Avaliação de parâmetros imunológicos associados à co...

Avaliação de parâmetros imunológicos associados à co-infecção

HIV-1/Mycobacterium tuberculosis: estudo de casos de síndrome

inflamatória associada à reconstituição imunológica

Por

ÉRIKA DE ARAÚJO ABI-CHACRA

Rio de Janeiro

Maio de 2008

Ministério da Saúde Fundação Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz Mestrado em Biologia Parasitária

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INSTITUTO OSWALDO CRUZ Pós-Graduação em Biologia Parasitária





Dissertação apresentada ao Instituto Oswaldo Cruz como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciências, na área de Imunologia.

Orientadores: Dra. Mariza Gonçalves Morgado – IOC- FIOCRUZ

Dra. Valeria Rolla – IPEC-FIOCRUZ

Rio de Janeiro

Maio de 2008

Ministério da Saúde Fundação Oswaldo Cruz

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INSTITUTO OSWALDO CRUZ Pós-Graduação em Biologia Parasitária





Orientadores: Dra. Mariza Gonçalves Morgado – IOC- FIOCRUZ

Dra. Valeria Rolla – IPEC-FIOCRUZ

Aprovada em: 19/05/2008 EXAMINADORES: Prof.ª Dra. Euzenir Sarno – IOC/FIOCRUZ (Presidente da Banca)

Profª. Dra. Alda Maria Da-Cruz – IOC/FIOCRUZ (Revisora)

Prof. Dr. Afrânio Kritski – HUCFF/UFRJ

Suplentes:

Prof. Dr. Luiz Roberto Castello Branco – IOC/FIOCRUZ

Prof. Dra. Martha Maria de Oliveira – HUCFF/UFRJ

Rio de Janeiro, 19 de maio de 2008

Ministério da Saúde Fundação Oswaldo Cruz

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ESSA DISSERTAÇÃO FOI REALIZADA SOB A ORIENTAÇÃO DA DRA. MARIZA

GONÇALVES MORGADO E DA DRA. VALÉRIA CAVALCANTI ROLLA, NO

LABORATÓRIO DE AIDS E IMUNOLOGIA MOLECULAR DO INSTITUTO OSWALDO

CRUZ, FIOCRUZ E NO INSTITUTO DE PESQUISA CLÍNICA EVANDRO CHAGAS,

FIOCRUZ.

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A minha querida mãe Maria de Fátima Alves de Araújo.

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AGRADECIMENTOS

A Deus por me dar à vida, por estar ao meu lado em todos os momentos difíceis e

por me abençoar sempre. Sem ele, não conseguiria realizar esse trabalho. Te amo!

Aos meus queridos pais, em especial a minha mãe, por me dar força, carinho,

incentivo e por estar ao meu lado nos momentos mais difíceis. Sem o seu apoio e sem a sua

compreensão eu não chegaria até aqui. Te amo!

A minha afilhada que sempre se orgulhou dessa madrinha “chupa cabra” e sempre

compreendeu quando eu tinha que fazer as coisas da dissertação e às vezes não podia estar

com ela. Te amo, minha linda!!!!!!!!

Ao meu querido primo Antônio Abi-chacra pelo orgulho que sempre sentiu dessa

prima maluca e pelo amor que você me deu ao longo dessa fase. Muito obrigada! Te amo!

A minha madrinha (que às vezes esquece disso, rsrsrs) Patrícia Freire e meu

compadre Anderson pelo apoio, pelos conselhos e pelo amor. Nunca vou esquecer de

vocês!!!!

Às minhas orientadoras, Dra. Mariza Gonçalves Morgado e Dra. Valéria Rolla, por

confiarem em mim e pela oportunidade de realização desse trabalho. Muito Obrigada!

Aos meus queridos pacientes, que são a razão desse estudo, sem vocês nada seria

possível. Que Deus abençoe a todos.

Às médicas responsáveis pelo recrutamento dos pacientes, Dra. Viviane de Oliveira

Coelho e Dra. Flávia Marinho Sant’Anna. Sem o trabalho de vocês essa dissertação não

poderia ser realizada. Obrigada.

As Dras. Maria Helena Saad e Cinthia Horn pelos antígenos utilizados nos ensaios

deste estudo e pela boa vontade em me ajudar, sempre nos momentos em que eu mais

precisava. Muito obrigada.

Ao Thiago e ao Wagner do IPEC (coleta) que sempre com a maior boa vontade

levavam o sangue para o laboratório. Vocês são uns amores!!!

A Cristianne por ter me aturado durante esse tempo todo. Você é uma santa!!!!!

Agradeço também pela sua ajuda imediata em todos os momentos. Você é uma fofa...

A Giselle Furtado pela ajuda com a citometria de fluxo, pelas palavras de incentivo

e apoio e pelas risadas no p2..... (além do El Bicon....). Muito obrigada amiga!

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A Vanessa Martins pelos resultados de carga viral e pelos pepinos solucionados.

Ninguém merece, amiga! Muito obrigada e que Deus te abençoe sempre!

A Geane Flores (madrinha de bateria da Porto da Pedra, 2008) pelos gradientes e

pepinos (para não dizer pi...) compartilhados. Mestres em Ficoll pelo menos nós somos!!!!

Muito obrigada!!

A Fernanda Heloise pelas noites no p2 (não deixe o Thiago saber...) e por todo

apoio e carinho. Minha eterna gratidão. Obrigadaaaaa!!!!!!!

A Adriana, Haline e Carlos pelo apoio constante e pelas palavras de carinho. Adoro

vocês!!! Brigaduuuu!!!!

A Professora, doutora, funcionária e futura mamãe Dra. Sylvia Teixeira pelo apoio,

pela resolução de muitos pepinos (principalmente os finais) dessa dissertação, além das

muitas caronas para Nikiti city. A você minha eterna gratidão.

A Dra. Monick Guimarães pela atenção, paciência e boa vontade comigo no

laboratório. Suas palavras de incentivo sempre me ajudaram a seguir em frente. Obrigada.

A Professora, doutora, funcionária e futura mamãe 2 Dra. Carmem Beatriz Wagner

Giacoia Gripp pelo suporte científico que me ajudou a realizar essa dissertação. Muito

obrigada!

A Roberta Lorete pelo apoio constante e pelas risadas que me ajudaram a superar os

momentos difíceis. Muito obrigada amiga!!!!

A Deise Luci pelas orientações e pelo carinho. Muito obrigada.

Ao Dr. José Carlos e Dra. Vera Bongertz pelos ensinamentos durante a realização

deste trabalho. Muito obrigada!

Aos amigos Joanna Reis, Vitor Pimentel (me alise), Caroline Passaes, Saada

Chequer, Rafael, Cibele e Dalziza (Ziza) pelo carinho durante essa caminhada. Adoro

vocês!

A Gonzalo Bello e Carlos Augusto pelos ensinamentos e pelos conselhos. Acho

vocês hiper inteligentes. Um dia eu chego lá!!!!

Aos meus queridos amigos de turma: Ana Luiza Valadão, Michelli Faria, Carla

Sodré, Amanda Torrentes e a todos os outros, por segurarem na minha mão e me ajudarem

a levantar e seguir em frente durante os momentos difíceis. Amo vocês!

ix

Aos meus queridos amigos Carlos Marclei e Isabel Romeo que sempre acreditaram

em mim e me deram forças para chegar até aqui. Meu coração é de vocês!

Ao Sr. Carneiro pelo carinho, pelo sangue que ele doou para a realização dos

experimentos de teste (coitado, cinco tubos de heparina!!!) e pelos momentos agradáveis

que passamos quando ele aparecia no laboratório. O Sr. é nota 1000!!!!

Aos amigos do Departamento de Imunologia: Raquel, Karen, Adriano, Priscila,

Cláudia, Claudinha, Eduardo (Alda), Edu (Dumith), Jorge, Rômulo, Josué, Jaline, Jairo,

Ana Cristina e a todos os outros pelo companheirismo e pela força! Valeu pessoal!

A Dra. Alda pelo carinho, incentivo e por aceitar a missão de revisar esta

dissertação. Obrigada!

A Dra. Marilene e Dra. Joseli Lannes pelo carinho constante e pelos ensinamentos.

Muito obrigada! As sras. estão no meu coração!

Ao Dr. Dumith Chequer (primo distante!) pelo carinho e atenção no decorrer desses

dois anos. Obrigada de todo o coração.

A banca pela avaliação dessa dissertação.

A galera da secretaria: Silvia, Ricardo e Ivone pelo incentivo, pelo carinho e pelas

risadas sempre constantes no nosso dia-dia. Adoro vocês!

A galera da limpeza: Dona Maria e Patrícia, por deixarem o departamento sempre

um brinco e por terem sempre uma palavra amiga para todas as pessoas. Que Deus esteja

com vocês!!

A todas as pessoas que tiveram ao meu lado durante essa caminhada!

A vocês.......

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RESUMO

Pacientes infectados com HIV são mais suscetíveis a infecções oportunistas, sendo a tuberculose uma das mais freqüentes. A TARV reduziu a morbidade e mortalidade dos pacientes, mas a recuperação da resposta imune pode levar a um quadro patológico paradoxal denominado IRIS. Na IRIS ocorre uma reação imunoinflamatória a antígenos de agentes infecciosos e já foi descrita para Toxoplasma, CMV e tuberculose.Entretanto, os mecanismos imunopatogênicos associados ao desenvolvimento da IRIS ainda não estão bem definidos. O objetivo desse estudo é avaliar a reconstituição imune e a ocorrência de síndrome inflamatória aguda em indivíduos co-infectados pelo HIV-1 e pelo Mycobacterium tuberculosis (MTB) em resposta à terapia combinada antiretroviral e tuberculostática. Quinze indivíduos infectados com o HIV-1 e com o M. tuberculosis, virgens para a TARV foram incluídos no estudo. Esses pacientes foram avaliados antes e durante as visitas de acompanhamento (D1, D30, D60, D90 e D120) após o início da TARV através da contagem absoluta de linfócitos T CD4+ e T CD8+ e a análise da expressão de moléculas associadas à ativação celular (HLA-DR+ em TCD3+, CD38+ em TCD8+) utilizando citometria de fluxo, além da avaliação dos níveis de CV. A produção de IFN-γ frente a antígenos do M. tuberculosis (PPD, ESAT-6 e 38kDa/CFP-10) foi avaliada através do método de ELISPOT. Análises do acompanhamento mostraram uma clara redução nos níveis de CV associada com um aumento das contagens de células TCD4+, que apresentaram uma mediana no início do tratamento de 103 céls/mm3 [IC 95% (53 – 171,5 céls/mm3)] e de 212 céls/mm3 [IC 95% (134,5 – 290,5 céls/mm3)] no D120 após o tratamento. Três pacientes apresentaram um quadro clínico de IRIS durante o estudo, em torno de D30 pós TARV. Todos os pacientes apresentaram elevados níveis de ativação celular, apesar do controle da CV do HIV-1. O ensaio de ELISPOT para IFN-γ mostrou um aumento no número de indivíduos responsivos ao PPD (26,6% vs 93,3%), ESAT-6 (6,6% vs 20%) e 38kDa/CFP-10 (20% vs 53,3%) e uma resposta aumentada ao PPD após a introdução de TARV (D30) nos casos de IRIS em comparação aos outros pacientes. Além disso, observamos um aumento tanto na frequência como na magnitude da resposta aos antígenos micobacterianos ao longo do tratamento associado com o evento de reconstituição imunológica ocorrida nesses pacientes. Os casos de IRIS apresentaram um perfil diferenciado de resposta aos antígenos micobacterianos quando comparados aos demais pacientes, com resposta aumentada ao PPD em D30, redução em D60 e novo incremento em D90. Nesse trabalho procuramos contribuir para a análise de alguns parâmetros imunológicos associados com a reconstituição imune e os eventos associados à IRIS entre os pacientes co-infectados pelo HIV-1/M. tuberculosis.

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ABSTRACT

Patients infected with HIV are more susceptible to opportunistic infections, being tuberculosis one of the most frequent. The introduction of TARV reduced the morbidity and mortality of the patients, but the immune reconstitution can lead to a paradoxical pathological picture called IRIS. In the IRIS an imuneinflammatory reaction to antigens of infectious agents is observed and it has already been described for Toxoplasma, CMV and tuberculosis. However, the immunopathogenic mechanisms of IRIS development are not yet fully understood. The aim of this work is to evaluate the immune reconstitution and the occurence of the acute inflammatory syndrome in co-infected patients with HIV-1 and M. tuberculosis (MTB) in response to the antiretroviral and tuberculostatic therapy. Fifteen individuals infected with HIV and M. tuberculosis, naïve to TARV, were included in this study. These patients were evaluated before and during the follow-up visits (D1, D30, D60, D90, D120) after TARV submission for their cellular immune status, monitored throughout T CD4+ and CD8+ cell counts and the analysis of the activation associate molecules (HLA-DR+ em TCD3+, CD38+ em TCD8+) on T cells subsets by flow cytometry, and the evaluation of the VL. ELISPOT assays for γ-INF to M tuberculosis antigens (PPD, ESAT-6 and 38kDa/CFP-10) were carried out to assess the cellular immune response during the immune reconstitution in response to TARV. Analyses of follow-up visits shown a clear reduction in the VL associate with an increase in the TCD4+ cell counts, presenting a median of 103 cells/mm3 [IC 95% (53 – 171,5 cells/mm3)] at the begining of the treatment and 212 cells/mm3 [IC 95% (134,5 – 290,5 cells/mm3)] in the final of the treatment Three patients showed a clinical picture of IRIS during the study. All the patients presented high levels of cellular activation, even after HIV-1 VL control. The ELISPOT assay showed an increase in the number of responsive individuals to PPD (26,6% vs 93,3%), ESAT-6 (6,6% vs 20%) and 38kDa/CFP-10 (20% vs 53,3%) along treatment and an increased response to PPD after TARV introduction (D30) in the cases os IRIS in comparison with the others patients. Therefore, we observed an increased response to micobacterial antigens during the treatment associated with immune reconstitution occurred in these patients. The IRIS cases presented a distinct profile of the response to the MTB antigens when compared to the other patients, showing an increase in the number of spots/106cels in D30 and D90 and reduction in D60. In the present work we tried to contribute to the analysis of the immunological parameters associated with the immune reconstitution and occurrence of IRIS among the HIV and M tuberculosis infected patients in consequence to the TARV.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1.1: Distribuição de adultos vivendo com HIV/AIDS até o fim de 2007. Figura

adaptada do Boletim epidemiológico da UNAIDS (http://www.unaids.gov)

Figura 1.2: Distribuição de adultos vivendo com HIV/TB até o fim de 2005. Figura

adaptada do site da World Health Organization. (http://www.who.int.en)

Figura 4.1: Representação das análises realizadas para determinação das populações de

células TCD3+/TCD8+ expressando as moléculas associadas à ativação celular (CD38 e o

HLA-DR), durante todas as visitas do estudo (D1, D30, D60, D90 e D120). A região 1 (R1)

representa a população de linfócitos totais e a região 2 (R2) representa a população de

linfócitos TCD3+ ou TCD8+. A partir da região 2 (R2) foram definidas as populações de

células que expressavam os marcadores de ativação celular (CD38 e o HLA-DR) e a partir

da região 1 (R1) as populações de células TCD3+ ou TCD8+.

Figura 4.2: Representação esquemática do ensaio de ELISPOT para quantificação de

células produtoras de IFN-γ. Figura adaptada do site da Expert Review in Molecular

Medicine. (www-ermm.cbcu.cam.ac.uk).

Figura 5.1: Contagens absolutas de células TCD4+ dos pacientes infectados pelo HIV-1 e

pelo Mycobacterium tuberculosis (n=15) durante as visitas de acompanhamento (D1, D30,

D60, D90 e D120). As linhas horizontais representam os valores medianos e cada ponto

representa um paciente diferente durante cada visita. * p<0,05 – Wilcoxon U-test

Figura 5.2: Percentagem de ganho de células TCD4+ nos pacientes infectados pelo HIV-1 e

pelo Mycobacterium tuberculosis (n=15) durante as visitas de acompanhamento (D1, D30,

D60, D90 e D120). As linhas horizontais representam os valores medianose e cada ponto

representa um paciente diferente durante cada visita.

Figura 5.3: Contagens absolutas de células TCD8+ nos pacientes co-infectados pelo HIV-1

e pelo Mycobacterium tuberculosis (n=15) durante as visitas de acompanhamento (D1,

D30, D60, D90 e D120). As linhas horizontais representam os valores medianos e cada

ponto representa um paciente diferente durante cada visita.

Figura 5.4: Contagens absolutas de células TCD4+ e células TCD8+ nos casos de síndrome

inflamatória associada a recosntituição imune durante as visitas de acompanhamento (D1,

D30, D60, D90 e D120).

xiii

Figura 5.5: Carga viral plasmática do HIV-1 dos pacientes infectados pelo HIV-1 e pelo

Mycobacterium tuberculosis durante as visitas de acompanhamento (D1, D30, D60, D90 e

D120). * p<0,05 – Wilcoxon U-test

Figura 5.6: Contagem de células TCD4+ e quantificação da carga viral plasmática do HIV-

1 dos pacientes infectados pelo HIV-1 e pelo Mycobacterium tuberculosis durante as visitas

de acompanhamento (D1, D30, D60, D90 e D120). Os pontos representam os valores

medianos.

Figura 5.7: Contagem de células TCD4+ e quantificação da carga viral plasmática do HIV-

1 nos casos de síndrome inflamatória associada a reconstituição imune durante as visitas de

acompanhamento (D1, D30, D60, D90 e D120).

Figura 5.8: Níveis de expressão de HLA-DR em células TCD3+ nos pacientes co-

infectados pelo HIV-1 e pelo Mycobacterium tuberculosis durante o tratamento (D1, D30,

D60, D90 e D120). As linhas horizontais representam os valores medianos e cada ponto

representa um paciente diferente durante cada visita. * p<0,05 – Wilcoxon U-test.

Figura 5.9: Níveis de expressão de CD38 em células TCD8+ nos pacientes co-infectados

pelo HIV-1 e pelo Mycobacterium tuberculosis durante o tratamento (D1, D30, D60, D90 e

D120). As linhas horizontais representam os valores medianos e cada ponto representa um

paciente diferente durante cada visita. * p<0,05 – Wilcoxon U-test.

Figura 5.10: Níveis de expressão de CD38 em células TCD8+ e níveis de expressão de

HLA-DR em células TCD3+ nos casos de síndrome inflamatória associada a reconstituição

imune durante o tratamento (D1, D30, D60, D90 e D120).

Figura 5.11: Percentual de indivíduos respondedores aos antígenos PPD, ESAT-6 e

38kDa/CFP-10 (entre os quinze pacientes incluídos no estudo) ao longo do tratamento (D1,

D30, D60 e D90).

Figura 5.12: Ensaio de ELISPOT para detecção de células produtoras de IFN-γ, realizado

nos indivíduos infectados pelo HIV-1 e pelo Mycobacterium tuberculosis, durante as visitas

de acompanhamento (D1, D30, D60 e D90). O resultado é expresso em células formadoras

de spots (CFS)/1 x 106 células mononucleares do sangue periférico (CMSP). As linhas

horizontais menores representam os valores medianos e as linhas horizontais maiores

representam a positividade do teste (foram considerados respondedores para os antígenos

PPD, ESAT-6 e 38kDa/CFP-10, os indivíduos com ≥ 30 spots/106 células).

xiv

Figura 5.13: Ensaio de ELISPOT para detecção de células produtoras de IFN-γ em resposta

aos antígenos micobacterianos (PPD, ESAT-6, 38kDa/CFP-10) realizado nos casos de

IRIS, durante as visitas de acompanhamento (D1, D30, D60 e D90). O resultado é expresso

em CFS/1 x 106 CMSP.

xv

LISTA DE ABREVIATURAS E GLOSSÁRIO

AIDS - Síndrome da imunodeficiência adquirida

CCR2 – Receptor de quimiocinas: MCP 1, 2 e 4

CCR5 – Co-receptor. Participa da entrada do vírus na célula hospedeira

CD4 – Glicoproteína de superfície das células T

CD8 – Glicoproteína de superfície das células T

CD25 – Ligante de IL-2 e da subunidade de IL-2R

CD38 – Glicoproteína de Superfície do Tipo II, expressa em células NK, linfócitos B e T

CD88 – Receptor para fragmento C5a do complemento

CCL5 – Quimiocina envolvida no recrutamento de leucócitos

Células NK – Células Natural Killer

CTLs – Linfócitos T Citotóxicos

CR1 – Receptor do Complemento Tipo 1

CR3 – Receptor do Complemento Tipo 3

CV – Carga Viral

CXCR4 - Co-receptor. Participa da entrada do vírus na célula hospedeira

DC-SIGN – Receptor de Lectina do Tipo C

DNA - Ácido desoxirribonucléico

DR5 – Receptor de TRAIL nas células T

DTH – Reação de Hipersensibilidade do Tipo Tardia

EDTA – Ácido etilenodiaminotetracético

Env – Gene que codifica as glicoproteínas do envelope viral

Fas – Receptor de Indução de Apoptose

FasL – Ligante do receptor Fas

FDC – Células Dendríticas Foliculares

FoxP3 – Marcador molecular de Células T regulatórias

G0 – Estado de Inativação Celular

G1- Estágio Inicial do Ciclo Celular

Gp 120 – Glicoproteína de 120 kDa

Gp 41 – Glicoproteína de 41 kDa

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HIV - Vírus da Imunodeficiência Humana

HLA – Antígeno leucocitário humano

IFN-γ - Interferon γ

IgA – Imunoglobulina A

IgG – Imunoglobulina G

IgG1 – Subtipo 1 de IgG




IgM – Imunoglobulina M

IL – Interleucina

INNTR – Inibidor não-nucleosídico da transcriptase reversa

INTR – Inibidor nucleosídico da transcriptase reversa

IP-10 – Quimiocina CXCL10

IRIS – Síndrome inflamatória associada à reconstituição imune

LPS - Lipopolissacarídeo

LTNP – Não progressores de longo termo

LTR - Longas repetições terminais

MCP-1 – Proteína co-fator de membrana 1

MHC – Complexo principal de histocompatibilidade

MIG – Quimiocina CXCL9

MIP-1α - Proteína 1α inflamatória de macrófagos

MTB – Mycobacterium tuberculosis

NRAMP-1 – Proteína 1 de macrófagos associada à resistência natural

Nef – Gene acessório do HIV-1

NF-κB – Fator nuclear κB

pDCs – Células dendríticas plasmocitóides

RANTES – Citocina membro da superfamília da IL-8. Ligante de CCR5.

