Biotecnologia

Pro fa . Dra . DANIELA DEFAVARI DO NASCIMENTO

Biotecnologia

Plano de Ensino

Bibliografia

Avaliação

Conteúdo Programático

Datas Importantes

� Primeira Prova Bimestral: 29/09/2011

� Segunda Prova Bimestral: 24/11/2011

Entrega de relatórios de aulas práticas: sempre na � Entrega de relatórios de aulas práticas: sempre na semana seguinte a cada aula prática. (A não entrega acarretará em ausência e zero).

� Alunos sem equipamentos de segurança (jalecos, etc) serão impedidos de entrar nas aulas práticas, ficando portanto com ausência e zero.

Biotecnologia

� Aplicação tecnológica que utiliza sistemas biológicos e organismos vivos ou seus derivados para a criação ou modificação de diversos produtos ou processos em uso

� Não é considerada uma ciência como tal, mas sim qualquer técnica ou tecnologia que emprega organismos vivos ou seus técnica ou tecnologia que emprega organismos vivos ou seus componentes com o objetivo de melhorar espécies de plantas ou animais, ou desenvolver microorganismos, para um fim determinado e, geralmente, utilizada em benefício do ser humano

� Enfoque multidisciplinar, já que envolve várias ciências e disciplinas: biologia, bioquímica, genética, virologia, agronomia, engenharia, química, medicina, veterinária e outras

Biotecnologia

� É a aplicação de um conjunto de tecnologias: desde técnicas “tradicionais”, já amplamente estabelecidas, conhecidas e utilizadas desde a antiguidade (por exemplo, a fermentação de alimentos e o controle biológico), até as técnicas “modernas”, baseadas no exemplo, a fermentação de alimentos e o controle biológico), até as técnicas “modernas”, baseadas no emprego de novas técnicas de DNA recombinante (engenharia genética), nos anticorpos monoclonais e nos novos métodos de cultivo de células e tecidos

� A biotecnologia moderna tem gerado uma grande polêmica, sobretudo no que se refere à clonagem e ao uso de organismos geneticamente modificados

Evolução da Biotecnologia

� Empregada pelo ser humano desde o início da história da humanidade, quando se tornou sedentário (há cerca de 10.000 anos)

� Primeiro tipo de domesticação que o homem aprendeu a realizar não foi a animal, mas a levedura (Saccharomyces spp.) no preparo de pão, queijo, iogurte e bebidas alcoólicas (cerveja e vinho)de pão, queijo, iogurte e bebidas alcoólicas (cerveja e vinho)

� Finalidade era tornar alimentos como o leite e o suco de uvas mais apetitosos

� Além disso, o ser humano também começou com o melhoramento de cultivos e com a domesticação de animais, mediante cruzamentos, fator limitante na melhora de organismos, já que os métodos convencionais, incluindo alguns descritos desde o Antigo Testamento, eram demorados e empíricos, além de serem efetuados por meio de teste e erro

Setor Produto/Atividade

Alimentar Laticínios, peixes e produtos de carne; novos gêneros

alimentícios; amido; xaropes; aditivos alimentares; corantes;

aromatizantes; estabilizadores; leveduras; aminoácidos;

Setores industriais beneficiadospela Biotecnologia

vitaminas.

Agrícola Insumos; pesticidas microbianos incluindo virais; inoculantes

de fixação de N; inoculantes de micorrizas; propagação

vegetativa; produção de embriões; vacinas.

Químico Ácidos orgânicos; álcoois; cetonas; enzimas; polímeros;

perfumarias; extração de metais; bioacumulação.

Setor Produto/Atividade

Fermentação Cervejas, vinhos, destilados; queijo, proteínas de

unicelulares; produtos químicos, álcoois combustíveis;

Setores industriais beneficiadospela Biotecnologia(continuação)

unicelulares; produtos químicos, álcoois combustíveis;

enzimas; antibióticos; drogas; vitaminas; vacinas.

