Aula de espectrometria_de_massas_2010_2

Departamento de Química

Disciplina: Espectroscopia

Prof.ª Dr.ª Simone Schneider Amaral

Canoas, outubro de 2010.

1.0 - Introdução

Conceito: técnica analítica para a determinação da composição elementar e/ou

da estrutura de uma amostra ou molécula.

Princípio:

Ionização dos compostos gerando moléculas ou fragmentos de moléculas

carregados, separação dos íons de acordo com a relação massa/carga (m/z) por

exposição a um campo eletromagnético externo e detecção dos mesmos.exposição a um campo eletromagnético externo e detecção dos mesmos.

Ionização

VaporizaçãoSeparação íons

(m/z)

Detecção

Espectro

1.0 - Introdução

Extrapolação do conceito de espectroscopia � NÃO envolve a absorção

emissão ou reflexão da radiação eletromagnética.

Fig. 1. Espectro de massas do etilbenzeno.

1.0 - Introdução

Análises qualitativas e quantitativas.

AplicaçõesAplicações::

� Identificação de compostos;

� Determinação da composição isotópica de elementos;

� Determinação estrutural;� Determinação estrutural;

� Quantificação de determinado composto em uma amostra;

� Estudo de mecanismos de reações;

� Estudo do comportamento de íons em fase gasosa;

� Estudo das propriedades químicas, físicas e biológicas de compostos;

1.0 - Introdução

AplicaçõesAplicações (continuação)(continuação)::

Análise de compostos cujo espectro de massas é totalmente desconhecido �

o íon molecular, a sequência de fragmentações e auxílio de outros tipos de

Análise de compostos cujo espectro de massas é conhecido � padrão ou

busca em bibliotecas de espectros.

o íon molecular, a sequência de fragmentações e auxílio de outros tipos de

espectrometria.

2.0 - Desenvolvimento

Categorias – espectrômetros de baixa resolução e espectrômetros de alta

resolução (precisão de 4 casas decimais!).

InstrumentaçãoInstrumentação

Fontes de Íons:

Ponto de partida da análise � ionização da amostra.Ponto de partida da análise � ionização da amostra.

Diversos métodos de ionização.

Fase gasosa Ionização por evaporação

Dessorção

Finalidade e utilidade de um método dependem da escolha do método de

ionização correto!


Fonte de Íons por Impacto de Elétrons (EI)

Técnica mais utilizada para a geração de íons � moléculas PM < 3.000 Da,

voláteis.

IONIZAÇÃOIONIZAÇÃO EMEM FASEFASE GASOSAGASOSA

Moléculas na fase gasosa são bombardeadas com elétrons de alta energia

(geralmente 70 eV) para produzir um cátion-radical (íon molecular).(geralmente 70 eV) para produzir um cátion-radical (íon molecular).

Potencial de ionização das moléculas orgânicas � 15 eV.

Acréscimo de aproximadamente 50 eV de energia ao íon molecular.

Quebra das ligações covalentes (3 – 10 eV)


Fonte de Íons por Impacto de Elétrons (Continuação)

Quebra das ligações covalentes é normalmente extensiva � fragmentação

importante das moléculas.

Fonte:

http://www.mhhe.com/physsci/chemistry/ca

rey/student/olc/ch13ms.html Acesso:

Fragmentações reprodutivas � importante para a comparação de espectros

com as bibliotecas disponíveis.

Fragmentações previsíveis � conceitos fundamentais de físico-química

orgânica.

Elucidação da estrutura do analito

17/03/2010.


Fonte de Íons por Impacto de Elétrons (Continuação)

Fig. 2. Espectro de massas por impacto de elétrons (EI) do álcool 3-

nitrobenzílico (PM=153). Fonte:

http://www.nd.edu/~massspec/gifs/NBA_ci.gif. Acesso: 17/03/2010.


Fonte de Íons por Ionização Química (CI)

Sensibilidade � picomolar.

Gás reagente (metano, isobutano, amônia, ...) introduzido na fonte e ionizado

� colisão com as moléculas do analito sob alta pressão.

