AVALIAÇÃO DA ESTIMULAÇÃO DA MEDULA ESPINHAL … · simultâneo de diversas estruturas cerebrais...
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MAXWELL BARBOSA DE SANTANA AVALIAÇÃO DA ESTIMULAÇÃO DA MEDULA ESPINHAL COMO MODELO DE TRATAMENTO DA DOENÇA DE PARKINSON NO PRIMATA Callithrix jacchus. Tese de Doutorado apresentada à Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor em Psicobiologia. NATAL 2014
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MAXWELL BARBOSA DE SANTANA
AVALIAÇÃO DA ESTIMULAÇÃO DA MEDULA ESPINHAL
COMO MODELO DE TRATAMENTO DA DOENÇA DE
PARKINSON NO PRIMATA Callithrix jacchus.
Tese de Doutorado apresentada à Universidade
Federal do Rio Grande do Norte, como requisito
parcial para a obtenção do título de Doutor em
Psicobiologia.
NATAL
2014
ii
MAXWELL BARBOSA DE SANTANA
AVALIAÇÃO DA ESTIMULAÇÃO DA MEDULA ESPINHAL
COMO MODELO DE TRATAMENTO DA DOENÇA DE
PARKINSON NO PRIMATA Callithrix jacchus.
Tese de Doutorado apresentada à Universidade
Federal do Rio Grande do Norte, como requisito
parcial para a obtenção do título de Doutor em
Psicobiologia.
Orientador: Prof. Dr. Antônio Pereira Junior
Co-Orientador: Prof. Dr. Rómulo Antonio Fuentes
NATAL
2014
UFRN / Biblioteca Central Zila Mamede
Catalogação da Publicação na Fonte
Santana, Maxwell Barbosa de.
Avaliação da estimulação da medula espinhal como modelo de
tratamento da doença de Parkinson no primata Callithrix jacchus. /
Maxwell Barbosa de Santana – Natal, RN, 2014.
132 f.: il.
Orientador: Prof. Dr. Antônio Pereira Júnior.
Co-orientador: Prof. Dr. Rómulo Antonio Fuentes.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Psicobiologia.
1. Sagui comum – Tese. 2. Sagui comum – Doença de Parkinson -
Tese. 3. Estimulação medular - Tese. I. Pereira Júnior, Antônio. II.
Fuentes, Rómulo Antonio. III. Universidade Federal do Rio Grande do
Norte. IV. Título.
RN/UF/BCZM CDU 599.821
iii
AVALIAÇÃO DA ESTIMULAÇÃO DA MEDULA ESPINHAL
COMO MODELO DE TRATAMENTO DA DOENÇA DE
PARKINSON NO PRIMATA CALLITHRIX JACCHUS.
Autor: MAXWELL BARBOSA DE SANTANA
Data: Natal, 31 de Janeiro de 2014
Orientador: Prof. Dr. Prof. Dr. Antônio Pereira Junior
Co-Orientador: Prof. Dr. Rómulo Antonio Fuentes
Banca Examinadora: Prof. Dr. Antônio Pereira Júnior
Instituto do Cérebro – UFRN (Orientador).
_________ _______________________
Prof. Dr. Hougelle Simplício Gomes Pereira
Departamento de Ciências Biomédicas -
UERN.
__________ _______________________
Prof. Dr. Renan Cipriano Moioli
Instituto Internacional de Neurociências de
Natal (IINN-ELS).
_____________________________________
Prof. Dr. Clécio de Oliveira Godeiro Júnior
Professor Adjunto do Departamento de
Medicina Integrada - UFRN.
__________ _______________________
Prof. Dr. Jeferson de Souza Cavalcante
Professor Adjunto do Departamento de
Fisiologia - UFRN.
__________ _______________________
iii
Aos pacientes portadores da doença de Parkinson,
solidarizo-me nas suas lutas diárias.
Gostaria que este trabalho pudesse contribuir para
abrir uma nova porta na terapêutica desta patologia.
À minha querida avó, Lucibela Barbosa (in memorian)
iv
“Lembre-se que nada acontece por acaso, tudo é decorrência de
nossa ação ou omissão.”
(David Pereira Neves)
“Se acredita que consegue ou não consegue é o que acontece.”
(Henry Ford)
v
AGRADECIMENTOS
Ao professor Rómulo Fuentes, pela oportunidade oferecida para desenvolver este
trabalho. Pela confiança, orientação e dedicação na condução da minha carreira científica
durante o doutorado. Por seu exemplo e parceria durante os anos deste projeto desafiador. Por
seu incentivo, pela sua grande amizade que adquiri e por seus importantes conselhos ao longo
desta jornada no Instituto Internacional de Neurociências de Natal (IINN-ELS).
Ao professor Antônio Pereira, pela confiança e orientação durante o doutorado. Por ter
me apresentado este projeto quando iniciei esta jornada a 5 anos atrás. Por abrir as portas do
Instituto Internacional de Neurociências de Natal (IINN-ELS). Pela sua amizade.
Ao professor Hougelle Simplício, pela orientação e confiança durante o
desenvolvimento deste projeto. Pelos seus preciosos e pacientes ensinamentos que me
possibilitou aprender diversas habilidades para a realização de cirurgias com o Callithrix
jacchus. Pelos valiosos conselhos e pela grande amizade.
Ao professor Miguel Nicolelis, pelo apoio e confiança na realização deste trabalho.
Pelos incentivos e conselhos durante a execução deste projeto. Pelo admirável trabalho na
condução das atividades do Instituto Internacional de Neurociências de Natal (IINN-ELS), e o
seu trabalho sócio educacional, os quais me contagiaram e me incentivaram a vir para Natal.
Tenho profunda admiração por sua capacidade desbravadora e inovadora.
Ao professor Per Petersson pela orientação e pelas discussões durante a realização
deste trabalho. Pela sua amizade. Aos meus colegas Pär Halje e Ulrike Richter que auxiliaram
na análise eletrofisiológica dos dados. Ao Tobias Pálmer, por ter desenvolvido o software de
tracking e por sua amizade.
Ao professor Edgard Morya, pelo apoio na realização deste trabalho. Por sua ajuda
inestimável na estruturação do sistema de eletrofisiologia do CPM. Por seus ensinamentos nas
construções de partes dos componentes eletrofisiológicos usados neste trabalho. Por sua
amizade e conselhos.
À Jim Meloy e Gary Lehew pelo apoio na elaboração do projeto de construção das
matrizes de eletrodos de registros em multi áreas no Callitrhix jacchus. Pelos conselhos e por
suas amizades.
Ao professor Marco Freire pelo suporte na realização da histologia. Pela amizade e
discussões na realização deste trabalho.
vi
À Valéria Arboés por sua ajuda nas discussões durante a montagem dos aparatos
comportamentais. Por sua ajuda durante as cirurgias, ensinamentos no manejo dos animais e
pelas opiniões que contribuíram para realização deste trabalho. Pela sua amizade.
À Professora Hannah Buchanan-Smith pelos seus ensinamentos iniciais com o manejo
dos saguis. E cujos conselhos me incentivaram a adquirir um novo olhar sobre o Callithrix
jacchus.
Gostaria de agradecer aos funcionários do Instituto Internacional de Neurociências de
Natal (IINN-ELS), que foram sempre solidários e deram suporte para a realização deste
trabalho. Nominalmente, gostaria de agradecer ao bioterista Alexandre Nascimento pela ajuda
no manejo dos animais e pela ajuda durante a condução dos experimentos.
Aos meus colegas do Instituto Internacional de Neurociências de Natal (IINN-ELS),
pela amizade e discussão durante a realização deste trabalho, em especial, gostaria de
agradecer à Ivani Brys, Carolina Kunicki, Joanilson Guimarães, Nelson Lemos e Mariana
Araujo.
Aos alunos de iniciação científica que se disponibilizaram a me auxiliar na realização
deste trabalho, Alynne Soares, Pollyanna Schneider, Pedro Cavalcanti, Thayane Kerbele,
Thaís Vinholo e Carlos Eduardo Idalino.
À minha mãe, pelo carinho, apoio e paciência durante este período de ausência. Ao
meu pai, à D. Zilda e os meus irmãos pelo carinho e pelo apoio durante estes anos de
doutorado. Por permite alterar as suas rotinas para me auxiliar nesta jornada. A minha estadia
em Natal não teria sido fácil sem o apoio de vocês.
Aos meus amigos que me incentivaram nesta jornada. Em especial, gostaria de
agradecer ao professor Pergentino da Cunha Sousa, por seus conselhos e sua amizade nos
momentos difíceis desta caminhada.
À Pós-graduação de Psicobiologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte
pela oportunidade de desenvolvimento da minha carreira científica e pelo apoio dado no
desenvolvimento deste trabalho.
Às agências de fomento que contribuíram para a realização deste trabalho.
Gostaria de agradecer às demais pessoas que me auxiliaram de forma direta ou mesmo
indireta para a realização deste trabalho e gostaria de pedir desculpas por ter me esquecido de
citar nominalmente alguém.
vii
RESUMO
A doença de Parkinson (DP) é uma das chamadas desordens do movimento e é
causada pela degeneração dos neurônios dopaminérgicos das vias nigro-striatais. A maior
parte dos casos de parkinsonismo é idiopática e acomete com mais frequência pessoas de
idade avançada. Seus sinais clínicos característicos são o tremor de repouso, rigidez muscular,
bradicinesia e distúrbios do equilíbrio. Estas alterações são acompanhadas pela presença de
inclusões citoplasmáticas (corpos de Lewy), com o avanço da idade. Atualmente, os
principais tratamentos disponíveis para a DP são a farmacoterapia com levodopa e a
estimulação cerebral profunda. Essas terapias, entretanto, ou causam múltiplos efeitos
colaterais e sua eficácia diminui com o tempo (levodopa) ou apresentam restrições quanto à
elegibilidade dos pacientes devido ao seu alto grau de invasividade (estimulação cerebral
profunda). Este projeto de tese de doutorado tem como objetivo o estudo da estimulação
elétrica das colunas dorsais na medula espinhal (ECD) como terapia para o tratamento dos
distúrbios motores da DP. A grande vantagem da ECD é o seu grau de invasividade mínimo,
quando comparado com outras técnicas baseadas na estimulação elétrica do sistema
nervoso. Esta metodologia foi proposta para o tratamento sintomático da DP baseado em
estudos em roedores e em relatos de casos clínicos. A ideia deste estudo pré-clínico é testar a
eficácia da ECD utilizando avaliações comportamentais em um modelo de parkinsonismo em
primatas (Callithrix jacchus, o sagui comum). Adicionalmente, o registro eletrofisiológico
simultâneo de diversas estruturas cerebrais envolvidas com o controle motor, uma realização
feita pela primeira vez em estes primatas, permitiu estudar os mecanismos neuronais
subjacentes ao efeito terapêutico da estimulação da medula espinal.
viii
ABSTRACT
Parkinson's disease (PD) is a so-called movement disorders and is caused by the
degeneration of dopaminergic neurons of the nigro-striatais pathways. Most cases of
parkinsonism is idiopathic and most often it affects people of advanced age. Its characteristic
clinical signs are tremor at rest, muscular rigidity, bradykinesia and balance disorders. These
changes are accompanied by the presence of cytoplasmic inclusions (Lewy bodies) with
advancing age. Currently, the main treatments available for PD are pharmacotherapy with
levodopa and deep brain stimulation. These therapies, however, or they cause multiple side
effects and their effectiveness decreases with time (levodopa) or they have restrictions on the
eligibility of patients due to their high degree of invasiveness (deep brain stimulation). This
thesis project aims to study the electrical stimulation of the dorsal columns of the spinal cord
(SCS) as therapy for the treatment of motor disorders in PD. The great advantage of SCS is its
degree of minimum invasiveness compared with other techniques based on electrical
stimulation of the nervous system. This methodology has been proposed for the symptomatic
treatment of PD based on studies in rodents and clinical case reports. The idea of this
preclinical study was to test the effectiveness of ECD using behavioral assessments in a
model of parkinsonism in primates (Callithrix jacchus, the common marmoset). Additionally,
simultaneous electrophysiological recordings from several brain structures involved in motor
control, an achievement done for the first time in these primates, allowed to evaluate the
neural mechanisms underlying the therapeutic effect of spinal cord stimulation.
ix
SUMÁRIO
Página
LISTA DE ILUSTRAÇÕES xi
LISTA DE ABREVIATURAS xii
1 – INTRODUÇÃO 1
1.1 – DOENÇA DE PARKINSON. CONSIDERAÇÕES
HISTÓRICAS E EPIDEMIOLÓGICAS 1
1.2 – ASPECTOS CLÍNICOS 4
1.3 – RESUMO DAS ESTRUTURAS RESPONSÁVEIS PELO MOVIMENTO 9
1.3.1. Resumo da Organização dos Circuitos dos Núcleos da base 10
1.4 - SUBSTRATO NEUROANATÔMICO DA DP 15
1.5 – TRATAMENTOS DA DP 18
1.5.1 – Tratamentos Farmacológicos 18
1.5.1 – Tratamentos Não-Farmacológicos 25
1.5.2.1 - Técnicas lesionais 26
1.5.2.2 -Estimulação Cerebral Profunda (ECP) 27
1.6 – MODELOS ANIMAIS DA DOENÇA DE PARKINSON 30
1.6.1 – O modelo da 6-OHDA no sagui comum 35
1.7 - ESTIMULAÇÃO DAS VIAS DA COLUNA DORSAL:
DESSINCRONIZAÇÃO DE CIRCUITOS NEURONAIS ENVOLVIDOS NA DP 37
1.7.1 – Sincronização Anômala do Circuito Córtex
Motor-Tálamo-Núcleos da Base na DP 37
1.7.2 – Estimulação Elétrica das Colunas Dorsais 38
1.8 – JUSTIFICATIVA 42
x
2 – OBJETIVOS 44
2.1 – OBJETIVO GERAL 44
2.2 – OBJETIVOS ESPECÍFICOS 44
3 – PRIMEIRO ARTIGO: Objetivos específicos 1 e 2 45
Characterization of long-term motor deficits in the 6-OHDA model of
Parkinson’s disease in the common marmoset 47
4 – SEGUNDO ARTIGO: Objetivos específicos 3 e 4 79
Spinal Cord Stimulation alleviates motor symptoms in a primate model of
Parkinson’s disease 79
5 – CONCLUSÃO GERAL 97
6 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 101
ANEXOS
xi
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Página
Figura 1: Cronograma de Evolução da DP segundo os estágios de Braak. 8
Figura 2: Desenho esquemático resumido das vias direta e indireta através dos
Núcleos da Base. 16
Figura 3: Locais de ação de algumas drogas utilizadas no tratamento da DP na
sinapse dopaminérgica. 18
Figura 4: Metabolismo de síntese e degradação da dopamina. 20
Tabela 1: Complicações motoras e não-motoras associadas à farmacoterapia
com levodopa. 21
Tabela 2: Principais características das intervenções cirúrgicas utilizadas no
tratamento da DP 28
Figura 5: Desenhos esquemáticos de seguimentos da medula espinhal. 40
xii
LISTA DE ABREVIATURAS
6 – OHDA 6 – Hidroxidopamina
AMPT α-Metil-p-tirosina
AV Núcleo ventral anterior do tálamo
COMT Catecol-O-metil-transferase
DA Dopamina
DAT Transportador de dopamina
DAT-KO Animal geneticamente modificado que não expressa o transportador de
dopamina
DDC Enzima dopa-descarboxilase
DBS Sigla em Inglês para “Deep Brain Stimulation” (Estimulação cerebral
profunda)
DP Doença de Parkinson
DOPAC Ácido dihidroxifenilacético
ECP Estimulação cerebral profunda
ECD Estimulação elétrica das vias das colunas dorsais da medula espinhal
GABA Ácido gama-aminobutírico
GPe Porção externa do globo pálido
xiii
GPi Porção Interna do globo pálido
HVA Ácido homovalínico
L-DOPA L-dihidroxifenilalanina
LFP Potencial de campo local
M1 Córtex motor primário
MPTP 1-Metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina
MPP+
1-Metil-4-fenilpiridina
MAO-B Monoamima oxidase (Tipo B)
NB Núcleos da base (Gânglios da Base)
Put Núcleo putamen
Si3a Córtex sensorial primário
SNC Sistema nervoso central
SNpc Região pars compacta da substância negra
SNpr Região pars reticulada da substância negra
STN Núcleo subtalâmico
TH Tirosina hidroxilase
UPDRS Escala Unificada de Avaliação da Doença de Parkinson
xiv
VL Núcleo ventral lateral do tálamo
VLPN Núcleo posterior do tálamo
VTA Área tegmental ventral
1
1 – INTRODUÇÃO
1.1 – DOENÇA DE PARKINSON. CONSIDERAÇÕES HISTÓRICAS E
EPIDEMIOLÓGICAS
A doença de Parkinson (DP) é uma patologia que foi primeiramente descrita em 1817
pelo médico inglês James Parkinson, em uma monografia que se tornou célebre dentro na
História das Neurociências, intitulada: Um Ensaio Sobre a Paralisia Agitante (“An Essay on
the Shaking Palsy”)(Parkinson 2002; Fahn 2008).
James Parkinson descreveu as características desta patologia neurodegenerativa como
sendo um tremor de repouso, acompanhado de postura fletida e marcha acelerada e para
frente, com um curso progressivo; culminando após um período de anos em invalidez,
caquexia e por último, morte por inanição (Parkinson 2002). Ainda no século XIX, Jean
Marie Charcot, através da obra “Leçons sur les maladies du système nerveux”, também
contribuiu de forma importante para o estudo desta patologia ao detalhar mais características
clínicas da doença, entre elas a alteração postural, a rigidez muscular, a micrografia e a
bradicinesia. Além disso, Charcot sugeriu a mudança de nome da enfermidade, de “Paralisia
Agitante” para “Doença de Parkinson”, em homenagem à descrição da patologia realizada por
James Parkinson (Teive et al. 2001).
Outra contribuição importante foi feita ainda no início do século XX, pelo médico
russo Tretiakoff, através de seus estudos morfológicos post mortem em indivíduos portadores
da DP. Ele observou uma degeneração da substância negra do mesencéfalo destes pacientes,
acompanhado da presença de corpos de Lewy nesta área. Esta porção do mesencéfalo é
considerada atualmente como uma destacada região afetada pela DP (Lees et al. 2008).
2
Posteriormente, Marsden contribuiu de maneira significativa para o entendimento das
bases bioquímicas da DP, particularmente ao elucidar a participação dos defeitos do complexo
I mitocondrial e os estudos sobre o estresse oxidativo na etiopatogenia da doença. Além disso,
Marsden destacou-se pelas contribuições no entendimento da fisiologia dos núcleos da base,
uma área do cérebro atualmente envolvida em vários distúrbios do movimento, incluindo a
DP (Teive et al. 2001)
Por volta de meados do século XX, outro resultado importante apresentado por
Carlsson proporcionou um melhor entendimento das mudanças bioquímicas ocorridas no
cérebro, e particularmente, com a participação do neurotransmissor dopamina na DP.
Atualmente, este neurotransmissor é reconhecido por ter um papel chave na modulação
sináptica dos núcleos da base; e o entendimento da sua funcionalidade propiciou o surgimento
do principal tratamento farmacológico da DP até o momento, que é a farmacoterapia por
levodopa (Fahn 2008).
Mais recentemente, a melhor caracterização dos corpos de Lewy, especificamente a
descoberta de que estes têm como principal componente a proteína alfa-sinucleína, abriu uma
fronteira promissora no estudo da DP. Além do mais, a utilização da técnica de estimulação
cerebral profunda, como tratamento não-farmacológico da DP, destacou - se como terapia de
vanguarda e ferramenta experimental para o melhor entendimento desta patologia
neurodegenerativa.
Atualmente, a DP é considerada a segunda desordem neurodegenerativa mais comum
em pessoas de idade avançada atingindo indivíduos de ambos os sexos e todos os grupos
étnicos e classes econômicas (Van Den Eeden et al. 2003), (Wright Willis et al. 2010).
