Locais Síntese e Acumulação de Compostos Secundários

No séc. 20 os produtos naturais tornam-se de grande interesse Bioquímico -modo como são produzidos cada um deles

No inicio de século 20 surgem departamentos de Bioquímica clínica, farmacologia, toxicologia, microbiologia e biologia celular com alguns cientistas interessados

departamentos de química

A meio do século 20 alguns biólogos celulares e fisiologistas começaram a usar produtos naturais como ferramentas em ensaios em que influenciam ou quebram funções celulares de um modo especifico

Exemplo: colchicina, atropina, nicotina, etc.

A descoberta dos antibióticos departamentos de microbiologiacompanhias farmacêuticas.

• Ultima metade do século 20 ecologistas

(interacção entre espécies)

Evolução Face a Novos Métodos Físico-químicos

• Caracterização das espécies vegetais com actividade farmacológica e o estudo da sua composição química com isolamento, identificação e dosagem dos seus constituintes

Botânica Química e Fisiologia

Brasil são 10% de toda a flora mundial e só 1% da flora brasileira é conhecida!!

Química Analítica, com métodos cromatográficos, espectrométricos e Radiológicos cada vez mais sofisticados > conhecimento da Composição química e da estrutura dos seus componentes activos

-cromatografia em papel-cromatografia de camada fina-cromatografia em coluna- líquida : HPLC e MPLC

Novas técnicas de determinação, identificação e caracterização de compostos:

- Ressonância magnética nuclear 1H e 13C(NMR)- espectrometria de massa (MS)- espectrometria de Ultra-violeta (UV)- espectrometria de infravermelhos- cristalografia de raios-X

Conjugação com técnicas informáticas (aquisição de espectros de padrões, criação de bibliotecas de espectros)

Separação isolamento e purificação na ordem dos nanogramas a partir de misturas complexas

Isolamento:

- A totalidade da planta- Só um órgão- Tecidos específicos

Métodos imunológicos de detecção e técnicas de sondas radioactivas :

- detecção de compostos ao nível celular- ELISA localiza locais de acumulação dos compostos naturais (metabolitos secundários)

Técnicas complementares• Técnicas de cultura in vitro- Permitem o conhecimento dos

processos de biossíntese dos compostos químicos naturais

Limitações estruturais das células

• Técnicas de transformação genética - Manipulação genética de estruturas vegetais mais

complexas para produção dos compostos( hairy roots)

A quantidade de compostos secundários na planta depende do equilíbrio entre:

- Síntese- Armazenamento regulação complexa- Degradação

Origem das vias metabólicas dos compostos secundários:

- Em todos os organismos acumulação de alterações (mutações nos genes associados aos metabolismos primários)

- Processo +/- aleatório e acidental

- Mutações em produtos primários => eliminação, redução na produção

- Mutações nos compostos secundários => mais toleradas

Metabolitos secundários

• Encontram-se em organismos específicos ou grupos de organismos são expressão de individualidade das espécies.

• Não são produzidos em todas as condições e em muitos casos os

seus efeitos benéficos para a planta são desconhecidos.

• Alguns são produzidos como material tóxico contra predadores, como voláteis atractivos ou agentes colorantes.

• As suas vias biossintéticas derivam das do metabolismo primário

Metabolitos secundários

Metabolitos primários

Outros compostos origem de Metabolismo Secundário

• Aminoácidos não-proteícos: Ornitina e lisinaprecursores de alcalóides

• Aminoácidos Aromáticos: fenilalanina, tirosina, triptofano precursores de alcalóides

• Os metabolitos secundários podem formar-se por condensação de produtos de diferentes vias biossintéticas, ou ligações a açúcares simples ou muito complexos

Indigofera tinctoria I. suifruticosa

Construção das unidades de origem dos metabolitos secundários

• Informação genética igual em todas as células

• Dentro das células a produção e acumulação pode ser compartimentada

• Acumulação longe da produção

Transporte de longa distância

Transporte célula a célula

FloemaLacticiferos

Células epidérmicas

• Alcalóides de Lupinus polyphyllus tecidos verde

cadaverina + esqueleto de lupanina

• Alcalóides de Conium maculatum

Enzimas no estroma

Raízes e raízes transgénicasNão produzem alcalóides de lupanina

Plastos Mitocondria

Células da epiderme

Outros Alcalóides de Lupinus

Tremoceiro ornamental

• Alcalóides de Peganum harmala – produzidos nas raízes

• Alcalóides de tabaco ou papoila do ópio são produzidos nas raízes por toda a planta, excepto sementes

Acumulação de Alcalóides de Lupinus nas células da epiderme (Sem cloroplastos) via floema

Inibição pela luz

Acumulação dos compostos:

- Época do Ano

- Estado de desenvolvimento da planta

Arruda síria

Alcalóides• Etimologicamente, alcalóide é um composto que tem algo de

alcalino ou que se parece ás bases (neutros ou sais).

• São substâncias que se comportam como bases na presença de ácidos, contêm azoto e que actuam sobre o organismo humano com grande intensidade. Podem ser substâncias venenosas que quando empregues em doses muito pequenas, actuam como fármacos curativos.

• Nas plantas com alcalóides, o azoto disponível não se transforma totalmente em péptidos vegetais, contínua em circulação na seiva ou fixa-se em algumas partes da planta, pode combinar-se com o enxofre e dar heterósidos sulfurados, ou com o cianeto e dar heterósidos cianogenéticos.

• Alguns são líquidos ou amorfos, mas a maioria são cristalizáveis.

• Os alcalóides derivados do tropano são metabolitos secundários que têm na estrutura das suas moléculas átomos de azoto secundário, terciário e quaternário.

• Alguns destes alcalóides funcionam como fitoalexinas ou na interacção planta−insecto, e também foram utilizados como estimulantes, drogas, narcóticos e venenos

• Existem em várias espécies da família das Solanaceas, esta família, conta com cerca de 90 géneros e mais de 2.000 espécies distribuídas em zonas temperadas e tropicais da terra. Muitas são originárias da América e do México

• Nas Solanaceas há varias espécies que são ao mesmo tempo tóxicas e medicinais, como a belladona (Atropa belladona), figueira do diabo (Datura stramonium), a mandrágora (Mandragora officinarum) e o meimendro negro (Hyoscyamus niger), espécies que se utilizam desde a antiguidade como medicinais, mas que têm alcalóides do grupo tropano o que as torna altamente tóxicas quando mal utilizadas

ALCALÓIDES TROPANO

Tropano

C8H15N

Composto bicíclico

Escopolamina

Raízes de herbano produtoras de Alcalóides Tropano - escopolamina

Locais de acumulação

• Em toda a planta mas predominantemente nos órgãos externos:

- tecidos em crescimento activo (ápices vegetativos)

- nos caules sempre no parênquima nunca no súber

- células epidérmicas e hipodérmicas

- bainhas vasculares

- Vasos lacticíferos

Locais de síntese

• Em geral Sintetizados no retículo endoplasmático• Transporte por vesículas até ao vacuolo• Armazenamento no vacuolo sob a forma de sais

Durante o transporte podem ocorrerAlterações na estrutura do alcalóide

Compartimentação da Biossíntese1º alcalóide enzima de biossíntese a partir do metabolismo Primário, identificada, isolada e caracterizada tetrahidrobenzil-isoquinolino

isolado de Berberis sp.

