Appostilas de Práticas de Microbiologia

8/20/2019 Appostilas de Práticas de Microbiologia

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALFENAS – UNIFAL-MG

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA

MICROBIOLOGIA BÁSICA

Roteiro de aulas práticas

Professores da Disciplina no 2º Semestre de 2014

Amanda Latércia Tranches Dias

Daniela Cristina de Macedo Vieira

Jorge Kleber Chavasco

Marília Caixeta Franco Ariosa

Ana Carolina Padovan

Eliane de Oliveira Silva


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ÍNDICE

1- INTRODUÇÃO .................................................................................................................................. 3 2- NORMAS DE SEGURANÇA E TRABALHO NO LABORATÓRIO................................................. 6

3- MÉTODOS DE COLORAÇÃO EMPREGADOS EM BACTERIOLOGIA: ....................................... 8 SIMPLES, NEGATIVA E DE ESPOROS ............................................................................................... 8

4- MÉTODO DE COLORAÇÃO DIFERENCIAL DE GRAM .............................................................. 12

5- MÉTODO DE COLORAÇÃO PELA TÉCNICA DE ZIEHL-NEELSEN (ÁLCOOL-ÁCIDORESISTÊNCIA) .................................................................................................................................... 15 6- PREPARO DE MEIOS DE CULTURA ............................................................................................ 17 7- MÉTODOS FÍSICOS DE CONTROLE MICROBIANO ................................................................... 20 8- TÉCNICA DE ESTERILIZAÇÃO POR FILTRAÇÃO ..................................................................... 21 9- AVALIAÇÃO DA EFICIÊNCIA DA AUTOCLAVE NA ESTERILIZAÇÃO .................................. 22 10- LAVAGEM DAS MÃOS ................................................................................................................ 23 11- AVALIAÇÃO DA AÇÃO ANTIMICROBIANA DE ANTISSÉPTICOS E DESINFETANTES ..... 25 12- TÉCNICAS DE INOCULAÇÃO DE BACTÉRIAS EM MEIOS DE CULTURAS ......................... 27 13- IDENTIFICAÇÃO DE COCOS GRAM-POSITIVOS ..................................................................... 30

14- IDENTIFICAÇÃO DE BASTONETES GRAM NEGATIVOS – PROVAS BIOQUÍMICAS ......... 34 15- ANTIBIOGRAMA .......................................................................................................................... 40 16- PROPRIEDADE OLIGODINÂMICA DE METAIS ....................................................................... 43

17- ISOLAMENTO DE ACTINOMICETOS DO SOLO ....................................................................... 44 18- ALTERAÇÕES FENOTÍPICAS E GENOTÍPICAS ........................................................................ 45

19- UROCULTURA.............................................................................................................................. 47 20- ESTUDO DOS FUNGOS ANEMÓFILOS ...................................................................................... 50 21- MÉTODOS PARA O ESTUDO DE LEVEDURAS E FUNGOS LEVEDURIFORMES ................. 53


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1- INTRODUÇÃO

O conhecimento não é material a ser fragmentado, as ciências se complementam e évivendo esta totalidade que podemos compreender um pouco do funcionamento do universo.

A idéia da criação de uma apostila de práticas de microbiologia surgiu com a finalidadede facilitar o entendimento das práticas exercidas por um profissional de microbiologia dentrode um laboratório, mas é importante deixar claro que teoria e prática andam juntas e que,normalmente, as aulas criadas têm resultados previsíveis para o certo, o que não acontece emum laboratório. Porém, são estes resultados imprevisíveis, que levam às grandes descobertase é daí que nasce a principal característica de um pesquisador, a persistência.

Importância da Microbiologia

Seria muita pretensão de nossa parte achar que todas as pessoas que entram emcontato com a microbiologia tornem-se grandes amantes da área. Porém, não podemosminimizar a importância desta ciência para o conhecimento geral dos profissionais das ciênciasbiológicas e para os das demais áreas.

“Meu Deus, que maravilhas existem em uma criatura tão pequena!”, foi o relato deLeeuwenhoek em sua carta enviada para a Society de Londres em 1693, quando visualizoupela primeira vez os micro-organismos. Seres que fascinaram e ainda fascinam muitoscientistas, importantes por estarem em praticamente todos os lugares que se pode imaginar,gerando benefícios e malefícios para a sociedade.