3
A DP apresenta uma prevalência crescente com o avançar da idade. Existem
estimativas que apontam que em indivíduos na faixa de 65 à 69 anos a prevalência da doença
seja entre 0,5 e 1 % dos indivíduos. Este percentual aumentaria em idosos acima de 80 anos,
atingindo uma prevalência de 1 a 3% dos indivíduos (Toulouse & Sullivan 2008).
Em um trabalho recente, Wright Willis e colaboradores (2010) fizeram um
levantamento epidemiológico detalhado da população idosa acima de 65 anos atendida pelo
serviço de saúde dos EUA. Estes autores encontraram uma prevalência média de 553/100.000
pessoas na faixa de 65-69 anos, e entre pessoas de 75-79 anos este valor foi de 1.881/100.000
indivíduos. Na população acima de 80 anos os valores médios de prevalência observados
foram de 2.757/100.000. Ainda neste estudo, os autores encontraram um aumento da
prevalência e da incidência da DP maior na população branca em relação à população negra,
asiática e hispânica dentro dos Estados Unidos. Ademais, embora tenham encontrado uma
associação inconsistente entre a vida no campo e a DP, os autores ressalvam a ocorrência em
certas populações rurais de valores elevados de incidência e prevalência da doença, assim
como uma maior prevalência e incidência da DP em áreas historicamente mais
industrializadas do país. Estas associações podem estar correlacionadas à fatores ambientais,
tais como a presença de contaminantes químicos como pesticidas e herbicidas (Wright Willis
et al. 2010).
No Brasil, existem poucos estudos oficiais mais recentes sobre a
incidência/prevalência da DP na população brasileira. Ainda assim, um estudo do Instituto
Brasileiro de Pesquisa e Estatística (IBGE) estimou a partir do censo demográfico de 2000
que a prevalência da DP em indivíduos entre 60 e 69 anos é de 700/100.000, e entre 70 e 79
anos é de 1.500/100.000. O IBGE estimou também que menos de 10% dos portadores da DP
têm menos de 50 anos e que 5% têm menos de 40 anos (Souza 2011).
4
1.2 – ASPECTOS CLÍNICOS
Clinicamente, a DP apresenta um conjunto de sintomas, entre eles alguns são
considerados como características cardinais desta patologia neurodegenerativa: o tremor de
repouso, a rigidez muscular, a bradicinesia e distúrbios do equilíbrio (instabilidade
postural). Esses sintomas normalmente surgem afetando inicialmente um lado do corpo. A
redução da expressão facial, diminuição da freqüência de piscar dos olhos e a hipofonia
também podem ser manifestações precoces. O espalhamento das características motoras para
o membro contralateral ocorre tipicamente 3 a 5 anos após o diagnóstico, implicando em
extensão do processo neurodegenerativo (Pahwa & Lyons 2007; Obeso et al. 2010).
O Tremor de repouso. O tremor na DP é tipicamente de repouso e desaparece
quando um movimento voluntário é realizado. Registros eletromiográficos mostram descargas
rítmicas à uma freqüência de 4-6Hz com disparos alternados em grupos de músculos
agonistas e antagonistas. As articulações distais dos membros são preferencialmente afetadas.
O tremor pode ser intermitente e ser aumentado pelo estresse ou por atividades que envolvam
concentração, tal como a contagem de palavras (Pahwa & Lyons 2007).
A Rigidez muscular. A rigidez na DP é um aumento no tônus muscular passivo, nos
grupos musculares extensores e flexores que se estende através de uma faixa de músculos. É
clinicamente expressa como uma rigidez nos grupos de músculos devido a um defeito na
obtenção completa do relaxamento muscular (Pahwa & Lyons 2007).
5
A característica mais típica da rigidez na DP é o aumento da resistência ao
deslocamento passivo da articulação normalmente associado com o fenômeno de “roda-
denteada” (semelhante a pequenos solavancos que o examinador percebe durante a
movimentação de um membro). Comumente, este fenômeno é observado nos membros
superiores. Movimentos voluntários simultâneos de outros segmentos do corpo podem
aumentar a rigidez (Pahwa & Lyons 2007).
A Bradicinesia. A Bradicinesia é caracterizada como uma lentidão na inicialização e
na execução dos movimentos. Pode ser observada durante a execução de movimentos
apendiculares repetitivos. A bradicinesia pode ser vista, intercambiavelmente, como parte de
um quadro geral mais amplo que inclui a Hipocinesia. Aqui será adotado a linha de visão de
pesquisadores que segregam o termo bradicinesia da hipocinesia, sendo que esta é definida
como pobreza de movimentos espontâneos e automáticos (menor frequência de movimentos).
Adicionalmente, será utilizado neste trabalho o termo Acinesia, que é entendido como
dificuldade em iniciar movimentos, ou mesmo ausência de movimentos(Pahwa & Lyons
2007).
Na DP, o paciente apresenta uma redução na taxa e amplitude de movimentos.
Movimentos automáticos tais como piscar, movimentos dos braços quando caminha, ou
comprometimento do passo quando caminha, bem como tarefas voluntárias mais complexas,
como escrever (micrografia) e beber e escovar os dentes podem ser afetados. Outros aspectos
da bradicinesia incluem salivação excessiva devido à disfagia de saliva e perda da expressão
facial (hipomímia) (Pahwa & Lyons 2007).
Instabilidade postural e distúrbios da marcha. Estas anormalidades aparecem nos
estágios finais da doença, quando os reflexos posturais necessários para manter o centro da
gravidade são afetados. Estão associados com perda do equilíbrio e a queda. A marcha
6
parkinsoniana é caracterizada pela flexão do tronco e movimento reduzido do braço ao
caminhar, sendo mais pronunciado no lado do corpo mais afetado. O portador da DP não
consegue mais caminhar com passos largos, os joelhos tornam-se flexionados e a marcha
torna-se arrastada. Com o progresso da doença, a paralisia começa a aparecer. Ao tentar
iniciar uma marcha o paciente pode paralisar, como se estivesse em um estado congelado
(Pahwa & Lyons 2007).
O diagnóstico da DP pode considerar a presença de ao menos três destes sinais:
tremor de repouso, a rigidez muscular, a bradicinesia e distúrbios do equilíbrio, sendo
que um deles deve ser a bradicinecia, um sinal chave, que é observado em combinação a dois
outros sinais em quase todos os pacientes que apresentam o diagnóstico da DP (Pahwa &
Lyons 2007).
Recentemente, outros elementos passaram a ser citados como possíveis sinais não
motores e anteriores ao aparecimento dos sinais cardinais. Em um artigo publicado em 2003,
Braak e colaboradores propõem uma periodização (sistema de estágio) para o surgimento dos
sintomas, baseado em estudos de imageamento, neuropatologia e avaliações clínicas e
epidemiológicas. Estes autores concebem estes estágios em uma fase prodrômica de
aproximadamente 20 anos ao início clínico dos sintomas motores característicos da DP,
seguido por um progresso da doença que poderia equivaler a aproximadamente 20 anos após
este diagnóstico (Braak et al. 2003).
São considerados 6 estágios, os quais englobam os períodos em relação ao início
clínico. Estes estágios têm mudança sequenciais e aditivas baseadas na presença da proteína
alfa-sinucleína e depósitos de Lewy (corpos de Lewy) no cérebro, coração e nervos
autonômicos periféricos (Braak et al. 2003; Hawkes et al. 2010).
7
Estes estágios de Braak incluiem os estágios de Hoehn & Yahr de 1967, cujas
observações eram focadas apenas nos estágios posteriores ao diagnóstico da DP e são
considerados modelos adotados no estudo desta patologia (Hawkes et al. 2010). (ver Figura
01).
A UPDRS, sigla em inglês para Escala Unificada de Avaliação da Doença de
Parkinson (UPDRS, Unified PD Rating Scale) também é amplamente utilizada na clínica. A
Escala UPDRS foi criada em 1987 e é usada para monitorar de maneira eficaz a progressão da
DP e a eficácia do tratamento medicamentoso. Esta escala considera o auto-relato do paciente
e a observação clínica na pontuação. Esta escala é dividida em quatro partes: avaliação de
atividade mental; comportamento e humor; atividades de vida diária; exploração motora e
complicações da terapia medicamentosa. É tida como bastante confiável e é vista
mundialmente como um método uniforme de avaliação da DP (Hobart et al. 1996; Goulart
2005).
8
9
1.3 – RESUMO DAS ESTRUTURAS RESPONSÁVEIS PELO MOVIMENTO
O conjunto de estruturas neuronais responsáveis pelo controle do movimento pode ser
dividido em quatro subsistemas distintos, altamente interconectados. O primeiro desses
subsistemas é representado pelos circuitos da substância cinzenta na medula espinhal. Os
tipos celulares existentes nesse subsistema correspondem aos motoneurônios alfa, que enviam
axônios para inervar a maior parte dos músculos estriados do corpo (a chamada via final
comum de Charles Sherrington). Os motoneurônios são inervados por neurônios sensoriais
primários da periferia e também recebem projeções descendentes de áreas motoras no tronco
cerebral e no córtex. Além disso, são contactados por interneurônios inibitórios que modulam
a sua excitabilidade (Purves 2007).
O segundo subsistema motor consiste de neurônios cujo corpo celular está localizado
no córtex e tronco cerebral. Os axônios desses neurônios de alta ordem descendem para a
medula espinhal, onde farão sinapses diretamente com motoneurônios alfa, formando um
circuito monosináptico efetor juntamente com um interneurônio, ambos na substância
cinzenta da medula espinhal. O terceiro e o quarto subsistemas são estruturas ou grupo de
estruturas que não tem acesso direto a motor neurônios ou interneurônios da medula espinhal,
mas, que exercem controle sobre o movimento pela regulação da atividade dos neurônios
motores superiores que dão origem as vias descendentes. Um desses subsistemas, o terceiro, é
o cerebelo, que tem como função corrigir erros de movimentos, comparando os movimentos
comandados pelo córtex e tronco cerebral com a retroalimentação sensorial sobre o
movimento que tem realmente ocorrido (Purves 2007).
Os núcleos da base (NB), localizados nas áreas subcorticais do cérebro, formam o
quarto subsistema responsável pelo controle do movimento. De um modo geral os Núcleos da
Base diferem do cerebelo por atuarem junto com áreas de associação do neocórtex no
10
planejamento e programação do controle do movimento (Purves 2007). A discussão dos seus
aspectos estruturais e funcionais será realizada de maneira separada a seguir. O melhor
entendimento da contribuição dos NB para o controle motor é proveniente dos estudos das
desordens ocorridas nestas áreas, tais como a DP e a doença de Huntington (Purves 2007).
1.3.1. Resumo da Organização dos Circuitos dos Núcleos da base
Os NB se referem a uma coleção de núcleos subcorticais constituídos pelo núcleo
caudado, o putâmen, o globo pálido externo (GPe) e Globo pálido interno (GPi) e o núcleo
subtalâmico (STN). Os seguintes núcleos talâmicos estão associados aos núcleos basais:
núcleo ventral anterior e núcleo ventral lateral. Além destes, há outros núcleos como a
substância negra (subdividida em pars compacta e pars reticulata) - uma estrutura
mesencefálica conectada de maneira recíproca com os núcleos da base (Purves 2007).
Em um modelo funcional considerado clássico, os núcleos da base têm dois pontos de
entrada primários: o estriado (núcleo caudado e o putâmen) e o núcleo subtalâmico. Estes
núcleos recebem aferências do córtex, de estruturas límbicas e do tálamo, além de aferências
modulatórias da porção da substância negra pars compacta (SNpc) do mesencéfalo e do
núcleo da Raphe. (Alexander et al. 1986; Albin et al. 1989; Haber 2003).
Estas duas estruturas de entrada (núcleo caudado e putâmen) então retransmitem sinais
por duas rotas, uma direta e outra indireta, aos principais núcleos de saída: o globo pálido
interno e a substância negra pars reticulata (SNpr). Os núcleos de saída projetam então
diretamente para o tálamo,e este para certos alvos corticais e regiões límbicas (Alexander et
al. 1986; Albin et al. 1989).
11
Citologicamente, o caudado e o putâmen são idênticos. Seus neurônios se dividem em
duas categorias dependendo se seus dendritos sejam espinhosos ou lisos. Os neurônios
espinhosos são os mais numerosos do estriado e funcionam como neurônios de circuito local e
de projeção, contendo a maioria deles mais de um neurotransmissor. Desta forma é possível
demonstrar uma divisão histoquímica do estriado para distintos neuropeptídos e enzimas
relacionadas com neurotransmissores (Graybiel 1990; Gerfen & Surmeier 2011).
Além disso, as conexões provenientes da substância negra (região pars compacta) para
o estriado (por meio do trato nigroestriatal) são as conexões estriatais mais intensamente
estudadas. Estas projeções utilizam a dopamina como neurotransmissor e tem como alvo as
espinhas dendríticas dos neurônios espinhosos médios do estriado e são terminações
imunorreativas para a enzima tirosina hidroxilase (TH), a qual sintetiza a dopamina (Gerfen &
Surmeier 2011).
A população de neurônios espinhosos estriatais recebe aferências corticais e talâmicas
e envia projeções eferentes pelas vias direta e indireta (Albin et al. 1989). Os neurônios
espinhais estriatais que fazem parte da chamada via direta expressam os receptores
dopaminérgicos do subtipo D1 (receptores D1 e D5). Esta subpopulação de neurônios
espinhosos envia projeções diretamente para o Globo pálido interno e para a substância negra
(região pars reticulada). Por outro lado, a subpopulação de neurônios espinhais estriatais da
via indireta expressam os receptores dopaminérgicos do subtipo D2 (receptores D2, D3 e D4)
e projetam axônios para o Globo Pálido externo. Funcionalmente, a via direta é tida como
facilitadora do movimento e a via indireta é tida como inibidora do movimento (Kravitz et al.
2010).
De acordo com este modelo, as projeções de ambas as vias direta e indireta incidem
sobre os núcleos de saída (GPi e SNpr) e estes, por sua vez, projetam para núcleos do tálamo
12
que enviam projeções de volta para o córtex motor. Em situações normais, o efeito da
transmissão dopaminérgica em ambas as vias direta e indireta diminui o fluxo inibitório dos
gânglios da base e aumenta a excitabilidade dos neurônios do córtex motor. (Gerfen &
Surmeier 2011). (ver painel A da Figura 2).
A partir do córtex motor, a informação é enviada para os motoneurônios através das
vias motoras descedentes laterais (especialmente os tratos corticoespinhal e rubro-espinhal) e
vias ventromediais (especialmente os vestíbulo-espinhais; os tratos tecto-espinhal e os tratos
retículo-espinhais pontino e bulbar) (Purves 2007).
Atualmente, consideram-se os NB também sob outros aspectos funcionais. Um
primeiro modelo alternativo destaca a participação do tronco cerebral, por meio do núcleo
pedúnculo pontino (NPP), e da formação reticular locomotora mesencefálica (RLM) e a
formação reticular pontomedular (FRPM) como alvos das projeções de saída dos núcleos da
base (via GPi e SNr),e, usando o mesmo conceito de ativação das vias direta e indireta, este
modelo propõe um papel motor chave dos NB como o início e término seletivo de sequências
motoras estereotipadas ou rítmicas. Estas sequências motoras normalmente são controladas
pelo tronco cerebral e circuitos da medula espinhal, muitas vezes referidas como programas
motores. Revisão detalhada deste conceito alternativo por (Haber 2003; Grillner et al. 2005;
Draganski et al. 2008; Obeso et al. 2008; Redgrave et al. 2010).
Sob um outro modelo, os NB são subdivididos anatomofuncionalmente em áreas
motoras, límbicas, associativas e sensórias. Esta divisão é mais abrangente e complexa do que
o modelo clássico de “via direta e indireta”. Especificamente sob o ponto de vista motor, os
NB podem ser entendidos como organizados em conexões intrínsecas e extrínsecas (Redgrave
et al., 2010). Em relação às conexões intrínsecas, a natureza da retroalimentação do
processamento da informação é mantida, como no modelo clássico, mas, atribuindo-se novas
13
possibilidades de interconexões entre as regiões dos NB, destacadamente entre o Globo Pálido
externo e o Núcleo Subtalâmico e o Globo Pálido externo e o estriado. Em relação às vias
extrínsecas, considera-se que os NB interconectam-se com estruturas externas como loops
paralelos segregados. Esta segregação a partir do córtex fornece “um aferente organizado
segregado para os principais núcleos de entrada dos NB”. Revisão detalha deste conceito
alternativo por Redgrave et al., (2010).
14
Figura 2: Desenho esquemático resumido das vias direta e indireta através dos Núcleos da Base. Em A,
na via indireta (sombra amarela), as projeções inibitórias transitórias do núcleo caudado e putamen
(estriado) projetam para os neurônios inibitórios tonicamente ativos na porção externa do globo pálido,
que projetam para o núcleo subtalâmico o qual também recebe projeções excitatórias do córtex (seta não
mostrada). O Núcleo subtalâmico envia projeções excitatórias para a porção interna do globo pálido. Este
último envia projeções inibitórias para os núcleos Ventral Anterior (AV) e Ventral Lateral (VL) do
Tálamo. Na via direta, as projeções inibitórias do caudado e putamen são ligadas diretamente à porção
interna do globo pálido. Na via direta, as projeções inibitórias do caudado e putamen projetam para os
neurônios inibitórios tonicamente ativos da porção interna do globo pálido, a qual projeta para os núcleos
Ventral Anterior (AV) e Ventral Lateral (VL). Note que a região pars compacta da substância nigra
(SNpc) tem ação inibitória na via indireta e excitatória na via direta. Em B, na condição parkinsoniana, o
balanço dos sinais inibitórios na via direta está alterado. As projeções da SNpc diminuem, o que dificulta
a inibição dos núcleos caudado e putamen. O resultado disto na via direta é uma inibição tônica
sustentada do globo pálido interno, fazendo com que haja uma menor inibição dos neurônios corticais
pelo tálamo. Adaptado de Purves et al. (2007).
Córtex Frontal Córtex Cerebral
Tálamo (Núcleos VL
e VA)
Globo Pálido
(Porção Interna) Globo Pálido
(Porção
Externa)
Núcleo
Subtalâmico
SNpc Caudado / Putamen
tônico
tônico transitório
Transitório transitório transitório
transitório transitório transitório Transitório
Via Indireta
A
Córtex Cerebral Córtex Frontal
Tálamo (Núcleos VL e
VA)
Globo Pálido
(Porção Interna) Globo Pálido
(Porção Externa)
Núcleo
Subtalâmico
SNpc Caudado / Putamen
Degeneração
Maior Inibição
tônica
Diminuiu Aumento
uu
Excitação
diminuiu
B (Doença de Parkinson)
Aumentou
15
1.4 - SUBSTRATO NEUROANATÔMICO DA DP
A principal mudança patológica observada nos indivíduos portadores da DP é a perda
de neurônios que produzem dopamina na parte compacta da substância negra. Outra
característica patológica chave é a presença de inclusões citoplasmáticas chamadas
corpúsculos de Lewy nos neurônios dopaminérgicos da substância negra. Estas inclusões
citoplasmáticas também são encontradas em outras áreas do cérebro, tais como o locus
coeruleus; os núcleos basais de Meynert; os núcleos motores basais do vago; o gânglio
simpático e o córtex cerebral (Obeso et al. 2010)
De acordo com Dauer & Przedborski (2003), estima-se que ocorra uma perda de 70-
80% da dopamina estriatal e uma perda de 50-85% dos neurônios da substância negra no
início dos sinais clínicos da doença de Parkinson. Nos estágios iniciais de evolução da
doença, os processos neurodegenerativos são principalmente confinados às fibras
dopaminérgicas inervando o aspecto dorso-lateral do putâmen e, portanto, as manifestações
clínicas são principalmente motoras. Com o progresso da doença, a perda de dopamina se
estende para todo o estriado e outras regiões no córtex cerebral, tronco cerebral e medula
espinhal também podem ser afetadas (Dauer & Przedborski 2003; Obeso et al. 2010).
