epidemiológicos têm mostrado os benefícios do café para a saúde

humana, como efeito antioxidante (GÓMEZ-RUIZ, LEAKE, AMES, 2007), antibacteriano

(MECKELBURG et al., 2014), anti-inflamatório, antiobesidade (JIA et al., 2014) e redução

dos riscos de incidência de diabetes tipo 2 (AKASH et al., 2014), mas suas propriedades

tóxicas ainda não estão totalmente estabelecidas.

De acordo com Daglia e colaboradores (2000), além de levar a mudanças na

composição química e nas atividades biológicas do café, o processo de torrefação pode gerar

compostos orgânicos resultantes da pirólise. O processamento do café por via úmida inicia-se

com a retirada da polpa e da casca (PANDEY et al., 2000). No método por via seca, essa

remoção acontece durante o beneficiamento. A torrefação dos grãos é uma das principais

etapas do processamento do café. Ela é dependente da temperatura e do tempo e contribui

para a excelência do produto final (FRANCA, MENDONÇA, OLIVEIRA, 2005; FUJIOKA,

SHIBAMOTO, 2008; HERNÁNDEZ, HEYD, TRYSTRAM, 2008). Durante essa etapa,

vários compostos são formados, dentre eles, os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos

(HPAs) (DAGLIA et al., 2000).

Os HPAs são compostos orgânicos formados por processos de combustão incompleta

de matérias orgânicas em função da temperatura de pirólise. Esses compostos podem ser

contaminantes do solo, ar, corpos hídricos e alimentos e estão associados à incidência de

câncer em seres humanos devido ao seu potencial mutagênico e carcinogênico (IARC, 1983;

17

IPCS, 1998). Os hidrocarbonetos podem penetrar no organismo por inalação, pelo contato

com a pele ou por ingestão (HATTERMER-FREY, TRAVIS, 1991).

Ainda, é importante ressaltar que entre as substâncias presentes na composição

química do café, apenas a cafeína é termoestável. As demais substâncias, como proteínas,

açúcares, ácido clorogênico, trigonelina e gordura podem ser transformadas em formas

reativas durante a torrefação e causar danos à saúde humana (TRUGO, MACRAE, 1984;

GINZ et al., 2000; LIMA, 2003; TRUGO, 2003; RAWEL, KULLING, 2007).

Como corroborado por Feria-Morales (2002), a qualidade do café baseia-se em testes

de odor e sabor, bem como na avaliação do tamanho, da cor, forma e dureza dos grãos. A

Classificação Oficial Brasileira determina que a qualidade seja classificada de acordo com os

tipos ou defeitos, que podem ser intrínsecos ou extrínsecos. Os defeitos intrínsecos são mais

determinantes para a qualidade do café. Eles são provenientes da aplicação inadequada dos

processos agrícolas e industriais, além dos fatores fisiológicos e genéticos. Os principais

defeitos intrínsecos são: grãos pretos, ardidos, verdes, brocados, com formação incompleta ou

murchos (BÁRTHOLO, GUIMARÃES, 1997).

18

1.1 Justificativa

O café é uma das bebidas mais comercializadas no mundo, sendo o Brasil o maior

produtor e exportador mundial (ICO, 2018b, c).

Durante a etapa de torrefação dos grãos pode ocorrer a formação de compostos

químicos potencialmente tóxicos. A produção desses agentes contaminantes varia de acordo

com a temperatura e o tempo de torra utilizados. Sendo assim, este estudo avaliou a influência

de diferentes graus de torrefação nos efeitos prejudiciais do café para a saúde humana. Além

disso, as variações da qualidade dos grãos também estão relacionadas com a composição

química do café, o que pode interferir no seu potencial citotóxico, mutagênico e genotóxico.

Assim, devido ao grande consumo mundial de café, à formação de compostos

associados à incidência de câncer durante a torrefação (IARC, 1983; IPCS, 1998) e às

variações da qualidade dos grãos, pode-se concluir que a população que consome essa bebida

está exposta aos seus possíveis efeitos deletérios.

19

2. Objetivos

2.1 Objetivo geral

Avaliar a influência da qualidade dos grãos de café e do grau de torrefação nos seus

impactos sobre a saúde humana.

2.2 Objetivos específicos

Para atingir esse objetivo são propostos os seguintes objetivos específicos:

1) Preparar as bebidas com as amostras de café produzidas com diferentes qualidades

de grãos e diferentes graus de torrefação;

2) Avaliar o potencial mutagênico das amostras utilizando o ensaio

Salmonella/microssoma;

3) Avaliar a citotoxicidade das amostras em células de hepatocarcinoma da linhagem

HepG2 utilizando o ensaio de Water Soluble Tetrazolium salt -1 (WST-1);

4) Avaliar o potencial genotóxico das amostras utilizando o ensaio de micronúcleo

em células de hepatocarcinoma da linhagem HepG2;

5) Analisar os constituintes químicos presentes nas amostras.

20

3. Revisão Bibliográfica

3.1 História do café

O café é consumido há mais de mil anos (SOBÉSA CAFÉ, 2008) e hoje é uma das

bebidas de maior consumo mundial (Van DONGEN et al., 2017). A Arábia foi responsável

pela difusão da sua cultura. Os manuscritos mais antigos que mencionam a bebida datam de

575 no Iêmen. Somente no século XVI na Pérsia, o café passou a ser consumido de maneira

tradicional (NEVES, 1974).

O café começou a ser degustado na Europa em 1615, trazido pelos viajantes. Os

franceses, alemães e italianos procuravam desenvolver plantações em suas colônias. Os

holandeses conseguiram as primeiras mudas e as cultivaram em Amsterdã, transformando o

café em uma das bebidas mais consumidas no continente, tornando-se parte definitiva dos

hábitos europeus. Em seguida, os franceses receberam uma muda de café pelo major de

Amsterdã e começaram a cultivar nas ilhas de Sandwich e de Bourbon (NEVES, 1974). Com

as experiências holandesa e francesa, o cultivo foi levado para outras colônias europeias. O

crescimento do mercado europeu favoreceu a expansão da plantação nos países africanos e

através dos colonos, o café chegou a Porto Rico, Cuba, Suriname, São Domingos, Guianas e

finalmente, ao norte do Brasil (TAUNAY, 1939).

Em 1727, Francisco de Melo Palheta trouxe o café da Guiana Francesa para o Belém

do Pará. No Brasil, o cultivo passou pelos estados do Maranhão, Rio de Janeiro, Paraná,

Espírito Santo, da Bahia, de Minas Gerais e São Paulo. Rapidamente, o café passou a ser o

produto base da economia brasileira (ABIC, 2008). As primeiras plantações comerciais foram

instituídas no Vale do Paraíba por volta de 1761 (CARVALHO, 1993).

O ano de 1808 foi marcante na formação da cafeicultura brasileira. O reordenamento

econômico e político no Rio de Janeiro, nova sede do Império português, ativou notavelmente

o rumo das atividades mercantis em toda a região centro-sul do país. Com a abertura dos

portos, estabeleceu-se o livre intercâmbio do Brasil com o mercado mundial. A outra face do

impulso à cafeicultura residiu no tráfico transatlântico negreiro (MARQUESE, TOMICH,

2009, p. 339-383). Grande parte dessa oferta de trabalho foi canalizada para a expansão da

fronteira cafeeira. O Vale do Paraíba, relativamente próximo ao porto do Rio de Janeiro,

passou por uma política de ocupação nas duas primeiras décadas de XIX. Devido às suas

condições geoecológicas, o café era o produto ideal a ser explorado pelos senhores de

escravos que passaram a investir na região (MARQUESE, SALLES, 2015, p. 100-129).

http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0101-90742015000200108&lng=en&tlng=en#B22

http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0101-90742015000200108&lng=en&tlng=en#B22

21

A economia cafeeira assumiu papel fundamental no desenvolvimento econômico do

Brasil, sendo a atividade agrícola precursora das regiões mais dinâmicas. Desde então, o país

sempre esteve entre os maiores produtores e expostadores de café (PONCIANO, 1995).

Atualmente, a cultura dessa bebida é praticada em todos os continentes e os principais países

produtores estão na América do Sul (Brasil e Colômbia) (ICO, 2018b).

3.2 Caracterização do café

O cafeeiro pertence à família Rubiaceae, subfamília Ixoroideae e compreende os

gêneros Coffea L. e Psilanthus Hook.f. Esses gêneros agrupam 124 espécies que ocorrem

naturalmente na zona intertropical que cobre os continentes da América, África, Ásia e

Oceania (DAVIS et al., 2011). As plantas do gênero Coffea e Psilanthus são caracterizadas

por árvores e arbustos perenes, de madeira dura e densa, com ramificação plagiotrópica,

inflorescências axilares pareadas, calículo presente e geralmente visível, cálice truncado a

ondulado ou levemente lobado, corolas brancas ou raramente róseas, flores hermafroditas,

botões florais com pétalas contorcidas para a esquerda e sobrepostas. O fruto drupáceo

contém duas sementes plano-convexas, sulcadas longitudinalmente em sua face plana, que

constituem os grãos característicos do café (DAVIS et al., 2006; MAURIN et al., 2007).

Os gêneros Coffea e Psilanthus diferem basicamente quanto à morfologia floral. Em

Coffea, as anteras e o estilo são proeminentes, ficando visíveis acima da corola. Já em

Psilanthus, a corola é tubular e longa, as anteras e o estigma são inclusos e não transpõem a

corola (LASHERMES et al., 1997; CROS et al., 1998; DAVIS et al., 2006, 2011).

Apenas três espécies apresentaram características favoráveis ao cultivo para

exploração comercial: Coffea arabica L., Coffea canephora Pierre ex Froehner e Coffea

liberica Bull. ex Hiern. Atualmente, somente as duas primeiras espécies têm importância

econômica em escala mundial (ICO, 2018a), pois as plantações de Coffea liberica foram

dizimadas por uma epidemia de traqueomicose, causada pelo fungo Fusarium xylarioides,

durante as décadas de 1940 e 1950 (DORÉ, VAROQUAUX, 2006). Além disso, entre as três

espécies, a Coffea liberica possui menor aceitabilidade para o consumo (ICO, 2019). A

Coffea arabica é um arbusto originário da Etiópia e se desenvolve em altitudes elevadas (600-

2200 m), enquanto as plantações de Coffea canephora se adaptam em altitudes abaixo de 800

m (ILLY, VIANI, 1995; COMITÉ FRANÇAIS DU CAFÉ, 1997).

Na maioria das áreas de cultivo, há uma colheita anual. A seleção do período para a

colheita é fundamental, uma vez que se os frutos não estiverem maduros, os grãos não estarão

22

plenamente desenvolvidos ou amadurecidos no seu interior e não amadurecerão após serem

colhidos; e se os frutos estiverem maduros demais, os grãos não poderão ser aproveitados.

Como há o amadurecimento em tempos diferentes, o método mais recomendado é a colheita

dos frutos maduros, conhecidos como cerejas, e o retorno aos mesmos arbustos a cada dez

dias, até que a colheita seja completa (LUNA-FILHO, 2004). Mesmo em regiões apropriadas

para o cultivo do café, as alterações nas condições climáticas podem provocar maturações não

uniformes ocasionando a presença de frutos verdes ou a ocorrência de fermentações

indesejáveis. Dessa forma, é importante o estabelecimento de um estágio ideal de maturação

fisiológica para a colheita dos grãos de café (MALTA, CHAGAS, OLIVEIRA, 2003). A

Figura 1 mostra os estágios de maturação.

Figura 1: Frutos do café em seus diferentes estágios de maturação. Fonte: MARCOLAN,

ESPINDULA, 2015.