A microbiologia, ciência que estuda a vida em miniatura, foi uma ferramenta criada pelosestudiosos a fim de ampliar os conhecimentos do mundo microscópico. Os micro-organismos,os seres minúsculos, apesar do tamanho, são seres muito complexos, estão em todas aspartes do planeta, convivendo de forma harmônica ou não com o homem e outros seres,fundamentais para a sobrevivência na Terra. Participam ativamente de diversos ciclosbiogeoquímicos, devolvendo para o meio ambiente os nutrientes essenciais, além de

auxiliarem na degradação da matéria orgânica. Além disso, atuam nos processos debiolixiviação e biorremediação. As indústrias, farmacêuticas e alimentícias, principalmente, deleitam-se com a grande

capacidade desses seres produzirem metabólitos importantes para a produção de suasmatérias primas.

Mas o aspecto mais importante e que deve sempre ser lembrado, é que os micro-organismos fazem parte da biosfera, são encontrados em quase todos os ecossistemas, sendoassim, qualquer fator que provoque um desequilíbrio em suas populações, estará afetandotodo um ecossistema e, consequentemente, a biosfera.

Estudar para conhecer e preservar estas formas de vida é a importante tarefa dosmicrobiologistas, uma vez que ainda há muito que se descobrir sobre o universo dos micro-

organismos.

Alfenas – MG 2004

Os Autores


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Micro-organismo - Grupo de organismos, procariontes ou eucariontes, cujas estruturasmorfológicas são, geralmente, observadas ao microscópio óptico e crescem em uma ampla

faixa de temperatura.

Microbiota normal – Conjunto de micro-organismos que vivem na pele ou em algumassuperfícies internas do corpo dos animais, inclusive o homem, que não causam mal aohospedeiro e estão altamente adaptados à sobrevivência e ao crescimento nessas áreas.

Microbiota residente - Conjunto de micro-organismos que são encontrados regularmente emum dado sítio, sem causar doença.

Microbiota transitória - Conjunto de micro-organismos que se instalam temporariamente nohospedeiro, podendo, com o tempo, desaparecer.

Desinfecção - Processo de eliminação de micro-organismos patogênicos, em suas formasvegetativas, de material inanimado pelo calor ou substâncias químicas. Exemplo: uso dedesinfetantes em salas cirúrgicas.

Anti-sepsia - Processo de eliminação de micro-organismos patogênicos, em suas formasvegetativas, de tecidos vitalizados por substâncias químicas. Exemplo: uso de polivinilpirrolidona –iodo para lavagem das mãos.

Assepsia - Conjunto de medidas que visam minimizar a entrada de micro-organismos num

local asséptico, isto é, onde não existam micro-organismos ou estejam em baixo número.Exemplo: Utilização de cabine de fluxo laminar para manipulação de culturas.

Esterilização - Conjunto de medidas que levam a destruição total dos micro-organismos demateriais inanimados podem ser empregados métodos físicos e químicos. Exemplo:autoclavagem de meios de cultura.

Flambagem - Ato de eliminação dos micro-organismos de materiais inanimados pela ação docalor. Exemplo: alça de platina na chama do bico de gás.

Repicagem – Transferência do inóculo de micro-organismos para um novo meio de cultura.

Meio de cultura – É a fonte de nutrientes essenciais, necessária para o crescimento dos micro-organismos.

Termosempregadosno laboratório

demicrobiologia


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Esfregaço - Camada de células de micro-organismos espalhada uniformemente na áreacentral da lâmina de vidro (limpa).

Inoculação – Introdução de um micro-organismo em um meio de cultura.

Incubação – Exposição temporária de um micro-organismo em condições físicas e químicasideais para o seu crescimento.