A perda da aferência dopaminérgica da Substância negra (SNpc) para o estriado leva
ao aumento da atividade na via indireta, e uma diminuição da atividade na via direta. Essas
alterações causam um aumento na atividade dos neurônios da região do globo pálido interno,
o qual resulta em aumento da inibição dos neurônios talamocorticais (Figura 02) (Braak &
Del Tredici 2008).
16
Esta perda de morte celular seletiva dos neurônios da SNpc permanece não totalmente
esclarecida, mas alguns estudos indicam que a homeostosia desta região é vulnerável à
diferentes fatores genéticos, celulares e ambientais que de maneira independente ou
simultânea podem influenciar nas taxas de morte celular ao longo do tempo (Obeso et al.
2010). Além disso, existe uma outra região adjacente à SNpc, a Área Tegmental Ventral
(VTA), que também possui neurônios dopaminérgicos, mas, que apresenta uma
suscetibilidade relativamente menor à degeneração (Salvatore & Pruett, 2012).
Esta discrepância de degeneração não isenta a VTA de também ser afetada por um
processo de degeneração celular. A VTA apresenta um processo de degeneração mais lento. A
causa desta diferença de suscetibilidade não está clara. Por exemplo, em um trabalho recente
com amostras de cérebros humanos de pacientes parkinsonianos, Reyes e colaboradores
(2013) indicam que existem diferenças na composição do transportador de dopamina e de
autorreceptores dopaminérgicos de superfície de membrana das células do VTA e da SNpc.
Esta diferença entre as células dopaminérgicas poderia contribuir para este padrão de morte
heterogêneo observado (Reyes et al. 2013).
Durante a progressão da DP, os alvos dos neurônios dopaminérgicosnos NB são
afetados de maneira diferente (Brooks & Piccini 2006). Na fase inicial, os terminais
dopaminérgicos da região dorsal do putâmen são afetados primeiramente. Em seguida, os
terminais localizados na porção anterior do putâmen e a cabeça do caudado também são
afetados. Por consequência, o globo pálido interno apresenta um aumento da regulação
dopaminérgica. Esta localização inicial da degeneração dos terminais dopaminérgicos tem
sido correlacionada com sintomas da DP como a rigidez e a bradicinesia (Brooks et al. 2003).
Na fase avançada, estudos de Tomografia por Emissão de Pósitron (PET) com o
marcador 18F-dopa associado à análise histopalológica do cérebro de paciente com a DP
17
mostraram uma extensão dos danos para outras áreas que compõem os NB. Inclui-se também
nesta progressão a redução significativa dos neurônios dopaminérgicos da SNpc (Braak et al.
2003; Brooks & Piccini 2006).
As alterações descritas acima na DP levam ao surgimento de um fluxo de saída
inibitório extremamente alto dos NB (via GPi e SNpr). Este fluxo é anormal e acarreta em
uma inibição dos núcleos talâmicos Ventral Anterior (AV) e Ventral Lateral (VL) e, portanto,
uma menor ativação dos neurônios corticais pelo tálamo (Dauer & Przedborski 2003). Por
consequência, há uma falha no processo de desinibição de circuitos corticais, normalmente
mediado pelos NB. Esta falha se reflete na essência conceitual da DP, que é considerada uma
desordem hipocinética de movimento (Pahwa & Lyons 2007) (ver Figura 02).
Córtex Cerebral Aumentou
uu
18
1.5 – TRATAMENTOS DA DP
1.5.1 – Tratamentos Farmacológicos
Até os anos 1960, o tratamento da DP era fundamentado no uso de medicamentos com
ação anticolinérgica e no tratamento cirúrgico com ablação de alvos localizados nos NB. O
aparecimento da levodopa, contudo, permitiu uma revolução no tratamento desta doença. Este
fármaco, que é um precursor da dopamina, foi introduzido como agente terapêutico a partir de
estudos em modelos animais de parkinsonismo por Arvid Carlsson (Iversen & Iversen 2007).
A ação desta droga reduzia significativamente a intensidade dos sintomas de
impedimento motor nos modelos animais da doença e posteriormente mostrou-se eficaz em
humanos (Cotzias,1967 citado por (Ponce & Lozano 2011). Desse modo, este fármaco
promoveu um surpreendente impacto em pacientes que estavam afetados com DP fazendo
com que voltassem a ter uma vida próxima do normal (Ferraz, 2004).
A levodopa (também conhecida como L-dopa ou L-3,4-dihidroxifenilalanina) até hoje
é considerada a pedra angular do tratamento da DP, tida como o padrão ouro na terapêutica
desta patologia. A levodopa quando administrada por via oral é absorvida no duodeno e
transportada pela corrente sanguínea, e pode então atravessar a barreira hematoencefálica
através de transportadores de aminoácidos neutros. Ao chegar até o cérebro é convertida em
dopamina pela ação da enzima dopa-descarboxilase (DDC). Esta conversão pode ocorrer nos
neurônios dopaminérgicos remanescentes na substância nigra ou por neurônios não
dopaminérgicos ou ainda por células da glia na região do estriado (Figura 03) (Fahn 2008).
A levodopa é inativada por duas enzimas presentes na corrente sanguínea, a DDC e a
Catecol-O-Metil-Transferase (COMT). A DDC converte a levodopa em dopamina, o que
19
Figura 3: Locais de ação de algumas drogas utilizadas no tratamento da DP na sinapse
dopaminérgica. Em azul, é mostrado os grupos de agentes terapêuticos que atuam sobre a
porção pré-sináptica (neurônios dopaminérgicos remanescentes) e na porção pós-sináptica.
Adaptado de (Singh et al. 2007).
20
pode levar a ocorrência de náuseas, vômitos e hipotensão ortostática. A COMT converte a
levodopa em 3-O-metil-dopa. A meia vida plasmática da levodopa é considerada muito curta,
não passando de 90 minutos. Nas apresentações comerciais de levodopa sempre há a
combinação com drogas inibidoras da ação periférica da DDC, como a benzerasida ou a
carbidopa. Há também drogas com ação inibitória sobre a COMT (tolcapone e entacapone)
que podem estar presentes nestas apresentações comerciais (Singh et al. 2007).
Outras drogas utilizadas no tratamento da DP são a selegilina, a amantadina e
agonistas dos receptores dopaminérgicos. A selegilina tem uma ação inibidora da enzima
monoamino-oxidade (MAO), que é uma das enzimas responsáveis pelo metabolismo da
dopamina (Ver Figuras 03 e 04). A amantadina, por sua vez tem uma ação semelhante à da
anfetamina, fazendo uma estimulação catecolaminérgica indireta (Ferraz 2004).
21
Figura 4: Metabolismo de síntese e degradação da dopamina. Em A, a via de síntese da dopamina a
partir da tirosina. Notar que a dopamina, a noradrenalina e a adrenalina fazem parte de uma mesma
via de síntese, e são quimicamente semelhantes com a presença do anel catecol. Em B, a dopamina
é degradada pelas enzimas MAO e COMT, gerando dois principais metabólitos: Ácido 3,4-
Dihidroxifenilacético (DOPAC) e Ácido Homovanílico (HVA). Adaptado de (Fahn 2008) e
(Eisenhofer et al. 2003).
B A
22
A farmacoterapia com levodopa oferece o melhor controle sintomático da DP.
Entretanto, o tratamento prolongado com a levodopa pode levar a complicações motoras
graves, incluindo diferentes tipos de discinesias (Tabela 1). Em muitos pacientes, os períodos
de dificuldade motora estão também associados com dor, ataques de pânico, depressão severa,
confusão e sensações de morte (Stocchi 2009).
Tabela 1: Complicações motoras e não-motoras associadas à farmacoterapia com levodopa.
Flutuações motoras Principais complicações não-motoras
“Fenômeno de encurtamento do tempo de efeito” (Wearing-off phenomenon)
Ansiedade, agitação, irritabilidade
“Retardo do início do efeito” (Delayed ON)
“Ausência do efeito” (no ON) Dor, formigamento, sudorese, calor, fadiga,
mudanças de humor, sonolência, urgência
urinária
“Fenômeno liga-desliga” (“ON-OFF” phenomenon)
Discinesias
Distonias de pico de dose
Bifásica
Distonias de período “OFF”
Fonte: Adaptado de (Stocchi 2009).
As complicações motoras decorrentes do uso prolongado da levodopa ainda são alvo
de intensa investigação. Neste sentido, algumas teorias foram apresentadas para tentar
explicar o mecanismo que causaria estas complicações. Uma dessas teorias associa as
complicações motoras à estimulação pulsátil, não fisiológica dos receptores dopaminérgicos
(Olanow et al. 2006). Esta conclusão é sustentada por observações que indicam que os
neurônios dopaminérgicos na SNpc disparam tonicamente a uma taxa relativamente constante
23
de 3–6 Hz e a dopamina estriatal é mantida em níveis relativamente constantes, como
mostrado por trabalhos que empregaram técnicas de microdiálise e amperometria (Stocchi
2009). Assim, a resposta promovida pela levodopa seria no sentido de alterar os níveis de
dopamina na fenda sináptica de uma forma variável, e com o passar do tempo dependente da
concentração de levodopa sanguínea. Esta modulação a longo prazo acarreta no surgimento
dos efeitos adversos deste fármaco e, entre estes, os sintomas motores da discinesia são
destacamente os mais relatados (Olanow et al. 2006).
Uma outra classe de agentes farmacológicos também usada na tratamento da DP são
antagonistas colinérgicos (anti-Ach). O uso destes agentes como anti-parkinsonianos foram
primeiramente propostos por Charcot. O alvo da ação desta classe de fármacos são os NB,
onde há normalmente um balanço entre a neurotransmissão dopaminérgica e colinérgica. Na
DP, há um excesso relativo da transmissão colinérgica devido à deficiência de dopamina. Ao
se bloquear os receptores colinérgicos recupera-se o equilíbrio perdido (Singh et al. 2007).
A amantadina é outro fármaco também utilizado no tratamento da DP. Ela é um
fármaco antiviral cujo mecanismo de ação ainda é não totalmente esclarecido, mas parece
exercer uma ação peculiar de antagonista de receptores NMDA, além de estimular a secreção
de dopamina, a inibição da recaptação de dopamina pelos neurônios da SNpc e além de uma
possível ação estimulatória sobre os receptores dopaminérgicos (Olanow et al. 2006; Singh et
al. 2007). Sua ação antiparkinsoniana foi descoberta acidentalmente ao se perceber a melhoria
do estado motor de um indivíduo bradicinético ao qual se prescreveu o fármaco devido um
quadro gripal (Singh et al. 2007).
Os agonistas dopaminérgicos, foram introduzidos em 1974 e foram desenvolvidos na
tentativa de superar as limitações da levodopa no tratamento da DP (Olanow et al. 2006). É
uma classe de drogas com propriedades físicas e químicas diferentes entre si, mas de ação
24
farmacológica semelhante: substituem a dopamina, poupam o metabolismo glial, e estimulam
diretamente os receptores pós-sinápticos do estriado. Fazem parte desse grupo a pergolida,
lisuride, bromocriptina, apomorfina, cabergolina, pramipexole e ropinirole. As vantagens
desta classe de fármacos sobre a levodopa são (i) agem diretamente no estriado; (ii)
ultrapassam a barreira hemato-encefálica com facilidade e não sofrem concorrência pelo
transporte com aminoácidos aromáticos como a levodopa sofre; (iii) possuem ação mais
duradoura, e (iv) não sofrem metabolismo oxidativo (Stocchi 2009). A estas vantagens, pode-
se adicionar a menor incidência de complicações motoras, um reflexo provável de sua longa
meia-vida plasmática, variando entre 6 a 96 horas quando administrados por via oral (Stocchi
2009).
O papel dos agonistas dopaminérgicos no manejo de pacientes na fase inicial da DP foi
mais bem compreendido com os chamados estudos de monoterapia. Nestes estudos,
observou-se que a administração de pramipexole, carbegolina, pergolida e ropinirole reduziu
o risco de aparecimento das complicações motoras que surgem na terapia prolongada com
levodopa (Parkinson Study 2000) (Oertel et al. 2006). Embora a monoterapia com agonistas
dopaminérgicos possa ser efetiva na fase inicial da doença, com o passar do tempo (cerca de
três anos) ela se torna ineficaz, propendo os pacientes ao uso da levodopa como
complementação terapêutica (Jenner 2000; Olanow et al. 2006).
Os agonistas dopaminérgicos, embora menos potentes que a levodopa para o controle
dos sintomas motores parkinsonianos, têm menor potencial de indução de complicações
motoras, como flutuações e discinesias. Este efeito parece estar relacionado à capacidade
desses agentes produzirem estimulação dopaminérgica mais sustentada, ao contrário da
estimulação pulsátil determinada pela levodopa. Assim, os agonistas dopaminérgicos podem
ser utilizados na fase inicial da DP, prevenindo a ocorrência das complicações; e na fase
25
avançada da DP, atenuando as complicações relacionadas ao uso da levodopa, sobretudo as
flutuações (Olanow et al. 2006).
Os inibidores seletivos da COMT (catecol-O-metil-transferase), tolcapone e
entacapone foram introduzidos recentemente na terapia antiparkinsoniana. Propunham-se a
diminuir a dose de levodopa administrada aos pacientes com DP, ao bloquear a enzima
responsável por sua degradação. Porém, a hepatotoxicidade combinada com sua eficácia
discutível levou a uma utilização mais restrita (Olanow et al. 2006).
1.5.2 – Tratamentos Não-Farmacológicos
A abordagem cirúrgica da doença de Parkinson é uma alternativa que tem quase um
século de uso. Portanto, muito antes da introdução de medicação dopaminérgica, cirurgias já
eram executadas para tratar o tremor parkinsoniano. Estas, porém, falhavam em reduzir a
discinesia. Dezenas de técnicas de lesões e ablações foram propostas, e a maioria abandonada
em pouco tempo (Singh et al. 2007).
As deficiências da farmacoterapia prolongada para a DP, no entanto, contribuíram
para um novo enfoque neurocirúrgico, que pode ser dividido em três categorias maiores: (i)
técnicas lesionais, (ii) de estimulação cerebral e (iii) transplantes. No entanto, o tratamento
cirúrgico é restrito a poucos pacientes com a DP. Neste sentido, somente entre 5% a 10% dos
pacientes portadores da DP são considerados elegíveis para a intervenção cirúrgica. As
técnicas lesionais incluem a talamotomia (retirada do tálamo) e a palidotomia (retirada
bilateral do globo pálido). As técnicas de estimulação cerebral incluem a estimulação cerebral
profunda e a estimulação talâmica (ver Singh et al. 2007).
26
Segundo estes mesmos autores, “estes procedimentos geralmente não são
recomendados para os seguintes pacientes: (1) pacientes que não respondem à levodopa; (2)
pacientes muito idosos; (3) pacientes cujo principal sintoma é o tremor; (4) pacientes cujos
sintomas predominantes são o congelamento (“freezing”) e quedas; (5) pacientes que tem
sérios problemas psiquiátricos ou de saúde; e, (6) pacientes que possuem parkinsonismo
(oposto ao da DP idiopática).” (Singh et al. 2007, p.11).
1.5.2.1 - Técnicas lesionais
1. A talamotomia é uma técnica indicada para o tratamento do tremor no paciente
com a DP. Pode proporcionar uma redução significativa na intensidade do tremor (Pahwa &
Lyons 2007). Esta é uma vantagem do ponto de vista clínico, por reduzir ou abolir a
necessidade de uso de drogas anticolinérgicas. O quadro de acinesia pode permanecer
inalterado. Portanto, a melhora substancial da qualidade de vida do paciente não é absoluta,
uma vez que a acinesia figura entre os sintomas mais disabilitantes. As complicações incluem
apraxia do membro superior, disartria, disfagia, abulia e distúrbios da fala e da linguagem,
principalmente nas intervenções bilaterais (Pahwa & Lyons 2007).
2. A palidotomia estereotáxica do globo pálido interno é o procedimento cirúrgico
de escolha no tratamento de discinesias induzidas por levodopa, promovendo uma notável
melhora deste sintoma. Há melhora parcial concomitante da rigidez (Pahwa & Lyons 2007).
A lesão bilateral deve ser executada preferencialmente em uma única sessão. Também é o
procedimento mais adequado no tratamento de bradicinesia refratária à medicação. O
27
benefício na redução do tremor é bem mais discreto. Esta técnica cirúrgica apresenta
morbidade menor que a talamotomia e mortalidade nula. No entanto, há relatos de
complicações como disfunção cognitiva, disfagia, disartria, hemianopsia lateral homônima,
hemiparesia transitória, abscesso intracraniano e hemorragia subcortical e palidal. Os locais
acidentalmente lesionados são a cápsula interna e a radiação óptica (Pahwa & Lyons 2007).
1.5.2.2 - Estimulação Cerebral Profunda (ECP)
Há uma grande semelhança nos efeitos clínicos obtidos com lesão cirúrgica e a
estimulação cerebral profunda. Tal fato sugere que a estimulação elétrica crônica atue de
forma a romper ou inibir a atividade neuronal. A estimulação cerebral profunda possui a
vantagem de poder ser regulada ou mesmo suspensa, ao contrário das técnicas lesionais. Da
mesma forma, não impede que o paciente possa futuramente obter proveito de novas
abordagens (Pahwa & Lyons 2007).
O eletrodo, sustentado por uma bateria subcutânea que dura de 3 a 5 anos, pode ser
implantado no núcleo subtalâmico ou no globo pálido interno. Há evidências de que a
estimulação do núcleo subtalâmico produza melhores resultados. Ao atenuar as discinesias, a
estimulação subtalâmica permite o aumento da dose de levodopa; melhorar os sintomas
parkinsonianos independentemente da ação da levodopa e melhorar a bradicinesia. Além
disso, pode ser observado uma melhora do tremor. As complicações encontradas são disartria
e alterações do equilíbrio (Pahwa & Lyons 2007; Benabid et al. 2009).
28
A técnica de ECP do núcleo subtalâmico é um procedimento comumente utilizado
para casos mais avançados da DP. Nesta técnica, é feito um estudo pré-operatório de imagens
(principalmente ressonância magnética) para determinar a localização dos alvos de
estimulação. Durante a cirurgia são colocados primeiramente eletrodos de registro
eletrofisiológicos até a região alvo. Em seguida, estes eletrodos são substituídos por outros
que permitem iniciar as sessões de estimulação intra-operatória para avaliar a melhora do
paciente, sobretudo para a rigidez. Após confirmação da melhora, são implantados os
eletrodos de estimulação definitiva. Uma bateria subcutânea ligada ao eletrodo de estimulação
é inserida na região da clavícula, ao final da cirurgia, ou vários dias depois (ver Benabid et al.
2009).
O mecanismo de ação da ECP ainda não está totalmente esclarecido, mas, sugere-se
que a estimulação de alta frequência empregada poderia promover os seguintes mecanismos:
(1) pode haver uma interferência na funcionalidade das redes neurais da região estimulada
levando a uma dessincronização das oscilações anormais; (2) extinção ou inibição do disparo
neuronal; (3) Indução de disparos de alta freqüência na região alvo e (4) inibição da produção
ou liberação de algum neurotransmissor nas regiões afetadas (ver Benabid et al. 2009).
A tabela 2 resume as principais características das intervenções cirúrgicas utilizadas na
DP.
29
Tabela 2: Principais características das intervenções cirúrgicas utilizadas no tratamento da
DP.
Intervenção cirúrgica Características do procedimento
Palidotomia Procedimento de escolha no tratamento de
discinesias induzidas por levodopa e na
bradicinesia refratária à medicação. Os locais
acidentalmente lesionados são a cápsula interna e
a radiação óptica.
Talamotomia Indicada no tratamento do tremor. Pode
proporcionar uma redução de até 80% da
intensidade do tremor. É raramente realizado.
Estimulação Cerebral Profunda do Núcleo
Subtalâmico e Globo Pálido interno
O eletrodo, sustentado por uma bateria
subcutânea que dura de 3 a 5 anos, pode ser
implantado no núcleo subtalâmico ou no globo
pálido interno. Representa um custo elevado para
o paciente.
Estimulação Talâmica No tálamo é inserido um eletrodo que está
conectado à um pulso gerador localizado na pele
sobre o tórax. Possui as vantagens da
talamotomia.