3.2.1 Coffea arabica L.

Devido à qualidade mais nobre da bebida, Coffea arabica corresponde a 63% do café

consumido mundialmente (ICO, 2017b). As plantas dessa espécie são autógamas,

alotetraploides verdadeiras (2n = 4X = 44) e suas formas de cultivo para exploração comercial

apresentam pequena variabilidade genética. A diversidade genética da espécie é nativa dos

territórios altos do sudoeste da Etiópia e do Sudão. As plantas de café arábica (Figura 2) são

arbustos monocaules, com até 4 m de altura. As folhas são sublanceoladas ou ovaladas, os

bordos são ondulados e medem cerca de 10-15 cm de comprimento por 4-6 cm de largura. A

coloração predominante é verde escuro e a epiderme superior apresenta aspecto brilhante. Nos

vértices formados entre as nervuras principal e secundárias, costumam ocorrer pequenas

cavidades denominadas domácias. As flores são hermafroditas e agrupadas em conjuntos de

8-15, formando os glomérulos. A base de cada flor é composta por um pedicelo de 1-3 mm de

comprimento e um cálice curto. Geralmente, tem cinco pétalas que são soldadas e formam a

23

corola que mede cerca de 8-10 mm longitudinais. A partir de cada pétala surge um filete curto

de onde se fixam anteras lineares de 6-8 mm na extremidade. O pistilo é constituído por um

tubo longo medindo de 12-15 mm que se projeta, a partir do ovário até acima da corola,

culminando com um estigma bífido. O fruto é uma drupa ovóide bilocular e quando madura

pode apresentar coloração vermelha ou amarela. O endocarpo é considerado como

frutescência. As sementes, geralmente em número de duas, são envolvidas pelo endocarpo,

que é chamado de pergaminho e cobertas por um perisperma fino, chamado de película

prateada. O grão é comercialmente conhecido como fava e é composto pelo endosperma, que

apresenta coloração verde azulado. O endosperma é rico em polissacarídeos (50-55% da

matéria seca do grão), proteínas (11-13%) e lipídeos (12-18%). Essas características estão

intimamente relacionadas com o sabor e aroma e podem variar em função da localização do

plantio, processamento do cultivo, controle fitossanitário e ocorrência de defeitos nos grãos

(CORTEZ, 2001).

Figura 2: Café arábica. Fonte: MARCOLAN, ESPINDULA, 2015.

24

3.2.2 Coffea canephora Pierre ex Froehner

O café canéfora ou café robusta é uma espécie diploide (2n = 2x = 22), estritamente

alógama, nativo das florestas baixas da África equatorial. É cultivado em países da África

Central e Ocidental, no sudeste da Ásia e na América do Sul. Devido ao maior teor de sólidos

solúveis em comparação com o café arábica e por apresentar maior rendimento após o

processo de torra, o café canéfora é o componente principal dos cafés solúveis, participando

com mais de 80% na composição desses. Atualmente, o café canéfora corresponde a cerca de

36% das exportações mundiais de café (ICO, 2013).

Desde o final do século XIX, o termo “café robusta” tem sido usado para designar a

espécie Coffea canephora. No entanto, no Brasil, as variedades dessa espécie que apresentam

maior porte e vigor também são chamadas de “robustas”; e as mais compactas são chamadas

de “conilon” que são amplamente cultivados no Espírito Santo, Rondônia e extremo sul da

Bahia. O genótipo do tipo “robusta” são plantas mais altas, vigorosas, de folhas e frutos

maiores, com maior resistência à ferrugem, maior sensibilidade à seca e melhor qualidade de

bebida (MUSOLI et al., 2009). A Figura 3 mostra comparativamente os dois tipos de

genótipos da Coffea canephora.

As diferenças entre o café arábica e o robusta estão resumidas na Tabela 1.

Figura 3: Planta do tipo “conilon” (A) e planta do tipo “robusta” (B) pertencentes ao genótipo

da Coffea canephora. Fonte: MARCOLAN, ESPINDULA, 2015.

25

Tabela 1: As características do café arábica e robusta.

Características do café verde

Parâmetro Café arábica Café robusta

Clima ideal Temperado Úmido e quente

Altitude (m) 600-2200 0-800

Temperatura (°C) 15-24 16-36

Pluviosidade (mm/ano) 1200-2200 2200-3000

Cromossomas 44 22

Folha Pequena e oval Grande e larga

Flor, de branca a rosa Pequena Grande

Forma do fruto (cereja) Elipsoidal, oblongo e de 15 mm Elipsoidal e de 12 mm

Amadurecimento 7-9 meses 9-11 meses

Semente (mm) 5-13 e oval convexa 4-8 e arredondada

Fonte: Adaptado de ILLY, VIANI, 1995.

3.3 Processamento do café

A aceitabilidade do café está relacionada aos fatores que são afetados durante as

fases pré e pós-colheita dos grãos e com os métodos de preparo da bebida. Os atributos de

classificação estão vinculados às condições naturais, como solo, clima, chuva e altitude; e aos

cuidados adotados no cultivo, que consistem na adubação, poda, seleção para colheita e

manipulação (LUNA-FILHO, 2004).

Os grãos de café correspondem às sementes do cafeeiro. Essas se encontram

envolvidas por uma polpa, constituindo a baga ou cereja (Figura 4) que vai adquirindo

tonalidade avermelhada ou amarela conforme amadurece. Embaixo da casca vermelha, existe

uma polpa carnuda péctico-gelatinosa (mesocarpo), seguida por uma camada viscosa

(endocarpo ou pergaminho). O conjunto dessas três camadas constitui o pericarpo

(PRODOLLIET, 1996, p. 304-338.). Na maioria das vezes, no interior de todas essas

camadas, existem duas sementes que são os grãos de café propriamente ditos, podendo variar

em tamanho, tonalidade, forma e densidade, de acordo com as condições de crescimento e o

genótipo. A estrutura celular do grão de café é caracterizada por paredes bem grossas que

tornam as sementes muito duras. Geralmente, as cerejas são colhidas após cinco anos de

plantação, quando o fruto fica vermelho ou amarelo (ARYA, RAO, 2007).

26

Figura 4: Baga ou cereja do café. Fonte: CASAL, 2004.

O processamento do café inicia-se com a conversão das cerejas em grãos de café

verde, com a remoção da polpa e do casco através do método úmido ou seco (PANDEY et al.,

2000). O método seco, comumente usado no Brasil, é tecnologicamente mais simples quando

comparado ao método úmido. Após ser colhido, o café é abanado de forma a retirar parte das

impurezas, como gravetos e folhas, por exemplo. Posteriormente, é feita uma lavagem que

possibilita a retirarada do restante das impurezas e separa os frutos em diferentes estágios de

maturação. Nessa etapa, os frutos verdes e cerejas por serem mais pesados, afundam na água.

Já os frutos passas e secos, que são mais leves, boiam e são retirados primeiro. Em seguida, os

frutos passam pela despolpadora e as sementes são levadas para o separador rotatório para

remoção da polpa remanescente. Depois, na etapa de fermentação que ocorre em grandes

tanques de concreto, a mucilagem aderida é quebrada pela ação enzimática e as sementes são

lavadas (SMITH, 1989). A produção de compostos orgânicos voláteis durante a fermentação

resulta em um café com uma maior qualidade de aroma (GONZALEZ-RIOS et al., 2007a, b).

Posteriormente, as sementes são secas em secadores mecânicos ou ao sol (SMITH, 1989). No

processamento por via seca, após a colheita, o café é colocado em um espaço apropriado, com

uma camada de aproximadamente 5 cm de espessura e é misturado constantemente até que

esteja completamente seco. Durante a noite, o café é coberto e esse processo dura em torno de

três semanas. Em ambas as vias de beneficiamento, a umidade final não deve ultrapassar 12%

(SMITH, 1989).

Após a secagem, o café está preparado para os estágios finais de limpeza,

processamento, descascamento, beneficiamento e classificação, onde se avalia o odor, sabor,

tamanho, a forma, cor, dureza e presença de imperfeições nos grãos (FERIA-MORALES,

2002). O café verde é enviado para a indústria onde ocorre o processo de torrefação que

27

consiste na aplicação considerável de calor ao grão até que sua cor atinja tonalidade marrom.

Logo após, é feito um resfriamento por corrente de ar ou por um spray com água. Durante a

torrefação, o grão de café sofre duas transformações: o estágio inicial dura cerca de 80% do

tempo do processo e a cor do grão é gradualmente modificada até atingir o marrom; no

segundo estágio, ocorre a pirólise com dilatação do grão e um escurecimento seguido da

emissão de uma fumaça oleosa e estalos carcterísticos. Dessa maneira, há uma rápida

mudança química que só é interrompida após o resfriamento rápido. O grão de café após ser

torrado mantém as características de “flavour” por aproximadamente uma semana, sob

condições normais de temperatura e pressão (SMITH, 1989). As transformações do café

dependem, principalmente, da estabilidade dos seus diversos componentes ao calor aplicado

durante o processo de torrefação. O grau de torrefação pode ser medido pela variação da cor

ou pela diminuição do peso que é proveniente da perda de umidade e de uma fração de

material orgânico volatilizado durante essa etapa (SABBAGH, YOKOMISO, 1976).

3.3.1 Torrefação dos grãos de café

A torrefação dos grãos de café é uma etapa muito importante, uma vez que

propriedades organolépticas específicas (sabores, aromas e cor) são desenvolvidas (FRANCA,

MENDONÇA, OLIVEIRA, 2005; FUJIOKA, SHIBAMOTO, 2008; HERNÁNDEZ, HEYD,

TRYSTRAM, 2008). Esse processo é dependente da temperatura e do tempo e é responsável

por várias alterações na composição química e nas atividades biológicas do café. Nessa etapa,

ocorrem diversas reações químicas. Os compostos polifenólicos, por exemplo, são

transformados em uma mistura complexa de produtos decorrentes da reação de Maillard,

responsável pelo escurecimento não enzimático (CZERNY, MAYER, GROSCH, 1999;

SACCHETTI et al., 2009). Essa reação ocorre durante o processamento térmico e/ou

armazenamento prolongado de alimentos contendo proteínas e açúcares redutores

(FRIEDMAN, 1996; NUNES, BAPTISTA, 2001), formando produtos voláteis de odor

característico e que provêm, em grande parte, da degradação de Strecker (PARLIMENT,

1994). A reação de Maillard inicia-se com o ataque nucleofílico do grupamento α-carbonílico

de um açúcar redutor ao grupo amina presente nas proteínas, por exemplo (NUNES,

BAPTISTA, 2001; FINOT, 2005). No procedimento de torrefação, também ocorre a formação

de compostos orgânicos resultantes da pirólise (DAGLIA et al., 2000), os compostos de

enxofre são alterados por oxidação e degradação térmica e/ou hidrólise (KUMAZAWA,

28

MASUDA, 2003) e o teor de vanilina aumenta consideravelmente durante esse processo

(CZERNY, GROSCH, 2000).

O grau de torrefação pode ser monitorado visualmente seguindo a experiência do

torrefador. Não existe uma maneira direta de monitorar esse processo, a não ser pelo

termômetro da máquina de torra que indica a temperatura da massa do grão. Diante disso, a

Specialty Coffee Association of America (SCAA) e a empresa norte americana Agtron criaram

padrões aceitos internacionalmente para o monitoramento indireto, ou seja, fora do forno. Foi

criada uma escala de 0 a 100, determinada através da absorção de luz infravermelha pelo grão

ou pó de café. Ela é dividida em intervalos de dez valores, chamados de número agtron. Cada

um desses números corresponde a um intervalo de temperatura e quanto mais alto for o grau

de torrefação, menor será esse número. Existem outros padrões para monitorar a torra, mas

esse é o mais aceito. A Agtron desenvolveu um espectrômetro de infravermelho para

determinar o grau de torrefação e criou discos de diferentes tonalidades conforme os padrões

definidos na escala. Assim, a SCAA padronizou o controle da torrefação através de

comparações visuais usando esses discos e o espectrômetro de infravermelho (MELO, 2004).

A Figura 5 mostra a classificação por meio do Sistema Agtron/SCAA.

