AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DO TRATAMENTO ... -...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO - UFES PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FISIOLÓGICAS CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE LABORATÓRIO DE FISIOLOGIA TRANSLACIONAL AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DO TRATAMENTO COM SILDENAFIL SOBRE CÉLULAS DE MEDULA ÓSSEA DE CAMUNDONGOS HIPERCOLESTEROLÊMICOS FRANCIANE PEREIRA BERNARDES Vitória-ES 2015
Transcript of AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DO TRATAMENTO ... -...
UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPRITO SANTO - UFES
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIAS FISIOLGICAS
CENTRO DE CINCIAS DA SADE
LABORATRIO DE FISIOLOGIA TRANSLACIONAL
AVALIAO DOS EFEITOS DO TRATAMENTO COM SILDENAFIL SOBRE
CLULAS DE MEDULA SSEA DE CAMUNDONGOS
HIPERCOLESTEROLMICOS
FRANCIANE PEREIRA BERNARDES
Vitria-ES
2015
FRANCIANE PEREIRA BERNARDES
AVALIAO DOS EFEITOS DO TRATAMENTO COM SILDENAFIL SOBRE
CLULAS DE MEDULA SSEA DE CAMUNDONGOS
HIPERCOLESTEROLMICOS
Orientadora: Profa. Dra. Silvana dos Santos
Meyrelles
Universidade Federal do Esprito Santo Vitria-ES, Dezembro de 2015.
Dissertao apresentada ao Programa de
Ps-Graduao em Cincias
Fisiolgicas da Universidade Federal do
Esprito Santo como requisito parcial
para obteno do ttulo de Mestre
em Cincias Fisiolgicas.
FRANCIANE PEREIRA BERNARDES
Bernardes, Franciane Pereira.
Avaliao dos efeitos do tratamento com Sildenafil sobre clulas de
medula ssea de camundongos hipercolesterolmicos / Franciane Pereira
Bernardes. 2015.
89 f.
Orientador: Profa. Dra. Silvana dos Santos Meyrelles.
Dissertao (mestrado) Universidade Federal do Esprito Santo,
Programa de Ps-Graduao em Cincias Fisiolgicas.
1. Hipercolesterolemia. 2. Sildenafil. I. Meyrelles, Silvana dos Santos.
II. Universidade Federal do Esprito Santo. Centro de Cincias da Sade.
III. Avaliao dos efeitos do tratamento com Sildenafil sobre clulas de
medula ssea de camundongos hipercolesterolmicos.
FRANCIANE PEREIRA BERNARDES
AVALIAO DOS EFEITOS DO TRATAMENTO COM SILDENAFIL SOBRE
CLULAS DE MEDULA SSEA DE CAMUNDONGOS
HIPERCOLESTEROLMICOS
Aprovada em ____ de Dezembro de 2015.
COMISSO EXAMINADORA
___________________________________
Profa. Dra. Silvana dos Santos Meyrelles.
Universidade Federal do Esprito Santo
Orientadora
___________________________________
Avaliador Interno
___________________________________
Avaliador Externo
Dissertao apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Cincias Fisiolgicas da Universidade Federal do Esprito Santo como requisito parcial para obteno do ttulo de Mestre em Cincias Fisiolgicas.
Dedico a minha amada irm Elaine, minha me Marineth e ao
amor da minha vida, Diego Izoton.
AGRADECIMENTOS
Agradeo a todos que de alguma forma contriburam para a concretizao
deste sonho.
Agradeo professora Dra. Silvana dos Santos Meyrelles por ter aceitado me
orientar e auxiliar nesta importante etapa da minha formao, por sua pacincia
e seu tempo dedicados realizao deste projeto.
Ao professor Dr. Elisardo Corral Vasquez por sua contribuio, seu auxlio e
tempo disponibilizado durante o desenvolvimento do projeto.
professora Dra. Maria do Carmo Pimentel Batitucci por sua contribuio, sua
disponibilidade e atenciosidade no desenvolvimento dos protocolos do
microncleo, sua equipe de pesquisa por ter me recebido com muito carinho
e atenciosidade.
prof. Dr. Bianca Prandi Campagnaro por contribuir para o desenvolvimento
e a concretizao deste projeto e tambm para o meu aprendizado.
Ao prof. Dr. Breno Valentin Nogueira por sua disponibilidade e ateno e sua
equipe de pesquisa por terem me recebido muito bem.
Aos professores do Programa de Ps-Graduao em Cincias Fisiolgicas
(PPGCF) da UFES, especialmente profa. Dra. Ivanita Stefanon, aos prof. Dr.
Leonardo dos Santos e Dr. Marcelo Baldo por suas aulas maravilhosas. Com
elas a Fisiologia Cardiovascular ficou mais linda e interessante.
Aos amigos do PPGCF pela parceria, integrao e pelas brincadeiras de muito
bom gosto, em especial Girlndia Brasil ( uma simpatia!), ao Fabrcio
Bragana (oh pessoa agradvel, como pode!) e Cleciane (vamos subir o
conceito do programa! kkk), vocs so maravilhosos!
Obrigada aos professores Dr. Jones Bernardes Gracelli e Dr. Elisardo Corral
Vasquez por terem aceitado avaliar minha aula de qualificao. Todas as
sugestes foram de extrema importncia e certamente iro contribuir para o
curso de doutorado e para toda minha vida no h limite para pesquisar e
questionar.
Aos amigos do Laboratrio de Fisiologia Translacional (LFT) pelo apoio,
companheirismo, parceria e amizade. Las, Brunella, Jamila, Rossana, Camila,
Markin, Flavia, Thansia, Ananda, Brenna, Viviane, Isabela, Victor, Vincios,
Joo Victor, Eduardo; verdadeiramente vocs so maravilhosos! O carinho
ser eterno e as amizades sero mantidas. Foi um prazer trabalhar com vocs.
Alan, obrigada por tudo, suas explicaes e sua pacincia. Foi muito bom fazer
parte da dupla Chris & Grag.
Ao meu amigo Jean Carlos Vencioneck Dutra, o meu muitssimo obrigada.
Voc excedeu as expectativas do que se pode esperar de um amigo, com sua
boa vontade e disponibilidade de sempre ajudar e se preocupar junto, e
resolver junto. Voc espetacular, dogo.
Aos amigos da turma BioUfes 2008/2 que continuaram a participar dos bons e
no to bons momentos da UFES: Clber Covre, Main Mantovanelli, Sarah
Cantarino, Vincius Santi e Lorena Xavier. Vocs me fazem muito bem!
minha amada irm Elaine Bernardes pela pacincia e compreenso com a
minha ausncia, especialmente neste ltimo ano.
Ao meu namorado Diego Izoton, por seu amor, apoio, carinho e
companheirismo.
RESUMO
A hipercolesterolemia, alm de ser um dos principais fatores que levam ao
desenvolvimento da aterosclerose, provoca danos oxidativos e genotxicos em
clulas de medula ssea. O Sildenafil tem sido utilizado com sucesso em
pesquisas cardiovasculares e, no caso da aterosclerose, demonstra efeitos
positivos na diminuio do estresse oxidativo e de marcadores de danos
genotxicos em modelos experimentais de aterosclerose (camundongo
knockout para a apolipoproteina E - apoE-/-). Neste trabalho foi testada a
hiptese de que o tratamento com Sildenafil seria capaz de melhorar possveis
danos que a hipercolesterolemia comprovadamente causa nas clulas de
medula ssea de camundongos apoE-/-. Foram utilizados camundongos
machos com 03 meses de idade divididos em trs grupos: controle C57BL/6
(C57), veculo (apoE-/- V) e tratado (apoE-/- S) os quais foram submetidos ao
tratamento com Sildenafil 40mg/Kg/Dia ou Veculo por trs semanas. Durante o
perodo de tratamento foram feitas coletas de sangue perifrico e no ltimo dia
de tratamento as clulas de medula ssea dos fmures e tbias foram isoladas
e submetidas a protocolos de citometria de fluxo, dosagem de colesterol
plasmtico e teste do microncleo. O estresse oxidativo foi avaliado por meio
da determinao dos nveis das Espcies Reativas de Oxignio (EROs) nion
superxido (O2-) e perxido de hidrognio (H2O2) nos ensaios de citometria de
fluxo DHE e DCF, respectivamente. Foram adquiridas informaes acerca das
fases do ciclo celular das clulas de medula ssea por meio de marcao com
Iodeto de Propdeo (PI) e a estimativa de danos genotxicos e citotxicos foi
feita por meio do teste do microncleo de medula ssea e de sangue. Os
dados obtidos foram submetidos Anlise de Varincia (ANOVA) de uma via
seguida do post hoc de Fisher ou, quando cabvel, ao teste t de student para
amostras independentes e os resultados esto expressos como mdia EPM e
considerados estatisticamente significativos quando *p < 0,05. Os dados
relativos s EROs indicam que animais apoE-/- V apresentam maiores nveis de
nion superxido quando comparados ao grupo controle (C57) e ao grupo que
recebeu Sildenafil (apoE-/- V: 2217,6361,0* versus C57: 1128,228,0 versus
apoE-/- S: 1125,7190,8#). Os nveis de H2O2 tambm se apresentaram
aumentados no grupo apoE-/- V, com valores de 2847,0191,0* versus C57:
2181,0107,7 versus apoE-/- S: 2107,080,60#. Quanto s caractersticas do
ciclo celular, os valores obtidos apontaram para uma maior fragmentao de
DNA nos animais do grupo veculo com relao ao controle e ao tratado (apoE-
/- V: 2,140,12* versus C57: 1,590,10 versus apoE-/- S 1,310,11#). Tambm
constatou-se no grupo veculo uma maior proporo de clulas de medula
ssea no momento G0/G1 (apoE-/- V: 75,450,70* versus C57: 68,600,53
versus apoE-/- S: 67,751,60#). Alm disso, os dados de microncleo sugerem
que os animais hipercolesterolmicos que no receberam tratamento com
Sildenafil apresentam danos genotxicos expressivos na medula (apoE-/- V:
6,40,35* versus C57: 3,50,27 versus apoE-/- S: 5,00,41#) e no sangue
(apoE-/- V: 7,60,80* versus C57: 4,00,37 versus apoE-/- S: 3,950,40#) em
comparao ao grupo tratado com Sildenafil. Em conjunto, os resultados
indicam que o tratamento com Sildenafil em camundongos
hipercolesterolmicos foi capaz de produzir efeitos benficos no ambiente
medular demonstrados pela menor produo de EROs, menor quantidade de
DNA fragmentado e menor quantidade de clulas micronucleadas na medula
ssea e no sangue perifrico.
Palavras-chave: hipercolesterolemia, EROS, dano genotxico, Sildenafil.