Transplante Uma alternativa recente é o alotransplante de
células mesencefálicas de fetos. Apresenta três
problemas importantes: os de aspectos técnicos,
éticos e imunológicos. Ainda não há consenso
geral sobre a melhor localização onde devem ser
repostas as células dopaminérgicas e necessita-
se de pelo três mesencéfalos fetais para o
implante unilateral.
Fonte: Adaptado de Singh (2007).
30
1.6 – MODELOS ANIMAIS DA DOENÇA DE PARKINSON
O aumento do conhecimento sobre a fisiopatologia da DP depende da existência de
modelos animais adequados, que permitam a avaliação de novos agentes farmacológicos e
estratégias terapêuticas antes que estes sejam aplicados em humanos. As características da DP
podem ser mimetizadas, em maior ou menor escala, em animais de laboratório (como
roedores e primatas) através da administração de diferentes compostos farmacológicos:
reserpina, 6-hidroxidopamina (6-OHDA), 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP),
paraquate, manebe e rotenona (Dawson 2000); (Beal 2001) e (Shimohama et al. 2003).
Embora não exista um modelo animal ideal da DP, que satisfaça todos os critérios e
apresente todas as características associadas à condição clínica em humanos, como: (I) fácil
detecção das alterações motoras associadas ao parkinsonismo; (II) perda seletiva e gradual
dos neurônios dopaminérgicos com o avanço da idade e (III) produção de inclusões
citoplasmáticas (corpos de Lewy); alguns modelos têm sido de grande valia na elucidação dos
mecanismos moleculares relacionados à neurodegeneração na DP e na avaliação de novos
agentes terapêuticos (Shimohama et al. 2003).
O modelo da administração da reserpina e do AMPT (α-metil-p-tirosina) em roedores
foram os primeiros modelos para a avaliação de potenciais tratamentos para a DP. Por
exemplo, o modelo de administração da reserpina – uma droga que interfere com o
armazenamento vesicular de monoaminas, levando a uma depleção temporária nos níveis de
monoaminas nas terminações nervosas, induzindo hipolocomoção e rigidez muscular nos
animais – foi crucial para o desenvolvimento da levodopa como agente antiparkinsoniano
31
(Fahn 2008). Entretanto, a principal desvantagem de tais modelos é que os déficits motores
são temporários.
Em contraste, a 6-OHDA é uma das neurotoxinas mais comuns utilizadas
experimentalmente em modelos de degeneração da SNpc, tanto in vitro como in vivo (Blum et
al. 2001). A 6-OHDA é uma toxina efetiva em camundongos, ratos, gatos e primatas, mas, é
incapaz de atravessar a barreira hematoencefálica, sendo necessária a administração
diretamente na estrutura cerebral que se deseja lesar. (Schwarting & Huston 1996). Os sítios
de injeção de 6-OHDA comumente são a SNpc; o feixe prosencefálico medial (objetivando
lesionar o feixe nigroestriatal) e o estriado (Deumens et al. 2002) (Eslamboli 2005) (Simola et
al. 2007).
O modelo de DP em roedores induzido por lesão unilateral dos núcleos da base por 6-
OHDA tem sido empregado satisfatoriamente como um meio de detecção de potenciais
agentes antiparkinsonianos através da indução de comportamento rotacional após a destruição
da via nigroestriatal. Porém, a principal limitação do uso deste modelo é que este
comportamento rotacional não se assemelha com as anormalidades motoras ocorridas na DP
(Gerlach & Riederer 1996) (Deumens et al. 2002).
A injeção bilateral de 6-OHDA na SNpc ou em outras regiões cerebrais provoca uma
mortalidade neuronal elevada (Glinka et al. 1997). Esta droga apresenta similaridade
estrutural com as catecolaminas e tem alta afinidade pelo sistema de transporte das mesmas,
mostrando assim a sua seletividade por neurônios catecolaminérgicos. A 6-OHDA produz
lesões na SNpc pela indução da produção de H2O2 e radicais livres, como radicais •OH, e é
mais tóxica que o MPP+ (metabólito ativo do MPTP que é captado pelo transportador de
dopamina) para o complexo I da cadeia de transporte de elétrons (Shimohama et al. 2003)
(Simola et al. 2007).
32
Após a injeção de 6-OHDA dentro da SNpc ou o feixe prosencefálico medial, os
neurônios dopaminérgicos começam a degenerar dentro de 12 h e os níveis de dopamina
reduzem para níveis acentuadamente baixos de 2 a 3 dias depois. De maneira interessante, a
injeção intraestriatal de 6-OHDA causa uma morte neuronal induzida retrogradamente mais
progressiva que a sua administração dentro da porção mesencefálica substância nigra / área
tegmental ventral. A magnitude da lesão depende da quantidade de 6-OHDA injetada, o sítio
de injeção, e as espécies animais usadas (Schober 2004).
Animais lesionados bilateralmente com 6-OHDA demonstram sintomas motores
parkinsonianos acentuados que prejudicam sua alimentação e por isso causa alta mortalidade,
podendo prejudicar experimentos comportamentais de caráter crônicos (Ferro et al. 2005). A
6-OHDA é usualmente injetada unilateralmente, desta maneira, o hemisfério intacto funciona
como um controle interno, constituindo um modelo de hemiparkinsonismo caracterizado por
comportamento motor assimétrico (Betarbet et al. 2002).
Além disso, a injeção unilateral de 6-OHDA na substância negra ou no feixe
prosencefálico medial provoca a morte acentuada de neurônios dopaminérgicos no
mesencéfalo do lado aplicado e a diminuição de dopamina no lado correspondente do
estriado. Esses animais hemilesionados quando avaliados, em testes após a lesão, com
administração de agonistas dos receptores dopaminérgicos D1/D2, tais como a apomorfina e a
bromocriptina, apresentam comportamento rotatório contralateral em relação ao local de lesão
(Deumens et al. 2002). Por outro lado, drogas que induzem a liberação de dopamina, tais
como a anfetamina, causam rotações ipsilaterais à lesão (Metz & Whishaw 2002). Esse
comportamento pode ser explicado pela hiperexpressão dos receptores dopaminérgicos na
porção lesada do estriado (Gerlach & Riederer, 1996).
33
Outro modelo animal da doença de Parkinson é o camundongo geneticamente alterado
(knock-out, KO) para não expressar do transportador de dopamina (DAT-KO) (Giros et al.
1996). O transportador de dopamina (DAT) é responsável pela recaptação da dopamina
liberada para o terminal pré-sináptico, controlando a duração e a intensidade da transmissão
dopaminérgica. Nos animais DAT-KO, existe uma dependência estrita da dopamina recém
sintetizada (síntese de novo) para a função sináptica normal e os níveis de dopamina
extracelulares estão aumentados, levando à hiperatividade locomotora (Sotnikova et al. 2006).
A inibição aguda da enzima tirosina hidroxilase pela administração do fármaco AMPT (α-
metil-p-tirosina) resulta em uma depleção rápida (<15min), profunda (>99,8 %) e de longo
prazo (até 16 h) da dopamina estriatal. Os camundongos DAT-KO tratados com AMPT
apresentam grave acinesia, rigidez, tremor e ptose (Gainetdinov 2008).
Um avanço importante no desenvolvimento dos modelos animais da DP, bem como do
conhecimento acerca dos mecanismos relacionados ao processo neurodegenerativo desta
doença, deu-se com a descoberta do MPTP (Dauer & Przedborski 2003). O uso desta
substância foi um dos raros casos em que os efeitos da neurotoxina foram descobertos
primeiro em humanos, sendo posteriormente desenvolvido o modelo animal (Shimohama et
al. 2003).
O mecanismo da neurotoxicidade induzida pelo MPTP envolve, inicialmente, sua
passagem facilitada pela barreira hematoencefálica em virtude da sua lipofilicidade elevada
(Markey et al. 1984). No cérebro, o MPTP é convertido no íon 1-metil-4-fenil piperidínio
(MPP+) pela ação da enzima monoamina oxidase B (MAO-B), sendo esta conversão realizada
principalmente nas células da glia. O MPP+
é então captado pelo transportador de dopamina
nos terminais dopaminérgicos nigroestriatais, sendo este o fator determinante para a relativa
seletividade do MPTP sobre neurônios dopaminérgicos (Schober 2004).
34
Em primatas (homens, macacos e babuínos), o MPTP induz sinais que são
praticamente indistinguíveis da DP, como degeneração de neurônios dopaminérgicos da via
nigroestriatal, aparecimento de agregados da proteína α-sinucleína (embora não existam
corpos de Lewy característicos), além de distúrbios motores clássicos da DP, como rigidez
muscular, bradicinesia e instabilidade postural. Embora no modelo de parkinsonismo no sagui
comum induzido com MPTP não seja mostrado a ocorrência de tremor de repouso, estes
animais mostram um tremor corporal postural (Jenner 2003; Jackson & Jenner 2012). De
maneira similar ao observado na DP, a neurotoxicidade e os sintomas induzidos pelo MPTP
aumentam com o avanço da idade em primatas (Ovadia et al. 1995), podendo estes serem
revertidos quando tratados com levodopa e agonistas dopaminérgicos (Langston & Irwin
1986; Jackson & Jenner 2012).
No entanto, o MPTP é considerado uma droga que requer um risco de segurança alto
para quem manuseia os animais de experimentação. E, por essa razão, procedimentos
rigorosos de conduta experimental e equipamentos de segurança laboratorial adequado são
uma exigência absoluta para se trabalhar com este modelo de parkinsonismo (Przedborski et
al. 2001). Consequentemente, surgiram uma série de estudos que visaram o desenvolvimento
de modelos de parkinsonismo em um primata não-humano de fácil manejo com base em
lesões intracerebrais de 6-OHDA que minimizassem o risco de exposição tóxica inadvertida
para pesquisadores e a equipe de manutenção dos biotérios (Ungerstedt 1976); (Annett et al.
1992); (Mitchell et al. 1995); (Klintenberg et al. 2003) e (Jackson & Jenner 2012).
35
1.6.1 – O modelo da 6-OHDA no sagui comum
O sagui comum (Callithrix jacchus) passou a ser utilizado mais recentemente como
uma boa referência de estudo de modelo de envelhecimento e de doenças neurodegenerativas
como a DP (Tardif et al. 2011). Este pequeno primata do novo mundo possui uma expectativa
de vida máxima de 16 anos. Além disso, eles exibem mudanças relacionadas à idade em
patologias que se espelham àquelas observadas em humanos como amiloidoses, assim como
propensão à redução da atividade do complexo ubiquitina-proteassoma, semelhante à DP
(Zeng et al. 2005).
Nesta espécie animal, os principais modelos de indução de sintomas motores de
parkinsonismo induzido por 6-OHDA são: (a) injeção unilateral no feixe prosencefálico
medial (feixe nigroestriatal) ou (b) injeção unilateral no estriado. Estes modelos são bastantes
descritos na literatura, e como mencionado anteriormente, requerem uma intervenção
cirúrgica estereotáxica. Estes dois modelos possibilitam a avaliação da coordenação motora
fina; negligência sensório-motora contralateral ao sítio de lesão; viés de cabeça ipsilateral ao
sítio de injeção, rigidez contralateral, bradicinesia e rotação corporal quando o animal tenta
movimentar-se. Os primeiros sintomas surgem após 7 dias da administração de 6-OHDA. As
características neuropatológicas reportam para uma perda acentuada tanto nos neurônios
dopaminérgicos quanto nos níveis de dopamina observado na região estriatal ipsilateral à
injeção. Em ambos os modelos de parkinsonismo induzido por 6-OHDA não há a descrição
de presença de corpos de Lewy. Para mais detalhes ver os trabalhos de (Annett et al. 1992)
(Eslamboli et al. 2003), (Eslamboli 2005) e (Jackson & Jenner 2012).
No modelo de parkinsonismo induzido por injeção de 6-OHDA no feixe de projeção
nigroestriatal dopaminérgica (feixe prosencefálico medial) os sintomas citados acima são
mais acentuados, além disso, vale ressaltar que não há o surgimento de tremor de repouso de
36
3-5 Hz típico de lesão do mesencéfalo, como visto no ser humano (Brooks & Piccini 2006).
Este modelo de parkinsonismo será adotado neste trabalho, adotando o modelo descrito por
Annett (1992).
O modelo de injeção bilateral simultânea de 6-OHDA tanto no estriado quanto no
feixe nigroestriatal no sagui comum não são modelos frequentemente usados porque acabam
levando a impedimento motor acentuado, o qual requer durante muitos dias um cuidado
intensivo nos pós-operatório, além de elevada taxa de morbidade (Cenci et al. 2002).
Mais recentemente, modelos bilaterais de injeção de 6-OHDA no feixe nigroestriatal
foram conduzidos através de outra estratégia. Foi introduzida uma separação temporal das
cirurgias de lesão hemisféricas entre um lado. Ou seja, a injeção de 6-OHDA feita primeiro
em um hemisfério e depois de 8 semanas realizada no outro hemisfério, mostrou-se eficiente
em aumentar a sobrevida do animal. Neste modelo, também se faz necessário um cuidado
intensivo no pós-operatório, no entanto, este tempo despendido neste cuidado é reduzido
comparado ao modelo de injeção bilateral simultânea. Além disso, este modelo parece ter a
vantagem de otimizar o uso de um mesmo animal para uma avaliação comportamental em um
condição unilateral e posteriormente bilateral (Mitchell et al. 1995) (Klintenberg et al. 2003).
É importante destacar que a administração de 6-OHDA em primatas como um modelo
animal da DP promove um processo neurodegenerativo rápido, contrastando com o avanço
lento e gradual verificado na condição clínica (Eslamboli 2005).
37
1.7 - ESTIMULAÇÃO DAS VIAS DA COLUNA DORSAL: DESSINCRONIZAÇÃO DE
CIRCUITOS NEURONAIS ENVOLVIDOS NA DP
1.7.1 – Sincronização Anômala do Circuito Córtex Motor-Tálamo-Núcleos da
Base na DP
Um importante fenômeno eletrofisiológico observado da reunião de neurônios de uma
mesma região ou regiões distintas, é o fenômeno de sincronia das atividades neuronais. A
dinâmica de sincronização de disparos de neurônios tem sido proposta como um mecanismo
fundamental para representações de objetos perceptuais, esquemas cognitivos e funções
motoras (Singer 1999; 2001; Fries 2009; Uhlhaas et al. 2009). Neste sentido, por exemplo,
observa-se a atividade sincrônica da atividade correlacionada de diferentes neurônios entre o
córtex e os NB, que seguem “loops” de reentradas entre estas duas regiões, cuja atividade
cíclica se supõe sejam importantes para codificar diferentes tipos de movimentos (Hammond
et al. 2007).
Em modelos animais da DP, observam-se que os neurônios dos NB mudam o seu
comportamento mostrando sincronização aumentada e anormal, que pode ser vista como uma
reconfiguração dos circuitos cortico-estriatais após a depleção dos níveis de dopamina. Neste
sentido, os neurônios estriatais (que são na sua maioria silenciosos em uma condição normal)
tornam-se hiperativos e muitas vezes sincronizados no estriado “desnervado” (que não recebe
mais aferências dopaminérgicas), em um estado de rede dominante que envolve mais
neurônios ativos. As consequências destas alterações anômalas de sincronizações são
evidenciadas pelos sintomas motores da DP. Esta reconfiguração pode ser modulada,
38
revertendo-se, por exemplo, com agonistas dopaminérgicos diretos ou mesmo a levodopa
(Jaidar et al. 2010).
A sincronização da atividade neuronal das estruturas dos núcleos da base é também
evidente nos potenciais de campos locais (LFPs) registrados na região subtalâmica de
pacientes com a DP. Estas oscilações ocorrem principalmente na faixa de banda Beta (β) (~14
– 30 Hz) e após o tratamento com levodopa mudam para sincronização em frequências mais
altas na faixa de gama (Kuhn et al. 2004; Kuhn et al. 2006). Esta mudança no padrão de
bandas é compatível com a execução de movimento. Além disso, Estes registros sugerem que
as descargas de alguns neurônios do núcleo subtalâmico estão bloqueadas (presas) em
oscilações β (Uhlhaas & Singer 2006). Do mesmo modo, foi observado este padrão de
alteração anômala e a reversão para um padrão de oscilação gama em vários outros modelos
animais, como em primatas não-humanos (Hammond et al.,2007).
O núcleo subtalâmico é o principal sítio alvo de ação da técnica de estimulação
cerebral profunda em humanos. Sua efetividade terapêutica deve-se à aplicação de estímulos
elétricos de alta frequência (>100 Hz) sobre esta região dos núcleos da base. Acredita-se que
este padrão de estimulação possa promover uma ação de inibição da atividade deste núcleo, o
que leva a uma ação dessincronizadora e uma liberação do estado anômalo em que ficavam os
circuitos córtico-tálamo-núcleos da base na condição parkinsoniana (Benabid 2003).
1.7.2 – Estimulação Elétrica das Colunas Dorsais
Recentemente, uma técnica inovadora desenvolvida por Fuentes e colaboradores
(2009) demonstrou que a estimulação elétrica epidural das vias das colunas dorsais da medula
espinhal (ECD) em roedores, através do uso de eletrodos bipolares implantados na porção
39
epidural da medula espinhal restaurou a capacidade locomotora em dois modelos animais que
reproduzem os principais sintomas da DP. Os modelos foram: (1) um modelo de depleção
aguda de dopamina empregando camundongos DAT-KO tratados com AMPT e (2) um
modelo crônico que envolveu a perda de conexões dopaminérgicas nigrais através da técnica
de lesão bilateral estriatal com 6-OHDA em ratos (Fuentes et al. 2009).
Neste trabalho, os autores observaram que a técnica de ECD alterou o padrão de
atividade no córtex motor e na região dorsolateral do estriado para um estado que se
aproximou daquele encontrado durante a iniciação espontânea da locomoção, tanto nos
animais normais quanto nos animais que reproduziram a DP. Ou seja, a ECD além de
estimular as vias somestésicas (Holsheimer 2002) (Ramasubbu et al. 2013), poderia também
recrutar áreas relacionadas à motricidade levando a uma dessincronização cortical e estriatal,
requerida para a iniciação dos movimentos voluntários (Fuentes et al. 2009; Fuentes et al.
2010).
As chamadas colunas dorsais da medula espinhal são tratos de substância branca
localizados na porção dorsal da medula espinhal. São formados por fibras de neurônios de
segunda ordem, cujos axônios são do tipo grandes e mielinizado Aβ, que conduzem
informações sensoriais ascendentes corporais de tato fino, pressão e propriocepção ao cérebro.
As colunas dorsais da medula integram com o lemnisco medial do tronco cerebral o chamado
sistema coluna dorsal-leminisco medial, e são subdivididas em fascículo grácil e fascículo
cuneiforme. A figura 05 mostra a localização das colunas dorsais na medula. Para maiores
detalhes sobre a organização e fisiologia das vias sensoriais ver Purves (2007).
A estimulação dorsal da medula espinhal é uma técnica bastante conhecida para o
emprego no tratamento de diversos tipos de dor. A pesar dos mecanismos responsáveis pela
eficácia ainda estarem sendo descritos, seu uso é aprovado atualmente pela agência de
40
medicamentos e alimentos dos Estados Unidos (“Food and Drug Administration – FDA”)
para os seguintes tratamentos: dores crônicas, dores refratárias a medicamentos, dor bilateral
ou unilateral associada com a síndrome pós-lamectomia, dores lombares e dores nas pernas.
Além disso, a sua aplicação é autorizado para o tratamento de Neuropatias periféricas,
causalgias, radiculopatias, distrofia simpático-reflexa entre outras fontes de dor crônica (Kries
2009). Quanto ao tratamento de outras patologias, é descrito o seu uso experimental em
humanos, mas ainda sem estudos suficientes que permitam a aprovação pelas agências de
saúde. Entre estas últimas condições de aplicação de tratamento destacam-se: a transsecção
total da medula espinhal; paraplegia e quadriplegia (Fishman 2009; Harkema et al. 2011;
Ramasubbu et al. 2013).