Receptores KIR – Receptores expressos em células NK. Estão envolvidos com sua

imunoreatividade.

SIV- Vírus da imunodeficiência símia

xvii

STAT 1 – Transdutor de sinal e ativador de transcrição 1

TARV - Terapia antiretroviral altamente ativa

TB – Tuberculose humana

TGF-β - Fator de crescimento de transformação β

TIRAP – Adaptador do receptor toll de sinalização MAL

TLR – Receptor toll

TNF-α - Fator de necrose tumoral α

TRAIL – Ligante indutor de apoptose associado ao TNF

Vírus GB – Flavivírus relacionado com o vírus da hepatite

xviii

SUMÁRIO

Pág.

Resumo

Abstract

Introdução 1

Patogênese da Infecção pelo HIV-1 1

Patogênese da Infecção pelo Mycobacterium tuberculosis 12

TARV e Reconstituição Imune 15

Co-infecção HIV-1/Mycobacterium tuberculosis 17

Síndrome Inflamatória da Reconstituição Imune (IRIS) 22

Justificativa 31

Objetivos 34

Metodologia 35

Pacientes e Métodos 35

Obtenção de Amostras de Sangue Periférico 36

Obtenção e Criopreservação de CMSP 37

Descongelamento de Células Criopreservadas 37

Citometria de Fluxo 38

Determinação da Carga Viral Plasmática 40

Ensaio de ELISPOT 40

Análise Estatística dos Dados 43

Aspectos éticos 44

Resultados 45

Discussão 60

Conclusões 70

Perspectivas 71

Anexo I 72

Referências bibliográficas 75

1

I. INTRODUÇÃO

I.1. Patogênese da infecção pelo HIV-1

O HIV é um membro da família dos retrovírus complexos, pertencente ao gênero

dos Lentivirus (Coffin.,1996). Os lentivírus são capazes de induzir infecção latente a longo

prazo das células e de efeitos citopáticos a curto prazo, produzindo doenças fatais, de

progressão lenta, que incluem síndromes que levam ao comprometimento do sistema imune

e posteriormente a eventos relacionados à imunossupressão. Dois tipos estreitamente

relacionados de HIV, o HIV-1 e o HIV-2 foram identificados. Estes dois vírus apresentam

um baixo grau de homologia em suas seqüências de nucleotídeos tendo, como

conseqüência, diferenças importantes quanto ao peso molecular e estrutura primária de suas

proteínas, assim como possuem diferenças em seus genes regulatórios. Ambos HIV-1 e

HIV-2 replicam em células T CD4+ e são considerados patogênicos, porém o HIV-2 é

considerado menos patogênico por levar um tempo maior para o desenvovimento da AIDS,

além de ter menor taxa de transmissão vertical (McMichael et al., 2001).

O HIV-1 é a causa majoritária de AIDS no mundo, onde o número de pessoas

infectadas se aproxima dos 40 milhões atualmente (Figura 1.1). A maioria destas vivem em

países subdesenvolvidos da África Subsariana, Ásia e América do Sul. (UNAIDS., 2007).

2

Figura 1.1: Distribuição de adultos vivendo com HIV/AIDS até o fim de 2007. Figura adaptada do Boletim

epidemiológico da UNAIDS (http://www.unaids.gov)

A patogênese da infecção pelo HIV envolve a infecção e a replicação no interior de

células do hospedeiro que carregam a molécula CD4, incluindo linfócitos T CD4+,

macrófagos e células dendríticas. A replicação e a destruição de células T CD4+, as quais,

são células efetoras chave na resposta imune do hospedeiro, leva a uma profunda

imunossupressão clinicamente conhecida como AIDS. Para entrar nas células o HIV

necessita de um co-receptor além da molécula CD4. Os receptores de quimiocinas CCR5 e

CXCR4 foram identificados como os principais co-receptores para o HIV-1 (revisto por

Hogan et al., 2001).

Duas variantes do HIV-1 relacionadas ao tropismo têm sido identificadas. Após a

soroconversão isolados do HIV-1 tendem a ter um fenótipo não indutor de sincício. Essas

variantes não indutoras de sincício são também conhecidas como M-trópicas ou macrófago-

trópicas, por infectaren in vitro macrófagos derivados de monócitos, mas não estabelecem

infecção em linhagens de células T CD4+. Outra variante do HIV-1 com fenótipo indutor

de sincício preferencialmente infecta linhagens de células T e, assim, é conhecida como T-

trópica. Entretanto, tanto variantes M-trópicas e T-trópicas infectam linfócitos T CD4+

primários utilizando os respectivos co-receptores CCR5 e CXCR4 (Valentin et al., 1994).

Inicialmente a infecção do HIV é caracterizada por variantes M-trópicas, uma vez que as

variantes indutoras de sincício tendem a emergir durante o estágio tardio da infecção. Essas

variantes têm sido vinculadas ao aumento da citopatogenicidade, resultando em uma

depleção mais rápida das células T (Richman et al., 1994; Kimata et al., 1999; Zhu et al.,

1993; Miedema et al., 1994). Essa transição entre fenótipos virais está relacionada com a

evolução no uso do co-receptor (Scarlatti et al., 1997; Connor et al., 1997; Bjorndal et al.,

1997), contudo não é necessária para a progressão da doença.

O período entre a infecção pelo HIV e a progressão para a AIDS é conhecido como

o período de latência clínica. Contudo, nesta fase ocorre atividade intensa e progressiva do

HIV no tecido linfóide, com replicação viral persistente durante toda a infecção, alcançando

taxas surpreendentes de cerca de 1010 virions produzidos por dia em uma pessoa infectada.

O processo de replicação viral e infecção de novas células alvo é mediado em parte

pela transcriptase reversa do HIV, que não tendo sistema de correção, produz novas

3

mutações a cada dia (Coffin et al., 1995). A diversidade dentro do genoma viral aumenta

durante a infecção, levando a um escape potencial da resposta imune do hospedeiro e

resistência aos anti-retrovirais (revisto por Hogan et al., 2001).

Durante a infecção primária pelo HIV, ocorrem altos níveis de viremia nas

primeiras semanas (Piatak et al., 1993). Esse evento é geralmente acompanhado por uma

síndrome aguda, caracterizada por alguns sintomas não específicos como febre, fadiga,

exantema, linfoadenopatia, e, freqüentemente, meningite asséptica.(Schacker et al., 1996;

Kahn et al., 1998). A replicação viral dentro do tecido linfático é intensa nos primeiros

estágios da infecção (Pantaleo., 1993). A viremia alcança o pico, e a contagem de células

CD4+ diminui de forma aguda. Além disso, existe um “burst” do vírus no plasma, seguido

de um declínio relativo da viremia. Durante esse período, uma forte resposta de células T

citotóxica é gerada, a qual coincide com supressão inicial da carga viral em muitos

pacientes. Virions são capturados por células dendríticas foliculares (FDC) dentro dos

tecidos linfóides. Durante todo o curso da infecção pelo HIV-1, o tecido linfóide representa

o principal sítio de replicação. (HIV Medicine., 2006).

Após a entrada do HIV-1 em uma célula T CD4+ quiescente e após a atividade da

transcriptase reversa, o genoma viral é representado por um DNA proviral não integrado. O

DNA proviral preferencialmente se integra em genes ativos conhecidos como hot spots

(Schroder., 2002). A ativação das células T CD4+ é necessária para a integração do DNA

no genoma da célula hospedeira e é um pré-requisito para a síntese de novos virions. Nesse

contexto, o microambiente do tecido linfóide representa um ótimo sítio para a replicação

viral. O contato íntimo célula-célula entre células TCD4+ e células apresentadoras de

antígeno, a presença de virions infecciosos na superfície de FDC e uma produção

abundante de citocinas pró-inflamatórias como IL-1, IL-6 ou TNF-α promove a indução da

replicação viral em células infectadas. Ambos IL-1 e TNF-α induzem NF-κB, o qual se liga

a LTR do HIV-1 para promover a transcrição do provírus (HIV Medicine., 2006).

À medida que a infecção avança, o sistema imunológico adaptativo monta respostas

imunológicas com mediação tanto humoral quanto celular dirigidas aos antígenos virais.

Essas respostas controlam parcialmente a infecção e a produção viral, e tal controle é

refletido por uma queda na viremia para níveis baixos, porém, ainda assim, detectáveis, em

um período de 12 semanas após a exposição primária.

4

Estudos feitos com macacos infectados com SIV (vírus da imunodeficiência de

macacos) mostram que os macacos perdem quase que completamente suas células T CD4+

da lâmina própria do intestino (Veazey et al., 1998) na fase aguda da infecção. Estudos

subseqüentes demonstraram que esse efeito ocorre em função do tropismo do SIV pelo co-

receptor CCR5 e que muitas das células T CD4+ de memória que habitam a mucosa do

intestino (e outros sítios de mucosa) são CCR5+ (Veazey et al., 2000; Picker et al., 2004).

O mesmo fenômeno foi demonstrado em humanos infectados com HIV (Brenchley et al.,

2004; Mehandru et al., 2004). Uma possível explicação seria que a infecção viral direta

com destruição celular, tanto por ação do próprio vírus, como por citólise mediada por

células T citotóxicas estariam envolvidas na depleção de células T CD4+ nesses sítios.

Também foram mostradas altas taxas de infecção entre células T CD4+ de memória em

outros sítios, enfatizando a natureza sistêmica desse alvo de destruição celular. Outros

estudos sugerem que ocorra uma extensiva apoptose em células T CD4+ associada com

marcadores de regulação positiva de Fas e FasL e propõem que a exposição de células T

CD4+CCR5+ a locais com altas concentrações da proteína de envelope do SIV (Env)

iniciam a apoptose mediada por Fas. A destruição de células T CD4+ de memória na

infecção aguda por SIV, nos sítios efetores da mucosa, é mediada pela infecção viral direta

e pela apoptose induzida pela exposição celular a proteína do envelope do SIV (Env).

(revisto por Picker et al., 2005)

A infecção por SIV induz um estágio de intensa ativação imune e acentuada

regulação positiva da proliferação de células T CD4+ de memória e uma renovação,

incluindo novas células T CD4+ de memória expressando CCR5 (Picker et al., 2004). O

efeito dessas mudanças na dinâmica das células T CD4+ de memória é substancial. Após a

infecção, uma resposta proliferativa generalizada de células T CD4+ de memória produz

células de vida curta que migram para o tecido da mucosa tentando compensar a perda de

células T CD4+ de memória na fase aguda. Contudo, essa resposta é incompleta e falha.

Essa perda precoce da resposta proliferativa resulta na interrupção da emigração de novas

células T CD4+ de memória para os tecidos e isso está associado com uma progressão

rápida da doença (Picker et al., 2005).

5

Durante a fase progressiva crônica da doença do HIV, o paciente torna-se suscetível

a outras infecções, e as respostas imunológicas a essas infecções podem estimular a

produção de HIV e acelerar a destruição dos tecidos linfóides.

A doença causada pelo HIV progride até a destruição do tecido linfóide periférico e

a diminuição da contagem de células T CD4+ que cai abaixo de 200 células/mm3 . A

viremia pode subir drasticamente, enquanto a replicação viral em outros reservatórios

acelera-se sem controle. Pacientes com AIDS são suscetíveis a múltiplas infecções

oportunistas e neoplasias, uma vez que células T CD4 + auxiliares são essenciais para as

respostas imunológicas tanto mediadas por células quanto por anticorpos a vários

microorganismos.

A habilidade do HIV em replicar apesar da vigorosa resposta imune mediada por

célula e humoral sugere que o vírus pode usar alguns mecanismos para evadir a resposta

imune. Esses mecanismos incluem variação antigênica, epítopos que não são reconhecidos

e são apresentados a células T e a falta de ativação de células efetoras (Goulder et al., 1997;

Price et al., 1997; Borrow et al., 1997); regulação negativa de moléculas MHC na

superfície de células infectadas (Collins et al., 1998); e o desaparecimento inicial de células

T CD8+ específicas durante a exaustão clonal (Pantaleo et al., 1997; McKinney et al.,

1999). Além disso, o vírus pode persistir em sítios imuno privilegiados, como o sistema

nervoso central, olhos e etc. aonde a exposição a células imunes efetoras é prevenida.

A infecção de células T de memória em repouso pelo HIV resulta em um

reservatório latente para o vírus (Stevenson., 2003), porque essas células não expressam

produtos virais e assim não são reconhecidas por células imunes efetoras. Células

quiescentes (G0) são portadoras da infecção devido ao bloqueio da transcriptase reversa;

portanto, a célula provavelmente está na fase do ciclo celular além de G0 o que permite o

estabelecimento do provirus. Presumivelmente, a célula então retorna ao seu estado

quiescente enquanto simultaneamente evita os efeitos virais citopáticos e os mecanismos

imunes do hospedeiro. Assim, existe uma estreita janela para o estabelecimento da infecção

latente (Stevenson., 2003). Sinais estimulatórios sutis dirigidos a células TCD4+ podem

promover a entrada em um estágio inicial do ciclo celular (G1) que podem ser suficientes

para remover o bloqueio da restrição da infecção de uma célula quiescente. Na fase inicial

da infecção por SIV, e na fase inicial e tardia da infecção pelo HIV-1, muitas das células

6

que expressam o RNA viral não expressam marcadores de ativação celular, e essas células

persistem após a terapia anti-retroviral (Zhang et al., 1999). Nef do HIV-1 pode criar

condições que permite a entrada do vírus em células não-ativadas (Spina et al., 1994; Miller

et al., 1994). Macrófagos infectados com o HIV-1 liberam, em um modo dependente de

Nef, fatores solúveis que tornam as células T suscetíveis a infecção (Swingler et al., 2003).

Nef pode ser expresso mesmo antes do estabelecimento do provirus, permitindo a

preparação de uma célula “resting” para a infecção (Wu et al., 2001).

Células apresentadoras de antígeno, incluindo macrófagos e células dendríticas,

podem ser a estratégia central usada pelo HIV-1 para resistir à pressão imune e anti-

retroviral (revisto por Stevenson., 2003). A infecção dos macrófagos pelo HIV-1 ocorre

primariamente através do co-receptor CCR5 e, contudo existem algumas exceções,

indivíduos que não possuem o CCR5 (possuem o polimorfismo ∆32-CCR5) são altamente

resistentes à infecção (Dean et al., 1996; Liu et al., 1996; Samson et al.,1996). Assim,

macrófagos ou linfócitos de mucosa CCR5+ (Veazey et al., 1998) podem ser importantes

no estabelecimento da infecção. Macacos Rhesus infectados com SIV/HIV (SHIV)

altamente patogênico resulta em completa depleção de células TCD4+; após a depleção dos

linfócitos, contudo, a viremia plasmática é sustentada quase que completamente por

macrófagos teciduais (Igarashi et al., 2001). Macrófagos teciduais podem também estar

envolvidos na disseminação dos vírus a células TCD4+, e o Nef do HIV-1 pode alterar as

características fisiológicas dos macrófagos infectados de forma a propiciar condições para a

disseminação viral (Swingler et al., 2003).

As células dendríticas favorecem a replicação viral por dois processos distintos: elas

são suscetíveis à infecção direta, e elas capturam virions e depois os transmitem para as

células TCD4+ (Cameron et al., 1992; Pope et al., 1994). Após capturar os virions, as

células dendríticas enviam sinais às células T, os quais promovem sua habilidade para

replicar o vírus. Proteínas celulares que medeiam a captura do HIV-1 pelas células

dendríticas, como a proteína de membrana chamada DC-SIGN, é provavelmente um dos

muitos receptores de lectina do tipo C que pode se ligar ao HIV-1 (Turville et al., 2002).

Uma característica da interação vírus-célula dendrítica é que os virions capturados são

internalizados em um compartimento não lisossomal, de baixo pH, conservando a

habilidade de infectar células T em trans (Kwon et al., 2002).

7

O curso da infecção em indivíduos infectados por HIV-1 pode variar

dramaticamente, mesmo se a infecção primária tiver origem na mesma fonte. Em alguns

indivíduos com infecção pelo HIV-1 não progressores de longo-termo (LTNP),

caracterizados por não apresentarem declínio nas contagens de CD4, ou infecção crônica

por mais de 10-12 anos sem desenvolvimento da AIDS, foi identificado um vírus latente

(Haase et al., 1999), que se caracterizava por pouca ou nenhuma replicação viral. Assim, as

infecções com vírus latentes, ou com um vírus com pouca capacidade replicativa, podem

prolongar o curso clínico da infecção por HIV-1. No entanto, na maioria dos indivíduos a

infecção por HIV-1, mesmo os que apresentam um perfil de não progressão a longo termo,

é caracterizada por uma replicação competente produzindo um elevado número de vírions

por dia.

A resposta imune celular desempenha um papel vital na patogênese do HIV. Com a

ajuda de linfócitos TCD4+ específicos para o HIV (células T helper), linfócitos TCD8+, a

arma efetora do sistema imune celular, matam células infectadas com HIV, as quais

apresentam peptídeos virais associados com moléculas HLA de classe I. Linfócitos T

citotóxicos (CTLs) são linfócitos TCD8+ especializados que destroem células alvo

expressando proteínas estranhas; o hospedeiro usa essa arma efetora do sistema imune para

controlar patógenos intracelulares. Em resposta a proteínas novas “estranhas”, CTLs não

primados, que reconhecem os antígenos, são seletivamente ativadas, proliferam e se tornam

células “matadoras” funcionais. Muitas pessoas infectadas com o HIV produzem CTLs , as

quais estão presentes em alta frequência quando comparadas com CTLs específicas em

outras infecções virais. Contudo, apesar da presença de níveis detectáveis de CTLs ativadas

na circulação periférica , a replicação viral permanece. (revisto por Hogan et al., 2001)

Pessoas que são infectadas com o HIV expressam uma ampla e produtiva resposta

CTL específica (Dalod et al., 1999), e essa resposta desempenha um significante papel no

controle da infecção pelo HIV no hospedeiro. Na infecção primária, o desenvolvimento de

uma resposta CTL específica para o HIV está correlacionada com o controle da viremia

(Koup et al., 1994; Borrow et al., 1994). Uma alta frequência de CTLs durante a infecção

primária tem sido associada a baixa viremia e lenta diminuição nas contagens de linfócitos

TCD4+. Além disso, parece existir uma correlação inversa entre a freqüência da atividade

de CTLs e a carga viral plasmática em todos os estágios da infecção pelo HIV (Ogg et al.,

8

1998; Greenough et al., 1997). Uma associação entre a amplitude de resposta de células

TCD8+ anti-HIV e uma melhora no estado clínico parece também existir (Dalod et al.,

1999; Pantaleo et al., 1997). Macacos Rhesus infectados com o vírus da imunodeficiência

símia (SIV), que foram depletados de células TCD8+ com o uso de anticorpos monoclonais

anti-CD8, mostraram um significante aumento da viremia durante a infecção aguda e

crônica por SIV, fornecendo evidências in vivo de que células TCD8+ desempenham um

importante papel na supressão da replicação de SIV (Schmitz et al., 1999; Jin et al., 1999).

Outro aspecto da imunidade celular específica ao HIV é a resposta de células T

helper, importante na manutenção das respostas de células TCD8+ em outras infecções

virais persistentes (Zajac et al., 1998; Matloubian et al., 1994). As células TCD4+ helper

são ativadas quando se ligam a epítopos virais apresentados no contexto das moléculas

MHC de classe II. Uma vez ativadas, elas secretam IL-2 e outras citocinas que aumentam a

resposta CTL e humoral. Além disso, precursores CTL parecem ser dependentes da

presença da função T-helper (Kalams et al., 1999). Assim, ambas as células T helper e

CTLs parecem ser vitais no controle da progressão da infecção pelo HIV, e a persistência

de CTLs funcionais parece depender em parte da preservação da resposta de células T

helper. Altos níveis de CTLs em pessoas com imunossupressão progressiva, podem ser

parcialmente efetivos, em parte devido a falta de uma resposta T helper eficiente; essa idéia

pode ajudar a explicar a habilidade do HIV em replicar ativamente frente a uma vigorosa

resposta CTL.(revisto por Hogan et al., 2001).