Análise de moléculas voláteis de baixo peso molecular.

� colisão com as moléculas do analito sob alta pressão.

Ionização Secundária por transferência de íons

Geração de íons [M + 1]+, [M + 15]+, [M + 24]+, [M + 43]+, [M + 18]+ e [M – 1]+

� Dependendo do gás utilizado.


Fonte de Ionização Química (CI)

Energia de 5 eV para a ionização � grau de fragmentação pequeno.

Evitar grau elevado de fragmentação em que não se observa o íon molecular

� comum na ionização por impacto de elétrons.

Fig. 3. Ionização por ionização química (CI).


Fonte de Ionização Química (Continuação)

Fig. 4. Espectro de massas por ionização química (CI) do álcool 3-nitrobenzílico

(PM=153). Fonte: http://www.nd.edu/~massspec/gifs/NBA_ci.gif. Acesso:

17/03/2010.



Fig. 5. Espectro de massas por ionização química (CI) do 3,4-dimetóxi-

acetofenona (PM= 180).



Reações:

Reação 1

C10H12O3 + CH4+ � [C10H12O3 + H]+ + CH3

+ (m/z = 181; (M + 1)+ íon

quasimolecular)

Reação 2

CH3+ + CH4 � C2H5

+ + H2

C10H12O3 + C2H5+ � [C10H12O3 + C2H5]+ (m/z = 209 � 180 + 29)

Reação 3

CH4 + C2H5+ � C3H5

+ + 2 H2

C10H12O3 + C3H5+ � [C10H12O3 + C3H5]+ (m/z = 221 � 180 + 41)


Moléculas da amostra passam diretamente de uma fase condensada para a

fase vapor na forma de íons.

IONIZAÇÃOIONIZAÇÃO PORPOR DESSORÇÃODESSORÇÃO

Desvantagens:

Com frequência, a informação obtida é limitada.

Principais aplicações � determinação do peso molecular.

Com frequência, a informação obtida é limitada.

Espectros complicados de serem analisados devido aos abundantes íons da

matriz.

Ionização por Dessorção de Campo (FD)

Amostra é colocada em um metal emissor em cuja superfície existem agulhas

de carbono microscópicas.


Ionização por Dessorção de Campo (Continuação)

Gradientes de voltagem muito altos na ponta das agulhas removem um elétron

da amostra.

Fig. 6. Esquema da ionização pordessorção de campo. Fonte:http://en.wikipedia.org/wiki/Field_desorption. Acesso em 12/03/2010.

Técnica pouco utilizada atualmente.

Os íons gerados dessa maneira têm muito pouca energia em excesso e,

portanto, ocorre pouca fragmentação � íon molecular é usualmente o único

íon.

ption. Acesso em 12/03/2010.


Ionização por Dessorção de Campo (Continuação)

Fig. 7. Espectro de massas obtido por dessorção de campo (FD).

Bombardeio por Átomos Rápidos (FAB)

Átomos de xenônio ou argônio de alta energia (6 – 10 KeV) para bombardear

amostras dissolvidas em líquido de baixa pressão de vapor (glicerol).

A matriz protege a amostra de danos excessivos provocados pela radiação.


Formam-se íons positivos por adição de cátion [M + 1]+ ou [M + 23, Na]+ e íons

negativos por desprotonação [M - 1]+.

Principais aplicações � análise de moléculas pesadas pouco voláteis,

particularmente na determinação do peso molecular.

Sensibilidade � nanomolar.

Pode ser utilizado no modo de alta resolução.

Bombardeio por Átomos Rápidos (Continuação)


Fig. 8. Esquema de uma fonte de

ionização por bombardeio de

átomos rápidos (FAB). Fonte:

Desvantagens:

Muitos íons gerados pela matriz � sobreposição de sinais escondendo

fragmentos iônicos importantes da amostra.

ww.chem.umn.edu/services/masssp

ec/.../sourceAndAnalyzer.ppt.

Acesso: 12/03/2010.

Feixe pulsado de laser para ionizar as amostras.

