Atividade antibiofilme do hipoclorito de sódio contra biofilmes

simples formados por Salmonella Typhimurium

T.A. Penno1,

V. Schuh1, G.A. Hillesheim

1, A.G. Forchesatto

1, S.M. Silveira

2, A.F. Millezi

3.

1- Discente do curso Engenharia de Alimentos, Instituto Federal Catarinense – campus Concórdia – CEP:

89700-000 – Concórdia – SC – Brasil. Telefone: (49) 9122-9206 – e-mail: (pennotaci@gmail.com).

2- Docente do curso Engenharia de Alimentos, Instituto Federal Catarinense – campus Concórdia – CEP: 89700-

000 – Concórdia – SC – Brasil. Telefone: (49) 8840-7007 – e-mail: (sheila.silveira@ifc-concordia.edu.br ).

3- Orientadora, Docente do curso de Agronomia, Instituto Federal Catarinense – campus Concórdia – CEP:

89700-000 – Concórdia – SC – Brasil. Telefone: (49) 9803-9600 – e-mail: (alessandra.millezi@ifc-

concordia.edu.br ).

RESUMO – Biofilme é uma matriz celular, biologicamente ativa, que se forma em superfícies.

Salmonella Typhimurium é uma bactéria em forma de bacilos, Gram-negativos, anaeróbia facultativa e

móvel. O hipoclorito de sódio é atualmente o sanitizante mais utilizado, em função da sua rápida ação,

fácil aplicação e completa dissociação em água. Foram realizadas as análises de MTT (Atividade

Metabólica), CV (Quantificação de Biomassa) e UFC (Quantificação de Células Viáveis). Todas as

análises foram realizadas em triplicata, com uma concentração de hipoclorito de sódio a 2%. Os

resultados obtidos pelas análises, após serem avaliados por ANOVA pelo método de Bonferroni:

Compare Select Pairs of Columns, foram satisfatórios, na concentração utilizada de hipoclorito de

sódio, pois apresentaram resultados significativos (P<0,05), o que indica uma boa ação do hipoclorito

de sódio como sanificante. Contudo, pode-se concluir que o hipoclorito de sódio, apresentou uma boa

eficiência, agindo contra biofilmes formados por S. Typhimurium.

ABSTRACT - Biofilm is a cellular matrix, biologically active, that is formed on surfaces. Salmonella

Typhimurium bacteria is in the form of bacilli, Gram-negative, facultative anaerobic and mobile.

Sodium hypochlorite is currently the most widely used sanitizer, due to its fast action, easy to use and

complete dissociation in water. the analysis MTT (Metabolic Activity), CV (Quantification of

Biomass) and CFU (Quantification of Viable Cells). All analyzes were performed in triplicate, with a

sodium hypochlorite concentration of 2%. The results obtained by the analysis, after being evaluated

by ANOVA Bonferroni Compare Select Pairs of Columns were satisfactory, the concentration used

sodium hypochlorite, as had results below the stipulated limit (P <0.05), which It indicates a good

action of sodium hypochlorite as a sanitizer. However, it can be concluded that sodium hypochlorite

had good efficiency, acting against biofilms formed by S. Typhimurium.

PALAVRAS – CHAVE: Biofilme, Salmonella Typhimurium, hipoclorito de sódio.

KEYWORDS: Biofilm, Salmonella Typhimurium, sodium hypochlorite.

1- INTRODUÇÃO

As bactérias, em sua maioria, quando se encontram em seu habitat natural, vivem em grupos

de diferentes graus de complexidade, o que se associa com a variedade de superfícies bióticas ou

abióticas, onde podem assim formar um biofilme (Caixeta, 2006). Biofilme pode ser definido como

complexas comunidades de microrganismos, aderidos a uma superfície, juntamente com uma matriz

de substâncias poliméricas extracelular de origem microbiana (Xavier, 2002). Biofilme também pode

ser definido como uma matriz celular, biologicamente ativa, e substâncias extracelulares em

associação com uma superfície sólida (Kumar, 1998). Na sua formação ocorre primeiramente a adesão

das células bacterianas, através de forças físicas e atrações eletrostáticas, à superfície (Arcuri, 2000).

