Avaliação de Meio de Cultura - Dirce Yano
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1MUDANDO DE MTODOS DE ANLISE
AVALIAO DE MEIOS DE CULTURA
DIRCE M.Y.YANO
14.06.10
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2QUALIDADE EM LABORATRIOS DE ENSAIOISO NBR ABNT 17025:2005
Garantia da Qualidade
Conjunto de aes planejadas e sistemticas para garantir que um produto ou um servio vai satisfazer os
requisitos da qualidade.
Controle de QualidadeConjunto de tcnicas e atividades usadas para cumprir
os requisitos da qualidade.
Aes concretas no dia a dia.
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3PORQUE IMPLEMENTAR A ISO?
Melhorar os processos
Aumentar segurana
Melhorar qualidade global
Aprimorar equipes de trabalho
Oferecer maior confiana aos cliente
Diminuir custos operacionais
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4REQUISITOS DE GERNCIA
ATRIBUIES E
RESPONSABILIDADES
CONTROLE DE
DOCUMENTOS E
REGISTROS
ORGANIZAO
RESPONSABILIDADE
SUPRIMENTO DE BENS
AUDITORIAS
NO CONFORMIDADES
AES CORRETIVAS
E PREVENTIVAS
ANLISE CRTICA
REVISES
GESTO
LABORATORIAL
ATENDIMENTO AO CLIENTE SERVIOS
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5REQUISITOS TREQUISITOS TREQUISITOS TREQUISITOS TCNICOSCNICOSCNICOSCNICOS
CONFIABILIDADEDOS
RESULTADOS
MTODOS DE ENSAIO
CONDIESAMBIENTAIS
FATORESHUMANOS
EQUIPAMENTOS RASTREABILIDADEMANUSEIO DE
ITENS
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6AVALIAAVALIAO DE MEIOS DE CULTURAO DE MEIOS DE CULTURA
ABNT NBR ISO/IEC 17025
Elemento 4.6 Aquisio de servios e insumos
Requisito 4.6.1 O laboratrio deve ter poltica e procedimentos para seleo e compra de servios e suprimentos utilizados que afetem a qualidade dos ensaios.Devem existir procedimentos para compra, recebimento e armazenamento de materiais de consumo do laboratrio que sejam importantes para os ensaios.
Requisito 4.6.2 O laboratrio deve garantir que os suprimentos e materiais de consumo adquiridos que afetem a qualidade dos ensaios no sejam utilizados atque tenham sido inspecionados ou verificados de alguma outra forma...Devem ser mantidos registros das aes tomadas para verificar a conformidade.
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7AVALIAAVALIAO DE MEIOS DE CULTURAO DE MEIOS DE CULTURA
Elemento 4.6 Elemento 4.6 AquisiAquisio de servio de servios e insumosos e insumos
Requisito 4.6.4 O laboratrio deve avaliar os fornecedores dos materiais de consumo, suprimentos e servios crticos que afetem a qualidade de ensaios e calibraes e deve manter registros dessas avaliaes, e listar os que foram aprovados.
Requisito 4.6.3Os documentos de aquisio dos itens que afetam a qualidade do resultado do laboratrio devem conter dados que descrevam os servios e suprimentos solicitados.Estes documentos devem ter seu contedo tcnico analisado criticamente e aprovado antes da liberao.
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8AVALIAAVALIAO DE MEIOS DE CULTURAO DE MEIOS DE CULTURA
AQUISIO DE INSUMOS
Aquisio Requisitos Procedimentos
Registro informaes codificao no laboratrio
Controle manutenoestoque responsvel
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9AVALIAAVALIAO DE MEIOS DE CULTURAO DE MEIOS DE CULTURA
Desidratados Comercialmente disponveis
fornecedor
avaliao
validade lote
garantia da qualidade
Formulados
insumos de qualidade
pessoal qualificado
controle de qualidade
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AVALIAAVALIAO DE MEIOS DE CULTURAO DE MEIOS DE CULTURA
Meios prontos para o uso
Comercialmente disponveis
fornecedor
avaliao
validade lote
controle de qualidade
1010
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AVALIAAVALIAO DE MEIOS DE CULTURAO DE MEIOS DE CULTURA
NUTRIO MICROBIANA
Os microrganismos realizam reaes qumicas e organizam as molculas em estruturas especficas.
A expresso final dessa organizao resulta no crescimento.
Os microrganismos requerem em quantidades diferentes de
macronutrientes e micronutrientes.