ABSTRACT
Hypercholesterolemia, besides being a major factor leading to the development
of atherosclerosis, causes oxidative and genotoxic damage in bone marrow
cells. Sildenafil has been used successfully in cardiovascular research and in
the case of atherosclerosis, shows positive effects in the reduction of oxidative
stress and the genotoxic damage markers of atherosclerosis in experimental
models (Knockout mouse apolipoprotein E - apoE-/-). In this study we tested the
hypothesis that treatment with sildenafil would be able to improve the damage
caused by the hypercholesterolemia on the bone marrow cells from apoE-/-
mice. Male mice were used at 03 months of age divided into three groups:
C57BL/ 6 control (C57), vehicle (apoE-/- V) and treated (apoE-/- S) which were
subjected to treatment with Sildenafil 40 mg/kg/Day or vehicle for three weeks.
During the treatment period, peripheral blood samples were taken and on the
last day of treatment the bone marrow cells from the femurs and tibias were
isolated and subjected to flow cytometry protocols, dosage and serum
cholesterol micronucleus test. Oxidative stress was evaluated by determining
the levels of Reactive Oxygen Species (ROS) superoxide anion (O2-) and
hydrogen peroxide (H2O2) on cytometry flow assays DHE and DCF,
respectively. Information has been obtained on the cell cycle phases of bone
marrow cells by staining with propidium iodide (PI) and the estimation of
genotoxic and cytotoxic damage was done through the micronucleus test of
bone marrow and blood. Statistical analysis was performed using the one-way
analysis of variance (ANOVA). When the ANOVA showed significant
differences, the Fishers test was performed as a post hoc analysis. When
appropriate, the Student t test for independent samples was performed. The
results are expressed as mean SEM and the differences between means
were considered statistically significant p < 0.05. Data on ROS indicate that
apoE-/- V animals had higher levels of superoxide anion compared with the
control group (C57) and the group receiving Sildenafil (apoE-/- V: 2217.6361.0*
versus C57: 1128.228.0 versus apoE-/- S: 1125.7190.8#). Hydrogen peroxide
levels also had increased in the group apoE-/- V with values about
2847.0191.0* versus C57: 2181.0107.7 versus apoE-/- S: 2107.080.60#.
Regarding the characteristics of the cell cycle, the values obtained indicate a
greater DNA fragmentation in the animals of vehicle group compared to the
control and treated (apoE-/- V: 2.140.12* versus C57: 1.590.10 versus apoE-/-
S 1.310.11#). It was also observed in the vehicle group had a greater
proportion of bone marrow cells when G0/G1 (apoE-/- V: 75.450.70* versus
C57: 68.600.53 versus apoE-/- S: 67.751.60#). Furthermore, the micronucleus
data suggest that hypercholesterolemic animals receiving vehicle have
significant genotoxic damage in the bone marrow (apoE-/- V: 6.40.35* versus
C57: 3.50.27 versus apoE-/- S: 5.00.41#) and blood (apoE-/- V: 7.60.80*
versus C57: 4.00.37 versus apoE-/- S: 3.950.40#) compared to the group
treated with Sildenafil. Together, these results indicate that treatment with
sildenafil in hypercholesterolemic mice was able to produce beneficial effects on
the bone marrow environment demonstrated by a lower production of ROS,
smaller amount of fragmented DNA and least amount of micronucleated cells in
the bone marrow and peripheral blood.
Keywords: hypercholesterolemia, ROS, genotoxic damage, Sildenafil.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Processos biolgicos e molculas presentes na placa
aterosclertica. ................................................................................................. 20
Figura 2 Viso geral das principais fontes endgenas de EROs. .................. 24
Figura 3 Estrutura da medula ssea e microambiente hematopoitico. ........ 26
Figura 4 Vias de diviso celular das clulas-tronco adultas. ......................... 27
Figura 5 Dot plot tpico de clulas totais de medula ssea........................... 41
Figura 6 Histograma tpico representativo do ciclo celular obtido aps
marcao com PI. ............................................................................................ 43
Figura 7 - Histograma tpico de intensidade de fluorescncia emitida por DHE
......................................................................................................................... 52
Figura 8 Histograma tpico de intensidade de fluorescncia emitida por DCF.
......................................................................................................................... 53
Figura 9 Histogramas tpicos do ciclo celular obtidos pela marcao com PI
em clulas de medula ssea nos diferentes grupos de estudo. ....................... 56
Figura 10 Microscopia ptica de EPC, ENC e EPC MN. .............................. 60
Figura 11 Microscopia ptica de ENC de sangue perifrico .......................... 63
LISTA DE GRFICOS
Grfico 1 Proporo de bitos por doena isqumica do corao. ............... 19
Grfico 2 Proporo de bitos por doena cerebrovascular......................... 19
Grfico 3 Nveis de Colesterol Plasmtico Total .......................................... 49
Grfico 4 Nveis de Triglicerdeos Plasmticos ............................................ 49
Grfico 5 Nmero de clulas contadas na Cmara de Neubauer ............... 50
Grfico 6 Dot plot das populaes de clulas de medula ssea. ................. 51
Grfico 7 Nveis de O2- em clulas de medula ssea ................................. 53
Grfico 8 Nveis de H2O2 em clulas de medula ssea.................................54
Grfico 9 Quantidade de clulas na fase Sub-G0..........................................57
Grfico 10 Quantidade de clulas na fase G0/G1 ......................................... 58
Grfico 11 Percentual de Clulas na fase S do ciclo celular ........................ 59
Grfico 12 Percentual de Clulas na fase G2/M do ciclo celular .................. 59
Grfico 13 Frequncia de EPC MN .............................................................. 61
Grfico 14 Relao de EPC/(EPC+ENC) ..................................................... 62
Grfico 15 Quantidade de ENC MN de sangue perifrico no incio do
tratamento/veculo (T0). ................................................................................... 64
Grfico 16 Quantidade de ENC MN de sangue perifrico aps 21 dias de
tratamento (TF) ................................................................................................ 64
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Dados do Colesterol Total e Triglicerdeos plasmticos ................................ 49
Tabela 2 - Frequncia de EPC MN e Relao de EPC/(EPC+ENC)............................... 61
Tabela 3 - Frequncia de ENC MN nos momentos T0 e TF ............................................. 64
LISTA DE SIGLAS E ABREVIAES
ANOVA: anlise de varincia
apoE: apolipoprotena E
apoE-/-: Camundongo nocauteado para a apoE
CAT: catalase
DHE: Diidroetdeo
DCF: Diclorofluorescena
DCV: Doena cardiovascular
EPC: Eritrcito policromtico
EPM: Erro Padro da Mdia
ENC: Eritcito normocromtico
EROs: Espcies Reativas de Oxignio
GMPc: Monofosfato cclico de guanosina
GPx: glutationa peroxidase
ICAM: Molcula de adeso intercelular
IL: interleucina
MIF: Mediana de Intensidade de Fluorescncia
MN: microncleo
PDE: fosfodiesterase
SOD: superxido dismutase
VCAM: Molcula de adeso de clula vascular
SUMRIO
1 INTRODUO .................................................................................................................. 18
1.1 Dados relevantes sobre a epidemiologia das Doenas Cardiovasculares ........... 18
1.2 Aterosclerose ............................................................................................................ 19
1.2.1 Aterosclerose Experimental ............................................................................ 21
1.3 Espcies Reativas de Oxignio .................................................................................. 23
1.4 Importncia da Medula ssea .......................................................................................... 25
1.5 Sildenafil .......................................................................................................................... 28
2 HIPTESE e JUSTIFICATIVA ...................................................................................... 33
3 OBJETIVOS ...................................................................................................................... 35
3.1 Objetivo Geral ................................................................................................................. 35
3.2 Objetivos Especficos .................................................................................................... 35
4 MATERIAIS E MTODOS .............................................................................................. 37
4.1 Animais Experimentais ............................................................................................ 37
4.2 Coleta e Isolamento das clulas de medula ssea ............................................. 38
4.3 Quantificao e Estimativa de Viabilidade Celular .............................................. 39
4.4 Ensaios realizados por citometria de fluxo ................................................................ 40
4.4.1 Determinao dos Nveis de Espcies Reativas de Oxignio (EROs) .......... 41
4.4.2 Anlise do Ciclo Celular das clulas de medula ssea .................................... 42
4.5 Determinao dos Nveis de Colesterol Plasmtico e Triglicerdeos ............... 43
4.6 Teste do Microncleo ................................................................................................... 44
4.7 Anlise Estatstica .................................................................................................... 46
5 RESULTADOS ................................................................................................................. 49
5.1 Colesterol Plasmtico e Triglicerdeos ....................................................................... 49
5.2 Quantificao e Viabilidade Celular ............................................................................ 50
5.3 Dados obtidos por citometria de fluxo ........................................................................ 51
5.3.1 Perfil das populaes de clulas de medula ssea .......................................... 51
5.3.2 Nveis de EROs...................................................................................................... 52
5.3.3 Anlise das fases do ciclo celular ........................................................................ 55
5.4 Estimativa de Dano no material gentico - Teste do Microncleo ......................... 59
5.4.1 Microncleo na Medula ssea .............................................................................. 59
5.4.2 Microncleo no sangue .......................................................................................... 62
6 DISCUSSO ......................................................................................................................... 66
6.1 Colesterol Plasmtico e Triglicerdeos ....................................................................... 66
6.2 Nveis de EROs ............................................................................................................. 67
6.3 Anlise das fases do ciclo celular ............................................................................... 69
6.4 Estimativa de Dano no material gentico - Teste do Microncleo ......................... 71
7 CONCLUSO ........................................................................................................................ 72
8 Limitaes do Estudo ........................................................................................................ 73
Introduo
18
1 INTRODUO
1.1 Dados relevantes sobre a epidemiologia das Doenas
Cardiovasculares
De acordo com a Organizao Mundial da Sade (OMS) as Doenas
Cardiovasculares s) ainda so a principal causa de morte em todo o mundo. As
DCVs so aquelas que afetam o corao e os vasos sanguneos e incluem,
por exemplo, o infarto, o acidente vascular cerebral (AVC), a aterosclerose, e
tambm arritmias cardacas, isquemias ou anginas. Segundo relatrio da OMS
do ano 2012, a doena isqumica, o AVC, a doena pulmonar obstrutiva
crnica e as infeces do trato respiratrio inferior foram as quatro
enfermidades que mais fizeram vtimas em ambos os sexos. No Brasil, as
DCVs so responsveis por cerca de 30% das mortes registradas no Pas ao
ano, das quais, mais de 308 mil ocorreram por infarto e acidente vascular
cerebral (AVC).
Estes altos nmeros colocam o Brasil entre os dez pases com maior ndice de
mortes por doenas cardiovasculares. Estudos do Instituo Dante Pazzanese de
Cardiologia (So Paulo) mostraram que 60% das vtimas so homens, com
idade mdia de 56 anos. No Esprito Santo as doenas do aparelho circulatrio
representam a primeira causa de bito para ambos os sexos, principalmente a
partir dos 50 anos de idade, prevalecendo os bitos por doena isqumica do
corao e doena cerebrovascular (Grficos 1 e 2) (PORTAL BRASIL, 2011;
WHO, 2012; SESA, 2012).