Mais recentemente, nove trabalhos de casos-clínicos relataram a aplicação do uso da
técnica de estimulação da medula espinhal em pacientes portadores da DP, que possuíam um
histórico de dor crônica associado (Thevathasan et al. 2010; Weise 2010; Agari & Date 2012;
Fenelon et al. 2012; Hassan et al. 2013; Landi et al. 2013; Mitsuyama T 2013; Soltani &
Lalkhen 2013; Sidiropoulos et al. 2014). Em sete destes trabalhos os pacientes apresentaram
melhoras significativas dos sintomas motores da DP (Fenelon 2011; Agari & Date 2012;
Hassan et al. 2013; Landi et al. 2013; Mitsuyama T 2013; Soltani & Lalkhen 2013;
Sidiropoulos et al. 2014).
41
B T1 - Humano
C T2 - Sagui
D T1 - Rato
E T2 - Camundongo
Figura 5: Desenhos esquemáticos de seguimentos
da medula espinhal. Em A, uma visão coronal de
uma seção da medula espinhal, onde se observa a
localização da passagem das vias sensoriais
ascendentes representadas pela cor azul. Notar a
localização do Sistema Coluna Dorsal-Leminisco
Medial, subdividido em duas regiões: Fascículo
Grácil e Fascículo Cuneiforme (estas duas regiões
compõem as chamadas colunas dorsais da medula
espinhal). Em vermelho, estão marcadas as regiões
de passagem das vias motoras descendentes. B, C, D
e E são desenhos esquemáticos da medula a nível
torácico alto no Homem (B); Sagui (C); Rato (D) e
Camundongo (E). Nestas estruturas note a
semelhança das regiões da coluna dorsal. O
fascículo grácil está indicado pela sigla “gr" ;
enquanto o fascículo cuneiforme está sinalizado pela
sigla “cu”. As regiões estão sinalizadas por um
círculo vermelho. Adaptado de: (A) (Wikipedia
2013) e (B), (C), (D) e (E) adaptado de (Sengul
2013).
Dorsal
Ventral
A
42
1.8 – JUSTIFICATIVA
De acordo com as informações mostradas até o momento, o tratamento dos sintomas
motores da DP corrente envolve apenas o controle dos sintomas. No entanto, a Estimulação
Cerebral Profunda, a principal terapia não farmacológica utilizada atualmente no tratamento
sintomático da DP, atinge apenas uma fração de todos os pacientes que poderiam se beneficiar
desta terapia. O baixo número de pacientes elegíveis para este tratamento se deve, em parte,
ao procedimento cirúrgico altamente invasivo (Singh et al. 2007).
Era, portanto, um fato potencialmente importante que um método muito menos
invasivo pudesse ser desenvolvido e testado para se obter uma alternativa eficiente para
aliviar os sintomas motores em modelos de roedores da DP.
Com base neste sentido, a técnica de ECD como complemento do tratamento da DP
foi primeiramente desenvolvida em modelos de roedores no laboratório do professor Miguel
Nicolelis (Duke University – Estados Unidos) e se mostrou ser um complemento importante
na terapia da DP em modelos de roedores (Fuentes et al., 2009).
Após a implementação desta terapia nestes modelos animais, vários relatos de casos
clínicos foram reportados na literatura. Quase todos estes relatos indicaram que esta técnica
poderia se tornar uma alternativa para o tratamento dos sintomas motores da DP.
Com esta panorâmica de resultados experimentais envolvendo: 1) o sucesso da
eficácia da estimulação das colunas dorsais da medula espinhal como tratamento dos sintomas
motores de parkinsonismo em modelos de roedores e; 2) alguns relatos de casos clínicos que
descrevem semelhante eficácia em humanos, estabelecemos como meta investigar se a ECD
43
pode ser empregada como um complemento para o tratamento dos sintomas motores da DP,
em primatas não-humanos .
A nossa proposta foi utilizar para este fim o sagui comum (Callithrix jacchus), que
possui um manejo mais facilitado, tem baixo peso corporal, e apresenta um cérebro
lisencefálico. Porquanto, o sucesso da eficácia desta técnica implica como uma alternativa de
tratamento dos sintomas motores da DP em humanos em um número maior de pacientes
elegíveis quando comparado com técnicas mais invasivas utilizadas atualmente.
44
2 – OBJETIVOS
2.1 – OBJETIVO GERAL
O objetivo geral do presente trabalho consisti em estudar os efeitos da estimulação
elétrica das vias das colunas dorsais da medula espinhal em um modelo de parkinsonismo em
um primata não-humano, c omo uma avaliação pré-clínica desta terapêutica, utilizando
metodologias comportamentais; eletrofisiológicas e histológicas.
2.2 – OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1 - Adaptar um modelo de parkinsonismo agudo bilateral, através do uso de 6-OHDA
em primatas não-humanos da espécie Callithrix jacchus no Centro de Pesquisas de Macaíba
(RN) do Instituto Internacional de Neurociências de Natal Edmond & Lily Safra (CPM/IINN-
ELS), em parceria com a UFRN;
2 - Investigar as alterações comportamentais motoras nestes animais parkinsonianos;
3 - Utilizar a terapêutica experimental nos animais parkinsonianos com a técnica de
Estimulação das Colunas Dorsais (ECD);
4 - Analisar o padrão eletrofisiológico do córtex motor, tálamo e núcleos da base no
sagui comum e os efeitos da dessincronização da alça de controle motor entre estes circuitos
nos saguis parkinsonianos;
45
3 – Primeiro artigo: Objetivos específicos 1 e 2
Characterization of long-term motor deficits in the 6-OHDA model of Parkinson’s
disease in the common Marmoset
M. Santanaa,h
, T. Palmérb,c
, H. Simplícioa,i
, P. Peterssonb,, R. Fuentes
a,*, M.A.L.
Nicolelisa,d,e,f,g,
a Edmond and Lily Safra Institute of Neuroscience of Natal, Natal, Brazil, 59066-060
b Integrative Neurophysiology and Neurotechnology, Neuroanano Research Center,
Department of Experimental Medical Sciences, Lund University, BMC F10, S-221 84 Lund,
Sweden
c Mathematics LTH Centre for Mathematical Sciences, Faculty of Engineering, Lund
University BMC F10, S-221 84 Lund, Sweden
d Biomed. Engin., Duke Univ., Durham, NC
e Ctr. for Neuroengineering, Duke Univ., Durham, NC, USA
f Dept. of Neurobio., Duke Univ., Durham, NC, USA
g Dept. of Psychology and Neurosci., Duke Univ., Durham, NC, USA
h Psycobiology Program, Federal Univ. of Rio Grande do Norte, Natal, Brazil
i State Univ. of Rio Grande do Norte, Natal, Brazil
* Corresponding author at: Edmond and Lily Safra Institute of Neuroscience of Natal, Natal,
Brazil, 59066-060. Tel: +554008-0003. E-mail address: [email protected] (R.
Fuentes).
Artigo a ser submetido à revista: Behavioural Brain Research (ISSN 0166-4328; Qualis
A2).
46
Resumo
Pesquisas objetivando o desenvolvimento de novas terapias para a Doença de Parkinson (PD)
dependem criticamente de modelos animais válidos da doença que permitam o teste de
déficits motores durante períodos a longo prazo. Nós apresentamos aqui uma caracterização
completa de uma vasta gama de sintomas motores no modelo de parkinsonismo por lesão por
6-OHDA no sagui comum, quando avaliado por durante vários meses. A gravidade dos
sintomas motores foi quantificada tanto por meio de protocolos de pontuação manual
apropriadamente adaptados para incluir espécies de comportamento motor específico e
mediante o uso de procedimentos de rastreamento quantitativo de movimento automático,
com base na análise de imagem matemática de gravações de vídeos. As análises mostraram
que os métodos automatizados para permitir a caracterização rápida e confiável de alterações
no comportamento motor específico combinando os procedimentos de pontuação manuais e
sintomas motores robustos que foram observados durante vários meses puderam ser induzidos
quando se usou o procedimento de lesão neurotóxica em dois estágios, que envolveu a lesão
de um hemisfério de cada vez. Este modelo de parkinsonismo em um primata não humano
pode, portanto, ser bem adequado para a avaliação a longo prazo de novas terapias para o
tratamento da DP.
Palavras-chaves: Parkinson’s Disease; Common Marmoset; 6-Hidroxidopamine; Motor
disability, Automatic Analysis
47
Characterization of long-term motor deficits in the 6-OHDA
model of Parkinson’s disease in the common marmoset
M. Santanaa,h
, T. Palmérb,c
, H. Simplícioa,i
, P. Peterssonb,*, R. Fuentes
a,*, M.A.L.
Nicolelisa,d,e,f,g,
a Edmond and Lily Safra Institute of Neuroscience of Natal, Natal, Brazil, 59066-060
b Integrative Neurophysiology and Neurotechnology, Neuronano Research Center, Department of
Experimental Medical Sciences, Lund University, BMC F10, S-221 84 Lund, Sweden
c Mathematics LTH Centre for Mathematical Sciences, Faculty of Engineering, Lund University
BMC F10, S-221 84 Lund, Sweden
d Biomed. Engin., Duke Univ., Durham, NC
e Ctr. for Neuroengineering, Duke Univ., Durham, NC, USA
f Dept. of Neurobio., Duke Univ., Durham, NC, USA
g Dept. of Psychology and Neurosci., Duke Univ., Durham, NC, USA
h Psychobiology Program, Federal Univ. of Rio Grande do Norte, Natal, Brazil
i State Univ. of Rio Grande do Norte, Natal, Brazil
Research aimed at developing new therapies for Parkinson’s disease (PD)
critically depend on valid animal models of the disease that allows for repeated testing of
motor disabilities over extended time periods. We here present a thorough
characterization of a wide range of motor symptoms in the 6-OHDA marmoset model of
PD when tested over several months. Severity of motor deficits were quantified both
through manual scoring protocols appropriately adapted to include species specific
motor behavior and through the use of automated quantitative motion tracking based
on mathematical image processing of digital video recordings. Analyses show that the
automated methods allow for rapid and reliable characterization of changes in motor
behavior matching the manual scoring procedures, and that robust motor symptoms
lasting for several months could be induced when using a two-stage neurotoxic lesioning
procedure involving one hemisphere at a time. This non-human primate model of PD
may therefore be well suited for long-term evaluation of novel therapies for treatment of
PD.
48
1. Introduction
When investigating new therapeutic approaches for PD, researchers are crucially
depending on valid animal models of the disease in combination with reliable methods to
assess the symptoms displayed. Although several different animal models of PD exist, since
these models have proven to capture several important features of the disease, the preferred
choices by many labs today are the 6-hydroxydopamine (6-OHDA) lesioned rat or the MPTP-
lesioned non-human primate ([1],[2]). However, MPTP is a severe safety hazard to the
personnel handling the animals and for that reason strict procedures of experimental conduct
and appropriate laboratory safety equipment is an absolute requirement [3]. Consequently,
there have also been a number of studies aimed at developing a primate model of PD based on
intracerebral 6-OHDA lesions which would minimize the risk of inadvertent toxic exposure
for researchers and animal care taking personnel [4][5][6][7]. In parallel with the efforts to
improve animal PD models, more sophisticated and diverse methods to assess severity of PD
symptoms in animals has also been a key objective in the methodological development for
several labs ([8], [9]).
This work aims towards further improvement of the procedures used to assess
symptoms in animal models of PD, and is relevant to the entire field given that the validity of
the findings made in any experiment ultimately is dictated by the reliability and sensitivity of
the testing methods used. In particular, when evaluating new potential therapies, for example
neuromodulation approaches like deep brain stimulation ([10],[11]), or spinal cord stimulation
[12,13], robust testing procedures are needed to allow researchers to repetitively assess the
severity of the symptoms displayed over long time periods.
To this end we have here developed new methods for behavioral assessment of PD
symptoms in the 6-OHDA lesioned common marmoset (Callithrix jacchus). These procedures
include manual scoring of PD symptoms according to an adapted PD rating scale and
automated movement tracking procedures based on digital video recordings. Using these
methods, a thorough characterization of changes in motor behavior in seven marmoset
monkeys exposed to neurotoxic 6-OHDA lesions were conducted over a time period of
several months. By testing the animals in four different stages of the step-wise lesioning
procedure, different levels of symptom severity could be mimicked. The lesioning stages
evaluated were: 1) prior to lesion 2) after unilateral lesion 3) after bilateral lesion and 4) after
49
bilateral lesion and treatment with the dopamine synthesis blocker alpha-methyl-p-tyrosine
(AMPT). See Figure 1.
2. Material and Methods
2.1. Animals and housing conditions
Seven adult male common marmosets (Callithrix jacchus) 300-550g were used in the
study. The animals were housed in pairs in cages (1.0 x 1.0 x 2.3 m) in a vivarium with
natural light cycle (~12/12 hours). Each cage has cover for rain and direct sun light and the
vivarium has a mobile roof that can be opened or closed according to weather changes (such
as heavy rain). Common marmosets are endemic to Northeast Brazil where the vivarium is
located; thus ensuring suitable temperature, humidity and light conditions. To enrich the
housing environment, cages are supplemented with elements such sticks, tubes, ropes and
ladders. Each cage has a small wooden box used as nest for protection and sleeping. Animals
are offered two meals a day consisting of primate chow, local fruits, vegetables, mealworm
larvae, arabic gum, dairy products, grains, eggs, and meat.
All animal procedures were carried out according to approved protocols by AASDAP
Ethics Committee and strictly in accordance with the National Institute of Health Guide for
the Care and Use of Laboratory Animals (NIH Publications No. 80-23). This project was
approved by SISBIO/Brazilian Institute of Environment and Natural Resources (IBAMA)
(No. 20795-2).
2.2 Behavioral training
2.2.1 Skilled reaching in transparent behavioral box
A skilled reaching and grasping task based on modification of the methods developed
for by Campos-Romo et al., 2009 [14] (for African green monkey, and adapted in this work
for the common marmoset), it was carried out in a transparent acrylic box of 0.45 x 0.45 x
0.45 m. The box had one wall modified to include 8 small circular openings giving the
50
marmoset access from the inside of the chamber to four external shelves located at 58, 148,
238 and 328 mm from the floor with each opening centered 32 mm above the shelf. Two
cameras (AVT – Stingray F033C, 80 fps) were used for digital video recording, one for a top
view and the other for a side or front view (Figure 2). A disposable white sheet of ethylene
vinyl acetate foam was used to cover the floor of the box and to preventing the animal from
slipping.
The training of animals was divided into four stages. (I) In stage 1 the primary
aim is to familiarize the animal with the researcher and the testing set-up. First, the animal is
habituated to receive marshmallow and mealworm (Tenebrio molitor) in its home cage three
times a week for two weeks. Second, the animal is accustomed to a transportation box. In this
step the animal is encouraged to enter or exit the box through the use of food baits and it is
free to explore the box or to return to its home cage at any time. Once showing interest in
exploring the box, the animal is accustomed to a sound signaling entrance and another sound
signaling exit from the transport box. Third, the animal is habituated to exit from
transportation box and explore the transparent box used in the skilled reaching task. In this
training, three marshmallows (~60 mg; ~2x5x10 mm in volume) are placed on the floor of the
box to encourage the animal to explore the apparatus. Entrance to the task box is signaled
with a sound. This training scheme is performed twice a week for two weeks. All the
procedures are performed either between 10:30 and 12:00 or between 14:00 and 15:30,
corresponding to the intervals between the two main meals and to the normal peak of motor
activity. Generally, the performance in the skilled reaching task was the same in these two
periods of the day. The food rewards during training of the task replaced the juice portion that
the animals would normally receive in their home cages.
(II) In the second stage, the animals are trained to collect marshmallows from
the floor of the transparent box and from the external shelves. In this procedure, three
marshmallows are placed on the floor and 18 marshmallows are distributed in the first three
shelves. After the animal has retrieved all the marshmallows or if five minutes has passed, it
is returned to its home cage. At this stage, to guide the animal to the holes, six extra
marshmallows are placed close to the openings in the wall (holes that allow access to
shelves). After that the animal has recovered the first marshmallow from a shelf, the
marshmallows at the hole are removed. Three marshmallows are placed on the external
shelves at fixed distances from every hole. One of them is placed in a central point with
respect to the hole allowing the animal to use any of the arms to retrieve it and the other two
51
marshmallows are located 3 cm to each side of the central marshmallow. This arrangement
requires the animal to retrieve the marshmallows using the contralateral arm to the
marshmallows position. The animal freely chooses the sequence of visiting the different
holes. Animals are trained according to this procedure twice a week during a variable period
(1-2 weeks) depending on how quickly they learn the task. When the animal is able to retrieve
marshmallows from all shelves through the openings (with no marshmallows at the borders of
the openings) it enters the third stage.
(III) In stage three, the animals gradually improve with regard to the total
number of marshmallows collected during the 5 min period. Animals are trained once a week
and the performance of the animals typically increased every week until reaching a plateau (as
measured by the number of retrieved marshmallows and time to retrieve all). During this
period it was also noted which forelimb the animal preferred to use in the task, when it
retrieves the central marshmallow. This phase lasted up to 8 weeks, a point at which we
assume that the animal has reached plateau performance. This is verified re-testing the
performance after two weeks without training. This 2-week period corresponds to the period
of absence of behavioral tests following the 6-OHDA injections.
(IV) In stage four animals are retested after the 6-OHDA lesion. Weekly
performance in tests was compared to the pre-lesion period, between periods (unilateral
periods), and the period after the second lesion (bilateral period). The tests lasted for 24 weeks
in total after the second lesion.
2.2.2 Motor Activity in home cage
To analyze the spontaneous motor behavior of the animal inside the home cage over
extended periods of over 24 hours we used actimeters (Actiwatch Mini©, Camntech, UK.).
The actimeter allowed for quantification of the movements of the animal’s body at all times,
including the periods the animal spend in the the nest box.
To do the measuring, the actimeter must be weared by the animal. To this end, four
animals wore custom made vests (made of lightweight material that includes cotton fabric and
micro net) weighing 7g that allowed them to carry the actimeters for 3 consecutive days (72
hrs) once during the pre-lesion, hemi-lesion, and bilateral lesion periods. Activity data was
collected at a resolution of 2 s epochs.
52
2.3 Procedure for 6-OHDA injections
The animals were initially sedated with ketamine (10-20 mg/kg ,i.m.) and Atropine
(0.05 mg/kg i.m.) followed by deep anesthesia with isoflurane inhalated though a nose cone,
to be finally intubated with an endotracheal tube and ventilated with artificial ventilator to be
maintained with isoflurane 1-5% in oxygen at 1-1,5 L/min during the surgery. One mL of 6-
OHDA Hydrochloride (Sigma; 4 mg/mL dissolved in 0.05% ascorbate/saline solution) was
freshly prepared and stored on ice chamber before use. Five injections (2L each) were made
with a 32 gauge Hamilton syringe at 0.5 µL per minute into the medial forebrain bundle
(MFB) in the following locations (Anteroposterior/MediolateralL/Dorsoventral): 6.5/1.2/6.0;
6.5/1.2/7.0; 6.5/2.2/6.5; 6.5/2.2/7.5; 6.5/3.2/8.0, which corresponds to a slightly modified
version of the protocol used by Annett et al. 1992 [5]. After each infusion, the needle was left
in place for further 3 min.Anteroposterior coordinates were corrected according to the
dimensions of the skull of each animal based on the anatomy atlas by Stephan et al., 1980
[15] .
During the 3-5 days following the surgery, the animals received non-steroid anti-
inflammatory analgesic (Flunixin meglumine; Schering-Plough; 1 mg/kg, s.c.) and
dexamethasone (0.5 - 1mg/kg, i.m.), and a supplementary liquid high-energy diet. After 8
weeks, the same procedures were repeated for the second 6-OHDA lesion in the other
hemisphere. Thus, the animal was considered bilateral 6-OHDA lesioned in two stages,
representing the protocol used by Mitchell et al. 1995 [4]. The second 6-OHDA lesion was
made in the contralateral hemisphere to the preferred limb.