- Planta venenosa/medicinal - Na Europa as bagas são usadas para fazer doce.- No sudoeste Asiatico (Irão) as bagas são usadas para cozinhar (condimento para arroz).- Com excepção dos frutos e sementes a planta causa ligeiro envenenamento não fatal, o agente é a berberina

antimicrobiana

• Inicio da biossíntese Citosol• Enzimas chave: enzima berberina ponte carbono,

Canarina sintetase• Últimos passos catalisados por enzimas dependentes do

citocromo P450• Berberina ponte carbono e a (S)-tetrahidroprotoberberina

oxidase estão compartimentadas em conjunto em vesículas derivadas do RE liso

• Produto final acumula-se no vacúolo central das células• 2 mol de L-tirosina (percursor) 1 mol de berberina

4 mol S-adenosilmetionina 2 mol NADPH

Consumo

• Adição de algumas auxinas e poliaminas promovem a produção de Berberina induzem produção de etileno

Biossíntese da Berberina

• Técnicas de produção de protoplastos e isolamento de vacúolos permitem o estudo da tomada de compostos secundários.

[compostos secundários] > 500 mmol/L

Transporte contra o gradiente de concentração tonoplasto

H+ antiporte

ATPases e pirofosfatases

mecanismo específico

Ex: Fumaria capreolata vacúolos (S)-escoularina e reticulina

(R) não transportadas

Transporte activo ATP, [H+], sensível a inibidores de metabolismo

Erva-das-candeias

• O vacuolo toma determinados alcalóides em detrimento de outros num sistema que depende de:

- pH

- Temperatura

- ATP

- KCl

EX: alcalóides, coumarinas,

glicósidos, flavonóides

Características gerais• MM de 100 a 900• Carácter lipofílo acentuado solúveis em solventes

orgânicos e álcool de elevada graduação• Reagem com ácidos sais solúveis em água ou sol.

Hidroalcoólicas• Oxisgenados cristalizam facilmente, inodoros e não

voláteis poucos corados (ex: berberina e sanguinarina)• Sem oxigénio líquidos, odoríferos e voláteis

(conocina, nicotina, esparteína)• MM pequena e % de O2 líquidos ou cristalizam

dificilmente (ex: higrinas)

• Reveladores: reagente de Dragendorff (sol. Iodeto de bismuto e potássio) ou reagentes com poliácidos minerais complexos (ex: ác. Fosfomolíbdico)

Alcalóides Indólicos terpénicos (iridoides)

• Alcalóides derivados do triptofano com cadeia monoterpénica

• Este tipo de alcalóides encontram-se em várias famílias

vegetais, mas principalmente nas Apocinacea,

Loganiaceae, Nissaceae e Rubiaceae, todas da ordem

Gentianales. ex:Catharanthus roseus,Tabernaemontana divaricata e Rauvolfia serpentina

Vinblastina e vincristina anticancerigenos

Ajmalicina e serpentina antihipertensivos

Alcalóides bisindólicos

ajmalicina (A), catarantina (B), vindolina (C) alcaloides monoterpénicos-indólicos e de alcaloides bisindólicosvincristina (D, VCR) e vinblastina (D, VLB).

Em C. roseus as partes aéreas da planta contêm entre 0,2 a 1% de uma mistura de mais de cem alcalóides indólicos monoterpenóides, sendo os mais abundantes a catarantina e a vindolina

ajmalicina é um alcalóide extraído da raiz de C. roseus

AMIs Alcalóides monoterpénicos Indólicos

Problemas: (2004)

Produção reduzida 0.0005% peso seco

Custo elevado 1 milhão de dólares por Kg (vinblastina) 12Kg/ano

3,5 milhões de doláres por Kg (vincristina) 1Kg/ano

Precursores e via biossintéticaOs alcalóides deste grupo têm 2 elementos estruturais: • núcleo indólico derivado do triptofano • unidade C9 ou C10 derivada da secologanina (glicosídeo

iridoide)

alcalóides indólicos monoterpenóides possuem uma metade indólica fornecida pela triptamina e uma porção terpenóide fornecida pela secologanina

triptofano, derivado da via do xiquimato, é convertido em triptamina pela enzima triptofano descarboxilase (TDC),

secologanina deriva do IPP (isopentenil pirofosfato -isopreno) numa via no cloroplasto,

IPP cloroplastideal via de Rohmer (gliceraldeído/piruvato) não pela via do mevalonato, como no citoplasma

iniciogeranil difosfato (condensação IPP) geraniol

geraniol hidroxilase (cloroplasto)desenvolve-se pelo menos em quatro compartimentos subcelulares

diferentes e que são utilizados repetidas vezes ao longo da via:

• cloroplastos: • A conversão do triptofano em triptamina, pela TDC (triptofano

descarboxilase) • Vacúolo:• biossíntese STR (estrictosidina sintase) para formar estrictosidina

no vacúolo (AVLB sintase-peroxidase básica) • RE: (vesículas do reticulo)• biossíntese da secologanina (enzima SGD e T16H-hidroxilação da

tabersonina) • Citoplasma (enzimas D4H e DAT- últimos passos da síntese de

vindolina

estrictosidina é deglucosilada pela estrictosidina P - D - glucosidase (SGD). A estrictosidina deglucosilada é convertida em 4,21 - dehydrogeissoschizina.

A partir deste alcalóide são sintetizados por diferentes vias os alcalóides ajmalicina, catarantina e vindolina

Reagentes de detecção de alcalóides• Reagentes gerais em meio ácido precipitados corados

que podem ser solúveis no reagente:

- Dragendorff

- Bouchardat (sol. Aquosa de iodo em iodeto de potássio)

-Mayer - Valser (sol. Aquosa de tetra-iodo mercurato de potássio)

• Reagentes com poliácidos minerais complexos (em meio ác. ou neutro) compostos cristalinos ou amorfos:

- ác. Silicotúngstico

- ác. Fosfotúngstico

- ác. fosfomolíbdico

- ác. cloroplatínico

• Reagentes que originam cor específica de grupos de alcalóides:

- ác. Minerais concentrados, (sulfúrico) com molibdato de amónio, de vanadato de amónio

ou selenito de amónio (sem especificação)

- p- dimetilaminabenzaldeído (reagente de Wasicky) alcalóides da clavagem do centeio

- ninhidrina arilalquilaminas

- reagente de Vitali-Morin estéres do tropanol (Solanáceas)

Outros organismos com alcalóides• Existem várias espécies diferentes de cogumelos psilocibinos,

• contêm Psilocibina e Psilocina (alcalóides activos).• A psilocibina é quimicamente semelhante ao LSD (orthophosphoryl-4-

hydroxy-n-dimethyltryptamine).