O cloro, na forma de hipoclorito de sódio, consiste no sanitizante mais utilizado para garantir a

qualidade microbiológica da água e dos alimentos (Both, 2009). Os compostos, que tem o cloro como

princípio ativo, são germicidas de amplo espectro de ação, pois reagem com as proteínas da membrana

das células microbianas, promovendo assim uma interferência no transporte de nutrientes e fazendo

com que se percam componentes celulares (Antoniolli, 2005). O hipoclorito de sódio é atualmente o

sanitizante mais utilizado, em função da sua rápida ação, fácil aplicação e completa dissociação em

água (Antoniolli, 2005), além de ser de baixo custo, comparado com outros sanitizantes, de fácil

acesso e amplamente disponível no comércio (Both, 2009).

Salmonella Typhimurium é uma bactéria pertencente à família Enterobacteriaceae e se

apresenta na forma de bacilos Gram-negativos não produtores de esporos, é anaeróbia facultativa, é

móvel devido aos seus flagelos peritríqueos, produz ácido a partir da glicose além de ser capaz de

utilizar citrato como única fonte de carbono. O pH ótimo para o seu crescimento é em torno de sete,

sendo a temperatura ótima na faixa entre 35ºC a 37ºC, porém podendo haver crescimento na faixa

entre 5ºC e 47ºC. Essa bactéria não é capaz de suportar concentrações de NaCl acima de 9% (Franco,

1996).

Este trabalho foi realizado considerando os problemas que são encontrados nas indústrias, com

a formação de biofilmes, nas superfícies dos equipamentos e superfícies sem contato com o alimento.

Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo, avaliar a eficiência do hipoclorito de sódio

contra a formação biofilmes simples de Salmonella Typhimurium, em superfícies.

2- MATERIAIS E MÉTODOS

Inoculou-se uma alça de bactéria em TSB, e incubou-se a 36°C por 24 horas, após o

crescimento da bactéria, fez-se inóculo padronizado. A partir desse inóculo, colocou-se 100 µL em

três poços, da placa de 96 poços, nesses mesmos três poços colocaram-se 100 µL de hipoclorito de

sódio a 2%, tendo assim o tratamento. Para obter o controle positivo, sem sanitizante, fez-se a

inoculação de três poços somente com o inóculo padronizado. Após incubou-se novamente, em

Shaker, com 80 rpm a 36°C por 24 horas. O mesmo procedimento foi realizado para as três análises:

MTT (Atividade Metabólica), CV (Quantificação de Biomassa) e UFC (Quantificação de Células

Viáveis).

2.1- Atividade Metabólica (MTT)

Após a incubação no Shaker, lavou-se a placa com água destilada estéril, secou-se a placa

perto da chama, e adicionou-se a solução de MTT em todos os poços que haviam sido inoculados, e

mais três poços extras, para serem obtidos os resultados sem interferência da solução de MTT na

leitura. As placas foram incubadas por 2 horas e 30 minutos em over night a 37°C. Ao término desse

período fez-se a leitura da placa em Elisa, a 630 nm.

2.2- Quantificação de Biomassa (CV)

Após a incubação no Shaker, lavou-se a placa com água destilada estéril, a placa foi seca

próximo à chama, adicionou-se metanol em todos os poços que haviam sido inoculados, deixou-se agir

por 15 minutos, adicionou-se cristal violeta deixando agir por 5 minutos, passado esse tempo, lavou-se

a placa em água corrente, bom baixa vazão, secou-se a placa novamente e foi adicionado ácido acético

33% nos poços, seguindo assim para a leitura da placa em espectrofotômetro Elisa, a 630 nm.

2.3- Quantificação de Células Viáveis (CFU)

Após a incubação no Shaker, a placa foi lavada com água destilada estéril, secou-se a placa

próximo à chama, adicionou-se água destilada estéril, seguindo assim para o banho-maria de

ultrassonografia, permanecendo por seis minutos. Após transferiu-se 100 µl da água destilada contida

no poço para um microtubo contendo 900 µL de água peptonada esterilizada. Foram realizadas as

diluições até 10-6

. Inoculou-se em triplicata, pelo método de microgota. As placas foram incubadas a

36°C por 24 horas, fez-se esse procedimento para todos os poços da placa. Após o tempo de incubação

realizou-se a contagem das colônias.