Energético Biomassa; etanol; metano.

Serviços Aproveitamento de resíduos; purificação de água;

tratamento de efluentes; recuperação de petróleo.

(Mantell et al., 1994)

Fermentação

DNA

MEIO AMBIENTE

AGRICULTURA MEDICINA

Monitoramentoambiental

Biorremediação

Prevençãode poluição

Diagnósticos Vacinas

Terapias

Rendimentode safras

Saúde animal

Qualidade dosalimentos

APLICAÇÕES

Tecnologia debioprocessamentoTecnologia

de antisensoEngenharia

Engenharia

Engenharia de tecidos

Tecnologia debiosensores

INSTRUMENTOS BIOTECNOLÓGICOSEngenharia de proteínas

Tecnologia de anticorposmonoclonais

Tecnologia dechip de DNA

Engenhariagenética

Tecnologia de culturade células e tecidos

CONHECIMENTO CIENTÍFICO

BioquímicaBiologiacelular

Engenhariaquímica

Ciências dacomputação

Ciências dosmateriais

GenéticaImunologiaFisiologia

Biologiamolecular

Microbiologia

Engenhariabioquímica

Kreuzer & Massey, 2002

Marcadores Moleculares

� RFLP (digestão do DNA com enzimas de restrição, corrida em gel e hibridização)

� RAPD (amplificação do DNA)

� AFLP (digestão e amplificação)

� Microssatélites ou SSR

� STR

� SNP

Enzimas de restrição

� Funcionam como "tesouras" capazes de clivar o DNA com precisão em locais bem definidos.

� Hoje em dia conhecem-se centenas de enzimas de restrição isoladas de inúmeras bactérias.de restrição isoladas de inúmeras bactérias.

� As enzimas de restrição reconhecem e atuam sobre sequências específicas de DNA.

� http://www.e-escola.pt/site/topico.asp?topico=279&canal=5

Bioinformática

� Manipulação, análise e armazenamento de dados biotecnológicos

Expressão em bactériaspara produção em massade proteínas(ex.: taumatina) CLONAGEM DE

GENES DEPLANTAS

CLONAGEM DEGENES DEBACTÉRIAS

Mutagênese

(Mantell et al., 1994)

MutagêneseSítio-específica

Substituição na mesma espécie (ex.: proteínas de reserva de sementes)

Transferência para uma diferente espécie (ex.: tolerância a sais e

resistência a herbicidas)

Planta

Cultura de tecidos

Cultura de protoplastos Cultura de calos Cultura de meristemas1. Fusão de protoplastos(híbridos somáticos)

2. Transformação

1. Micropropagação2. Variação somaclonal3. Embriogênese somática(sementes artificiais)

4. Metabólitos secundários

1. Micropropagação2. Eliminação de vírus3. Manutenção de germoplasma

Meio de cultura

� Composição: � água,

� nutrientes (N, P, K, S, Ca, Mg, C, Fe, Mo, Cu, Cl, Zn, Mn, Co), Mn, Co),

� carboidratos,

� aminoácidos,

� vitaminas,

� fitorreguladores.

Micropropagação

Agricultura

• Transgênicos

Processo de modificação do genoma do organismo através da incorporação de um fragmento de DNA de uma espécie diferente, utilizando a Tecnologia do DNA Recombinante. diferente, utilizando a Tecnologia do DNA Recombinante.

� Transgênico

Indivíduo que possui um gene exógeno adquirido por meio de um dos vários Métodos de Transformação.

› introdução de genes exógenos que possuem uma função conhecida

› O gene que contém a informação para síntese de uma proteína

Tecnologia do DNA Recombinante

Exemplos: insulina humana, hormônios de crescimento humano, plantas resistentes a vírus, plantas tolerantes a insetos, plantas resistentes a herbicidas e produção de bactérias utilizadas para biodegradação de vazamentos de óleos ou lixos tóxicos.