• cogumelos psilocibinos Psilocybe mexicanaPsilocybe caerulescensPsilocybe (Stropharia)

cubensis, Pscilocybe wassoniStroparia cubensis.

• Os cogumelos psicoactivos são todos aqueles que contêm estes ou outro tipo de alcalóides capazes que afectar o Sistema Nervoso Central.

Amanita muscaria e Amanita pantherina

psicoactivos mas não psilocibinos.

• O químico suiço Albert Hofmann que descobriu o LSD, foi também o primeiro a extrair psilocibina e psilocina dos cogumelos mágicos. A psilocibina, que é convertida em psilocina pelo organismo humano, é a responsável pelos efeitos alucinógenos

• A psilocibina é um composto indólico derivado da triptamina, e tem a nomenclatura química de éster fosfato 3-[2(Dimetilamino)etil]indol-4-ol di-hidrogénio, sendo ainda encontrada com a nomenclatura de O-fosforil-4-hidroxi-N,N-dimetiltriptamina. Tem a fórmula C12H17N2O4P; com peso molecular de 284,27g.

LSD actua sobre vários receptores da serotonina (5-HT) assim como o

ecstasy, enquanto que a psilocibina é mais selectiva (especificamente em relação ao 5-HT2).

psilocibina

biossintese• Chegou-se a resultados experimentais que sugerem a seguinte

sequência: triptofano ->triptamina -> N-metiltriptamina -> N,N-dimetiltriptamina -> psilocina -> psilocibina.

• O fungo também pode converter em psilocibina a 4-hidoroxitriptamina por uma via alternativa.

• A triptamina origina várias outras substâncias, todas dotadas de actividade alucinogénica. Todas as substâncias da família da psilocibina têm estas propriedades. Têm a estrutura indólica básica característica da maioria dos alucinogénicos encontrados na natureza.

Lípidos

• Substâncias do metabolismo primário com algumas estruturas que os integram derivadas do complexo AGS (ác. Gordo sintetase).

• Nos organismos vivos têm funções de:

-reserva energética-plástica-protecção-revestimento

• Genericamente:

- não voláteis- hidrófobas- solúveis em solventes orgânicos polares ou pouco

apolares- ésteres de carboxilicos com 4 ou + C (ác. Gordos) e de 1 álcool ou poliol

Álcoois de ac. Gordos e resinas

Os lipídos podem ser separados ou isolados com solventes de baixa polaridade como:

• Clorofórmio• tetracloreto de carbono,• éter de petróleo,• éter etílico, • benzina, • benzeno, • tolueno, • misturas de benzeno • tolueno e etanol (2:1).

canola

• Classificação dos lipídos:- segundo a estrutura química lipidos simples (gliceridos)- reacções químicas que têm lipidos conjugados

(fosfolipido)- funções que desempenham lipidos derivados

(isoprenicos:

colesterol)

lípidos simples como as ceras têm grande

importância nas plantas: funções de recobrir as folhas para evitar

a transpiração, evitam ataques de

pragas e doenças quando se encontram na cortiça das

diferentes espécies florestais

Lipídos simples (função éster):vários grupos funcionais, abundantes em plantas e animais. nas plantas superiores lenhificadas

folhagemcortiça, ramos, sementes, flores, Frutos,Madeira

(baixos conteúdos de ceras e glicéridos)

• Lipídos isoprenóides• lipídos isoprenóides classificam-se em:

terpenos e terpenóides

abundantes em plantas, na actualidade conhecem-se cerca de 22 000 compostos diferentes, mas existem muitas estruturas desconhecidas.

• A maior parte dos Lípidos de membrana são

anfipáticos

extremidade não-polar extremidade polar

• Ácidos gordos Lípidos simples

cadeia de hidrocarbonetos com um ácido carboxílico numa extremidade

CH3(CH2)n-COO-

Não-polar polar

Ác. Gordos• A neutralização do grupo carboxilo por soluções de hidróxilos

alcalinos (hidroxilo de potássio ou sódio) origina sais solúveis em água com propriedades tensioactivas sabões

• Lipídos simples: Glicéridos (acilgriceróis) reserva energética

céridos (álcoois gordos)

estéridosAcumulam-se em células, tecidosou órgãos de reserva como

corpúsculos oleosos

triglicéridos

predominantes nas ceras protecção interna (animais marinhos)protecção externa (caules, sementes, folhas)Ex: álcool estearílico, mirístílico ou oleílico

esterificação por ác. Gordos de esteróis Ex: colesterol (animal), abundante em substâncias lipídicas animais (lanolina, óleo fígado bacalhau) forma livre ou estéridosFitoesteróis menos abundantes, forma livre ou ligados a heterosídosFitoesterolinas. Ex: ergosterol, sitosterol,estigmasterol

(esteres de ác. Gordos e glicerol)

Cera de abelha cérido

Gordura de animais marinhostrigliceridos

Azeite tem fitoesteróis que tem actividade pró-vitamina D

• Ác. Gordos poli-insaturados com 20 C eicosanóides

mediação de processos fisiológicos

ex: prostaglandinas, tromboxanos, leucotrienos

(inflamação, frio, manifestação alérgicas)

Biossíntese percursor directo ác. eicosapentenóico (síntese química, produção de percursores em corais e plantas) ex: dinoprostona induz trabalho de parto

ex: alprostadil tratamento da disfunção eréctil

Corpos gordos: óleos, gorduras (predominantemente glicéridos) ceras (céridos)

Reacção de acroleínaTeor de insaponificação <1 Reacção negativa de acroleína

Teor de insaponificação >1

Lípidos complexos

• Lípidos com elementos como azoto, fósforo, além dos elementares hidrogénio, carbono e oxigénio

ác. α – glicerofosfórico

EX: lecitinas membranas celulares fosfoaminolípidos

muito reactivos

grupo ácido e um azoto

Fosfolipídos (lipídos polares)

lecitina

lecitina

lecitina

glicolipídos

Papel dos lipídos polares

• A natureza anfipática dos glicerolipídos é essencial para a formação da bicamada; Os triacilgliceróis não existem nas membranas

• Plantas podem regular a sua própria temperatura e viver sob condições ambientais extremas

• Fluidez das membranas é afectada pelo grau de ácidos gordos insaturados e conteúdos em esterol

