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AVALIAÇÃO CICATRIZANTE DA AÇÃO DO ÓLEO ESSENCIAL DE ARNICA MONTANA POR
APLICAÇÃO INTRAPERITONEAL EM LESÕES CUTÂNEAS DE RATOS
Três Corações 2008
MÁRCIO AMÉRICO DIAS
AVALIAÇÃO CICATRIZANTE DA AÇÃO DO ÓLEO ESSENCIAL DE ARNICA MONTANA POR
APLICAÇÃO INTRAPERITONEAL EM LESÕES CUTÂNEAS DE RATOS
Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado em Clínica Odontológica da Universidade Vale do Rio Verde de Três Corações - UNINCOR, para a obtenção do título de Mestre. Área de Concentração: Diagnóstico Bucal. Orientador Prof. Dr. Natanael Átilas Aleva
Três Corações 2008
DEDICATÓRIA A Deus pelo dom da vida pelas oportunidades ofertadas pela proteção e benção em todos os meus dias, aos meus pais Lourdes e Lucas por sempre me darem apoio por estarem presentes em mais esta etapa, a minha esposa Mara por estar em minha vida por ser sempre minha companheira me apoiando em todos os meus momentos, e aos meus filhos Pedro e Gabriel por serem minha razão de viver serem a alegria, paz e carinho e proporcionarem força e união familiar.
AGRADECIMENTOS
Quero agradecer em primeiro lugar a Deus por todas as oportunidades, momentos
vividos e as pessoas que tem se colocado no meu dia a dia.
Aos meus pais e irmãos que sempre me apoiaram, me ensinando a viver a humildade e
incentivando-me em toda esta caminhada.
A minha esposa que sempre esteve presente, me deu forças e ao meu lado
incansavelmente paciente.
Aos meus filhos que de uma maneira ou outra souberam conviver com minha ausência
durante este trabalho.
Ao orientador, colega, amigo, companheiro, incentivador, confidente, irmão Prof. Dr.
Natanael Átilas Aleva meu eterno agradecimento.
Ao Prof. Dr. Alessandro Antonio Pereira que mostrou total dedicação, apoio,
disponibilidade e incentivo.
Ao Prof. Dr. Luciano José Pereira que transmitiu paciência, carinho, firmeza, ética,
profissionalismo em todos os momentos da elaboração deste trabalho.
A Profa. Dra. Maria das Graças Cardoso com seu profissionalismo passou
tranqüilidade e seriedade na preparação deste trabalho.
Aos grandes amigos Profs: Viator Ferreira Reis Filho, Paulo Roberto Dominguete e
Alexandre Magno Megale Costa que mostraram apoio, disposição, paciência e coragem.
À memória do saudoso amigo Prof. Jefferson Augustus Tagliaferri e Meneses pelos
momentos vividos juntos.
A colega Virginia Kelma Santos Silva que sempre demonstrou grande carinho, apoio e
amizade.
As Universidades UNINCOR e UNIFAL pelas facilidades oferecidas.
A todos os funcionários da UNINCOR que participaram deste trabalho demonstrando
dedicação e profissionalismo.
SUMÁRIO
página
LISTA DE ABREVIATURAS ............................................................................................. 05
RESUMO .............................................................................................................................. 07
ABSTRACT .......................................................................................................................... 08
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 09
2 REFERENCIAL TEÓRICO .............................................................................................. 10
2.1 Fitoterapia ....................................................................................................................... 10
2.2 Arnica ............................................................................................................................. 12
2.3 Óleo essencial ................................................................................................................. 15
2.4 Inflamação, cicatrização e efeito antiinflamatório da arnica .......................................... 18
3 PROPOSIÇÃO .................................................................................................................. 27
4 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................... 28
4.1 Equipamentos utilizados ................................................................................................. 28
4.2 Solução experimental de arnica ...................................................................................... 29
4.3 Animais de experimentação ............................................................................................ 29
4.4 Protocolo para ferida induzida ........................................................................................ 29
4.5 Grupos experimentais ..................................................................................................... 30
4.6 Administração das substâncias ....................................................................................... 30
4.7 Processo de montagem das lâminas ............................................................................... 32
4.7.1 Fixação ........................................................................................................................ 32
4.7.2 Desidratação ................................................................................................................ 32
4.7.3 Diafanização ................................................................................................................ 32
4.7.4 Inclusão ....................................................................................................................... 32
4.7.5 Microtomia e montagem dos cortes sobre as lâminas ................................................. 32
4.7.6 Coloração .................................................................................................................... 33
4.7.6.1 Corantes ................................................................................................................... 33
4.7.6.2 Método de coloração com HE ................................................................................. 34
4.7.7 Montagem das lâminas em Bálsamo de Canadá ........................................................ 34
4.7.8 Leitura das lâminas ..................................................................................................... 35
4.8 Análise estatística .......................................................................................................... 35
5 RESULTADOS ................................................................................................................ 36
página
6 DISCUSSÃO ..................................................................................................................... 47
7 CONCLUSÃO ................................................................................................................... 51
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................. 52
5
LISTA DE ABREVIATURAS
- n = número
- mg = miligramas
- mL = mililitros
- kg = quilogramas
- % = porcentagem
- g = gramas
- qsp = quantidade suficiente para
- SP = São Paulo
- BR = Brasil
- RJ = Rio de Janeiro
- h = horas
- mm = milímetros
- ATP = adenosina tri-fosfato
- DNA = ácido desoxirribonucléico
- RNA = ácido ribonucleico
- µg = micrograma
- FIGURA 1 - Gaiola individual
- FIGURA 2 - Animal anestesiado com área de tricotomia em região mediana do dorso
- FIGURA 3 - paquímetro digital com gabarito plástico
- FIGURA 4 - Mesa operatória- material
- FIGURA 5 - Animal anestesiado com remoção da espécime
- FIGURA 6 – Área dorsal em maior aumento
- ºC = grau Celcius
6
- Tabela 1: Descrição individual das variáveis histopatológicas do grupo A
- Tabela 2: Descrição individual das variáveis histopatológicas do grupo B
- Tabela 3: Teste de Mann-Whitney para as variáveis histopatológicas entre os grupos
- HE = hematoxilina-eosina
- FIGURA 7 – Nota-se área correspondente à ferida cuja crosta encontra-se deslocada, sendo espessa e uniforme. Nas margens há discreta proliferação epitelial e na porção central observa-se tecido de granulação jovem, bastante vascularizado e com discreto infiltrado inflamatório mononuclear. Objetiva 2,5x
- FIGURA 8 – Nota-se área correspondente à margem da ferida com discreta proliferação epitelial e com tecido de granulação jovem, bastante vascularizado e com discreto infiltrado inflamatório mononuclear. Objetiva 10x
- FIGURA 9 – Nota-se área correspondente ao tecido de granulação jovem: bastante celularizado com fibrócitos, vascularizado com microvasos sanguíneos e com discretos leucócitos mononucleares. Objetiva 25x
- FIGURA 10 - Nota-se área correspondente à ferida cuja crosta foi deslocada. Nas margens há discreta proliferação epitelial e na porção central observa-se tecido de granulação jovem, bastante vascularizado e com moderado infiltrado inflamatório mononuclear. Objetiva 2,5x
- FIGURA 11 - Nota-se área correspondente à margem da ferida com proliferação epitelial e com tecido de granulação jovem, bastante vascularizado e com moderado infiltrado inflamatório mononuclear. Objetiva 10x
- FIGURA 12 - Nota-se área correspondente ao tecido de granulação jovem: bastante celularizado e vascularizado com vasos sanguíneos (VS) levemente dilatados e hiperêmicos, além de leucócitos mononucleares (MN). Objetiva 25x
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RESUMO
DIAS, Márcio Américo. AVALIAÇÃO CICATRIZANTE DA AÇÃO DO ÓLEO ESSENCIAL DE ARNICA MONTANA POR APLICAÇÃO INTRAPERITONEAL EM LESÕES CUTÂNEAS DE RATOS. 2008. p. 58 (Dissertação de Mestrado em Clínica Odontológica). Universidade Vale do Rio Verde de Três Corações UNINCOR MG*.
A utilização de plantas medicinais como terapia curativa e preventiva é extremamente
difundida no Brasil. Entretanto, grande parte deste uso é realizada de forma indiscriminada.
Dentre as plantas medicinais de uso popular, destaca-se a arnica, da família Asteraceae. O
objetivo do presente estudo foi avaliar a avaliação cicatrizante do óleo essencial de arnica
montana, por aplicação intraperitoneal, em feridas cutâneas no dorso de ratos (Wistar) através
de análise histológica. Foram realizadas feridas cirúrgicas no dorso de 20 animais, com
auxílio de um paquímetro digital, associado a um gabarito plástico com 10 mm de diâmetro.
O Grupo A (n=10) recebeu a injeção via intraperitoneal de uma solução contendo 90 % de
propilenoglicol e 10% de Cloreto de sódio a 0,9% (grupo controle). O Grupo B (n=10)
recebeu a injeção de solução contendo 90% de propilenoglicol e 10% de óleo essencial de
arnica. As soluções foram administradas de acordo com cada grupo, numa concentração de
150mg/Kg de óleo essencial de arnica (0,40 mL) para o grupo A e volume equivalente no
Grupo B. As aplicações foram realizadas em intervalos de doze horas, durante sete dias. Após
sete dias todos os animais foram anestesiados e biopsiados. A distribuição da severidade do
infiltrado inflamatório foi comparada entre os grupos através do teste Mann-Whitney com
nível de significância de 95%. Não houve diferença estatisticamente significativa entre os
grupos para as variáveis estudadas (p>0,05). Conclui-se que na dosagem e via de
administração estudada o óleo essencial de arnica não foi efetivo no favorecimento da
cicatrização de feridas no dorso de ratos.
* Orientador: Prof. Dr. Natanael Átilas Aleva – Universidade Vale do Rio Verde - UNINCOR.
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ABSTRACT
DIAS, Márcio Américo. ANTI INFLAMMATORY ACTION OF ARNICA MONTANA ESSENTIAL OIL BY INTRAPERITONEAL APPLICATION IN CUTANEOUS LESIONS IN RATS. 2008. p. 58 (Master’s Dissertation in Clinical Dentistry). University of Vale do Rio Verde de Três Corações – UNINCOR – Três Corações/MG*.
The use of medicinal plants as curative and preventive therapy is extremely widespread in
Brazil. However, a large part of this use is made indiscriminately. Among the popularly used
medicinal plants, Arnica of the Asteraceae family is one of the most commonly used. The aim
of the present study was to assess the antinflammatory activity of the essential oil of arnica by
intraperitoneal application on cutaneous wound on the back of Wistar rats, by means of
histologic analysis. Surgeries were performed on the back of 20 animals, with the aid of a
digital pachymeter, associated with a plastic template 10 mm in diameter. Group A (n=10)
received an injection of a solution containing 90 % of propyleneglycol and 10% of sodium
chloride at 0.9% (Control Group). Group B (n=10) received an injection of a solution
containing 90% of propylene glycol and 10% of essential oil of Arnica. The solutions were
administered according to each group, at a concentration of 150 mg/Kg of essential oil of
arnica (0.40 mL) for Group A and an equivalent volume in Group B. The administration was
conducted every twelve hours during seven days. After this period, all the animals were
anesthetized and biopsies were performed. The severity distribution of the inflammatory
infiltrate was compared between the groups by the Mann-Whitney test with a level of
significance of 95%. There was no statistically significant difference between the groups for
the studied variables (p>0.05). It was concluded that at the studied dosage and mode of
administration, arnica essential oil was not effective in favoring healing of back wounds in
rats.
