A L-asparaginase é uma enzima constitutiva na maioria dos microrganismos citados, com exceçãono Proteus vulgaris (Tosa et al., 1972) e Saccharomyces cerevisiae (Dunlop et al., 1978). Algumas destas enzimasapresentam atividade antineoplásica, embora poucas possam ser utilizadas como quimioterápicos, fato quecontinua estimulando a pesquisa de novos tipos desta enzima para o enriquecimento desse recursoterapêutico.Algumas bactérias, como a Escherichia coli, apresentam duas proteínas independentes com atividadesde asparaginase. Uma delas está localizada no citoplasma, a asparaginase I, e a outra no espaçoperiplasmático, a asparaginase II, e somente a do tipo II apresenta atividade antineoplásica (Campbell et al.,1967.Na célula animal normal, a asparagina não é um aminoácido essencial para a manutenção da viabilidade celular, assim, a célula supre a falta deste aminoácido através da ação da asparagina sintetase. A asparagina sintética é uma enzima intracelular, indutível e responsável pela síntese de novo da asparagina. Em níveis basais de asparagina, a síntese da asparagina sintetase não é induzida (Wriston & Yellin, 1973) (Keating et al., 1993).As células neoplásicas não são capazes de induzir asíntese da asparagina síntese , portanto, são dependentesdo nível extracelular de asparagina para realizar sua síntese protéica. Como a asparagina é retirada do meio plasmático por ação da asparaginase, as células neoplásicas, incapazes de realizar a síntese de novode asparagina, entram em colapso metabólico e morrem.A L-asparaginase mostrou-se muito útil no tratamento da leucemia linfocítica aguda, leucemia mielóide aguda e linfomas.A capacidade de reduzir substancialmente o nível plasmático de asparagina e de mantê-lo baixo por período de tempo prolongado é a característica principal, responsável pela atividade antineoplásica da asparaginase, e foi ainda demonstrado que os níveis de aminoácidos têm que cair a níveis críticos de 0,005 mM, externamente, e no pool interno de 0,05 mM, para interromper a síntese de proteínas e, conseqüentemente, o crescimento celular.Em 1968 foi observado que nas células neoplásicas asparaginase-sensíveis e asparaginase-resistentes o nível de asparagina intracelular é da ordem de 0,02 mM. (Broome, 1968). Nos tratamentos com aasparaginase a taxa de regressão de tumores é bastante elevada e a redução da indução de leucemias atinge valores de 75% a 95%. Existem alguns fatores limitantes para o uso da asparaginase comoquimioterápico. Um dos fatores a ser considerado é a necessidade de doses diárias de injeções parenterais de 10 a 200 U/kg/dia, por período de tempo que pode durar 21 dias. Um outro fator seria o de apresentar alguns efeitos tóxicos, como hiperglicemia, quedana albumina sérica, nas lipoproteínas e fibrinogênio, aumento de gordura no fígado e algumas disfunções cerebrais leves. O fator limitante mais importante é o desenvolvimento de hipersensibilidade ao tratamento.Isto ocorre entre 5 e 50% dos pacientes tratados. Esta hipersensibilidade vai desde pequenas reações alérgicas na área de injeção, broncospasmos e até choque anafilático, sugerindo que o paciente não deve ser submetido várias vezes a tratamentos com o mesmo tipo de asparaginase. O quadro alérgico se instala aomesmo tempo em que se processa o chamado “immunoclearence” plasmático da enzima, condições em

que a asparaginase é rapidamente metabolizada, perdendo o seu efeito terapêutico (Ohmuma et al., 1970)(Keating et al., 1993). Com o objetivo de amenizar pelo menos parte desses problemas, foram desenvolvidos experimentos de modificação estrutural e de conjugação da L asparaginase com compostos orgânicos As modificações variam desde conjugação da molécula protéica com bioplímeros, como polietilenoglicol, dextrana, albumina e heparina, ao melhoramento genético de bactérias produtoras da enzima.Com estas modificações, outras características foram adquiridas, como, por exemplo, o aumento do tempo de circulação, resistência à inativação por enzimas proteolíticas, mudança na característica da superfície, diminuindo sua capacidade antigênica, aumento na afinidade pela célula alvo e manutenção da atividade enzimática (Ducan & Spreafico, 1994). A forma de asparaginase conjugada mais conhecida para uso clínico é a do tipo II de Escherichia coli com polietilenoglicol (PEG), com a qual têm-se obtido excelentes resultados.A meia vida (t1/2) do conjugado PEG-asparaginase é de mais ou menos seis dias, contra aproximadamente um dia da asparaginase nativa (Keating et al., 1993).A descoberta de novas asparaginases com atividades antineoplásicas é de importância fundamental, principalmente se elas forem imunologicamente diferentes daquelas até então estudadas.diâmetro de 0,6 a 0,7 mm e tamanho variando de 1,5 a 5 mm dependendo do meio em que é cultivada.É móvel, possuindo de um a três flagelos em um ou ambos os pólos (Baldani et al., 1986).Asparagina é conhecido por ser um excelente agente anti-cancro. presente no estudo, o efeito combinado de pH e da temperatura sobre o rendimento de L asparaginase de purificado novel Pectobacterium carotovorum foi estudada em condições de ensaio utilizando o método de superfície de resposta.