Bicamada lipídicaesterol

ác. Gordos nos diferentes tecidos vegetais Planta composição ácidos gordos (%

mol)

folhas 16:0 18:1 18:2 α-18:3 outros

ervilha 13 2 25 53 8

cevada 13 6 6 64 11

trigo 18 5 15 55 7

espinafre 13 5 14 54 14

soja 12 7 14 56 11

Sementes

soja 11 22 53 8 2

feijão 1 3 4 vestígios 91

coco 9 7 2 0 80

Ác. Gordos de plantas

A composição dos grupos de substituição varia entre os diferentes tecidos

Composição dos lipídos em diferentes organelos

Composição das fracções lípidicas das membranas dos tilacóides

A forma dos Lípidos afecta a geometria da membrana

Lípidos podem ser classificados como:- cones- cilindros- cones invertidos

Depende: área de secção de ligação da porção dos hidrocarbonetos versus a área de superfície da cabeça polar dos Lípidos

glicoglicerolípidos• GLICOGLICEROLIPIDOS NEUTROS:• compostos com frequentemente 1 ou 2 açucares

ligação glicosídica ao glicerol ou diacilglicerol 3 ou +

Importantes em plantas superiores, bactérias e algas membranas fotossíntese

< quantidade em animais

Todos os organismos aeróbios fotossintetizadores

85 % de glicoglicerolípidos neutros (MGDG e DGDG)

Assimetrias na distribuição dos Lipídos na membrana do tilacoide

Formas diferentes dependendo da ligaçãoá componente glicolitica

• Desde 1960 homólogos superiores de galactolipidos (tri- e tetragalactosil diacilglicerois) foram identificados em todos os tecidos vegetais.

• galactolipidos têm grandes quantidades de ácido linolenico (18:3n-3) e um acido trienoico especifico (16:3 n-3). Nas Plantas superiores acido linolenico é quase o único ácido gordo no MGDG

plantas "18:3".

• angiospermicas, acido linolenico está concentrado nas posições sn-1 e -2 no MGDG e no DGDG e está ausente o 16:3 n-3

• nas plantas inferiores (algas verdes, musgos, fetos, coníferas) e algumas angiospermicas (Solanaceae, Brassicaceae, Chenopodiaceae) têm 16:3 n-3 concentrado na posição sn-2 do galactolipido, enquanto a baixa percentagem de 18:3 n-3 é acetilado em ambas as posições.

plantas "16:3" e têm uma estrutura similar á "procariotica" da cianobactéria.

• algas vermelhas e diatomaceas fotossintetizadoras galactolípidos são caracterizados por uma alta proporção de 20:5 n-3.

Propriedades• Os monogalactosil diacilglicerois contêm 2 grupos acil ácidos

linolénicos (18:3 n-3)frutos de Rosa canina

• agente anti-inflamatório.• razão para a utilização clínica em acções anti-artríticas• Anti-tumor, actividade de controlo da falta de oxigénio e neutralização

de vírus. • DGDG sintetizado ou isolado de folhas de Clinacanthus (Tailândia) exibe actividade anti-herpes simplex vírus

Síntese de DGDG aumenta durante o desenvolvimento da floração

em Petunia hybrida, pistilos > [glicolipidos] que outros órgãos florais

Biossíntese dos ácidos gordosPrincipais passos (semelhantes em plantas, leveduras, bactérias e animais):

1- formação do 3-carbono malonil-CoA pela enzima Acetil-CoA Carboxilase (ACCase)

Gasto de ATP e NADPH

2- ligação do malonil á proteína acil transportadora (ACP) Memb Mitc impermeável a malonil CoA

3- condensação repetida de unidades de 2-carbono ao intermediárioPara formar palmitoil-S-ACP (C16:0) e estearoil-S-ACP (C18:0)

4- desnaturação

Estrutura da Acetil-CoA

• Acetil-CoA carboxilase (ACC) é a 1ª enzima da Biossíntese dos ácidos gordos carboxilases com Biotina como cofactor e bicarbonato grupos carboxilo

• Na forma existente no cloroplasto tem 4 subunidades (plantas)• ACC catalisa adição de CO2 á acetil-CoA originando malonil-CoA

em dois passos:

• BCCP + ATP + HCO.3 → BCCP-CO2 + ADP + P*

• BCCP-CO2 + Acetil-CoA → BCCP + malonil-CoA

Exportados para as células para serem utilizados como fonte deenergia no metabolismo

Activação da Acetil CoA Carboxilase1º- biotina é carboxilada á custa de ATP. 2º- O grupo carboxilo é transferido para Ac-CoA - reacção irreversível é o ponto de

múltiplos mecanismos de regulação

Reacção (1) catalizada pela biotina carboxilase (BC); reacção (2) transcarboxilase (TC); BCCP = proteína transportadora biotina carboxilase

Carboxilação da Biotina

Transcarboxilação da Biotina

• o grupo prostético biotina da acetil-CoA carboxilase liga-se grupo amina do sitio activo da lisina de modo similar á piruvato carboxilase

• transferência do CO2 activado para a acetil-CoA para formar malonil-CoA.

• (1) proteína transportadora biotina carboxil (dimero de 22.5-kD subunidades)

• (2) biotina carboxilase (dimero de 51-kD subunidades), + CO2 ao grupo prostético;

• (3) transcarboxilase (a2b2 tetramero com subunidades 30-kD e 35-kD), transfere CO2 activado para a acetil-CoA.

• Nas plantas ACC está no estroma dos plastos, onde a síntese dos ácidos gordos ocorre. bissíntese de ác. Gordos mesófilo fotossíntetico,

sementes frutos acumuladores

de óleos

longa e flexível cadeia biotina-lisina (biocitina) permite que o grupo carboxil activado seja transportado entre biotina carboxilase e transcarboxilase

Regulação:Palmitoil-CoA, o produto final da biossíntese dos ácidos gordos, inactiva as subunidades

Citrato como activator alostérico da enzima, promove a forma polimérica activa da enzima

Polipéptido da acetil-CoA carboxilase, tem sítios de fosforilação, e proteínas cinases responsáveis.

• fosforilação no Ser1200 é responsável pelo decréscimo da afinidade para o citrato.

• actividade da acetil-CoA carboxilase depende

de fosforilação e desfosforilação.

A forma desfosforilada da enzima é activada por:- baixa [citrato] - inibida por altos níveis de ác. gordos acil-CoA.

A forma fosforilada da enzima é activada por:- altos níveis de citrato- é muito sensível á inibição por ac

gordos acil-CoA.

Existem vários sítios de fosforilação alguns são reguladores, outros são silenciados

fosforilação dos sítios reguladores decresce a afinidade da enzima pelo citrato níveis elevados de citrato

enzima activada.

baixos níveis de ác. gordos acil-CoA inibem a carboxilase fosforilada, mas a enzima desfosforilada é inibida por altos níveis de ác. gordos acil-CoA.

fosfatases especificas desfosforilam ACC sensibilidade ao citrato

Forma fosforilada e não fosforilada da Acetil CoA carboxilase

Transporte da malonil- CoA para fora do plasto

• proteína (em E. coli) de um polipéptido de cerca de 80 a 90 aa ao qual está ligado (no resíduo de serina) um grupo fosfopanteteino, mesmo grupo da zona de trabalho da coenzima A.