Dessorção/Ionização com Laser Assistida por Matriz (MALDI)


Matrizes: ácido nicotínico e o ácido sinapínico.

Sensibilidade � Fentomol (10-15 mol).

Análise de moléculas de alto peso molecular � biomoléculas (mínimo 500Da).

Fig. 9. Esquema de uma fonte de

ionização por MALDI. Fonte:

www.chem.umn.edu/services/m

assspec/.../sourceAndAnalyzer.p

pt. Acesso: 12/03/2010.

Uma solução da amostra é misturada com grande excesso de matriz.

Dessorção/Ionização com Laser Assistida por Matriz (Continuação)


Solução resultante é evaporada na superfície de uma sonda metálica usada

para a inserção da amostra no aparelho.

Mistura sólida é exposta a um feixe de laser pulsado causando a sublimação eMistura sólida é exposta a um feixe de laser pulsado causando a sublimação e

ionização do analito.

Características do espectro � pequeno ruído de fundo e ausência de

fragmentação do íon molecular.

Presença de íons com cargas múltiplas (M2+ e M3

+) além de picos de dímeros e

trímeros.

Dessorção/Ionização com Laser Assistida por Matriz (Continuação)


Fig. 10. Espectro MALDI de uma mistura de ubiquitina, citocromo C e mioglobina

equina com matriz 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB). Fonte: http://www.kcl.ac.uk/ms-

facility/maldi.html. Acesso: 15/03/2010.

Ionização por Eletronebulização (Electrospray Ionization – ESI)


Sensibilidade � Fentomol (10-15 mol).

Análise de moléculas não voláteis e de alto peso molecular em solução �

biomoléculas (mínimo 100.000 Da).

IONIZAÇÃOIONIZAÇÃO PORPOR EVAPORAÇÃOEVAPORAÇÃO

biomoléculas (mínimo 100.000 Da).

A solução da amostra é introduzida no equipamento através de uma agulha

capilar de aço inoxidável.

Ionização ocorre à pressão e temperatura atmosféricas.

A ponta da agulha é mantida em potencial elevado com relação a um eletrodo

cilíndrico que circunda a mesma � ionização.

Ionização por Eletronebulização (Electrospray Ionization – ESI)


A nuvem resultante, com gotículas carregadas, passa por um capilar de

dessolvatação para a evaporação do solvente.

Cone de TaylorGás (N2) –

nebulizar e

Fig. 11. Esquema de uma fonte de ionização por ESI. Fonte:

http://www.colorado.edu/chemistry/chem5181/MS_ESI_Gilman_Mashburn.pdf.

Acesso: 15/03/2010.

nebulizar e

evaporar.

Ionização por Eletronebulização (Continuação)2.0 - Desenvolvimento

MecanismosMecanismos dede IonizaçãoIonização::

Evaporação de Íons: evaporação do solvente causa aumento de densidade de

carga � repulsão Coulômbica supera a tensão superficial do líquido.

Fig. 12. Esquema mecanismo de

evaporação (ES).

http://rsl.eng.usf.edu/Pages/ResearchElectr

osprayAmbient.html. Acesso: 26/03/2010.


Íons de cargas múltiplas � a determinação da massa verdadeira só pode ser

feita se a carga do íon for conhecida (m/z).

Formação de Adutos � moléculas polares que não possuem grupamentos

ácidos ou básicos podem tornar-se carregadas pela formação de adutos �

introdução de sais à solução.introdução de sais à solução.

Devido a presença inevitável de alguns íons como Na+ e Cl- em soluções

aquosas a formação de adutos são comuns mesmo sem a adição de sais.

Íons Negativos – Cl-

Íons Positivos – Na+, Li+, NH4+ entre outros


Altas concentrações de sal � interferência de fundo.

Fig. 14. Espectro obtido a partir da técnica de ionização por ESI.

Fonte: http://www.chem.ox.ac.uk/spectroscopy/mass-

spec/Lecture/oxmain_lectureESI.html Acesso: 16/03/2010.