Membrana filtrante ou Millipore - Filtros de celulose com diâmetros de poros variados,suficientes para reter os micro-organismos. Usados para a filtração de substâncias termolábeiscomo soro, antibióticos, vitaminas, colírios. Apresentação de equipamentos e materiais utilizados no laboratório de microbiologia

Materiais:

Alça e agulha de platina

Bico de Bunsen

Cemitério

Descarte

Lâmina

Lamínula

Pêra

Placa de Petri

Pipetas

Pipetas semi-automáticas

PVPI

Recipiente de sulfocrômica

Suporte de pipetas

Termômetro

Tubo

Equipamentos:

Autoclave

Banho Maria

Centrifuga

Cabine de fluxo

Esterilizador de alça

Estufas

Leitor de Microplacas (Elisa)

Liofilizador

Microscópio

Microondas

pHmetroShaker


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2- NORMAS DE SEGURANÇA E TRABALHO NO LABORATÓRIO

Nas aulas práticas trabalharemos, muitas vezes, com micro-organismos patogênicospara o ser humano. Por isso, torna-se necessário adotarmos medidas preventivas desegurança, para evitar possíveis contaminações:

1. Observe o horário de início das aulas práticas, a fim de evitar contratempos naexecução dos trabalhos estipulados;

2. É obrigatório o uso do avental, luvas e óculos de proteção em todo trabalho prático ondehá riscos de contaminação microbiana;

3. Não é permitido fumar, comer ou beber no ambiente do Laboratório;4. Evite tocar os olhos, boca ou nariz com as mãos;5. Não faça uso de lenços ou avental para limpar objetos ou instrumentos de trabalho,

principalmente a objetiva do microscópio.6. Lave sempre as mãos após manusear culturas ou materiais contaminados com micro-

organismos, patogênicos ou não;7. Comunique imediatamente ao responsável, qualquer suspeita de haver contraído

enfermidade como conseqüência de infecção no Laboratório;8. Trabalhe sempre de maneira ordenada, tranqüila, constante e metódica;9. Evite conversas desnecessárias, principalmente com as pessoas que estejam

trabalhando, pois a concentração é indispensável para o sucesso da atividade prática;10. Anote todos os detalhes da atividade prática para a elaboração do relatório;11. Limpe e desinfete a superfície da bancada de trabalho antes e após o trabalho de cada

dia;12. No caso de derramamento acidental de material contaminado com micro-organismos,

desinfete imediatamente o local;13. Tome cuidado na pipetagem de soros, soluções antigênicas ou suspensões de micro-

organismos, utilizando para tal propósito pipetas semi-automáticas (não use pipetagem

com a boca);14. Flambe a boca de tubos de ensaio ou outros frascos que contenham culturas, após aretirada de tampas ou tampões de algodão e, também, antes de recolocá-los;

15. Não coloque de qualquer modo sobre a mesa o instrumental, alças e agulhas de platina,após ter sido utilizado; esterilize-o antes de guardá-lo. Há um “cemitério” para as placase tubos contaminados e depósito próprio para pipetas, lâminas e lamínulascontaminadas. Algodão, gaze, papel-toalha e papel de filtro, quando não contaminados,deverão ir para a lata de lixo; quando contaminados, deverão ir para o saco branco,apropriado para esta finalidade.

16. Nunca deixe placas de Petri e tubos de ensaio abertos desnecessariamente sobre abancada;

17. Antes de acender o bico de Bunsen, verifique se a entrada de ar está na posiçãocorreta; risque o fósforo e abra a chama convenientemente. Para desligar, fecheprimeiro o registro da bancada, espere até esgotar todo o gás e, então feche o registrodo bico de Bunsen;

18. Após a utilização do microscópio, diminua ao mínimo a intensidade de iluminação,desligue-o, coloque-o na posição inicial, retire a lâmina e limpe suas objetivas compapel da bancada ou lenço de papel, sem esfregar até que retire todo o óleo;

19. Não retire ou forneça qualquer cultivo ou material do laboratório sem a préviaautorização dos responsáveis pelo mesmo;

20. Utilize todo material com o máximo de cuidado e atenção a fim de evitar perdasdesnecessárias;

21. Não deixe, desnecessariamente, abertas as portas de armários, geladeiras e estufas.


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22. Após a utilização de reagentes e soluções, retorne os frascos aos seus locais deorigem;

23. Antes de conectar qualquer aparelho a tomada, verifique se a voltagem é a correta;24. Qualquer dúvida sobre o seu modo de agir no Laboratório esclareça com os

responsáveis pelo mesmo;25. Ao sair do Laboratório no final da jornada de trabalho, verifique se não há aparelhos e

lâmpadas ligados desnecessariamente.