• Enzima usada na síntese de ác. Gordos assim como reacções de acil-transferases e desaturação

Movimentos na Mitocondria

Todo o metabolismo dos Lípidos

cloroplastos

mitocondria

citoplasma

• No sistema procariota as enzimas estão dissolvidas livremente e separadas no citoplasma.

• Nos mamíferos as enzimas estão no citoplasma como um complexo solúvel

• Ao contrário dos mamíferos as plantas têm enzimas de polipéptidos individuais e estão nos plastos (embora envolva mitocondrias e citoplasma)

• Dihidroxiacetona fosfato (DHAP) move-se do estroma para o citosol triosefosfato DHAP piruvato

MitocondriaAcetil-CoA

acetatoCloroplastoÁc. gordos

Organização das enzimas envolvidas na Biossíntese dos ác. Gordos

Plantas

Bactérias

Mamíferos

Leveduras

KR- 3 cetoacil-ACP redutase ER- enoil ACP redutase MT- Malonil- CoA ACP DH- 3-Hidroxiacil-ACP desidratase KAS - 3 cetoacil-ACP sintetase

• Plastos de sementes ricas em óleos parecem ter uma via glicolitica completa em conjunto com a piruvato desidrogenase o que permitirá a conversão da glucose em acetil CoA.

• Plastos e cloroplastos de sementes

ricas em óleos podem usar diferentes

vias metabólicas para fornecer os

necessários substratos e cofactores

Enzimas mais importantes da Biossíntese de ácidos gordos

ACCase (Acetil CoA carboxilase) Acetil CoA +ATP+CO2 malonil CoA

Malonil- CoA ACP (Acyl carrier protein) transacilase (isolada de várias plantas-MT)

3 cetoacil-ACP sintetase (3 formas em plantas-especificas para substrato- KAS)

3 cetoacil-ACP redutase (necessita NADPH e NADH - KR)

3-Hidroxiacil-ACP desidratase (DH)

enoil-ACP redutase (2 isoformas- ER)

Síntese de Ácidos Gordos

Enzimas KAS3a, 3b, 3c

Resumo biossíntese

Abrev: ACCase( acetyl-CoA carboxylase); ACP(acyl carrier protein); ACS(acetyl-CoA synthase); CoA(coenzyme A); dims(cyclohexanedione inhibitors)FAS(fatty acid synthase); fops(aryloxyphenoxy propionate inhibitors) PDC(pyruvate dehydrogenase complex). 

• plantas superiores existem 2 formas de ACCase:

eucariotica (citosólica) resistente a herbicidas procariotica (plastidial) susceptível a herbicidas

• enzima plastidial 2 isoformas   • forma dimerica maioria das monocotiledoneas e todas as

dicotiledoneas

• forma multidominio só em gramíneas

Herbicidas actuam no domínio carboxiltransferase

Existem duas formas de ACCase nas plantas

ACCase isoenzimas têm propriedades bioquímicas distintas

Enzima multifuncional (gramíneas) vs enzima multisubunidades (dicotiledoneas):- Km mais baixo para a acetil-CoA

- carboxila propionil–CoA

- ACCase dos Cloroplastos das gramíneas sensível a vários herbicidas

Acetil – CoA carboxilase

Fornece Malonil – CoA para:

- Síntese de Ácidos Gordos

- Ceras da Cutícula

- Flavonóides e antocianinas

- Antroquinonas

- Malonil - ACC

Regulação da actividade da ACCase (resumo)

• Depende de LUZ/Escuro

• A regulação da enzima implica a modulação da síntese de ácidos gordos

dependente da LUZ/Escuro

• Actividade da ACCase:

- 2 a 4 vezes superior em cloroplastos incubados á luz

- é sujeito a inibição retroactiva em excesso de Lípidos

- é regulada por fosforilação/ desfosforilação

Estrutura do grupo próstetico da proteína acil transportadora (ACP)

ACP permite que os ác. Gordos sejam solúveis em água durante a síntese

Plantas têm pelo menos 2 formas de ACP:

ACP-I e ACP-II são expressas diferencialmente:- em folhas vs sementes- á luz vs escuro

Nas Plantas:

- Síntese de ác. Gordos ocorre nos plastosOutros eucariotas é no citoplasma

- Enzimas das plantas e bactérias estão fracamente associadas e podem ser separadas facilmente

- Os genes que codificam para as enzimasnas plantas são codificados nuclearmenteos polipéptidos têm sequencias “leader” de transporte para os plastos

- os plastos têm que exportar os Lípidos

Testes de marcação de Lípidos

• Sudão III• Tetróxido de Ósmio• Sudão negro B

• Azul do Nilo

Lípidos Totais

Lípidos não ácidos

FOX2 (xilenol laranja dissolvido com sulfato de amónio ferroso em ác. Sulfúrico)

cora azul arroxeadoÁc. Gordos polinsaturados oxigenados

Terpenóides• Maior constituinte dos óleos essenciais das plantas aromáticas e

medicinais condensação de unidades de isopreno

• Hemiterpenos monoterpenos, diterpenos, sesquiterpenos

• Biossíntese condensação de 2 compostos com C5

• Têm funções ecofisiológicas importantes:

- relações com patogénios, benéficos para as plantas, controlo alelopático da germinação e/ou desenvolvimento

- economia hídrica (saturação dos estomas - controlo da evapotranspiração), aumento do brilho folhear (reflexão das radiações - regulação da temperatura)

• Antibacterianos

• Antifungicos

• Antineoplasicos ou citoestáticos

• Percursores de esterol animal e fitoesteroides

• Percursores da P450 das plantas

• Ligam-se a proteínas da membrana

isoprenilação

Características• Grupo maior e mais diverso dos compostos secundários:

- livres- modificados

esteresglicosídosligados a proteínas

• Comuns em plantas e fungos raros em bactérias

• Nos mamíferos os esteróides resultam do metabolismo terpenóide• Têm origem na via do ác. Mevalónico e na via 2-C-methyl-D-erythritol 4-

phosphate/1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate (via MEP/DOXP), via não mevalonica ou via independente do ácido mevalónico ocorre nos plastos, nos protozoa, e em bactérias (VIA DO PIRUVATO-GLICERALDEÍDO-FOSFATO)

mesmo produto final IPP e DMAPP (dimetilalilpirofosfato)

• 1ª enzima na formação do ác. Mevalónico é a acetacetil-CoA tiolasee encontra-se nos plastos.