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AVALIAAVALIAO DE MEIOS DE CULTURAO DE MEIOS DE CULTURA
MEIOS DE CULTURA
Definio
Formulaes de substncias em forma slida, lquida ou semi slida que contm
constituintes naturais ou sintticas para promover a multiplicao, crescimento e manter a viabilidade dos microrganismos.
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Quanto consistncia
Meios lquidos exemplo: caldo nutriente.
Meios slidos quando acrescentamos um agente solidificante gar (carboidrato).
Meios semi-slidos quando acrescentamos menos Agar no meio.
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Meios simples
permitem crescimento de bactrias de fcil crescimento.
Meios enriquecidos
bactrias de difcil crescimento exigem nutrientes especficos, como adio de vitaminas , ex: biotina, cido pantotnico.
Quanto funo
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gar Baird-Parker
AVALIAAVALIAO DE MEIOS DE CULTURAO DE MEIOS DE CULTURA
gar m-Endo LES
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gar Levine
(Lactose Azul de metileno)
AVALIAAVALIAO DE MEIOS DE CULTURAO DE MEIOS DE CULTURA
gar Seletivo para Pseudomonas CN
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gar XLD
AVALIAAVALIAO DE MEIOS DE CULTURAO DE MEIOS DE CULTURA
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Alm de conhecer os meios de cultura, o microbiologista deve tambm saber como preparar corretamente.
O xito do trabalho depende no somente da escolha do meio de cultivo, mas tambm das condies fsicas de cultivo (fatores ambientais) que so diferentes entre os microrganismos.
Praticamente, a grande maioria dos meios comercialmente disponveis (usados na rotina do laboratrio) se encontram sob a forma de p, granulados, desidratados, tornando fcil o seu preparo.
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Norma ISO 11133-1/2009 e 11133-2/2004
Parmetros
Checagem do pH
Produtividade
Seletividade
Tipos de Meios de Cultura
Slido
Semi slido
Lquido
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AVALIAAVALIAO DE MEIOS DE CULTURAO DE MEIOS DE CULTURA
Mtodo
Quantitativo
Qualitativo
Os mtodos devem ser escolhidos pelo laboratrio, baseados em tcnicas aceitas.
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AVALIAAVALIAO DE MEIOS DE CULTURAO DE MEIOS DE CULTURA
Meios sMeios slidos, semi slidos, semi slidos ou llidos ou lquidos devem ser quidos devem ser inoculados com uma alinoculados com uma alquota de microrganismos quota de microrganismos alvo (positivo) e no desejado (negativo).alvo (positivo) e no desejado (negativo).
As diluiAs diluies devem ser preparadas a partir de es devem ser preparadas a partir de culturas de trabalho.culturas de trabalho.
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AVALIAAVALIAO DE MEIOS DE CULTURAO DE MEIOS DE CULTURA
Culturas de Trabalho Culturas de Trabalho -- Contagem de cContagem de clulaslulas
A partir da cultura de trabalho (24h), utilizando a escala de MA partir da cultura de trabalho (24h), utilizando a escala de MacFarland acFarland (0,5) = 10(0,5) = 108.8.
Preparar os tubos de diluiPreparar os tubos de diluio (diluio (diluio decimal seriada) ato decimal seriada) at 1010--88..
Semear 1mL das 5 Semear 1mL das 5 ltimas diluiltimas diluies em profundidade em placas estes em profundidade em placas estreis.reis.
Distribuir aproximadamente de 15 a 20mL de Distribuir aproximadamente de 15 a 20mL de gar PCA previamente gar PCA previamente resfriado e mantido a (46 resfriado e mantido a (46 1)1)C. (fazer duplicata).C. (fazer duplicata).
Homogeneizar bem. Deixar solidificar.Homogeneizar bem. Deixar solidificar.
Incubar as placas em posiIncubar as placas em posio invertida na temperatura apropriada do o invertida na temperatura apropriada do microrganismo por 24h.microrganismo por 24h.
Fazer as contagens dentro do limite de especificaFazer as contagens dentro do limite de especificao de contagem.o de contagem.
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Meios seletivos e no seletivosMeios seletivos e no seletivos
QuantitativoQuantitativo
Meios slidos Inoculao em profundidade
Inoculao em superfcie
Aps a incubao, contar as colnias das placas da diluio que proporcionar contagem entre os limites especificados pelo mtodo.
A contagem ser sempre na mesma diluio para os dois meios (avaliao e de referncia).