Indivíduos infectados com o HIV-1 apresentam elevados marcadores de ativação

e/ou apoptose nas células TCD4+ e TCD8+ (Groux et al., 1992; Meyaard et al., 1992;

Gougeon et al., 1993; Finkel et al., 1995), assim como nas células B, células NK e

monócitos. Altos níveis de citocinas pró-inflamatórias, como o fator de necrose tumoral

alfa (TNF-α), interleucina 6 (IL-6) e interleucina 1 beta (IL-1β) no plasma e nos

linfonodos, são também observados nos estágios iniciais da infecção (Emilie et al., 1990;

Birx et al., 1990; Lafeuillade et al., 1991). A secreção de quimiocinas como MIP-1α, MIP-

1β e RANTES é aumentada nesses pacientes (Canque et al; 1996., Cotter et al., 2001). O

grau de ativação de células T, medidos com a expressão do marcador de ativação CD38 em

células TCD8+, foi associado a um prognóstico adverso em pacientes infectados (Giorgi et

al., 1993; Liu et al., 1998; Giorgi et al., 1999), sugerindo, assim, que pode existir uma

9

correlação direta entre a progressão da doença e graus de ativação de células TCD8+

(Hazenberg et al., 2003; Deeks et al., 2004; Wilson et al., 2004).

Seres humanos infectados com o HIV, assim como Macacos Rhesus infectados pelo

SIV sofrem progressiva depleção de células TCD4+ e evolução para a AIDS, e são

caracterizados por uma intensa ativação de células T. Por outro lado, Sooty mangabeys

infectados com SIV e macacos verdes africanos, os hospedeiros naturais do SIV e que não

desenvolvem qualquer imunodeficiência, exibem ativação celular mínima apesar da

evidência de replicação viral (Silvestri et al., 2003). Muitos indivíduos infectados com o

HIV-2 mostram uma progressão moderada ou lenta para a doença e morrem devido a

causas não relacionadas ao HIV-2. Além da baixa carga viral e respostas imunes robustas

(Leligdowicz et al., 2007), eles usualmente exibem ativação imune significativamente

menor quando comparados com indivíduos infectados com o HIV-1 (Sousa et al., 2002).

Durante a infecção pelo HIV o estabelecimento da ativação imune e inflamação

envolve muitos mecanismos que estão diretamente ou indiretamente relacionados com a

replicação viral. A causa comum da ativação de células T durante a infecção é a

estimulação antigênica pelo vírus, o qual cria a resposta imune adaptativa. Durante a

infecção primária, o HIV-1 induz intensas respostas de células T, em particular de células

TCD8+, as quais podem persistir durante a fase crônica da infecção devido a contínua

replicação do vírus (revisto por Appay et al., 2008). Mais de 20% das células TCD8+

circulantes podem ser específicas ao HIV em pacientes infectados cronicamente não

tratados (Betts et al., 2001; Papagno et al., 2002). Respostas de células TCD4+ específicas

ao HIV são normalmente presentes em baixa magnitude (mais de 3% de células TCD4+

circulantes) (Betts et al., 2001), as quais podem estar relacionadas com a depleção

preferencial destas células pelo vírus (Douek et al., 2002).

No entanto, a extensão da ativação durante o curso da infecção é tal que a

estimulação unicamente com os antígenos do HIV não pode contar para o fenômeno

completo da ativação imune observado (Appay et al., 2008). Produtos gênicos do HIV

podem induzir diretamente a ativação de linfócitos e macrófagos, e a produção de citocinas

e quimiocinas pró-inflamatórias. Por exemplo, a proteína do envelope a gp120 pode ser

capaz de ativar células ou aumentar sua responsividade a ativação, mesmo na falta de

infecção direta, através da ligação a CD4 ou a co-receptores (Rieckmann et al., 1991; Lee

10

et al., 2003). A proteína acessória Nef é também capaz de levar a ativação linfocitária

diretamente (Wang et al., 2000; Simmons et al., 2001) ou através da infecção de

macrófagos (Swingler et al., 1999).

A depleção massiva de células TCD4+ (e possivelmente macrófagos e células

dendríticas) pelo HIV-1 nos tecidos linfóides de mucosa pode resultar na destruição de

diferentes componentes imunes que constituem a barreira mucosa do intestino, essa barreira

normalmente previne a translocação da flora que habita o trato intestinal e restringe esses

patógenos a lâmina própria e aos linfonodos mesentéricos. O comprometimento da sua

integridade pode, portanto, resultar na translocação microbiana do intestino para o sistema

imune sistêmico (Brenchley et al., 2006). A infecção pelo HIV-1 está associada com um

significante aumento nos níveis de LPS plasmático, um indicador de translocação

microbiana, a qual está diretamente correlacionado com medições de ativação imune

(Brenchley et al., 2006). A translocação de produtos bacterianos resulta na profunda

ativação da resposta imune inata: LPS, flagelina e CpG DNA, os quais são ligantes de

receptores toll (TLR), e são conhecidos por estimular diretamente macrófagos periféricos e

células dendríticas a produzir citocinas pró-inflamatórias (TNF-α, IL-6 e IL-1β). O

resultado pode ser a ativação sistêmica e a diferenciação de linfócitos e monócitos e o

estabelecimento do estado pró-inflamatório.

Uma conseqüência direta da ativação de células T é o aumento dos níveis do fator

nuclear intracelular NF-κB, o qual aumenta a transcrição do vírus integrado e a produção

de novos virions que podem infectar novos alvos. Um ciclo vicioso é estabelecido, durante

o qual a replicação do HIV-1 promove a ativação imune (ativação de células T) e a ativação

imune promove a replicação do HIV-1. Citocinas pró-inflamatórias liberadas participam

também dessa cascata: a ação sinérgica de IL-1β, TNF-α e IL-6 pode levar à ativação de

células T (Decrion et al., 2005); além disso, IL-1β e TNF-α podem também diminuir a

resistência trans-epitelial nos tecidos da mucosa (Stockmann et al., 2000), promovendo a

translocação microbiana e ativação. A ativação de células T implica também no seu

“turnover”, ocorrendo a diferenciação de células não primadas em células que tiveram

experiência com o antígeno, e apoptose.

A dinâmica de ativação, expansão e apoptose parece diferir entre células TCD4+ e

células TCD8+ (Ferreira et al., 2000; Homann et al., 2001; Foulds et al., 2002). Células T

11

CD8+ sofrem extensiva expansão sob ativação e podem estabelecer um pool estável de

células T de memória em repouso. Por outro lado, a capacidade das células TCD4+ em

expandir e sobreviver parece ser menor, e a vasta maioria das células TCD4+ ativadas

entram em apoptose rapidamente. Durante a infecção crônica, a freqüência de células

TCD4+ circulantes infectadas é muito baixa (0,01-1%) o que conta para o declínio de

células TCD4+ no sangue periférico (Haase et al., 1996; Lassen et al., 2004). Enquanto a

infecção e depleção de células T no sítio da mucosa podem eventualmente contar para esse

declínio, a apoptose induzida por ativação é considerada a maior causa de perda de células

TCD4+ periféricas em pacientes infectados com o HIV-1 (revisto por Appay et al., 2008).

Eventos durante a infecção primária fornece evidências de que a imunidade humoral

pode não desempenhar um papel significante na prevenção ou no controle da infecção.

Anticorpos contra o HIV começam a aparecer dentro de duas a três semanas após a

infecção, mas a replicação viral persiste apesar desse evento. A maioria dos anticorpos

iniciais são produzidos para componentes do envelope, proteínas gp120 e gp41 e não são

neutralizantes, porque os imunógenos estão escondidos dentro da estrutura interna do vírus

ou estão “mascarados” por glicosilação. Anticorpos efetivamente neutralizantes com

atividade restrita são normalmente formados uma vez na infecção, e anticorpos

neutralizantes com ação ampla não ocorre antes da etapa tardia da infecção (Pilgrim et al.,

1997; Wyatt et al., 1998; Moog et al., 1997; Wyatt et al., 1998).

Além do efeito neutralizante dos anticorpos, outras funções podem desempenhar um

papel importante. Por exemplo, anticorpos na presença do complemento podem lisar

virions (Sullivan et al., 1996). Citólise mediada por célula dependente de anticorpo, um

método de eliminar células infectadas com vírus, pode estar correlacionada com o controle

da viremia durante a infecção aguda (Connick et al., 1996).

As células dendríticas parecem desempenhar um papel crítico na infecção inicial de

mucosa (Spira et al., 1996; Zoeteweij et al., 1998; Hu et al., 2000; Steinman et al., 2000).O

papel normal das células dendríticas é capturar antígenos nos tecidos periféricos e os

transportar para os linfonodos, aonde eles ativarão as células T e assim estimularão a

imunidade primária e secundária. Contudo, o HIV pode explorar a função normal das

células dendríticas. A proteína de membrana DC-SIGN, uma proteína presente nas células

dendríticas que facilita o contato inicial destas células com as células T em repouso pode

12

também se ligar a glicoproteína do envelope do HIV-1. A DC-SIGN presente nas células

dendríticas pode capturar o HIV, transportá-lo até os linfonodos sem promover sua entrada

ou sua replicação, e apresentar o HIV a células T ativadas, assim facilitando a infecção de

células T pelo HIV (Geijtenbeek et al., 2000).

Células dendríticas plasmocitóides (pDCs) produzem grandes quantidades de

interferons do tipo 1 após sua estimulação com partículas infecciosas e não infecciosas do

HIV-1. O IFN-α induz a expressão de formas secretadas e de membrana, do ligante indutor

de apoptose associado ao TNF (TRAIL) pelas células TCD4+. Coincidentemente, os

vírions do HIV-1 regulam positivamente a expressão do receptor de morte DR5 nas células

TCD4+. A interação de TRAIL com o DR5 induz a apoptose seletiva de células TCD4+

mas não de células TCD8+, fornecendo uma outra hipótese para a depleção seletiva de

células TCD4+ além da via Fas-FasL e da ativação que induz a morte celular, que

sozinhas não poderiam explicar essa depleção dos linfócitos CD4+ (revisto por Hel et al.,

2006).

I.2. Patogênese da infecção pelo Mycobacterium tuberculosis

A tuberculose humana (TB) é uma doença infecciosa e contagiosa causada

principalmente pelo Mycobacterium tuberculosis, uma bactéria patogênica e aeróbia que

estabiliza sua infecção normalmente nos pulmões. A progressão da infecção pelo M.

tuberculosis é fundamentalmente regulada pela integridade do sistema imune do

hospedeiro, o qual pode ter êxito através da imediata eliminação microbiana e/ou latência,

ou falha resultando no desenvolvimento de doença ativa (Ducati et al., 2006).

Globalmente, a tuberculose (TB) representa aproximadamente nove milhões de

novos casos da doença e três milhões de mortes todos os anos (WHO., 2007). A

tuberculose é uma doença que está relacionada com a pobreza, e 90% dos casos ocorrem

em países em desenvolvimento (WHO., 2007).

A infecção de M. tuberculosis ocorre através da inalação de perdigotos de secreções

respiratórias de pessoas com doença pulmonar ativa (casos positivos de escarro). A rota de

entrada do bacilo é normalmente através do trato respiratório. A infecção pode resultar na

13

indução da resposta imune do hospedeiro levando a contenção da doença (infecção latente).

A infecção latente é uma fase que o hospedeiro abriga a infecção, mas não apresenta sinais

ou sintomas da doença (Abebe et al., 2007)

Se o hospedeiro é incapaz de conter o bacilo, os organismos se multiplicarão e

crescerão após a infecção e a doença clínica pode se desenvolver em aproximadamente 5-

10% dos indivíduos infectados. A doença que se desenvolve durante os primeiros cinco

anos após a infecção primária é classificada como TB primária. Ela pode ocorrer após a

infecção primária, ou após a cura da doença primária (Abebe et al., 2007)

Qualquer TB pulmonar diagnosticada 5 anos após a infecção primária é classificada

como TB pós primária. A TB pós primária ocorre na maioria dos casos em adultos e idosos,

e pode desenvolver-se de uma reativação endógena de uma infecção latente ou de uma re-

infecção exógena (Abebe et al., 2007).

A infecção de M. tuberculosis pode resultar em um amplo espectro de doenças que

se encontram fora dos pulmões (TB extrapulmonar). A forma mais comum de TB

extrapulmonar é a TB linfática. Outras formas de TB extrapulmonar incluem: pleural,

meninges, pericardial, esqueletal, gastrointestinal, geniturinária e TB miliar (Abebe et al.,

2007).

A resposta imune protetora anti-micobacteriana envolve linfócitos T ativando

macrófagos e suas funções microbicidas através da liberação de IFN-γ (Flynn et al., 2001).

Isso leva a formação de granulomas, cruciais para a contenção da micobactéria.

Macrófagos/células dendríticas são encontrados no centro desses granulomas, em conjunto

com as micobactérias rodeadas por linfócitos T, os quais fornecem a ativação apropriada

(Nicod et al., 2007).

A primagem de linfócitos T contra antígenos micobacterianos ocorre no linfonodo

de drenagem proximal e conta com um subgrupo particular de células fagocíticas, as células

dendríticas. As células dendríticas têm a habilidade de ativar linfócitos naive após sua

migração dos sítios infecciosos. As células dendríticas capturam o antígeno e os levam para

os linfonodos, onde expressam altas quantidades de moléculas de apresentação, como MHC

I ou MHC II, assim como moléculas co-estimulatórias como CD80 e CD86, e fatores

solúveis como IL-12, IL-18 ou IL-23 (Mellman et al., 2001).

14

O M. tuberculosis invade as células dendríticas após a ligação a lectina específica de

células dendríticas (DC-SIGN). O receptor do complemento 3 (CR3) e os receptores de

manose, os quais são os principais receptores de M. tuberculosis em macrófagos, parecem

desempenhar um papel menor, se algum, na ligação da micobactéria as células dendríticas

(Tailleux et al., 2003). O lipoglicano lipoarabinomanana (LAM) é identificado como

ligante chave de DC-SIGN. Parece que o HIV é capturado pelo mesmo receptor DC-SIGN

(Geijtnbeek et al., 2000).

A habilidade de células TCD4+ e TCD8+ de eliminar patógenos intracelulares tem

sido mostrada ser dependente da sua capacidade de atrair células infectadas, assim como,

da secreção de moléculas efetoras citolíticas e anti-microbianas. Células TCD8+ podem

liberar quimiocinas como CCL5, que eficientemente atrai macrófagos infectados com a

micobactéria (Stegelmann et al., 2005). As células NK (natural killer) são também

bactericidas contra a micobactéria. Esses linfócitos “killer” podem ser ativados na presença

de antígenos estranhos, mesmo quando as células apresentadoras de antígeno estão

ausentes. Essas células são efetores imunes inatos que produzem citocinas imuno-

regulatórias, as quais, são críticas para a defesa inicial do hospedeiro contra patógenos

virais, bacterianos e parasitas (Nicod et al., 2007).

IFN-γ e monocinas como a IL-15 e IL-18 desempenham um papel crucial na

regulação de células TCD8+ contra a infecção por M. tuberculosis pelas células NK. As

células NK aumentam também a função das células Tγδ, outro tipo de linfócito, que

desempenham um papel na resposta imune contra a micobactéria (Zhang et al., 2006).

Essas células são citolíticas e podem potencialmente destruir o M. tuberculosis, além de

serem potentes secretoras de IFN-γ e ativadoras de macrófagos.

Monócitos resting ou macrófagos não podem matar ou inibir o crescimento da

micobactéria. Sua ativação requer a liberação de um número de citocinas pelos linfócitos,

como IL-2, IFN-γ ou TNF. IFN-γ regula positivamente uma variedade de funções dos

macrófagos, incluindo produção de TNF, espécies tóxicas do oxigênio e óxido nítrico pela

indução da óxido nítrico sintase. O TNF não inibe o crescimento da micobactéria, mas pode

ser mais importante que o IFN-γ em induzir atividade bactericida do macrófago humano

(Nicod et al., 2007). O TNF é o fator chave nas defesas do hospedeiro contra infecções

15

micobacterianas. O TNF age como um segundo sinal para a ativação de célula T, assim

como, para a ativação de macrófagos.

Apesar dos anticorpos contra o M. tuberculosis não permitirem a transferência da

imunidade contra a tuberculose, eles mostram ter um papel na opsonização e, assim,

aumentam a fagocitose pelos macrófagos ou ações citolíticas de linfócitos NK. Anticorpos

específicos para a micobactéria parecem capazes de aumentar ambas as respostas imunes

mediadas por células e a inata contra a micobactéria. É possível que a falta desses

anticorpos no estágio tardio da AIDS possa favorecer a disseminação de micobactérias

atípicas, como as pertencentes ao complexo do Mycobacterium avium.

Muitos antígenos micobacterianos estão sendo utilizados na fabricação de vacinas

contra o M. tuberculosis, devido à sua capacidade de estimular respostas imunes protetoras.

Um dos antígenos de maior importância é a proteína secretada ESAT-6, a qual está presente

somente em M. tuberculosis e M. bovis. Estudos com modelos animais mostraram que o

ESAT-6 induz respostas fortes de células T em camundongos, conferindo imunidade

protetora contra o MTB. Essa proteína é utilizada também para diagnóstico, pois o PPD não

consegue distinguir entre a infecção por M. tuberculosis e a sensibilização após a vacinação

por BCG (Harboe., 1996).

O 38 kDa é uma lipoproteína exposta na superfície micobacteriana e também é

utilizada em testes comerciais e na fabricação de vacinas. Esse antígeno é utilizado em

combinação com outros antígenos para detectar respostas específicas ao MTB, além de ser

utilizado com um indicador de doença ativa e induzir resposta proliferativa de células T

(Mehra., 1996).

O antígeno micobacteriano CFP-10 também induz a produção de IFN-γ, sendo

utilizado para o diagnóstico de tuberculode latente.

I.3. TARV e Reconstituição Imune

A introdução dos inibidores de protease e dos inibidores da transcriptase reversa não

nucleosídeos (INNTR) nos regimes terapêuticos antiretrovirais em 1996 iniciou a era da

terapia antiretroviral altamente ativa (TARV). A implementação de TARV resultou em uma

redução na morbidade e na mortalidade em pessoas infectadas com HIV (Palella et al.,

16

1998). Apesar dos benefícios de TARV serem consideráveis, a sua administração não é tão

fácil. Muitas pessoas infectadas com HIV não toleram os efeitos tóxicos das drogas. A

aderência ao tratamento é difícil por causa do grande número de pílulas e regimes de

tratamento complicados. A aderência pobre ao tratamento leva a emergência de linhagens

virais resistentes às drogas, as quais são muito difíceis de serem tratadas.

Na maioria dos países do Sudeste Asiático e da África, a incidência e a prevalência

da infecção pelo HIV-1 continua a aumentar e ultrapassa a Europa e a América do Norte

(HIV Medicine., 2005). No entanto devido aos elevados custos da terapia antiretroviral e a

falta de infra-estruturas de saúde nestes países subdesenvolvidos, a utilização da TARV

ainda é muito limitada.

O desenvolvimento de TARV aumentou a sobrevida de pacientes infectados pelo

HIV. A TARV, através do controle da replicação viral, permite o

estabelecimento/manutenção da resposta imune contra uma grande variedade de patógenos

incluindo micobactéria, citomegalovírus, o vírus Epstein-Barr, os vírus da hepatite B e C e

Candida albicans, mas não para o HIV-1. (Shelburne et al., 2005; Rinaldo et al., 1999).

Estudos prévios dos efeitos de TARV demonstraram sua supressão rápida e potente da

viremia, acompanhado de aumento nas contagens de células CD4 circulantes com um

predomínio do fenótipo de células de memória (CD45RO), devido à redistribuição celular a

partir do tecido linfóide. Essa população de células é de vida-curta, porém, se a supressão

da replicação viral for mantida, ocorre um aumento constante de linfócitos não primados

(naive) (CD45RA), que reflete uma restauração da atividade tímica (Lipman et al., 2006).

Esse incremento nas populações linfocitárias resulta em um nítido declínio na prevalência

de infecções oportunistas em pacientes com HIV.

Após a iniciação da terapia anti-retroviral, a contagem de células TCD4+ periféricas

começa a aumentar, continuando por 3-5 anos pelo menos (Kaufmann et al., 2003). O

aumento inicial nas contagens de células TCD4+ é muito rápido e é normalmente

observado nos primeiros 3 a 6 meses (Ledergerber et al., 2004) . Esse aumento inicial conta

com uma redução na ativação de células T e primariamente consiste da liberação de células

TCD4+ de memória, aprisionadas no tecido linfóide (Bucy et al., 1999).Uma segunda fase

de aumento lento se segue, dirigindo as contagens estáveis de células TCD4+ por 4-6 anos

(Pakker et al., 1998). Durante essa segunda fase, linfócitos TCD4+ não primados,

17

provenientes do timo, assim como linfócitos TCD4+ de memória, contribuem para a

reconstituição do sistema imune (revisto por Battegay et al., 2006).