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3- MÉTODOS DE COLORAÇÃO EMPREGADOS EM BACTERIOLOGIA:SIMPLES, NEGATIVA E DE ESPOROS

A visualização de bactérias após o emprego de métodos de coloração foi introduzida porRobert Koch em 1876, baseando-se em observações anteriormente feitas por Goeppert &Cohn em 1849.

Os corantes quanto à origem podem ser classificados como naturais e artificiais. Quantoà natureza química os artificiais são classificados em ácidos, básicos e neutros. Dentre oscorantes naturais temos o carmin e a hematoxilina. Já entre os corantes artificiais podem serdestacados os seguintes:

Corantes básicos: cristal violeta, violeta de genciana, azul de metileno, fucsina básica,verde malaquita, etc.

Corantes ácidos: Fluoresceína, eosina, vermelho do congo, etc.O corante possui um cromóforo que pode ser negativo (corante ácido ou aniônicos) ou

positivo (corante básico ou catiônico).Os corantes ácidos têm forte afinidade por constituintes positivos da célula como as

proteínas. Os corantes básicos têm afinidade por constituintes negativos da célula, como osácidos nucléicos e componentes da parede celular. Estes últimos são ideais para corarbactérias, pois o ácido nucléico está disperso no citoplasma.

As principais etapas do preparo de um espécime microbiano corado para examemicroscópico são: confecção de um esfregaço a partir de uma camada fina do espécime sobreuma lâmina de vidro, fixação do esfregaço à lâmina, normalmente pelo calor e coloração comum ou mais corantes.

A coloração simples é utilizada para visualizar tipos morfológicos e arranjos celulares.Neste processo o esfregaço é corado por um único reagente. Corantes básicos são ospreferidos. Os mais utilizados são o azul de metileno, cristal violeta ou a fucsina carbólica.

A coloração negativa é indicada em situações especiais, tais como a necessidade de

observar a célula sem distorções, pois não há fixação pelo calor, ou ainda, observarmicroscopicamente micro-organismos tênues e difíceis de corar, como é o caso dos espirilos.Emprega-se corante acídico, tal como a eosina ou a nigrosina. O corante ácido, com suaporção cromógena carregada negativamente, não penetra na célula devido à carga negativada superfície da mesma. A célula após o processo aparecerá não corada contra fundo escuro(fortemente corado).

Coloração de esporos: espécies de bactérias anaeróbicas dos gêneros Clostridium e Bacillus, são exemplos de organismos que tem a capacidade de existir tanto na formametabolicamente ativa denominada de célula vegetativa, como também em células inativaschamadas de esporos. Essa estrutura intracelular é formada quando as condições ambientaistornam-se desfavoráveis para manter a atividade da célula vegetativa.

O esporo é constituído por uma parede (composta de peptidoglicano e dipicolínato de cálcio), ocórtex (composto de peptidoglicano com ligações menos rígidas), uma capa (composta deproteínas rica em ligações dissulfetos intramoleculares) e exósporo (membrana lipoprotéicaque contém aminoaçucares. A capa do esporo confere resistência a agentes químicos).Devido sua estrutura, o esporo é resistente a efeitos deletérios como o calor excessivo,radiações, ação de agentes químicos, etc. Quando as condições ambientais tornam-sefavoráveis, o esporo germina, assumindo a forma vegetativa da bactéria.

O método de coloração de esporos de Wirtz-Conklin baseia-se no grau de afinidade quea estrutrura do esporo possui ao corante. Nesse método, é usado o verde de malaquita aquente como corante principal. Devido à ação drástica do calor sobre a célula e o esporo hápenetração do verde-malaquita. No esporo o corante resiste a lavagem com água, porém, as

estruturas vegetativas (células) não retêm esse corante e se descoram. Em seguida é usada asafranina, como corante de contraste, que cora a estrutura vegetativa de vermelho ou rósea.


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Atividades Práticas

Preparo dos esfregaços de micro-organismos

Limpe a lâmina de vidro com papel, flambe-a e deixe esfriar a temperatura ambiente; Esterilize a alça de repicagem; Aguarde até a alça esfriar; Se a cultura estiver em meio liquido, transfira uma gota da cultura para o centro da

lâmina. Se a cultura estiver em meio sólido, transfira uma gota pequena de água para ocentro da lâmina e em seguida, com auxílio da alça (esterilizada) retire uma pequenaporção, tocando levemente na superfície do meio de cultura;

Espalhe a cultura sobre a parte central da lâmina e deixe o esfregaço secar ao ar; Passe a parte de baixo da lâmina sobre a chama por três vezes para fixar o esfregaço; Deixe a lâmina esfriar. Identifique-a com lápis de cera na parte superior (com um

número). Circule o esfregaço pelo lado inverso da lâmina.