2.4 Description of manual PD scoring procedure
To evaluate the motor disability of the parkinsonians animals, we adapted a human
motor disability rating scale based on method developed by [16], [17] and [18]. The use of a
motor disability rating scale allowed us to quantify some behavioral changes that would not
be detected by means of automatic video analysis. Altogether we quantified 16 parameters:
(1) Tremor at rest; (2) Tremor in Motion; (3) Freezing; (4) Locomotion (gait); (5) Fine motor
skills; (6) Bradykinesia; (7) Hipokynesia; (8) Rigidity; (9) Body Balance / Coordination
(Spontaneous behavior); (10) Body Balance / Coordination (Induced behavior); (11) Posture;
53
(12) Alarm response (Startle response); (13) Climbing; (14) Gross motor skills; (15) Facial
Expression; (16) Vocalization.
For each parameter, the normal pre-lesion condition scores zero points, while the
maximum symptom severity and/or the lowest motor performance was deemed 3.
Intermediate impairment received 1 or 2 points. Some parameters were evaluated for each
body part (i.e., limbs, trunk, head), each receiving a maximum score of 3. Thus, different
parameters can have different total scores. For example, the "fine motor skills" parameter
totaled 6 points, because it had 2 sub-items (skilled use of each forelimb). The total
sum of scores for all the 16 parameters is 84.
The scoring methodology for this scale takes into account the individual variability of
the animals. Thus, previous to the lesion, the animals were filmed in their home cages. The
video of each animal was used as a reference to the same animal after 6-OHDA lesions. Thus,
the score of each animal after lesion was done comparing to the previous normal state.
The procedure for motor examination of the animals was done at the home-cage or in
behavior box, when we conducted the experiments with AMPT in behavior box (2x 240
mg/kg S.C.). In the cage, we proceeded as follows: the same observer-experimenter stood for
about 2 minutes in front of the home cage of the animal while observing and evaluating it.
Assessments occurred at two times of day: in the middle of the morning (~ 9 AM) or
afternoon (~ 5 PM). All tests were done before meals.
For the parameters "Climbing", "Bradykinesia", "Fine Motor Skills" and "Body
Balance (Induced)," two rewards of Tenebrio molitor or marshmallow were offered with
tweezers for each parameter to induce the desired motor behavior. For the evaluation of the
parameter "Rigidity", a clamp was offered to the animal for grabbing it with one arm at a
time, then gently slight movements of "push and pull" were made to observe the degree of
stiffness of each forelimb.
During the experiments with AMPT (2x 240 mg/kg S.C.), the assessment of the
manual PD scoring was made 6 hours after the first injection. During the AMPT experiments,
the animal was observed both in the cage and behavioral box. The observation in the box was
important to examine the parameters of "Bradykinesia", "Hypokinesia", "Freezing",
"Coordination (spontaneous)", "Posture" and "Fine Motor Skills" (which were evaluated
during the attempts to recover marshmallows from the shelves).
2.5 Description of automated tracking procedure
54
Motion tracking in the two setups was performed using similar methods. Software
tools were developed in MATLAB and included mex-implementations (MATLAB compiled
c-code; Mathworks Inc.). Constant light conditions between different recording sessions
eliminated the need for advanced background-models. Hence, a simple mixture of Gaussians
model was employed with only two levels of constant variations [19]. That is, each pixel is
modeled as belonging to one of two Gaussian distributions. The most probable distribution is
estimated and the expectation for the selected distribution is updated using the latest pixel
value. Consequently, the background image is contained in the brighter distributions, as the
animals' image in this set of experiments was always darker than the actual background. After
subtracting the background, difference images are threshold to produce the binary foreground
images used in the shape analysis(See Fig. 3).
By assuming that the two-dimensional image of the monkey in each camera plane is
approximately elliptically shaped, the position and orientation of the animal can be estimated
from the position and orientation of the three-dimensional ellipsoid that best fits the binary
foreground images. Given a binary foreground image F and a hypothetical foreground image
M generated by an ellipse (x, y, θ), matching quality is defined as
,
that is, the number of pixels with coinciding foreground classifications divided by the total
number of pixels classified as foreground. Note that the foreground image M is not actually
computed, but instead the quality measure is computed using the conic matrix for the ellipse.
Movement tracking in time is then carried out by using the last known location to initiate
estimation for a given frame followed by step-wise improvements of the matching quality by
gradual adjustments of the parameters of the estimated ellipse. These calculations are
performed for every frame in the video, resulting in the vectors (x, y, θ, q), each of length N,
where N is the number of frames in the video and q is the quality measure given above.
2.6 Description of automated extraction of kinematic parameters presented in plots
55
From the tracking data, relevant metrics summarizing changes in kinematic parameters
over the different experimental conditions were constructed. From the (x,y) position vectors,
instantaneous speed vector was constructed by calculating the distance between (x,y)
positions in successive image frames and dividing by the time resolution (ranging from 1/10
to 1/80 seconds). From the instantaneous speed vectors locomotion bouts were identified by
applying a motion threshold (10cm/s). A locomotion bout was defined as the period of time
where instantaneous speed was uninterruptedly greater than threshold. From a single
locomotion bout, different parameters could be obtained: maximum speed, average speed,
distance covered, duration and maximal acceleration.
2.7 Tyrosine-hydroxylase (TH) staining and quantification
After the period of the experiments, the animals were sacrificed by intracardiac
perfusion after deep sedation with ketamine (40 mg/kg IM); (xylazine 0.04 mg/kg IM) and
atropine (0,05 mg/kg IM). Intracardiac perfusion was performed with 0.9% saline solution
and heparin at 37 °C, followed by 4% paraformaldehyde in phosphate buffer (TF) 0.1 M (pH
7.4), cooled to 4 °C. The brains were removed and posfixed in the same solution for 2 h,
washed in 0.1 M phosphate buffer (pH 7.4) at 4 °C for 24 hours, crioprotected in 20%
following 30 % sucrose solution at 4 °C, and finally rapidly frozen for cryostat embedding
medium (Tissue -Tek ®, Sakura, Japan). The brains were kept in a freezer at -80 °C until
sectioned coronally at 50 µm in a cryostat (Carl Zeiss Micron, HM 550, Germany). The
sections were mounted on electrically charged glasses (SuperFrost Plus® - Fisher Scientific
International, Hampton, NH, USA).
Immunohistochemical stainings were performed on free-floating or mounted
directly on a glass slide (by SuperFrost® glass). The sections are reacted for
immunohistochemistry for detection of tyrosine hydroxylase (TH) in substantia nigra and
striatal region using modifications of the protocol of Eslamboli et al. (2003) [20].
The sections were washed in 0.1M phosphate buffer (PB) for 5 minutes. Then,
incubated in 1% hydrogen peroxide/methanol solution for 20 minutes to remove endogenous
peroxidase activity, and rinsed in 0,05% phosphate buffer-Tween 0,05% (PB-T) for 5
minutes. Then, the sections are surrounded with the aid of a hydrophobic PAP pen PEN and
incubated in 10% goat normal serum diluted in 0,1 PB for 30 minutes. The excess of serum
56
was removed and the sections were incubated in the primary anti -TH (rabbit polyclonal
antibody; 1:500; diluted in normal serum/PB; Merck Millipore, Billerica, MA, USA, Cod:
AB152) overnight at room temperature in the humidity chamber to prevent air-drying of the
tissue sections. The sections are washed with PB-T (5 min) and incubated in biotinylated goat
anti-rabbit secondary antibody (1:200, diluted in PB; Vector Labs, Burlingame, CA, USA,
Cod: BA1000) for 2 h. After that, the sections are washed again with PB-T (5 min) and then
incubated in avidin-biotin-peroxidase solution (Vectastain Standard ABC® kit, Vector
Laboratories, USA) for 1 hour.
After removal of the ABC® solution, the sections are washed in PB (5 min) and
then placed in a solution containing 0.03% 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate
(DAB) (Sigma Company, USA, Cod: D-5637) and 0.001% hydrogen peroxide in 0.1M PB.
Monitoring of the reaction is done in a light microscope. Then, the sections were washed and
the slides left to dry overnight. After dehydration through a series of graded alcohols and
clearance in xylene, the slides were coverslipped using Entellan® (Merck, Darmstadt,
Germany) mounting medium.
2.8 Quantification Analysis of Striatal TH-immunoreactive density and TH-cells in the SNpc
The tissue samples were mounted and photographed using a microscope with
the same camera configuration and under identical illumination conditions. TH+-reactivity in
both striatum (Caudate + Putamen) and SN in all groups was assessed by computer
densitometry using digital images captured with the camera (CX9000, MBF Bioscience Inc.,
USA) attached to the microscope (light field Nikon Eclipse 80i optical microscope, Nikon,
Japan - 10x and 20x objectives), attached to a. TH+ reactivity across striatum was assessed by
optical densitometry with the ImageJ software (National Institutes of Health, Bethesda,
Maryland, USA, http://rsb.info.nih.gov/ij/). Measurements were obtained by using a 0.2 mm2
square window positioned throughout striatal region (60 samples per striatum - per animal).
To reduce the effects of within-group variability, it was adopted a normalized scale based on
the reactivity for TH of the internal capsule (white matter) as TH background level staining
(averaged over measurements of 10 different sites using the same window). For each animal,
a contrast index was calculated according to the equation: C = (G–W)/(G+W) [21], in which
57
G is the average optical density (OD) of striatal tissue, and W is the OD of the white matter
(internal capsule). The data is presented as contrast index.
For the quantification of cells labeled by TH+, the borders of Substantia Nigra pars
compacta (SNpc) were defined according to the atlas by Stephan et al., 1980 [15]. The size of
the SNpc area was adjusted considering location: anterior, central and caudal area. We used
neighboring structures as reference. We measured the area of SNpc and we counted the total
number of cells labeled by TH (StereoInvestigator system, MBF Bioscience Inc., USA). We
quantified at least 3 sections per animal. The cell density was adjusted to TH+ Cells/mm2.
We used the area of SNpc from control group as a reference to measure the borders in all
animals, and the values of cells was corrected by this reference.
2.9 Statistical analyses
For motor disability rating and immunohistochemistry, the analysis were performed
using the software GraphPad Prism version 5.01 for Windows(GraphPad Software, San Diego
California USA).
Motor disability scores were pooled in 4 groups: 1st – 8
th, 9
th – 16
th, 17
th – 24
th
weeks after second lesion, and 9th – 16
th weeks after second lesion with AMPT, and analyzed
with a two-way ANOVA the 4 groups as the between effect and motor parameters as the
within effect. In the case of significant interaction between groups, we used post hoc
comparisons by using Bonferroni t tests, with level of significance set at alpha=0.05. The
comparisons between groups vs. pre-lesion or groups vs. AMPT testing were made using a
repeated measures ANOVA. In the case of significant interaction between groups, we used
post hoc comparisons by using Bonferroni t tests, with level of significance set at alpha=0.05.
For immunohistochemistry analysis, average values for all measurements were
assessed with non-parametric Mann-Whitney (Control x Lesioned). The criterion for
statistical significance was preset at an alpha = 0.05. Average values are expressed as mean
standard error of mean (SEM).
3. Results
58
3.1 Modeling the parkinsonism in the common marmoset after two-stage lesion
A primary aim of this study was to establish a chronic non-human primate
model of PD that will later allow evaluating different therapeutic approaches for PD over
multiple testing sessions spanning several weeks or even months. Moreover, to open up for
repeated assessment of the beneficial effects of experimental treatments on a range of
symptoms the model should preferably include several relatively stable stages characterized
by different degrees of disease severity.
Here, a multiple stage lesion paradigm was evaluated and was shown to produce
similar symptoms of PD in all animals tested over prolonged testing periods. Accordingly,
healthy animals would first receive unilateral lesions through injection of 6-OHDA into the
medial forebrain bundle of one of the hemispheres. Second, 8 or more weeks after the first
lesion, they received a second lesion in the contralateral hemisphere and, finally, representing
the most severe PD model, bilaterally lesioned animals would in addition be injected with a
inhibitor of dopamine synthesis (AMPT) causing a further reduction in dopamine levels and
aggravated symptoms.
In relation to parkinsonian symptoms observed after the first 6-OHDA
injection, we observed similar symptoms to those described by Annett et al. 1992 [5]. The
animals showed rigidity in the contralateral limbs to the injured hemisphere, ipsilateral head
position bias to the lesioned hemisphere, and visuospatial neglect contralateral to the lesioned
hemisphere. In addition, the animal showed evident body rotation while trying to ambulate,
especially in the ipsilateral direction, and difficulty to use the contralateral forelimb to lesion
hemisphere. However, despite these difficulties, the animal was able to ingest food and water
inside the cage by itself. Symptoms were stable up to 10 weeks after injury. After this period
they showed a significant improvement, but they did not return to previous behavioral state of
pre-injury.
After 8 weeks, the animals received the second injection of 6-OHDA in
another hemisphere. Similar to what is described by Mitchell et al. 1995 [4], from 2nd
to 8th
week, the animals showed strong motor impairment, which required special care, such as
regular oral delivery of food and liquid by syringe. This care was especially necessary during
the first two weeks after the second injury and was sufficient to ensure that the body weight of
59
the animals did not fall to below 90% of the preoperative weight. This parkinsonian condition
remained stable.
The observed symptoms were: (1) hunched posture (dorsal decubitus posture
was observed in the first 3 days), (2) few spontaneous movements (hypokinesia), (3)
Bradykinesia, (4) Episodes of freezing, (5) Uncoordinated gait, (6) difficulty of changing
posture to bipedalism, (7) difficulty in initiating movements (akinesia), (8) rigidity (especially
forelimbs), (9) the absence of rest tremor (unlike what is observed in humans). (10) However,
it was seen tremor in motion and sporadic postural tremor.
In some cases, (11) a slowed response alarm was also observed. Other
symptoms included: (12) slower climbing, (13) despite the lack of balance, the animals still
could hold a resting position in the branches supported on the four limbs, but with great
difficulty and abnormally, (14) episodes of hypomimia. Moreover, after the second lesion, the
animals had a (15) strong bilateral visuospatial spatial neglect, similar to blindness, in which
the animal had difficulty to finding objects in space. For example, when food was offered, the
animal would only perceive and accept it when the food was placed in contact with the
animal's mouth and lips. Additionally to these symptoms, the animal showed (16) strong
difficulty using their arms to grab any food offered, featuring a clear difficulty in using fine
motor skills. In some animals, the weakness was exacerbated by a worsening of gross motor
skills, in which the animal could not grasp the branches, for example. A few days after the
second injury, (17) the animals still showed some asymmetrical posture, which was
characterized by an ipsilateral head position bias in relation to the lesion. The postural
asymmetry observed after second injection disappeared 10 days after this second lesion. This
slowdown was accompanied by a slight gradual recovery (intensity) of parkinsonian
symptoms, notably a recovery of rigidity.
3.2 Evaluation of motor symptoms using an adapted PD motor disability rating scale for non-
human primates
In order to confirm that the motor symptoms displayed by each animal were preserved
over extended time periods, motor deficits were repetitively evaluated by an experienced
60
examiner using motor disability rating scale that was specifically adapted to the motor
behavior of the common marmoset (See Material and Methods for details).
The PD rating scores were divided according 3 periods after the 2nd
6-OHDA lesion
(1st – 8
th, 9
th – 16
th and 17
th – 24
th). After the second injection of 6-OHDA, there was a PD
score x Period interaction (Two-way ANOVA, period as between effect, motor parameters as
the within effect F[2,15] = 12,84, P<0,001). Post hoc analysis reveled significant differences
of motor disability rating scale between the 1st – 8
th vs the 9
th – 16
th weeks(Bonferroni t=
3.292, P<0.01) and 1st – 8
th vs 17
th – 24
th week (Bonferroni t= 4.757, P<0.01), but no
difference between the 9th – 16
th vs (17
th – 24
th weeks (Bonferroni t= 2.145; see Figure 4).
Post hoc analysis between the 1st – 8
th vs 9
th – 16
th weeks showed a significant
reduction of scores of bradykinesia (Bonferroni t=6.287, P<0.001) and rigidity (Bonferroni
t=5.287, P<0.001). The other symptoms did not differ significantly (see Figure 3). The
comparison between the1st – 8
th vs 17
th – 24
th weeks showed a significant reduction of
bradykinesia (Bonferroni t=5.234, P<0.001), hipokynesia (Bonferroni t=4.017, P<0.001),
rigidity (Bonferroni t=4.307, P<0.001), body balance (induced behavior) (Bonferroni
t=4.345, P<0.001), posture (Bonferroni t=4.345, P<0.001), and climbing (Bonferroni
t=4.075, P<0.001). The post hoc analysis between the 9th
– 16th vs 17
th – 24
th weeks did not
showed a significant difference of the score of the parameters; see Figure 3.
Following AMPT administration, there was a significant difference in the PD score
between Periods x AMPT treatment interaction (Two-way Anova, F[3,15] = 28,91, P<0.001).
Post hoc analysis revealed significant differences between the Period 1st – 8
th weeks x AMPT,
Bonferonni t=3.294, P<0.01; Period 9th
– 16th
weeks x AMPT, Bonferonni t=7.919, P<0.001;
and Period 17th
– 24th
weeks x AMPT, Bonferonni t=8.645, P<0.001; see Figure 05. AMPT
was given before and after the first lesion, and after the second lesion. Before the lesions,
parkinsonian motor symptoms were not observed. After first lesion the animal, showed classic
symptoms of unilateral lesion, like as head position bias; rotation; contralesional sensorimotor
neglect and contralesional skilled arm use (data not shows here). The analyzes here were
made after second lesion at box apparatus and motor disability rating scale (Figure 3 and 4).
Two animals were evaluated up to 30 weeks, by which time these two 6-OHDA
lesioned marmoset showed reduction of spontaneous disability. When AMPT was given, the
animals showed a increase in impairment rating scores.
61
When we compare the effect of AMPT test vs period 1st – 8
th weeks, AMPT
significantly increased the score of tremor in motion (Bonferroni t=9.181, P<0.001); freezing
(Bonferroni t=4.455, P<0.001); locomotion (Bonferroni t=4.102, P<0.001); fine motor skills
(Bonferroni t=3.966, P<0.01); bradykinesia, (Bonferroni t=8.475, P<0.001); hipokynesia
(Bonferroni t=3.776, P<0.01) and gross motor skills (Bonferroni t=5.433, P<0.001); see
figure 3.
When compared to theperiod 9th
– 16th
weeks, AMPT increased the score of tremor in
motion (Bonferroni t=7.872, P<0.001); freezing (Bonferroni t=5.487, P<0.001); locomotion
(Bonferroni t=4.556, P<0.001); fine motor skills (Bonferroni t=4.671, P<0.001);
bradikynesia (Bonferroni t=12.15, P<0.001); hipokynesia (Bonferroni t=5.210, P<0.001);
rigidity (Bonferroni t=6.043, P<0.001); startle response (Bonferroni t=3.511, P<0.01); gross
motor skills (Bonferroni t=6.533, P<0.001); see figure 3.
Similarly, when comparedto period 17th – 24
th weeks, AMPT showed increase of
score of tremor in motion (Bonferroni t=7.895, P<0.001); freezing (Bonferroni t=6.212,
P<0.001); locomotion (Bonferroni t=4.853, P<0.001); fine motor skills (Bonferroni t=5.048,
P<0.001); bradikynesia (Bonferroni t=11.13, P<0.001); hipokynesia (Bonferroni t=6.148,
P<0.001); rigidity (Bonferroni t=5.565, P<0.001); body balance (induced behavior)
(Bonferroni t=4.853, P<0.001); posture (Bonferroni t=4.853, P<0.001); startle response
(Bonferroni t=3.300, P<0.05); climbing (Bonferroni t=4.400, P<0.001); gross motor skills
(Bonferroni t=6.989, P<0.001); and vocalization (Bonferroni t=3.041, P<0.05); see Figure 3.
3.3 Twenty-four hour recordings of overall motility in the home cage
In addition to the more detailed characterizations changes in motor patterns the overall
motor activity in the home cage was also recorded for four animals. We report the results in
two of the, since the other two had incomplete data collection. Although the relative pattern of
motor activity during the day-night cycle was preserved in the parkinsonian animals, the
absolute amount of motor activity displayed was decreased; see figure 5.