* Advisor: Prof. Dr. Natanael Átilas Aleva – UNINCOR.
9
1 INTRODUÇÃO
O uso de plantas medicinais para tratar doenças acontece há muitos anos. No
Brasil, existem inúmeras plantas sendo utilizadas para fins medicinais na forma de chás, pós e
raízes. Dentre esta imensa variedade de plantas com uso terapêutico popular, destaca-se a
arnica, que vem sendo empregada para distensões, hematomas, inchação dolorosa, entorses e
ferimentos em geral. Os extratos podem ser derivados das folhas, flores e raízes bem como de
outras partes da planta (YUI et al., 1998).
A arnica é uma planta ornamental herbácea, rizomatosa e perene, característica da
família Asteraceae. Apresenta inflorescências terminais grandes, eretas, ramificadas com
numerosos capítulos pequenos, sendo cultivado em bordaduras ou em canteiros a pleno sol
(LORENZI; SOUZA, 1995). É encontrada em campos rupestres, nos estados de Minas
Gerais, Goiás e Bahia (PINTO et al, 2000). Alguns nomes populares para a arnica são: arnica
silvestre, espiga de ouro, erva lanceta de origem brasileira. Esta planta é reconhecida por sua
ação antinflamatória (YUI et al., 1998; BEVILAQUA, 2003), cicatrização de feridas e alívio
da dor (CERQUEIRA et al., 1987; LOPES 2001, SANTOS et al., 2005).
A maior parte da aplicação popular e dos estudos avaliando a ação da arnica para
fins terapêuticos utiliza as aplicações tópicas ou na forma de tintura (CARVALHO;
BONAMIM, 2001). A utilização de óleos essências de arnica ainda não foi completamente
estudada. Duas técnicas para o preparo dos extratos de arnica são relatadas na literatura: a
maceração hidroalcóolica e desintegração em óleo de soja; e também a extração em
propilenoglicol e butilenoglicol (INTERNATIONAL JOURNAL OF TOXICOLOGY, 2001).
Os óleos essenciais também chamados de substâncias voláteis ou óleos etéreos são misturas
complexas e apresentam as características de volatilidade e baixo peso molecular.
Normalmente são líquidos de aparência oleosa, odoríferas, solúveis em solventes orgânicos e
solubilidade limitada em água (SIMÕES et al., 1999). O uso sistêmico da arnica na forma de
óleo essencial pode ser uma alternativa para a administração deste agente farmacológico que
ainda não apresenta relatos na literatura. Estudos deste tipo auxiliam na prevenção do uso
irresponsável e sem controle, devido aos riscos de toxicidade e efeitos colaterais que podem
ter aplicações clínicas futuras em diversas áreas da saúde.
10
2 REFERENCIAL TEÓRICO 2.1 Fitoterapia
A utilização das plantas medicinais teve seu início na pré-história. Os homens
primitivos iniciaram as práticas de saúde, alimentando-se de determinadas plantas pelo
instinto de sobrevivência. Com isso, foram observados determinados efeitos para minimizar
suas enfermidades, acumulando conhecimentos empíricos que foram passados a longo do
tempo (BRANDÃO, 2003).
Desde 1978, a organização Mundial de Saúde (OMS) vem alertando para o fato de que
a maior parte da população mundial, especialmente da África, Ásia e América Latina, extraem
diretamente da natureza sua fonte de matéria-prima para a saúde. No Brasil, o uso de plantas
medicinais é enriquecido pela vasta biodiversidade, pela miscigenação das culturas indígena,
negra e européia e pelo alto custo dos medicamentos industrializados. Muitas plantas têm sua
eficiência respaldada pelo uso tradicional, repassado de geração em geração, ou contam com
estudos de eficiência e segurança devidamente estabelecidos (BEVILAQUA, 2003).
Estima-se, que a porcentagem da população que utiliza tratamentos não convencionais,
inclusive a fitoterapia, é de 10% na Dinamarca, 33% na Finlândia, 49% na Austrália e 48%
nos Estados Unidos (NATALIA, 2003). Na América Latina, estes valores tendem a ser ainda
mais altos, uma vez que nas regiões tropicais, existem diversas espécies de plantas medicinais
de uso local, com possibilidade de geração de uma relação custo-benefício bem menor para a
população, promovendo saúde a partir de plantas produzidas localmente. No Brasil existem
diversidades e peculiaridades, com concepções, opiniões, valores, conhecimentos, práticas e
técnicas diferentes, que precisam ser incorporadas e respeitadas no cotidiano, influenciadas
por hábitos, tradições e costumes. O conhecimento e uso das plantas medicinais têm sido
estimados, baseando em algumas variáveis sociais. Algumas características desejáveis das
plantas medicinais são sua eficácia, baixo risco de uso, assim como reprodutibilidade e
constância de sua qualidade. Entretanto, devem ser levados em conta alguns pontos para
formulação dos fitoterápicos, necessitando do trabalho multidisciplinar, para que a espécie
vegetal seja selecionada corretamente, o cultivo seja adequado, a avaliação dos teores dos
princípios ativos seja feita e para que a manipulação e a aplicação na clínica médica ocorram
(ARNOUS, 2005).
Mesmo com o grande desenvolvimento de drogas obtidas por síntese orgânica, os
produtos naturais continuam desempenhando um papel de destaque na saúde pública. Mais de
11
25% dos medicamentos em uso são derivados naturais ou produtos semi-sintéticos de origem
natural. O uso popular de plantas na medicina tradicional é uma valiosa fonte para a
descoberta de novos agentes terapêuticos. No entanto, o conhecimento popular tem que estar
associado à bioensaios para comprovar a eficácia e a toxicidade dessas plantas para o uso
terapêutico (VALDERRAMAS, 2006).
Com o decorrer da evolução histórica, teorias e análises de certas plantas medicinais
foram criadas com o objetivo de contribuir com a Ciência Médica Moderna. Surge então a
fitoterapia, que etimologicamente vem da palavra grega Phyton (plantas) e Therapeia
(tratamento), ou seja, tratamento através das plantas (GUYOT, 1990; MIGUEL, MIGUEL
1999). A fitoterapia caracteriza-se pela prática do uso de plantas ou de suas partes com a
finalidade de prevenir, aliviar ou curar um processo patológico. Durante anos, a completa
falta de rigor técnico e científico fez inúmeros trabalhos com plantas medicinais estarem
disponíveis nas publicações científicas sem a correta identificação taxonômica das espécies
utilizadas nas pesquisas. Isto ocorria, muitas vezes, única e exclusivamente pelo fato de o
pesquisador não reconhecer a importância da botânica e do significado da efetiva
identificação das plantas medicinais (ROCHA, 2006).
12
2.2 Arnica
A Arnica Montana é uma planta originária das regiões montanhosas do norte da
Europa, de terras silicosas. O cultivo no Brasil é de adaptação muito difícil. Existem muitas
plantas chamadas popularmente de arnica, entretanto, na verdade, existem espécies diferentes
que não possuem a mesma aplicação terapêutica. A variedade dos produtos a base de arnica
existentes no mercado explica a diversa empregabilidade desta planta, como sabonetes para
limpeza de partes contundidas, conservando a pele macia e elástica, fazendo desaparecer as
rachaduras e asperezas; pasta dental e água dentifrícia; óleo tônico capilar; óleo e pomada
para fricção muscular, etc.(MARQUES, 2006).
A arnica é uma planta que apresenta múltiplas funções medicinais e da qual tudo se
aproveita (MATOS; LORENZI, 2002). Preparações com flores, raízes e folhas de arnica têm
sido usadas na medicina tradicional há bastante tempo para o tratamento de distúrbios
inflamatórios (FINAL, 2001). A arnica apresenta extratos com propriedades na absorção de
edemas, e cicatrização de feridas, propriedades analgésicas e antinflamatória (MIRANDA,
2001). O uso tópico é atualmente muito utilizado em contusões, inflamações (CARVALHO;
BONAMIM, 2001), ferimentos e hemorragias subcutâneas (ROCHA, 2006).
Os extratos das flores e de outras partes da planta têm sido empregados topicamente
ou na forma de tintura na terapêutica para distensões, hematomas, inchações dolorosas,
entorses e ferimentos em geral. Dessa forma, ao se considerar a eficácia antinflamatória da
arnica, um estudo a nível sistêmico foi feito comparando a ação dessa planta com a
betametazona, um corticóide de ação prolongada com capacidade de reduzir acentuadamente
ou suprimir os sinais típicos do processo inflamatório quando administrado por via oral.
Concluiu-se que a arnica tem realmente eficácia antinflamatória e quando comparada com o
corticóide o efeito foi menor, mas não significantemente diferente (YUI; LINARELLI;
ZELANTE, 1998).
Os efeitos da administração da arnica na forma de tintura-mãe e na forma de
ultradiluições foram realizados com diversos agentes flogísticos (0,06 ml de carragerina a 1%,
histamina 2,5%, serotonina 0,001% e bradicinina 0,01%). As soluções foram testadas no
tecido subcutâneo do coxim plantar da pata de ratos machos albinos da linhagem Wistar.
Verificou-se que houve uma inibição do edema inflamatório através do uso da arnica
(CARVALHO; BONAMIM, 2001).
Além de lactonas sesquiterpênicas, mais de 150 outras substâncias químicas foram
encontradas na arnica. Entre essas se pode destacar a presença dos flavonóides (quercentrina e
13
os derivados quercentrina-3-mono-glicosídeo e quercentrina-3-glicogalaturônico)
(LUSSIGNOLI et al., 1999) que parecem interferir nas propriedades funcionais em células de
mamíferos como nos mastócitos, basófilos, linfócitos, músculo liso e plaquetas (YUI;
LINARELLI; ZELANTE, 1998).
A arnica tem sido frequentemente pesquisada como medicamento homeopático e esta
é uma solução hidroalcóolica dinamizada, preparada a partir de substâncias minerais,
vegetais, animais ou de produtos sintetizados. Partindo desse princípio, sabe-se que o
fundamento básico da terapêutica homeopática consiste na frase em latim “similia similibus
curentur”, cuja tradução significa: “sejam os semelhantes curados pelos semelhantes”.
Quando determinado método ou substância causa em indivíduos sadios e sensíveis um quadro
sintomático semelhante ao do portador da doença, está se aplicando o princípio da
semelhança. Os homeopatas modernos não têm considerado a homeopatia como alternativa e
sim, como complemento, pois reconhecem a eficácia e validade dos tratamentos alopáticos.
Desde a sua criação, o tratamento homeopático procura tratar a pessoa como um todo,
buscando um conjunto de sintomas existentes no paciente, procurando promover o auto-
equilíbrio (MARQUES, 2006).
Preparações homeopáticas de arnica são freqüentemente usadas em combinação com
outras drogas, como alternativas clínicas para fins terapêuticos em condições como trauma
(BUCAY, 1995), parto, hematoma e dor dental (LUSSIGNOLI et al, 1999). A maior
dificuldade na aceitação da homeopatia reside na compreensão dos mecanismos de ação das
doses mínimas, já que frequentemente se espera uma atitude relacionada à dose-efeito, como
habitualmente ocorre com medicamentos alopáticos (BEVILAQUA, 2003).