Os fatores que podem determinar as respostas de células TCD4+ são parcialmente

conhecidos e dependem de ambos o hospedeiro e o vírus. Variações individuais

consideráveis na reconstituição de linfócitos TCD4+ têm sido descritas. Em pacientes

infectados pelo HIV-1 com respostas virológicas excelentes e níveis contínuos de RNA

plasmático abaixo de 1000 cópias por mL, ter idade alta, duração longa da infecção e

baixas contagens de células TCD4+ no início representam importantes fatores de risco para

a manutenção de baixas contagens de células TCD4+ (Kaufmann et al., 2002; Kaufmann et

al., 2005 ).

Fatores que podem impedir uma recuperação completa de células TCD4+ incluem

aumento da patogenicidade viral ou certos fatores do hospedeiro como produção

insuficiente de linfócitos T pelo timo (Douek et al., 2003). Além disso, algumas co-

infecções como HIV/Hepatite C podem limitar a recuperação de células TCD4+, ao passo

que outras co-infecções como HIV/vírus GB parece aumentar as contagens de células

CD4+ (Willians et al., 2004; Tillmann et al., 2001; Greub et al., 2000; Rockstroh et al.,

2004; Rockstroh et al., 2005).

A fraca supressão da replicação do HIV-1 é o maior fator que impede a recuperação

de células CD4+, levando a um aumento da morte celular associada ao vírus e apoptose

(Hansjee et al., 2004; Douek et al., 2002). Se a carga viral não for completamente

suprimida, linhagens virais com reduzido “fitness” e patogenicidade podem emergir através

da pressão das drogas antiretrovirais (revisto por Battegay et al., 2006). A terapia anti-

retroviral efetiva é normalmente acompanhada por uma recuperação imunológica, aumento

das contagens de células CD4+ e declínio do RNA HIV-1.

I.4. Co-infecção HIV-1/Mycobacterium tuberculosis

Pacientes infectados com o HIV-1, em estado avançado de imunodeficiência ficam

mais suscetíveis a infecções oportunistas, como CMV (Cytomegalovírus), MAC (complexo

do Mycobacterium avium), Cryptococcus, entre outras. De fato, as doenças oportunistas

(OD) são as maiores causas de morte em pacientes com AIDS (Gadelha et al., 2002).

18

Entre as infecções oportunistas, a tuberculose é uma das mais freqüente em

pacientes infectados com o vírus da imunodeficiência humana (HIV) (Cahn et al., 2003).

No final de 2000, cerca de 11.5 milhões de pessoas infectadas com HIV mundialmente,

estavam co-infectadas com Mycobacterium tuberculosis. Cerca de 70% de pessoas co-

infectadas estão na África Subsariana, 20% no Sul da Ásia e 4% na América Latina e no

Caribe. (WHO., 2004) (Figura 1.2). Uma em cada 3 pessoas infectadas com HIV

mundialmente está co-infectada com o M. tuberculosis (Global Alliance for Tuberculosis

Drug Development., 2005)

Figura 1.2: Distribuição de adultos vivendo com HIV/TB até o fim de 2005. Figura adaptada do site da World

Health Organization. (http://www.who.int.en)

O HIV aumenta a suscetibilidade à infecção com M. tuberculosis e aumenta o risco

da progressão da infecção por M. tuberculosis para a doença. Esse risco aumenta na medida

em que aumenta o estado de imunossupressão. Comparado com um indivíduo não infectado

com HIV, uma pessoa infectada com HIV tem risco 10 vezes maior de desenvolver TB

(uma em cada 3 pessoas morrem de TB) (WHO., 2004).

Sem relatório 0-24

25-49 50-99

100 ou mais

Casos notificados de TB (novos e recaída) por 100 000 habitantes

Casos notificados de tuberculose , 2005

19

Os efeitos prejudiciais de TB no curso da infecção por HIV têm sido mostrados em

muitos estudos (WHO., 2004). Pacientes com MTB têm alta carga viral plasmática de HIV-

1 e progressão mais rápida da doença do HIV, quando comparados com pacientes sem

MTB. A mortalidade nos pacientes co-infectados com HIV e com MTB é duas vezes maior

do que em pacientes infectados com HIV sem MTB (Whalen et al., 1995). Nessa população

muitas mortes são causadas pela progressão na doença do HIV, mais do que pela MTB.

Assim, pacientes positivos para HIV com MTB enfrentam um maior risco de contrair

outras doenças oportunistas. O IFN-γ desempenha um papel central em mediar defesas

imunes humanas contra a TB. Essa citocina (produzida por células TCD4+) ativa

macrófagos para inibir o crescimento intracelular da micobactéria. Pessoas com defeitos

genéticos, resultando na redução da produção de IFN-γ ou uma falha na resposta ao IFN-γ,

desenvolvem doenças sérias e fatais causadas por micobactérias. Devido à infecção por

HIV causar depleção seletiva de células TCD4+, a infecção progressiva por HIV está

associada à redução da capacidade de células T de produzir IFN-γ.

Após a falha da resposta imune inata em prevenir a infecção por M. tuberculosis, a

resposta mediada por células se desenvolve. IL-12 e IL-2 dirigem a expansão clonal de

linfócitos T CD4+ que secretam IFN-γ, que atua como um potente ativador de macrófagos.

Quimiocinas como a IL-8, e citocinas pró-inflamatórias, como o TNF-α, facilitam o

recrutamento e ativação de células mononucleares, respectivamente (DiPerri et al., 1998).

Macrófagos infectados e células dendríticas processam e apresentam antígenos

micobacterianos e virais a células TCD4+ e TCD8+ e a outros subgrupos de linfócitos

como células T regulatórias, γδ e células NK (natural killer). Peptídeos processados junto

com IL-12 derivada de macrófagos ou células dendríticas favorecem a diferenciação das

células T em células T de perfil Th1 e a secreção de IFN-γ, IL-2 e TNF-α, os quais

acredita-se ter papel protetor (Salgame et al., 2005). Apesar das células dendríticas serem

cruciais na produção de uma resposta imune adaptativa efetiva, devido a sua habilidade em

carrear antígenos aos tecidos linfóides onde ocorrem as interações com as células TCD4+,

tem sido descrito que a molécula de adesão específica de células dendríticas DC-SIGN

facilita a infecção de células T (Geijtenbeek et al., 2000; McDonald et al., 2003; van

Kooyk et al., 2003).

20

A micobactéria também libera moléculas que interagem com as células dendríticas e

macrófagos através do DC-SIGN e isso tem sido mostrado estimular a secreção de citocinas

anti-inflamatórias (IL-10), levando a supressão da função das células dendríticas e sua

maturação (Kaufmann et al., 2003). Isso pode ter conseqüências severas no caso da co-

infecção HIV/MTB; o efeito conjugado de dois patógenos pode supostamente aumentar não

somente a transinfecção de células T dependente de células dendríticas, como minimizar a

habilidade do hospedeiro em responder adequadamente aos patógenos, levando a um

aumento da sua sobrevivência e disseminação (revisto por Siawaya et al., 2007).

O desenvolvimento de granulomas fornece o ambiente crítico dentro do qual o

hospedeiro limita a infecção por M. tuberculosis.

O granuloma é caracterizado pela ativação e diferenciação epitelióide de

macrófagos e desenvolvimento de células de Langerhans multinucleadas. Linfócitos T

CD4+ localizados dentro da periferia do granuloma têm um papel crítico em dirigir as

funções imunes mediadas por células. O desenvolvimento de hipersensibilidade retardada

(DTH) leva à formação de necrose central caseosa, que inibe o crescimento extracelular

bacilar (Phillips et al., 1998). Contudo, a falha em limitar a replicação da micobactéria

resulta em expansão da inflamação e destruição tecidual. A doença clínica subsequente é

diretamente atribuída ao dano tecidual local e sistêmico provocado pela resposta

inflamatória do hospedeiro ao patógeno existente (Phillips et al., 1998). Assim, a supressão

da resposta do hospedeiro causada pela co-infecção HIV/MTB leva a uma perturbação da

imunopatologia da tuberculose.

A co-infecção HIV/MTB perturba a resposta imune mediada por célula ao M.

tuberculosis, prejudicando o recrutamento e a função das células efetoras chaves

envolvidas: macrófagos e células TCD4+ (Bartley et al., 1999). Embora a infecção do

HIV-1 seja principalmente caracterizada pela progressiva e generalizada linfocitopenia de

células TCD4+, linfócitos TCD4+ são também funcionalmente limitados. A IL-2 que

medeia a ativação e proliferação de linfócitos TCD4+ é inibida, e o desenvolvimento da

AIDS está associado com o aumento da secreção de citocinas do tipo 2, imunoregulatórias,

e a diminuição da secreção de citocinas do tipo 1. Essas mudanças na secreção de citocinas

reforça o “braço” humoral do sistema imune e inibe a função imune mediada por célula.

21

TNF-α e IFN-γ são as citocinas chaves na formação do granuloma que contém a

infecção da MTB; contudo, citocinas pró-inflamatórias e especialmente TNF-α podem, em

excesso, levar a uma severa destruição tecidual e necrose (Sharma et al., 2005). A

tuberculose latente é baseada no balanço entre respostas protetoras (pró-inflamatórias) e

respostas supressoras (anti-inflamatórias) para limitar a imunopatologia. A ativação

dominante de células Th1 está sob a regulação de outros subgrupos de células T. Grupos de

células Th2 secretam IL-4, IL-10 e IL-13 e assim inibem a resposta pró-inflamatória

mediada por células Th1 e a resposta destrutiva para o tecido. Células T regulatórias

CD4+CD25+ favorecem a liberação de citocinas do tipo Th2, promovendo um feedback

negativo das células Th1 (Guyot-Revol et al., 2006). A secreção de IL-4 em pacientes com

TB ativa está associada à atividade de células Th2 (Kidd et al., 2003). Existem evidências

de que o aumento da secreção de IL-4 aumenta a toxicidade do TNF-α e fibrose, e promove

a apoptose mediada por TNF-α em linfócitos ativados pelo MTB. A IL-4 está envolvida na

imunopatologia da infecção pelo MTB e sua presença tem sido associada com a extensão

da doença (Dheda et al., 2005; Ordway et al., 2005; Seah et al., 2001).

Estudos de co-infecção HIV/MTB têm mostrado que o turnover de células T

induzidas por MTB acelera a progressão da infecção assintomática pelo HIV para a AIDS

por causar a replicação viral (Goletti et al., 1996; Nakata et al., 1997) e induzir morte

celular programada nos linfócitos T através de vias dependentes de TNF-α (Herbein et al.,

2000). O subsequente aumento da carga viral leva a uma alterada função celular imune

(Clerici et al., 1993), além da infecção e depleção de células T (Jones et al., 1994). A

subsequente imunidade celular fraca e a perda da produção de citocinas pró-inflamatórias

levam a desintegração do granuloma, ou a inabilidade de formar granulomas, e mesmo a

morte (Dheda et al., 2004; Jones et al., 1994). Em indivíduos com tuberculose latente, a

progressiva depleção de células TCD4+ causada pela atividade do HIV aumenta a

probabilidade de reativação do MTB e doença (Bonecini-Almeida et al., 1998).

Devido a esses mecanismos, a imunodeficiência progressiva associada ao HIV

resulta na não formação do granuloma e no aumento da carga micobacteriana em tecidos

infectados. Além disso, por uma variedade de mecanismos, a ativação imune nos sítios da

doença micobacteriana amplifica o impacto local da infecção pelo HIV-1 (Behrens et al.,

2000). Como resultado, a co-infecção HIV/MTB altera as características clinicopatológicas

22

da tuberculose (Bartley et al., 1999). A enfraquecida resposta inflamatória do hospedeiro

resulta na diminuição do dano tecidual e aumento na probabilidade de infecção disseminada

multibacilar. Assim, pacientes com AIDS podem desenvolver infecção micobacteriana

ativa com alta carga bacilar, mas com poucos sintomas clínicos ou sinais de doença (Lawn

et al., 2005). Pacientes infectados com HIV tem um risco aumentado para episódios

secundários de TB de uma re-infecção exógena (Cahn et al., 2003).

I.5. Síndrome Inflamatória da Reconstituição Imune (IRIS)

Desde sua introdução, a TARV tem levado a um significante declínio na

mortalidade e morbidade associadas à AIDS (Palella et al., 1998). Esses benefícios são, em

parte, resultado de uma recuperação parcial do sistema imune, manifestada pelo aumento

nas contagens de linfócitos T CD4+ e diminuição da carga viral plasmática do HIV-1 (Gea-

Banacloche et al., 1999).

Entretanto, para certos pacientes que recebem TARV, uma profunda reação

patológica inflamatória surge, tendo como alvo infecções tratadas previamente ou infecções

subclínicas. A resposta inflamatória pode resultar em um espectro de apresentações,

variando de uma piora clínica de infecções oportunistas ainda em tratamento, apresentação

atípica de infecções oportunistas ou tumores, até desordens autoimunes como a doença de

Graves. Esse fenômeno é descrito como reação paradoxal ou “síndrome inflamatória da

reconstituição imune” (IRIS) (Shelburne et al., 2005).

O reconhecimento da IRIS tornou-se amplo após a introdução de TARV nos anos

90. A chamada reação paradoxal foi bem descrita entre pacientes não infectados com HIV

tratados para a infecção por Mycobacterium tuberculosis (MTB). Uma piora clínica nesses

pacientes, em geral no início da terapia anti-MTB, foi atribuída a uma reversão da

imunossupressão induzida pela infecção por MTB e foi associada com a conversão de

testes cutâneos (PPD) de negativos para positivos. Reações inflamatórias durante o

tratamento são também descritas em pacientes infectados com Mycobacterium leprae.

Finalmente, a recuperação de células imunes, seguida de transplante da medula óssea ou

quimioterapia, tem sido claramente associada com um dano clínico para alguns pacientes

(Cheng et al., 2000).

23

A reação paradoxal pode ser definida como o dano clínico ou radiológico de lesões

tuberculosas preexistentes ou o desenvolvimento de novas lesões em pacientes que

inicialmente responderam a tratamento efetivo. Manifestações de reações paradoxais

podem ser sutis como febre, aumento discreto dos linfonodos, ou uma falha respiratória ou

ainda um dano neurológico (Lawn et al., 2005).

Teorias correntes sobre a patogênese da síndrome envolvem uma combinação de

carga antigênica, grau de restauração imune após o tratamento com TARV e

susceptibilidade genética do hospedeiro. Esses mecanismos patogênicos podem interagir e

provavelmente dependem da carga antigênica dos agentes infecciosos e não-infecciosos

(Murdoch et al., 2007).

Se provocada por um agente infeccioso ou não-infeccioso, a presença de um

estímulo antigênico para o desenvolvimento da síndrome parece ser necessário (Lipman et

al., 2006; Murdoch et al., 2007). Esse estímulo antigênico pode ser organismos “intactos”,

organismos clinicamente “silenciosos”, organismos mortos ou organismos em processo de

morte e seus antígenos residuais. A IRIS que ocorre como resultado de uma infecção

clinicamente silenciosa é caracterizada por uma inflamação atípica exuberante e/ou uma

apresentação clínica acelerada sugerindo uma restauração da imunidade específica ao

antígeno. Essas características diferenciam a IRIS de uma infecção oportunista incidente

que ocorre durante o tratamento com TARV como resultado de um atraso ou retardo da

imunidade adequada (Murdoch et al., 2007).

Um dos mecanismos mais importantes envolve a teoria de que a síndrome é

precipitada pelo grau de restauração imune seguida da TARV. Avaliando essa teoria,

pesquisadores têm examinado a associação entre as contagens de células T CD4+, a carga

viral plasmática e o risco para a IRIS. Alguns estudos sugerem diferenças nos perfis basais

de células T CD4+ ou a carga viral quantitativa no início da TARV ou sua taxa de mudança

durante a TARV entre pacientes IRIS e não IRIS (Breton et al., 2004; Shelburne et al.,

2005; Ratnam et al., 2006; Jevtovic et al., 2005; Puthanaki et al., 2006; Lipman et al.,

2006), enquanto outros estudos demonstram apenas tendências ou nenhuma diferença

significante entre pacientes IRIS e não IRIS (Narita et al., 1998; Navas et al., 2002;

Manosuthi et al., 2006).

24

Um mecanismo imunológico alternativo pode envolver mudanças qualitativas na

função dos linfócitos ou na expressão fenotípica dos linfócitos. Por exemplo, após o

tratamento com TARV um aumento das células TCD4+ de memória é observado (Autran et

al., 1997), possivelmente como resultado da redistribuição do tecido linfóide periférico

(Bucy et al., 1999). Esse fenótipo TCD4+ de memória é primado para reconhecer estímulos

antigênicos prévios, e assim pode ser responsável pelas manifestações de IRIS vistas logo

após o início de TARV. Após essa redistribuição, ocorre o aumento de células T não

primadas e isso parece ser responsável pelo aumento quantitativo posterior das contagens

de células T CD4+ (Pakker et al., 1998). Esses dados sugerem que a IRIS pode ser devida a

uma combinação de ambas, a restauração quantitativa da imunidade assim como a função

qualitativa e a expressão fenotípica observada após o início de TARV (Murdoch et al.,

2007).

Outra hipótese que discute a base imunológica da IRIS mostra que uma rápida

expansão clonal induzida por TARV e uma redistribuição de células T de memória

específicas para o M. tuberculosis (Autran et al., 1997) dirigem uma ativação imune

desregulada (Lawn et al., 2005) e uma “tempestade” de citocinas (Bourgarit et al., 2006). A

função imune desregulada pode ser a conseqüência da perda de populações celulares

derivadas do timo induzida pelo HIV (células T não primadas e células T regulatórias

naturais) que são restauradas em uma cinética lenta, quando comparadas com a população

de célula T de memória após TARV (Autran et al., 1997; Carcelain et al., 2001). Assim,

devido à falta de ocorrência de células T regulatórias naturais nos primeiros meses do

tratamento com TARV, existe uma expansão desregulada de células T de memória, levando

a uma “tempestade” de citocinas e o desenvolvimento de IRIS.

As células T regulatórias (CD4+ CD25+ FoxP3+) têm uma habilidade intrínseca em

regular negativamente a resposta imune e podem desempenhar um papel na IRIS. Essas

células T regulatórias são suscetíveis à infecção por HIV e seus números diminuem na

AIDS (Shelburne et al., 2005).

A terapia anti-retroviral também muda o balanço entre as respostas Th1 e Th2, o

qual leva a um aumento de IL-2 e IFN-γ, ambos dos quais tem propriedades pró-

inflamatórias (Imami et al., 1999; Kelleher et al., 1999; Lawn et al., 2005; Surjushe et al.,

2006). Assim, a IRIS ocorre em um ambiente no qual o sistema imune restaurou sua

25

atividade específica a micróbios, assim como, aumentou seu estado inflamatório (Shelburne

et al., 2003).

A habilidade do hospedeiro em formar granulomas é restabelecida durante a TARV.

Estudos de hipercalcemia durante a IRIS micobacteriana fornecem evidências indiretas que

a TARV restaura a habilidade de formar granulomas fisiologicamente funcionais (Douek et

al., 1998). Hipercalcemia é uma complicação bem reconhecida de infecção micobacteriana,

surgindo como resultado da produção de 1,25-dihidroxicholecalciferol em granulomas

funcionais. Elevadas concentrações no soro de 1,25-dihidroxicholecalciferol e

hipercalcemia durante a IRIS micobacteriana refletem a restauração da habilidade do

hospedeiro em formar granulomas fisiologicamente funcionais (Lawn et al., 2005).

Outro mecanismo patogênico da IRIS envolve a susceptibilidade genética do

hospedeiro, a uma resposta imune exacerbada a estímulos antigênicos infecciosos e não-

infecciosos sobre restauração imune. Embora as evidências sejam limitadas, alelos

específicos de HLA sugerem associações com o desenvolvimento de IRIS a patógenos

específicos (Price et al., 2001). Aumento nos níveis de IL-6 em pacientes com IRIS pode

explicar a exacerbada resposta Th1 a antígenos micobacterianos em indivíduos com IRIS

clínica (Bourgarit et al., 2006; Stone et al., 2002; Shelburne et al., 2003). Assim, a pré-

disposição genética pode parcialmente explicar porque as manifestações de IRIS diferem

nos pacientes com carga antigênica similar e respostas imunológicas a TARV.

A IRIS parece ter dois padrões de distribuição (French et al., 2004). A IRIS

“precoce” se apresenta durante os três primeiros meses de TARV e parece resultar em uma

resposta imune contra patógenos oportunistas viáveis, os quais estão geralmente presentes

como uma infecção subclínica. A IRIS “tardia” apresenta-se em um intervalo de meses a

anos após o início de TARV e parece resultar de uma resposta imune contra os antígenos de

patógenos oportunistas não-viáveis. Parece claro que a resposta imunopatológica a

diferentes patógenos tem mecanismos patológicos diferentes.