• Enzima chave na regulação β-hidroxil-β-metilglutaril coenzima A redutase (HMG-CoA) encontra-se bactérias, leveduras (matriz mitocondrial), plantas superiores (cloroplastos e citoplasma), insectos e mamíferos (retículo endoplasmático) em todos os tecidos que sintetizam terpenóides

isopentenil pirofosfato IPP

osmeterium

• HMG- CoA membrana molécula de largo peso molecular

subunidades polipeptidicas

• A compartimentação sub-celular do metabolismo dos terpenoides é controversa

Cloroplastos contêm via biossíntética completa

(autónomos na produção de terpenos)

(carotenos e a cauda da molécula de clorofila produção nos

cloroplastos

Fitoesteróis são sintetizados no citoplasma

• Síntese abreviada dos esteróis

intermediários

terpenoides

• Hemiterpenos (DMAPP) dimetilalil pirofosfato resulta da isomerização do isopentenil pirofosfato (ác. Mevalónico terpenóides)

• DMAPP é um potente electrólito compostos com grupo 3,3 dimetilalil

ex: Humulona do H. lupulus• Hemiterpenos em:

- furocoumarinas

- antraquinonas rotenóides

- derivados de isoflavonóides

• Metabolizado facilmente isolamento difícil• Benzofuranos (Asteraceae) citotóxicos e insecticidas percursor

dimetilalil pirofosfato

Politerpenos• 2000 espécies (+ angiospermicas, mas fungos e fetos também)

contêm polisoprenos em pequenas quantidades

• Polisoprenos são Z-isómero só alguns são E- isómeroEm cada espécie só um é produzido

• Ocorrem na forma de látex em partículas mínimas que se acumulam em células especiais ou no interior de laticíferos

• Biossíntese nos laticíferos onde estão todas as enzimas

• Látex funciona como um citoplasma altamente especializado com núcleos, mitocondrias, RE e ribossomas e polisoprenos, partículas de resina e partículas luteóides (vacúolos com enzimas hidrolitícas)

• HMG- CoA redutase é o passo limitante na biossíntese• Os politerpenos são substâncias poliméricas tais como a borracha. • incluem poliprenóis (polióis de cadeia longa, da ordem de C55 a

C120). Estes ocorrem essencialmente como constituintes de membranas de microorganismos

• Percursores:

3-isopentenil pirofosfato, IPP

3,3'-dimetilalil pirofosfato, DMAPP

Geranilgeranil difosfato GGPP

Farnesil difosfato FPP

Exemplos de terpenos

N Numero de unidades de isopreno

Numero de carbonos

Nome

0 2 10 Geraniol

1 3 15 Farnesol

2 4 20 Geranilgeraniol

3 5 25 Geranilfarnesol

7 9 45 Solanesol

8-11 10-13 50-65 Castaprenol-Ficaprenol

• Biossíntese:3 passos iniciação

elongação ( Z- 1,4 prenil transferase) terminação

Presença de moléculaDifosfato alilico IPP(isopentenil

pirofosfato)

adicionados á cadeia Z 1,4 poliisopreno

Polimero liberta-se da enzima transferase

• Plantas: elongação requer um iniciador E- difosfato alilico(C20)

Farnesil pirofosfato (FPP)

• Complexo enzimático em partículas hidrofóbicas, mas FPP é hidrofílico no citoplasma reacção na superfície da partícula

• A enzima necessita de Mg2+ e Mn 2+ e de difosfato alilico

Em Hevea brasiliensis esta enzima está associada a

estas partículas mas ligada á membrana

Actividade biológica do látex:

- ajuda a selar feridas

- natureza pegajosa ajuda a proteger dos ataques dos insectos

O sistema de lacticíferos está presente em todas as partes da planta matura:- raízes- caules- folhas- em alguns casos frutos

biossíntese de terpenóides tem lugar numa via comum a vários organismos.Envolve condensação de blocos de C5 isopentenil difosfato (IPP,13) e dimetilalil difosfato (DMAPP,14), que são condensados pelas preniltransferases formando intermediários lineares difosfatados de vários tamanhos, ex: FPP(15)

Ciclização, conjugação, e/ou re-arranjos catalisados por terpeno sintases produzindo os diversos esqueletos carbonados dos produtos terpénicos naturais.

Resumo de biossíntese dos terpenóidesEx: gossipol e artemisina

• Estes esqueletos de carbono são alterados por múltiplas transformações: oxidação, redução, isomerização, hidratação, e conjugação formando estruturas complexas e diversas dos produtos naturais como gossipol (1) e artemisinina (2).

• ENZIMAS

• AtoB, acetil-CoA acetiltransferase• HMGS hidroximetilglutaril-CoA sintase (ERG13)• tHMGR hidroximetilglutaril-CoA redutase (HMG1)• MK mevalonate cinase (ERG12)• PMK fosfomevalonato cinase (ERG8)• PMD fosfomevalonate descarboxilase (ERG19)• IDI isopentenil difosfato-isomerase• IspA farnesil diphosphate sintase• CAS cadinene sintase• CAH cadinene hidroxilase• CPR P450 redutase• ADS amorfadieno sintase• AMO amorfadieno oxidase

Acetileno

• Hidrocarboneto dos alcenos. É o mais simples composto com 2 hidrogénios e 2 carbonos – composto orgânico insaturado com a tripla ligação com ligação covalente.

• Acetileno reage com álcoois, hidrogeno cianeto, ác. clorídrico, ou ácidos carboxílicos originando compostos vinilicos :

• Reacções com aldeídos

• Com monóxido de carbono dando acrílicos

• Ciclização dando benzeno ou ciclooctataedros

Compostos acetilénicos• Compostos altamente instáveis:

- luz- oxigénio- calor

• Acetilenos vegetais misturas complexas• Existem em toda a natureza concentrado em

plantas e fungos

• 1000 acetilenos são já conhecidos• 3 tipos em plantas:

1) acetilenos ácidos2) derivados do ác. Crepenico3) derivados dos terpenos tripla ligação

Exemplos de compostos acetilénicos álcoois

• álcoois acetilénicos naturais e os seus derivados foram isolados de uma grande variedade de espécies vegetais, fungos e invertebrados. Estudos farmacológicos revelaram que muitos deles têm propriedades químicas e medicinais.

Álcoois Monoacetilénicos foram isolados de culturas de Clitocybe candicans (Basidiomicetes) e os estudos da estrutura mostram 2 ou 3 grupos hidroxil

• Acetilenos ác. derivam do ác. oleico trigliceridos

óleo das sementes

de algumas plantas

• Acetilenos derivados ác. Crepenico derivados metabólicos

acumulam-se nas raízes

ex: Apiaceae, Araliaceae, Asteraceae

• Acetilenos com tripla ligação derivados de diferentes vias

esporadicamente distribuídos em diferentes grupos de plantas

• ácido Oleico é provavelmente o ác. Gordo mais comum (Azeite é rico neste composto: cerca de 60-70%, mas também se encontra em nozes). As maiores fontes para o Homem são palma, soja e manteiga

Ácido Oleico

vários isómeros do ác. Oleico com uma dupla ligação trans. compostos naturais isómeros trans posição(n-13), (n-12), (n-9) ou (n-7) Os óleos e gorduras vegetais praticamente livres de ligações trans

Só aquecidos a altas temperaturas na presença de componentes activos

ligações trans são comuns nas gorduras animais especialmente manteiga e gorduras de ruminantes

Ácidos acetilenicos (acidos 6-octadecinoico e 6-nonadecinoico) descritos em raízes de Pentagonia gigantifolia, Rubiaceae, inibiam o crescimento de estirpes Candida albicans. O potencial antifúngico é comparável com o da anfotericina B e fluconazole mas com pouca toxicidade.