› O gene que contém a informação para síntese de uma proteína de interesse pode ser transferido para outro organismo que produzirá grandes quantidades dessa determinada proteína

Como Produzir moléculas de DNA Recombinante ?

DNA de espécies de interesse são cortados comEnzimas de Restrição

C

A

A

CG G T

T

C

GC GC C

A

A

CG G T

T

C

GC GC

Técnica de PCR

Finalidade de produzir rapidamente

grande quantidade de cópias de uma grande quantidade de cópias de uma

determinada sequência de DNA,com o

auxílio de primers específicos.

Reação de PCR

� Clonagem Molecular

Consiste no isolamento e

propagação de moléculas de

DNA idênticas.

Próximo Passo

Vetor

Fragmento de DNA alvo

Clivagem do DNA

com enzima de

restrição para

produzir

extremidades

coesivas

DNA idênticas.

O fragmento do DNA de

interesse (inserto) é ligado a um

vetor para formar o DNA

recombinante.

Ligação das

extremidades coesivas

(DNA Ligase)

DNA

Recombinante

Inserto

�TransformaçãoO DNA recombinante é introduzido numa

célula hospedeira compatível.

DNA Recombinante

Um único transformante, em condições

ideais, sofre muitos ciclos de divisão

celular, produzindo uma colônia que

contém milhares de cópias do DNA

recombinante.

� Vetores de Clonagem

�Plasmídios: DNA circular extracromossômico

encontrados em bactérias e leveduras

Transformação Genética

Uma vez clonado e multiplicado, o gene pode ser manipulado

e utilizado em diversas análises, incluindo a introdução desse

gene em um organismo diferente do qual foi isolado.

� Pré- Requisitos

1. Cultura de Tecidos (propagação e regeneração)

2. Método eficiente de introdução do DNA

3. Agentes seletivos para os tecidos transgênicos

Cultura de tecidos

� É necessário

portanto que a célula

� Introdução de genes em células isoladas

que recebeu o gene

de interesse seja

capaz de originar um

organismo completo

(regeneração)

�Química

� Eletroporação

Métodos de Transformação

�Microinjeção

�Biolística

�Agrobacterium

Eletroporação

Protoplastos

Microinjeção

Biolística

Câmara de Vácuo

� Biolística

Cana-de-açúcar transgênica

Agrobacterium

�Na Natureza:

Agrobacterium tumefaciens� Galha da coroa

Agrobacterium rhizogenes

� Síndrome das raízes em cabeleira

Plasmídio Ti� Agrobacterium

� Elementos essenciais ao processo de transferência

► Região vir

► Extremidades do T-DNA (25pb)

Transformação de Eucalipto

BA C

D FE

BA C

D FE

BA C

D FE

González et al (2002)

Como ocorre a transferência ?

� Agrobacterium

� Gene uidA: expresão da ββββ-glucuronidase (GUS)

Como Selecionar os Transformantes ?

� Genes Marcadores� Fenótipos facilmente detectáveis

� Indicação que o gene de interesse está se expressando

Gene uidA: expresão da -glucuronidase (GUS)

� Gene bar: gene de resistência ao herbicida glifosato

� Gene nptII: de resistência ao antibiótico canamicina

� Gene gfp: expresão da “green fluorescent protein”

Transformação Genética

GUS GFP

Folhas de N. benthamiana

• Clonagem

Pecuária

Animais transgênicos

Andi

Ambiente

Biorremediação de metais pesados

Derramamento de petróleo

Medicina

• Terapia gênica

• Células tronco

Medicina

• Vacinas de DNA

Medicina

• Vacinas de DNA

•Vacinas comestíveis

• Produção de insulina, hormônios e outras substâncias por microrganismos ou plantas

Medicina

• Diagnóstico precoce de doenças•Práticas forense•Testes de paternidade