A arnica também apresenta potencial no favorecimento na cicatrização de feridas. A
grande diversidade de produtos para o tratamento de feridas gera insegurança nos
profissionais da saúde sobre qual a opção mais indicada (EDGAIR FERNANDES
MARTINS, et al.,2005). Desta forma, o efeito do extrato aquoso liofilizado da planta arnica,
em aplicação sistêmica, sobre a cicatrização de feridas cutâneas abertas foi realizado
previamente (JOURNAL OF THE ROYAL SOCIETY OF MEDICINE, 2003). Ratos albinos
foram distribuídos em três grupos, a saber: grupo controle que não sofreu nenhum
procedimento, grupo simulado que recebeu o diluente e o grupo que recebeu doses diárias
intraperitoneais de arnica em solução salina. Os animais foram submetidos a exérese de um
retalho dermato-cutâneo dorsal padronizado e posteriormente observados por períodos de sete
dias. Avaliou-se a evolução ponderal; as áreas das feridas operatórias; a absorbância do
espectro visível e ultravioleta de preparações de arnica no extrato liofilizado, fígado e no soro
14
dos animais; a presença de tecido de granulação, fibras colágenas, células mononucleares,
polimorfonucleares na ferida operatória com microscopia de luz. Os achados mostraram uma
perda ponderal nos animais do grupo experimental aos sete dias. A área de cicatrização foi
menor no grupo que usou a arnica. Concluiu-se que o extrato aquoso liofilizado por via
intraperitoneal promove uma redução significativa da área das feridas cutâneas abertas de
ratos, em relação aos animais que receberam somente solução salina ou nenhum tipo de
tratamento e que a dose empregada não exibe sinais de toxicidade hepática detectável pela
sorologia.
A arnica apresenta extratos com propriedades na absorção de edemas (CARVALHO;
BONAMIM, 2001), e cicatrização de feridas, propriedades analgésicas e antinflamatórias
(MIRANDA, 2001). O uso tópico é atualmente muito utilizado em contusões, inflamações
(CARVALHO; BONAMIM, 2001), ferimentos e hemorragias subcutâneas (ROCHA, 2006).
O uso da arnica como agente antinflamatório foi testado em cirurgias para colocação de
implantes dentários como alternativa ao uso de antibióticos. Em um total de 736 implantes a
terapia antiinflamatória da Arnica Montana foi testada em comparação a ação da nimesulida
100mg. A taxa de sucesso foi de 96,2% (MAZZOCCHI; PASSI; MORETTI, 2007). Também
para fins médicos, o uso tópico da arnica foi testado no tratamento da osteoartrite das mãos. O
uso da arnica gel (50 g tintura/100 g, qsp 1:20) foi feito por 21 dias em pacientes
radiograficamente definidos como portadores da patologia. O efeito foi similar ao
medicamento ibuprofeno (5%) (WIDRIG; SUTER, SALLER R, MELZER, 2007).
As tinturas fitoterápicas (TF) foram preparadas por percolação, em solução
hidroalcoólica a 70%, na concentração de 20% (p/V) da droga. As tinturas homeopáticas (TH)
foram preparadas por maceração em solução hidroalcoólica a 70% por 20 dias, na
concentração de 10% (p/V) da droga (MACIEL et al., 2006).
Um estudo verificando os efeitos da administração da arnica na atividade de diferentes
agentes flogísticos em ratos verificou que houve uma inibição do edema inflamatório, de
acordo com os agentes irritantes testados (CARVALHO; BONAMIN, 2001).
Em uma revisão sistemática, a eficácia clínica da arnica homeopática foi avaliada nas
bases de dados: MEDLINE, EMBASE, CISCOM e a biblioteca Cochrane. Somente foram
considerados experimentos de controle clínico da arnica homeopática comparada com
placebo. Oito experimentos cumpriram todos os critérios de inclusão, chegando à conclusão
que há necessidade de experimentações clínicas mais rigorosas para que o efeito da arnica
possa ser considerado significativo (ERNST et al., 1998). Na mesma linha de estudo Linde et
al., (2001) realizaram uma descrição detalhada dos métodos usados através de uma revisão
15
retrospectiva dos experimentos clínicos da medicina homeopática em humanos. Do total de 22
experimentos, 18 seguiram os critérios de inclusão, 4 foram excluídos. Observou-se que
apesar de a maioria dos experimentos disponíveis relatar resultados positivos, as evidências
ainda não são totalmente suportadas.
2.3 Óleo essencial
Os óleos essenciais são substâncias orgânicas muito conhecidas pelo cheiro que
caracteriza certas plantas. O aroma das plantas que contém óleos essenciais é fruto da
combinação de diversas frações que podem estar em um só órgão vegetal ou em toda a planta
(MARTINS et al., 2000). Os óleos essenciais das plantas são compostos incolores ou
ligeiramente amarelados, que possuem como características básicas, o cheiro e o sabor.
Localizam-se em pequenas bolsas entre as células e atuam em resposta à adaptação da planta
ao ambiente. Sua concentração nas diferentes partes vegetais varia quantitativamente e
qualitativamente com fatores como tipo de solo, clima, tipo de adubação, período do dia e
época do ano. O termo qualidade para uma planta medicinal transcende os limites da
aparência e abundância da massa vegetal obtida. É preciso ir além, focando este conceito com
base na concentração dos princípios ativos presentes na massa vegetal. Isso porque a síntese
desses princípios ativos pode ser alterada conforme as técnicas de cultivo (OLIVEIRA
JÚNIOR, 2005).
Biologicamente, os óleos essenciais são mediadores de polinização tendo função
atrativa em determinadas espécies vegetais. Quimicamente, os óleos essenciais são definidos
como uma mistura complexa de substâncias voláteis, constituída basicamente de
fenilpropanóides, monoterpenos (85%) e sesquiterpenos (10-15%). Estes compostos são
instáveis em presença de luz, umidade, calor, metais e aptos a sofrerem polimerizações e
oxidações (CARDOSO, 2001).
Constituem-se em complexas misturas de substâncias voláteis, geralmente lipofílicas,
cujos componentes incluem hidrocarbonetos terpênicos, álcoois simples, aldeídos, cetonas,
fenóis, ésteres, ácidos orgânicos fixos, etc, em diferentes concentrações, nos quais, um
composto farmacologicamente ativo é majoritário (SANTURIO, 2007).
O uso de óleos essenciais tem grandes áreas de atuação, a nível fisiológico, uma vez
que as substâncias constituintes são absorvidas pelo organismo via oral, cutânea, respiratória,
injetável (aplicada somente por profissionais de saúde graduados), Com o desenvolvimento da
indústria química, os óleos sintéticos começaram a ser produzidos em larga escala, tornando-
16
se mais acessíveis economicamente. Se por um lado o uso de óleos essenciais na terapêutica
passa a ser mais divulgado (através do marketing das indústrias químicas), por outro ocorre
um prejuízo, pois produtos sintéticos não podem ser comparados a produtos naturais. Para o
uso farmacêutico, somente os óleos naturais são permitidos pela farmacopéia (DE LA CRUZ,
1997).
A nomenclatura é muito variada para a denominação dos óleos essenciais, que também
são chamados de substâncias voláteis ou óleos etéreos. Estas são misturas complexas e
apresentam as características de volatilidade, baixo peso molecular, normalmente são líquidos
de aparência oleosa, odoríferas, solúveis em solventes orgânicos e com solubilidade limitada
em água (SIMÕES et al., 1999).
Os métodos de extração dos óleos essencias passaram por uma evolução. Os
procedimentos empregados no passado eram bem simplificados e os produtos obtidos a partir
destes nem sempre eram óleos 100% puros. Hoje, com a tecnologia, é possível a extração de
óleos essenciais puros e concentrados. Este é o caso da extração por CO2 que permite obter-se
um produto final de extrema pureza e qualidade. Conforme o método empregado para
extração de um óleo essencial, suas características químicas poderão ser totalmente alteradas
fazendo com isso que seus efeitos terapêuticos alterem-se junto. Métodos mais rápidos de
extração pode ser o fator de um produto sair muito mais barato, mas conforme o óleo, isso
poderá alterar drasticamente suas qualidades terapêuticas para um tratamento. Dentre os
vários métodos de extração, podemos citar: Destilação à vapor, Hidrodestilação, Solvente,
CO2 hipercritico, Prensagem a frio, Turbodestilação e Hidrodifusão, Enfleurage, Fitóis ou
florasóis (AROMALÂNDIA, 2002).
Quimicamente, a maioria dos óleos essenciais é constituída de derivados
fenilpropanóides ou de terpenóides (ROCHA, 2006). As propriedades dos óleos podem ser
antivirais, bactericida, cicatrizante, analgésico, relaxante, expectorante e antiespasmódico
(MARTINS, 2000) dependendo da planta de origem.
Pelo fato do interesse no cultivo comercial de plantas medicinais ser recente,
informações sobre o crescimento e nutrição dessas espécies ainda são escassas e dispersas,
sobretudo para as originadas do Cerrado. Os poucos trabalhos científicos encontrados sobre
arnica fazem referência de estudos florísticos, fenológicos, fitoquímicos, de micropropagação,
conservação de germoplasma e produção de óleo essencial (OLIVEIRA JÚNIOR, 2006).
A idade e o desenvolvimento da planta, bem como dos diferentes órgãos vegetais,
também são de considerável importância e podem influenciar não só a quantidade total de
metabólitos produzidos, mas também as proporções relativas dos componentes da mistura. É
17
o caso, das lactonas sesquiterpênicas produzidas em Arnica montana, consideradas os
principais princípios ativos desta planta utilizada como antiinflamatório; enquanto plantas
jovens acumulam majoritariamente derivados da helenalina, a concentração destes compostos
é reduzida para praticamente zero após aproximadamente seis semanas contadas a partir da
formação das folhas; por outro lado, os níveis de compostos do tipo diidrohelenalina
aumentam muito e então se mantêm constantespor um longo período (LOPES, 2001).
Os nutrientes minerais essenciais, entre eles o fósforo, apresenta-se como componente
integral de importantes compostos das células vegetais, incluindo açúcares-fosfatados,
intermediários da respiração e fotossíntese e os fosfolipídeos que compõem as membranas
vegetais. É também componente de nucleotídeos utilizados no metabolismo energético das
plantas, como ATP, e no DNA e RNA. Este elemento participa de várias etapas da rota
biossíntética para a formação do óleo a partir de mono e sesquiterpenos, ora como integrante
de moléculas de enzimas ou de produtos de reações catalisadas por essas enzimas (DAVID,
2007).
18
2.4 Inflamação, cicatrização e efeito antinflamatório da arnica
Todos os organismos vivos, desde os procariontes até o homem, possuem mecanismos
adaptativos para responder a estímulos agressivos no sentido de manter o equilíbrio
homeostático. Nos vertebrados, esta resposta inclui uma série de alterações bioquímicas,
fisiológicas e imunológicas coletivamente denominadas inflamação (VOLTARELLI, 1994).