Ácido Crepeninico (acido 9-octadecenio-12-inoico) encontra-se em 60% no óleo extraído de sementes de Crepis foetida (Compositae) efeitos tóxicos das plantas com este ác. Gordo em ovelhas Australianas

• Isómero trans:

• Ácidos gordos saturados

• Isómero cis:

Biossíntese• Ácido oleico e linoléico são os precursores dos

acetilenos nos microrganismos e nas plantas

• Ácidos Crepeninico e dihidrocrepeninico são incorporados em quase todos os acetilenos por oxidações e re-arranjos

• Componentes derivados de modificações do ác. Gordo acetilénico em C18 porções vegetativas da planta

• Forma triacilgricéridos óleo das sementes

BIOSSÍNTESE

Distribuição nas plantas• Limitados a alguns taxa comparativamente com os ác.

Gordos

• Comuns inseridos nos triacilgliceridos em óleos de sementes de Asteraceae mas mais em Loranthaceae, Olacaceae, Opiliaceae e Santalaceae

• Acetilenos metabolicamente alterados Apiaceae, Araliaceae, Asteraceae, Campanulaceae e Pittosporaceae.

• Fungos Basidiomicetes, livres em diferentes partes do organismo, mas também como componentes de óleos essenciais

Propriedades Fisiológicas e Farmacológicas

• O tipo e quantidade de acetilenos presentes na maioria das plantas varia com o estágio de desenvolvimento e com a zona da planta Ex. raízes de Helianthus pentainene

• O tempo de vida de um acetileno nas plantas é de 6 a 48h

• Poliacetilenos nas plantas podem ir de vestígios a 1%

• Plantas que não produzem acetilenos podem ser induzidas a produzi-los na presença de fungos

• Plantas transformadas com Agrobaterium podem começar a produzir tal como “hairy roots” de plantas não produtoras

frutos

• Actividade biológica:

os que ocorrem em óleos essenciais contribuem para o sabor e cheiro em várias especiarias originárias em ervas da família das Apiaceae

alguns acetilenos são altamente tóxicos para humanos e animais (ex: cicuta, Oenanth crocata)

falcarinol é menos tóxico para as pessoas mas potente antifúngico membranas de cenouras ou ginseng, salsa

antibióticos (bactericidas) micomicina instável

tiarubrina A

antiviral condriol (algas marinhas)

• Fitoalexinas:

aumentam a produção em resposta a infecções fúngicas

ex: em Carthamus tinctorius o safinol aumenta 20x quando a planta é atacada por Phytophthora drechsleri

• Planta-insecto e planta-nematodo

Estes compostos podem ter efeito anti-alimentação dos insectos

Ex: ácido 8-Z-Dihidromatricarida em carochas, aranhas, vermes

Em Asteraceae compostos acetilenos com estruturas tiofeno tem actividade anti-nematodos

4 dos compostos acetilénicos mais comuns nas Asteraceae são insecticidas para as Oncopeltus fasciatus anti-hormonas

juvenis

• Efeitos fototóxicos dos compostos acetilénicosQuando excitados estes compostos medeiam vários

efeitos fototóxicos através de 2 tipos de acção:

Acetilenos de cadeia linear interagem com moléculas alvo na célula

Tiofenos medeiam a oxidação de várias biomoléculas (Lípidos de membrana e proteínas)

Só em Asteraceae existem compostos acetilénicos com fototóxicidade Alterações no comportamento após ingestão: fotofobia, Ruptura do tegumento

Fototoxicidade em plantas• Fototoxicidade em plantas é mediada pela formação de singletos de

oxigénio (tiofenos, polienos e perileno quinonas) ou através de ligações covalentes com o DNA no caso das fotogenotópicas furanocoumarinas

• As tiarubrinas possuem um mecanismo único de fototoxicidade envolvendo formação induzida pela luz de intermediários reactivos como os fotosulfidos e ditionas de cadeia aberta e activação do enxofre que é parte da via do tiarubrina-tiofeno.

ditionas

Formação de tiofenos

• A toxicidade da tiarubrina é resultado de pelo menos 3 mecanismos distintos.

(1) toxicidade das tiarubrinas na ausência de luz resultante da reacção do anel alvo (uma única enzima)

(2) fototoxicidade da luz visível causada por intermediários

(3) danos foto-oxidativos causados por formação de singletos de oxigénio induzidos por UV e pelos fotoprodutos finais os tiofenos.

• A utilidade destes 3 métodos de estratégia defensiva é relevante pelos danos que estes compostos podem causar nos patogénios ou herbívoros

Ceras• Misturas complexas: hidrocarbonetos, aldeídos, cetonas • Compostas predominantemente por céridos• Reacção negativa da acroleína• Percentagem elevada de insaponificação• Líquidas e sólidas

ésteres de álcoois e ác. saturados

Ésteres de álcoois

Ácidos insaturados

Biossíntese• Derivam de ác. Gordos de cadeia longa (C28-C30).

Formados pela extensão de cadeias curtas de ác. Gordos

• Elongamento das cadeias necessita de malonil CoA e a redução de NADPH

Ceras na superfície das folhas

Folhas “limpas”de ceras

Reposição das ceras

• O tamanho dos ácidos produzidos depende das espécies mas os mais comuns são: C28, C30 e C32

• As cadeias longas de álcoois são formadas por redução das cadeias longas de ác, gordos (Acil Co A redutase)

Maiores constituintes das ceras das plantas

n-Alkanes CH3(CH2)xCH321 to 35C - odd numbered

Alkyl esters CH3(CH2)xCOO(CH2)yCH334 to 62C - even numbered

Fatty acids CH3(CH2)xCOOH 16 to 32C - even numbered

Fatty alcohols (primary)

CH3(CH2)yCH2OH 22 to 32C - even numbered

Fatty aldehydes CH3(CH2)yCHO 22 to 32C - even numbered

Ketones CH3(CH2)xCO(CH2)yCH323 to 33C - odd numbered

Fatty alcohols (secondary)