Grficos 1 e 2 - Proporo de bitos por doena isqumica do corao e doena cerebrovascular na populao adulta. Esprito Santo, 2010.
DOENA ISQUMICA DO CORAO DOENA CEREBROVASCULAR
Fonte: SIM/SESA (2012).
19
Dentre as DCVs, a doena isqumica do corao, o AVC e a hipertenso
arterial so bastante estudadas devido ao seu alto ndice de morbi-mortalidade
e por se desenvolverem em decorrncia da aterosclerose (WHO, 2014). Ainda
que avanos teraputicos na rea cardiovascular sejam frequentes, estima-se
que essa forte repercusso sobre o padro de morbi-mortalidade tende a
persistir devido, principalmente, ao aumento da populao idosa e da
expectativa de vida associados ao sedentarismo e a dietas hiperglicdicas e/ou
hiperlipdicas, que contribuem para consolidar esses dados epidemiolgicos
(BARRETO et al., 2003; V DIRETRIZ BRASILEIRA DE DISLIPIDEMIAS E
PREVENO DA ATEROSCLEROSE, 2013).
1.2 Aterosclerose
A aterosclerose uma DCV inflamatria crnica de origem multifatorial
caracterizada pela formao de placas de constituio fibrosa e lipdica
(ateroma) que diminuem progressivamente o dimetro dos vasos sanguneos
(BERLINER et al., 1995).
A Aterosclerose desenvolve-se em resposta agresso endotelial,
acometendo principalmente a camada ntima de artrias de mdio e grande
calibre, o que pode levar isquemia vascular. Cada tecido ou rgo responde
inflamao de forma dependente de suas caractersticas celulares prprias e
da arquitetura do tecido lesado, bem como do suprimento sanguneo e da
natureza dos agentes agressores. Entretanto, ainda que a resposta leso
seja caracterstica em cada local afetado, a resposta celular e a biologia
vascular da aterosclerose so similares nos diversos tecidos e rgos, e
sugerem inmeros processos moleculares como, por exemplo, ativao de
molculas de adeso, acmulo e ativao de clulas brancas do sangue,
peroxidao lipdica, apoptose, alteraes em clulas musculares lisas,
linfcitos e moncitos (Figura 1) (ROSS, 1999; LIBBY; DICARLI;
WEISSLEDER, 2010).
20
Figura 1 Processos biolgicos e molculas presentes na placa aterosclertica.
Nota: As partculas de LDL oxidadas so fagocitadas pelos macrfagos originando as clulas espumosas. Concomitantemente maior expresso de molculas de adeso celular, a produo de Espcies Reativas de Oxignio (EROs) pelos macrfagos e clulas musculares lisas aumentada no interior da placa. Fonte: Libby, Dicarli e Weissleder (2010). Adaptado.
Vrios fatores de risco podem resultar no processo aterosclertico, como, por
exemplo, hereditariedade, hipertenso arterial, dislipidemia, diabetes,
obesidade, idade, tabagismo e sedentarismo (GRUNDY et al., 1999). Esses
fatores so capazes de lesar o endotlio vascular causando disfuno
endotelial e, assim, a camada ntima fica mais permevel s lipoprotenas que
ficam retidas no espao subendotelial (PAOLETTI; GOTTO JUNIOR; HAJJAR,
2004).
As lipoprotenas so responsveis pelo transporte e pela distribuio dos
lipdeos atravs do plasma e podem ser classificadas em: lipoprotena de baixa
densidade (LDL), lipoprotena de alta densidade (HDL), ambas ricas em
colesterol, lipoprotena de densidade intermediria (IDL), lipoprotena de muito
baixa densidade (VLDL), de origem heptica e quilomcrons (QM), de origem
intestinal, sendo essas duas ltimas classes muito ricas em Triglicerdeos. O
21
componente proteico das lipoprotenas chamado apolipoprotena (apo), as
quais possuem diversas funes no metabolismo das lipoprotenas, como a
formao intracelular de partculas lipoproteicas (apo B100 e apo B48),
cofatores enzimticos (apo CII, CIII e apo AI) e ligantes a receptores de
membrana, como o caso das apo B100 e apoE. (NOVAK; BYDLOWSKI,
1996; JAWIN; NASTALEK; KORBUT, 2004).
A dislipidemia (isto , LDL-colesterol elevado e HDL-colesterol diminudo) um
evento que marca o incio da formao da placa aterosclertica (processo de
aterognese), pois, os altos nveis de colesterol (hipercolesterolemia)
aumentam a possibilidade de passagem das LDL para o espao subendotelial.
Dessa forma, aps o dano endotelial e o aprisionamento do LDL, este sofre
oxidao e torna-se imunognico causando, assim, a liberao de fatores
inflamatrios. Comea ento haver aumento da expresso de molculas
glicoproteicas de adeso celular (VCAM-1) e intercelular (ICAM-1), e de
protenas quimioatrativas de moncitos sintetizadas na superfcie endotelial,
que resulta no recrutamento de moncitos que so atrados para o local da
placa. Logo que os moncitos so recrutados pelas molculas de adeso, as
clulas T tambm so estimuladas a entrarem no local da leso e assim,
tambm participam da formao da leso aterosclertica (HANSSON et al.,
2002). Uma vez na camada ntima, os moncitos so transformados em
macrfagos que possuem receptores especiais chamados scavengers que
fagocitam as molculas de LDL oxidado. A estrutura formada por macrfagos
com LDL oxidado chamada de clula espumosa e esta componente das
estrias gordurosas, as quais caracterizam a leso inicial da aterosclerose
(LIBBY; RIDKER; MASERI, 2002; PAOLETTI; GOTTO JR; HAJJAR, 2004; V
DIRETRIZ BRASILEIRA DE DISLIPIDEMIAS E PREVENO DA
ATEROSCLEROSE, 2013).
1.2.1 Aterosclerose Experimental
Diversas espcies animais tm sido utilizadas no estudo da patognese e do
tratamento das leses da aterosclerose. O camundongo representa o grupo de
vertebrados geneticamente modificados mais utilizados em pesquisas
22
cientficas de diversas doenas e, no caso das doenas cardiovasculares,
mesmo sendo eles, geralmente, resistentes aterosclerose, a linhagem
C57BL/6 uma exceo regra e vem sendo trabalhada em vrias frentes de
pesquisas cardiovasculares (JAWIN; NASTALEK; KORBUT, 2004;
CHORILLI; MICHELIN; SALGADO, 2007).
O camundongo membro da classe Mammalia, ordem Rodentia, famlia
Muridae, gnero Mus, espcie Mus musculus. Uma grande vantagem do
modelo murino, alm de ser relativamente de fcil aquisio e manuteno,
que no camundongo possvel silenciar ou substituir genes de interesse. Na
pesquisa sobre a aterosclerose, isso foi realizado concomitantemente por duas
equipes de pesquisa, as quais apresentaram o camundongo knockout para
apolipoprotena E (apoE-KO/apoE-/-) que possui fundo gentico C57BL/6J e foi
desenvolvido para representar um modelo de estudo da aterosclerose
(PIEDRAHITA et al., 1992; PLUMP et al., 1992; NEVES et al., 2013).
A apoE uma glicoprotena de aproximadamente 34 kD sintetizada
primariamente no fgado, mas que tambm pode ser produzida no crebro,
corao, bao, nos rins, ovrios, testculos, pulmes e ainda na pele e em
macrfagos (DRISCOL; GETZ, 1984; ELSHOURBAGY et al., 1985; LIN et al.,
1986; NAKAI et al., 1996; MAHLEY; RALL JUNIOR, 2000). A apoE integrante
da membrana das lipoprotenas e localiza-se preferencialmente nas VLDL, IDL
e HDL, respectivamente, mas pode tambm ser encontrada no plasma. A
apoE est envolvida na redistribuio de triglicerdeos e colesterol em
diferentes tecidos; ela funciona como um ligante de alta afinidade para os
receptores apoB e apoE (receptores de LDL) e receptor de remanescentes de
quilomcrons e tem a funo de retirar do plasma as VLDL e IDL via receptor
de LDL. Logo, deficincias da apoE causam inmeras doenas envolvidas com
o aumento nos nveis de colesterol e triglicerdeos na circulao, devido ao
no-reconhecimento dessas molculas pelos receptores de membrana dos
quilomcrons e pelas molculas de VLDL, responsveis por sua captao no
fgado (OJOPI; BERTONCINI; DIAS NETO, 2004).
O camundongo apoE-/- considerado um dos modelos de aterosclerose mais
relevantes por apresentar colesterol plasmtico com valores superiores a
500mg/dl, a maioria de VLDL, IDL e LDL; assim ele possui nveis
23
colesterolmicos cerca de 5-6 vezes maior que os camundongos controles
C57BL/6J e desenvolve hipercolesterolemia e leses arteriais de forma
espontnea, sem necessidade de dieta rica em colesterol (PIEDRAHITA et al.,
1992; PLUMP et al., 1992; VASQUEZ et al., 2012).
1.3 Espcies Reativas de Oxignio
Em situaes fisiolgicas, a utilizao de oxignio (O2) molecular para a
gerao de energia via cadeia respiratria mitocondrial produz, ao final do
processo, adenosina trifosfato (ATP) e espcies qumicas altamente reativas
conhecidas como Espcies Reativas de Oxignio (EROs), as quais atuam
como agentes oxidantes no meio celular (TURRENS, 2003; SAMPAIO;
MORAES, 2010). So exemplos de EROs: nion superxido (O2-), radical
hidroxila (OH), perxido de hidrognio (H2O2), alm das espcies reativas de
nitrognio (xido ntrico (NO) e peroxinitrito (ONOO-)) as quais tambm so
consideradas como EROs por muitos pesquisadores e ainda o cido
hipocloroso e o oxignio singlete (HALLIWELL, 2006; MURPHY et al., 2011).
As EROs podem ser formadas por causas endgenas, a partir do metabolismo
normal da mitocndria e tambm por enzimas como, por exemplo, NADPH
oxidase, Xantina oxidase, Lipoxigenase, Cicloxigenase, Citocromo P450
(COOPER et al., 2002) e ainda podem ser produzidas durante processos
patolgicos como, por exemplo, o que ocorre na resposta inflamatria (BERRA;
MENCK, 2006).
Alm das causas endgenas as EROs podem ser formadas a partir do
estmulo de fatores externos como poluentes, agentes qumicos, radiaes
ultravioleta, herbicida, metais pesados (BERRA; MENCK, 2006; XU et al.,
2011).
Vrios estudos realizados nos ltimos anos tm demonstrado que as EROs
participam ativamente em diversos processos biolgicos, incluindo o
crescimento normal da clula, a diferenciao celular, apoptose e senescncia
celular (FINKEL, 2003). Segundo Ribeiro e outros (2005), as EROs podem ser
consideradas molculas com funes de mensageiros secundrios, atuando
24
em vias de regulao de expresso de genes sensveis aos sinais redox e de
alteraes da homeostase celular, atravs da sntese de molculas
fisiologicamente ativas.