A inflamação é uma resposta celular e humoral de magnitude variável com
repercussões meramente locais, loco-regionais ou sistêmicas, cujo disparo é produtor de uma
cascata de eventos que envolvem complementos, cininas, fibrinolíticos e coagulantes
estimulados, juntos, com a ativação de fagócitos e das células endoteliais (SANTOS JUNIOR,
2003).
A inflamação pode ser causada por infecções microbianas, agentes físicos, substâncias
químicas, tecido necrótico e reações imunológicas, sendo chamados de agente inflamatório ou
flogógeno. O agente age sobre os tecidos e induz a liberação de mediadores que, ao agirem
nos receptores existentes nas células de microcirculação e nos leucócitos, produzem aumento
de permeabilidade vascular e exsudação de plasma e de células sanguíneas para o interstício.
Cessada a ação do agente inflamatório, reduz-se a liberação dos mediadores, a
microcirculação recupera o estado hemodinâmico original e o líquido e as células exsudadas
voltam à circulação sanguínea geralmente pelos vasos linfáticos. Se há necrose, o tecido
destruído é fagocitado e logo depois surgem os fenômenos de cicatrização ou de regeneração,
tudo dependendo da extensão da lesão e do órgão acometido. O processo inflamatório,
portanto, é um fenômeno essencialmente dinâmico, razão pela qual seu aspecto morfológico
se modifica com o tempo (SECCO, 1990).
A descrição feita anteriormente corresponde a uma reação inflamatória cujo agente
causal age e depois é eliminado ou inativado, permitindo a cura do processo. Contudo, há
agentes flogógenos que podem manter a inflamação por longo tempo, porque agem
repetidamente, devido à difícil eliminação ou porque induzem resposta imunitária a seus
antígenos. Nessas circunstâncias, a resposta inflamatória persiste em razão da geração
continuada de mediadores que estimulam a exsudação celular, podendo durar tempo variável.
Todavia, a inflamação e o reparo podem ser potencialmente nocivos, causando reações de
hipersensibilidade que ameaçam a vida do indivíduo, bem como a lesão progressiva e fibrose
dos órgãos (COLLINS, 2000).
Os estágios iniciais da inflamação envolvem mudanças locais no fluxo sanguíneo
(vasodilatação, aumentando a permeabilidade das vênulas, extravasamento de fluídos e
19
formação de edema) combinando a migração de várias células inflamatórias (neutrófilos,
eosinófilos, células dendríticas, mastócitos e linfócitos) no local do tecido injuriado. As
alterações no fluxo sanguíneo são desencadeadas por diferentes mediadores que se originam
do plasma ou de células locais, e este processo pode ser amplificado ou modificado por
produtos liberados das células inflamatórias que migraram para o local da inflamação. Os
mediadores químicos agem juntos ou em seqüência, amplificando resposta inflamatória inicial
e influenciando sua evolução por regular as subseqüentes respostas vascular e celular.
Existem três fases que são desejáveis e importantes e podem ser consideradas benignas dentro
de padrões das atividades celulares e dos mediadores que permanecem apropriadamente
regulados e podem ser identificadas por alterações locais notáveis pelos seguintes sinais e
sintomas: o rubor, o calor, o tumor e a dor (SANTOS JUNIOR, 2003).
Os principais mediadores envolvidos nas alterações vasculares são histamina, fator
ativador de plaquetas (PAF), prostaglandinas E (PGE2) e prostaciclinas (PGI2) ou ainda o
sistema de cininas (como a bradicinina), fatores do complemento (C3a e C5a), fatores do
sistema de coagulação e/ou fibrolítico (derivados do plasma) (VALDERRAMAS, 2006).
A inflamação é fundamentalmente uma resposta de defesa do organismo, visando
destruir, amenizar ou circunscrever a ação do agente agressor. Nesse processo encontramos o
macrófago em estado ativado, onde sua capacidade de fagocitar e exercer atividades
antimicrobianas e citotóxicas estão aumentados por sofrer uma série de alterações morfo-
funcionais (ROITT et al.,1999; SELIGMANN, 2003).
Independentemente da natureza do estímulo desencadeante, as células ativadas do
sistema fagocítico mononuclear (monócitos circulantes e macrófagos teciduais) iniciam a
cascata de eventos, secretando, em uma etapa inicial, citocinas da família da IL-1 e TNF
(fator de necrose tumoral). Estas moléculas têm ação pleiotrópica, tanto a nível local como
sistêmico. Localmente, agem sobre células da matriz ou estroma tecidual, principalmente
fibroblastos e células endoteliais, causando a liberação de um segundo conjunto de citocinas
que incluem, além dos próprios IL-1 e TNF, também IL-6 e IL-8 e as proteínas inflamatória
(MIP-1) e quimiotática (MCP) de macrófago (VOLTARELLI, 1994).
A inflamação aguda refere-se à resposta inicial à lesão tecidual; é mediada pela
liberação de mediadores químicos e em geral, precede o desenvolvimento da resposta imune.
Esta resposta acontece quando as células imunologicamente competentes são ativadas,
reagindo a organismos estranhos ou substâncias antigênicas, liberadas durante a resposta
inflamatória aguda ou crônica (WANMACHER; FERREIRA, 1995).
20
Em 1930, foi descrita no soro de pacientes com infecções agudas uma proteína que
precipitava o polissacarídeo C da cápsula do pneumococo (a proteína C-reativa ou PCR ) e em
1941 foi introduzido o termo “fase aguda” para descrever as alterações séricas observadas
nestes pacientes. Atualmente se sabe que, além das infecções, muitas outras formas de injúria
tecidual, como trauma, isquemia, neoplasias e hipersensibilidade, desencadeiam alterações na
concentração de várias proteínas plasmáticas, conhecidas como “proteínas de fase aguda”
(PFAg). Elas constituem apenas uma parte da “reação ou resposta de fase aguda” (RFAg) que
inclui febre, leucocitose e anormalidades metabólicas que produzem variada manifestação
clínica e laboratorial (VOLTARELLI, 1994)
O sistema fagocítico mononuclear é composto por dois tipos de células que participam
na defesa imune do hospedeiro, desenvolvendo funções distintas: os macrófagos e os
monócitos. Os macrófagos têm a função de remover antígenos particulados e atuar como
células apresentadoras de antígeno, internalizando e apresentando antígenos aos linfócitos T
(KIM; KIM; LEE, 2003). Os monócitos encontram-se circulando no sangue e quando
necessário, migram para diferentes órgãos e cavidades do corpo em reposta a um estímulo
lesivo, diferenciando-se em macrófagos. Os leucócitos polimorfonucleares são as primeiras
células que são ativadas na defesa imune do hospedeiro contra a infecção. Estas células
migram e infiltram-se no sítio inflamatório por gradientes quimiotáticos, onde juntamente
com os macrófagos, fagocitam e destroem o agente causador da inflamação (BIASI et al.,
2003; ARNHOLD, 2004)
A destruição do agente estranho ocorre por meio da liberação de enzimas hidrolíticas,
proteínas bactericidas e espécies reativas de oxigênio estocadas nos grânulos dos
polimorfonucleares (ARNHOLD, 2004). Dentre estas enzimas, pode-se destacar a
mieloperoxidase, uma protease presente nos grânulos azurófilos de neutrófilos e em
monócitos (RODRIGUES et al., 2002; ARNHOLD, 2004; HANSSON; OLSSON;
NAUSEEF, 2006)
O processo inflamatório possui três fases: 1- vasodilatação (YUI; LINARELLI;
ZELANTE, 1998), 2- aumento da permeabilidade vascular (TESKE et al, 1994), 3- exsudação
leucocitária (BEVILAQUA, 2003). A inflamação é fundamentalmente uma resposta de
proteção, cujo objeto é livrar o organismo tanto da causa inicial da agressão, microrganismos,
traumas e toxinas, quanto das conseqüências desta agressão às células e aos tecidos
necróticos. (ROBBINS et al., 1996). Desta forma, a resposta inflamatória é um mecanismo
que provoca alterações do sistema vascular, componentes líquidos e celulares, visando
21
destruir, diluir ou isolar o agente lesivo, sendo assim uma reação de defesa e de reparação do
dano tecidual (GILMAN, 1996; RANG et al, 1997).
A inflamação pode ser aguda, com duração relativamente curta apresentando os
eventos vasculares como exsudação plasmática e neutrófilos; ou crônica, com duração mais
longa e associada à presença de linfócitos e macrófagos, proliferação de vasos sanguíneos e
necrose tecidual. Os componentes básicos de um processo inflamatório envolvem eventos
irritativos, vasculares, exsudativos, celulares, mediadores derivados de células e indução da
resposta imune (RANG et al, 1997).
Os antinflamatórios são fármacos, cuja finalidade é a contenção e a reversão da
inflamação, seja local ou sistêmica. Devem apresentar rapidez de ação, potência analgésica e
segurança. São classificados esteroidais ( AIEs) ou Aine ( NUNES, 2006).
Os antinflamatórios não esteróides (AINES) ou mesmo corticoesteróides,
normalmente são empregados quando se deseja prevenir a dor ou edema de caráter
inflamatório, apesar de também apresentarem alguma ação em quadros onde a dor já se
encontre instalada e, estes medicamentos devem ser eleitos de acordo com a intensidade do
quadro, pois podem provocar vários efeitos nocivos (ROTHIER; ETHER, 1995).
Estas drogas exercem suas ações através da inibição da ciclooxigenase (COX), a
enzima chave que catalisa a conversão do ácido araquidônico em prostaglandinas e
tromboxanos. Apresentam-se como isoformes COX-1 (constitutivamente expressa nos
tecidos) e COX-2 (induzida em células e tecidos envolvidos com o processo inflamatório). As
prostaglandinas estão envolvidas em diversos processos fisiológicos e patológicos; ainda na
maioria dos leitos vasculares, as prostaglandinas da família E (PGEs) são potentes
vasodilatadoras. A PGI2 também é um eficiente vasodilatador, podendo causar importante
hipotensão arterial, enquanto o TXA2 apresenta potente atividade vasoconstritora. No sangue,
as prostaglandinas modulam também a função plaquetária. A PGE1, PGD2 e a PGI2 são
inibidoras da agregação plaquetária, ao passo que o tromboxano A2 é forte indutor da
agregação plaquetária. A PGI2 é sintetizada pelo endotélio vascular, controlando a adesão de
células ao endotélio e a agregação plaquetária, contribuindo como mecanismo
antitrombogênico da parede vascular intacta (MARQUES, 2006).
Ainda os AINES, além de antinflamatórios, são analgésicos suaves sendo eficazes
somente contra dor moderada. Este efeito analgésico é provavelmente devido à prevenção da
sensibilização do nociceptor, já que reduz a liberação dos mediadores químicos
(VALDERRAMAS, 2006).
22
Outros mecanismos dos AINES podem ser: estabilização da membrana lipossômica,
inibição da migração de leucócitos para área inflamada, interferências na reação antígeno-
anticorpo e inibição da biossíntese de mucopolissacarídeo. Seu uso se torna restrito pelo fato
de provocarem efeitos adversos, principalmente no trato gastrointestinal, além dos efeitos
hepáticos, renais, no baço, no sangue e na medula óssea (NUNES, 2006).
Apesar da predominância, no arsenal terapêutico, de substâncias sintéticas, inclusive
as antinflamatórias, nos últimos anos têm-se verificado retomada à valorização de práticas
terapêuticas consideradas por muitos profissionais de saúde como populares ou não
científicas, inclusive a lenta reincorporação das ervas medicinais como alternativa ou
complemento terapêutico (GARROS, 2006).