CH3(CH2)xCHOH (CH2)yCH3

23 to 33C - odd numbered

β-DiketonesCH3(CH2)xCOCH2CO(CH

2)yCH3

27 to 33C - odd numbered

TriterpenolsSterols, α-amyrin, β-amyrin, uvaol, lupeol, erythrodiol

Triterpenoid acids Ursolic acid, oleanolic acid, etc

Proporções relativas (%peso) dos constituintes mais comuns de ceras em algumas espécies de plantas

Grape leaf Rape leafApple fruit

Rose flower Pea leafSugar canestem

Hydrocarbons 2 33 20 58 40-50 2-8

Wax esters 6 16 18 11 5-10 6

Aldehydes 6 3 2 - 5 50

Ketones - 20 3 - -

Secondary alcohols

- 8 20 9 7 -

Primary alcohols

60 12 6 4 20 5-25

Acids 8 8 20 5 6 3-8

Other components present include various diol types and triterpenoid acids

• Numa planta os aldeídos e os álcoois gordos são similares aldeídos são intermediários na síntese dos álcoois

• Ésteres das ceras resultam da combinação de longas cadeias de álcoois com longas cadeias de ácidos (acil CoA álcool transacilase)

• Hidrocarbonetos das ceras tem origem nas longas cadeias de ác. Gordos (C12, C14, C16 e C18). Precursores para as cadeias longas de ác. Gordos são também precursores dos hidrocarbonetos

• Cetonas e álcoois secundários também são sintetizados a partir de ác. Gordos de cadeia longa

Resumo da biossíntese• Duas vias para a Biossíntese de ceras:

• via acil redução (com inicio na formação de álcoois e esteres),

• via da descarboxilação que resulta na síntese de aldeídos, álcoois secundários, alcanos e cetonas.

• Na via redutiva de esteres acil CoA produzidos pelo elongamento da cadeia são reduzidos num processo de dois passos via um intermediário aldeído transiente e é catalizado por uma única enzima acil-CoA redutase

Acil redução

Descarboxilação

Locais de produção• As ceras cobrem tanto folhas como caules, flores e

frutos

• Produção células da epiderme

Actividade biológica• Em todas as plantas existem ceras com hidrocarbonetos

C29, C31 e C33, assim como os esteres das ceras são quase ubíquos

diferenciação taxonómica

• Protecção contra patogénicos e desidratação• Papel importante em Nepenthes (carnívora)

• Nos processos de atracção de insectos:

-cheiro

- visão

- tacto (a superfície das ceras é fundamental)

voláteis dissolvidos nas ceras

reconhecimento da superfície

Ex: Pseudomyrmex ferrugineus (formiga) e a ( Acacia collinsii) árvore. Os insectos têm razões cuticulares de alcanos e alcenos semelhantes aos hidrocarbonetos cuticulares da árvore

• Análise de ceras:

• Hidrocarbonetos removem-se com um solvente não polar hexano purificado

Analise por cromatografia gasosa e espectrometria de massa

• Ésteres difícil, mistura complexa

Análise por espectrometria de massa

Estruturas secretoras nas plantas

• Secreção acto de separação de uma substância do protoplasto (libertação de compostos com actividade fisiológica)

• Estruturas secretoras variam em grau de especialização e em localização na planta

- internas

- externas

- pêlos glandulares

- glândulas vascularizadas

- canais intercelulares

- cavidades (bolsas)

- fusão de células (lacticíferos)

• Estruturas secretoras externas:

- tricomas e glândulas

- nectários

- hidátodos

• Estruturas secretoras internas:

- células secretoras

- espaços secretores (cavidades/canais)

- lacticíferos

Biotecnologia nos metabolitos secundários• Mais de ¼ dos novos fármacos (30 anos)

molécula de origem vegetal• 9 dos 20 mais vendidos fármacos

metabolitos secundários das plantas

Interesse redobrado nos compostos naturais

• Sucesso limitado na abordagem de síntese química para produção de novos fármacos Enorme biodiversidade de compostos activos na “biblioteca”de moléculas dos organismos vivos.

• plantas + insectos, bactérias, nemátodos e vírus co-evolução plantas grande variedade de produtos naturais envolvidos na defensa

• Para biologia molecular e aplicações biotecnológicas, as plantas medicinais e os seus produtos têm alguns problemas:

• A produção dos compostos é especifica de espécies e do genótipo e a acumulação é limitada a certos tecidos ou tipos celulares e regulados por factores ambientais e de desenvolvimento

• A função da maioria dos metabolitos não é conhecida ou muitas vezes qual dos vários metabolitos produzidos pela planta é responsável pela actividade medicinal.

O problema níveis de produção. Existem 3 opções:

• Desenvolver a síntese química se a estrutura é conhecida • Extracção a partir da planta (silvestres, cultivadas, cultura de tecidos• Produção do metabolito em sistemas heterologos (plantas ou não-vegetais)

problemas

• Síntese química não possível ou não rentável compostos secundários complexos

• Por vezes é possível baseado no conhecimento da acção para produzir um substituto sintético com a mesma acção.

Ex: artemisinina, em que o sitio activo da molécula, uma ligação peroxidica farmacoforica num único heterociclo 1,2,4- trioxano forma as bases para o desenvolvimento de um fármaco peróxido sintético antimalarico.

• Sistemas de extracção baseados na planta inteira :

• Baixos níveis de produtos naturais

• Acumulação em tecidos específicos

• Em estágios do crescimento vegetativo específico

• Condições de crescimento ou ambientais específicos

• Cultura de tecidos

Problemas:

• Em cultura os compostos naturais não se acumulam ou acumulam em pequenas quantidades toxicidade celular

• Diferentes sistemas foram testados com vários sucessos.

Esquema geral da Transformação de plantasCom Agrobacterium sp

• A. rhizogenes, causa o sindroma “hairy root”.

• É uma bactéria Gram negativa do solo capaz de entrar na planta por ferida e causar a proliferação de raízes secundárias

• Efeitos morfogénicos nas plantas por transferência de parte do plasmideo Ri (root inducing)

• “Hairy roots”têm crescimento rápido, crescem em meio sem hormonas

• Não susceptíveis a gravitropismo

• Geneticamente estáveis com produções elevadas de metabolitos secundários característicos das plantas originais.

• Produção de metabolitos secundários estável comparativamente com outros sistemas de cultura in vitro

• Produção de alcalóides por “hairy roots” estável por anos

• Alguns casos há excreção para o meio dos compostos. A extensão da excreção varia com a espécie em estudo

• O crescimento varia entre espécies até entre clones diferentes da mesma espécie.

• Relação crescimento produção também varia com a espécie

Factores de produção em “hairy roots”• Biossíntese de metabolitos secundários em raízes transformadas é

geneticamente controlada factores nutricionais ambientais.

• Nível de sacarose• Fitorreguladores exógenos • Tipo de fonte de azoto (e quantidade) • Luz• Temperatura• Presença de químicos

- Crescimento- Aumento Biomassa- Metabolitos secundários

Composição do meio de cultura afecta crescimento e produção