Fig. 15. Espectro obtido a partir da técnica de ionização por ESI. Fonte:

http://www.chem.ox.ac.uk/spectroscopy/mass-spec/Lecture/oxmain_lectureESI.html.

Acesso: 16/03/2010.


Resumo das Fontes de Íons:

Comparação entre os métodos de ionização. Fonte: Silverstain.

AnalisadoresAnalisadores dede MassasMassas2.0 - Desenvolvimento

Separam a mistura de íons formados durante a etapa de ionização segundo a

relação m/z.

InstrumentosInstrumentos comcom SetoresSetores MagnéticosMagnéticos dede DuplaDupla FocalizaçãoFocalização::

Campo magnético para fazer com que o feixe de íons tenham uma trajetória

curva.curva.

Separação dos íons baseia-se na relação m/z � íons mais leves desviam-se

mais do que os mais pesados.

A resolução do espectro depende da entrada dos íons, com mesma energia

cinética, no campo magnético � aceleração prévia dos íons.


InstrumentosInstrumentos comcom SetoresSetores MagnéticosMagnéticos dede DuplaDupla FocalizaçãoFocalização (Cont(Cont..))::

Aceleração - aplicação de voltagem e direcionamento da trajetória pela

passagem por uma sequência de fendas (Ec = z . V = m.v2 / 2).

Ec depende da carga do íon (z) e da massa (m)!

Íon acelerado � Campo magnético (B) � Modificação da trajetória �

Movimento circular.

Raio do instrumento é fixo � B varia para colocar os íons sequencialmente no

foco de acordo com o momento dos mesmos (m.v).



Feixe de íons passa por um analisador eletrostático (ESA) � reduz a

Íons de mesma massa e energias diferentes chegam ao foco em pontos

diferentes.

Feixe de íons passa por um analisador eletrostático (ESA) � reduz a

distribuição de energias de um feixe forçando os íons de mesma carga

(independente da massa) a seguir a mesma trajetória.

Setor Elétrico � duas placas metálicas curvas entre as quais um potencial é

aplicado.



Íons com energias menores que a média atingem o lado inferior da fenda do

ESA e são removidos.

Íons com energias maiores que a média atingem o lado superior da fenda do

ESA e descarregam-se.

Fig. 16. Esquema de um analisador de massas de dupla focalização. Fonte: Acesso:

16/03/2010.


InstrumentosInstrumentos comcom QuadrupoloQuadrupolo::

Descrição simplificada: voltagem é aplicada nos tubos.

Quatro tubos cilíndricos paralelos montados segundo os vértices de um

quadrado que servem como eletrodos.

Os íons entram no espaço entre os cilindros em uma das extremidades e sãoOs íons entram no espaço entre os cilindros em uma das extremidades e são

acelerados.

Para cada voltagem aplicada, somente íons com certo valor de m/z possuem

uma trajetória estável e são capazes de atravessar o quadrupolo e chegar até o

detector.


InstrumentosInstrumentos comcom QuadrupoloQuadrupolo (Cont(Cont..))::

A seleção de íons pode ser feita em velocidade muito alta e toda a faixa de

massas é analisada em tempo inferior a 1s!

Os demais íons têm oscilações erráticas e colidem com um dos tubos ou saem

do quadrupolo.

Fig. 17. Esquema de um analisador de massas com Quadrupolo. Fonte:

http://qopn.iqsc.usp.br/files/2008/05/cursoem-2.pdf. Acesso: 17/03/2010.


InstrumentosInstrumentos comcom CapturaCaptura dede ElétronsElétrons ((IonIon TrapTrap))::

Existem três modos básicos de operação � tipo mais simples utilizado como

detector de cromatógrafos a gás.

Dispositivo no qual ânions ou cátions gasosos podem ser formados e

confinados por períodos longos por campos elétricos e/ou magnéticos.

Eletrodo central com formato de anel e um par de eletrodos circulares

convexos � aplicação de tensão de radiofrequência variável no anel.

Íons com razão m/z apropriadas circulam em uma órbita estável dentro da

cavidade definida pelo anel.