Dentre as substâncias naturais mais amplamente utilizadas para cicatrização de feridas
cutâneas, destacam-se o mel, a própolis e as folhas de Aloe vera. Estudos apresentando
resultados positivos foram feitos com óleo de copaíba (Copaifera langsdorfii), componente R,
fibras de batata doce (Ipomoea batatas) e curcumin (Curcuma longa) (OLIVEIRA, 2001).
Desde a Idade Média, os efeitos antinflamatórios da arnica são conhecidos, bem como
sua aplicação na cicatrização de ferimentos graças às suas propriedades regeneradoras de
tecidos. Vários estudos recentes têm demonstrado sua eficácia no tratamento antinflamatório
(ROCHA, 2006) e analgésico (BEVILAQUA, 2003). O efeito da tintura da arnica na
cicatrização de feridas abertas em ratos foi avaliado através da análise macroscópica do
aspecto da lesão e análise histológica. Foram observados vasos sanguíneos e elementos
celulares inflamatórios, demonstrando que os ratos tratados com tintura da arnica
apresentaram uma resposta mais satisfatória na cicatrização quando comparados aos demais
grupos controles (MIRANDA, 2001; YUI; LINARELLI; ZELANTE, 1998).
Os efeitos antinflamatórios são derivados dos constituintes químicos que esta planta
apresenta, como flavonóides, fenóis, acetofenona, carotenóide, glicosídeo, óleo essencial,
saponinas, terpenos, lactonas, sendo a helenalina e a dihidro-helenalina, as lactonas de ação
anti-flogística mais estudadas, entre outros princípios ativos ( FINAL, 2001).
Estudos recentes mostram que a composição química com flavonóides pode alterar as
propriedades funcionais de certas células como: mastócitos, basófilos, linfócitos, músculo liso
e plaquetas. Estas alterações ocorrem através da interferência com um grande número de
sistemas enzimáticos, principalmente nas enzimas que participam da formação dos
mediadores do processo inflamatório, como é o caso da fosfolipase A2, fosfolipase C, lipo e
cicloxigenase (LEE; MATTELIANO; MIDDLETON, 1982).
23
Os dados obtidos na literatura sobre a atividade antimicrobiana dos óleos essenciais
são tratados do ponto de vista experimental, considerando-se uma possível aplicação clínica
dos óleos. O estudo objetivou analisar os fatores que influenciam na atividade antimicrobiana
de óleos essenciais, in vitro, com base nos resultados descritos na literatura. Verificou-se que
os testes e avaliações da atividade antimicrobiana dos óleos essenciais podem ser dificultados
pela volatilidade do óleo, sua insolubilidade em água e sua complexidade química. Tais
dificuldades tornam os resultados disponíveis na literatura, difíceis de comparar. Por outro
lado, os métodos usados diferem largamente e fatores importantes que influenciam os
resultados são freqüentemente negligenciados. Assim, após breve levantamento, concluiu-se
que alguns fatores devem ser levados em consideração, tais como: a técnica usada, o meio de
cultura, densidade do inóculo, o óleo essencial e o emulsificador utilizado. Portanto, para a
realização de testes que visam verificar a atividade antimicrobiana de óleos essenciais, é
necessário definir e adotar uma metodologia adequada e bem padronizada (NASCIMENTO,
2007).
Existem relatos de avaliação clínica com arnica em inflamações de origem
odontológica. A arnica foi utilizada em pacientes submetidos à remoção cirúrgica de terceiros
molares inferiores, iniciando o tratamento três dias antes da cirurgia. Não houve edema em
90% dos pacientes, devido à redução da permeabilidade capilar resultando em diminuição do
sangramento durante a cirurgia (MACEDO, 2004).
Quando existe uma perda maior de células e tecido na formação de uma lesão
ulcerada, o processo inflamatório e o reparo desta lesão acontecem por união secundária e
envolvem uma série de eventos vasculares, celulares, neurológicos e humorais. Os
medicamentos que são usados para diminuir as lesões inflamatórias na mucosa oral são
preferencialmente de uso tópico. Tal fato deve prevenir os efeitos colaterais e as interações
medicamentosas decorrentes do uso desses medicamentos. As drogas mais utilizadas são os
antinflamatórios esteroidais como os corticosteróides, os quais sendo usado por um período
de tempo reduzido, de modo tópico, acabam por minimizar os efeitos adversos
(VALDERRAMAS, 2006).
Lökken et al. (1995), submeteram 24 pacientes a exodontia bilateral de terceiros
molares impactados em eventos distintos. A medicação Arnica Montana, era administrada três
horas após a cirurgia. Foram executadas medições de dor, segundo a escala analógica.
Observaram também edema, sangramento e capacidade de abertura bucal. Não encontraram
evidências da eficácia de tratamento homeopático sobre dor ou outros episódios inflamatórios.
Diferenças de 30 a 40% seriam necessárias para demonstrar efeitos significativos.
24
A eficiência da arnica para tratar ferimentos, especialmente àqueles com hematomas, é
comprovada pela presença de uma substância chamada quercetina, capaz de aumentar a
resistência dos vasos e a irrigação sangüínea nos locais feridos, diminuindo o coágulo e
eliminando o hematoma. Outra substância, a inulina, funciona como um analgésico, aliviando
a dor (SANTOS et al., 2005).
A medicina tradicional brasileira emprega preparações alcoólicas e hidroalcoólicas de
folhas e raiz de arnica para o tratamento de feridas, inflamação e dores. Santos et al.(2005)
afirma em seu estudo que pesquisas anteriores investigaram a presença de lactonas
sesquiterpene (Sls), ligninas(Lg) e flavonóides na arnica. Embora o Sls seja mais conhecido
por sua atividade antinflamatória in vitro, uma ação mediou sua inibição pelo NFk-B por isso,
ainda não há na evidência para tal atividade in vivo. Além disso, Sls tem sido descrito como
um potente alergênico. Frações de CH2Cl2 das raízes de arnica é ativo no teste do ácido
acético induzido em ratos. Dez Lg foram isolados dessa fração e alguns deles observados no
modelo de dor. Os resultados obtidos mostraram que o cubebin do Lg era um dos mais ativos.
Ambos, cubebim e metilcubebim foram ativos em doses de 10, 20 40mg/kg, mas não
produziram uma anti-nocipção dose-dependente e a dose de 5mg/kg foi ineficaz, como
também eram o outro Lg. Além disso, o cubebim dado aos ratos não mostrou atividade
antinflamatória ou antipirética. Dando continuidade aos experimentos, os autores pesquisam a
fitomedicina comercial focalizando frações polares da planta com preparações alcoólica e
hidroalcólicas. Eles relataram a atividade analgésica do extrato polar e o maior constituinte
(ácido di-cafealquino) da raiz da arnica. Este estudo suporta ao menos em parte o uso de raiz
de arnica na medicina tradicional (SANTOS et al., 2005).
Lussignoli et al. (1999), relatou o efeito do Traumeel S®, formulação homeopática
que contém arnica e outros extratos e minerais em sua composição, na inflamação sangue-
induzido em ratos. Observaram que o Traumeel S® parece agir apressando-se o processo em
vez de obstruir o desenvolvimento do edema no começo. Além disso, seu efeito não pode ser
considerado enquanto a soma de seus componentes ativos e provavelmente uma interação
cinegética ocorrer para determinar o efeito final.
As atividades analgésica e antinflamatória do extrato hidroalcoólico bruto da arnica
brasileira, em uma dosagem de 100, 200 e 300 mg/kg, administrada oralmente para os testes
de contorção, edema de pata e placa quente, 30 minutos antes da realização do experimento
em grupos de seis animais foi realizado. Utilizaram-se ratos Wistar (160-170 g) nos testes de
edema de pata e placa quente e camundongos Swiss albinos machos (20-25 g) no teste de
contorção abdominal. Para o teste de edema de pata a indometacina (5mg/kg) foi
25
administrado como droga padrão para o grupo controle positivo, e solução Tween 5 % em
salina no grupo controle negativo. Como agente flogístico, foi utilizada a carragenina 100 µg
por pata. Para o teste de contorção abdominal, as contorções foram induzidas pela
administração intraperitoneal de acido acético 0,6 % e as drogas utilizadas seguiram os
mesmos padrões do teste de edema de pata. Para o teste da placa quente, avaliou-se o tempo
de latência e como resposta nociva o ato de lamber uma das patas posteriores, após a
exposição à placa quente. Compararam-se os resultados obtidos com os padrões: positivo
[sulfato de morfina (4 mg/kg)] e negativo (Tween 5 % em solução salina). Os resultados
apresentados nos testes demonstraram uma redução do edema das patas dos ratos nos grupos
tratados em relação aos grupos controles, o que indica que a arnica brasileira apresenta
atividade antinflamatória. A arnica brasileira também apresenta atividade analgésica
periférica uma vez que foi observado no teste de contorção que os grupos tratados com arnica
demonstraram um número de contorção menor que os demais apresentados. No teste da placa
quente (analgesia central) os grupos tratados com arnica não demonstraram resposta
significante, comparando-se com os grupos controle (ROCHA, 2006).
O reparo de tecidos pode ocorrer de duas formas: (1) pela regeneração com a
recomposição da atividade funcional do tecido ou (2) pela cicatrização com restabelecimento
da homeostasia do tecido com perda da sua atividade funcional pela formação de tecido
conjuntivo neoformado-fibrose. Após um trauma ou doença, esses processos ocorrem visando
limitar os danos e restabelecer a integridade e a função dos tecidos afetados. Inicialmente, a
ferida é preenchida por coágulo, fibrinas e exsudato formando uma crosta que a isola do meio
ambiente quase que imediatamente (COTRAN, 1989) e sua reestruturação constituem
mecanismo complexo, em que vários fatores contribuem para a criação de diversos tipos de
cicatrização, como hipertrofia, atrofia ou normotrofia, da área lesionada (ROCHA JÚNIOR,
2006).
A regeneração e a cicatrização constituem eventos distintos. Na regeneração, a
reposição tecidual é realizada por meio de células do mesmo tipo das células perdidas no
momento da lesão; sendo assim, se houver pouca alteração do estroma, a regeneração da lesão
será completa. Na cicatrização, entretanto, diante de grandes destruições teciduais, estes são
substituídos por um conjuntivo próprio que é a cicatriz (VIEIRA, 2006).
O reparo é dividido em três fases: (1) inflamação, (2) formação de tecido de
granulação com deposição de matriz extracelular e (3) remodelação. Estas fases não são
mutuamente excludentes, mas sobrepostas no tempo. O reparo completo de tecidos resulta de
alternâncias sucessivas de reações anabólicas e catabólicas que têm os leucócitos como um de
26
seus mais importantes protagonistas. Essas células, além de suas conhecidas atividades
imunes, estão intimamente envolvidas com as reações catabólicas de degradação de tecidos
pela produção de proteases e espécies reativas de oxigênio e nitrogênio e também com as
reações anabólicas de formação de tecidos pela produção de fatores de crescimento,
responsáveis pela recomposição da celularidade regional ou restabelecimento da sua
homeostasia pela formação da cicatriz (BALBINO; PEREIRA; CURI, 2005).