Normalmente a produo de EROs contrabalanceada por vias enzimticas
como, por exemplo: superxido dismutase (SOD), glutationa peroxidase (GPx),
catalase (CAT) e por vias no enzimticas como as vitaminas A, C e E
(RAHMAN, 2007; NAKA et al., 2008). Entretanto, quando o organismo excede
a capacidade protetora antioxidante, ocorre o estresse oxidativo (STOCKER;
KEANEY, 2004). Com o estresse oxidativo, as EROs podem interagir com
vrios componentes celulares como cidos nucleicos, protenas e lipdeos e
causar danos moleculares e, conforme assinalado na Figura 2, esses efeitos
variam de acordo com a quantidade de EROS produzida, com a permanncia,
a fonte e localizao do estresse e o tipo de espcie formada (SCANDALIOS,
2005; URAO; USHIO-FUKAI, 2013). A primeira ERO produzida em quase todos
os casos relacionados com o estresse oxidativo o nion superxido (O2-)
(GALARIS et al., 2008).
Figura 2 Viso geral das principais fontes endgenas de EROs.
Legenda: SOD: Superxido Dismutase, GPx: Glutationa peroxidase, Trx-Prx: Thioredoxina-peroxiredoxina. Fonte: URAO e USHIO-FUKAI (2013). Adaptado.
25
Segundo Madamanchi e outros (2005), h evidncias de que clulas
endoteliais, clulas musculares lisas e macrfagos so fontes de EROs que
modificam fosfolipdeos e oxidam as LDL, alm de estarem envolvidas na
sinalizao vascular durante a formao da leso aterosclertica, na disfuno
endotelial, na proliferao celular e na apoptose. Alm disso, o estresse
oxidativo tem sido apontado como um importante fator para a iniciao e
progresso de muitas doenas vasculares incluindo hipertenso, aterosclerose
e acidentes vasculares (CAI; HARRISON, 2000; BRITO, 2007).
1.4 Importncia da Medula ssea
A medula ssea um rgo difuso, porm volumoso e muito ativo, encontrada
no canal medular dos ossos longos e nas cavidades dos ossos esponjosos. A
medula ssea pode ser do tipo vermelha, assim denominada devido
numerosa presena de eritrcitos em diversos estgios de maturao e do tipo
amarela, rica em clulas adiposas e que no produz clulas sanguneas.
Apesar de no recm-nascido toda a medula ssea ser vermelha, no adulto ela
transformada em medula ssea amarela, ficando a medula ssea vermelha
restrita ao osso esterno, s vrtebras, costelas, dploe dos ossos do crnio e
epfises do fmur e do mero (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2008; KRAUSE,
2008).
Desde a vida pr-natal, medida que a ossificao do esqueleto avana, a
medula ssea se torna cada vez mais importante como rgo hematopoitico,
ou seja, aquele que atua na produo das clulas do sangue, processo
denominado hematopoese (ou hemocitopoese). Na vida ps-natal, eritrcitos,
granulcitos, linfcitos, moncitos e plaquetas se originam a partir de clulas-
tronco da medula ssea vermelha; os linfcitos B se diferenciam na medula,
enquanto os linfcitos T provm de clulas que migram da medula para o timo
e ali se diferenciam (ROSS; ROMRELL, 1993; TRAVLOS, 2006).
A medula ssea vermelha constituda por clulas reticulares associadas
colgeno, vasos sanguneos, capilares sinusides (unidades especializadas de
vasos sanguneos) e por uma rede esponjosa de clulas hematopoiticas
26
(Figura 3); e a medula ativa contm principalmente clulas sanguneas em
desenvolvimento e megacaricitos, alm de macrfagos, mastcitos,
plasmcitos e alguns adipcitos. Diante de toda sua dinmica e complexidade,
a hematopoese depende do microambiente adequado e de fatores de
crescimento como, por exemplo, interleucinas e citocinas que regulam a
proliferao, diferenciao e a apoptose das clulas imaturas bem como a
atividade funcional das clulas maduras. Todas as clulas do corpo so
derivadas primariamente da medula ssea e tanto a medula como o timo so
chamados rgos linfoides primrios (TRAVLOS, 2006; JUNQUEIRA;
CARNEIRO, 2008).
Figura 3 Estrutura da medula ssea e microambiente hematopoitico.
Fonte: Travlos (2006). Modifidada.
Dessa forma, no microambiente medular possvel encontrar clulas-tronco
pluripotentes indiferenciadas, clulas-tronco progenitoras multipotentes, clulas
progenitoras comprometidas com uma nica linhagem celular, clulas
precursoras (geralmente constituem os diversos blastos representando a etapa
inicial de maturao das clulas) e tambm as clulas sanguneas em
diferentes momentos de maturao. As clulas-tronco progenitoras podem ser
do tipo mesenquimal (estromais) ou hematopoiticas (CTH). As clulas
progenitoras mesenquimais podem se diferenciar em adipcitos, osteoblastos,
condrcitos, mioblastos e em algumas clulas do tecido conjuntivo. As clulas
hematopoiticas geram a linhagem linfoide (linfcitos T e B) pelo processo de
linfocitopoese e a linhagem mielide (demais clulas sanguneas) pelos
27
processos de eritrocitopoese, leucocitopoese, plaquetocitopoese. Sendo que
moncitos, linfcitos e granulcitos so consideradas as trs principais
categorias de clulas brancas do sangue (ALBERTS et al., 2010; DOTSENKO,
2010).
As clulas-tronco indiferenciadas so capazes de auto-renovao e de se
diferenciar, sob certos estmulos, em pelo menos um tipo de clula madura
(especializada). Apesar de muitos rgos adultos como fgado, crebro, tecido
gorduroso, pele e intestino delgado manterem um reservatrio de clulas-
tronco indiferenciadas, a medula ssea considerada a principal fonte de
clulas-tronco adultas. Essas clulas-tronco adultas realizam uma diviso
assimtrica originando uma clula comprometida com a diferenciao e outra
que mantm as caractersticas primitivas da clula original, repondo o nmero
de clulas indiferenciadas; geralmente o ambiente medular determinante no
destino da clula produzida na diviso assimtrica (Figura 4). As clulas-tronco
adultas tornam possvel a regenerao de danos e a reposio de clulas
senescentes ao longo da vida (KAJI; LEIDEN, 2001; ARAUJO et al., 2009;
ALBERTS et al., 2010).
Figura 4 Vias de diviso celular das clulas-tronco adultas.
Nota: Representao esquemtica das possveis variveis de diviso celular assimtrica das clulas-tronco adultas Fonte: Alberts e outros (p. 1420, 2010). Adaptado.
28
Face ao exposto, a medula ssea vem sendo fortemente estudada sob seu
aspecto imprescindvel manuteno da vida dos organismos, tanto pela
formao das clulas sanguneas pelo processo de hamatopoiese como pela
auto-renovao e manuteno das clulas-tronco indiferenciadas inclusive nos
indivduos adultos, fornecendo possibilidades de transplantes e tratamentos de
diversas doenas. Suas caractersticas, sua funcionalidade e capacidade
plstica so investigadas em situaes fiolgicas e inmeras fisiopatolgicas
como, por exemplo, Cncer, Diabetes, Nefropatias, Cardiopatologias, Doenas
que atingem o sistema nervoso central etc (KAJI; LEIDEN, 2001; WEIMANN et
al., 2003; GUARITA-SOUZA et al., 2005; SAMBUCETI et al., 2009; PORTO et
al., 2011; LIMA et al., 2012; YANG et al., 2015; XIAO WANG et al., 2015).
De acordo com LIU, CAO e FINKEL (2011) o fato de as clulas-tronco adultas
serem fonte de inmeros tipos diferentes de clulas maduras e tambm de
persistirem por longos perodos de tempo sugere que essas clulas
multipotentes podem demandar de um mecanismo de proteo especfico
contra os efeitos das EROS a longo prazo e do dano oxidativo, sendo que,
uma adaptao a esse favor pode ser o metabolismo intrinseco das clulas-
tronco.
Segundo Wessely (2010) desbalanos na regulao da proliferao celular e
no equilbrio com a morte celular programada (isto , apoptose) desempenham
importante papel no contexto das doenas cardiovasculares; e para Soehnlein
e Swirski (2013) as vias envolvidas no metabolismo do colesterol controlam a
proliferao de clulas hematopoiticas e progenitoras.
J Tonini e outros (2013) relataram que clulas mononucleares de medula
ssea de camundongos hipercolesterolmicos apresentam aumento na
produo de espcies reativas de oxignio, danos ao DNA e apoptose.
1.5 Sildenafil
O Citrato de Sildenafil foi sintetizado por um grupo de qumicos farmacuticos
investigadores da Pfizer e, inicialmente, estudado na hipertenso e na angina
de peito, porm, os estudos clnicos iniciais demonstraram que o frmaco
apresentava pouco efeito na angina de peito e induzia ereo do pnis. Logo
29
que foi aprovado pela Food and Drug Administration (FDA) em 1998, o
Sildenafil (Viagra Pfizer, Nova York, EUA) passou a ser utilizado para o
tratamento da disfuno ertil (FINK et al., 2002; AVERSA et al., 2007;
SCHWARZ et al., 2007; AU et al., 2013)
A excitao sexual estimula vias neurais que resultam na liberao de xido
ntrico (NO) de nervos e de clulas endoteliais diretamente no pnis. O NO
penetra no citoplasma das clulas do msculo liso e se liga guanilil ciclase
solvel (GCs), essa interao estimula a GCs a produzir monofosfato de
guanosina cclico (GMPc) a partir de guanosina trifosfato (GTP). O GMPc,
segundo mensageiro responsvel por regular diversas respostas fisiolgicas,
ativa a protena kinase dependente de GMPc (PKG) que, por sua vez, ir atuar
na fosforilao de diversas protenas, resultando em uma diminuio dos nveis
intracelulares de clcio e, consequentemente, em relaxamento do msculo liso,
dilatao arterial e constrio venosa, rigidez e ereo peniana (ZUSMAN et
al., 1999; CORBIN, 2004).
O equilbrio da via NO/GMPc/relaxamento se d por meio da degradao do
GMPc, a qual feita por enzimas da famlia das fosfodiesterases (PDEs), que
compreendem uma gama de enzimas as quais inibem a atividade dos
segundos mensageiros nas clulas por hidrolisarem a ligao fosfodister do
GMPc e, dessa forma, modularem os nveis intracelulares de GMPc (RAJA;
NAYAK, 2004; SARAIVA, 2010).