Quando a radiofrequência é aumentada, órbitas de íons mais pesados tornam-

se estáveis, enquanto as de íons mais leves tornam-se desestabilizadas.

A tensão de radiofrequência é então varrida e os íons aprisionados, à medida

que ficam desestabilizados, deixam a cavidade do eletrodo em anel porque ficam desestabilizados, deixam a cavidade do eletrodo em anel por

aberturas no eletrodo convexo inferior.

Os íons emitidos passam então para um transdutor (detector).

Equipamentos mais sensíveis que os quadrupolos e podem ser acoplados com

outros equipamentos sem a necessidade de equipamentos especiais.



Fig. 18. Esquema de um analisador de massas por aprisionamento de íons. Fonte:

http://qopn.iqsc.usp.br/files/2008/05/cursoem-2.pdf. Acesso: 17/03/2010.


AnalisadoresAnalisadores dede MassaMassa atravésatravés dede MedidasMedidas dede TempoTempo dede VôoVôo ((TimeTime--ofof--flightflight

–– TOF)TOF)::

Íons positivos são produzidos periodicamente por bombardeio da amostra com

pulsos breves de elétrons, íons secundários ou fótons gerados com laser

(MALDI).

Íons acelerados em um tubo por um potencial (V).

Separação dos íons por massa ocorre durante o trânsito dos íons ao detector

localizado no fim do tubo.

Todos apresentam a mesma energia cinética quando entram no tubo (Ec =

mv2/2 = zV) � velocidades variam inversamente com a massa.


AnalisadoresAnalisadores dede MassaMassa atravésatravés dede MedidasMedidas dede TempoTempo dede VôoVôo (Cont(Cont..))::

Partículas mais leves atingem o detector mais rapidamente que as partículas

mais pesadas.

t = (L2m/2zeV)1/2, onde é o tempo de vôo e L é o comprimento do tubo.

Tempos de vôo típicos – 1 a 30µs.

Desvantagens: baixa resolução e baixa sensibilidade.

Menos utilizados que os instrumentos de setor magnético e quadripolares.

Vantagens: intervalo de massas ilimitado, simplicidade e robustez.


AnalisadoresAnalisadores dede MassaMassa atravésatravés dede MedidasMedidas dede TempoTempo dede VôoVôo (Cont(Cont..))::

Fig. 19. Esquema de um analisador de massas através de Medidas de Tempo de Vôo.

Fonte: http://www.proteomicsnijmegen.nl/Maldi_pages/Maldi-about.htm Acesso:

17/03/2010.


Técnica de ionização que fornece o maior número informações estruturais

através da fragmentação das moléculas.

InterpretaçãoInterpretação dosdos EspectrosEspectros dede MassaMassa porpor ImpactoImpacto dede ElétronsElétrons

Remoção de 1 e- � formação do íon molecular.

Principais íons formados:

Ex.: MeOH

MeOH + e- � MeOH + (m/z = 32) + 2e-

Fragmentação dos íons moleculares:

Ex.: MeOH +� CH2OH+ (m/z = 31) + H+

MeOH +� CH3+ (m/z = 15) + OH

CH2OH+ � CHO+ (m/z = 29) + H2


Nem sempre é possível observar o pico do íon molecular.

Precisa permanecer intacto até atingir o detector.

Pico Base �� pico mais intenso do espectro e tem, arbitrariamente a

Importância � indica o peso molecular do analito.

Pico Base �� pico mais intenso do espectro e tem, arbitrariamente a

intensidade 100%.

A intensidade dos demais picos serão proporcionais à intensidade do pico

base.

Pode ser o íon molecular ou qualquer fragmento relativamente estável.


ResumoResumo -- AnalisadoresAnalisadores dede MassasMassas

Comparação entre os analisadores de Massas. Fonte: Silverstain.


Fig. 20. Espectro de massas do metanol obtido por EI. Fonte:

http://www.chem.arizona.edu/massspec/intro_html/intro.html. Acesso: 17/03/2010.


Determinação da Fórmula Molecular:

Íon de Massa Molecular Unitária: soma das massas unitárias dos isótopos mais

abundantes.