29

Figura 5: Discos do sistema Agtron/SCAA (Specialty Coffee Association of America) Roast

Classification Color Disk apresentados frente (A e C) e verso (B e D). Fonte: Adaptado de

RABELO et al., 2015.

Comumente, a faixa de temperatura utilizada na torrefação é de 200 °C-230 °C, com

intervalo de tempo variando de 12-20 minutos. Durante esse período, as reações de pirólise,

de Maillard e a caramelização formam compostos que conferem cor, aroma e sabor à bebida.

Os valores de tempo e temperatura variam mediante o grau de torrefação desejado e conforme

a umidade, variedade dos grãos de café e o torrador utilizado (LOEBLEIN et al., 2007).

Durante a torrefação, ocorrem alterações importantes no que dizem respeito às

características do café (cor, massa, forma, densidade, pH, volume e componentes voláteis),

além da perda da umidade (HERNÁNDEZ, HEYD, TRYSTRAM, 2008). Portanto, trata-se de

um processo bastante complexo considerando a importância do calor transferido para o grão

(FRANCA et al., 2009). Após essa etapa, os grãos devem ser rapidamente resfriados, a fim de

30

interromper as reações exotérmicas e evitar a torra excessiva, o que compromete a qualidade

do produto. Posteriormente, a trituração é feita por moinhos de vários tipos. Alguns desses

grãos são embalados para serem comercializados como grãos inteiros. O café moído é então

selado a vácuo e dispensado para consumo (DUTRA et al., 2001).

Para a produção de café instantâneo, existe uma etapa adicional de extração que

segue a torrefação e a moagem. Os sólidos solúveis e compostos voláteis que fornecem aroma

e sabor são extraídos dos grãos usando água. A água aquecida até 175 °C sob condições

pressurizadas é utilizada para extrair todos os compostos solúveis necessários. Após a

extração, é feita a evaporação ou a concentração do extrato via congelamento (EPA, 2010). A

liofilização e a secagem por pulverização são os métodos mais utilizados para produzir o café

instantâneo. No processo de liofilização, o extrato concentrado é inicialmente congelado e

depois moído. Posteriormente, os grânulos congelados são peneirados antes da secagem para

assegurar tamanhos uniformes. Nessa etapa, ocorrem poucas mudanças no aroma devido ao

aquecimento e à oxidação que devem ser feitos em uma câmara de vácuo. Quando se utiliza o

método de secagem por pulverização, o extrato concentrado é atomizado em uma câmara de

secagem a partir da qual a água é removida devido ao contato com o ar a temperaturas entre

200-300 °C. Essa técnica permite a produção em larga escala e fornece produtos com baixa

densidade e boa fluidez. As avaliações sensoriais de diferentes cafés instantâneos

comercializados revelaram que o atributo de qualidade está associado ao grão, tempo de

armazenamento, processo de fermentação, à torrefação, extração de sólidos solúveis e ao

material de embalagem (OLIVEIRA et al., 2009).

3.4 Formação de compostos tóxicos após a torrefação

Um grande número de propriedades benéficas vem sendo atribuídas ao café

(ALMEIDA et al., 2003; YEN et al., 2005; FARAH et al., 2006), entre elas está a atividade

antimicrobiana (DAGLIA et al., 2002; FURUHATA et al., 2002), redução da incidência de

diabetes tipo 2 (Van DAM, FESKENS, 2002) e da gordura corporal pela lipólise via

catecolaminas (KOBAYASHI-HATTORI et al., 2005), o efeito antioxidante de ocorrência

natural e induzido pela torrefação (LÓPEZ-GALILEA et al., 2006) e a proteção contra a

aterosclerose, diminuindo os lipídeos sanguíneos e a oxidação do colesterol LDL (YUKAWA

et al., 2004).

Embora o café apresente propriedades benéficas, durante o processo de torrefação

dos seus grãos, pode ocorrer a formação de compostos potencialmente tóxicos, colocando em

31

risco a saúde humana. Na torrefação do café, o objetivo principal é a formação do aroma e

sabor da bebida. Essa etapa de aquecimento modifica a textura do grão até atingir um ponto

que viabiliza a moagem e extração dos aromas e sabores (BAGGENSTOSS et al., 2008).

Dados na literatura têm mostrado que esse processo leva à formação de compostos tóxicos,

principalmente hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (DAGLIA et al., 2000). Outro

composto tóxico formado durante a torrefação é a acrilamida (ACM), que também apresenta

uma potencial atividade cancerígena, entretanto sua temperatura de ebulição é baixa e ela

acaba se volatilizando durante essa etapa do processamento do café (NERI, 2004).

Alguns estudos epidemiológicos têm corroborado para elucidação dos efeitos

deletérios do café, sendo o seu consumo associado ao desenvolvimento de diferentes tipos de

tumores (HIGDON, FREI, 2006).

3.5 Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs)

Os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) são uma família de moléculas

com mais de cem compostos orgânicos já identificados e estão amplamente distribuídos na

natureza (água, solo, plantas e atmosfera). Eles são constituídos apenas de carbono e

hidrogênio, formados por dois ou mais anéis aromáticos condensados, cada um contendo

cinco ou seis átomos de carbono, (GUILLEN, 1994; BUDZINSKI et al., 2004; VIVES,

GRIMALT, GUITART, 2004; MASTANDREA, 2005) como ilustrado nas Tabelas 2 e 3.

32

Tabela 2: Estrutura dos principais hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) de baixa

massa molecular.

HPAs Massa Molecular (g/mol) Estrutura Química

Pireno 202

Fluoranteno 202

Acenafteno 154

Acenaftileno 152

Antraceno 178

Fluoreno 166

Naftaleno 128

Fenantreno 178

Fonte: Adaptado de WENZL et al., 2006.

33

Tabela 3: Estrutura dos principais hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) de alta

massa molecular.

HPAs Massa Molecular (g/mol) Estrutura Química

Benzo(a)antraceno* 228

Benzo(b)fluoranteno* 252

Benzo(j)fluoranteno 252

Benzo(k)fluoranteno 252

Benzo(ghi)perileno 276

Benzo(a)pireno* 252

Criseno* 228

Ciclipenta(c,d)pireno 226

Dibenzo(a,h)antraceno 278

Dibenzo(a,e)pireno 302

Dibenzo(a,h)pireno 302

Dibenzo(a,i)pireno 302

Dibenzo(a,l)pireno 302

Indenol(1,2,3-c,d)pireno 276

5-Metilcriseno 242

Benzo(c)fluoreno 216

*: HPAs utilizados como marcadores para análise em alimentos. Fonte: Adaptado de WENZL

et al., 2006.

34

Os HPAs têm sido objeto de muitos estudos devido aos seus potenciais

carcinogênicos e mutagênicos (IARC, 1983; JOE, SALEMME, FAZIO, 1984). As principais

fontes responsáveis pela presença dessas moléculas em alimentos e bebidas são: fontes

naturais (processos geoquímicos e queimadas em florestas); alguns tipos de processamentos

(torrefação, defumação e secagem direta com madeira); poluição do ambiente (vazamentos de

óleo, sistemas de aquecimento, tráfego e atividades industriais) e materiais de embalagem

(LO, SANDI, 1978; DUNN, ARMOUR, 1980; JOE, SALEMME, FAZIO, 1984; LARSSON,

1986; ATSDR, 1996).

A exposição dos seres humanos aos HPAs pode ocorrer através da ingestão de

alimentos e/ou água contaminados e pelo contato com as vias aéreas e dérmica, sendo

rapidamente absorvidos pelo pulmão, intestino e pela pele (IARC, 1985; FOTH, KAHL,

KAHL, 1988; BRAUN, APPEL, SCHMAL, 2004; NEVES, 2006; BRITO, 2009). Para a

IARC (International Agency for Research on Cancer), os maiores níveis detectáveis de HPAs

estão no fígado (IARC, 1985, 2013).

A contaminação do café com os HPAs pode ocorrer durante o processo de torrefação

dependendo das temperaturas utilizadas. A formação dos HPAs acontece durante a combustão

incompleta da matéria orgânica, sendo influenciada pela temperatura e pressão. O aumento da

temperatura contribui para o maior percentual de formação desses agentes contaminantes

(PAGE et al., 1999).

Durante a combustão da matéria orgânica, o carbono e hidrogênio reagem com o

oxigênio formando dióxido de carbono e água. A pirólise ocorre quando não há oxigênio

suficiente. Esse processo consiste na combustão incompleta, onde parte do combustível da

reação origina outros subprodutos, como monóxido de carbono e HPAs (WILLIAMS,

HORNE, 1995; LOPES, ANDRADE, 1996; McGRATH, CHAN, HAJALIGOL, 2003;

MEIRE, AZEREDO, TORRES, 2007; SALGUEIRO, 2008). Em elevadas temperaturas, a

pirólise de compostos orgânicos gera fragmentos de moléculas e radicais livres que se

combinam para dar origem aos HPAs, sendo liberados na zona de combustão como vapor

(GARCIA et al., 2014).

Organizações internacionais (World Health Organization (WHO), Food and

Agriculture Organization (FAO) e International Agency for Reserach on Cance (IARC))

selecionaram os 13 principais HPAs com potencial carcinogênico presentes em alimentos:

benzo(a)antraceno (B(a)A), criseno (ChR), benzo(b)fluoranteno (B(b)F), benzo(j)fluoranteno

(B(j)F), benzo(k)fluoranteno (B(k)F), benzo(a)pireno (B(a)P), dibenzo(a,h)antraceno (DhA),

35

dibenzo(a,e)pireno (DeP), dibenzo(a,h)pireno (DhP), dibenzo(a,i)pireno (DiP),

dibenzo(a,l)pireno (DlP), indeno(1,2,3- c,d)pireno (IcP) e 5-metilcriseno (5MC) (FAO, 2008).

Segundo a IARC, os HPAs são classificados em grupos de carcinogenicidade

conforme mostra a Tabela 4. O B(a)P pertence ao Grupo 1, considerado o composto mais

prejudicial dessa classificação, sendo comprovadamente carcinogênico para humanos (IARC,

2013). Dados encontrados na literatura relatam a presença de B(a)P em amostra de café

torrado (KURATSUNE, HUEPER, 1960; KRUIJF, SCHOUTEN, Van Der STEGEN, 1987).

Tabela 4: Potencial carcinogênico dos principais hidrocarbonetos policíclicos aromáticos

(HPAs).

HPAs

Classificação IARC

(International Agency for

Research on Cancer )a

Grupo Ano

Acenafteno 3 2010

Acenaftileno NCb 2010

Antraceno 3 2010

Benzo(a)antraceno 2B 2010

Benzo(a)pireno 1 2012

Benzo(b)fluoranteno 2B 2010

Benzo(ghi)perileno 3 2010

Benzo(k)fluoranteno 2B 2010

Criseno 2B 2010

Dibenzo(a,h)pireno 2A 2010

Fenantreno 3 2010

Fluoranteno 3 2010

Fluoreno 3 2010

Indeno(1,2,3-c,d)pireno 2B 2010

Naftaleno 2B 2002

Pireno 3 2010

a) Grupo 1: Carcinogênico para humanos; Grupo 2A: Provavelmente carcinogênico para

humanos; Grupo 2B: Possivelmente carcinogênico para humanos; Grupo 3: Não classificável

em relação a carcinogenicidade para humanos; Grupo 4: Provavelmente não carcinogênico

para humanos; b) Não classificado até o momento. Fonte: IARC, 2013.

36

Os principais efeitos tóxicos dos HPAs consistem no desenvolvimento de

mutagênese, teratogênese e carcinogênese que são consequência de sua atuação sobre o

material genético (KLASSEN, DOULL, AMDUR, 1996; WHO, 1998). Geralmente, os danos

causados à saúde ocorrem por contato crônico, caracterizado pela ingestão de pequenas

quantidades de contaminante por um longo período de tempo (UPSHALL, PAYNE,

HELLOU, 1992; HEATH, KOBLIS, SAGER, 1993, p. 267-302; RICE et al., 2000).