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Meios SlidosInoculao em superfcie
AVALIAAVALIAO DE MEIOS DE CULTURAO DE MEIOS DE CULTURA
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Meios SlidosInoculao em profundidade (pour plate)
AVALIAAVALIAO DE MEIOS DE CULTURAO DE MEIOS DE CULTURA
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AVALIAAVALIAO DE MEIOS DE CULTURAO DE MEIOS DE CULTURA
CClculo da Produtividade (P)lculo da Produtividade (P)
Para calcular a produtividade Para calcular a produtividade a contagem devera contagem devercorresponder corresponder mesma mesma diluidiluio para os dois meios.o para os dois meios.
P = NA / NRP = NA / NR
NA= nNA= nmero total de colnias mero total de colnias obtidas no Meio de Avaliaobtidas no Meio de Avaliao.o.
NR= nNR= nmero total de colnias mero total de colnias obtidas no Meio de Referncia.obtidas no Meio de Referncia.
ExemploExemplo
Meio de AvaliaMeio de Avaliao= 200 ufc/mL o= 200 ufc/mL na diluina diluio (o (--6)6)
Meio de Referncia= 250 ufc/mL Meio de Referncia= 250 ufc/mL na diluina diluio (o (--6)6)
P= (200 / 250) = 0,8 P= (200 / 250) = 0,8
A produtividade pode ser A produtividade pode ser expressa em porcentagem (%).expressa em porcentagem (%).
A Produtividade de um meio deve ser 0,7 por microrganismo, que pode crescer facilmente no meio.
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MEIOS SELETIVOS E NO SELETIVOSMEIOS SELETIVOS E NO SELETIVOS
QualitativoQualitativo
Meios lquidos
Inocular 1mL de cada diluiInocular 1mL de cada diluio: 10o: 10--44,, 1010--55,, 1010--6 6 ,, 1010--7 7 e 10e 10--88 ..
Incubar os tubos na temperatura e tempo adequados para Incubar os tubos na temperatura e tempo adequados para cada microrganismo.cada microrganismo.
ApAps a incubas a incubao observar a maior diluio observar a maior diluio com crescimento o com crescimento (turva(turvao do meio).o do meio).
AVALIAAVALIAO DE MEIOS DE CULTURAO DE MEIOS DE CULTURA
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AVALIAAVALIAO DE MEIOS DE CULTURAO DE MEIOS DE CULTURA
CClculo da produtividade (P) lculo da produtividade (P) P = DA / DR
DA= diluiDA= diluio com turbidez no Meio de Avaliao com turbidez no Meio de Avaliaoo
DR= diluiDR= diluio com turbidez no Meio de Refernciao com turbidez no Meio de Referncia
ExemploExemplo
Meio de AvaliaMeio de Avaliao = 8 (o = 8 (ltima diluiltima diluio com turvao com turvao: o: -- 8)8)
Meio de Referncia = 10 (Meio de Referncia = 10 (ltima diluiltima diluio com turvao com turvao: o: --10)10)
TP =TP = 8 8 = 0,8= 0,8
1010
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AVALIAAVALIAO DE MEIOS DE CULTURAO DE MEIOS DE CULTURA
Para o mPara o mtodo qualitativo,o crescimento do todo qualitativo,o crescimento do microrganismo no desejado (negativo) no meio microrganismo no desejado (negativo) no meio seletivo deve ser a inibiseletivo deve ser a inibio de crescimento.o de crescimento.
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AVALIAAVALIAO DE MEIOS DE CULTURAO DE MEIOS DE CULTURA
Mtodo qualitativo com um tubo ou um frasco
Inocular com alInocular com ala de 1a de 1L, o microrganismo alvo L, o microrganismo alvo diretamente no meio a ser avaliado.diretamente no meio a ser avaliado.
Fazer o mesmo com microrganismo no desejado.Fazer o mesmo com microrganismo no desejado.
Leitura Leitura VisualVisual
ResultadoResultado 0 0 sem turbidezsem turbidez
1 1 pouca turbidezpouca turbidez
2 2 bem turvobem turvo
O valor para microrganismo alvo deve ser 2.O valor para microrganismo alvo deve ser 2.
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AVALIAAVALIAO DE MEIOS DE CULTURAO DE MEIOS DE CULTURAClculo do ndice de Crescimento Absoluto (ICA)
Dividir a placa em quadrantes e identificar com a numerao 1, 2, 3, 4 e um trao no centro da placa correspondente ao nmero 5.
Preparar a suspenso do inculo a 108UFC/mL.
Proceder da mesma forma na placa com meio de referncia.
Clculo= Cada estria dado um valor de 0,2. Multiplicar pelo nmero de estrias com crescimento.