3.4 Automatic assessment of PD symptoms
62
We compare the average speed in the box in different periods. After first lesion, the
speed reduced, but not significantly (ns, P<0,05, Kruskal Wallis test). Similarly, after the
second lesion, periods of week (1st – 8
th) and (9
th – 16
th), the animals showed reduced of the
average of speed, but not significantly when comparated to baseline (ns, P<0,05, Kruskal
Wallis test). The AMPT test, realized after second lesion, however, showed the significantly
reduction of a speed when compared with baseline (Kruskal Wallis test, post hoc analysis of
Dunn’ s test p<0,005), see figure 6 and 7.
3.5 Immunohistochemical verification of 6-OHDA lesions
On average, the staining intensity in the caudate-putamen of lesioned animals was
44±10% of that of control animals. (Figure 8 and 9).
Immunohistochemistry for TH reveled a significant reduction in the number of TH+
cells of the midbrain dopaminergic neurons projecting to the forebrain in the lesioned
hemispheres. The cell densities (number of cells/mm2) were 139.0±12.14 and 59.93±6.07 in
control animals and lesioned animals, respectively (P<0.01, U=33, Mann-Whitney U-test). In
addition, axonal terminal staining density in the caudate-putamen decreased in lesioned
animals. The contrast index showed a reduction in caudate control vs bilateral lesioned
animals (0.254±0.02 and 0.155±0.01, respectively; P<0.05, U=112, Mann-Whitney U-test).
Likewise, the density in putamen reduced control vs lesioned (0.213±0.02 and 0.135±0.02,
respectively; P<0.05, U=109, Mann-Whitney U-test). See Figure 8 and 9.
4. Discussion
The present study evaluated a model of bilateral 6-OHDA lesion in non-human
primate Callithrix jacchus, previously described up to 8 weeks after the second lesion [4], as a
possible model for the long-term bilateral lesion. In this new scenario, we evaluated the motor
symptoms of parkinsonism in a longer period of time (up to 24 weeks) as a model for the
investigation of prospective treatments for PD.
For this aim, we modified behavioral assessment methods previously described and we
developed other methods to assess the degree of parkinsonism. The introduction of these new
ways of assessment involved the use of a box-shaped apparatus that allowed the evaluation of
63
fine motor behavior of the animal. Furthermore, this box allowed the automatic quantification
of motor behavior and the overall displacement of the animal in the box.
The model of bilateral 6-OHDA lesion in a two-staged procedure in non-human
primates, as previously described, requires thoroughly cares after the second lesion [4]. The
animal has difficulties to eat and drink, however, despite these difficulties, when evaluated for
the study of PD, this model obeys the principle of the 3Rs. First, there is an optimal use of
each animal, since every one of them traverses a temporal journey that represents three
distinct periods with different degree: baseline, unilateral and bilateral lesion [22]. Eight
weeks after the second lesion, we observed a spontaneous improvement of motor symptoms,
notably, the symptoms of bradykinesia, hypokinesia, episodes of freezing, rigidity, and
difficulty performing gross and fine motor skills.
In the long term (9th
week to 24th week), this 2-stage bilateral lesion model, promotes
less motor impairments when compared to MPTP models, which are extensively used in
primates. Then, to temporarily increase symptoms of motor impairment of the animals, we
used an inhibitor of dopamine synthesis (AMPT), which caused a marked motor disability in
animals after the second lesion. The motor symptoms were associated with an increased score
of motor disability rating scale, and a marked akinesia observed both in home-cage and in the
test box. The impairments observed under AMPT effect after the 9th
week were as severe as
those seen in the first two weeks after the second lesion. This disability was temporary, and
the animal returned to a pre - AMPT scene after 24h - 48h. This staging of action of the
AMPT enabled to modulate the symptoms of parkinsonism from a medium (9-16 weeks)
level / low symptoms (weeks 17-24) to a level of severe parkinsonism, without sacrificing the
animal. This feature may be useful for experiments that need to evaluate the different states of
parkinsonism in the same animal, i.e., as in electrophysiological recordings.
It is necessary to state some important considerations regarding to motor disability
rating scale we developed. i) The scale proved sensitive enough to determine the degree of
parkinsonism in lesioned animals. ii) This scale applies to animals with bilateral lesions,
although its use for the unilateral model is possible, although it will not include the
quantification of head position bias, rotation and visuospatial spatial neglect, which can be
evaluated separately. In addition, this scale requires to know the pre-lesion condition which is
64
represent the zero score. This feature allows individualizing the scale, since each animal is
compared to itself before and after the 6-OHDA injections.
Another consideration is that our animal facility is located in the endemic geographic
area of the species, thus it is the outdoor type, having a natural light-dark cycle, temperature
and moisture similar to that experienced by the animal in nature. Such open vivarium is not
suitable for use of the AMPT model, which requires a high level of security and contention
[3].
The box used in this work can be considered a multipurpose device, since it allows to
evaluate different aspects of the motor function (reaching, grasping, displacement) while
conducting, for example, freely moving electrophysiological recordings.
The training model applied demanded, in fact, a few weeks, but produced robust
results, since the animals maintained the performance even after two weeks without training.
We used actimeters in 4 animals, but obtained a complete set of data from two. We
observed no difference between baseline and unilateral lesion phase. However, when we
compared measurements to baseline phase and after bilateral lesions the values were
significantly reduced and represented a decrease motility of full day when the animal was
present in a home-cage. The use of a smaller time analysis recording of two seconds, it was
able to register fast movements of the animal.
The motor disability was accompanied by a reduction of cell numbers to ~ 42±23% (of
the values observed in control animals) and the reduction of axonal terminal staining density
in the caudate-putamen decreased to ~ 44±10% of the levels seen in normal subjects.
5. Conclusion
We obtained a long term bilateral 6-OHDA marmoset PD model by modifying the
protocol described by Mitchell et. al., 1995 [4]. A main feature of the original protocol is that
65
each hemisphere is injected with 6-OHDA at different times (with a minimum of two months
between first and second injection procedure), thus allowing for severe and chronic nigrostriatal
lesions without endangering the animals life, since it is allowed to recover during the initial post-
injection period. This modification, as evaluated by open field activity and actimetry, proved to
cause bradykinesia, hypokinesia, and limb rigidity. Further, to cause increased parkinsonian
symptoms, these animal were in some experiments injected with AMPT, an inhibitor of the
tyrosine hydroxylase. This manipulation caused a dramatic akinetic state.
The two-stage bilateral 6-OHDA marmoset is a reliable and reproducible model of
Parkinson's disease when evaluated at long term. This model reproduces the motor symptoms of
bradykinesia, hypokinesia and rigidity. The addition of AMPT results in extremely severe
symptoms that might be used as a late stage model for Parkinson's.
Acknowledgments
This study was part of a thesis submitted to UFRN Psychobiology Post-
Graduation Program as one of the requirements for the Doctor’s Degree of Maxwell Barbosa
de Santana. We are thankful to Marco Freire for support on Histology; and Marcelo Carvalho
for technical support. This research was supported by The Michael J. Fox Foundation for
Parkinson’s Research, FINEP 01.06.1092.00, and INCEMAQ – Program of National
Institutes of Science and Technology of CNPq/MCT; CAPES; The Swedish Research Council
[#325-2011-6441], the Olle Engkvist, Parkinson Research, Crafoord, Åke Wiberg, Magnus
Bergvall, Kockska and Segerfalk Foundation. NIH Transformative award (R01-NS073125-
03).
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68
Figure 1: Timeline of the two-staged 6-OHDA bilateral lesion model in common marmosets.
69
Figure 2: Automatic tracking in the behavioral chamber. and box calibration (red and black)
drawn on video data for the two tower cameras (F-G), and movement trace for the whole
experiment drawn on the background images for the two cameras (H-I).
70
71
Figure 3: Rating Scale of motor impairment. Average rated motor disability for six
marmosets after the second lesion (the value for the non-lesioned subject is zero). Note how
the AMPT injection (2x250mg/kg, S.C. injected three hours apart) brings the subjects to a
condition with severe symptoms (bars represents S.E.M.). α Significant difference between
period of weeks (1-8) vs (9-16) P<0.01. β Significant difference between period of weeks (1-
8) vs (17-24) P<0.01. * Significant difference between weeks (1-8) vs (AMPT) P<0.05. #
Significant difference between period of weeks (AMPT) vs (9-16) P<0,01; and d Significant
difference between period of weeks (AMPT) vs (17-24) P<0,05. (ANOVA for repeated
measures with post hoc Bonferroni test).
72
Figure 4. Total score of motor impairment in the different periods after the second injection
of 6-OHDA for six marmosets (the value for the non-lesioned subject is zero). The injection
of AMPT promoted a severe increase in symptoms. α Represents significant differences
between the distinct periods of week vs AMPT experiment, P <0.001. * Significance between
period of weeks (9th
– 16th) vs (AMPT) P<0,01. (ANOVA for repeated measures with post
hoc Bonferroni test).
73
Figure 5: Daily motor activity (each point represent the average of three days recorded in a
row with actimeter) of Animal #1 (red) and Animal #2 (blue). Day 0 corresponds to the day of
the second lesion, data between day -50 and 0 correspond to unilateral lesion. Data earlier
than day -50 are before the lesion.
74
Figure 6: Average locomotion speed in the acrylic chamber during the different periods of the
lesioning procedure: before the lesions (Baseline), after the first lesion (Hemilesion), 1-8 and
9-17 weeks after the second (Bilateral) lesion (third and fourth label, respectively), and full
lesion plus AMPT treatment (AMPT; n=5, bars represent standard error). ** Significant
differences between baseline (before lesion) vs period of after first lesion (hemilesion);
baseline vs period of weeks (1-8); baseline vs period of weeks (1-8) ; ). *** Significant
differemces between baseline vs (AMPT) P<0,001 (ANOVA for repeated measures with
post hoc Bonferroni test).
**
75
Figure 7: (A) Example of automatic tracking (red lines) in an acrylic chamber (blue cube).
Animals were trained to recover food rewards from three outer shelves through small
apertures. The plots correspond to: non-lesioned animal (left), unilateral stage (center) and
unilateral stage with AMPT (right). (B) Bradykinesia is evident in the distribution of the
speed components of movements displayed by the animals. Data from two individuals are
shown. A threshold (20 cm/s) was used to classify movement bouts into two groups – fast and
slow. The group-size quota was modeled as a binary distribution, and a two-proportion z-test
was applied, showing that there is a <0.01% significance in test subject A (left), and 0.12%
significance in subject B (right). The mean±SD of the motor disability rating scale for the two
individuals after lesioning are shown in the inserted boxes (manual evaluations were
performed during the same days as the box tests were carried out). Note that even though
these two animals were only moderately parkinsonian a slowing of movements could still be
detected. D) Average movement speed in the acrylic chamber during the different periods of
76
the lesioning procedure: before the lesions (Baseline), after the first lesion (Hemilesion), 1-8
and 9-17 weeks after the second (full) lesion (third and fourth label, respectively), and full
lesion plus AMPT treatment (AMPT; n=5, bars represent standard error). * Significant
difference between period of weeks (9th-16
th) vs (AMPT) P<0,05 (ANOVA for repeated
measures with post hoc Bonferroni test).
77
Figure 8. Examples of immunolabeling of enzyme tyrosine hydroxylase (TH) in coronal
sections showing regions of Caudate (Cd)-Putamen (Put) and Substantia nigra (SN). (A)
Immunohistochemistry of TH showed a intense labeling of Cd-Put in both hemispheres (top
panel - Control). Lesion performed in the left hemisphere induced a pronounced loss of
labeling in both left Cd-Put (middle panel - Unilateral). In bilateral lesioned animals, both
sides of Cd-Put were strongly affected, showing a much less reactive tissue (bottom panels -
Bilateral) when compared to control. In (B), the same pattern of immunostaining of SN can be
observed. In control animals, the intense label for TH represents the TH+ cell (midbrain
dopaminergic neurons) (top panels – immunostaining with DAB and immunofluorescence for
TH). In unilateral animals, the lesion performed in the left hemisphere reduced the TH+ cell,
when compared to another hemisphere (middle panels - immunostaining with DAB and
immunofluorescence for TH). In bilateral animals, both sides showed reduction in TH+ cells.
The loss of immunostaining showed the strong effect of 6-OHDa lesion, when compared to
control (bottom panels - immunostaining with DAB and immunofluorescence for TH).
78
Figure 9. Quantitative analysis of of tyrosine hydroxilase (TH) immunolabeling in Caudate
(Cd)-Putamen (Put) and Substantia nigra (SN). In top panel, the contrast index of Cd and Put
in unilateral lesioned side and bilateral lesioned sides showed significant reduction, when
compared to control, (0.254±0.02 in control Cd and 0.155±0.01 in bilateral lesioned side,;
P<0.005, U=112, Mann-Whitney U-test). Likewise, the density in putamen reduced control vs
bilateral lesioned side (0.213±0.02 and 0.135±0.02, respectively; P<0.05, U=109, Mann-
Whitney U-test). In the bottom panel, the number of TH+ cells of the midbrain dopaminergic
neurons reduced significantly, when compared to control (139.0±12.14 and 59.93±6.07 in
control animals and lesioned animals, respectively ; P<0.0001, U=33, Mann-Whitney U-test).
79
4 – Segundo artigo: Objetivos específicos 3 e 4
Spinal Cord Stimulation alleviates motor symptoms in a primate model of
Parkinson’s disease
1,7Santana M.
+,
2Halje P.
+,
1,8Simplício H.,
2Richter U.,
1Freire, M.,
2Petersson, P.*,
1Fuentes
R.#,* and
1,3,4,5,6Nicolelis MAL.*
1 Edmond and Lily Safra Institute of Neuroscience of Natal, Natal, Brazil, 59066-060
2 Integrative Neurophysiology and Neurotechnology, Neuronano Research Center,
Department of Experimental Medical Sciences, Lund University, BMC F10, S-221 84 Lund,
Sweden
3 Biomed. Engin., 4 Ctr. for Neuroengineering, 5 Dept. of Neurobio., 6 Dept. of Psychology
and Neurosci., Duke Univ., Durham, NC
7 Psychobiology, Federal Univ. of Rio Grande do Norte, Natal, Brazil
8 State Univ. of Rio Grande do Norte, Natal, Brazil
# Corresponding author at: Edmond and Lily Safra Institute of Neuroscience of Natal, Natal,
Brazil, 59066-060. Tel: +554008-0003. E-mail address: [email protected] (R.
Fuentes).
+ These two authors contributed equally to this work
* This study was conducted in a joint effort by these three principle investigators
Artigo submetido à revista: Nature (ISSN 0028-0836; Qualis A1).
80
Resumo
Embora a estimulação elétrica cerebral profunda possa aliviar os sintomas motores da
DP, apenas uma fração pequena dos pacientes portadores de doença podem ser beneficiados
com este procedimento, devido à sua natureza altamente invasiva. Um método muito menos
invasivo – a estimulação epidural da medula espinhal (SCS) – foi recentemente sugerido
como uma abordagem alternativa para o tratamento sintomático dos sintomas motores da DP.
Entretanto, os mecanismos subjacentes à melhoria motora promovido pela SCS são ainda
desconhecidos. Aqui, mostramos, que a SCS alivia os sintomas motores em um modelo não-
humano da DP. Registros neuronais simultâneos de múltiplas estruturas do circuito Córtex-
Gânglios da Base-Tálamo nos animais parkinsonianos revelou uma atividade neuronal
anormal altamente sincronizada dentro de cada uma destas estruturas e um acoplamento
funcional excessivo entre eles. A estimulação por SCS interrompeu este comportamento
patológico do circuito de uma maneira que imita os efeitos causados pela terapia
farmacológica de reposição dopaminérgica ou a estimulação cerebral profunda. No seu
conjunto, estes resultados sugerem que a SCS deve ser considerada como uma nova opção de
tratamento adicional para os pacientes portadores da doença de Parkinson.
Palavras chaves: Parkinson’s Disease; Callithrix jacchus; Pre-Clinical Study; Spinal Cord
Stimulation
81
SPINAL CORD STIMULATION ALLEVIATES MOTOR SYMPTOMS IN A PRIMATE
MODEL OF PARKINSON’S DISEASE
1,7Santana M.+, 2Halje P.+, 1,8Simplício H., 2Richter U., 1Freire, M., 2Petersson, P.*, 1Fuentes R.* and
1,3,4,5,6Nicolelis MAL.*
1 Edmond and Lily Safra Institute of Neuroscience of Natal, Natal, Brazil, 59066-060
2 Integrative Neurophysiology and Neurotechnology, Neuronano Research Center, Department of
Experimental Medical Sciences, Lund University, BMC F10, S-221 84 Lund, Sweden
3 Biomed. Engin., 4 Ctr. for Neuroengineering, 5 Dept. of Neurobio., 6 Dept. of Psychology and
Neurosci., Duke Univ., Durham, NC
7 Psychobiology, Federal Univ. of Rio Grande do Norte, Natal, Brazil
8 State Univ. of Rio Grande do Norte, Natal, Brazil
Although deep brain electrical stimulation can alleviate the motor symptoms of Parkinson’s
disease (PD), just a very small fraction of PD patients can take advantage of this procedure due to
its highly invasive nature. A significantly less invasive method - epidural spinal cord stimulation
(SCS) – has been recently suggested as an alternative approach for symptomatic treatment of PD.
However, the mechanisms underlying motor improvements through SCS are unknown. Here, we
show that SCS reproducibly alleviates motor symptoms in a primate model of PD. Simultaneous
neuronal recordings from multiple structures of the cortico-basal ganglia-thalamic loop in PD
monkeys revealed abnormal highly synchronized neuronal activity within each of these structures
and excessive functional coupling among them. SCS disrupted this pathological circuit behaviour in
a manner that mimics the effects caused by pharmacological dopamine replacement therapy or
deep brain stimulation. Altogether, these results suggest that SCS should be considered as an
additional new treatment option for PD-patients.
+ These two authors contributed equally to this work
* This study was conducted in a joint effort by these three principle investigators
82
Chronic electrical microstimulation of subcortical brain structures, a procedure known
as deep-brain stimulation (DBS), has become an important complement to dopamine replacement
therapy in the symptomatic treatment of Parkinson’s disease (PD) 1. However, partially because of
the highly invasive nature of this surgical procedure 2 and it's need for additional complex and costly
technologies, only a small fraction of all PD patients that could possibly benefit from this therapy are
actually eligible for implantation. In this context, the recent demonstration that electrical epidural
spinal cord stimulation (SCS) alleviates akinesia in rodent models of PD 3 and may reduce motor
symptoms in patients 4–7 is a significant finding, since SCS, unlike DBS, is minimally invasive. Following
the initial report on rodent PD-models, SCS has been evaluated for treatment of PD in a few clinical
case studies. Results of these studies range from no measurable improvements in two patients 8 to
significant symptomatic relief 4–7 in 19 patients. More importantly, in some cases SCS achieved PD
symptom relief equivalent to the best effects obtained by pharmacological treatment 4. At present,
the underlying causes for the different outcomes in these preliminary clinical studies are not known,
but variations in electrode design, spinal cord implantation location, and choice of stimulation
parameters have been suggested as possible contributing factors 9,10. One way to optimize the
application of this potential therapy for PD is to establish what neurophysiological changes are
associated with the relief of symptoms, and to evaluate how these changes can be most effectively
induced. Here, we have addressed these questions by characterizing the behavioural and
neurophysiologic SCS effects in 6-OHDA (6-hydroxydopamine) lesioned marmoset monkeys (Callithrix
jacchus), a primate model of PD.
Using previously described procedures11,12, five adult male marmosets were rendered
parkinsonian through 6-OHDA stereotactic micro-injections in the medial forebrain bundle (MFB) of
either one (n=2) or both hemispheres (n=3). Injections resulted in neurodegeneration of the
midbrain dopaminergic neurons projecting to the forebrain in the lesioned hemispheres, as assessed
post mortem through immunohistochemical quantification of tyrosine hydroxylase (Extended Data
Fig. 1). In lesioned animals, the number of dopaminergic neurons in the midbrain was reduced to
42±23% of the values observed in control animals. In addition, axonal terminal staining density in the
caudate-putamen decreased to 44±10% of the levels seen in normal subjects. Severity of
Parkinsonism was regularly examined in all marmosets using manual scoring of a wide range of
symptoms and automated quantification of spontaneous motor behaviour. On average, spontaneous
locomotion was reduced to about a fourth of pre-lesion activity, and PD-symptoms approached the
maximum score (mean±SD: 75±29%) in all the eight categories assessed 13-14.