Alguns fatores de risco identificados para o desenvolvimento de IRIS incluem: sexo

masculino, um pequeno intervalo entre o início do tratamento para infecções oportunistas

(OI) e início de TARV, uma alta carga viral plasmática antes do início da terapia

(Hoffmann et al., 1999), uma rápida queda do RNA do HIV-1 após TARV, ser virgem de

TARV no momento do diagnóstico da OI (Shelburne et al., 2005). Uma infecção ativa ou

26

subclínica por patógenos oportunistas, ou antígenos de micoorganismos não-viáveis (CMV

ou cryptococcus) são todos possíveis alvos para uma resposta imunopatológica.

Outros prognósticos significantes têm também incluído idade baixa, baixa

porcentagem de células T CD4+ basais e baixa contagem de células T CD4+ no início de

TARV. Isso pode ser um marcador de uma alta carga de patógeno ou um aumento na

suscetibilidade devido a uma desregulação da imunidade durante a reconstituição imune.

Além da existência de genes de susceptibilidade a doença para algumas formas de IRIS

(French et al., 2004) e baixa relação CD4/CD8 basais (Ratnam et al., 2006; French et al.,

2000).

A tuberculose extra-pulmonar poderia ser um possível fator de risco para pacientes

co-infectados com HIV/TB. Pacientes com tuberculose extra-pulmonar teriam oito vezes

mais chances de desenvolverem IRIS (Manosuthi et al., 2006). A tuberculose disseminada

poderia também estar associada com a ocorrência de IRIS. Estudos prévios sugerem uma

alta freqüência de IRIS entre pacientes que apresentam ambas tuberculose pulmonar e

extra-pulmonar. A IRIS ocorre na maioria dos casos (83%) em pacientes com tuberculose

extra-pulmonar (Breton et al., 2004).

Outros fatores como, por exemplo, raciais poderiam desempenhar um papel

importante no fenômeno da IRIS (Manosuthi et al., 2006). Contudo, estudos feitos com

pacientes co-infectados com HIV/TB mostraram que não existe diferença de risco quanto a

idade de início da TARV, raça, contagem de células CD4, níveis de RNA de HIV-1 ou a

terapia anti-retroviral utilizada (Shelburne et al., 2005) para desenvolver IRIS. Porém os

homens têm um risco aumentado comparados com as mulheres.

As melhores associações descritas entre agentes infecciosos particulares e IRIS

incluem a doença do Cytomegalovirus (CMV), infecção com Mycobacterium tuberculosis

ou com o complexo do Mycobacterium avium, e com Cryptococcus neoformans. O M.

tuberculosis está entre os patógenos mais freqüentemente associados a IRIS (Shelburne et

al., 2002). O fato de que organismos micobacterianos e seus componentes da parede

celular persistirem nos tecidos do hospedeiro por semanas após a iniciação do tratamento

anti-micobacteriano é provavelmente um importante fator que contribui para a alta

freqüência do desenvolvimento de IRIS em associação com esse grupo particular de

organismos (Lawn et al., 2005). A descrição da IRIS em pacientes co-infectados com

27

HIV/MTB se tornou extremamente freqüente com a era da TARV (29-36%) (Lawn et al.,

2005). Classicamente, a IRIS ocorre em pacientes co-infectados com HIV e MTB, virgens

de tratamento anti-retroviral, com imunodeficiência avançada (AIDS), quando ambas as

terapias são iniciadas simultaneamente ou em um intervalo curto (Bourgarit et al., 2006).

Uma explicação plausível para o surgimento da IRIS seria que a abundância de

antígenos microbianos, vivos ou mortos, promoveria uma resposta imune exacerbada

elevada, quando encontrasse números aumentados de células funcionais ativas específicas

para o antígeno. Assim, a IRIS seria menos freqüente se TARV fosse adiada até uma

significante diminuição da carga do antígeno feita através de terapia antimicrobiana

específica (Lipman et al., 2006). A IRIS micobacteriana parece ser o resultado de uma

resposta de hipersensibilidade do tipo tardia e pode também estar associada com

polimorfismos nos genes que codificam diferentes citocinas fornecendo evidências de

diferentes tipos de resposta imune.

A associação entre um pequeno atraso entre o início do tratamento para a

tuberculose e o início da TARV é uma área de debate. Enquanto alguns pesquisadores não

acharam diferença no tempo de início do tratamento para tuberculose e da TARV entre

indivíduos IRIS e não IRIS (Breton et al., 2004), outros apontaram uma diferença

significante entre os grupos (Navas et al., 2002; Shelburne et al., 2005). Em geral, IRIS

ocorre em indivíduos que iniciaram TARV dentro de dois meses após o início da terapia

anti-MTB (Navas et al., 2002; Shelburne et al., 2003).

Alguns trabalhos mostram o aumento de sintomas respiratórios após o início da

terapia anti-MTB em combinação com a TARV (Chien et al., 1998; Kunimoto et al., 1999;

Orlovic et al., 2001). Em dois estudos de IRIS associada a micobactéria, a piora clínica

paradoxal ocorreu em aproximadamente 35% dos pacientes com infecções HIV/MTB

combinadas após o início de TARV durante a terapia anti-MTB (Narita et al., 1998; Navas

et al., 2002). Todos esses pacientes começaram TARV dentro de dois meses após o início

do regime TB (Navas et al., 2002).

Um estudo feito com pacientes co-infectados com HIV/MTB que receberam TARV

aproximadamente 1 semana após a terapia anti-MTB, mostrou uma exacerbação da resposta

Th1 específica para MTB, com eventos pro-inflamatórios durante a reconstituição imune

observada após a introdução da TARV. Além disso, um aumento do número de células

28

produtoras de IFN-γ específicas para PPD (utilizado em ensaios de ELISPOT para

quantificação das células produtoras de IFN-γ) após o início de TARV não difere entre os

grupos (IRIS + e IRIS-). Contudo, sua proporção aumenta notavelmente durante a IRIS

associada com uma produção aguda de citocinas e quimiocinas de perfil Th1 e pro-

inflamatórias, como IFN-γ, IL-2, IL-12, IP-10 e MIG. Além de TNF-α, IL-6, IL-1β, IL-10,

RANTES e MCP-1, sendo nenhuma citocina de perfil Th2 identificada (Bourgarit et al.,

2006). Uma excessiva restauração da resposta Th1 específica para o PPD com nenhum

balanço Th2 é responsável pelo aumento das lesões do granuloma e está associado com

uma liberação de citocinas pro-inflamatórias não-específicas agudas e quimiocinas

induzindo uma síndrome inflamatória sistêmica. Assim, parece que não ocorre um balanço

da resposta de célula T durante a IRIS. Isso pode ser observado em pacientes que

receberam terapia antiretroviral 6 meses após o início da terapia anti-MTB. Após um mês

de terapia antiretroviral a contagem de células CD4 em relação às células CD8 foi maior,

comparado com o grupo que não possuía IRIS (Breton et al., 2004). Em pacientes que

iniciaram TARV aproximadamente 27 dias após o início da terapia anti-MTB também foi

observado um aumento na contagem de células CD4 em relação às células CD8 (Shelburne

et al., 2005).

Entretanto, em alguns pacientes co-infectados com HIV/MTB que iniciaram TARV

após o diagnóstico de MTB e que desenvolveram IRIS posteriormente, foi observado que

um aumento na contagem de células CD4 após o início de TARV parece não estar

associado com a IRIS (Manosuthi et al., 2006). Em uma coorte de 180 pacientes, as

mudanças nas células CD4+ durante os primeiros 3 meses de TARV não esteve associada

com a ocorrência de IRIS, sugerindo que estudos com coortes maiores parecem ser

necessários para detectar mudanças imunológicas relacionadas a IRIS (Shelburne et al.,

2006).

A diminuição nos níveis de RNA do HIV-1 parece ter correlação com o

desenvolvimento de IRIS. Pacientes que desenvolveram IRIS têm reduções mais marcantes

dos níveis de RNA do HIV-1 que os pacientes que não desenvolvem IRIS (Shelburne et al.,

2005; Breton et al., 2004).

As reduções nos níveis de RNA do HIV-1 em resposta ao TARV resultam

inicialmente em uma redistribuição de linfócitos CD4 de memória. Essa redistribuição de

29

linfócitos CD4 ativados pode ser responsável pelas manifestações da IRIS, as quais podem

ser explicadas porque o aumento na contagem de células CD4 parece ser mais lento se

comparado com a diminuição da carga viral.

O polimorfismo nos genes de citocinas pode também estar associado com um

aumento na freqüência de IRIS em pacientes co-infectados com HIV/MTB, assim como o

HLA. Alguns alelos de genes de citocinas como TNFA-308*2 e IL-6-174*G participam da

IRIS de micobactéria (Lipman et al., 2006; Manosuthi et al., 2006). Além disso, fatores

genéticos diversos afetando o balanço Th1-Th2 poderiam determinar a predisposição ao

IRIS e sua severidade em várias infecções (Price et al., 2002).

A IRIS associada a micobactérias pode também resultar em um aumento do nível de

IL-6 no plasma, mas o efeito é transitório. As conseqüências metabólicas e imunológicas do

aumento da produção de IL-6 merecem mais atenção, porque podem contribuir para a

ativação imune persistente em pacientes com a replicação do HIV bem controlada por

TARV, assim como para a patogênese do diabetes tipo 2, a qual é reconhecida como uma

complicação “crônica” de TARV (French et al., 2004). Além disso, níveis altos de IL-6 no

soro poderia estar correlacionado com o aumento do linfonodo e formação de granuloma

(Bourgarit et al., 2006).

M. tuberculosis geralmente dissemina em pacientes com infecção pelo HIV;

portanto o processo inflamatório observado em IRIS associado aos MTB pode envolver

outros órgãos além do pulmão (Furrer et al., 1999; John et al., 1998). Quando a resposta

imune leva a inflamação no sistema nervoso central, o paciente pode ser severamente

afetado (Crump, et al., 1998).Um estudo de pacientes co-infectados tratados com TARV e

terapia anti-MTB, encontrou uma incidência de aumento paradoxal de tuberculomas do

SNC em 8,7% dos pacientes (Hollender et al., 2000).

As manifestações clínicas mais comuns da IRIS associada ao M. tuberculosis são

febre, linfadenopatia e piora de sintomas respiratórios (Lawn et al., 2005). Desordens

pulmonares, como novos infiltrados pulmonares, linfadenopatia do mediastino, e efusões

pleurais são também comuns (Narita et al., 1998). Apresentações extrapulmonares são

também possíveis, incluindo tuberculose disseminada com falha renal aguda associada

(Jehle et al., 2004), respostas inflamatórias sistêmicas (Furrer et al., 1999) ,tuberculomas

intracranianos (Crump et al., 1998), expansão de lesões do sistema nervoso central,

30

hepatoesplenomegalia, perfuração do intestino, osteomielite, nefrite, meningite (Surjushe et

al., 2006). Outros sintomas não específicos incluem: febre persistente, perda de peso e

piora dos sintomas respiratórios. A IRIS abdominal pode estar presente com dores

abdominais não específicas e icterícia obstrutiva.

A IRIS associada a M. tuberculosis parece ocorrer em duas fases distintas. A

maioria dos casos com envolvimento pulmonar, como linfoadenopatia ou efusões pleurais,

tem ocorrência dentro de poucas semanas do início de TARV. Em contraste, envolvimento

dos linfonodos extratorácicos, do intestino, ou do sistema nervoso central, parece ocorrer

após alguns meses de terapia, embora o número de casos seja pequeno (Shelburne et al.,

2003).

O tratamento para a IRIS associada a micobactéria, depende da apresentação e da

severidade da doença. Contudo, é importante a continuação da terapia primária contra o

patógeno a fim de diminuir a carga antigênica, a continuação de TARV e o uso criterioso

de agentes anti-inflamatórios (Shelburne et al., 2003). Como a patogênese da síndrome é

inflamatória, corticoesteróides ou drogas anti-inflamatórias (não esteroidais) podem aliviar

os sintomas. Em alguns estudos onde a terapia da IRIS foi mencionada, o uso de

corticoesteróides foi variável (Narita et al., 1998; Phillips et al., 1999; Orlovic et al., 2001;

Shelburne et al., 2005; Kumarasamy et al., 2004; Michailidis et al., 2005). A interrupção de

TARV é raramente necessária, mas pode ser considerada em situações de risco de vida,

como: encefalite, cerebrite e edema cerebral perilesional (Surjushe et al., 2006).

31

II. JUSTIFICATIVA

Embora a patofisiologia da IRIS não esteja ainda totalmente elucidada, existem

fortes evidências de que esta síndrome estaria associada com a restauração da resposta

imune de linfócitos T aos antígenos micobacterianos, ou por recirculação ou proliferação de

células de memória após a introdução da HAART e o controle da viremia plasmática

(Autran et al., 1997). Esta hipótese foi sustentada recentemente pelo mesmo grupo

(Bourgarit et al., 2006), que mostrou, em uma pequena casuística de indivíduos co-

infectados pelo HIV e o M tuberculosis, em início de tratamento para a tuberculose,

seguido de introdução da HAART, a ocorrência de IRIS em 37% (n=7) dos 19 indivíduos

incluídos no estudo. A IRIS foi caracterizada nestes pacientes pela exacerbação da resposta

de interferon gama ao PPD, medida através do ensaio de ELISPOT, associada com um

aumento na produção de outras citocinas Th1 e pro-inflamatórias, já demonstrado em outro

estudo (Stone et al., 2002), que evidenciou um alto nível de IL-6 sérico durante a IRIS.

Estas alterações imunológicas se correlacionam com o surgimento de sinais clínicos, tais

como o aumento dos linfonodos, sinais flogisticos locais e formação de granuloma,

sugerindo uma exacerbada restauração da resposta Th1 ao PPD. No seu conjunto, os

achados deste grupo (Bougarit et al., 2006) dão suporte ao uso de anti-inflamatórios

sistêmicos ou agentes imunossupressores nos casos graves de IRIS. No entanto, devido à

limitada casuística analisada, os próprios autores afirmam que estes resultados são ainda

preliminares, carecendo de confirmação com estudos de maior escala.

Diversos estudos na literatura apontam para o papel de diferentes subpopulações de

células T, assim como a produção de diferentes citocinas na fisiopatologia da IRIS, no

entanto, estes estudos são, de modo geral, limitados a pequenas casuísticas e retrospectivos

fatores que limitam o alcance dos resultados. O acompanhamento de coortes que permitam

uma melhor exploração das alterações imunológicas que ocorrem antes e durante a

ocorrência da IRIS poderia colaborar com um maior conhecimento e detalhamento deste

fenômeno. Assim, conforme recentemente discutido por Shelburne et al., 2006 ainda são

necessários estudos que procurem elucidar se a IRIS seria resultado de uma alta liberação

antigênica, de uma resposta excessiva mediada por um sistema imune em fase de

reconstituição, de uma produção exacerbada de citocinas pro-inflamatórias ou da ausência

32

de regulação imune devido à inabilidade de produção de citocinas regulatórias. Por outro

lado, genes associados com a susceptibilidade a diferentes aspectos da IRIS têm sido

identificados, incluindo a presença do alelo TNFA-308*2 com a tuberculose (Price et al.,

2002) e do HLA-B44 com a IRIS associada ao vírus herpético (Price et al., 2001).

Atualmente estamos conduzindo um ensaio clínico em pacientes co-infectados pelo

HIV e o M tuberculosis, virgens de tratamento anti-retroviral, que tem por objetivo avaliar

a eficácia terapêutica do inibidor de transcriptase reversa não-nucleosídico efavirenz em

duas dosagens (600 e 800 mg) no tratamento da AIDS associada à tuberculose com

esquemas que contenham rifampcina. Trata-se de um ensaio clinico aberto randomizado

para esses dois braços de tratamento e para o qual estão sendo recrutados 180 pacientes

soropositivos para o HIV-1, com diagnóstico confirmado de tuberculose, que serão

acompanhados do ponto de vista clinico e laboratorial por um período de 6-7 meses. Os

pacientes irão iniciar o acompanhamento pelo tratamento de primeira linha preconizado

para a tuberculose, entrando-se com o esquema anti-retroviral após 30 dias. Dados

publicados pelo grupo do Programa de Tuberculose do IPEC (Fernandes et al., 2000 e Serra

et al., IAS 2003 ) e outros ( Bougarit et al., 2006) têm apontado para a ocorrência de uma

exacerbação da resposta inflamatória, caracterizada como efeito paradoxal ou IRIS, em

cerca de 20-37% dos pacientes que iniciam o tratamento associado para a tuberculose e a

aids na presença de controle da carga viral plasmática e reconstituição da resposta imune,

com incremento nos níveis de linfócitos T CD4+ periféricos. A análise detalhada das

características dos pacientes antes do inicio do HAART e a evolução imunológica durante o

tratamento anti-retroviral em pacientes virgens de tratamento para o HIV (grupo onde

encontramos a maior incidência de IRIS), representa uma oportunidade única de se estudar

as alterações imunológicas associadas à reconstituição da resposta imune nos pacientes co-

infectados e, assim, identificar e caracterizar os possíveis mecanismos imunológicos

envolvidos para que estratégias clinicas possam ser traçadas para identificar os indivíduos

em risco e se possível prevenir a ocorrência da síndrome inflamatória associada à

reconstituição imune.

Assim, neste estudo estaremos avaliando o perfil de sub-populações de linfócitos T

em uma coorte de indivíduos com AIDS e tuberculose em resposta à terapia anti-retroviral.

A carga viral será também avaliada nestes indivíduos ao longo do estudo. Estes casos serão

33

selecionados para uma análise mais detalhada da resposta imune a antígenos de MTB

através do ensaio de ELISPOT. Serão também obtidos dados clínicos e sócio-demograficos

dos pacientes incluídos no estudo. No seu conjunto estas análises permitirão avaliar a

reconstituição da resposta imune nos pacientes co-infectados e os possíveis parâmetros

imunológicos envolvidos com a evolução para a IRIS.

34

III. OBJETIVOS

III.1 Objetivo Geral

Avaliar a reconstituição imune e a ocorrência de síndrome inflamatória aguda

(IRIS) em indivíduos co-infectados pelo HIV-1 e pelo Mycobacterium tuberculosis (MTB)

em resposta à terapia combinada antiretroviral e tuberculostática.

III.2 Objetivos Específicos

Quantificar as populações de linfócitos TCD3+CD4+ e TCD3+CD8+ em indivíduos

com tuberculose, infectados pelo HIV-1, em resposta à terapia específica (TARV-

tuberculostático), a fim de avaliar a reconstituição imunológica nesses indivíduos;

Avaliar a ativação celular durante o evento de reconstituição imune, através da

análise de moléculas associadas, como o CD38 em células TCD8+ e o HLA-DR em células

TCD3+ em indivíduos com tuberculose, infectados pelo HIV-1, em resposta à terapia

específica (TARV-tuberculostático) e nos indivíduos que apresentaram a síndrome

inflamatória aguda (IRIS);

Avaliar a carga viral plasmática em indivíduos com tuberculose, infectados pelo

HIV-1, em resposta à terapia específica (TARV-tuberculostático), avaliando o grau de

eficácia da mesma;

Avaliar a freqüência e a magnitude da resposta imune celular a antígenos de M.

tuberculosis, através do método de ELISPOT, em indivíduos com tuberculose, infectados

pelo HIV-1, em resposta à terapia específica (TARV-tuberculostático) observando como

ocorre o evento de reconstituição imunológica nesses indivíduos;

Avaliar se o grau de reconstituição imunológica promovido pela terapia anti-

retroviral pode estar envolvido no desenvolvimento da IRIS;

Descrever a ocorrência de síndrome inflamatória aguda (IRIS) em indivíduos com

tuberculose, infectados pelo HIV-1, em resposta à terapia específica (TARV-

tuberculostático), analisando possíveis fatores que possam estar envolvidos.

35

IV. METODOLOGIA

IV.1 Pacientes e Métodos

O presente estudo é um subprojeto do ensaio clínico “Estudo da eficácia, anti-

retroviral, tolerância e outras interações medicamentosas do análogo não nucleosídeo

efavirenz associado à rifampicina no tratamento de pacientes com AIDS e tuberculose”, do

Instituto de Pesquisa Clinica Evandro Chagas, aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa

com Seres Humanos (CEP-0002.0.009.000-07). Trata-se de estudo prospectivo

longitudinal, descritivo onde os pacientes são acompanhados clinicamente e através de

parâmetros laboratoriais imunológicos e moleculares, ao longo de seis meses de tratamento

para a tuberculose e para o HIV-1. O tratamento para a tuberculose e para o HIV-1

seguiram as normas do Ministério da Saúde (Ministério da Saúde.,2004).

Quinze indivíduos co-infectados com o HIV-1 e com a tuberculose foram incluídos

no estudo. Como critério de inclusão, os pacientes soropositivos para o HIV-1 deveriam ser

virgens de tratamento anti-retroviral, apresentar diagnóstico de tuberculose, ter a

quantificação de linfócitos TCD3+CD4+ <350/mm3 ou tuberculose disseminada e ter idade

superior a 18 anos. Os demais critérios de inclusão e exclusão do protocolo encontram-se

detalhados no Anexo I. Toda a condução clínica do protocolo foi realizada pela equipe

clínica do IPEC, sob a coordenação da Dra Valéria Rolla.