Os HPAs ligam-se ao ácido desoxirribonucleico (deoxyribonucleic acid – DNA)

formando complexos HPA-DNA (BRAUN, APPEL, SCHMAL, 2003). Na ativação

enzimática do B(a)P, por exemplo, a enzima que catalisa a reação de epoxidação forma um

composto denominado B(a)P-diol-epóxido (oxa-ciclo-propano). Esse diol-epóxido é capaz de

reagir covalentemente com as bases nucleofílicas do DNA, causando alterações no material

genético e embasando o processo de carcinogênese (VOLLHARDT, SCHORENE, 2004).

Existem estudos que indicam que a atividade carcinogênica decorra do ataque nucleofílico do

nitrogênio do grupo amina da guanina (G – base do DNA) ao oxa-ciclo-propano. A mudança

da guanina afeta a estrutura da dupla hélice do DNA, formando o aduto HPA-DNA que

resulta na replicação incorreta da molécula (Figura 6). O aumento na produção de adutos de

DNA nas células pode provocar um potencial efeito mutagênico (AKCHA et al., 2000).

Figura 6: A ativação enzimática do benzo(a)pireno em diol epóxidos na formação de adutos

de DNA. Fonte: MEIRE, AZEREDO, TORRES, 2007.

37

A presença da cafeína aumenta a solubilidade do B(a)P em água devido à formação

do complexo B(a)P-cafeína, que é solúvel no meio aquoso. Esse ativo presente no pó do café

pode arrastar o B(a)P e os demais HPAs para a bebida (HISCHENHUBER, STIJVE, 1987).

Estudos confirmaram que a quantidade de cafeína extraída do café fervido era 19-30%

superior em relação ao café que foi apenas coado. Esses dados sugerem que a fervura

favorece a formação do complexo solúvel HPA-cafeína, contribuindo para a passagem dos

hidrocarbonetos para a bebida (CAMARGO, TOLEDO, 1998). Sendo assim, o consumidor

que ferve o pó de café junto com a água, poderá estar ingerindo mais HPAs totais do que

aqueles indivíduos que tomam apenas o café coado (LODOVICI et al., 1995).

O mecanismo de eliminação do B(a)P pelo corpo humano envolve a formação de

epóxidos e posteriormente, de compostos poliidroxilados que são mais solúveis em água e

consequentemente, mais facilmente eliminados pela via urinária. Um dos intermediários

gerados durante esse processo pode reagir com a guanina do DNA, formando um complexo

capaz de induzir a célula a erros de reparação que resultam no desenvolvimento de tumores

(IARC, 1983; IPCS, 1998).

3.6 Legislação sobre HPAs em alimentos

A legislação de alguns países define limites para vários tipos de HPAs presentes em

diferentes grupos de alimentos. No entanto, a legislação brasileira é mais limitada (GARCIA

et al., 2014).

3.6.1 Brasil

No Brasil, a legislação sobre HPAs na área de alimentos é bastante restrita. Para os

grupos de alimentos presentes na legislação, os limites máximos tolerados (LMTs) são

estabelecidos apenas para o B(a)P. A Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) e

o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) ainda não estabeleceram

LMTs para a maioria dos alimentos sujeitos à contaminação por HPAs. Existem apenas

Portarias e Resoluções Normativas da ANVISA que determinam LMT de B(a)P na água, no

gelo e nos alimentos que passaram por processo de defumação. A Resolução RDC n° 2/2007

estabeleceu LMT de B(a)P em alimentos adicionados de aroma de fumaça e a Portaria n°

518/2004, juntamente com a Resolução RDC n° 274/2005, instituíram LMT de B(a)P para a

38

água envasada e o gelo (ANVISA, 2005, 2007). Os valores dos limites tolerados estão

expressos na Tabela 5.

3.6.2 União Europeia

A EC (European Commission) n° 1881/2006 é embasada no regulamento do ECC

(European Consumer Center) n° 315/93 de 08 de fevereiro de 1993 e define os níveis

máximos de B(a)P e de determinados contaminantes presentes nos gêneros alimentícios. Já a

EC n° 835/2011, alterou a legislação de 2006 acrescendo novas regras em relação aos limites

máximos tolerados (LMTs) de B(a)P e considera o B(a)P, B(a)A, B(b)F e ChR como

marcadores de HPAs em alimentos (EC, 2011).

A EFSA (European Food Safety Autority) revisou o parecer do SCF (Scientific

Committeeon Food) presente na EC n° 108/2005 e ponderou novos dados científicos e a

margem de exposição (MOE – margin of exposure) aos contaminantes. Em 2008, nessa

mesma análise, o Panel on Contaminants in the Food Chain (CONTAM) da EFSA adotou um

parecer sobre os HPAs presentes em alimentos. Foi concluído que a adoção do somatório dos

níveis máximos de quatro HPAs: B(a)P, B(a)A, B(b)F e ChR é o marcador mais apropriado

para representar a presença desse grupo de contaminantes, porém esse marcador não é

sensível o suficiente para detectar níveis muito baixos de B(a)P nos alimentos. O CONTAM

também concluiu que os danos causados pelos HPAs é proporcional ao nível de MOE dos

consumidores (EC, 2006, 2011).

Conforme o parâmetro de exposição “as low as reasonably achievable” (ALARA)

através do regulamento EC n° 835/2011, os níveis de HPAs precisam ser seguros e mínimos,

decorrentes das boas práticas agrícolas, pesqueiras e de fabricação. Dados recentes indicam

que derivados de cereais e vegetais contêm baixos níveis de HPAs (CAMARGO, TOLEDO,

2002; FALCO et al., 2003). Devido ao alto consumo desses alimentos, a EFSA os considera

como importantes fontes de exposição humana a contaminantes. Os alimentos que sofrem

processos como defumação e são submetidos a altas temperaturas, têm maior índice de

contaminação (GARCIA et al., 2014).

A Tabela 5 mostra os limites tolerados de HPAs em alguns alimentos na União

Europeia e no Brasil.

39

Tabela 5: Limite máximo tolerado (LMT) de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos em

alimentos em diferentes países.

Legislação Alimentos

LMT (µg/Kg)

B(a)P1 B(a)P, B(a)A2, B(a)F3 e

ChR4(a)

União Europeia§

Óleos e gorduras (exceto manteiga de cacau

e óleo de coco) para consumo direto

humano ou ingrediente em alimentos

2,0 10,0

Óleo de coco para consumo direto ou

ingrediente em alimentos 2,0 20,0

Grãos de cacau e produtos derivados 5,0

35,0 (de gordura – até

31/03/2015)

30,0 (de gordura – de

01/01/2015)

Carne defumada e produtos cárneos

defumados

5,0 (até

31/08/2014)

2,0 (de

01/09/2014)

30,0 (até 31/08/2014)

12,0 (de 01/09/2014)

Peixe defumado (parte comestível) e

produtos de peixe defumados

5,0 (até

31/08/2014)

2,0 (de

01/09/2014)

30,0 (até 31/08/2014)

12,0 (de 01/09/2014)

Crustáceos defumados (parte comestível e

apêndices do abdômen)

Caranguejos e cristáceos (Brachyurae

Anomoura) defumados (parte comestível e

apêndices)

Sardinha defumada e defumadas em latab,

moluscos bivalves (fresco, refrigerado,

congelado), carne tratada termicamente e

seus produtosc

5,0 30,0

Moluscos bivalves defumados 6,0 35,0

Produtos processados a base de cereais e

alimentos para bebês e crianças 1,0 1,0

Fórmulas para lactentes e fórmulas de

transição 1,0 1,0

Alimentos dietéticos para fins medicinais

específicos (para lactantes) 1,0 1,0

Brasil §§

Produtos adicionados de aroma de fumaça 0,7 NAd

Água de gelo 0,01 µg/L NA

40

1) Benzo(a)pireno; 2) Benzo(a)antraceno; 3) Benzo(a)fluoranteno; 4) Criseno; a) As

concentrações para os limites inferiores são calculadas com base no pressuposto de que todos

os valores das quatro substâncias abaixo do limite de quantificação são zero; b) Para os

produtos em lata, a análise será realizada em todo o conteúdo da lata; c) Carne e produtos a

base de carne que foram submetidos a um tratamento térmico que dê potencialmente origem a

formação de HPA, ou seja, apenas grelhados na grelha ou em churrasqueira; d) Não

aplicável. Fonte: Adaptado de: §EC, 2011 §§ANVISA, 2005, 2007.

3.6.3 Estados Unidos

O FDA (Food and Drug Administrarion) estabeleceu uma metodologia de triagem

que utiliza a fluorescência para detectar alguns HPAs em determinados frutos do mar. A

Tabela 6 mostra os níveis de alerta de diferentes HPAs em camarão, caranguejo, ostras e

peixe (FDA, 2011).

Tabela 6: Níveis de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos estabelecidos pelo FDA (Food

and Drug Administrarion) em frutos do mar.

Composto Nível de alerta (mg/Kg)*

Camarão e caranguejo Ostras Peixe

Naftaleno 123 133 32,7

Acenafteno NA NA NA

Fluoreno 246 267 65,3

Fenantreno* 18461 20001 4901

Antraceno*

Fluoranteno 246 267 65,3

Pireno 185 200 49

Benzo(a)antraceno 1,32 1,43 0,35

Criseno 132 143 35

Benzo(b)fluoranteno 1,32 1,43 0,35

Benzo(k)fluoranteno 13,2 14,3 3,5

Benzo(a)pireno 0,132 0,143 0,035

Dibenzo(a,h)antraceno 0,132 0,143 0,035

Benzo(ghi)perileno* NA NA NA

Indeno(1,2,3-c,d)pireno 1,32 1,43 0,35

NA: Não aplicável; 1: Representa a soma dos níveis de fenantreno e antraceno; *: Inclusão

dos homólogos alquilados (C-1, C-2, C-3, C-4 naftalenos, fluoretos de C-1, C-2, C-3; C-1, C-

2, C-3, C-4 antraceno/fenantreno). Fonte: Adaptado de FDA, 2011.

41

3.7 Mutação e câncer

O câncer é basicamente uma doença de células, caracterizada por um desvio nos

mecanismos que controlam a proliferação e a diferenciação celular. As células que sofrem

transformação neoplásica proliferam excessivamente e formam tumores locais que podem

comprimir ou invadir estruturas adjacentes normais. A incidência, distribuição geográfica e o

comportamento de tipos específicos de câncer estão relacionados a múltiplos fatores, como

sexo, idade, predisposição genética e exposição à carcinógenos ambientais. Entre esses

fatores, a exposição ambiental é responsável pela maioria dos casos (KATZUNG, 2005, p.

751).

As alterações que geram neoplasias ocorrem em duas famílias de genes que

controlam o ciclo celular: os proto-oncogenes e os supressores de tumor. Nos tecidos, há

inúmeras células e o controle sobre suas multiplicações é absolutamente necessário para

manter o equilíbrio tecidual. Para que células normais saiam do estado quiescente e comecem

a se proliferar, elas recebem, principalmente, sinais vindos do ambiente em seu entorno, seja

de outras células ou da matriz extracelular que preenche o espaço entre elas. Da mesma

forma, existem sinais bioquímicos que agem para inibir a divisão celular. Eles podem ser de

dois tipos: os que forçam as células a sair do estado proliferativo para o estado quiescente, do

qual elas podem reemergir quando o ambiente enviar sinais para isso ou aqueles que as

mantêm em estado de pós-mitose, quando a divisão já está terminada. Para tornar-se uma

célula cancerosa é preciso desenvolver a capacidade de evitar esses sinais para que sua

proliferação celular não seja inibida (TEIXEIRA, 2007).