Estudos de desactivação e parâmetros termodinâmicos desta enzima terapeuticamente importante

também foram investigados. O pH óptimo e a temperatura do purificado L Asparaginase foram consideradas 8,49 e 39,3 ° C, respectivamente. A taxa de desactivação mínimo constante (Kd) e semi-vida máxima (t1 / 2) verificou-se que 0,041 min-1 e 16,9 h, respectivamente em pH de 8,6 e 40 ° C. Parâmetros termodinâmicos (AG,

AHV, Ds, e energias de ativação) também foram avaliados para purificada L Asparaginase. O mecanismo provável de desactivação purificado L asparaginase foi explicado de uma forma com base em estudos e desactivação parâmetros termodinâmicos.

Asparaginase (L amidohidrolase Asparagina EC.3.5.1.1) é uma enzima de importância terapêutica elevada tendentência devido a Antineoplásicas(Antineoplásicos são medicamentos utilizado para destruir

neoplasmas ou células malignas e, tem a finalidade de evitar ou inibir o crescimento e a disseminação

de tumores) atividades, e usar em certos tipos de terapias contra o câncer,principalmente na leucemia linfoblástica aguda (LLA) .ALL é um tipo de leucemia que começa a partir de células brancas do sangue na

medula óssea, a parte interna dos ossos. Se desenvolve a partir de células chamadas linfócitos, um tipo de glóbulo branco central para o sistema imunológico, ou a partir de linfoblastos, um tipo imaturo de linfócitos.)

Também é utilizado na indústria alimentar para a produção de alimentos acrilamida livre, enzima modelo para o desenvolvimento de um novo sistema de entrega de drogas e L asparagina biosensor para a leucemia no Estudos sobre a estrutura molecular, a catálise, aspectos, determinantes genéticos envolvidos na regulação e estabilização para melhorar a meia-vida biológica Asparaginase foram relatados No entanto,poucos estudos têm sido relatados Hemodinâmicas aspectos desta enzima de estabilidade térmica estudos que ajudam a compreender a relação entre estrutura e função de uma

determinada enzima. Desativação asparaginase desempenha um papel vital no câncer terapia . Inativação rápida pode limitar a eficiência do processo terapêutico. Um melhor conhecimento cinética de desactivação da enzima é necessária para melhorar a viabilidade de utilização terapêutica. a desactivaçãoestudos iria fornecer valiosos conhecimentos físicos em a estrutura e função da enzima. Deactivação é definida como um processo em que o secundário, ter uma estrutura terciária ou quaternária de uma proteína muda com a quebra de ligações covalentes. A capacidade de para determinação de parâmetros enzima é uma medida da sua capacidade para catalisar uma reacção enquanto que a estabilidade da enzima é julgado pela sua reside atividade UAL. Ambas estas propriedades são modificadas para uma grande medida pelo pH, temperatura e modificadores, tais como activadores, inibidores, etc O exame da relação navios entre propriedades de enzimas e ambientais condições desempenha um papel vital para prever, manipular e projetar a estrutura da proteína.É bem conhecido que a actividade e estabilidade de um enzima é fortemente influenciado pelo pH e temperatura.Otimização das variáveis de processo usando uma variável o tempo é muito tedioso, trabalho intensivo e não tem como explicar os efeitos interactivos entre as variáveis.

Assim, não descreve os efeitos líquidos das várias parâmetros sobre a atividade enzimática.

O objectivo da comunicação é estudar o com efeito combinado de pH e da temperatura na purificado

asparaginase de Pectobacterium carotovorum MTCC 1428, sob condições de ensaio usando RSM, para

demonstrar a cinética de desactivação purificado asparaginase, e para determinação de parâmetros termodinâmicos.