O estudo consistiu de uma entrevista para seleção de casos: pacientes com

tuberculose já em tratamento com o esquema I para tuberculose (Ministério da Saúde.,

2004) provenientes do Programa de Tuberculose do IPEC foram avaliados durante os 15

primeiros dias de tratamento tuberculostático (dia –15 para o início dos anti-retrovirais).

Posteriormente, foi realizada a consulta de inclusão no protocolo, quando ocorreu a

randomização (Dia 1) e introdução da terapia anti-retroviral (TARV), seguindo-se de um

período de tratamento com TARV e o esquema para tuberculose por 6 meses. Durante o

período de tratamento concomitante MTB-HIV, foram previstas as consultas nos dias 30,

60, 90, 120, 150 e 180 (esta última visita foi realizada quando o tratamento da tuberculose

já havia terminado). Consultas adicionais foram realizadas em caso de eventos adversos

(incluindo-se a IRIS) ou quando apareceram doenças associadas ao HIV/AIDS.

36

Todos os indivíduos foram tratados para o HIV-1 com dois inibidores da

transcriptase reversa análogos de nucleosídeos lamivudina e zidovudina, e com um inibidor

da transcriptase reversa não análogo de nucleosídeo, o efavirenz. Destes, oito pacientes

tomaram a dose de efavirenz de 600mg e sete pacientes tomaram a dose de 800mg. Todos

os pacientes foram tratados para a tuberculose com o esquema I para tuberculose que

contém rifampicina, isoniazida e pirazinamida. Para os pacientes que desenvolveram IRIS,

o tratamento utilizado nas formas graves foi a administração de corticoesteróides nas doses

de 1 mg/kg dia por um período definido clinicamente pelo desaparecimento dos sintomas

quando então era iniciada a retirada gradual desse fármaco. Em função do número restrito

de pacientes incluídos neste estudo, estes foram considerados como um único grupo para as

análises imunológicas, independente da dose de efavirenz em uso.

IV.2) Metodologia

IV.2.a) Obtenção de amostras de sangue periférico

A cada visita do estudo, a saber, nos dias –15 (quando o voluntário estava em uso

somente das drogas anti-TB), dia (D1) (introdução da TARV), D30, D60, D90, D120,

D150 e D180, foram colhidos de todos os participantes 30 mL de sangue heparinizado

estéril, para obtenção de células mononucleares do sangue periférico (CMSP), e 12 mL de

sangue em tubos contendo EDTA, para os testes de carga viral e citometria de fluxo para as

diferentes populações celulares. As amostras colhidas em EDTA foram utilizadas em um

período máximo 6 horas para a obtenção de plasma e de 24hs para os experimentos de

citometria de fluxo. Houve um intervalo de 10 dias para cada visita clínico-laboratorial.

Para a presente análise imunológica foram consideradas as coletas sanguíneas e os

dados clínico - laboratoriais realizados até a visita do dia 120.

IV.2.b) Obtenção e criopreservação de células mononucleares do sangue

periférico (CMSP)

37

As células mononucleares do sangue periférico foram obtidas por gradiente de

densidade a partir de 30mL de sangue venoso heparinizado. Este procedimento foi

realizado em um intervalo máximo de 24hs após a coleta do sangue.

As amostras foram adicionadas ao Ficoll-Hypaque (Histopaque, Sigma Chemical

Co, St. Louis, EUA) e centrifugadas (Heraeus Megafuge 1.0 R, Thermo Electron

Corporation, Germany) por 30 minutos a 400g a temperatura de 22°C. As células foram

lavadas três vezes através de centrifugações (Heraeus Megafuge 1.0 R, Thermo Electron

Corporation, Germany) de 10 minutos, a 400g em meio RPMI (Sigma-Aldrich, St. Louis,

EUA) contendo 10% de soro fetal bovino (SFB) (Gibco Invitrogen, Grand Island, EUA). A

viabilidade das células mononucleares foi avaliada através de contagem com corante azul

de Trypan (Sigma Chemical Co, St. Louis, EUA) após exclusão das células mortas logo

após as lavagens e ressuspensão em 2mL de RPMI (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA)

completo com 10% de SFB (Gibco Invitrogen, Grand Island, EUA).

As CMSP obtidas então foram centrifugadas (Heraeus Megafuge 1.0 R, Thermo

Electron Corporation, Germany) e os pellet foram ressuspensos em meio para

congelamento [10% de DMSO (Sigma Chemical Co, St. Louis, EUA) e 90% de SFB

(Gibco Invitrogen, Grand Island, EUA )] a uma concentração de 107 células/mL/tubo. As

células foram resfriadas em isopropanol a –80° C durante a noite e transferidas para serem

estocadas em botijão contendo nitrogênio (N2) líquido.

IV.2.c) Descongelamento das células criopreservadas

Para o descongelamento, as células foram retiradas do container de N2 de acordo

com as normas de biossegurança (CTBio-FIOCRUZ., 2005), colocadas em gêlo seco para

transporte até a área de trabalho e colocadas de maneira rápida a 37° C em banho-maria. As

células foram ressuspensas para 10 mL em RPMI (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA)

completo-SFB (Gibco Invitrogen, Grand Island, EUA) 10%, lavadas por duas vezes,

através de centrifugação (Heraeus Megafuge 1.0 R, Thermo Electron Corporation,

Germany) a 400g por 10 minutos. Os pellets obtidos foram ressuspensos em 5 mL de

RPMI (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA) completo-SFB (Gibco Invitrogen, Grand Island,

EUA) 10% e incubados a 37° C em atmosfera de 5% de CO2 (Heraeus Instruments,

38

Germany) por um período entre 3 horas (no mínimo) e 20 horas (no máximo). Apos este

período as células foram centrifugadas (Heraus Megafuge 1.0 R, Thermo Electron

Corporation, Germany) a 400 g por 8 min e ressuspensas em 2 mL de RPMI (Sigma-

Aldrich, St. Louis, EUA)-SFB (Gibco Invitrogen, Grand Island, EUA) 10%.

A recuperação e a viabilidade das células mononucleares foram avaliadas através de

contagem com corante azul de Trypan (Sigma Chemical Co, St. Louis, EUA) após exclusão

das células mortas. Somente prosseguiram para as análises imunológicas as amostras que

apresentaram viabilidade acima de 85%.

IV.2.d) Análise de linfócitos T por citometria de fluxo

As moléculas de superfície dos linfócitos T foram analisadas por citometria de fluxo

em Facscalibur (Beckton-Dickson BD, San Diego, EUA). Estes experimentos foram

realizados a partir de 50 uL de de sangue fresco, usando a técnica de marcação tripla com

20uL de um conjunto de anticorpos monoclonais específicos para as moléculas CD3, CD4 e

CD8 ligados, respectivamente, aos fluorocromos PerCP, FITC e PE (Tritest, Beckton-

Dickson BD, EUA), usando a plataforma Trucount (Beckton-Dickson BD, San Jose, CA-

EUA) e o programa de análise Multiset (Beckton-Dickson BD, EUA). Nesta abordagem os

resultados foram expressos em números absolutos de células por mm3.

Combinações adicionais de anticorpos permitiram avaliar os percentuais de

diferentes populações celulares associadas à ativação celular, tais como o CD38 em células

TCD8+ e o HLA-DR em células TCD3+ (Beckton-Dickson BD, EUA). Nestes

experimentos, 50µl de sangue total de cada amostra foram incubados com 5 µl de cada

conjunto de anticorpos monoclonais (CD8-FITC/CD38-PE ou CD3-FITC/HLADR-PE) por

30 min., a temperatura ambiente (22-24°C) e ao abrigo da luz. As células foram analisadas

utilizando-se o programa CellQuest (BD Biosciences, Pharmingen, EUA).

Com o intuito de avaliar a expressão do CD38 em células TCD8+ ou a expressão do

HLA-DR em células TCD3+, construímos, inicialmente, um dot plot de tamanho versus

granularidade para definir a população de linfócitos a ser analisada (R1). Dentro dessa

população, definimos o número de eventos a ser adquirido que foi de 10.000. eventos. Em

seguida, construímos um outro dot plot de tamanho versus CD8-FITC ou CD3-FITC, onde

39

a população de células TCD8+ ou TCD3+ foi definida (R2). A partir daí, construímos um

terceiro dot plot de CD8-FITC versus CD38-PE ou CD3-FITC versus HLA-DR PE para

determinar a duplo positividade das populações de células TCD3+ ou de células TCD8+.

As células pertencentes à região dois (R2) foram analisadas também em um histograma de

CD38-PE/HLA-DR-PE versus contagem celular, para determinar a porcentagem de células

expressando as moléculas associadas à ativação celular. Além disso, construímos um

histograma de CD3-FITC/CD8-FITC versus contagem celular, para determinar a

porcentagem de células CD3+/CD8+ (Figura 3.1).

A imunofenotipagem das diferentes populações de linfócitos T foi realizada em

todas as visitas do estudo.

Figura 4.1: Representação das análises realizadas para determinação das populações de células

TCD3+/TCD8+ expressando as moléculas associadas à ativação celular (CD38 e o HLA-DR), durante todas

as visitas do estudo (D1, D30, D60, D90 e D120). A região 1 (R1) representa a população de linfócitos totais

e a região 2 (R2) representa a população de linfócitos TCD3+ ou TCD8+. A partir da região 2 (R2) foram

40

definidas as populações de células que expressavam os marcadores de ativação celular (CD38 e o HLA-DR) e

a parti da região 1 (R1) as populações de células TCD3+ ou TCD8+.

IV.2.e) Determinação da carga viral plasmática do HIV-1 A quantificação do RNA viral do HIV-1 foi feita a partir do plasma, em amostras

colhidas em todas as visitas do estudo, utilizando-se a técnica b-DNA de amplificação de

sinal (Versant HIV RNA 3.0 Assay, Siemens, Milano, Italia), de acordo com as instruções

do fabricante. Trata-se de um ensaio de hibridização de ácidos nucléicos em fase sólida,

tipo sanduíche, que usa moléculas de DNA ramificadas. A metodologia baseia-se na

atividade de dois conjuntos de sondas de oligonucleotídeos: a sonda de captura

complementar e a sonda pré-amplificadora e amplificadora (b-DNA), que tem como alvo a

região correspondente ao gene pol do genoma do HIV-1. Para esta metodologia, 1ml de

plasma foi utilizado de cada paciente, obtido a partir do sangue venoso coletado em tubos

Vacuntainer com EDTA, centrifugado a 400g por 10 minutos, em temperatura de 22°C. O

limite de detecção da carga viral plasmática neste sistema é de 50 a 500.000 cópias de RNA

do HIV-1/mL de plasma.

IV.2.f) Ensaio de ELISPOT para quantificação de células secretoras de IFN-γ

em resposta a antígenos de M. tuberculosis

Para avaliação da resposta imune aos antígenos de MTB utilizamos o ensaio de

ELISPOT para detecção de IFN-γ, adaptado a partir de Bourgarit et al., (2006). Para tal,

utilizamos células mononucleares obtidas dos pacientes nas visitas D1, D30, D60 e D90 ou

D120, tanto dos que apresentaram IRIS, como dos demais pacientes incluídos no estudo.

Como antígenos foram utilizados a proteína purificada derivada de M. tuberculosis

PPD (Statens Serum Institute, Copenhagen, Denmark) e a proteína recombinante ESAT-6

(Statens Serum Institute, Copenhagen, Denmark), e as proteínas 38Kda /CFP-10 (Lionex

Diagnostic & Therapeutic, Braunchweig, Germany), todas na concentração de 5µg/mL.

41

Como controle positivo utilizamos a fitohemaglutinina (PHA) (Sigma-Aldrich, St. Louis,

EUA) na concentração de 1ug/poço (5ug/mL).

Para a realização destes experimentos, placas de filtração (Millipore Corporation,

Bedford, EUA) de 96 poços foram lavadas três vezes com tampão salina-fosfato (Gibco

Invitrogen, Grand Island, EUA) uma vez concentrado (PBS 1X – 200 µL/poço), Os poços

foram preenchidos com anticorpos monoclonais de captura anti-IFN-γ humano (100

µL/poço) (Cell Sciences Diaclone, France) e incubados a 4° C por no mínimo 18hs. As

placas foram lavadas novamente três vezes com PBS (Gibco Invitrogen, Grand Island,

EUA) 1X (200 µL/poço) e bloqueadas com RPMI (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA)

completo-SFB 10% (Gibco Invitrogen, Grand Island, EUA) (100 µL/poço) por 30 minutos

a 37° C em atmosfera de 5%CO2 (Heraeus Instruments, Germany). A seguir, 100 µL de

CMSP dos pacientes foram adicionadas aos poços a uma concentração de 105céls/poço,

seguido-se da adição dos antígenos PPD, ESAT-6, 38Kda/CFP-10 e PHA (controle

positivo) ou meio de cultura sozinho (controle negativo), todos em duplicata. Para cada

visita foram utilizados 10 poços (1,2x106cels) por paciente. Cabe ressaltar que, para fins

comparativos, as amostras de CMSP dos pacientes obtidas nos diferentes momentos do

estudo (D1 a D90 ou 120) foram testadas na mesma placa de cultura.

As placas foram incubadas por 40 horas a 37°C em estufa com atmosfera de 5% de

CO2 (Heraeus Instruments, Germany) Após esse período, as placas foram lavadas por três

vezes com PBS 1X (Gibco Invitrogen, Grand Island, EUA) , três vezes com PBS 1X-

Tween 20 (Merck Schuchardt OHG, Hohenbrunn, Germany) a 0,05%, e três vezes com

PBS 1X (Gibco Invitrogen, Grand Island, EUA) e em seguida foram adicionadas alíquotas

de 100 µL/poço de anticorpos anti-IFN-γ biotinilados (Cell Sciences Diaclone, France),

diluídos a 1/500 em PBS-BSA (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA) 1%. Após incubação a 37°

C por 4 horas, as placas foram novamente lavadas por três vezes com PBS 1X (Gibco

Invitrogen, Grand Island, EUA) e então adicionadas alíquotas de 100 µL/poço de uma

solução de streptoavidina fosfatase alcalina (Amersham Biosciences, England), diluída a

1/1000 em PBS contendo 1% de BSA (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA). Após incubação

de uma hora a 37° C, as placas foram lavadas novamente por três vezes com PBS 1X

(Gibco Invitrogen, Grand Island, EUA) antes da adição de 100uL/poço do substrato

cromógeno 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato e do agente catalizador nitroblue tetrazolium

42

(NBT-BCIP), (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA). Após 15-20 minutos de revelação, onde

são detectados pontos azuis (spots) nos locais onde haviam células produtoras de IFN-γ em

resposta aos antígenos, a reação enzimática era interrompida por lavagem com água

destilada. As placas eram secas ao ar livre por 48 horas e, a seguir, os spots eram contados

utilizando o leitor de ELISPOT (CTL Analyzers LLC, Cellular Technology), cada spot

representa uma célula secretora de IFN-γ. O número específico de células T respondedoras

foi calculado após subtração dos valores do controle negativo e multiplicado por 10, sendo

expresso como spot-forming cells (SFC)/106 CMSP. O experimento era considerado válido

quando o número de SFC era igual ou superior a 100 spots no controle positivo (PHA).

Podemos observar o ensaio de ELISPOT de forma simplificada na figura 3.1.

43

Figura 4.2: Representação esquemática do ensaio de ELISPOT para quantificação de células produtoras de

IFN-γ. Figura adaptada do site da Expert Review in Molecular Medicine. (www-ermm.cbcu.cam.ac.uk).

IV.3) Análise estatística dos dados

As análises foram realizadas avaliando-se a resposta imune de cada paciente ao

longo do tempo, nos vários pontos de coleta, assim como comparando-se o grupo que

44

apresentou IRIS com os demais pacientes. Foram utilizados os testes não paramétricos de

Wilcoxon ou Mann Whitney conforme o caso. Nesse estudo o intervalo de confiança

estipulado foi de 95% e consideramos significativos os valores de p< 0,05.

IV.4.) Aspectos éticos

Esse estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do IPEC e todos os

pacientes forneceram seu consentimento através de assinatura de Termo de Consentimento

Livre e Esclarecido, após ler o documento, discutir eventuais dúvidas com os pesquisadores

envolvidos no projeto e aceitar participar do estudo.

45

V. RESULTADOS

A população selecionada de pacientes com tuberculose e infecção pelo HIV virgens

de tratamento anti-retroviral consistiu de quinze homens com uma mediana de idade de 37

anos [IQR (32 – 40 anos)]. Doze pacientes apresentaram a forma disseminada da

tuberculose, dois apresentaram a forma pulmonar e um apresentou a forma ganglionar.

Dentre esses quinze pacientes, três apresentaram o quadro de síndrome inflamatória

associada à reconstituição imune (IRIS). Os três pacientes apresentaram linfadenopatia

cervical, sub-mandibular e supra-clavicular em torno do D30, de forma branda a moderada

para os pacientes 3 e 12, enquanto que o paciente 6 apresentou um quadro mais intenso e

teve indicação de tratamento com corticoesteróide no D90.

V.1. Análise quantitativa de linfócitos T circulantes

A avaliação do status imunológico foi realizada em todos os pacientes do presente

estudo (n=15). A contagem de linfócitos T CD4+ no início do tratamento anti-retroviral

concomitante ao da tuberculose (D1) apresentou uma mediana de 103 céls/mm3 [IQR (53 –

171,5 céls/mm3)] e 120 dias após o tratamento (D120) uma mediana de 202 céls/mm3 [IQR

(108 – 315,5 céls/mm3)].

Todos os pacientes tiveram aumento significativo nas contagens de células TCD4+

nos dias 30 (p=0,01), D60 (p=0,05), D90 (p=0,0005) e D120 (p=0,0005) após o início do

tratamento, quanto comparados com os valores no momento de entrada no estudo (D1)

(Figura 5.1).

D1 D30 D60 D90 D120

0

100

200

300

400

500

600

700

Visitas de Acompanhamento

Cél

ulas

TC

D4+

/mm

3

* * * *

46

Figura 5.1: Contagens absolutas de células TCD4+ dos pacientes infectados pelo HIV-1 e pelo

Mycobacterium tuberculosis (n=15) durante as visitas de acompanhamento (D1, D30, D60, D90 e D120). As

linhas horizontais representam os valores medianos e cada ponto representa um paciente diferente durante

cada visita. * p<0,05 – Wilcoxon U-test.

Corroborando com os dados acima apresentados, quando avaliamos o ganho

percentual de células TCD4+ desses pacientes em relação ao início do tratamento,

observamos que todos os indivíduos tiveram um ganho celular significativo 30 dias após o

início do tratamento, apresentando uma mediana de 221,3% [IQR (123,6 – 662,1%)].

Contudo, observamos que esse ganho celular foi significativo apenas trinta dias após o

início do tratamento, mantendo valores estáveis durante todo o período de

acompanhamento (mediana de 228,3% [IQR (114,5 – 353,4%)] no D60, mediana de

203,3% [IQR (126,7 – 256,3%)] no D90 e mediana de 204,7% [IQR (140,2 – 274,5)] no

D120). (Figura 5.2).

Figura 5.2: Percentagem de ganho de células TCD4+ nos pacientes infectados pelo HIV-1 e pelo


linhas horizontais representam os valores medianose e cada ponto representa um paciente diferente durante

cada visita.

D 30 D 60 D 90 D 1200

100

200

300

400

500500

100015002000


Perc

enta

gem

de

ganh

o d

e cé

lula

s TC

D4+

47

Em relação à contagem de linfócitos TCD8 +, verficou-se uma mediana de 555,5

céls/mm3 [IQR (256 – 985 céls/mm3)] no início do tratamento (D1) e, 120 dias após o

tratamento, de 818 céls/mm3 [IQR (320 – 973 céls/mm3)]. Comparando-se as contagens de

linfócitos TCD8 + nas diferentes visitas de acompanhamento após o tratamento não foi

observada nenhuma diferença significativa. (Figura 5.3).

Figura 5.3: Contagens absolutas de células TCD8+ nos pacientes co-infectados pelo HIV-1 e pelo


linhas horizontais representam os valores medianos e cada ponto representa um paciente diferente durante

cada visita.

A análise dos casos de IRIS em comparação com os demais pacientes incluídos no

estudo não revelou diferença significativa nas contagens de células TCD4+ no início do

tratamento (D1) (IRIS 60 céls/mm3 [IQR 33-227 céls/mm3], e demais pacientes 104,5

céls/mm3 [IQR 57,50-227 céls/mm3]). O incremento nas contagens de células TCD4+ após

o início do tratamento, mostrado na figura 5.1, foi também observado nos casos de IRIS

276,7%[IQR 107,9-797%], e nos demais pacientes 210,6% [IQR 139,2-527,2%]. O perfil

imunológico dos casos de IRIS, baseado na avaliação das populações de linfócitos T

CD3+CD4+ e CD3+CD8+, encontra-se representado na figura 5.4.