Os proto-oncogenes estão envolvidos na codificação de seus receptores, fatores de

crescimento, proteínas transdutoras de sinais que culminam na ativação do ciclo celular e

fatores nucleares de transcrição que controlam as fases desse ciclo. Quando ocorrem

mutações, os proto-oncogenes tornam-se oncogenes, que causam multiplicação celular

excessiva devido à alta expressão da proteína estimuladora do crescimento ou à produção da

forma mais ativa dessa proteína (DUESBERG et al., 2005). Alguns danos específicos

causados nos proto-oncogenes são: mutações puntiformes, rearranjos cromossômicos

(inversões e translocações) e amplificação gênica (HJALGRIM, 2003).

Os genes supressores de tumor detêm a replicação da célula quando há dano no DNA

através da parada do ciclo celular para recrutamento das proteínas de reparo ou indução de

apoptose para que o dano não se perpetue, inibindo a multiplicação (KATZUNG, 1998, p.

629-655). Alguns desses genes são: gene Rb, gene p53, genes BRCA1 e BRCA2, KLF6 que

se localizam no núcleo; NF-2 no citoesqueleto; NF-1 no aspecto interno da membrana

42

plasmática; receptor de TGF-Beta e caderina E na superfície celular; APC/Beta-catenina,

PTE, SMAD2 e SMAD4 no citosol. Os genes que regulam a apoptose têm papel importante

na oncogênese, pois uma alteração em determinados genes supressores pode inibir sua ação

impedindo que a célula tumoral entre em apoptose. O gene p53, chamado de “guardião do

genoma”, está localizado no cromossoma 17p13.1 e é o alvo mais comum das alterações

genéticas em tumores humanos, estando alterado em pouco mais de 50% dos casos (LIU MC,

2002). Mutações nos genes supressores de tumor contribuem para o desenvolvimento de

câncer uma vez que priva a célula de controles cruciais para a inibição do crescimento

inapropriado (TEIXEIRA, 2007).

As mutações espontâneas acumulam-se nas células somáticas ao longo da vida de

uma pessoa. A maioria dessas mutações não tem um efeito notável, mas algumas podem

alterar as principais funções celulares. As mutações somáticas podem causar distúrbios no

desenvolvimento normal do organismo e o acúmulo progressivo de mutações pode levar ao

câncer. A maioria dos cânceres carrega de 1.000 a 20.000 mutações de pontos somáticos e de

algumas a centenas de inserções, deleções e rearranjos (SHENDURE, NAT, 2008; CONRAD

et al., 2011; JIANG et al., 2013; SÉGUREL, WYMAN, PRZEWORSKI, 2014).

Diante da elevada popularidade do café, numerosos estudos têm sido conduzidos

para avaliar a sua segurança (WHO, IARC, 1991; NEHLIG, DEBRY, 1994, 1996;

TURESKY et al., 2003). Pesquisas têm avaliado o potencial mutagênico da cafeína devido à

sua similaridade química com os componentes purínicos dos ácidos nucleicos (DLUGOSZ et

al., 1996; CHRISTIAN, BRENT, 2001; NAWROT et al., 2003). A possível incorporação da

cafeína no material genético pode alterar as instruções de replicação celular (DLUGOSZ et

al., 1996). Ela apresenta resultados positivos em diversos ensaios de mutagenicidade em

organismos eucarióticos e linhagens celulares humanas (NAWROT et al., 2003).

A ocorrência de compostos mutagênicos em alimentos tratados termicamente é

comum (COMMONER et al., 1979; RAPPAPORT, 1979; DOLARA et al., 1980;

MIINZNER, 1981; BJELDANES et al., 1982a, b; LIN, LEE, HUANG, 1982). A torrefação

dos grãos de café a temperaturas de aproximadamente 220 °C é importante para a formação

de compostos responsáveis pelo sabor da bebida. Nessas temperaturas, ocorrem as reações de

ressonância entre carboidratos e compostos com grupamento amino. Utilizando o ensaio de

Salmonella/microssoma em mamíferos (AMES, McCARM, YAMASAKI, 1975), vários

autores (NAGAO et al., 1979; AESCHBACHER, CHAPPUIS, WURZNER, 1980;

AESCHBACHER, WURZNER, 1980) conseguiram demonstrar atividade mutagênica em

extratos aquosos de café instantâneo e em grãos torrados. A presença de compostos

43

heterocíclicos aromáticos em alimentos representa um grave problema de saúde pública,

tomando-se imprescindível a criação de uma legislação limitativa e de metodologias para a

sua detecção e quantificação (CHEN, CHIU, 1998). Diante disso, tem-se pesquisado

estratégias para o processamento de alimentos que reduzam a formação de compostos com

potencial mutagênico e carcinogênico (KNIZE, FELTON, GROSS, 1992).

44

4. Material e métodos

4.1 Preparo das amostras

A Consultoria Grão Mestre Café forneceu seis amostras de grãos de café torrados em

máquina Rod-Bel e moídos em moinho do tipo RA-23/27/24/25 para café e outros grãos

(modelo 56RC61004). As amostras foram enumeradas com códigos a fim de se realizar

ensaios cegos (café de qualidade comercial: 445 (torra clara – Agtron 95), 659 (torra média –

Agtron 65) e 762 (torra escura – Agtron 45); café de qualidade especial: 917 (torra clara –

Agtron 75), 823 (torra média – Agtron 55) e 935 (torra escura – Agtron 35)). Os tempos de

torra foram: 15 minutos (torra clara), 16 minutos (torra média) e 17 minutos (torra escura).

Todas as amostras pertencem à espécie Coffea arabica. As bebidas foram preparadas

utilizando cafeteira elétrica (Cafeteira CP38 Britânia) por percolação, na proporção de 24 g de

café para 400 mL de água destilada. O filtro de papel utilizado foi previamente umedecido

com 200 mL de água destilada aquecida até fervura para eliminar possíveis resíduos de

acrilamida.

Em seguida, as amostras foram liofilizadas e o resíduo seco foi ressuspendido em

água destilada estéril em concentrações apropriadas para cada ensaio. As soluções foram

armazenadas em tubos com fundo cônico tipo falcon no freezer a -20 ºC até a realização dos

ensaios. Todos os experimentos foram realizados nos Departamento de Biofísica e Biometria

e de Química Orgânica da Universidade do Estado do Rio de Janeiro; e a leitura das lâminas

do ensaio de micronúcleo foi feita no Laboratório de Toxicologia da Universidade Federal

Fluminense.

4.2 Análise Química

Pesou-se 1 g de cada amostra de café (445, 659, 762, 917, 823 e 935) e realizou-se a

extração em soxhlet com 100 mL de clorofórmio por um período de 4 horas. O excesso de

solvente foi removido em evaporador rotatório. O extrato foi solubilizado em 1 mL de

clorofórmio e analisado por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-

EM) (456 GC – MS-TQ, Bruker Daltonics, Inc., Alemanha).

A separação cromatográfica foi realizada em uma coluna capilar de sílica fundida

BR-5MS (30 m × 0,25 mm × 0,25 µm de espessura de filme) usando hélio como gás

carreador a 0,6 mL/min em modo de fluxo constante. As injeções foram feitas sem divisão de

45

fluxo. O detector espectrométrico de massas (MSD – Mass Spectrometric Detector) foi

operado por impacto eletrônico (70 eV) no modo de varredura (40-400 m/z). A entrada do

injetor estava a 250 °C e a temperatura do detector de massas foi de 280 °C. A temperatura do

forno estava a 60 ºC, sendo aumentada 3 ºC/min até atingir a temperatura de 240 ºC que foi

mantida por 2 minutos.

Os componentes presentes nas amostras foram identificados através dos seus índices

de retenção e espectros de massas, comparados com os dados correspondentes da biblioteca

NIST (National Institute of Standards and Technology) e dos compostos de referência. Esse

procedimento foi realizado em duplicata e com o branco analítico.

4.3 Teste de mutagenicidade Salmonella/microssoma

O teste de mutagenicidade com Salmonella Typhimurium é um teste de curta

duração utilizado para detectar substâncias que podem causar mutações de ponto. As

linhagens de Salmonella (TA98 e TA100) usadas nesse teste sofreram mutações nos genes

responsáveis pela biossíntese da histidina (Tabela 7) e consequentemente, não conseguem

crescer em meio pobre a esse aminoácido. Entretanto, quando expostas a mutágenos essa

mutação original da Salmonella é revertida e as cepas voltam a crescer em meio escasso de

histidina (MARON, AMES, 1983). As cepas utilizadas neste estudo foram previamente

identificadas através da avaliação das suas características genéticas e suas respectivas taxas de

reversão. A Tabela 8 mostra a taxa de reversão espontânea esperada para cada linhagem de

Salmonella utilizada nesse ensaio.

O teste com Salmonella/microssoma também conhecido como Teste de Ames

permite detectar a ação mutagênica dos alimentos que sofrem processamentos térmicos

(MILLER, 1989, p. 145-188). Esse teste é reconhecido pelo FDA (Food and Drug

Administrarion), reprodutível e tem sido capaz de detectar cerca de 90% dos carcinógenos

humanos conhecidos. Além disso, é considerado o melhor ensaio autônomo de identificação

de mutagenicidade, sendo amplamente utilizado em vários segmentos. Sendo assim, ele foi

selecionado como o método de primeira escolha para uma avaliação preliminar de

mutagenicidade e carcinogenicidade (MAHADEVAN et al., 2011).

Utilizou-se o protocolo de pré-incubação (MARON, AMES, 1983; OECD, 1997) do

ensaio Salmonella/microssoma que foi realizado na presença e ausência de metabolização. A

metabolização exógena (mix de S9 (50 mL): 21,75 mL de água destilada estéril, 25 mL de

tampão fosfato de sódio, 2 mL de NADP, 250 µL de glicose e 1 mL de solução de sais (MgCl,

46

KCl, Na2HPO4 H2O e NaH2PO4 H2O)) simula as transformações que a substância testada pode

sofrer no fígado de mamíferos. As linhagens de Salmonella Typhimurium (TA98 e TA100;

100 µL) foram expostas às amostras em diferentes concentrações (0,005, 0,05, 0,5, 5 e 50

mg/mL; 100 µL) e aos controles negativo (água destilada estéril; 100 µL) e positivo (4-

nitroquinolina 1-óxido 0,5 e 5 μg/placa para TA98 e TA100, respectivamente, na ausência de

S9 e 2-aminoantraceno 20 μg/placa na presença de S9; 100 µL) na ausência (tampão fosfato

de sódio 0,2 M e pH 7,4; 500 µL) e presença de ativação metabólica exógena (S9 4% p/v; 500

µL) e a mistura foi incubada por 20 minutos a 150 rpm e 37 °C. Posteriormente, 2 mL de

gelose contendo solução de histidina e biotina a aproximadamente 45 °C foram adicionados e

a mistura final foi vertida sobre uma placa de Petri contendo meio mínimo. Após incubação

por 72 horas a 37 ºC, o número de revertentes em cada placa foi contado. O resultado foi

considerado positivo quando o número de revertentes das cepas tratadas aumentou

significativamente comparado ao controle negativo.

Tabela 7: Características genéticas das linhagens de Salmonella Typhimurium.

Linhagem Genótipo Tipo de mutação detectada

TA98 hisD30521, rfa2, Δbio3,

ΔuvrB4, pKM101 (Apr)5 Deslocamento do quadro de leitura

TA100 hisG461, rfa2, Δbio3, ΔuvrB4,

pKM101 (Apr)5 Substituição de pares de bases

1: his – Mutação responsável pela síntese de histidina; 2: rfa – Permeabilidade da membrana

de lipopolissacarídeos; 3: Dependência à biotina; 4: ΔuvrB – Deleção do gene uvrB; 5: Apr –

Ampicilina resistente; pKM101: Plasmídeo. Fonte: MARON, AMES, 1983.

Tabela 8: Taxa de reversão/placa espontânea esperada para cada linhagem de Salmonella

Typhimurium.