MATERIAL E MÉTODOS

Estirpe bacteriana e as condições de cultura. O bactericida estirperial, P. carotovorum MTCC 1428 utilizado na presente investigação foi obtida a partir Microbiana Tipo Coleção Cultura e Banco Gene, do Instituto de Tecnologia microbiana (IMTECH), São Paulo,Índia. A cultura pura de isolar esta microbiana foi cultivadas num meio contendo (g / l): extracto de carne de vaca 1,0,extracto de levedura 2,0, NaCl 5,0, 5,0 e agar peptona 15,0 (PH 7,0), incubado a 30 ° C durante 24 h. A cultura foi mantida a 4 ° C por sub cultura cada mês.

Produção de L Asparaginase e purificação. A produção de L? asparaginase foi realizada na

meio semi-sintético contendo optimizados (g / l):glucose 5,202; 2,076 L asparaginase;? Na2HPO4 ·

2H2O, 6,0; KH2PO4 1,772, NaCl 0,5, MgSO4 · 7H2O 0,373; CaCl2 2H2O 0,015; extrato de levedura e 1,0 peptom 1,0 a pH inicial de 6,5 [12]. O inóculo foi preparado por adição de um ciclo completo de puro recentemente preparada cultura da slant em 80 ml de meio estéril mencionado acima contendo glicose como única de carbono fonte de um Erlenmeyer de 500 ml. O frasco de cultura

foi incubado a 30 ° C e 180 rpm num shak orbital ing incubadora de 10-12 h. A cultura foi transferida

(2% v / v, em meados? Fase logarítmica (DO a 600 nm =0,6-0,8)), em que um tanque de agitação biorreator de 7 litros (SartoriusBiostat B plus, Alemanha) com um volume de trabalho de 4 L.

O biorreator foi operado a 30 ° C, 200 rpm, e 1,5 vvm com pH não controlado. As amostras foram

desenhados em intervalos regulares de tempo, e da actividade específica foi medido em triplicado

intracelular L sparaginase foi isolado a partir de P. carotovorum MTCC 1428, como descrito por Kumar etal. [13]. Neste estudo, utilizou-se o elevado grau de pureza de preparação de enzima, a qual foi obtida por precipitação de proteínas com sulfato de amónio seguida por Anion? Cromatografia de

troca (DEAE-celulose) e cromatografia de filtração em gel (Sephadex G? 100)[14]. A concentração de proteína foi determinada de acordo com o método descrito por Lowry et ai. [15] usando BSA como um padrão. Todos experiência cromatográfica foram monitorizados para a proteína a 280 nm.

Estudos de desativação. As experiências foram conduzidas para estudar a estabilidade térmica de L asparaginase. O filtrado de cultura foi incubada a combinação diferente condições de pH e temperatura. Os níveis de pH e gama de temperatura seleccionada para estudar a desactivação

de L asparaginase foram 7,6, 8,6 e 9,6 e 30-50,40-60 e 30-50 ° C, respectivamente. O sam enzima

pios foram desativados em várias combinações de pH e temperatura, como mencionado acima, e ali-quotas de amostras foram coletadas em diferentes intervalos de tempo.O pH das amostras foi ajustado a norma As condições de ensaio e mediram a actividade residual de L asparaginase.

Estimativa da taxa de desactivação permanente (kd) e a metade de tempo de vida (t1 / 2). Desde a desativação da L Asparaginase é um dos principais obstáculos na eficiência de terapia é , uma melhor compreensão do mecanismo de desactivação é muito importante. A desativação de

L Asparaginase é assumida de seguir em primeiro lugar Kinet ordem ics. Isso é chamado de duas etapas simples teoria fase [10].O dois mecanismo de estado é o seguinte:

O pressuposto do mecanismo é que o ativo E estado enzima converte diretamente para inativos estado Ed sem fornecer qualquer quantidade significativa de interme diates.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Produção de L Asparaginase e purificação. o nosso trabalho anterior [14], foi demonstrado que a biomassa rendimento e actividade específica no final do cultivo em bioreactor foram encontrados para ser 0,97 ± 0,03 g / l e 28,87 ± 0,37 U / mg, respectivamente. GlutaminaseL livre Asparaginase foi purificado até à homogeneidade após a Sephadex G 100 cromatografia com 42,02% de rendimento. O

enzima foi purificada cerca de 72? dobra com um actividade específica de 2020,91 U / mg [14]. O ativo