D1 D30 D60 D90 D1200

500

1000

1500

2000

2500


Cél

ulas

TC

D8+

/mm

3

48

Paciente 3

0

200

400

600

800

1000

1200

D1 D30 D60 D120


CD4

CD8

Paciente 6

0

200

400

600

800

1000

1200

D1 D30 D60 D90 D120


CD4

CD8

Paciente 12

0

200

400

600

800

1000

1200

D1 D30 D60 D90 D120


CD4

CD8

Figura 5.4: Contagens absolutas de células TCD4+ e células TCD8+ nos casos de síndrome inflamatória

associada a recosntituição imune durante as visitas de acompanhamento (D1, D30, D60, D90 e D120).

Cél

ulas

/mm

3 C

élul

as/m

m3

Cél

ulas

/mm

3

49

V.2. Quantificação da carga viral

A avaliação da carga viral plasmática foi realizada em todos os quinze pacientes do

presente estudo. Os resultados variaram entre o limite de detecção da técnica (<50

cópias/mL) até o limite máximo (>500.000 cópias/mL), levando a uma mediana no início

do tratamento de 5,0 log10 IQR (4,9-5,6) e a uma mediana de 1,69 log10 IQR (1,69-1,76)

120 dias após o tratamento.

Todos os pacientes mostraram uma redução significativa da carga viral 30 dias após

o início do tratamento (p<0,05). (Figura 5.5)

Figura 5.5: Carga viral plasmática do HIV-1 dos pacientes infectados pelo HIV-1 e pelo Mycobacterium

tuberculosis durante as visitas de acompanhamento (D1, D30, D60, D90 e D120). * p<0,05 – Wilcoxon U-

test

Carga Viral

0

1

2

3

4

5

6

D1 D30 D60 D90 D120

Visitas de Acompanhame nto

*

Log 1

0- R

NA

Pla

smát

ico

do H

IV-1

50

O controle da carga viral foi mantido ao longo do tratamento, associado a um

incremento das populações de células TCD4+ em todos os indivíduos (figura 5.6). Nos 3

casos de IRIS presentes nesse estudo, observamos também um controle da carga viral 30

dias após o tratamento e a manutenção desse controle ao longo do acompanhamento. Além

disso, observamos que ocorre um aumento das contagens de células TCD4+ associado ao

declínio da carga viral plasmática (Figura 5.7).

0

50

100

150

200

250

300

D1 D30 D60 D90 D120


0

1

2

3

4

5

6

CD4

Cargaviral

Figura 5.6: Contagem de células TCD4+ e quantificação da carga viral plasmática do HIV-1 dos pacientes

infectados pelo HIV-1 e pelo Mycobacterium tuberculosis durante as visitas de acompanhamento (D1, D30,

D60, D90 e D120). Os pontos representam os valores medianos.

Cél

ulas

TC

D4+

/mm

3

Log 1

0-R

NA

Pla

smát

ico

51

Paciente 3

0

100

200

300

400

500

600

D1 D30 D60 D120


0

1

2

3

4

5

6

CD4

Cargaviral

Paciente 6

0

100

200

300

400

500

600

D1 D30 D60 D90 D120


0

1

2

3

4

5

6

CD4

Cargaviral

Paciente 12

0

100

200

300

400

500

600

D1 D30 D60 D90 D120


0

1

2

3

4

5

6

CD4

Cargaviral

Figura 5.7: Contagem de células TCD4+ e quantificação da carga viral plasmática do HIV-1 nos casos de

síndrome inflamatória associada a reconstituição imune durante as visitas de acompanhamento (D1, D30,

D60, D90 e D120).

Cél

ulas

TC

D4+

/mm

3

Log 1

0-R

NA

Pla

smát

ico

Cél

ulas

TC

D4+

/mm

3

Log 1

0-R

NA

Pla

smát

ico

Cél

ulas

TC

D4+

/mm

3

Log 1

0-R

NA

Pla

smát

ico

52

V.3. Avaliação do perfil de ativação celular

A avaliação do perfil de ativação celular foi realizada para todos os pacientes do

presente estudo (n=15), através da quantificação dos percentuais de expressão de HLA-DR

em células TCD3+ e de CD38 em células TCD8+.

A mediana de linfócitos TCD3+ que expressavam HLA-DR no início do tratamento

(D1) foi de 37,11 % [IQR (25,47 – 52,32%)], enquanto que 90 dias após o tratamento

(D120) esta reduziu-se para 25,25 % [IQR (8,25 – 28,81%)] (p=0,02). Apesar da redução

da carga viral em resposta à TARV, níveis elevados de ativação celular foram observados

para todos os pacientes, durante o período do estudo (Figura 5.8).

Figura 5.8: Níveis de expressão de HLA-DR em células TCD3+ nos pacientes co-infectados pelo HIV-1 e

pelo Mycobacterium tuberculosis durante o tratamento (D1, D30, D60, D90 e D120). As linhas horizontais

representam os valores medianos e cada ponto representa um paciente diferente durante cada visita. * p<0,05

– Wilcoxon U-test.

De modo geral, a mediana das contagens de linfócitos TCD8+ que expressavam

CD38 também se apresentou alta ao longo de todo o período de acompanhamento dos

pacientes co-infectados pelo HIV-1 e pelo M. tuberculosis. No início do tratamento (D1) a

mediana foi de 81,83 % [IQR (78,48 – 96,12%)] e, 120 dias após o tratamento, a mediana

D1 D30 D60 D90 D1200

102030405060708090


% d

e ex

pres

são

de H

LA-D

R e

m c

élul

as T

CD

3+

*

53

foi de 53,75 % [IQR (38,03 – 84,55%)]. Reduções significativas nos percentuais de

linfócitos T ativados CD8+/CD38+ foram observadas nos dias 90 (p=0,01) e 120 (p=0,001)

pós-tratamento. A figura 5.9 apresenta os níveis de ativação celular ao longo da terapia.

Figura 5.9: Níveis de expressão de CD38 em células TCD8+ nos pacientes co-infectados pelo HIV-1 e pelo

Mycobacterium tuberculosis durante o tratamento (D1, D30, D60, D90 e D120). As linhas horizontais

representam os valores medianos e cada ponto representa um paciente diferente durante cada visita. * p<0,05

– Wilcoxon U-test.

Os casos de IRIS apresentaram níveis elevados de ativação celular durante o estudo,

apesar do controle da carga viral plasmática. A figura 5.10 mostra os níveis de ativação

celular, medidos através da expressão dos marcadores de superfície HLA-DR em células

TCD3+ e do CD38 em células TCD8+ nos três casos de IRIS.

D1 D30 D60 D90 D1200

50

100


% d

e ex

pres

são

de C

D38

em

cél

ulas

TC

D8+

* *

54

Paciente 3

0

20

40

60

80

100

120

D1 D30 D60 D120


CD3/HLA-DR +

CD8/CD38 +

Paciente 6

0

20

40

60

80

100

120

D1 D30 D60 D90 D120


CD3/HLA-DR +CD8/CD38 +

Paciente 12

0

20

40

60

80

100

120

D1 D30 D60 D90 D120


CD3/HLA-DR +

CD8/CD38 +

Figura 5.10: Níveis de expressão de CD38 em células TCD8+ e níveis de expressão de HLA-DR em células

TCD3+ nos casos de síndrome inflamatória associada a reconstituição imune durante o tratamento (D1, D30,

D60, D90 e D120).

Perc

enta

gem

de

célu

las

Perc

enta

gem

de

célu

las

Perc

enta

gem

de

célu

las

55

A análise dos casos de IRIS em comparação com os demais pacientes incluídos no

estudo (figuras 5.8 e 5.9) não revelou diferença significativa nas contagens de células

TCD8+CD38+ no início do tratamento (D1) (IRIS: 79,19% [IQR 57,11-97,98]), e demais

pacientes: 85,10% [IQR 79,76-92,35%]) e de células TCD3+/HLA-DR+ (IRIS: 28,48%

[IQR 12,54-37,11%]), demais pacientes: 37,71 ([IQR 22,42-52,32]). Altos níveis de

ativação celular durante o tratamento, mostrado nas figuras 5.9 e 5.8, também foi observado

nos casos de IRIS.

V.4. Ensaio de ELISPOT para quantificação de células secretoras de IFN-γ em

resposta a antígenos de M. tuberculosis

Para avaliar a capacidade de produção de citocinas efetoras em resposta a estímulos

microbianos dos indivíduos infectados pelo HIV-1 e o MTB, incluindo os três casos de

IRIS, foi realizado o ensaio de ELISPOT para detecção de IFN-γ durante as visitas do

estudo. Ao longo do tratamento observamos uma redução da carga viral plasmática, com

um conseqüente aumento das contagens de células TCD4+ nos indivíduos co-infectados e

nos casos de IRIS. Esse incremento de células TCD4+ foi associado com a recuperação da

resposta imune, a determinados antígenos micobacterianos (PPD, ESAT-6, e 38kDa/CFP-

10). De fato, no início do tratamento (D1) apenas 4 dos 15 indivíduos (26,6%)

apresentavam resposta específica ao PPD. Essa resposta aumentou ao longo do tratamento,

alcançando valores superiores 90 dias após o início do tratamento, com 93,3% (12 em 15)

de indivíduos respondedores ao PPD. Em relação ao 38kDa/CFP-10, observamos que no

início do tratamento 20% dos indivíduos apresentavam resposta específica ao antígeno,

aumentando para 53,3% 90 dias após o tratamento. Vale ressaltar que a resposta ao PPD

desses pacientes foi muito mais intensa do que a resposta ao 38kDa/CFP-10 (figura 5.12).

Três pacientes também apresentaram respostas ao antígeno ESAT-6, entretanto com baixa

freqüência (Figura 5.11).

56

Figura 5.11: Percentual de indivíduos respondedores aos antígenos PPD, ESAT-6 e 38kDa/CFP-10 (entre os

quinze pacientes incluídos no estudo) ao longo do tratamento (D1, D30, D60 e D90).

Além do incremento no número de indivíduos respondedores ao PPD, verificamos

que a mediana de células produtoras de IFN-γ específicas ao PPD no início do tratamento

foi de 57,50 SFC/106 PBMC [IQR (42,50 – 62,50)] e 120 dias após o tratamento foi de

392,5 SFC/106 PBMC [IQR (60,0 – 672,5)]. Respostas mais limitadas foram observadas

em relação ao antígeno ESAT-6, tanto em relação ao número de indivíduos respondedores,

como em relação à intensidade desta resposta. Com relação à resposta ao conjunto de

antígenos 38kDa/CFP-10 observou-se uma maior magnitude de resposta quando

comparado ao antígeno ESAT-6. Um dos pacientes apresentou mais de 1.000 spots/106 ao

antígeno 38kDa/CFP-10 nas três visitas analisadas (D30, D60 e D90) subseqüentes a

introdução do tratamento anti-retroviral. (Figura 5.12).

0102030405060708090

100

D1 D30 D60 D90


PPDESAT-638 kDa/CFP-10

Perc

entu

al d

e in

diví

duos

resp

onde

dore

s

57

PPD

D1 D30 D60 D900

100

200

300

400

500500

100015002000


CFS

/106 C

MSP

ESAT- 6

D1 D30 D60 D900

100

200

300

400

500500

100015002000


CFS

/106 C

MSP

38kDa/CFP-10

D1 D30 D60 D900

100

200

300

400400

1200

2000


CFS

/106 C

MSP

58

Figura 5.12: Ensaio de ELISPOT para detecção de células produtoras de IFN-γ, realizado nos indivíduos

infectados pelo HIV-1 e pelo Mycobacterium tuberculosis, durante as visitas de acompanhamento (D1, D30,

D60 e D90). O resultado é expresso em células formadoras de spots (CFS)/1 x 106 células mononucleares do

sangue periférico (CMSP). As linhas horizontais menores representam os valores medianos e as linhas

horizontais maiores representam a positividade do teste (foram considerados respondedores para os antígenos

PPD, ESAT-6 e 38kDa/CFP-10, os indivíduos com ≥ 30 spots/106 células).

O perfil de resposta aos antígenos PPD, ESAT-6 e 38kDa/CFP-10 no teste de

ELISPOT, verificado para os três casos de IRIS incluídos neste estudo, encontra-se na

figura 5.13. As curvas apresentam o mesmo perfil para os três indivíduos em resposta aos

três antígenos utilizados no estudo. De fato, verifica-se um pico de resposta 30 dias após a

introdução da terapia anti-retroviral, seguida de uma redução no número de spots/106

células no D60 e novo incremento no D90. Essa redução do D60 não foi observada nos

demais pacientes, que não desenvolveram IRIS. Perfis de respostas muito similares ao

ELISPOT foram observadas para os pacientes 3 e 6, os quais apresentaram linfadenopatia

cervical e supra-clavicular no D30. Cabe ressaltar que dos três pacientes com quadro de

IRIS apenas o paciente 6 teve indicação clínica para a introdução do tratamento com

corticóide, o que ocorreu no D90.

59

Paciente 3

0100200300400500600700800900

D1 D30 D60 D90


PPDESAT-638/10

Paciente 6

0100200300400500600700800900

D1 D30 D60 D90


PPDESAT-638/10

Paciente 12

0100200300400500600700800900

D1 D30 D60 D90


PPDESAT-638/10

Figura 5.13: Ensaio de ELISPOT para detecção de células produtoras de IFN-γ em resposta aos antígenos

micobacterianos (PPD, ESAT-6, 38kDa/CFP-10) realizado nos casos de IRIS, durante as visitas de

acompanhamento (D1, D30, D60 e D90). O resultado é expresso em CFS/1 x 106 CMSP.

CFS

/106

CM

SP

CFS

/106

CM

SP

CFS

/106

CM

SP

60

VI. DISCUSSÃO

A infecção pelo HIV-1 é caracterizada pela perda contínua de células TCD4+,

levando a um quadro de imunodeficiência, doenças oportunistas e morte (Saag et al., 1996;

O’Brien et al., 1996; Mellors et al., 1997). Existe uma relação clara entre o número de

células TCD4+ no sangue periférico e o risco para doenças associadas ao HIV-1. Portanto,

a contagem de células TCD4+ no sangue periférico representa o principal indicador de

progressão para a AIDS. Contagens persistentes de células TCD4+ abaixo de 350

células/µL já é um critério para a iniciação de profilaxia primária ou secundária contra

infecções oportunistas (Battegay et al., 2006). A freqüência de infecções oportunistas

declina após o início da terapia anti-retroviral e subseqüente aumento nas contagens de

células TCD4+ (Egger et al., 1997; Gulick et al., 1997; Hammer et al., 1997; Ledergerber

et al., 1999).

O impacto da recuperação imunológica é refletido pelo declínio da morbidade e

mortalidade em pacientes infectados pelo HIV-1 após a introdução de terapia anti-retroviral

potente. Essa tendência tem sido mais evidente nos últimos anos (Palella et al., 1998;

Mocroft et al., 2003; Steme et al., 2005).

Em pacientes com tuberculose ativa observa-se uma diminuição das contagens de

células TCD4+ e TCD8+ (Jones et al., 1997) e alguns trabalhos sugerem uma correlação

entre a depleção de linfócitos TCD4+ e a gravidade da tuberculose (Kony et al., 2000).

Entretanto, a depleção de células T periféricas, parece não estar correlacionada com altas

taxas de mortalidade (Djomand et al., 1994). Além disso, as contagens de linfócitos TCD4+

e TCD8+ são restauradas aos valores ou contagens normais após terapia efetiva (Turett et

al., 1994). Outro aspecto importante da tuberculose é que ela pode exercer um impacto

significante na resposta imune, resultando em mudanças no número de linfócitos T

periféricos, possivelmente refletindo homing celular e diferenciação (Rodrigues et al.,

2002).

Os valores das contagens de células TCD4+ são utilizados como um marcador do

tratamento anti-retroviral e um fator de risco para a progressão de tuberculose latente para

tuberculose ativa em pacientes HIV+ (Wolday et al., 2003). Baixas contagens de células

TCD4+ não são preditivas somente para a progressão para a AIDS, como também

61

constituem um fator de risco para infecções oportunistas como a tuberculose (Chene et al.,

1998; Dragsted et al., 2004). Por outro lado, observa-se que o tratamento da tuberculose

aumenta as contagens de células TCD4+ em ambos os pacientes com ou sem HIV (Martin

et al., 1995).

Alguns estudos têm mostrado que pacientes soropositivos para o HIV e para a

tuberculose apresentam as menores contagens de células TCD4+ quando comparados com

indivíduos com tuberculose e negativos para o HIV e controles saudáveis, além de marcada

depressão de células TCD8+ (Rodrigues et al., 2003). Essa tendência observada em

indivíduos com tuberculose–infectados pelo HIV, pode estar refletindo um avanço maior da

doença causada pelo HIV-1. Podemos considerar também o papel da micobactéria como

um fator adicional para o decréscimo das contagens de linfócitos TCD4+ em pacientes

susceptíveis (Rodrigues et al., 2002). Esse cenário imunológico pode contribuir para o

prejuízo da resposta imunológica observada nesses pacientes.

Em nosso estudo, observamos que após a introdução da terapia anti-retroviral os

pacientes infectados pelo HIV e o MTB apresentaram um aumento progressivo nas

contagens de células TCD4+, com uma mediana de 103 céls/mm3 [IQR (53 – 171,5

céls/mm3)] no início do tratamento (D1) e de 202 céls/mm3 [IQR (108 – 315,5 céls/mm3)]

120 dias após o tratamento. Esse aumento das contagens de células TCD4 está associado a

uma diminuição da carga viral plasmática do HIV-1, observada ao longo do tratamento para

todos os pacientes incluídos nesse estudo. Isso se deve à eficácia da terapia anti-retroviral

utilizada que é normalmente acompanhada pela recuperação imunológica, aumento das

contagens de células TCD4+ e um declínio do RNA HIV-1 (Battegay et al., 2006).

Altos níveis de carga viral são considerados um fator de risco, associado com o

desenvolvimento e a progressão para a AIDS assim como para a infecção por patógenos

oportunistas (Kaplan et al., 2001; Swindells et al., 2002). Estudos apontam que pacientes

co-infectados pelo HIV-1/MTB apresentam altos níveis de carga viral plasmática quando

comparados com indivíduos HIV+ sem tuberculose (Toossi et al., 2001).

No presente trabalho, os pacientes apresentaram níveis elevados de carga viral

plasmática no início do tratamento (5,2 log10 [IQR (4,9-5,6)]. Entretanto, com o início da

terapia anti-retroviral, esses pacientes tiveram uma redução significativa da carga viral

plasmática, chegando a níveis indetectáveis pelo método de quantificação empregado,

62

paralelamente ao aumento das contagens de células TCD4+. Estes resultados condizem

com uma boa resposta à terapia empregada. Contudo, vale lembrar que apesar da terapia

anti-retroviral reduzir a carga viral a níveis indetectáveis, estudos mostram que a replicação

viral persiste em alguns reservatórios permitindo, assim a persistência da replicação viral

(Stevenson., 2003) e consequente manutenção da ativação linfocitária.

A fim de realizar uma avaliação mais acurada do perfil imunológico dos pacientes

apresentados nesse estudo, analisamos a expressão de moléculas relacionadas à ativação

imune, como o CD38 em células CD8+ e o HLA-DR em células CD3+. O CD38 é uma

gliocoproteína de superfície do tipo II, expressa no sangue periférico por células NK

(natural killer), linfócitos B e T e, em menor extensão, por plaquetas e eritrócitos (Savarino

et al., 2000). O HLA-DR é uma molécula do complexo principal de histocompatibilidade

de classe II que apresenta peptídeos antigênicos ao complexo receptor de células TCD4+ na

fisiologia normal da resposta imune. A ativação linfóide durante a infecção pelo HIV-1 está

associada com um aumento na expressão ou re-expressão de antígenos de superfície

linfóides como o CD38 e o HLA-DR (Levacher et al., 1992; Kestens et al., 1992). Uma alta

proporção de células TCD8+ positivas para a expressão de CD38 ou uma alta proporção de

células TCD3+ para a expressão de HLA-DR parecem ser um marcador de prognóstico

importante para a progressão da doença em indivíduos infectados pelo HIV-1 (Mocroft et

al., 1997). Além disso, células TCD8+/CD38+ têm sido associadas com uma resposta

deficiente à terapia em indivíduos infectados pelo HIV-1 (Vigano et al., 2000).

Duas linhas de observação sugerem que a expressão de CD38 pode ser usada como

ferramenta para o monitoramento de TARV. A primeira linha mostra que indivíduos

infectados pelo HIV-1 que exibem altos percentuais de células CD8+ expressando o

CD38+ vão responder à terapia anti-retroviral mais rapidamente que indivíduos com baixos

percentuais dessas células. Essa evidência sugere que essas células podem contribuir para o

“clearance” viral e se tornarem células efetoras quando a TARV diminuir a carga viral

(Wu et al., 1999). A segunda linha mostra que a diminuição da expressão de CD38 em

células CD8+ é um marcador de resposta efetiva ao TARV, provavelmente porque esse

evento se segue à diminuição da carga viral induzida pela terapia (Autran et al., 1997;

Bürgisser et al., 1999; Giorgi et al., 1998; Sondergaard et al., 1999).