A fase inflamatória inicia-se imediatamente após a lesão, ocorrendo vasoconstrição
por cinco a dez minutos. Essa vasoconstricção inicialmente reflexa propicia o fechamento dos
vasos lesados e favorece a hemostasia. Posteriormente, as células endoteliais retraem-se e
perdem suas conexões, aumentando a permeabilidade vascular e permitindo a passagem de
elementos sanguíneos para a ferida como plasma, eritrócitos e leucócitos, através do
fenômeno de diapedese. São importantes nesta fase os neutrófilos, responsáveis pela digestão
das bactérias e tecidos desvitalizados e os monócitos que se transformam em macrófagos e
auxiliam na fagocitose (GUYTON, 1989; VILELA; 2006).
Na fase proliferativa ou fibroblástica ocorre a reparação do tecido conjuntivo e do
epitélio, formando o tecido de granulação, que é composto por fibroblastos e vasos
sanguíneos neoformados. O fibroblasto surge por volta do segundo e terceiro dia após o
trauma (RESENDE; PEREIRA; CASTRO; 2005).
A remodelação do colágeno inicia-se na formação do tecido de granulação e mantém-
se por meses após a reepitelização. As colagenases e outras proteases produzidas por
macrófagos e células epidérmicas dão direção correta às fibras colágenas difusas. Há
diminuição de todos os elementos celulares, inclusive fibroblastos. (VIEIRA, 2006).
A cicatrização de feridas pode acontecer por: primeira intenção ou união primária,
quando as margens da ferida são aproximadas, havendo perda mínima de tecido, ausência de
infecção e discreto edema. Por segunda intenção ou união secundária quando ocorre perda
excessiva de tecido e presença de infecção, comprometendo a reparação, que se torna mais
lenta e por terceira intenção ou união terciária, quando a ferida não é suturada no tempo
previsto ou quando a sutura se rompe e a ferida necessita ser suturada novamente,
comprometendo o processo de cicatrização (VIEIRA, 2006).
27
3 PROPOSIÇÃO
O objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade antiinflamatória do óleo
essencial da Arnica por aplicação intraperitoneal em feridas cutâneas no dorso de ratos Wistar
através de análise histológica.
28
4 MATERIAIS E MÉTODOS
Este trabalho está de acordo com os princípios éticos adotados pelo Colégio Brasileiro de
Experimentação Animal (COBEA) e foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Universidade
Vale do Rio Verde-UNINCOR/Três Corações-MG.
4.1 Equipamentos Utilizados -Ketamina® injetável - uso veterinário - Quetamina 10% (30mg/kg de peso do animal)
(AGENER- São Paulo, SP, BR);
-Calmium® injetável - uso veterinário - Xilazina a 2% (6mg/kg de peso do animal)
(AGENER- São Paulo, SP, BR);
-Seringas com agulha de insulina 1 ml/cc U-100 – 13 X 0.38 (27,5 G1/2’’) (INJEX –
Ourinhos, SP,BR);
-Cloreto de sódio a 0,9% (SANOBIOL, Pouso Alegre, MG, BR)
-Lâmina de bisturi nº15 (LAMEDID, Barueri, SP, BR) ;
-Cabo de bisturi (DUFLEX, SSWHITE, Rio de Janeiro, RJ, BR);
-Tesoura de ponta romba (QUINELATO, Rio Claro, SP, BR);
-Pinças curvas (DUFLEX, SSWHITE, Rio de Janeiro, RJ, BR);
-Formol a 10%;
-Parafina;
-Hematoxilina e eosina;
-Microscópio ótico adaptado a um video-câmera
-Frascos de plástico com tampa de 100 ml
-Béquer
-Pipeta
-Luvas de procedimentos
-Luvas de couro
-Gaiolas próprias para ratos
-Frascos de vidro estéreis com tampa
29
4.2 Solução experimental de arnica O óleo essencial foi fornecido pela Farmácia Homeopática Bom Chá Comercial
LTDA, especializada em comércio de ervas, temperos e condimentos nacionais e importados,
sob CNPJ: 01.099.642/001-26, Inscrição Estadual: 114.680.182.116, e CEP: 01020-000,
localizada na Rua Tabatinguera, 520, no Centro de São Paulo/SP.
Resultados dados em conformidade com o certificado de análise do fornecedor:
Lote: 035298
Análise: 00035438 29/03/2007
Origem e procedência: nacional
Fabricação 03/2007 Validade: 09/2008
Aspecto: líquido, límpido
Cor: âmbar
Odor e sabor: característico
Densidade: 1,035 pH: 5,8 Viscosidade: 8,10 cPS
Solubilidade: completamente miscível em álcool, propilenoglicol
Monografia: laudo original do fabricante
4.3 Animais de experimentação
Utilizaram-se vinte ratos albinos Wistar, machos, com peso corporal em média de
230 gramas, com idade aproximada de cem dias, todos provenientes do Biotério da
Universidade Vale do Rio Verde-UNINCOR/Três Corações-MG. Os animais foram mantidos
em gaiolas individuais para que a ferida não tivesse contato com outros animais ou qualquer
tipo de contaminação externa. Os animais receberam água e ração ad libidum com ciclos de
claro/escuro de 12 horas (luz natural) e boa ventilação (FIGURA 1).
4.4 Protocolo para ferida induzida
Os animais foram anestesiados por Ketamina® (30mg/Kg de peso) e Calmium®
(6mg/Kg de peso), por via intraperitoneal e mantido na mesa operatória (FIGURA 2), em
posição de pronação. Os procedimentos foram realizados em ambiente asséptico, com todos
os materiais cirúrgicos autoclavados. Em seguida, realizou-se a tricotomia manual na região
mediana do dorso.
Com auxílio de um gabarito plástico com 10 mm de diâmetro calibrado com um
paquímetro digital (FIGURA 3), utilizando-se de cabo de bisturi, lâmina número quinze,
30
pinça curva e seringa de insulina (FIGURA 4), foi realizada uma abertura cutânea na região
dorsal dos animais dos dois grupos (FIGURA 5 e FIGURA 6).
4.5 Grupos experimentais
A amostra foi dividida em dois grupos de dez animais cada:
- Grupo A: Este grupo recebeu uma solução contendo 10% de soro fisiológico em
propilenoglicol.
- Grupo B: Este grupo recebeu uma solução contendo 10% de óleo essencial de arnica
em propilenoglicol.
4.6 Administração das Substâncias
As soluções foram administradas de acordo com cada grupo, numa concentração de
150mg/Kg de óleo essencial de arnica (0,40 ml) aproximadamente para o grupo A e volume
equivalente no Grupo B, por via intraperitoneal, com intervalo de doze horas, durante sete
dias. Os animais não foram anestesiados durante os procedimentos de aplicação da solução.
Após sete dias todos os animais foram anestesiados, biopsiados e sacrificados por
dose letal de anestésico. As amostras foram fixadas em formol a 10% para que suas estruturas
morfológicas mantivessem preservadas. Em seguida, foram encaminhadas para o Laboratório
de Patologia da Universidade Vale do Rio Verde - UNINCOR/Três Corações-MG, onde
passaram pelas etapas subseqüentes para a obtenção das lâminas, através das quais se fez a
análise dos componentes celulares presentes e a quantificação do processo inflamatório dos
grupos estudados.
31
FIGURA 1 - Gaiola individual FIGURA 2 – Animal anestesiado com área
de tricotomia em região mediana do dorso
FIGURA 3 - paquímetro digital com gabarito plástico
FIGURA 4 - Mesa operatória- utilizada
FIGURA 5 - Animal anestesiado com remoção da espécime
FIGURA 6 - Área dorsal em maior aumento
32
4.7 Processo de montagem das laminas
4.7.1 Fixação
A fixação é considerada a primeira etapa para o processo de origem das lâminas. No
presente estudo optou-e pelo formol de acordo com o protocolo do Laboratório de Patologia
da Universidade Vale do Rio Verde - UNINCOR/Três Corações-MG.
4.7.2 Desidratação
A desidratação das peças é um processo necessário para que as mesmas possam ser
incluídas em parafinas. É necessário que se faça uma substituição gradual com imersão em
soluções de álcool com concentrações crescentes (álcool 70%, 90%, 95%, 100%I, 100%II e
100%III) permanecendo uma hora em cada recipiente para completa remoção da água. Porém,
álcool e parafina não são miscíveis, havendo a necessidade de substituir o álcool por xilol.
4.7.3 Diafanização
O xilol é um agente diafinizador (solvente de parafina). Desta maneira, a peça é imersa
em xilol com concentrações crescentes (álcool-xilol, xilol I, II e III) permanecendo uma hora
em cada recipiente a fim de promover a total substituição do álcool.
4.7.4 Inclusão
A inclusão é feita colocando-se as peças em banho de parafina, para que o xilol seja
totalmente substituído pela mesma. Os trabalhos de inclusão podem ser divididos em três
etapas: embebição, inclusão definitiva ou formação de bloco e sua fixação no suporte e tem
como finalidade fazer com que os tecidos suportem o processo de corte.
4.7.5 Microtomia e montagem dos cortes sobre as lâminas
Para que os tecidos possam ser vistos, a luz deve ultrapassá-los, dirigindo-se aos olhos
do observador. Isto limita a espessura dos cortes em a poucos micrômetros. Quando os cortes
são feitos no micrótomo a parafina fica e o material envolto por ela sofre enrugamento.
Devemos, então, providenciar para que fique distendida (não derretida) colocando pouca água
sobre a lâmina e esta sobre uma placa aquecida (50ºC). Após o resfriamento, escorre-se o
33
excesso de água, se necessário faz-se uso de papel de filtro. Com o auxilio de um pincel,
posiciona-se o corte sobre a lâmina, levando depois para a secagem em estufa (40ºC), de 15 a
30 minutos.
4.7.6 Coloração
Como a maioria dos corantes age somente em solução aquosa, para que se possa corar,
deve-se promover a hidratação dos cortes (desparafinização, eliminação do solvente e
hidratação), seguindo o procedimento descrito abaixo:
• Xilol III ..............................................................5 minutos
• Xilol II................................................................5 minutos
• Xilol I ................................................................5 minutos
• Xilol: álcool 2:1..................................................5 minutos
• Xilol: álcool 1:1.................................................5 minutos
• Xilol: álcool 1:2................................................. 5 minutos
• álcool 100% I ....................................................3 minutos
• álcool 100% II ...................................................3 minutos
• álcool 100% III ..................................................3 minutos
• álcool 95% ....................................................... 3 minutos
• álcool 90 % .................................................... 3 minutos
• álcool 70 % .................................................... 3 minutos
• água destilada...................................................... enxaguar
Após a passagem por água destilada as lâminas estão prontas para serem coradas,
conforme o método de escolha.
4.7.6.1 Corantes
Os corantes são compostos químicos com determinados radicais ácidos ou básicos que
possuem cor, e apresentam afinidade de combinação com estruturas básicas ou ácidas dos
tecidos. Rotineiramente, usa-se hematoxilina (H), corante básico que se liga aos radicais
ácidos dos tecidos, e eosina (E), corante ácido que tem afinidade por radicais básicos dos
tecidos.
34
4.7.6.2 Método de coloração com HE
- Utilizando-se uma cuba própria para acomodar as lâminas (ou diretamente sobre as
mesmas), estas foram coradas de 3 a 5 minutos com hematoxilina.