As fracções do passo de purificação final foram reunidas, conscentrou usando liofilizador e dialisada contra o Tampão Tris-HCl (50 mM, pH 8,6). O concentrado fracção foi armazenado a -20 ° C para posterior análise de experimentos. L pureza? Asparaginase e molecular peso foi confirmada pela SDS-PAGE, Nativo PAGE eo gel Cromatografia de filtração em [14].O peso molecular do homotetramer purificada L Asparaginase e subunidades foi encontrado 144,42 e 36,10 kDa, respectivamente por MADI TOF MS [14].Otimização de efeito combinado de pH e temperamento sobre o desempenho de L asparaginase sob ensaio condição. Os fatores mais importantes físicos,que influenciam a taxa de reação enzimática, são pH e a temperatura de incubação com o substrato.Cada enzima tem um pH característico e temperatura optima para além do qual a redução da actividade foi observada. A temperatura e pH adequados para Asparagina sistema L Asparaginase foi determinado usando delineamento experimental estatístico. A fim para determinar as condições ideais, preliminares

experimentos foram realizados para estudar o efeito do pH sobre a actividade da L? asparaginase (mantendo a constante temperatura). Os resultados mostraram claramente que o máximo?

imum actividade foi observada quando o pH foi variado 8,0-9,0 [14]. Da mesma forma, os experimentos foram por formado para estudar o efeito da temperatura sobre a atividade de L asparaginase e descobriu que a maxima atividade mãe foi obtida quando a temperatura foi

variou entre 35 e 45 ° C [14]. Então, experimentos foram realizados em várias combinações de pH e

temperatura. A matriz de desenho e os correspondentes resultados das respostas observados e previstos (L asparaginanase actividade) .A atividade da enzima varia 5237-6645 U / ml.

A análise de regressão tiple nos dados experimentais, o segundo? equação polinomial ordem foi

encontrado para explicar a dependência da L asparaginase actividade do pH e da temperatura de incubação em que, A é B é pH e temperatura.Os resultados foram analisados pela A NOVA como adequado para a concepção experimental utilizada .

De acordo com a ANOVA de regressão quadrática modelo, o modelo é altamente significativo, como é evidente do teste F Fisher (média de regressão quadrado: média residual quadrado é 79,81), com uma probabilidade muito baixa valor (Pmodel> F é 0,0001). Isto indica que o efeitos combinados de pH e de temperatura significativamente contribuíram para maximizar a L actividade asparaginase.

A bondade do modelo foi verificada por meio do coeficiente R2 de determinação, o que implica que a amostra variação de 95,02 para a dependência de L asparagina

ão altamente significativa (P <0,0004). Contudo, a inter efeito de acção entre o pH ea temperatura é mais baixa de efeito linear (P <0,0616), mas representaram sensivel ciably. Além disso, constatou-se também que o coeficiente ciente para pH é muito maior do que o coeficiente para temperatura. Isto sugere que qualquer alteração no pH tem grande efeito sobre a atividade enzimática da L asparaginase de temperatura na gama estudada.O traçado de contorno 2D explica o comportamento do sistema e atividade enzimática mais independente variaveis, pH e temperatura são mostrados na Fig. 1. O

actividade da enzima é mais elevada numa gama de temperatura (36-41 ° C) e pH moderada (8,4-8,6). Esta equação foi otimizado e resolvido por MINITAB otimizador. Os níveis ideais de temperatura e pH foram verificou-se que 39,3 ° C e 8,49, respectivamente. A fim de verificar as condições ideais, os experimentos foram realizada no ponto central e os níveis ideais de variaveis. Estas condições apresentaram maior enzima valor de actividade (6856 U / ml), em comparação com a utilizada

presentemente para a análise da actividade da enzima. Depois otimização, L atividade asparaginase foi aumentado em 200 U / ml de amostra purificada.Estudos de desativação. L Asparaginase foi Desativado em várias combinações de pH e de temperatura como discutido na seção métodos. A extensão a desactivação é medida pela taxa de desactivação. A velocidade de desactivação é proporcional à enzima activa concentração e kd (velocidade de desactivação constante) é

a constante proporcional. O processo de desactivação é modelados como primeiro cinética de ordem e a desativação constante de velocidade foi avaliada. O valor mínimo de kd observada para L sparaginase foi 0,041 min-1 .As combinações de pH e temperatura na qual o velocidade de desactivação acima mencionado mínimo constante foram observados em 8,6 e 40 ° C, respectivamente. O processo de desactivação foi encontrada para ser mais rápida a pH

7,6 do que a pH alcalino (8.6, 9.6) para L? Asparaginase. Naidu e Panda [19] observaram que o efeito semelhante do pH na velocidade de desactivação permanente como relatado nesteestudo. Esta é possivelmente devido a troca de dissulfeto, que geralmente ocorre em condições quase neutras e alcalinas .Além disso, a observação de intervio entre a estabilidade conformacional e enzima

sugeriram que a actividade de enzimas que ocorrem naturalmente não se pode esperar para encontrar estabilidade a temperaturas muito acima do que a de crescimento de um organismo .Os resultados obtidos no presente estudo também indicam que o o pH óptimo ea temperatura lie perto da do

crescimento condição.