Linhagem Taxa de reversão espontânea esperada

TA98 25-75

TA100 75-225

Fonte: UMBUZEIRO, VARGAS, 2003.

4.4 Cultivo das células

A linhagem celular de hepatocarcinoma humano HepG2 foi gentilmente fornecida

pela Profª. Drª. Danielle Palma de Oliveira da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de

Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. O vial contendo 1 x 106 células/mL das células

47

HepG2 foi removido do nitrogênio líquido para que o descongelamento fosse feito em banho-

maria. As células foram transferidas para um tubo de fundo cônico tipo falcon contendo 9 mL

de meio de cultivo suplementado (DMEM 1: soro bovino fetal 9). Em seguida, o tubo foi

centrifugado por 5 minutos a 1.500 rpm e o sobrenadante foi descartado. O pellet de células

foi ressuspendido com 1 mL do mesmo meio de cultivo suplementado. As células foram

transferidas para uma garrafa de cultura de 150 cm2 contendo 30 mL de meio de cultivo

suplementado e incubadas na estufa a 37 °C e 5% de CO2 durante 48 horas.

Após o período de incubação, o meio de cultivo foi descartado e as células foram

lavadas com 10 mL de tampão PBS 1X (pH 7,4). Posteriormente, adicionou-se 10 mL de

tripsina e foi feita uma nova incubação na estufa a 37 ºC e 5% CO2 durante 5 minutos. A

tripsina foi inativada utilizando o mesmo volume de meio de cultivo suplementado. Em

seguida, essa solução foi transferida para um tubo falcon e centrifugada a 1.500 rpm por 5

minutos. O sobrenadante foi desprezado e o pellet foi ressuspendido com 1 mL de meio

suplementado.

A contagem das células foi feita utilizando a câmara de Neubauer e coloração com

Trypan Blue a fim de avaliar a viabilidade das mesmas, uma vez que as células viáveis ficam

incolores e brilhantes; e as inviáveis são coradas de azul. Uma alíquota da suspensão de

células foi diluida em Trypan Blue (10 µL da suspensão celular e 90 µL do corante). Então,

utilizando uma micropipeta, preencheu-se a câmara de Neubauer procedendo à contagem das

células nos quadrantes brancos. Para se obter o número de células por mL da suspensão,

multiplicou-se a média das células por quadrante pela diluição das células em Trypan Blue

(10) e pelo fator de diluição da câmara (10.000).

4.5 Ensaio de citotoxicidade WST-1

Este teste baseia-se na redução do íon (4-[3-(4-iodofenil)-2-(4-nitrofenil)-2H-5-

tetrazólio]-1,3-benzeno disulfonato) pela enzima desidrogenase nas mitocôndrias das células

metabolicamente ativas para gerar Formazan, o qual apresenta uma coloração amarelo/laranja

e pode ser analisado por espectrofotometria. Essa conversão ocorre somente nas células

viáveis, sendo então possível determinar a proporção de células vivas após o tratamento. A

análise de citotoxicidade foi feita de acordo com Mencalha e colaboradores (2014). Foram

plaqueados 1 x 105 células/mL das células HepG2 e 100 µL de meio de cultivo suplementado

em cada poço de uma placa contendo 96 poços. Após 24 horas de incubação (37 °C e 5%

CO2), o meio de cultivo suplementado foi descartado e 90 µL de meio fresco foram

48

adicionados. Em seguida, diferentes concentrações das amostras (0,005, 0,05, 0,5, 5 e 50

mg/mL; 10 µL) foram colocadas em contato com as células HepG2 num intervalo de 24, 48 e

72 horas, assim como os controles negativo (água destilada estéril; 10 µL) e positivo (Triton

X-100 5%; 10 µL). Após os intervalos de exposição, as células foram lavadas com 100 µL de

tampão PBS 1X e foram adicionados 90 µL de meio suplementado fresco e 10 µL da solução

de WST-1. Em seguida, as células foram mantidas a 37 °C e 5% CO2 por 3 horas. A

quantificação das variações colorimétricas foi realizada em leitor de microplaca (μ-Quant,

Bio-tek Instruments INC) utilizando-se o comprimento de onda de 450 nm. A porcentagem

das células viáveis foi determinada pela razão da absorvância obtida das culturas tratadas em

relação às não tratadas, assumindo que as não tratadas tinham 100% de viabilidade.

Para cada amostra avaliada, também foi calculado o valor de IC50 (inhibitory

concentration of 50%) que mede a concentração capaz de inibir 50% da viabilidade celular. O

valor de IC50 foi determinado através da equação obtida pelo gráfico da porcentagem de

viabilidade celular em 72 horas em função das concentrações testadas. Foram gerados os

valores de R2 da regressão polinomial de ordem dois de cada gráfico para calcular o IC50.

4.6 Ensaio de micronúcleo (MN)

O micronúcleo (MN) in vitro é um teste de genotoxicidade para a detecção de

micronúcleo no citoplasma das células em interfase. O MN pode ter origem de fragmentos de

cromossomos acêntricos ou inteiros que são incapazes de migrar para os polos durante o

estágio de anáfase na divisão celular. Esse ensaio detecta a capacidade da substância teste

induzir clastogenicidade ou aneugenicidade em células que foram submetidas à divisão

celular durante ou após a exposição à substância teste (FENECH, CROTT, 2000). Além

disso, também é um ensaio exigido pela OECD TG487 para avaliação de genotoxicidade

(OECD, 2014).

Foram plaqueados 2 x 104 células/mL das células HepG2 e 1 mL de meio de cultivo

suplementado em cada poço de uma placa contendo 24 poços com lamínulas pré tratadas com

ácido nítrico 0,1 M. Após 24 horas de incubação (37 °C, 5% CO2 e 95% de umidade relativa),

o meio de cultivo suplementado foi descartado e 900 µL de meio fresco foram adicionados.

Em seguida, a linhagem celular de hepatocarcinoma humano HepG2 foi exposta às amostras

de café em diferentes concentrações (amostras 445 e 659: 0,05, 0,5, 5, 50 e 500 µg/mL; 100

µL e amostras 762, 917, 823 e 935: 0,005, 0,05, 0,5, 5 e 50 µg/mL; 100 µL) assim como aos

49

controles negativo (água destilada estéril, 100 µL) e positivo (benzo-α-pireno 2,5 µg/mL; 100

µL). Após 24 horas de tratamento com as amostras a 37 ºC, 5% CO2 e 95% de umidade

relativa, as células foram lavadas com 1 mL de tampão PBS 1X e foi adicionado 1 mL de

citocalasina B (3 µg/mL). Depois de 24 horas do tratamento com a citocalasina B a 37 ºC, 5%

CO2 e 95% de umidade relativa, as células foram lavadas novamente com o tampão e

adicionou-se 1 mL do fixador fresco (metanol 3 : ácido ácetico 1) que foi mantido por 1 hora.

Em seguida, após uma nova lavagem com PBS 1X, 500 µL de Giemsa 0,6% foram

adicionados e mantidos por 30 minutos. Após as células estarem coradas, as mesmas foram

lavadas com 1 mL de PBS 1X, as lamínulas foram retiradas e as lâminas de vidro foram

preparadas com Entellan Novo (Merck, Darmstadt, Alemanha). Em seguida, as células foram

analisadas em microscópio óptico (Olympus CX31 – RTSF) com aumento de 40x (FENECH,

CROTT, 2000; OECD, 2014). O resultado foi considerado positivo quando o número de

micronúcleos das células binucleadas tratadas aumentou significativamente comparado ao

controle negativo.

4.7 Análise Estatística

Os resultados gerados foram comparados com os valores do controle negativo

usando one way ANOVA com o Dunnett’s post hoc test, através do GraphPad Prism

Software, versão 5.0. As diferenças foram consideradas significativas quando p < 0,05. Todos

os experimentos foram realizados em três repetições independentes.

50

5. Resultados

5.1 Rendimento dos extratos das amostras de café

A Tabela 9 mostra os rendimentos dos extratos das amostras de café comercial 445,

659 e 762; e de café especial 917, 823 e 935 após o processo de liofilização.

Tabela 9: Rendimento dos extratos das amostras de café após a liofilização.

%Rendimento

Amostras de Qualidade Comercial

445 (torra clara) 20,15

659 (torra média) 21,85

762 (torra escura) 19,08

Amostras de Qualidade Especial




5.2 Análise Química

As amostras de qualidade comercial 445 (torra clara), 659 (torra média), 762 (torra

escura) (Figuras 7-9) e a amostra 823 (torra média) de qualidade especial (Figura 11),

apresentaram um pico de grande intensidade no tempo de retenção de 14,96 minutos, sendo

identificado pela biblioteca NIST como naftaleno. Para confirmar a presença desse composto,

foi feita uma coinjeção de naftaleno nas amostras 445, 659, 762 e 823 que foram novamente

analisadas por CG-EM. Houve um aumento da intensidade do pico com tempo de retenção de

14,96 minutos nas amostras, sendo observado um pico semelhante com a injeção de padrão de

naftaleno, confirmando a presença do mesmo nas amostras.

Todas as amostras apresentaram um pico com tempo de retenção de 41 minutos que

de acordo com a biblioteca NIST, corresponde à cafeína (Figuras 7-12).

51

Figura 7: Cromatograma total de íons da amostra 445.

52


53


54


55


56


57

5.3 Teste de mutagenicidade Salmonella/microssoma

As Figuras 13-24 mostram a média do número de colônias revertentes após

exposição das cepas TA98 e TA100 às amostras de café comercial 445 (torra clara), 659

(torra média) e 762 (torra escura); e de café especial 917 (torra clara), 823 (torra média) e 935

(torra escura), respectivamente, na presença e ausência de metabolização exógena (S9) em

função das concentrações testadas.

5.3.1 Amostra 445

De acordo com as Figuras 13 e 14, pode-se observar que não houve alterações

significativas do número de revertentes na presença e na ausência de S9 para as cepas TA98 e

TA100, respectivamente.

Figura 13: Curva dose-resposta para a amostra de café 445 testada com a cepa TA98 na

presença e ausência de metabolização exógena (S9). Controle negativo (0): Água destilada

estéril; Controle positivo (Positivo): 4-nitroquinolina 1-óxido 0,5 μg/placa (-S9) e 2-

aminoantraceno 20 μg/placa (+S9); *: p < 0,05 comparado ao controle negativo.

58



estéril; Controle positivo (Positivo): 4-nitroquinolina 1-óxido 5 μg/placa (-S9) e 2-


59

5.3.2 Amostra 659

A Figura 15 mostra que não houve alterações significativas do número de revertentes

na presença e na ausência de S9 para a cepa TA98. De acordo com a Figura 16, pode-se

observar que a cepa TA100 apresentou citotoxicidade quando tratada com as concentrações

0,05, 0,5, 5 e 50 mg/mL na presença de S9.





60




aminoantraceno 20 μg/placa (+S9); *: p < 0,05 comparado ao controle negativo;

#: Citotoxicidade significativa (p < 0,05) comparada ao controle negativo.

61

5.3.3 Amostra 762

Conforme indicado na Figura 17, a maior concentração testada (50 mg/mL) induziu

aumento significativo do número de revertentes da cepa TA98 sob ausência de S9. Para a

cepa TA98 testada em presença de S9 (Figura 17) e TA100 sob presença e ausência de S9

(Figura 18), não houve aumento significativo do número de revertentes.





62





63

5.3.4 Amostra 917








64





65

5.3.5 Amostra 823








66





67

5.3.6 Amostra 935








68





69

5.4 Ensaio de citotoxicidade WST-1

As Figuras 25-30 mostram o percentual de viabilidade das células HepG2 expostas

às amostras de café comercial 445 (torra clara), 659 (torra média) e 762 (torra escura); e de

café especial 917 (torra clara), 823 (torra média) e 935 (torra escura), respectivamente, após

24, 48 e 72 horas de tratamento.