A fosfodiesterase tipo 5 (PDE5) a principal responsvel pela hidrlise de
GMPc em diversos tipos de tecidos ou clulas e est presente em grande
concentrao no corao, crebro, pulmo, rins, msculo liso vascular
sistmico, corpo cavernoso do pnis, nas plaquetas e no msculo liso visceral
e pode ser considerada como um dos principais reguladores da resposta
muscular ativao da cascata NO/GMPc (SODERLING; BAYUGA; BEAVO,
1998; ESSAYAN, 1999; GLOSSMANN; PETRISCHOR; BARTSCH, 1999;
WALLIS et al., 1999; GIORDANO et al., 2001). Em 2007 Foresta e outros
demonstraram, por meio da reao em cadeia da polimerase (rtPCR) e
posterior sequenciamento, que o RNAm para PDE5 tambm expresso na
medula ssea humana.
30
Nesse cenrio, o Sildenafil aumenta a biodisponibilidade do GMPc e estimula a
via do xido ntrico (NO/GMPc) por meio da inibio da PDE5, promovendo
efeitos de vasodilatao e relaxamento (TERRETT et al., 1996).
Alm da Disfuno Ertil, o uso do Sildenafil vem sendo aplicado de forma
importante no tratamento da Hipertenso Arterial Pulmonar, Fenmeno de
Raynauds e tambm em diversas pesquisas sobre doenas cardiovasculares
(GUIMARES et al., 1999; ZHAO et al., 2001; KUKREJA et al., 2011; DONATO
et al., 2013).
O sildenafil tambm atua como vasodilatador, produzindo um balano
hemodinmico entre a diminuio da resistncia arterial e o aumento da
complacncia venosa (JACKSON et al., 1999). Segundo Chau e outros (2011)
o Sildenafil atenua a progresso da insuficincia cardaca quando administrado
trs dias aps o infarto do miocrdio.
Nos processos inflamatrios o Sildenafil desempenha funo anti-inflamatria
por meio da preveno e/ou diminuio de peroxidao lipdica, da formao
de oxidantes e da produo de citocinas e acmulo de neutrfilos (ISERI et al.,
2009; KARAKOYUN et al., 2011).
Diversos estudos apontam o Sildenafil como um fator antioxidante,
relacionando-o com a diminuio do estresse oxidativo (DUSSAULT et al.,
2009; GOKAKIN et al., 2013).
Em um experimento com camundongo hipercolesterolmico (modelo apoE-/-)
tratados com Sildenafil na dose de 40 mg/kg corporal/dia na gua de beber,
Dussault e outros (2009) anunciaram o aumento significativo do nmero de
clulas progenitoras endoteliais (EPCs) e tambm uma modulao positiva das
atividades funcionais dessas clulas como, por exemplo, o aumento da
capacidade de migrao. Nesse mesmo trabalho o autor tambm demonstrou
que o Sildenafil foi capaz de melhorar a neovascularizao induzida por
isquemia.
Recentemente, Balarini e outros (2013) demonstraram que o tratamento
crnico com Sildenafil no modelo experimental de aterosclerose, o
camundongo apoE-/- apresentou benefcios com relao biodisponibilidade
de xido ntrico e funo endotelial, proporcionando reduo da deposio
de placa aterosclertica por meio da diminuio do estresse oxidativo.
31
Alm disso, o tratamento por trs semanas com Sildenafil no modelo murino de
aterosclerose (apoE-/-) tambm foi eficaz na reduo de marcadores
genotxicos, evidenciado pela menor fragmentao de DNA em clulas
mononucleares do sangue e clulas do fgado dos animais tratados com
Sildenafil (RODRIGUES et al., 2013).
O tratamento crnico com Sildenafil em modelo apoE-/- tambm teve efeito
protetor contra a vasoconstrio via mecanismos de sinalizao da cascata
NO/GMPc, o que foi acompanhado pela reduo do estresse oxidativo e da
deposio lipdica (LEAL et al., 2015).
Sendo assim, o Sildenafil tem se mostrado uma escolha teraputica
promissora no tratamento de doenas cardiovasculares acompanhadas do
aumento de colesterol circulante.
Hiptese
33
2 HIPTESE e JUSTIFICATIVA
Dada a importncia das clulas-tronco na renovao e manuteno das
populaes de clulas de todo o corpo, inclusive daquelas que participam do
processo inflamatrio envolvido na aterosclerose e, levando em considerao
os avanos e as descobertas sobre a atuao do Sildenafil nas doenas
cardiovasculares e observando que a fosfodiesterase 5 tambm expressa
em clulas de medula ssea, a hiptese desse trabalho foi de que o Sildenafil
poderia amenizar ou at mesmo prevenir alguns dos efeitos da
hipercolesterolemia/aterosclerose refletidos nas clulas de medula ssea de
camundongos apoE knockout.
Objetivos
35
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
Avaliar os efeitos do tratamento crnico com sildenafil sobre as clulas de
medula ssea de camundongos apoE-/- machos.
3.2 Objetivos Especficos
Nas clulas de medula ssea de camundongos apoE-/- machos de 3 meses e
seus respectivos controles:
a. Avaliar a Viabilidade Celular
b. Verificar os nveis citoplasmticos de espcies reativas de oxignio
c. Avaliar as fases do ciclo celular e possvel fragmentao do DNA
d. Verificar se h dano no material gentico
Materiais e Mtodos
37
4 MATERIAIS E MTODOS
4.1 Animais Experimentais
Foram utilizados camundongos (Mus musculus) machos, com 03 meses de
idade, provenientes do biotrio do Laboratrio de Fisiologia Translacional
(LFT), pertencente ao Programa de Ps-Graduao em Cincias Fisiolgicas
do Centro de Cincias da Sade da Universidade Federal do Esprito Santo
(UFES). Os animais foram mantidos em gaiolas com at 5 animais em cada
gaiola, onde receberam gua e rao ad libitum e tiveram ciclo de 12 horas
claro/escuro controlado, bem como temperatura (222C) e umidade (70%) do
ambiente. A utilizao dos animais foi realizada de acordo com normas
estabelecidas pelo conselho nacional de controle de experimentao animal
CONCEA e pela Lei brasileira que regulamenta procedimentos para o uso
cientfico de animais (Lei Arouca) N 11.794 e aprovado pela Comisso de
tica em Pesquisa com Animais da UFES/CEUA-UFES (Protocolo 008/15).
Os animais foram aleatoriamente divididos em trs grupos: controle (C57BL/6;
n=8), veculo (ApoE-/- V; n=8) e tratado (ApoE-/- S; n=8).
Para o grupo que recebeu tratamento com Sildenafil (Viagra - Pfizer, SP,
Brasil) foi feita gavagem do medicamento, na dose de 40 mg/Kg/dia, durante 3
semanas, a partir da 9 semana de vida. Essa dose foi escolhida com base em
estudos prvios em animais e humanos, levando em considerao que a
biodisponibilidade do Sildenafil reduzida e sua eliminao mais rpida em
camundongos, comparado ao homem (WALKER et al., 1999).
Ao grupo controle (C57) e ao grupo veculo (apoE-/- V) foi feita gavagem com
gua destilada pelo mesmo perodo de 3 semanas, iniciando-se na 9 semana
de vida.
A linha do tempo abaixo esquematiza o perodo em que foram realizadas as
gavagens e coletas de sangue caudal nos trs grupos:
38
4.2 Coleta e Isolamento das clulas de medula ssea
Para o isolamento das clulas de medula ssea os animais foram anestesiados
com injeo intraperitoneal de tiopental sdico (0,15M) e submetidos
toracotomia para exposio do corao e demais rgos. Primeiramente foi
coletado cerca de 1mL de sangue do ventrculo direito (VD) para a dosagem de
colesterol plasmtico. Posteriormente foi feita inciso na regio acima do
acetbulo do membro inferior, permitindo a remoo de fmures e tbias que
imediatamente foram postos em meio de cultura DMEN (Dulbeccos Modified
Eagle Medium; GIBCO) onde foi feita a retirada do msculo e limpeza dos
ossos. Foi feito um corte rente s extremidades epifisrias do fmur e da tbia a
fim de expor o canal medular e, assim, foi possvel realizar o flush utilizando-se
uma agulha de 26 gauge e seringa com meio de cultura DMEM (GIBCO). Por
meio do flush obteve-se uma suspenso de medula ssea a qual foi
homogeneizada e centrifugada a 1200 rotaes por minuto (rpm) por 10
minutos (Eppendorf: Centrifuge 5702). O sobrenadante foi desprezado, as
clulas ressuspendidas em 2 mL de soluo de lise de hemcias 1x (BD Pharm
Lyse, Lysing Buffer, # 555899) e as amostras foram misturadas e deixadas 5
minutos a 37C; aps esse tempo, reao foram adicionados 4 mL PBS 1x e
centrifugado por 5 minutos a 1200 rpm. Aps essa centrifugao, o
sobrenadante foi aspirado cuidadosamente com a pipeta e descartado. Ao
pellet foi adicionado 2 mL de PBS 1x, homogeneizado e novamente
centrifugado a 1200 rpm por 5 minutos. Esse ltimo procedimento foi repetido e
uma alquota foi separada para a contagem de clulas na cmara de
Neubauer. As amostras de clulas de medula ssea eram mantidas na
geladeira (aproximadamente 4C) por, no mximo, duas horas at o momento
da realizao dos ensaios de citometria.
39
4.3 Quantificao e Estimativa de Viabilidade Celular
Para estimar o nmero obtido de clulas no isolamento da medula ssea, foi
estabelecida uma diluio de 40 vezes da amostra de clulas, de modo que
foram pipetados 10 l da suspenso de clulas isoladas e adicionados 90 l
de PBS 1x (GIBCO). Em seguida, uma alquota de 10 l desta soluo foi
pipetada e adicionada em outro microtubo contendo 10 l de soluo de Turck
(cido actico 2% com azul de metileno). A soluo de Turck realiza a lise das
hemcias e plaquetas contidas na amostra. Uma alquota de 10 l da soluo
Clulas/Turck foi novamente pipetada e adicionada em 10 l soluo de azul
de Trypan 0,4%. A soluo (clulas/Turck/Trypan) foi homogeneizada,
colocada na cmara de Neubauer e quantificada com auxlio do microscpio
ptico no aumento de 40X. As clulas foram contadas nos quatro quadrantes
externos da cmara seguindo sempre a mesma direo para que a mesma
clula no fosse contada duas vezes. O nmero de clulas da amostra foi
obtido pela equao: Q = 40 x 104 x 1 mL x (N clulas / 4).
Na qual:
Q significa a Quantidade de clulas
40 corresponde ao fator de diluio
104 indica o fator de correo da Cmara de Neubauer
1 mL o volume amostra.
N clulas o nmero total de clulas contadas na Cmara
O objetivo deste clculo verificar se as amostras de clulas de medula ssea
apresentavam pelo menos 106 clulas na suspenso, para que pudessem ser
utilizadas nos ensaios de citometria de fluxo. Os valores obtidos para as clulas
de medula ssea ficavam na faixa de 107 clulas/mL.