- As lâminas foram lavadas durante um minuto em água corrente.
- As lâminas foram coradas durante 15 minutos em eosina.
- As lâminas foram lavadas novamente durante um minuto em água corrente.
- Diferenciar a eosina em álcool 70%, passando rapidamente a lâmina pelo álcool.
- Promoveu-se a desidratação para que as lâminas possam ser montadas em Bálsamo
do Canadá.
4.7.7 Montagem das lâminas em Bálsamo de Canadá
Após serem coradas, as lâminas foram desidratadas para prevenir a difusão dos
corantes e porque a água possui índice de refração diferente do vidro, podendo prejudicar a
leitura. Outra vez procedeu-se com a diafanização com xilol, a fim de tornar os cortes
perfeitamente transparentes.
Desidratação:
- álcool 70% .......................................................3 minutos
- álcool 90%........................................................3 minutos
- álcool 95%........................................................3 minutos
- álcool 100% I................................................... 3 minutos
- álcool 100% I.I................................................. 3 minutos
- álcool 100% III................................................ 3 minutos
- álcool:xilol 1:1 .................................................3 minutos
- álcool:xilol 1:1 .................................................3 minutos
- xilol I.................................................................5 minutos
- xilol II................................................................5 minutos
- xilol III.............................................................. 5 minutos
Foi feita, então, a montagem que é a etapa final da técnica histológica, que consistiu na
colagem da lamínula sobre o corte, com bálsamo do Canadá, uma resina que é solúvel em
xilol e insolúvel em água. A lamínula impede que haja hidratação do corte pela umidade do ar
ambiente, permitindo então que estas lâminas se mantenham estáveis por tempo indefinido.
35
Coloca uma gota do Bálsamo sobre o material e, em seguida, a lamínula, procurando evitar a
formação de bolhas de ar. Depois foram levadas para a estufa na posição horizontal, onde
permaneceram por pelo menos 48 horas (36ºC) para a secagem do Bálsamo. Assim, as
lâminas estão prontas para etiquetagem e leitura.
4.7.8 Leitura das lâminas
Um único examinador realizou a avaliação das lâminas coradas em Hematoxilina-
Eosina. A avaliação consistiu da graduação em 0 = ausente, 1 = leve, 2 = moderado, 3 =
intenso e x = presente, mas sem análise gradativa, para os seguintes itens:
-Epitélio: marginal, revestimento da ferida, pavimentoso estratificado,
paraqueratinizado, ortoqueratinizado, hiperplásico e atrófico/fino.
- Crosta: espessa e fina
- Infiltrado inflamatório: mononuclear e polimorfonuclear
- Edema
- Vasodilatação e Hiperemia
- Tecido de granulação: jovem e maduro
- Fibrose
4.8 Análise estatística
Os resultados encontrados foram tabelados e a análise estatística foi aplicada. A
distribuição da severidade do infiltrado inflamatório foi comparada entre os grupos através do
teste Mann-Whitney com nível de significância de 95%.
36
5 RESULTADOS
Os resultados serão apresentados por meio da descrição microscópica conjunta das
lâminas analisadas para cada Grupo e para cada período experimental. A seguir os fenômenos
serão ilustrados por meio de fotomicrografias, permitindo uma melhor compreensão e
comparação dos fenômenos relatados.
Tabela 1 Descrição individual das variáveis histopatológicas do grupo A
Grupo A
Espécimes 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Marginal 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Revestimento da
ferida
X 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Pavimentoso
estratificado
X X X X X X X X X X
Paraqueratinizado X X X X X X X X X X
Ortoqueratinizado 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Hiperplásico 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Epitélio
Atrófico/Fino X X X X X X X X X X
Espessa 0 X X X X X X X X X Crosta
Fina 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
MN 1 2 2 1 1 1 1 2 1 1 Infiltrado
Inflamatório PMN 0 1 2 0 1 1 1 2 2 0
Edema 1 2 2 0 1 1 1 2 1 0
Vasodilatação e
Hiperemia
Vasodilatação e
Hiperemia
1 2 2 1 1 1 1 2 2 1
Jovem 1 2 2 2 2 2 1 2 2 1 Tecido de
Granulação Maduro 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Fibrose 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 = ausente, 1 = leve, 2 = moderado, 3 = intenso e x = presente.
37
A análise microscópica dos cortes corados em hematoxilina-eosina (HE) mostrou ferida
parcialmente revestida por epitélio pavimentoso, estratificado e paraqueratinizado, com
apenas um espécime mostrando revestimento epitelial total da ferida. Os demais espécimes
mostraram epitélio com proliferação inicial nas margens da ferida, com grau 1, ou seja com
pequena extensão em direção ao centro da ferida. As características predominantes do
epitélio foram a espessura fina, com células em até dez camadas pouco distintas, com a
superfície constituída por paraqueratina. A maior extensão das feridas estava recoberta por
crosta espessa contendo muitos polimorfonucleares, hemácias e fibrina, na forma de coágulo
sanguíneo. Em alguns espécimes a crosta encontrava-se destacada da superfície, à distância,
provavelmente em conseqüência da manipulação cirúrgica durante a remoção da ferida.
Preenchendo a ferida encontrou-se, em todos os espécimes e com pequena variação de
intensidade, um infiltrado inflamatório mononuclear com predomínio de macrófagos,
sugerindo uma transição entre a inflamação e o tecido de granulação, sendo os
polimorfonucleares típicos da superfície superior da ferida em contato com a crosta.
Notadamente há numerosos vasos sanguíneos, pequenos, dilatados e hipêremicos,
característicos do tecido de granulação jovem, predominante em todos os espécimes e que se
apresentava ricamente celularizado com fibrócitos e fibroblastos. O edema foi discreto e
devido mais à vascularização do tecido de granulação jovem do que um componente do
processo inflamatório. Em profundidade o tecido de granulação estendia-se até os tecidos
musculares e adiposos. Não foram encontradas formações iniciais de fibrose no tecido de
granulação. (FIGURAS 7, 8 e 9)
38
FIGURA 7 – Nota-se área correspondente à ferida cuja crosta encontra-se deslocada, sendo espessa e uniforme. Nas margens há discreta proliferação epitelial e na porção central observa-se tecido de granulação jovem, bastante vascularizado e com discreto infiltrado inflamatório mononuclear. Objetiva 2,5x
ferida
Tecido de Granulação
epitélio
crosta
39
FIGURA 8 – Nota-se área correspondente à margem da ferida com discreta proliferação epitelial e com tecido de granulação jovem, bastante vascularizado e com discreto infiltrado inflamatório mononuclear. Objetiva 10x
epitélio
40
FIGURA 9 – Nota-se área correspondente ao tecido de granulação jovem: bastante celularizado com fibrócitos, vascularizado com microvasos sanguíneos e com discretos leucócitos mononucleares. Objetiva 25x
MN
41
Tabela 2: Descrição individual das variáveis histopatológicas do grupo B
Grupo B
Espécimes 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Marginal 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1
Revestimento da
ferida
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Pavimentoso
estratificado
X X X 0 X X X X X X
Paraqueratinizado X X X 0 X X X X X X
Ortoqueratinizado 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Hiperplásico 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Epitélio
Atrófico/Fino X X X 0 X X X X X X
Espessa X X 0 X X X X X X 0 Crosta
Fina 0 0 X 0 0 0 0 0 0 X
MN 2 2 2 2 1 2 1 2 2 1 Infiltrado
Inflamatório PMN 2 2 2 2 1 2 1 2 1 1
Edema 2 1 2 2 1 1 1 1 1 1
Vasodilatação e
Hiperemia
Vasodilatação e
Hiperemia
2 2 2 2 1 2 2 2 2 2
Jovem 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 Tecido de
Granulação Maduro 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1
Fibrose 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 = ausente, 1 = leve, 2 = moderado, 3 = intenso e x = presente.
A análise microscópica dos cortes corados em hematoxilina-eosina (HE) mostrou ferida
parcialmente revestida por epitélio pavimentoso, estratificado e paraqueratinizado. Um
espécime não mostrou proliferação marginal, e os demais mostraram epitélio com
proliferação inicial (grau 1 – discreto) com pequena extensão em direção ao centro da ferida.
As características predominantes do epitélio foram a espessura fina, com células em até dez
camadas pouco distintas, com a superfície constituída por paraqueratina. A maior extensão
das feridas estava recoberta por crosta espessa ou atrófica contendo muitos
polimorfonucleares, hemácias e fibrina, na forma de coágulo sanguíneo. Em alguns
42
espécimes a crosta encontrava-se destacada da superfície, a distância, provavelmente em
conseqüência da manipulação cirúrgica durante a remoção da ferida. Preenchendo a ferida
encontra-se, em todos os espécimes e com variação de intensidade, tecido de granulação e
infiltrado inflamatório mononuclear com predomínio de macrófagos, sugerindo uma
transição entre a inflamação e o tecido de granulação, sendo os polimorfonucleares típicos da
superfície superior da ferida em contato com a crosta, porém, sendo, às vezes notados no
interior da ferida, em pequena intensidade. Notadamente há numerosos vasos sanguíneos,
pequenos, dilatados e hipêremicos, característicos do tecido de granulação jovem,
predominante em todos os espécimes e que se apresentava ricamente celularizado com
fibrócitos e fibroblastos. O edema foi de discreto a moderado e devido ao infiltrado
inflamatório moderado e à rica vascularização típica do tecido de granulação jovem. Em
profundidade o tecido de granulação estendia-se até os tecidos muscular e adiposo. Não
foram encontradas formações iniciais de fibrose no tecido de granulação.
43
FIGURA 10 - Nota-se área correspondente à ferida cuja crosta foi deslocada. Nas margens há discreta proliferação epitelial e na porção central observa-se tecido de granulação jovem, bastante vascularizado e com moderado infiltrado inflamatório mononuclear. Objetiva 2,5x
tecido de granulação
ferida
epitélio
44
FIGURA 11 - Nota-se área correspondente à margem da ferida com proliferação epitelial e com tecido de granulação jovem, bastante vascularizado e com moderado infiltrado inflamatório mononuclear. Objetiva 10x
tecido de granulação
epitélio
45
FIGURA 12 - Nota-se área correspondente ao tecido de granulação jovem: bastante celularizado e vascularizado com vasos sanguíneos (VS) levemente dilatados e hiperêmicos, além de leucócitos mononucleares (MN). Objetiva 25x
MN
VS
46
Tabela 3: Teste de Mann-Whitney para as variáveis histopatológicas entre os grupos
Espécimes P
Marginal p= 0,969
Revestimento da
ferida
p= 1,000
Pavimentoso
estratificado
p= 1,000
Paraqueratinizado p= 1,000
Ortoqueratinizado p= 1,000
Hiperplásico p= 1,000
Epitélio
Atrófico/Fino p= 1,000
Espessa p= 1,000 Crosta
Fina p= 1,000
MN p= 0,138 Infiltrado
Inflamatório PMN p= 0,065
Edema p= 0,621
Vasodilatação e
Hiperemia
Vasodilatação e
Hiperemia
p= 0,062
Jovem p= 0,138 Tecido de
Granulação Maduro p= 0,266
Fibrose p= 1,000
A análise estatística dos dados pelo teste de Mann-Whitney demonstrou que não houve
diferença estatisticamente significativa entre os grupos para as variáveis estudadas
(Tabela 3).