Pode-se observar que a amostra 445 reduziu significativamente a viabilidade das

células HepG2 após 24 horas de exposição a partir da concentração de 0,5 mg/mL. Após 48 e

72 horas de tratamento, a perda da viabilidade foi significativa a partir de 0,05 mg/mL (Figura

25).

Figura 25: Porcentagem de viabilidade das células HepG2 tratadas com diferentes

concentrações da amostra de café 445 por 24, 48 e 72 horas. Controle negativo (0): Água

destilada estéril; Controle Positivo (Positivo): Triton X-100 5 %; *: p < 0,05 comparado ao

controle negativo.

70

Para a amostra 659 (Figura 26), a partir da concentração de 0,5 mg/mL houve uma

redução significativa na viabilidade celular em todos os tempos de exposição avaliados.



destilada estéril; Controle Positivo (Positivo): Triton X-100 5%; *: p < 0,05 comparado ao

controle negativo.

71

A amostra 762 reduziu significativamente a viabilidade das células de câncer de

fígado humano desde a menor concentração (0,005 mg/mL) em todos os três tempos de

exposição (Figura 27).




controle negativo.

72

A amostra 917 (Figura 28) diminuiu significativamente a atividade mitocondrial a

partir de 0,005 mg/mL em todos os tempos de exposição avaliados.




controle negativo.

73

Para a amostra 823, a partir da concentração de 0,5 mg/mL a redução da viabilidade

celular foi significativa em 24 horas de tratamento. Após 48 e 72 horas de exposição, a perda

da viabilidade ocorreu desde a menor concentração (0,005 mg/mL) testada (Figura 29).




controle negativo.

74

A amostra 935 reduziu significativamente a viabilidade das células HepG2 a partir de

0,05 mg/mL nos três tempos de tratamento (Figura 30).




controle negativo.

75

A Tabela 10 mostra os valores de IC50 (inhibitory concentration of 50%) das

amostras de café comercial 445, 659 e 762; e de café especial 917, 823 e 935. O valor de IC50

indica a concentração que foi capaz de inibir 50% da viabilidade das células HepG2 em 72

horas de tratamento.

Tabela 10: Valores de IC50 (inhibitory concentration of 50%) das amostras de café usadas no

tratamento das células HepG2 durante 72 horas.

IC50 (inhibitory concentration of 50%)

(mg/mL)

Amostras de Qualidade Comercial




Amostras de Qualidade Especial




5.5 Ensaio de micronúcleo (MN)

As Figuras 31 e 32 mostram a média do número de MN a cada 700 células (HepG2)

binucleadas tratadas com as amostras de café comercial 445 (torra clara), 659 (torra média) e

762 (torra escura); e de café especial 917 (torra clara), 823 (torra média) e 935 (torra escura),

respectivamente, durante 24 horas. Pode-se observar que nenhuma das amostras avaliadas foi

capaz de induzir genotoxicidade na linhagem celular de hepatocarcinoma humano HepG2.

76

Figura 31: Número de micronúcleos (MN) por 700 células (HepG2) binucleadas tratadas com

diferentes concentrações das amostras de café 445, 659 e 762, respectivamente, por 24 horas.

Controle negativo (0): Água destilada estéril; Controle Positivo (Positivo): Benzo-α-pireno

2,5 µg/mL; *: p < 0,05 comparado ao controle negativo.

77

Figura 32: Número de micronúcleos (MN) por 700 células (HepG2) binucleadas tratadas com

diferentes concentrações das amostras de café 917, 823 e 935, respectivamente, por 24 horas.

Controle negativo (0): Água destilada estéril; Controle Positivo (Positivo): Benzo-α-pireno

2,5 µg/mL; *: p < 0,05 comparado ao controle negativo.

78

As Tabelas 11 e 12 mostram os valores dos avaliadores de citotoxicidade (CBPI,

%RI e %Citostática) das células HepG2 tratadas com as amostras de café comercial 445, 659

e 762; e de café especial 917, 823 e 935. Todas as amostras apresentaram um valor de CBPI

(Cytokinesis-Block Proliferation Index) entre 1 e 2. Os valores de %RI (Replication Index)

foram próximos a 100 e a porcentagem citostática foi baixa para todas as amostras avaliadas,

não ultrapassando 7,2%. Todos os valores foram calculados de acordo com as fórmulas

publicadas em OECD (2014).

Tabela 11: Valores de CBPI (Cytokinesis-Block Proliferation Index), %RI (Replication

Index) e %Citostática para as células HepG2 tratadas com diferentes concentrações das

amostras de café 445, 659 e 762 por 24 horas.

Concentração (µg/mL) CBPI %RI %Citostática

Amostra 445 (torra clara)

Controle Negativo 1,71 ± 0,02 − −

0,05 1,72 ± 0,02 100,0 0,0

0,5 1,68 ± 0,03 96,7 3,3

5 1,71 ± 0,01 100,0 0,0

50 1,68 ± 0,02 95,6 4,4

500 1,74 ± 0,01 100,0 0,0

Controle Positivo 1,70 ± 0,01 99,6 0,4

Amostra 659 (torra média)


0,05 1,71 ± 0,01 100,0 0,0

0,5 1,74 ± 0,02 100,0 0,0

5 1,72 ± 0,01 100,0 0,0

50 1,72 ± 0,02 100,0 0,0

500 1,74 ± 0,01 100,0 0,0


Amostra 762 (torra escura)


0,005 1,70 ± 0,01 99,8 0,2

0,05 1,73 ± 0,00 100,0 0,0

0,5 1,71 ± 0,02 100,0 0,0

5 1,72 ± 0,01 100,0 0,0

50 1,74 ± 0,02 100,0 0,0


Controle Negativo: Água destilada estéril; Controle Positivo: Benzo-α-pireno 2,5 µg/mL.

79

Tabela 12: Valores de CBPI (Cytokinesis-Block Proliferation Index), %RI (Replication

Index) e %Citostática para as células HepG2 tratadas com diferentes concentrações das

amostras de café 917, 823 e 935 por 24 horas.

Concentração (µg/mL) CBPI %RI %Citostática

Amostra 917 (torra clara)


0,005 1,77 ± 0,05 100,0 0,0

0,05 1,71 ± 0,01 94,1 5,9

0,5 1,71 ± 0,00 94,1 5,9

5 1,81 ± 0,02 100,0 0,0

50 1,70 ± 0,03 92,8 7,2


Amostra 823 (torra média)


0,005 1,83 ± 0,04 100,0 0,0

0,05 1,81 ± 0,06 100,0 0,0

0,5 1,71 ± 0,02 94,8 5,2

5 1,72 ± 0,00 95,5 4,5

50 1,72 ± 0,02 95,5 4,5


Amostra 935 (torra escura)


0,005 1,73 ± 0,02 96,6 3,4

0,05 1,73 ± 0,06 96,6 3,4

0,5 1,72 ± 0,01 94,8 5,2

5 1,75 ± 0,02 99,9 0,1

50 1,80 ± 0,04 100,0 0,0


Controle Negativo: Água destilada estéril; Controle Positivo: Benzo-α-pireno 2,5 µg/mL.

80

6. Discussão

De todas as amostras avaliadas, apenas a 762, na maior concentração testada (50

mg/mL), induziu aumento significativo do número de revertentes da cepa TA98 de

Salmonella na ausência de metabolização exógena (Figura 17), indicando atividade

mutagênica (deslocamento do quadro de leitura) nessas condições. A amostra 762 possui

qualidade comercial e sofreu processamento referente a torra escura, ou seja, teve maior

tempo de torra se comparada às amostras 445 e 659 que possuem a mesma qualidade do grão,

porém menor grau de torrefação. Ainda, é importante ressaltar que a amostra 659 (qualidade

comercial e torra média) foi citotóxica nas concentrações 0,05, 0,5, 5 e 50 mg/mL para a cepa

TA100 em presença de S9 (Figura 16). Assim, para assegurar que a citotoxiciadade não tenha

interferido na avaliação da mutagenicidade gerando um resultado falso negativo, foram

testadas duas concentrações mais diluídas (0,0005 e 0,00005 mg/mL) a partir da menor dose

não tóxica (0,005 mg/mL). As três menores concentrações não apresentaram atividade

mutagênica e nem foram citotóxicas para o tratamento da cepa TA100 na presença S9,

garantindo que a resposta mutagênica foi negativa nessas condições (Figura 16). As amostras

de café especial 917 (torra clara), 823 (torra média) e 935 (torra escura) não apresentaram

mutagenicidade nas condições avaliadas neste estudo (Figuras 19-24).

As mutações somáticas podem ocasionar distúrbios no desenvolvimento do

organismo e o acúmulo gradual de mutações pode causar câncer. A maioria dos cânceres

carrega várias mutações de pontos somáticas, inserções, deleções e rearranjos (SHENDURE,

NAT, 2008; CONRAD et al., 2011; JIANG et al., 2013; SÉGUREL, WYMAN,

PRZEWORSKI, 2014).

Dados da literatura têm mostrado que a torrefação leva à formação de compostos

tóxicos, principalmente HPAs (NERI, 2004), que possuem potencial carcinogênico e

mutagênico (IARC, 1983; JOE, SALEMME, FAZIO, 1984). A contaminação do café com os

HPAs pode ocorrer dependendo das temperaturas utilizadas. A formação desses compostos

acontece durante a combustão incompleta da matéria orgânica, sendo influenciada pela

temperatura e pressão. O aumento da temperatura contribui para o maior percentual de

formação de agentes tóxicos (PAGE et al., 1999). No presente estudo, apenas a amostra com

maior grau de torrefação e qualidade comercial apresentou atividade mutagênica nas

condições descritas (Figura 17).

De acordo com os cromatogramas apresentados na análise química, as amostras 445

(Figura 7), 659 (Figura 8), 762 (Figura 9) e 823 (Figura 11) contêm naftaleno na sua

81

composição. O naftaleno é um HPA de baixa massa molecular e é possivelmente

carcinogênico para humanos (IARC, 2013). Esse composto sofre ativação metabólica

mediada pelo citocromo P450 (CYP) originando o epóxido, que é a sua forma reativa. O

epóxido pode ser conjugado com a glutationa (GSH), promovendo sua excreção. Porém, em

altos níveis de exposição, o GSH não consegue realizar o processo de desintoxicação

(PHIMISTER et al., 2004). Além disso, o epóxido pode ser metabolizado a outros compostos

reativos, como a 1,2-naftoquinona, capaz de desencadear o estresse oxidativo (BAGCHI et

al., 1998a, b, 2000, 2002) e de reagir com macromoléculas críticas (BUCKPITT et al., 2002).

Dessa forma, a carcinogenicidade do naftaleno está associada à presença das enzimas

metabólicas (CYP), produção de metabólitos tóxicos, depleção do GSH e às reações

citotóxicas dos próprios tecidos (RHOMBERG, BALEY, GOODMAN, 2010).

Além da atividade carcinogênica do naftaleno ser atribuída aos seus metabólitos,

estudos em animais mostram que esse HPA pode causar danos ao material genético mesmo

antes de ser metabolizado, incluindo a quebra da fita dupla do DNA (KARAGIANNIS et al.,

2011). Sabe-se que essa alteração do DNA consiste em um dano crítico em relação à

preservação da integridade genômica (JACKSON, 2001, 2002). O reparo inadequado da

quebra da fita dupla é o iniciador primário da carcinogênese (AUDEBERT et al., 2010 ).

O potencial mutagênico da cafeína está na sua similaridade química com os

componentes purínicos dos ácidos nucleicos (DLUGOSZ et al., 1996; CHRISTIAN, BRENT,

2001; NAWROT et al., 2003) podendo alterar a replicação celular (DLUGOSZ et al., 1996).

Alguns autores (NAGAO et al., 1979; AESCHBACHER, CHAPPUIS, WURZNER, 1980;

AESCHBACHER, WURZNER, 1980) comprovaram atividade mutagênica de extratos

aquosos de café instantâneo e de grãos torrados através do ensaio de Salmonella/microssoma

em mamíferos (AMES, McCARM, YAMASAKI, 1975), assim com os resultados obtidos

neste estudo.