3- RESULTADOS E DISCUSSÃO

A partir, dos valores gerados pela leitura em Elisa, nas análises de MTT e CV, e a partir, dos

números de colônias contadas na análise de CFU, foram realizados os cálculos de média e desvio

padrão, após aplicou-se o teste de ANOVA pelo método de Bonferroni: Compare Select Pairs of

Columns, tendo 99% como nível de significância, gerando assim os seguintes gráficos.

Figura 1- Resultado da análise de UFC, utilizando hipoclorito de sódio a 2%, como antibiofilme.

A Figura 1 apresenta os resultados da análise de UFC, a qual determina a quantidade de

células viáveis do biofilme. Como se pode perceber no controle, que é onde não teve aplicação do

tratamento com hipoclorito de sódio, apresentou valor próximo de 8,0 CFU.log10.cm2. Entretanto

quando foi aplicado o tratamento com hipoclorito de sódio, o valor foi próximo a 1,5 CFU.log10.cm2.

Comparando os resultados com e sem tratamento, pode-se perceber que houve uma redução decimal

significativa, tanto que os resultados apresentaram significância (P<0,05), entre eles.

Figura 2 - Resultado da análise de MTT, utilizando hipoclorito de sódio a 2%, como antibiofilme.

A Figura 2 apresenta os resultados da análise de MTT, a qual determina a atividade metabólica

do microrganismo no biofilme. O controle apresentou atividade metabólica elevada com translucidez,

próxima a 0,16 em OD de 630 nm, enquanto nos poços, nos quais se aplicou o sanitizante, apresentou

translucidez, em torno, de 0,02, na mesma faixa de leitura. Comparando os resultados com e sem

tratamento, pode-se perceber que houve uma redução significativa da atividade metabólica, os

resultados apresentaram significância (P<0,05), entre eles.

Figura 3 - Resultado da análise de CV, utilizando hipoclorito de sódio a 2%, como antibiofilme.

A Figura 3 apresenta os resultados da análise de CV, a qual determina a quantificação da

biomassa no biofilme. Nesta análise, também houve redução significativa (P<0,05), entre o controle e

o tratamento realizado com o sanitizante. O controle apresentou uma translucidez, próxima a 0,16, em

OD 630 nm, enquanto nos poços em que houve a aplicação do hipoclorito de sódio apresentou uma

translucidez próxima a 0,06, em OD de 630nm.

4- CONCLUSÃO

As três análises realizadas, para avaliar a eficiência do hipoclorito de sódio, na eliminação de

biofilmes simples formados por S. Typhimurium apresentaram bons resultados, mostrando assim que o

hipoclorito de sódio é capaz de eliminar o biofilme, deixando em níveis aceitáveis, concluindo-se que

houve uma boa sanitização da superfície.

5- AGRADECIMENTOS

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo

financiamento do projeto, e também ao Instituto Federal Catarinense- Campus Concórdia por ceder às

instalações do laboratório de microbiologia de alimentos, para a realização das análises.

6- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Both, J. M. C.; Longary, S. M.; Avancini, C. A. M. (2009). O desinfetante hipoclorito de sódio como

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0ahUKEwj8hvbqtLrNAhXKfpAKHeAZArUQFggeMAA&url=http%3A%2F%2Fses.sp.bvs.br%2Flil

dbi%2Fdocsonline%2Fget.php%3Fid%3D1352&usg=AFQjCNG-

8iC49uwqqbE2MWWiTSovxwTNzg&sig2=lncHAsDQxiFapUDNrxqkng

Caixeta, D. S. (2006). Formação de biofilme por diferentes linhagens de Pseudomonas sp.na

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mestrado). Universidade Federal de Lavras, Lavras – MG.

Franco, Bernadette, D.G de Melo; Landgraf, Mariza. Microbiologia de alimentos. São Paulo: Atheneu,

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Kumar, C. G.; Anand, S. K. (1998). Significance of microbial biofilms in food indrustry: a review.

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Xavier, J. B.; Picioreanu, C.; Almeida, J. S.; Vanloosdrecht, M. C. M. (2002). Monitorização e

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