83
Once PD symptoms had been confirmed, animals were implanted with bipolar
epidural SCS electrodes positioned symmetrically over the dorsal midline of the spinal cord at high
thoracic level (T3-T4). Four of the five animals (two with bilateral and two with unilateral MFB lesions)
were also chronically implanted with microelectrode arrays/bundles in both hemispheres for
subsequent record of neuronal ensemble activity (both single units and LFPs). These implants
targeted multiple structures in each animal, including: the primary motor cortex (MI), putamen (Put),
the sub-thalamic nucleus (STN), globus pallidus pars externa (GPe) and interna (GPi), and the
ventrolateral (VL) and ventral posterolateral (VPL) thalamic nuclei. In the two unilateral-lesion
animals, instead of globus pallidus, parts of primary somatosensory cortex (SI) were implanted. Prior
to SCS, all animals were also subjected to acute pharmacological inhibition of dopamine synthesis
(s.c. injections of alpha-methyl-p-tyrosine [AMPT] 2x240mg/kg) to further aggravate the PD
symptoms.
Before each stimulation session, the intensity of each stimulation frequency was
adjusted and set to 1.7 times the minimum intensity at which any behavioural response could be
detected to avoid SCS current intensities that could be experienced as uncomfortable. Overall, as
previously reported in rodents3, we observed that SCS induced a clear alleviation of motor
impairment in monkeys that exhibited severe PD symptoms. Because the stimulation frequencies
used in this study (range 4-300 Hz) proved equally effective, the analysis of the SCS effects, both
behavioural and electrophysiological, were performed by pooling all the frequencies, unless
otherwise stated. Based on our automated image analysis, SCS induced a 111±59,5% (SEM) increase
in general motility of trunk, head, limbs and tail (p<0.05, Wilcoxon signed rank test, Fig. 1a), a 192%
increase in the frequency of bouts of spontaneous locomotion (p<0.001, two-proportional z-test, Fig.
1b) and a 142% increase in the duration of locomotion periods (p<0.05, Wilcoxon rank sum test, Fig.
1c). These improvements resulted in a 243% increase in the total distance covered (p<0.05, Wilcoxon
rank sum test, Fig. 1d) by the monkeys. Remarkably, SCS induced a preferential increase in the
fraction of faster locomotion components indicating a specific reduction of bradykinesia, (p<0.05,
Kolmogorov-Smirnov test of difference in speed histogram distributions, Fig. 1e). The improvements
in motor disability were also assessed by an observer blinded to stimulation conditions that rated
specific symptoms, such as freezing, hypokinesia, bradykinesia, coordination, gait, posture, and gross
and fine motor skills, during the OFF and ON periods. The symptoms with highest reduction during
SCS were freezing (25±28%), hypokinesia (18±19%), and bradykinesia (16±15%). Overall, the PD-score
showed on average a significant reduction of 13.3 ± 17.3% (p<0.001, Wilcoxon signed rank sum test
[including all five subjects], Fig. 1f). In addition to the general improvements observed in all monkeys,
84
in a few instances SCS resulted in an extraordinary functional recovery. An example of this is shown
in Fig. 1g, where a severely parkinsonian animal, reached the maximum PD score on all symptoms
rated, and showed a dramatic improvement during SCS that allowed the animal to obtain a specific
behavioural goal – in this case, to find and retrieve a food item using skilled reaching and grasping
movements (Fig. 1g).
Chronic, multi-site neuronal extracellular activity was analyzed both in terms of changes in a
single neuron’s firing patterns and at the level of local field potentials (LFPs). SCS induced changes in
both LFPs and single cell activity throughout the cortico-basal ganglia-thalamic loop in parkinsonian
animals (Fig. 2a). As shown in Figs. 2b-c, the most noticeable effect was the suppression of LFP-
power in a frequency interval roughly spanning the beta-band (8-20 Hz), which was abnormally
strong in all PD monkeys (respective peak power values for the four subjects were 10, 11, 12, and 15
Hz) 15. This suppression of LFP oscillations was observed in all animals and, notably, in all parts of the
cortico-basal ganglia-thalamic loop with the exception of (GPe (Fig 2b-c, p<0.05, Wilcoxon rank sum
test on band power 8-20 Hz). In agreement with the behavioural effects, beta-suppression could be
obtained using both low- and high-frequency SCS paradigms with approximately equal efficacy
(average LFP power spectra ON/OFF stimulation for all animals and frequencies are presented in Fig.
2b).
Next, we examined the effects of SCS on single unit activity. Overall, about one third of
the neurons recorded in the lesioned hemispheres displayed significant changes in firing rates
associated with SCS (a 23% decrease and 9% increase [69 and 27 out of 302 units], respectively In GPi
and in the ventrolateral thalamic nucleus, SCS induced a net decrease in normalized neuronal firing
rate (Fig 2c; p< 0.05, Wilcoxon signed rank test). In contrast to the effect on LFP, SCS modulation of
neuronal firing rate differed markedly according to the stimulation frequency (Fig. 3a). While
stimulation at low-frequencies (4-20 Hz) caused mostly excitatory neuronal responses, inhibitory
firing modulation predominated during high-frequency stimulation (80-300 Hz; Pearson correlation
between the ratio of inhibitory/excitatory responses and stimulation frequency was: MI, r=0.96,
p<0.01; PU, r=0.74, p<0.05; VP, r=0.94, p<0.01; VL, r=0.76, p<0.05; STN, r=0.92, p<0.01; GPe and GPi
not significant, Fig. 3b).
Consistent with the LFP oscillatory activity, we observed a large fraction of neurons
with beta oscillatory firing in the OFF period (Fig. 3c) that was partially suppressed during the SCS ON
period (Fig. 3d, 3e). In total, 152 neurons out of 273 (56%) from the lesioned hemispheres displayed
significant beta-range (8-16 Hz) oscillatory firing patterns during the OFF periods (p<0.01, as
compared to spectra computed from equivalent random spike trains). Of these 152 neurons, 39
85
(26%) significantly decreased their beta rhythmic oscillation during the SCS ON period. The change in
beta power for all units with significant oscillatory activity in the beta range is summarized in Fig. 3f.
Taken altogether, these data suggest that SCS-induced symptomatic relief is primarily
associated with the disruption of synchronized oscillatory activity rather than with specific changes in
firing rate. However, because cortico-basal ganglia activity is known to be strongly influenced by
behavioural state, neurophysiologic changes could also result, to some extent, from secondary
changes in animal motor behaviour. Therefore, to further clarify how SCS induces neurophysiologic
changes that may cause symptomatic relief, in the two hemi-lesioned animals, we compared the
neuronal activity patterns from the lesioned hemisphere during SCS to either the patterns of the
intact hemisphere, or to the lesioned hemisphere following L-DOPA treatment (s.c. 15 mg/kg with
Benserazide 6.25 mg/kg). Recordings were split into 4 second epochs that were classified as either
active or inactive states based on automatically quantified motor activity. To facilitate comparisons
between states, two separate indices were constructed. First, two vectors were created summarizing
the mean differences [parkinsonian vs. intact state] and [parkinsonian vs. L-DOPA treated state],
respectively, in two multi-dimensional parameter spaces - spectral LFP power and firing rate per
structure. Each recorded epoch could then be represented as a point in the parameter spaces and be
quantitatively compared to the intact or L-DOPA treated state by geometrical projection onto these
vectors. Using this metric, it was evident that SCS treatment caused a shift towards healthy brain
activity patterns resembling the effect of L-DOPA treatment. This effect was observed only for the
analysis of LFP spectral power and not for neuronal firing rates (Extended Data Fig. 2). Importantly,
this shift could not be explained as a secondary effect due to an active or inactive behavioural state
since a two-way ANOVA, employed to estimate the relative effect-size of SCS compared to that of
behavioural state, showed that only 2.9%and 0.8% of the total variance (eta-squared; using the
metric for the intact and L-DOPA treated state, respectively) could be attributed to behavioural state
change, whereas the effect of SCS treatment explained 13.4% and 10.8% of the total variance.
Consequently, the main effect shared by both SCS and L-DOPA treatment appears to
be the suppression of the excessive neuronal population synchronization associated with the
parkinsonian state. Although it is not clear how coordinated low-frequency activity patterns arise in
PD, it is possible that an altered functional coupling between the circuit elements of the cortico-basal
ganglia-thalamic loop may be a key underlying factor 16. To test this idea, we computed the
coherence of the LFP signals between pairs of different neural structures as an indirect measure of
their functional connectivity. In the 6-OHDA lesioned dopamine-depleted hemispheres, we found
strong coherence between pairs of structures, but only in the parkinsonian low-frequency range (8-
86
15 Hz) (Fig. 4a, black traces). Importantly, like the L-DOPA treatment, SCS reduced the beta
coherence (Fig. 4a red trace), leading to a significant functional decoupling between the different
structures. This suggests that SCS brings the functional connectivity of the cortico-basal ganglia-
thalamic circuit closer to the normal state of the intact brain (Fig. 4b).
In conclusion, we observed that SCS caused clear symptomatic improvements in a
primate model of PD. Concurrent multi-site neuronal recordings showed that significant behavioural
improvements induced by SCS were strongly associated with desynchronization of neuronal activity
within the cortico-basal ganglia circuitry and reduction in beta-frequency coherence between
structure pairs. We therefore propose that SCS should be further tested in clinical studies aimed at
measuring its long-term efficacy as a less invasive, long-term therapy for PD patients.
Methods summary
Five adult male common marmosets (Callithrix jacchus) 300-550g were used in the study. The
animals were housed in pairs in cages (1.0 x 1.0 x 2.3 m) in a vivarium with natural light cycle (12/12
hours) and outdoor temperature. All animal procedures were carried out according to approved
protocols by AASDAP Ethics Committee and strictly in accordance with the National Institute of
Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH Publications No. 80-23). This project
was approved by SISBIO/Brazilian Institute of Environment and Natural Resources under No. 20795-
2.
Neurotoxic lesions were inflicted under deep anesthesia. Two L of 6-OHDA solution (4mg/mL, 0.05%
ascorbic acid, saline) were injected into the medial forebrain bundle in (AP/ML/DV): 6.5/1.2/6.0;
6.5/1.2/7.0; 6.5/2.2/6.5; 6.5/2.2/7.5; 6.5/3.2/8.011. AP-coordinates were scaled according to the
dimensions of the skull of each animal17.
Parkinsonian symptoms were assessed based on the ability to perform skilled reaching and grasping
and spontaneous motor behavior in the transparent acrylic testing box. Assessment methods were
based on previously described procedures13,18,19,14. Automatic motion tracking was performed using
custom developed software in MATLAB.
Local field potentials (LFPs) and action potentials were recorded using a multi-channel recording
system (Plexon Inc.).
Analyses of recorded signals were performed according to previously described methods3,20
87
Verification of recording electrode positions and extent of dopaminergic lesions were verified
through quantitative tyrosine hydroxylase staining in all animals.
Figure Legends
88
Figure 1
Spinal cord stimulation alleviates motor symptoms in parkinsonian primates
a, Average general increase in motility in response to SCS. Each colour line represents one recorded
animal over all trials. b-d, Average recovery of locomotion: bout distance, bout frequency and
duration, respectively (colours represent the four different subjects and asterisks denote significant
group differences). e, Reduction in bradykinesia reflected by the preferential recovery of faster
movement components in locomotion. f, Average improvements in PD-score in all testing sessions
divided by symptom category (mean and SEM shown). g, Example of functional motor improvement
from a state of severe parkinsonism enabling an animal to retrieve food rewards using skilled
reaching and grasping movements.
89
Figure 2
Spinal cord stimulation alters neuronal activity patterns in basal ganglia circuits
a, Example of parallel changes in LFP-power and single unit firing rates taking place simultaneously in
multiple structures of the cortico-basal ganglia-thalamic loop (left). For each structure represented
on the left panel, the top right panel represents single units and the bottom right panel depicts
pooled LFPs. Note the immediate reduction of low-frequency oscillations (beta band) in response to
SCS (colour codes denote Z-scores compared to OFF condition for units and dB above pink noise
curve for LFPs). b, Average LFP spectra for all recording sessions normalized to pink noise showing a
significant SCS-induced reduction in LFP beta-power in all structures except GPe .c, Changes in
normalized firing rates of individual neurons were diverse but, on average, they decreased in
response to SCS in GPi and VL.
90
Figure 3
Spinal cord stimulation alters the firing rate and oscillatory patterns of neuronal units in basal
ganglia circuits
a, Standardized neuronal firing rate response to different SCS frequencies in multiple structures of
the basal ganglia circuits. b, The fraction of inhibitory responses increased with higher SCS
frequencies. c, Autocorrelograms of two single units in MI exemplifying beta-range rhythmic firing
pattern in a parkinsonian animal (SCS OFF). d, Autocorrelograms of the same two units showing the
rhythmic spiking is effectively interrupted by SCS. e, The respective power spectra OFF/ON
(black/red) for the units shown in c-d, note the peak (arrow) in the beta-range during the OFF period,
which disappears during the ON period. f, Changes in power of rhythmic beta-firing plotted for all
183 units that presented significant beta oscillations either in the OFF or ON period. Filled colour
circles represent the units with significant suppression in beta power during the ON period. Black line
denotes 1:1 in beta-power ON/OFF, thus units located to the right of the line display beta
suppression.
91
Figure 4
Spinal cord stimulation and L-DOPA treatment suppresses multi-structure LFP coherence
a, Example of LFP coherence spectra from one of the hemi-lesioned animals (black trace) showing
coherent oscillations restricted to the beta-band in the parkinsonian condition (arrows) that are
suppressed by SCS (red trace; bold line and shaded area denote median and interquartile range,
stimulation artefacts around 20 and 40Hz have been removed). b, Connectivity diagram representing
the pooled LFP coherence in the 8-15Hz range in relation to the 30-40Hz band between all pairs of
electrodes in the different structures (values represent averages from all five recordings in the two
hemi-lesioned animals; all changes in beta-to-gamma coherence for SCS ON/OFF are significant
p<0.05, Wilcoxon rank sum test). Note that the excessive beta-band coherence, represented by the
warm colours in the parkinsonian state, is effectively reduced by SCS in the same way as for L-DOPA
treatment.
92
Appendices
Extended Data
Fig.1: Examples of tyrosine hydroxylase (TH) immunolabeling across striatum (ST) (A) and
substantia nigra (SN) (B) in control and 6-OHDA lesioned animals.
Fig2.: Spinal cord stimulation causes physiological changes resembling the effect of levodopa
treatment.
Acknowledgments
We are thankful to Tobias Palmér for developing the video tracking software used for automatic
quantification of locomotor behavior; Jim Meloy and Gary Lehew for building recording electrodes,
Ivani Brys for statistical discussion, Carlos Eduardo Idalino for support with data analysis, and
Marcelo Carvalho for technical support. This research was supported by The Michael J. Fox
Foundation for Parkinson’s Research; FINEP 01.06.1092.00; INCEMAQ – Program of National
Institutes of Science and Technology of CNPq/MCT; The Swedish Research Council [#325-2011-6441];
Swedish Society for Medical Research; the Olle Engkvist, Parkinson Research, Crafoord, Åke Wiberg,
Magnus Bergvall, Kockska and Segerfalk Foundation; NIH Transformative award (R01-NS073125-03).
Contributions
M.S, H.S, P.H., R.F , P.P, and M.A.L.N. designed the experiments; M.S, H.S, R.F., and P.P performed
the surgeries; M.S. conducted experiments; M.S. and M.F. performed immunohistochemistry; M.S.,
P.H., U.R., P.P., R.F., and M.A.L.N. analyzed the data, M.S., P.H, U.R, P.P., R.F., and M.A.L.N. wrote
the paper.
Reprints and permissions information is available at www.nature.com/reprints
The authors declare no competing financial interests.
Correspondence and requests for materials should be addressed to [email protected]
93
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95
Extended Data
Fig 01:
Fig 01. Examples of tyrosine hydroxylase (TH) immunolabeling across striatum (ST) (A) and substantia nigra (SN) (B) in control and 6-OHDA lesioned animals. Immunolabeling of enzyme tyrosine hydroxylase (TH) in coronal sections. Control animals presented an intense labelling in the ST (putamen and caudate nucleus) and SN in both hemispheres (top panels). Lesions performed in the left hemisphere induced a pronounced loss of labelling in both ST and SN. The side ipsilateral to the injection is much less reactive as compared to the contralateral side (middle panels). In bilaterally lesioned animals both sides of ST and SN were strongly affected, showing a much smaller tissue reaction (bottom panels) compared to control.
96
Extended Data
Fig 02:
Fig 02:Spinal cord stimulation causes physiological changes resembling the effect of levodopa treatment. Histograms showing the quantitative resemblance to the intact hemisphere (4 left panels) and the L-DOPA treated condition (4 right panels), respectively, for each 4s-epochs of the SCS recordings (SCS OFF=black and SCS ON=red). Lighter colours denote periods of motor activity, while dark colours are periods where the animal did not move. Note that while an active behavioural state in parkinsonian animals significantly shifted firing rate and LFP spectral contents towards the intact/L-DOPA treated state, this effect was much smaller than the SCS-induced LFP changes (effect-sizes, as fraction of total variance explained, eta-squared, is given under each pair of histograms OFF/ON; two-way ANOVA).
97
5 – CONCLUSÃO GERAL
O baixo número de pacientes elegíveis para o tratamento baseado na técnica de
estimulação cerebral profunda encorajou a busca de um método de neuromodulação menos
invasivo como tratamento da DP. Neste sentindo, a estimulação elétrica das vias das colunas
dorsais da medula espinhal (ECD) como tratamento da DP foi primeiramente desenvolvida
em modelos de roedores e se mostrou efetiva na melhora dos sintomas motores da DP. Nos
achados apresentados aqui, possibilitou-se dar um passo a diante, como um estudo pré-
clínico, e avaliarmos a utilização desta terapêutica experimental em primatas não-humanos
parkinsonianos.
Para isso, adaptamos um modelo de lesão unilateral e bilateral em dois estágios.
Ambos os modelos foram úteis para o estudo do padrão eletrofisiológico da alça de controle
motor córtex motor-tálamo-núcleos da base no sagui comum, assim como, pôde-se avaliar a
presença aumentada da atividade oscilatória e síncrona na faixa de 8-16 Hz (atividade
anômala beta) das populações neuronais nos animais parkinsonianos.
A utilização da ECD promoveu dessincronização neuronal sobre a alça de controle
motor e promoveu uma redução da atividade anômala beta, presente nestes circuitos nos
animais parkinsonianos. Do mesmo modo, durante a ECD, houve uma diminuição da
coerência na faixa beta entre as áreas cerebrais do circuito mencionado.
Mais ainda, a utilização da ECD diminuiu a atividade oscilatória (LFP) na faixa de 8-
16 Hz, como citado acima, mas, não promoveu mudanças na taxa de disparo dos neurônios
98
deste circuito. Estes achados são similares àqueles observados pela ação terapêutica da
levodopa.
Em concordância com estes achados, durante a realização deste projeto, vários relatos
de casos clínicos de uso da ECD em portadores da DP foram reportados na literatura. Quase
todos estes relatos indicaram que esta técnica produz melhorias clinicamente relevantes nos
sintomas motores da DP.
Portanto, propomos que a estimulação elétrica das colunas dorsais da medula espinhal
deve ser testada em estudos clínicos objetivando avaliar a sua eficácia a longo prazo, como
uma terapia menos invasiva e duradoura para os pacientes portadores da DP.
99
Os resultados desta tese mostrados aqui foram parcialmente publicados em forma de
resumo em anais de eventos em congressos nacionais e internacionais:
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ANEXOS
114
ANEXO 1
CARTA DE ENVIO DE ARTIGO PARA O PERIÓDICO NATURE