Todas as amostras avaliadas neste trabalho apresentaram cafeína na sua composição

(Figuras 7-12). A amostra 762 (qualidade comercial e torra escura) tem maior concentração

dessa substância, como indicado pelo pico de grande intensidade no tempo de retenção de 41

minutos (Figura 9), justificando a mutagenicidade apresentada nas condições descritas. Ainda,

é importante considerar que a maior concentração de cafeína é capaz de aumentar a

hidrossolubilidade do naftaleno presente na amostra (HISCHENHUBER, STIJVE, 1987).

Assim, pode-se dizer que houve um sinergismo entre a cafeína e naftaleno presentes na

amostra 762.

82

Pelo ensaio de citotoxicidade WST-1, pode-se observar que houve uma redução

dose-dependente da viabilidade das células cancerosas HepG2 após a exposição ao extrato de

todas as amostras de café (Figuras 25-30), como corroborado por estudos semelhantes feitos

por Iriondo-DeHond e colaboradores (2017). A escolha dessa linhagem celular baseia-se no

fato de que para a IARC (International Agency for Research on Cancer), os maiores níveis

detectáveis de HPAs estão no fígado (IARC, 1985, 2013).

A Figura 25 mostra que a linhagem celular de hepatocarcinoma HepG2 mostrou-se

suscetível ao tratamento com extrato da amostra 445 a partir da concentração de 0,05 mg/mL

após 48 e 72 horas de exposição; e em 24 horas de incubação, a partir de 0,5 mg/mL houve

diminuição significativa da atividade das desidrogenases mitocondriais. As células tratadas

com a amostra 659 (Figura 26) sofreram redução da atividade mitocondrial após exposição à

concentração de 0,5 mg/mL em todos os tempos de incubação avaliados. A diminuição da

viabilidade foi significativa desde a menor concentração (0,005 mg/mL) em 24, 48 e 72 horas

sob o tratamento com o extrato da amostra 762 (Figura 27).

De acordo com a Figura 28, todas as concentrações da amostra 917 foram capazes de

diminuir significativamente a atividade mitocondrial das células cancerosas HepG2 nos três

tempos de exposição avaliados. O tratamento com a amostra 823 (Figura 29) reduziu

significativamente a atividade das desidrogenases mitocondriais a partir de 0,005 mg/mL após

48 e 72 horas de exposição; o mesmo só foi observado em 24 horas, a partir de 0,5 mg/mL. A

viabilidade celular diminuiu com a exposição à amostra 935 a partir da concentração de 0,05

mg/mL após todos os três tempos de incubação (Figura 30).

A Tabela 10 mostra os valores de IC50 (inhibitory concentration of 50%) das

amostras avaliadas. Quanto menor o valor de IC50, menor é a concentração necessária para

inibir 50% da viabilidade das células HepG2 em 72 horas de tratamento com cada amostra.

Com os resultados obtidos através do ensaio de citotoxicidade WST-1, observa-se que houve

um efeito citotóxico em hepatocarcinoma frente ao tratamento com todas as amostras de café

testadas (Figuras 25-30). Comparando-se as amostras de qualidade comercial 445 (torra

clara), 659 (torra média) e 762 (torra escura), tem-se que as células cancerosas apresentaram

maior sensibilidade ao extrato da amostra 762 (IC50 1,81 mg/mL). As células HepG2

apresentaram sensibilidade semelhante após o tratamento com as amostras 455 (IC50 2,04

mg/mL) e 659 (IC50 2,24 mg/mL).

Entre as amostras de qualidade especial 917 (torra clara), 823 (torra média) e 935

(torra escura), tem-se que as células cancerosas foram mais sensíveis ao tratamento com a

amostra 823 (IC50 0,6 mg/mL). As células tumorais hepáticas apresentaram sensibilidade

83

semelhante quando tratadas com as amostras 917 (IC50 1,80 mg/mL) e 935 (IC50 1,96

mg/mL) (Tabela 10).

As células de hepatocarcinoma humano apresentaram sensibilidade semelhante ao

tratamento com as amostras de café comercial e especial, visto que todas as amostras

apresentaram valores de IC50 ≅ 2 mg/mL, exceto a amostra 823 (qualidade especial e torra

média), cujo valor de IC50 foi de 0,6 mg/mL (Tabela 10). Esse valor muito baixo pode ser

justificado pela maior quantidade de naftaleno presente na amostra 823, indicada pelo pico de

grande intensidade no tempo de retenção de 14,96 minutos (Figura 11). Segundo a IARC

(2013), esse composto é possivelmente carcinogênico para humanos, o que é corroborado por

estudos feitos em animais (SCHREINER, 2003).

A citotoxicidade apresentada pelas amostras avaliadas pode estar relacionada com as

alterações dos compostos fenólicos (MILLS et al., 2013) e aromáticos (GONZALEZ-RIOS et

al., 2007a, b) que dependem dos níveis de torrefação do café. Tradicionalmente, o café é

torrado, moído e preparado em água quente. A presença de compostos benéficos pode ser

afetada desde a etapa da colheita dos grãos até a preparação da bebida para o consumo (LEE

et al., 2016; NUNES, COIMBRA, 2007; WEI et al., 2012). Assim, a atividade

antiproliferativa do café também depende do grau de torrefação, como mostrado nos

resultados de avaliação de citotoxicidade do presente estudo (Figuras 25-30). A relação entre

a torrefação e a capacidade antioxidante do café tem sido estudada (CHO et al., 2014) e

observa-se que o grão com menor grau de torrefação tem maior atividade antioxidante

comparado ao café mais torrado. Segundo estudos, existe uma tendência de que o café menos

torrado tenha um maior efeito antineoplásico. Porém, a relação entre a torrefação e a

prevenção do câncer ainda não está totalmente esclarecida (MOJICA et al., 2018). Esses

dados corroboram com os resultados apresentados no ensaio de citotoxicidade WST-1

(Figuras 25-27), uma vez que entre as amostras de qualidade comercial, a amostra 762 (torra

escura) induziu maior perda de viabilidade das células HepG2, comparada às amostras 445

(torra clara) e 659 (torra média). Para a amostra 762, observa-se que a perda da viabilidade

alcança ≅ 16% a partir da menor concentração em 24 horas, seguindo perdas ainda maiores

nas subsequentes concentrações avaliadas (Figura 27).

Os objetivos dos testes de genotoxicidade são avaliar o risco das substâncias

presentes nos alimentos, identificar compostos que possam induzir danos hereditários em

seres humanos e prever potenciais carcinogênicos e genotóxicos, contribuindo para a

elucidação do mecanismo de ação dos carcinógenos químicos (EFSA, 2011).

84

O fígado é o principal órgão de biotransformação de xenobióticos. Por isso, células

hepáticas são amplamente utilizadas em estudos de genotoxicidade (MERSCH-

SUNDERMANN et al., 2004). A HepG2, utilizada no ensaio de MN deste estudo, é uma

linhagem celular de hepatoblastoma humano que mantém várias características dos

hepatócitos. Essas células cancerosas, assim como as saudáveis, possuem enzimas

responsáveis pela ativação e desintoxicação de carcinógenos reativos ao DNA. Sendo assim,

as células HepG2 podem ser escolhidas como um modelo ex vivo capaz de detectar agentes

não genotóxicos e citoprotetores (CAO et al., 2007).

As Figuras 31 e 32 mostram os resultados obtidos no ensaio de MN. Pode-se

observar que nenhuma das amostras avaliadas foi capaz de induzir clastogenicidade ou

aneugenicidade nas células cancerosas de fígado (p < 0,05) nas condições avaliadas. Estudos

genotóxicos feitos por Iriondo-DeHond e colaboradores (2017) também mostraram que o café

arábica não induziu aumento significativo nos danos ao DNA em células HepG2 após 24

horas de tratamento.

Pode-se sugerir que houve uma minimização dos efeitos genotóxicos das amostras de

café testadas neste estudo devido à ação dos compostos antioxidantes. Sabe-se que essas

substâncias reduzem o estresse oxidativo relacionado à causa de várias doenças, como o

câncer (LAMBERT, YANG, 2003). Os polifenóis, como os ácidos clorogênicos presentes em

grande quantidade no café, têm forte atividade antioxidante (IWAI et al., 2004).

Quando a citocalasina B é utilizada no ensaio de genotoxicidade, a avaliação da

citotoxicidade baseia-se no CBPI (Cytokinesis-Block Proliferation Index) ou RI (Replication

Index) (KIRSCH-VOLDERS et al., 2003; LORGE et al., 2008).

O CBPI indica o número médio de núcleos por célula. Sendo assim, um valor de

CBPI igual a 1 significa que todas as células são mononucleadas e que existe 100% de

citostase (inibição do crescimento celular). Se todas as células viáveis completarem uma

divisão nuclear, tornando-se binucleadas, o valor de CBPI é 2. O RI indica o número de ciclos

celulares por célula durante a exposição à citocalasina B em culturas tratadas comparadas ao

controle. Assim, a porcentagem de RI (%RI) indica o percentual de células que se dividiu nas

culturas tratadas. O valor da porcentagem citostática (%Citostática) indica o percentual de

inibição do crescimento celular e é calculado através da %RI (100 - %RI) (OECD, 2014).

As Tabelas 11 e 12 mostram os valores dos avaliadores de citotoxicidade para as

amostras de café comercial 445, 659 e 762; e de café especial 917, 823 e 935,

respectivamente. Os valores de CPBI para todas as amostras variaram de 1,68 a 1,83 em todas

as concentrações testadas. Esses valores indicam que existem células mononucleadas nas

85

culturas tratadas, mas que a maioria delas é binucleada. Os valores da %RI para todas as

amostras avaliadas variaram de 92,8 a 100,0 em todas as concentrações testadas. Esse

resultado mostra que a maioria das células se dividiu normalmente nas culturas tratadas.

Consequentemente, os valores obtidos da %Citostática foram baixos (0,0 a 7,2), mostrando

que a inibição do crescimento celular foi de até 7,2%. Diante dos valores apresentados nas

Tabelas 11 e 12, tem-se que nenhuma das amostras de café apresentou citotoxicidade nas

concentrações avaliadas durante o tratamento das células HepG2 no ensaio de micronúcleo.

86

7. Conclusão

De acordo com a análise química, todas as amostras avaliadas apresentaram cafeína

na sua composição. Além dessa substância, as amostras 445, 659, 762 e 823 contêm

naftaleno. Esse composto é um HPA de baixa massa molecular e é possivelmente

carcinogênico para humanos.

De todas as amostras avaliadas, somente a 762 (qualidade comercial e torra escura)

induziu atividade mutagênica, sendo essa observada na ausência de metabolização exógena.

Segundo o ensaio de citotoxicidade, houve uma redução dose-dependente da

viabilidade das células HepG2 após a exposição ao extrato de todas as amostras de café

avaliadas. Entre os grãos de qualidade comercial, a amostra 762 (torra escura) induziu maior

perda de viabilidade celular. Em relação aos grãos de qualidade especial, as células HepG2

foram mais sensíveis ao tratamento com a amostra 823 (torra média). Comparando-se o

tratamento com os grãos de café comercial e especial, as células de hepatocarcinoma humano

apresentaram sensibilidades semelhantes.

Nenhuma das amostras testadas foi capaz de induzir clastogenicidade ou

aneugenicidade nas células cancerosas de fígado nas condições avaliadas no ensaio de

micronúcleo.

Através dos resultados obtidos, identificou-se uma correlação entre a qualidade dos

grãos, o grau de torrefação e os efeitos prejudiciais do café para a saúde humana.

Dessa maneira, o presente trabalho contribuiu para a elucidaçãos dos efeitos

deletérios do café, oferecendo subsídios para novos estudos que avaliem os impactos dessa

bebida sobre a saúde humana.

87

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