A estimativa da viabilidade das clulas de medula ssea foi realizada
simultaneamente pelo o mtodo de excluso do corante azul de Trypan durante
40
a contagem em cmara de Neubauer. O corante azul de Trypan auxilia na
estimativa de viabilidade celular da amostra a ser trabalhada, pois, por este
mtodo, as clulas mortas coram em azul, uma vez que sua membrana
permevel ao corante, j a membrana das clulas vivas no permevel e,
portanto, estas no coram. Desta forma, ao visualizar as clulas ao
microscpio observou-se que as clulas mortas apresentaram-se com uma
colorao azul escuro e as clulas vivas ficaram translcidas. Para calcular a
viabilidade celular, a mdia de clulas vivas foi dividida pela mdia total de
clulas (vivas e mortas) contadas na cmara de Neubauer e o valor obtido
multiplicado por 100, fornecendo um valor em porcentagem. As amostras eram
consideradas viveis quando o valor em porcentagem da viabilidade obtida na
contagem era superior a 90% e assim seguiam para os protocolos de
citometria.
4.4 Ensaios realizados por citometria de fluxo
A fim de determinar as espcies reativas de oxignio e analisar o Ciclo Celular
das clulas de Medula ssea, foi utilizado o citmetro de fluxo FACSCanto II
(Becton Dickson Immnunocytometry Systems, San Jose, CA, USA) acoplado a
um computador onde era possvel visualizar os histogramas e dot plots
diversos gerados na aquisio das amostras.
A anlise das clulas por meio do citmetro de fluxo feita com base em
informaes sobre as caractersticas celulares, como tamanho e
complexidade/granulosidade, as quais so fornecidas em forma de grficos de
Dot plots (grfico de pontos) e histograma. Alm disso, possvel determinar a
intensidade de fluorescncia emitida de acordo com cada sonda utilizada nos
diferentes ensaios como, por exemplo, DHE, DCF-DA, PI as quais emitem um
determinado comprimento de onda que lido e interpretado pelos filtros do
citmetro de fluxo.
Em todas as amostras adquiridas no citmetro, sempre era gerado um grfico
dot plot caracterstico do tipo celular que representa as populaes celulares
41
presentes na amostra e suas posies relativas no grfico (Figura 5) de acordo
com o tamanho (FSC) e a complexidade celular (SSC).
Figura 5 Dot plot tpico de clulas totais de medula ssea.
Para todos os ensaios de citometria de fluxo foram adquiridos 20.000 eventos
em cada amostra e os dados coletados foram analisados por meio dos
softwares BD FACS Diva e FCS Express 4 (De Novo Software, Los Angeles,
CA, USA).
4.4.1 Determinao dos Nveis de Espcies Reativas de Oxignio (EROs)
Os nveis de EROs foram medidos por citometria de fluxo atravs da
fluorescncia emitida por sondas especficas para cada ensaio.
Para a deteco do nion superxido (O2-) foi realizado o ensaio do
dihidroetdeo (DHE) da seguinte forma: as amostras foram lavadas e
ressuspendidas em 1 mL de PBS na concentrao de 1x106 clulas/ml.
Posteriormente foram incubados com soluo de DHE 1,25 mM por 30 minutos
a 37C e no escuro. Para o controle positivo foi utilizado 2 L de perxido de
hidrognio (H2O2) por 5 minutos; j o controle negativo foi constitudo de
amostra apenas com a suspenso celular.
42
A reao que ocorre nesse perodo de incubao a seguinte: o DHE entra
livremente na clula, reage com o nion superxido (O2-) e forma o etdeo;
este se liga ao DNA causando a amplificao da fluorescncia vermelha (518-
605nm). No Citmetro os sinais foram obtidos utilizando filtro de 585nm para
DHE.
Desta forma a oxidao do DHE proporcional quantidade de (O2-) presente
na clula e perceptvel por meio da intensidade de fluorescncia.
Para a determinao do perxido de hidrognio (H2O2) foi realizado o ensaio de
diclorofluorescena (DCF) da seguinte forma: as amostras foram lavadas e
ressuspendidas em 1 mL de PBS na concentrao de 1x106 clulas/ml.
Posteriormente foram incubadas com soluo de 20mM diacetato de
diclorodihidrofluorescena (H2DCFDA) por 30 minutos a 37C e no escuro. Para
o controle positivo foi utilizado 2 L de perxido de hidrognio (H2O2) por 5
minutos; j o controle negativo foi constitudo de amostra apenas com a
suspenso celular.
O H2DCFDA um ster no-fluorescente, internalizado pelas clulas e que se
incorpora s regies hidrofbicas. Dentro da clula o H2DCFDA perde o grupo
diacetato pela ao de esterases intracelulares, resultando na formao de
diclorodihidrofluorescena (DCFH), que pode ser oxidado pelo (H2O2) e formar
diclorofluorescena (DCF), composto altamente fluorescente. Assim, a oxidao
do DCFH-DA proporcional quantidade de (H2O2) presente na clula e
perceptvel por meio da intensidade de fluorescncia emitida. Os sinais foram
obtidos utilizando filtros de 530 nm para DCF.
4.4.2 Anlise do Ciclo Celular das clulas de medula ssea
O ciclo celular foi analisado por meio do ensaio com Iodeto de Propdeo (PI)
que um agente intercalante do DNA e, por essa caracterstica, a quantidade
de DNA intercalado diretamente proporcional fluorescncia emitida pela
sonda, que detectada no citmetro de fluxo pelo filtro de 585nm.
43
Para que o PI pudesse entrar na clula e se intercalar ao DNA, ele foi
preparado em soluo de trabalho contendo RNAse, Triton X-100 e Tris-Cl 3,4
mM (pH 7,6), a qual foi adicionada em 1 mL de amostra em PBS 1X e incubado
por 10 minutos a -20C.
Na aquisio dos dados pela citometria de fluxo aproximadamente 200 clulas
por segundo foram adquiridas para que fosse possvel determinar em qual fase
do ciclo celular cada clula se encontrava. As fases do ciclo celular foram
visveis em histograma de anlise de DNA disponvel no software FACS Diva,
com coordenadas PI versus quantidade de clulas (PI vs Count.); pelo
histograma (Figura 6) possvel identificar a proporo de clulas com DNA
fragmentado (regio Sub-G0), com DNA caracterstico de clula diploide
(regio G0/G1), com DNA em duplicao (regio S) e com DNA j duplicado
(regio G2/M). A porcentagem de clulas em cada fase do ciclo foi calculada
pelo software FCS Express 4.
Figura 6 Histograma tpico representativo do ciclo celular obtido aps marcao com PI.
4.5 Determinao dos Nveis de Colesterol Plasmtico e Triglicerdeos
A anlise de lipdeos plasmticos bem como a de Triglicerdeos foi feita com o
sangue coletado do ventrculo direito imediatamente antes da eutansia, sendo
o animal previamente anestesiado com Tiopental sdico (40mg/kg) ip. O
sangue em eppendorf heparinizado foi centrifugado por 10 minutos a 4000 rpm
44
para a separao do plasma. O colesterol e os triglicerdeos plasmticos foram
medidos com o uso de kits enzimticos comerciais (Bioclin, Brasil) e a
aquisio dos dados foi feita pela leitura das amostras em espectrofotmetro a
500 nm.
4.6 Teste do Microncleo
O teste do microncleo um protocolo padronizado por Von Ledebur e Schmid
em 1973 e vem sendo amplamente utilizado como mtodo de estimativa de
danos mutagnicos e citogenticos.
O microncleo (MN) um ncleo adicional e separado do ncleo principal de
uma clula, formado por cromossomos ou fragmentos de cromossomo que no
so includos no ncleo principal durante a mitose (Von Ledebur; Schmid,
1973). Geralmente os microncleos possuem dimenses de cerca de 1/3 a 1/5
do tamanho do ncleo principal, possuem membrana nuclear e material
cromatnico distribudo de forma similar ao do ncleo; so formados durante o
perodo de diviso celular em consequncia de quebras cromossmicas ou de
cromossomos inteiros que, por no se ligarem s fibras do fuso, no so
includos nos ncleos das clulas filhas (Schmid, 1975).
O ensaio do microncleo detecta alteraes cromossmicas/genmicas e de
dano ao aparato mittico, sendo os microncleos indicativos de perdas
irreversveis de DNA (VALADARES; CASTRO; CUNHA, 2007).
Os eventos que levam formao de MN podem ser induzidos pelo estresse
oxidativo, exposio a agentes clastognicos ou aneugnicos, defeitos
genticos nos checkpoints do ciclo celular e/ou nos genes de reparo do DNA e
tambm pela deficincia de nutrientes requeridos como co-fatores no
metabolismo do DNA e na maquinaria da segregao cromossmica
(BONASSI et al., 2007).
O teste de microncleo em medula ssea de roedores vem sendo amplamente
utilizado como teste citogentico vivo para estimar o potencial clastognico
(que provoca quebra cromossmica) e aneugnico (que induz aneuploidia ou
45
segregao cromossmica anormal) de novos frmacos (HAYASHI; SOFUNI;
ISHIDATE JR, 1984).
Na medula, os eritrcitos policromticos (EPC) so clulas que ainda esto em
estgio imaturo de desenvolvimento e quando sofrem maturao se
transformam em eritrcitos normocromticos (ENC) os quais so lanados na
corrente sangunea. Em um organismo considerado sadio, a proporo de
EPC:ENC de 1:1, significando que a produo desse tipo celular est em
equilbrio. Em situaes de dano celular/citotxico, a proporo de EPC
diminui, refletindo numa diminuio na relao EPC/ENC ou EPC/(EPC+ENC).
Por ainda apresentarem resqucios de material gentico em seu interior, os
EPC costumam corar em um tom azulado/roxo com corantes bsicos como
Leishman/Giensa. Na medula possvel verificar a diferena entre o EPC (em
roxo) e o ENC (mais rosado).
A fim de realizar o teste do microncleo, durante o perodo de
tratamento/veculo foram feitas coletas de sangue da veia caudal em dois
momentos diferentes, sendo um acesso no primeiro dia de tratamento/veculo e
outro no ltimo dia de tratamento, imediatamente antes da eutansia, sob
anestesia com Tiopental sdico intraperitoneal (ip) 40mg/kg.
Para o teste do microncleo de medula ssea, os ossos dos membros
anteriores (meros) tiveram suas extremidades epifisrias cortadas e uma
agulha foi inserida na cavidade medular e feito flush utilizando-se Soro Fetal
Bovino (SFB), a fim de retirar a medula ssea. Em seguida a medula foi
centrifugada por 10 minutos a 1000 rpm, descartado o sobrenadante,
ressuspendida com 0,5 mL de SFB e centrifugado novamente. Aps essa
centrifugao a medula foi distribuda nas lminas histolgicas as quais foram
fixadas com metanol 24 horas depois do procedimento. O corante utilizado foi o
Leishman (Eosina azul de metileno). As lminas foram analisadas em
microscpio de Luz Olympus CX40 com aumento de 100x (por imerso).
Na avaliao da citotoxicidade foi considerada a razo EPC/(EPC+ENC) sendo
que, durante a contagem das duzentas primeiras clulas observadas na
lmina, foi anotado quantas dessas clulas eram ENC e quantas eram EPC.