63

O aumento da expressão do CD38 em células T tem sido descrito em pacientes com

tuberculose ativa, sugerindo um aumento na ativação celular e uma regulação positiva do

CD38 em resposta à doença causada pelo M. tuberculosis (Rodrigues et al., 2002;

Rodrigues et al., 2003).

Estudos apontam que os indivíduos infectados com o HIV-1 e com o M.

tuberculosis têm uma regulação positiva do CD38 e do HLA-DR (Hertoghe et al., 2000;

Rodrigues et al., 2003), e as maiores proporções dessas moléculas, quando comparados

com grupos de indivíduos infectados pelo HIV-1, sem tuberculose e com indivíduos com

tuberculose, sem o HIV-1 (Hertoghe et al., 2000). Observamos, também em nosso estudo,

altos níveis de ativação celular ao longo de todo o tratamento, com uma mediana no início

do tratamento de 37,11% [IQR (25,47-52,32 %)] para o HLA-DR e uma mediana de

81,83% [IQR (78,48-96,12)] para o CD38, e ao final do estudo uma mediana de 26,62%

[IQR (13,28-31,29 %)] para o HLA-DR e uma mediana de 68,75% [IQR (42,95-89,67 %)]

para o CD38. Alguns estudos na literatura apontam que este estágio de ativação dos

linfócitos TCD8+ durante doenças infecciosas ativas, incluindo a tuberculose,

possivelmente reflete a atividade citotóxica contra patógenos intracelulares (Huang et al.,

2000; Silva et al., 1994). Contudo, vale ressaltar que níveis aumentados de células

TCD8+/CD38+ não são específicos para a infecção causada pelo HIV-1, já que podem

estar elevados em doenças causadas por outras infecções bacterianas e virais associadas

com a ativação de células TCD8+ (revisto por Kaushik et al., 2006).

Diversos estudos estão buscando caracterizar os possíveis mecanismos que estão

envolvidos na síndrome inflamatória associada à reconstituição imune (IRIS). Contudo, o

conhecimento sobre as alterações imunológicas, dentre outras, que favoreçam a ocorrência

da IRIS ainda é muito escasso sendo, por isso, de extrema importância definir parâmetros

que possam contribuir para a compreensão desse fenômeno, para seu diagnóstico e

prevenção.

O presente estudo avaliou parâmetros imunológicos em pacientes co-infectados com

o HIV-1 e o M. tuberculosis e em pacientes que apresentaram a IRIS. Alguns trabalhos

apontam possíveis indicadores que contribuem para o surgimento da IRIS em pacientes co-

infectados, como o grau de recuperação imune após o início de TARV (Breton et al., 2004;

Jevtovic et al., 2005; Lipman et al., 2006; Puthanaki et al., 2006; Ratnam et al., 2006;

64

Shelburne et al., 2005). Esses estudos discutem que um aumento “brusco” nas contagens de

células TCD4+, que antes eram muito baixas no início do tratamento pode estar relacionado

ao surgimento da IRIS. Contudo, em nosso estudo, embora limitado pela pequena casuística

avaliada, observamos que todos os pacientes mostraram um aumento das contagens de

células TCD4+ após o início do tratamento, refletindo recuperação imunológica, e que esta

não foi associada ao fenômeno das IRIS, visto que mesmo alguns pacientes que

apresentaram um aumento “brusco” nas contagens de células TCD4+ não desenvolveram a

síndrome. Esses dados corroboram com outros dados descritos na literatura (Manosuthi et

al., 2006; Narita et al., 1998; Navas et al., 2002; Shelburne et al., 2006). Apesar da

pequena casuística avaliada, vale ressaltar que a proporção de pacientes que apresentaram

IRIS (3 em 15 pacientes), corrobora com outros estudos na literatura (Bourgarit et al.,

2006; Serra et al., 2007). Entretanto, vale ressaltar que são necessários estudos com coortes

maiores de pacientes com IRIS para tentarmos definir melhor alguns parâmetros

imunológicos envolvidos.

Em relação à reconstituição imunológica, vale ressaltar que após o tratamento com

TARV, ocorre um aumento de células TCD4+ de memória (Autran et al., 1997) como

resultado da redistribuição do tecido linfóide. Essas células TCD4+ de memória podem

reconhecer os antígenos micobacterianos e podem ser responsáveis pelo surgimento da

IRIS.

Outro fator importante discutido por alguns estudos na literatura diz respeito aos

níveis de RNA do HIV-1. A diminuição nos níveis de RNA do HIV-1 ou a sua rápida

queda pode estar associado ao desenvolvimento da IRIS (Breton et al., 2004; Shelburne et

al., 2005). Em nosso estudo, entretanto, essa diminuição não parece ter associação com o

desenvolvimento de IRIS visto que todos os pacientes co-infectados e os três pacientes que

apresentaram a IRIS tiveram redução significativa dos níveis de RNA do HIV-1 após 30

dias do início do tratamento.

Alguns trabalhos da literatura discutem que níveis elevados de ativação celular

podem estar relacionados ao surgimento da IRIS (Bourgarit et al., 2006; French et al.,

2004; Stone et al., 2002; Shelburne et al., 2003) e que parece ocorrer um aumento na

expressão de moléculas associadas à ativação nas células T durante a IRIS. Entretanto,

alguns trabalhos discutem que pode ocorrer uma diminuição nos níveis de HLA-DR nos

65

pacientes durante a TARV (Bourgarit et al., 2006). Contudo, em nosso estudo, observamos

que tanto os indivíduos co-infectados quanto os casos de IRIS apresentaram níveis elevados

de ativação celular ao longo do tratamento, sugerindo que a ativação celular observada

nesses pacientes pode não estar associada ao desenvolvimento da IRIS. Porém, vale

ressaltar que parece haver uma tendência à diminuição dos níveis de HLA-DR em nossos

pacientes 90 dias após o tratamento corroborando com os resultados obtidos no estudo

anterior. A continuidade deste estudo longitudinal avaliando os pacientes até 6 meses após

o tratamento (D180) será essencial para a avaliação da redução da ativação celular em

resposta à TARV e à terapia para a tuberculose.

Com o intuito de avaliar a frequência e a magnitude da resposta imune celular dos

indivíduos infectados pelo HIV e o MTB e dos casos de IRIS incluídos neste estudo,

analisamos a produção de IFN-γ frente a antígenos micobacterianos como o PPD, ESAT-6

e 38kDa/CFP-10. Os antígenos recombinantes ESAT-6 e CFP-10 têm sido descritos como

potentes indutores de IFN-γ, com potencial utilidade para o diagnóstico de infecção latente

por M. tuberculosis. Outras proteínas como o 38kDa têm sido exploradas como reagentes

para diagnóstico e componentes de vacinas (Elhay et al., 1998; Kamath et al., 1999; Lopez-

Vidal et al., 2004).

No presente estudo observamos uma resposta praticamente inexistente a estes

antígenos nos indivíduos infectados pelo HIV e MTB antes da introdução da terapia anti-

retroviral, possivelmente em função do elevado grau de imunossupresão dos mesmos.

Tanto a frequência de indivíduos respondedores como a intensidade da resposta de IFN-γ

pelas células T em resposta aos antígenos micobacterianos PPD, ESAT-6 e 38kDa/CFP-10

puderam ser observadas ao longo do período de acompanhamento dos mesmos, e foram

associadas com a redução da carga viral plasmática e incremento do número de linfócitos T

CD4+. Cabe ressaltar que a resposta ao antígeno ESAT-6 foi bem inferior à descrita na

literatura para pacientes infectados pelo HIV e MTB com níveis similares de

imunossupressão (Clark et al., 2007; Hammond et al., 2008). Variações locais e/ou

metodológicas, a serem posteriormente exploradas, podem estar contribuindo para as

diferenças observadas.

A imunidade protetora contra o M. tuberculosis depende essencialmente da

imunidade mediada por células, envolvendo interações entre células TCD4+ específicas e

66

células da linhagem monócito-macrófago (Kaplan et al., 1996; Rich et al., 1996; Vanham

et al., 1997). A atividade das células T parece trabalhar via citotoxicidade contra células

alvo infectadas. Essa atividade está relacionada à produção de IFN-γ pelas células T em

resposta aos antígenos micobacterianos (Scanga et al., 2000). O efeito dos linfócitos T

CD8+ citotóxicos está fortemente relacionado à capacidade do hospedeiro em bloquear o

desenvolvimento da doença causada pela micobactéria. Similar aos linfócitos TCD4+, a

produção de IFN-γ parece ser o marcador chave para a habilidade dos linfócitos TCD8+ em

realizar sua atividade citotóxica em humanos e camundongos (Lalvani et al., 1998; Tascon

et al., 1998). O IFN-γ é um fator chave na ativação de monócitos e macrófagos (Toossi et

al., 1996) e também está associado com a formação do granuloma, que é IFN-γ dependente

(Flynn et al., 1993).

Além da depleção numérica, os linfócitos TCD4+ de indivíduos infectados pelo

HIV-1 sofrem um comprometimento funcional, reduzindo, assim, a resposta imune celular

desses indivíduos. Contudo, após o início da terapia antiretroviral um aumento das células

T CD4+ de memória é observado (Autran et al., 1997), possivelmente como resultado da

redistribuição do tecido linfóide periférico (Bucy et al., 1999). Essas células têm a

capacidade de reconhecer estímulos antigênicos prévios. Após essa redistribuição, ocorre o

aumento de células T não primadas e isso parece ser responsável pelo aumento quantitativo

posterior das contagens de células T CD4+ (Pakker et al., 1998).

Entretanto, apesar dessa recuperação promovida pela terapia anti-retroviral, alguns

estudos mostram que pacientes co-infectados têm uma diminuição na resposta proliferativa

aos antígenos de M. tuberculosis (como o PPD), e produção reduzida de IL-2 e IFN-γ

(Hertoghe et al., 2000; Zhang et al., 1994;). Por outro lado, outros estudos demonstram que

a resposta imune celular é mantida em pacientes co-infectados, mesmo se estes possuem

contagens de células TCD4+ inferiores a 200 células /mm3 (Oh et al., 2005), além de um

aumento na produção de IFN-γ induzida por antígenos micobacterianos nesses pacientes.

Esses dados sugerem que esse aumento na produção de IFN-γ pode ser devido à ativação da

resposta imune celular, segundo os autores, na tentativa de controlar a infecção por M.

tuberculosis (Oh et al., 2005).

Por sua vez, uma das hipóteses acerca do desenvolvimento da IRIS diz respeito à

recuperação celular promovida pela TARV. Os pacientes co-infectados após essa

67

recuperação imunológica passariam a responder aos antígenos micobacterianos (que se

encontram no hospedeiro) de forma exacerbada e que talvez esse evento seja o

desencadeador da síndrome inflamatória (Lipman et al., 2006). Além disso, é discutido na

literatura que um aumento na produção de IL-2 e IFN-γ, a mudança no balanço Th1 e Th2

promovida pela TARV (Shelburne et al., 2003), a ativação imune desregulada (Lawn et al.,

2005), a falta de células T regulatórias (Autran et al., 1997; Cancerlain et al., 2001) e um

aumento exacerbado na produção de citocinas (Bourgarit et al., 2006) estariam envolvidos

na IRIS.

Embora os mecanismos que levem ao surgimento da IRIS não estejam bem

compreendidos, foi demosntrado que pacientes co-infectados com HIV/MTB que

receberam TARV aproximadamente uma semana após a terapia anti-MTB, apresentaram

um aumento no número de células produtoras de IFN-γ específicas ao PPD após o início de

TARV. Contudo, esse aumento não difere entre os grupos (IRIS + e IRIS-) e sua proporção

aumenta durante a IRIS associada com uma produção aguda de citocinas de perfil Th1 e

pró-inflamatórias (Bourgarit et al., 2006). A falta do balanço Th1/Th2 pode estar associado

com o surgimento da IRIS (Ruhwald et al., 2007). Além disso, parece que o aumento da

expressão de moléculas associadas à ativação celular durante a IRIS pode seguir a mesma

cinética de resposta ao PPD (Bourgarit et al., 2006). Além disso, foi demonstrado que

ocorre um aumento de células específicas ao PPD durante a IRIS nos pacientes IRIS+ e que

os pacientes IRIS- não apresentam um aumento agudo da resposta específica ao PPD.

Adicionalmente, também não houve diferenças entre os pacientes em relação ao número de

células específicas ao PPD no início do estudo.

A avaliação dos resultados obtidos neste estudo demonstrou que os pacientes co-

infectados respondem aos antígenos micobacterianos, e que essa resposta aumenta na

medida que aumenta a recuperação imunológica. Entretanto, diferentemente do que foi

descrito por outros grupos (Bourgarit et al., 2006), todos os pacientes apresentaram um

aumento da resposta ao PPD ao longo do tratamento, além de apresentarem níveis similares

de células específicas ao PPD no D1.

Nos casos de IRIS, observamos uma exacerbação da resposta ao PPD no D30 com

subsequente queda no D60 e novo recrudescimento no D90. Um perfil similar, porém em

menor magnitude foi observado com os dois outros antígenos, sendo mais evidente com o

68

38kDa/CFP-10. Cabe ressaltar que essa redução da resposta aos antígenos micobacterianos

não está associada ao tratamento para IRIS, pois apenas um dos três indivíduos que

apresentaram este quadro foi tratado com corticoesteróides, sendo este somente introduzido

no D90. Essa resposta exacerbada ao PPD e, em menor extensão, aos outros dois antígenos,

poderia estar envolvida com o fenômeno estudado, visto que os demais pacientes, que não

apresentaram a síndrome, mostraram padrões de resposta diferentes dos casos de IRIS, com

um aumento progressivo da frequência e magnitude das respostas ao PPD, 38kDa/CFP-10 e

ESAT-6 ao longo do tratamento. Esses resultados corroboram com outros dados da

literatura, onde apontam que a terapia antiretroviral leva a um aumento na produção de

IFN-γ (que possui propriedades pró-inflamatórias), e que esse aumento produz um

ambiente ideal para que ocorra o surgimento da IRIS.

Além das análises imunológicas apresentadas neste estudo, foi possível observar

alguns aspectos clínicos importantes. Como mencionado anteriormente, a tuberculose

disseminada é considerada como fator de risco para o desenvolvimento da IRIS (Breton et

al., 2004). Observamos, nos casos de IRIS presentes em nosso estudo, que todos

apresentavam tuberculose disseminada. Outro fator de risco importante foi pertencer ao

sexo masculino (Hoffmann et al; 1999). Nós observamos que os pacientes participantes

desse estudo e os casos de IRIS eram todos homens, corroborando com os fatores de risco

apontados na literatura.

Esse trabalho avaliou alguns parâmetros imunológicos que poderão ser úteis para o

estudo da co-infecção HIV-1/MTB, assim como, para a continuação dos estudos sobre a

IRIS em diferentes coortes. Os estudos sobre esse fenômeno de reconstituição imunológica

apresentado aqui continuam sendo muito escassos na literatura e trabalhos como esse

podem dar alguma contribuição no que diz respeito ao estudo da IRIS e na elaboração de

novas metodologias científicas que possam descrever melhor essa síndrome inflamatória.

O estudo dos mecanismos que desencadeiam a síndrome inflamatória associada à

reconstituição imune (IRIS) constitui uma área a ser explorada. Identificar os eventos

associados à IRIS pode ajudar na prevenção e no controle dessa síndrome entre os pacientes

co-infectados pelo HIV-1/M. tuberculosis. No âmbito da imunologia é de extrema

importância a continuidade desse tipo de abordagem para melhor avaliar os parâmetros

69

imunológicos envolvidos, permitindo assim uma melhor compreensão do fenômeno e uma

melhor gestão da terapia empregada no tratamento desses pacientes.

70

VII. CONCLUSÕES

A partir dos achados obtidos através da avaliação dos parâmetros imunológicos

apresentados nesse presente estudo, podemos concluir que:

Os indivíduos com tuberculose, infectados pelo HIV-1, apresentaram uma resposta

efetiva à terapia anti-retroviral, quando analisamos os parâmetros imunológicos no que se

refere à re-população de células TCD4+ e à diminuição da carga viral plasmática do HIV-1

ao longo do tratamento.

Além desses parâmetros, observamos ainda que todos os pacientes apresentaram

altos níveis de ativação celular medidos através das moléculas CD38 e HLA-DR.

Não foram observadas associações evidentes entre o status imunológico, a carga

viral e a ativação celular nos indivíduos com tuberculose, infectados pelo HIV-1, e nos

indivíduos que apresentaram IRIS sugerindo que esses fatores possam não estar envolvidos

com o surgimento da IRIS.

Podemos ressaltar uma melhora da reconstituição imunológica induzida pelo TARV

associado a um incremento na freqüência e na magnitude da resposta celular aos antígenos

micobacterianos PPD e 38kDa/CFP-10 e uma resposta de menor magnitude ao antígeno

ESAT-6.

Não foi observada uma associação evidente entre o evento de reconstituição

imunológica e o surgimento da IRIS na coorte estudada.

71

VIII. PERSPECTIVAS

Aumentar a coorte estudada para darmos continuidade à identificação de possíveis

mecanismos imunológicos associados com a ocorrência de IRIS.

Avaliar o perfil de citocinas durante o fenômeno da IRIS.

Avaliar outras populações celulares como células T regulatórias, células de memória

central e efetora e a participação dessas populações na IRIS.

72

ANEXO I

Critérios de inclusão e de exclusão dos pacientes no estudo e critérios de

caracterização de IRIS, utilizados pela equipe clínica do Instituto de Pesquisa Clínica

Evandro Chagas sob a supervisão da Dra. Valéria Rolla.

a) Critérios de inclusão no estudo:

1. Pacientes deverão ser maiores de 18 anos.

2. Indivíduos do sexo feminino ou masculino infectados pelo HIV e com

diagnóstico de tuberculose. As mulheres serão alertadas quanto a possível teratogenicidade

do efavirenz e deverão ter um teste de gravidez negativo e praticar controle da natalidade

através de barreiras mecânicas e/ou com uso de depo-provera durante todo o período

previsto no ensaio.

3. Os pacientes deverão ter documentação da infecção pelo HIV por dois

ELISA positivos e um exame confirmatório (imunofluorescência ou imunoblot) que

poderão ser substituídos por uma dosagem de carga viral plasmática.

4. Os pacientes deverão ter o diagnóstico de tuberculose definido por sinais e

sintomas clínicos de tuberculose para elegibilidade temporária até a confirmação através da

identificação do Mycobacterium tuberculosis em cultura. Caso o diagnóstico não seja

confirmado por cultura uma prova terapêutica positiva e afastamento de outros diagnósticos

de doenças oportunistas quando o único tratamento recebido for para tuberculose será

considerado como caso confirmado

5. Expectativa de vida maior que um ano (pontuação na escala de Karnofsky ≥

70).

6. Pacientes que não necessitem ser medicados com substâncias contra-

indicadas para utilização concomitante ao efavirenz: astemizol, cisaprida, claritromicina,

midazolam, terfenadina, triazolam e anticoncepcionais orais ou injetáveis a base de

estrogênio.

73

7. Paciente concorda em não utilizar nenhuma medicação (mesmo drogas

homeopáticas ou produtos naturais além de erva de São João e suplementos à base de alho)

sem o prévio conhecimento e consentimento do investigador durante todo o período do

estudo.

8. Os pacientes deverão datar e assinar voluntariamente o termo de

consentimento livre e esclarecido antes de ingressar no estudo e após explicação detalhada

da natureza do estudo. Em caso de incapacidade do paciente, o seu representante legal

poderá assinar em seu lugar.

b) Critério de exclusão no estudo:

1. Pacientes nos quais um tratamento anti-retroviral não estiver indicado:

contagem de CD4 > 350 cel/mm3 e carga viral até 100.000 cópias/ml conforme

recomendação do Ministério da Saúde (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2004).

2. Paciente possui história pregressa de hipersensibilidade, intolerância ou

resistência à rifampicina.

3. Diagnóstico de transtorno psiquiátrico (retardo, esquizofrenias, abuso ou

dependência de substâncias psicoativas).

4. Tratamento atual ou pregresso com ITRNN mesmo aqueles ainda em

investigação ou Inibidores da protease.

5. Tratamento atual ou pregresso com mais de dois ITRN.

6. O paciente apresenta uma ou mais das seguintes anormalidades nos exames

laboratoriais: TGO ou TGP > 5 vezes o nível superior da normalidade ou bilirrubina total >

1,5 mg/dL.

74

c) Critérios clínicos de IRIS (Robertson et al., 2006):

1. Piora dos sintomas de infecções ou inflamações;

2. Relação temporal com o início da terapia anti-retroviral;

3. Sintomas não explicados por nova infecção adquirida ou doença ou curso

não usual de uma doença adquirida anteriormente;

4. Diminuição na carga viral plasmática em ≥ 1log10;

5. Aumento na contagem de células TCD4+ de ≥ 25 células/mm3;

6. Biópsia demonstrando inflamação granulomatosa ou resposta inflamatória

exuberante não usual.

75

IX. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Abebe F, Hansen-Holm C, Wiker HG, Bjune G. Progress in serodiagnosis of

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