Ex.: C7H7NO m/z = 121

(7 x 12) [12Cl] + (7 x 1) [1H] + (1 x 14) [14N] + (1 x 16) [16O] = 121

Isótopos menos abundantes � picos de isótopos em M + 1, M + 2, ...Isótopos menos abundantes � picos de isótopos em M + 1, M + 2, ...

Fig. 21. Abundância relativa dos

Isótopos de Elementos Comuns.


Fig. 22. Espectro de massas obtido por EI (Isótopos). Fonte:

http://www.chem.arizona.edu/massspec/intro_html/intro.html. Acesso: 17/03/2010.


Se apenas C, H, N, O, F, P e I estão presentes na molécula, as intensidades

aproximadas esperadas para M + 1 e M + 2, em relação ao íon molecular para a

molécula CnHmNxOy são:

% (M + 1) ≈ (1,1 . n) + (0,38 . x)

% (M + 2) ≈ (1,1 . n)2 / 200 + (0,2 . y)

Cálculo do Número de Insaturações:

Ao conhecer a fórmula molecular de um composto é possível calcular o

número de insaturações do composto pela fórmula abaixo:

Para CnHmXxNyOz:

I = (n) – (m / 2) – (x / 2) + (y + 2) + 1


Ex.: C7H7NO

I = 7 – (7 / 2) + (1 / 2) + 1

I = 7 – 3,5 + 0,5 + 1

I = 5

As insaturações podem ser ligações π ou anéis.

Fig. 23. Benzamida. Fonte:

http://commons.wikimedia.org/wiki/F

ile:Benzamide.png. Acesso:

17/03/2010.


Alguns conceitos fundamentais de físico-química orgânica permite estabelecer

regras gerais de previsão de picos mais intensos:

Fragmentações:

1. O íon do pico molecular tem maior altura relativa nos compostos de cadeia

linear. A intensidade diminui à medida que o grau de ramificação aumenta;

2. A intensidade relativa do pico do íon molecular usualmente diminui com o

aumento do peso molecular em uma série homóloga. Os ésteres graxos

parecem ser uma exceção;

3. As quebras são favorecidas nas ligações dos átomos de carbono

ramificados.


Quanto mais ramificado o átomo de carbono, mais provável é a quebra. Isso é

uma consequência da estabilidade relativa dos carbocátions:

Fragmentações (Continuação):

CH3+ < RCH2

+ < R2CH+ < R3C+

4. Ligações duplas, estruturas cíclicas e, especialmente, anéis aromáticos

estabilizam o íon molecular, aumentando a probabilidade de sua formação;

5. As ligações duplas favorecem a quebra alílica e dão origem a carbocátions

alila estabilizados por ressonância. Esta regra não funciona para alcenos

simples por causa da migração rápida da ligação dupla, mas funciona para

cicloalcenos;


Os anéis insaturados podem sofrer uma reação do tipo retro-Diels-Alder:


6. Os anéis saturados tendem a perder as cadeias laterais na ligação α. Esse é

um caso especial da regra das ramificações (regra 3). A carga positiva tende

a ficar no fragmento cíclico;

Fig. 24. Retro-Diels-Alder. Fonte:

Silverstain.

7. Nos compostos aromáticos alquilsubstituídos, a quebra é mais provável na

ligação β em relação ao anel para dar íon benzila (estabilização por

ressonância ou pelo íon tropílio):



Fig. 25. Fragmentação do íon benzila e estabilização pelo íon tropílio. Fonte:

Silverstain.


8. As ligações C-C próximas de um heteroátomo frequentemente se

quebram, deixando a carga no fragmento que contém o heteroátomo,

cujos elétrons não-ligantes estabilizam o fragmento por ressonância;


Fig. 26. Estabilização pelos

9. As quebras são frequentemente associadas à eliminação de moléculas

pequenas, neutras e estáveis, como o monóxido de carbono, alcenos,

água, amônia, sulfeto de hidrogênio, cianeto de hidrogênio, ...

Fig. 26. Estabilização pelos

heteroátomos. Fonte: Silverstain.

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