46
Para avaliar a genotoxicidade/mutagenicidade nos grupos de estudo, foram
contados 2000 EPC por animal, sendo 1000 EPC por lmina e registrado
quantos destes EPC apresentaram microncleo em seu interior.
No sangue o tipo celular que h em abundncia so os ENC, pois, os EPC da
medula ssea duram apenas algumas horas aps a diviso celular e,
geralmente, no chegam ao sangue. Desta forma, a anlise de microncleo no
sangue feita pela contagem de ENC e de microncleos.
A fim de realizar o teste do microncleo no sangue realizou-se coleta de uma
gota de sangue da veia caudal no primeiro dia e ao final do perodo de
tratamento/veculo. Por meio da tcnica do esfregao, o sangue foi espalhado
em lmina de histologia, fixado em metanol 24 horas aps o esfregao e
corado com o corante Leishman no momento da anlise. A leitura das lminas
foi realizada em microscpio de luz Olympus CX40 com aumento de 100x (por
imerso).
Foram contados 2000 ENC por animal, sendo 1000 ENC por lmina e
registrado quantos destes ENC apresentaram microncleo em seu interior.
4.7 Anlise Estatstica
Para anlise estatstica dos ensaios de citometria de fluxo os dados da
Mediana de Intensidade de Fluorescncia (MIF) obtidos no software FCS
Express 4 foram submetidos Anlise de Varincia (ANOVA) de uma via,
seguida do post hoc de Fisher.
Na anlise do perfil lipdico foi realizada ANOVA de uma via seguida do post
hoc de Tukey.
As anlises estatsticas relacionadas ao teste do microncleo foram feitas por
meio da ANOVA de uma via, seguida do post-hoc de Tukey a fim de verificar as
diferenas entre os grupos. Quando o objetivo era comparar o mesmo grupo
em dois momentos de tratamento (T0 e TF) realizou-se o teste t de Student
para amostras independentes.
47
Em todos os casos, os resultados foram considerados estatisticamente
significativos quando o p-valor foi inferior a 5%, ou seja, *p < 0,05. Os dados
esto expressos como a mdia dos valores mais ou menos o erro padro da
mdia (mdia EPM).
Resultados
49
5 RESULTADOS
5.1 Colesterol Plasmtico e Triglicerdeos
A anlise dos nveis de colesterol plasmtico e Triglicerdeos fornece
informaes acerca do modelo de aterosclerose utilizado nesse estudo, e
conforme a literatura, esperado que os camundongos dos grupos apoE-/-
apresentem nveis colesterolmicos mais elevados do que os animais do grupo
controle (C57 BL/6J). Os valores obtidos por meio da dosagem de colesterol
plasmtico e de triglicerdeos esto sumarizados na Tabela 1 e dispostos nos
Grficos 3 e 4 abaixo:
Tabela 1 Dados do Colesterol Total e Triglicerdeos plasmticos indicados pela mdia EPM.
Grficos 3 e 4 Nveis de Colesterol Total e Triglicerdeos plasmticos.
Dados expressos como mdia EPM. *p
50
5.2 Quantificao e Viabilidade Celular
O mtodo de contagem celular pela cmara de Neubauer oferece uma boa
estimativa sobre a quantidade e viabilidade das clulas em suspenso na
amostra a ser utilizada nos ensaios de citometria de fluxo. A anlise da
viabilidade celular foi feita pelo mtodo de excluso do corante azul de Trypan.
Todas as clulas foram contadas e foi registrado o nmero de clulas mortas
observado na amostra, desta forma, foi possvel calcular o percentual de
clulas vivas e a viabilidade da amostra. Todas as amostras de clulas isoladas
da medula ssea nos trs grupos de estudo (C57, apoE-/- V e apoE-/- S)
apresentaram viabilidade superior a 95%.
Conforme os dados demonstrados no Grfico 5 a contagem de clulas vivas
indicou uma diferena significativa na quantidade de clulas observadas entre
os grupos, sendo que o grupo apoE-/- veculo apresentou menor quantidade de
clulas contadas: C57 156,85,0 versus apoE-/- V 110,84,7* versus apoE-/- S
173,03,0# (ANOVA uma via, post hoc Tukey).
Grfico 5 Nmero de clulas contadas na Cmara de Neubauer.
Dados expressos como mdia EPM. *p
51
5.3 Dados obtidos por citometria de fluxo
5.3.1 Perfil das populaes de clulas de medula ssea
Todas as amostras de clulas de medula ssea com viabilidade superior a 95%
foram utilizadas nos ensaios de citometria de fluxo, no mximo duas horas
aps o isolamento.
Em cada ensaio foi gerado um grfico dot plot tpico contendo informaes
acerca das caractersticas celulares das populaes presentes na amostra.
Cada populao apresenta tamanho e complexidade caractersticos do seu tipo
celular e, por isso, possvel identificar os diferentes tipos celulares presentes
na amostra de clulas de medula ssea obtida aps isolamento e lise de
hemcias.
O Grfico 6 indica as populaes das sries linfoctica (L), monoctica (M) e
granuloctica (G) observadas nas amostras de clulas de medula ssea
dispostas de acordo com seus tamanhos relativos (FSC) e suas complexidades
(SSC).
Grfico 6 - Dot plot representando as populaes de clulas de medula ssea.
Nota: FSC (forwards cattered light) corresponde luz desviada frontalmente ao passar atravs da clula e SSC (side scattered light) luz desviada lateralmente. Marcaes representam L: linfcitos, M: moncitos, G: granulcitos.
52
5.3.2 Nveis de EROs
Os nveis de EROs das amostras de clulas de medula ssea foram obtidos
por citometria de fluxo pela marcao com DHE e com DCF-DA para avaliar a
presena de nion superxido (O2-) e de perxido de hidrognio (H2O2),
respectivamente.
A quantidade de nion superxido nas clulas proporcional fluorescncia
emitida pelo dihidroetdeo (DHE) e quanto mais fluorescncia emitida mais o
histograma gerado na aquisio dos dados deslocado para a direita (Figura
7).
Figura 7 - Histograma tpico de intensidade de fluorescncia emitida por DHE (eixo X, interpretado pelo filtro PE-A) pela quantidade de clulas marcadas (eixo Y, Count).
Nota: Histogramas dos grupos representados por cores diferentes, sendo controle (em preto), tratado (em azul) e veculo (em vermelho). Escala logartmica.
Como demonstrado no Grfico 7, onde os valores indicam a Mediana de
Intensidade de Fluorescncia (MIF) emitida pelo DHE, possvel perceber os
nveis elevados de O2- no grupo veculo em comparao aos grupos controle e
tratado (apoE-/- V: 2217,6361,0* versus C57: 1128,228,0 versus apoE-/- S:
1125,7190,8#).
53
Grfico 7 Nveis de O2- em clulas de medula ssea.
Valores indicam MIFEPM. *p
54
interpretado pelo filtro FITC-A) pela quantidade de clulas marcadas (eixo Y, Count). Escala logartmica.
Os nveis de H2O2 detectados na citometria pela fluorescncia do DCF tambm
se apresentaram aumentados no grupo apoE-/- V, com valores de
2847,0191,0* versus C57: 2181,0107,7 versus apoE-/- S: 2107,080,60#
(Grfico 8).
Grfico 8 Nveis de H2O2 em clulas de medula ssea.
Valores indicam MIFEPM. *p
55
5.3.3 Anlise das fases do ciclo celular
O ciclo celular corresponde ao conjunto de eventos que ocorrem com qualquer
clula viva que possui ncleo e confere informaes importantes com respeito
normalidade funcional-fisiolgica e a propriedades celulares.
A anlise do ciclo celular em nossa pesquisa visou identificar a proporo de
clulas com DNA fragmentado nas amostras de clulas isoladas de medula
ssea e tambm estimar o percentual de clulas nos diferentes momentos do
ciclo celular.
As fases do ciclo celular (Sub-G0,G0/G1, S e G2/M) das clulas de medula ssea
foram analisadas por citometria de fluxo pelo mtodo de marcao com iodeto
de propdeo (PI) o qual se intercala no DNA e nos permite identificar em que
fase do ciclo cada clula nica se encontra. Por esse motivo a aquisio das
amostras no citmetro foi feita no modo Low, no qual um valor mximo de 200
eventos por segundo eram adquiridos e os histogramas gerados em escala
linear. A avaliao dos histogramas e dos valores percentuais de clulas nas
diferentes fases foram analisados e calculados com o auxlio do software FCS
Express 4.
Como representado pelos histogramas da Figura 9, o perfil geral do ciclo
celular o mesmo nos diferentes grupos, sendo possvel identificar as
diferentes fases do ciclo celular em sua sequncia esperada (Sub-G0 seguida
da fase G0/G1, seguida da fase S, que antecipa a G2/M). Alm disso, a
porcentagem de clulas que se encontra em cada fase do ciclo fica acessvel.
56
Figura 9 Histogramas tpicos do ciclo celular obtidos pela marcao com PI em clulas de medula ssea nos diferentes grupos de estudo.
Nota: Histogramas dos grupos representados por cores diferentes, sendo controle (em preto no preenchido), veculo (vermelho) e tratado (azul). Eixo X: intensidade de fluorescncia emitida por PI (interpretado pelo filtro PE-A); eixo Y, nmero de clulas marcadas (Count). Escala linear.
Ao analisar as fases do ciclo celular separadamente, nota-se que existem
diferenas importantes entre os grupos. Com relao fase Sub-G0 a qual
57
indica DNA fragmentado, os valores obtidos pela marcao com PI apontaram
para uma maior fragmentao de DNA nos animais do grupo veculo com
relao ao controle e ao tratado (apoE-/- V: 2,140,12* versus C57: 1,590,10
versus apoE-/- S 1,310,11#) (Grfico 9).
Grfico 9 Quantidade de clulas na fase Sub-G0.
Valores expressos como mdia EPM. *p
58
Grfico 10 Quantidade de clulas na fase G0/G1.
Valores expressos como mdia EPM. *p
59
Grficos 11 e 12 Percentual de Clulas na fase S e na fase G2/M do ciclo
celular.
Valores expressos como mdia EPM. *p
60
Figura 10 Microscopia ptica em maior aumento de EPC, ENC e EPC MN. Clulas acompanhadas da letra a so EPC; clulas acompanhadas da letra b so ENC; as setas indicam os EPC MN.
Na Medula ssea, concomitantemente anlise de mutagenicidade, foi feita a
estimativa de citotoxicidade adquirida pelo clculo da frequncia de EPC e
ENC nas primeiras 200 clulas observadas na lmina. Os resultados obtidos
nas leituras das lminas esto sumarizados na Tabela 2 e demonstrados nos
Grficos 13 e 14 abaixo:
61
Tabela 2 - Frequncia de EPC MN em 1000 EPC e Relao de EPC/(EPC+ENC). Contadas 2000 clulas por animal (1000 cls/lmina). Dados expressos como Mdia EPM.