Crescimento na estria central dado o valor de 1.
Clculo do ndice de Crescimento Relativo (ICR)
O ICR para um determinado microrganismo a comparao entre o ICA do meio em avaliao e o ICA do meio de referncia.
Avaliao Para todos os microrganismos em um meio de avaliao o ICA deve ser maior ou igual a 3,5.
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AVALIAAVALIAO DE MEIOS DE CULTURAO DE MEIOS DE CULTURA
Exemplo de formulExemplo de formulrio de Avaliario de Avaliao de Meio de Culturao de Meio de Cultura
MR= meio de refernciaMR= meio de referncia
AN= AN= gar nutrientegar nutriente
Meio Tipo Funo Incubao Microrg.
Controles
MR Mtodo Critrio Caract.
BairdBaird--
ParkerParker SSlidolido
ProdutividadeProdutividade 24h24h--48h 48h (35 (35 2)2)CC
S. aureusS. aureus
ATCC ATCC 2592325923
TSATSA QuantitativoQuantitativo >70%>70% ColniasColnias
NegrasNegras
HaloHalo
SeletividadeSeletividade 48h48h
(35 (35 2)2)CCE. coliE. coli
ATCC ATCC 2592225922
ANAN QualitativoQualitativo InibiInibioo --
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AVALIAAVALIAO DE MEIOS DE CULTURAO DE MEIOS DE CULTURA
QUALIDADE DA QUALIDADE DA GUAGUA
ReservatReservatrio de rio de gua gua conservaconservao, higienizao, higienizaoo
Deionizador , Osmose Reversa Deionizador , Osmose Reversa controles controles registro.registro.
Controles Controles microbiolmicrobiolgico e fgico e fsicosico--ququmico.mico.
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AVALIAAVALIAO DE MEIOS DE CULTURAO DE MEIOS DE CULTURA
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REFERNCIAS
Brasil, MinistBrasil, Ministrio da Agricultura, Pecurio da Agricultura, Pecuria e do Abastecimento. Secretaria ria e do Abastecimento. Secretaria de Defesa Agropecude Defesa Agropecuria. ria. InstruInstruo Normativa no Normativa n62 de 62 de 26/08/03.M26/08/03.Mtodos Analtodos Analticos Oficiais para Anticos Oficiais para Anlises Microbiollises Microbiolgicas gicas para Controle de produtos de Origem Animal e para Controle de produtos de Origem Animal e guagua. Bras. Braslia, 2003.lia, 2003.
EA/EURACHEM EA/EURACHEM EAEA--04/10. 04/10. Accreditation for Microbiological Accreditation for Microbiological LaboratoriesLaboratories. 2002.. 2002.
ABNT NBR ISO/IEC 17025ABNT NBR ISO/IEC 17025-- Requisitos Gerais para a Competncia de Requisitos Gerais para a Competncia de LaboratLaboratrios de Ensaio e Calibrarios de Ensaio e Calibrao.o. 2005.2005.
ISO. International Standard. ISO3696. Water for Analytical Laboratory Use Specifications and Test Methods. 1987.
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REFERNCIAS
EA/EURACHEM EA/EURACHEM EAEA--04/10. 04/10. Accreditation for Microbiological Accreditation for Microbiological LaboratoriesLaboratories. 2002.. 2002.
ABNT NBR ISO/IEC 17025ABNT NBR ISO/IEC 17025-- Requisitos gerais para a competncia de Requisitos gerais para a competncia de laboratlaboratrios de ensaio e calibrarios de ensaio e calibrao.o. 2005.2005.
AOAC INTERNATIONAL. AOAC INTERNATIONAL. Official Methods of Analysis of AOAC Official Methods of Analysis of AOAC International.International. 1818thth ed. 2005ed. 2005..
ISO 11133. Microbiology of food and animal feeding stuffs ISO 11133. Microbiology of food and animal feeding stuffs Guidelines on preparation and production of culture media Guidelines on preparation and production of culture media Part Part 1: General guidelines on quality assurance for the preparation o1: General guidelines on quality assurance for the preparation of f culture media in the laboratoryculture media in the laboratory. 2009.. 2009.
Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture mediamedia. ISO 11133. ISO 11133--2004.2004.
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REFERNCIAS
APHA American Public Health Association. APHA American Public Health Association. Compendium of Methods for Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods.the Microbiological Examination of Foods. 44thth ed. Washington DC. 2001.ed. Washington DC. 2001.
ISO. International Standard. ISO7218. Microbiology of food and animal feeding stuffs General rules for microbiological examinations. 2007.