47
4 DISCUSSÃO
O presente estudo teve como objetivo analisar o efeito antinflamatório e de
cicatrização do óleo essencial da arnica administrado por via intraperitoneal no reparo de
feridas cutâneas em ratos. Para a execução desta pesquisa, o óleo essencial de arnica foi
adquirido em farmácia de manipulação na concentração de 100%. Os métodos de extração
dos óleos essenciais passaram por uma evolução. Muitas plantas têm sua eficiência respaldada
pelo uso tradicional, repassada de geração em geração, ou contam com estudos de eficiência e
segurança devidamente estabelecidos (BEVILAQUA, 2003). Os procedimentos empregados
no passado eram bem simplificados e os produtos obtidos a partir destes nem sempre eram
óleos 100% puros. Atualmente, com a tecnologia, é possível a extração de óleos essenciais
puros e concentrados (AROMALÂNDIA, 2002). A nossa opção de aquisição em farmácia de
manipulação foi devido ao uso rotineiro destas formulações pela população em geral. A
obtenção do óleo em laboratório de pesquisa poderia causar divergência com a técnica de
manipulação em que o óleo é realmente consumido, justificando a aquisição em fornecedor do
mercado. É significativo salientar que a procedência do óleo é de suma importância, uma vez
que devem ser levados em conta alguns critérios para formulação dos fitoterápicos: que a
espécie vegetal seja selecionada corretamente, o cultivo seja adequado, a avaliação dos teores
dos princípios ativos seja feita e para que a manipulação e a aplicação na clínica médica
ocorram (ARNOUS, 2005). Entretanto, nenhum trabalho utilizando óleo essencial de arnica
foi encontrado na literatura.
O uso popular de plantas na medicina tradicional é uma valiosa fonte para a descoberta
de novos agentes terapêuticos. No entanto, o conhecimento popular tem que estar associado a
bioensaios para comprovar a eficácia e a toxicidade dessas plantas. Apesar de a arnica ser
utilizada freqüentemente pela população de modo geral, a quase totalidade das aplicações
estão associadas à forma de tintura (VALDERRAMAS, 2006). Com o decorrer da evolução,
teorias e análises de certas plantas medicinais foram criadas com o objetivo de contribuir com
a ciência médica moderna. (GUYOT, 1990; MIGUEL, MIGUEL 1999). O presente estudo
teve como diferenciais o uso do óleo essencial e a via intraperitoneal como opção de
administração.
Não há relato na literatura, até o presente momento, quanto ao uso terapêutico do óleo
essencial de arnica por via intraperitoneal, necessitando-se de mais estudos para que seu
mecanismo de ação possa ser mais bem compreendido e para permitir a comparação entre
48
diversas metodologias. A arnica apresenta extratos com propriedades na absorção de edemas,
e cicatrização de feridas, propriedades analgésicas e antinflamatória (MIRANDA, 2001). O
uso tópico é atualmente muito utilizado em contusões, inflamações (CARVALHO;
BONAMIM, 2001), ferimentos e hemorragias subcutâneas (ROCHA, 2006; LUSSIGNOLI et
al, 1999). Os extratos das flores e de outras partes da planta são empregados topicamente ou
na forma de tintura na terapêutica para distensões, hematomas, inchações dolorosas, entorses
e ferimentos em geral (YUI et al, 1998).
A arnica apresenta potencial no favorecimento da cicatrização de feridas (EDGAIR
FERNANDES MARTINS, et al, 2005; JOURNAL OF THE ROYAL SOCIETY OF
MEDICINE, 2003; MIRANDA, 2001). Desta forma, a presente metodologia empregou o
modelo de cicatrização no dorso de ratos com e sem o uso do óleo essencial de arnica,
substituindo-o por solução salina.
Na presente amostra não houve diferença significativa no processo de cicatrização
entre o grupo onde foi realizada a administração do óleo essencial de arnica (Grupo B) e o
grupo controle (Grupo A) onde foi aplicada solução salina (p>0,05). Um estudo para analisar
os efeitos da arnica na ação de diferentes agentes flogísticos em ratos verificou que houve
uma inibição do edema inflamatório (peso da pata), de acordo com os agentes irritantes
testados (CARVALHO e BONAMIN, 2001). Entretanto, o método de avaliação foi clínico e a
solução de arnica testada foi aplicada na forma de tintura (uso tópico). No presente estudo, a
ausência de diferença entre os grupos testados pode ter sido causada por baixa concentração
do óleo essencial na solução testada. Novos estudos com variação nas concentrações da
solução de arnica deverão ser desenvolvidos para constatação efetiva desta observação.
Neste trabalho, as aplicações das soluções foram realizadas por via intraperitoneal por
ser a via mais rápida de absorção. No uso tópico, o animal pode lamber o medicamento
dificultando a manutenção da concentração inicial. Além disso, a aplicação intraperitoneal
diminui o estresse quando comparada à técnica de administração gástrica por via oral (rato
entubado) e pelo pouco tempo de manuseio dos animais durante o procedimento. A dosagem
de 10% de óleo essencial e 90% de diluente nas aplicações foi baseada nas dosagens
recomendadas pela farmacopéia brasileira (MACIEL et al., 2006). Entretanto, novos estudos
devem ser realizados para a determinação da melhor dose terapêutica com o menor índice de
reações adversas, bem como análises toxicológicas.
O uso de óleos essenciais tem grandes áreas de ação: em nível fisiológico, uma vez
que as substâncias constituintes são absorvidas pelo organismo via oral, cutânea, respiratória,
injetável (aplicada somente por profissionais de saúde graduados). Com o desenvolvimento da
49
indústria química, os óleos sintéticos começaram a ser produzidos em larga escala, tornando-
se mais acessíveis economicamente. Se por um lado o uso de óleos essenciais na terapêutica
passa a ser mais divulgado (através do marketing das indústrias químicas), por outro ocorre
um prejuízo, pois produtos sintéticos não podem ser comparados a produtos naturais. Para o
uso farmacêutico, somente os óleos naturais são permitidos pela farmacopéia (De La Cruz,
1997).
O completo entendimento do mecanismo de ação do óleo essencial de arnica só se
dará por meio de metodologias apropriadas em futuros estudos. Uma curva dose-resposta
poderia verificar a existência de uma dosagem efetiva na aceleração e favorecimento do
processo cicatricial. Além disso, a comparação entre as vias de administração também é
importante, uma vez que se espera que as vias injetáveis utilizem dosagens mais baixas.
Nessas circunstâncias, a resposta inflamatória persiste em razão da geração continuada de
mediadores que estimulam a exsudação celular, podendo durar tempo variável. Todavia, a
inflamação e o reparo podem ser potencialmente nocivos, causando reações de
hipersensibilidade que ameaçam a vida do indivíduo, bem como a lesão progressiva e fibrose
dos órgãos (COLLINS, 2000).
O processo inflamatório refere-se à reação do tecido vivo vascularizado a uma
agressão que cause morte e necrose celular, sendo imprescindível para o estabelecimento da
cura. O processo inicia-se com a liberação de mediadores químicos que estimulam receptores
existentes nas células endoteliais da microcirculação e nos leucócitos, causando
vasodilatação, aumento da permeabilidade vascular, exsudação de plasma, de macromoléculas
sanguíneas e de leucócitos para o interstício. Este início refere-se à denominada inflamação
aguda e tem variação no tempo de duração e na intensidade dos sinais e sintomas. Com a
persistência e a agressividade do agente agressor, a tendência é a fase aguda se prolongar e ser
bastante sintomática, sendo, este último, importante para alertar o indivíduo da anormalidade.
Assim, quando as características da fase aguda inexistem ou são brandas significam que o
agressor tem baixa virulência ou que o mesmo foi eliminado ou controlado pela inflamação.
Nos períodos analisados houve a presença de infiltrado inflamatório polimorfonuclear
(neutrófilos) na porção da ferida, subjacente à crosta, caracterizando que a mesma, apesar de
proteger o tecido de granulação, não o faz completamente, assim nota-se nessa região, além
dos neutrófilos, plasma sangüíneo e hemácias extravasadas, células mortas e
microorganismos. No presente trabalho observamos os neutrófilos restritos à região da crosta
e logo abaixo, sugerindo uma fase aguda discreta e controlada. A inflamação é
fundamentalmente uma resposta de defesa do organismo, visando destruir, amenizar ou
50
circunscrever a ação do agente agressor. Nesse processo encontramos o macrófago em estado
ativado, onde sua capacidade de fagocitar e exercer atividades antimicrobianas e citotóxicas
estão aumentados por sofrer uma série de alterações morfo-funcionais (ROITT et al.,1999;
SELIGMANN, 2003).
Abaixo da crosta ou do epitélio, depois deste recobrir a ferida, nota-se o tecido de
granulação que substitui a inflamação e inicia o processo de cura. Quanto mais rápida for esta
modificação, de inflamação para tecido de granulação, mais rápido também se inicia a cura,
que dependendo da quantidade de tecido de granulação formado poderá ser por regeneração
ou reparação (cicatrização). Para diminuir a quantidade do tecido de granulação algumas
variáveis são importantes, tais como, tipo de agressor, extensão e profundidade da agressão,
tecidos envolvidos, alguns não podem ser controlados, principalmente se a agressão for, por
exemplo, um trauma acidental, assim, torna-se importante o uso de produtos adequados e
biocompatíveis para diminuir a intensidade da inflamação e estimular o início a cura.
Devemos salientar que esta migração também depende do tamanho da ferida, pois pode haver
demora no processo de cura devido à maior distância das margens, e observamos em nosso
trabalho uma proliferação e migração epitelial discreta, talvez pelo tamanho da ferida e/ou o
tempo de cura, considerando que não houve interferência externa quanto à agressão ou
infecção secundária.
Os fenômenos inflamatórios, bem como sua quantificação, são importantes para analisar
a intensidade do agressor e as conseqüências de sua ação no tecido, da mesma maneira, a
formação do tecido de granulação e sua caracterização em jovem ou maduro, representa um
parâmetro para analisar o processo de cura. Após um trauma ou doença, esses processos
ocorrem visando limitar os danos e restabelecer a integridade e a função dos tecidos afetados.
Inicialmente, a ferida é preenchida por coágulo, fibrinas e exsudato, formando uma crosta que
a isola do meio ambiente quase que imediatamente (COTRAN, 1989 ROCHA JÚNIOR,
2006; VIEIRA, 2006).
Em relação às feridas que envolvem o epitélio é bastante importante a análise deste
tecido com relação à proliferação e migração de suas células sobre o tecido de granulação
para recobrir e isolar a ferida do meio externo, assim, esses dois eventos são analisados para
avaliar o desenvolvimento da cura. Na fase proliferativa ou fibroblástica ocorre a reparação
do tecido conjuntivo e do epitélio, formando o tecido de granulação, que é composto por
fibroblastos e vasos sanguíneos neoformados. O fibroblasto surge por volta do segundo e
terceiro dia após o trauma (RESENDE; PEREIRA; CASTRO; 2005).
51
5 CONCLUSÃO
Conclui-se que na dosagem e via de administração estudadas o óleo essencial de
arnica não foi efetivo no favorecimento da cicatrização de feridas no dorso de ratos.
52
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