Grfico 13 - Frequncia de EPC MN observada em 1000 EPC contados.
Dados expressos como Mdia EPM. *p
62
Grfico 14 Relao de EPC/(EPC+ENC) obtida pela contagem das 200 primeiras clulas observadas na lmina.
Dados expressos como Mdia EPM. *p
63
Figura 11 Microscopia ptica em maior aumento de ENC obtidos por esfregao de sangue perifrico. As setas indicam os ENC MN presentes nas amostras.
Os dados obtidos na anlise do sangue esto sumarizados na Tabela 3 e
representados pelos Grficos 15 e 16 abaixo:
64
Tabela 3 - Frequncia (Mdia EPM) do nmero de ENC MN em 1000 ENC de camundongos C57, apoE-/- V e apoE-/- S nos momentos T0 (1 dia de tratamento/veculo) e TF (ltimo dia de tratamento). Contados 2000 ENC por animal, 1000 por lmina.
Grficos 15 e 16 - Quantidade de ENC MN encontrados em esfregao de sangue perifrico no incio do tratamento/veculo (T0) e aps 21 dias de tratamento (TF).
Dados expressos como Mdia EPM. *p
DISCUSSO
66
6 DISCUSSO 6.1 Colesterol Plasmtico e Triglicerdeos Recentemente dados publicados por nosso grupo de pesquisa demonstraram
que as clulas mononucleares de medula ssea de camundongos apoE-/-
apresentaram danos oxidativos relativos ao aumento de nion superxido e de
perxido de hidrognio em animais jovens e idosos, bem com danos
genotxicos no DNA, evidenciando a influncia da hipercolesterolemia sobre o
estresse oxidativo (TONINI et al., 2013).
No presente trabalho ns testamos a hiptese de que o tratamento com
Sildenafil seria capaz de melhorar alguns danos que a hipercolesterolemia
comprovadamente causa nas clulas de medula ssea de camundongos apoE-
/- knockout.
Em nosso estudo os animais dos grupos experimentais (apoE-/- V e apoE-/- S)
apresentaram nveis de colesterol total e triglicerdeos plasmticos bastante
elevados em comparao ao grupo controle (C57), indicando que os animais
apoE-/- utilizados nesta pesquisa eram de fato hipercolesterolmicos.
Interessantemente, os animais que receberam Sildenafil (grupo apoE-/- S) por
trs semanas no tiveram seus nveis lipdicos e de triglicrides alterados em
comparao ao grupo apoE-/- que recebeu veculo, indicando que o
medicamento provavelmente no age por vias do metabolismo lipdico.
Em nosso grupo de pesquisa tambm j foi demonstrado que animais apoE-/-
tratados com Sildenafil (40 mg/kg/dia) por trs semanas no apresentaram
alteraes lipdicas em comparao ao grupo experimental que recebeu
veculo (BALARINI et al., 2013; LEAL et al., 2015).
Est mais do que demonstrado em animais, estudos epidemiolgicos e
investigaes clnicas que altas concentraes de colesterol circulante
promovem a aterosclerose (HANSSON; HERMANSSON, 2011) e podem
ocasionar danos nos mais diferentes rgos como, por exemplo, na medula
ssea.
67
6.2 Nveis de EROs
Neste estudo, os resultados relativos as EROs demonstraram que tanto o
nion superxido, avaliado pela marcao com DHE, como o perxido de
hidrognio, avaliado pela marcao com DCF-DA estavam aumentados em
animais com hipercolesterolemia (grupo apoE-/- V). Em contrapartida, o grupo
hipercolesterolmico que recebeu Sildenafil por trs semanas apresentou
quantidades similares de O2- e H2O2 ao controle (grupo C57).
Esses resultados indicam que animais com nveis lipdicos elevados realmente
apresentam maior produo de EROs, pelo menos de O2- e H2O2 em
especfico e possuem uma tendncia ao desenvolvimento do estresse
oxidativo.
Concomitantemente tambm fica perceptvel o fato de o Sildenafil, de alguma
forma, ter interferido no estabelecimento do estresse oxidativo nos animais
tratados, seja ao prevenir a formao dessas EROs em questo seja ao agir
como fator antioxidante, retirando as EROS formadas.
O Sildenafil, utilizado em maior escala no tratamento da disfuno ertil e da
hipertenso pulmonar, desenvolve outros efeitos mais abrangentes no
organismo. Um dos efeitos benficos do Sildenafil est no balano oxidativo,
por diminuir o estresse oxidativo nos eventos inflamatrios (MORANO et al.,
2007; YILDIRIM et al., 2010) e inibir a gerao de EROs (HEMNES; ZAIMAN;
CHAMPION, 2008).
Dados publicados recentemente por nosso grupo de pesquisa confirmam e
reforam o efeito antioxidante do Sildenafil, pela diminuio da produo de
EROs (BALARINI et al., 2013; DIAS et al., 2014; LEAL et al., 2015; ALMEIDA,
2015) e tambm dos nveis de peroxidao lipdica, que est diretamente
relacionada ao estresse oxidativo (FAHNING et al., 2015).
O acmulo de GMPc proporcionado pelo Sildenafil pode ser um dos motivos
pelo qual ocorre diminuio do estresse oxidativo, pois, de acordo com
Curatola, Xu e Hendricks-Munoz (2011) o GMPc possui efeito protetor contra o
estresse oxidativo.
68
Em nveis fisiolgicos as EROs funcionam como molculas mensageiras que
sinalizam respostas biolgicas como, por exemplo, a proliferao celular,
migrao, sobrevivncia, diferenciao e a expresso gnica. Por outro lado, o
excesso de EROs que culmina com o estresse oxidativo pode ser prejudicial e
induzir vrias patologias como, a aterosclerose, insuficincia cardaca, diabetes
e cncer (USHIO-FUKAI; REHMAN, 2014).
No ambiente da medula ssea a ao das EROs varia grandemente de acordo
com o microambiente de cada linhagem celular, chamado por diversos autores
de nicho celular. A saber, geralmente nveis baixos de EROs podem manter a
quiescncia de clulas hematopoiticas, enquanto altos nveis de EROs
contribuem para a proliferao, senescncia ou apoptose, levando a uma
exausto prematura do processo de auto-renovao nesse tipo celular. Em
contrapartida, nveis fisiolgicos de EROs tambm so cruciais para processos
de reparo que envolvem diferenciao celular e mobilizao das clulas
tronco/progenitoras da medula ssea, bem como para a manuteno da
imunidade celular durante o estado de equilbrio e tambm durante condies
de estresse (PERVAIZ; TANEJA; GHAFFARI, 2009).
O nicho das clulas-tronco hematopoiticas (CTH) quiescentes, que so
consideradas as clulas-tronco hematopoiticas mais primitivas e responsveis
por manter a populao em longo prazo, caracterizado por baixo teor de
oxignio. Esse microambiente hipxico supostamente assegura s CTH uma
proteo contra o estresse oxidativo e a maior capacidade de manter a
caracterstica de auto-renovao (JANG; SHARKIS, 2007).
Nas clulas-tronco mesenquimais no h produo substancial de EROs e,
por esse motivo, muitas vezes elas so utilizadas para se estudar o acmulo de
EROs (LAVADO et al., 2015).
importante lembrar que a medula ssea fonte de todos os outros tipos
celulares, inclusive dos leuccitos sanguneos que participam do processo
inflamatrio e dos fatores e clulas, como as progenitoras endoteliais, que so
recrutados na tentativa de prevenir danos permanentes no organismo em
diferentes situaes. Assim, a produo de EROs na medula ssea implica em
69
eventos adversos e importantes no destino das CTH e o excesso de EROs
considerado txico para as clulas da medula ssea.
As clulas-tronco, tanto as pluripotentes como as multipotentes, mantm sua
identidade genmica por meio da manuteno dos nveis de EROs sob
controle, o que alcanado pela defesa antioxidante, bem como pela alta
expresso de genes antioxidantes, por um sistema de reparo de DNA mais
potente e pela expresso de protenas heat shock, induzidas em situaes de
estresse (CHAUDHARI; YE; JANG, 2014).
6.3 Anlise das fases do ciclo celular
Em nossos resultados, a maior produo de EROs no grupo apoE-/- V foi
refletida nas diversas fases do ciclo celular das clulas de medula ssea.
Primeiramente houve no grupo apoE-/- V maior quantidade de DNA
fragmentado.
Os animais do grupo veculo tambm apresentaram maior porcentagem de
clulas em G0/G1 e menor proporo de clulas entrando na fase S e na mitose
(fase G2/M). Ou seja, nos animais doentes (apoE-/-) que no receberam
tratamento, maior proporo de clulas no est conseguindo entrar no
processo de diviso celular, nem mesmo na sntese de DNA realizada na fase
S do ciclo.
Esses eventos podem estar diretamente relacionados ao maior estresse
oxidativo observado nos resultados do grupo veculo, devido aos altos nveis de
O2- e H2O2 detectados por citometria de fluxo.
Como dito anteriormente EROs podem afetar as caractersticas das clulas ao
ponto de modificar a taxa proliferativa, de diferenciao, apoptose e
envelhecimento e/ou exausto da auto-renovao.
As EROs, especialmente o radical hidroxil, reagem com os componentes da
molcula de DNA, danificando as bases purinas e pirimidinas e a estrutura da
desoxirribose, levando a quebras em fita simples ou em fita dupla e a ligaes
70
cruzadas na estrutura do DNA (GUTTERIDGE; HALLIWELL, 2010; VALKO et
al., 2007). As EROs podem ainda influenciar modificaes epigenticas por
meio da oxidao do DNA (SARDINA et al., 2012).
Notadamente, o aumento na produo de O2- induz a danos no DNA, alm de
inflamao e envelhecimento vascular (CSISZAR et al., 2009). Os danos no
DNA podem levar tanto parada quanto induo da transcrio, e tambm
induo de vias sinalizadoras de traduo, a erros de replicao e instabilidade
genmica (MARNETT, 2000).
Como visto em nossos resultados, animais com maior produo de H2O2 (apoE-
/- v) apresentaram menos clulas proliferando e entrando em diviso celular,
informao que apoia os resultados encontrados por Xiao e outros (2014), os
quais mostraram que o perxido de hidrognio inibe a proliferao e a
diferenciao endotelial de clulas tronco de medula ssea parcialmente via
produo de EROs.
Em reviso detalhada sobre o assunto, Sart, Song e Li (2015) fizeram um
levantamento de vrios aspectos relacionados influencia do estresse
oxidativo na sobrevivncia das clulas-tronco e reafirmam que nveis basais de
EROS so requeridos na ativao de diversas vias celulares de proliferao e
sobrevivncia enquanto o acmulo excessivo de EROs leva ao dano celular.
Todos esses fatos permitem-nos especular que as clulas de medula ssea
dos animais apoE-/- de fato esto sob influncia da maior quantidade de
EROs, de modo que