Coloração simples

Preparar o esfregaço segundo técnica acima, utilizando cultura de micro-organismo jáidentificado (padrão*).

Cobrir o esfregaço com a solução de um corante e deixar o tempo estipulado. Seempregar azul de metileno deixar 2 minutos, cristal violeta: 1 minuto e fucsina carbólica:30 Segundos, Lavar a lâmina em água corrente e deixar secar ao ar;

Observar em microscópio com objetiva de imersão (100x). Anotar os resultados. Interpretação dos resultados: Observar a forma e o arranjo, em seguida desenhar.

*Culturas padrões:Staphylococcus aureus e Bacillus cereus.

Forma Arranjo


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Coloração negativa

Colocar uma pequena gota de eosina a 2%, sobre a superfície de lâmina de vidro; Transferir para a lâmina, com o auxílio de alça de platina, pequena porção da cultura de

Bacillus cereus. Homogeneizar com a própria alça de platina, procurando espalhar omaterial na região central da lâmina; Secar ao ar;

Examinar em microscópio com objetiva de imersão (100x). Leveduras deverão serobservadas com objetiva a seco (40x);

Anotar os resultados. Interpretação dos resultados: Observar e desenhar a forma e o arranjo.

Coloração de esporos

Preparar esfregaço a partir da cultura de 48-72 horas de Bacillus cereus. Cobrir o esfregaço com solução de verde malaquita a 5% em água destilada e deixar a

lâmina sobre a superfície de placa aquecida durante 3 minutos, tendo o cuidado de não

deixar ferver o corante. Colocar poucas lâminas de cada vez. Podemos utilizar tambémo aquecimento pela ação direta de uma chama;

Lavar a lâmina em água corrente; Cobrir o esfregaço com solução de safranina durante 30 segundos. Escorrer o corante e

lavar em água corrente; Secar a lâmina e observar em microscopia de imersão.(100X) Interpretação dos resultados: Observar a forma e o arranjo, em seguida desenhar.

Forma Arranjo

Forma Arranjo


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Materiais utilizados para execução das técnicas de coloração:Lâminas de vidro, corantes, óleo de imersão, placa de aquecimento, culturas de micro-organismos.

Normas para a observação de micro-organismos ao microscópio óptico

Gire o revólver (sem segurar nas objetivas), encaixando a objetiva de menor aumento(4X);

Coloque a lâmina sobre a platina, prenda-a com a presilha; Verifique se o botão de intensidade luminosa está no mínimo;

Acenda a luz do microscópio; Regule a quantidade de luz utilizando o diafragma e abaixando o condensador; Movimente o botão macrométrico até seu ponto máximo levantando a platina; Olhando pela ocular e utilizando o parafuso macrométrico, abaixe lentamente a platina

até focalizar o material. Utilize o micrométrico para corrigir a focalização; Observação: Certifique-se de que o material foi focalizado, movimentando o charriot. Encaixe a objetiva de 10 X e focalize com auxílio do botão micrométrico; Selecione com o charriot uma área contendo micro-organismos; Coloque uma pequena gota de óleo de imersão sobre a lâmina no local onde a objetiva

de 100X será colocada (sob o feixe luminoso); Encaixe a objetiva de 100 X. Subacuidadosamente a platina com o macrométrico até encostar na objetiva de imersão;

Olhando pela ocular e utilizando o parafuso macrométrico abaixe a platina até focalizaro material;

Anote seus resultados Para desligar o microscópio diminua a intensidade luminosa, desligue o fio da tomada.

Gire o revólver, encaixando a objetiva de menor aumento e limpe a objetiva de imersãocom papel higiênico. Coloque a capa no microscópio.

Oculares

Objetivas

Platina

Botão micrométrico

Botão macrométrico

Mesa de platina

Braço

Prisma

Lâmpada

BaseCondensador

Revólver


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4 - MÉTODO DE COLORAÇÃO DIFERENCIAL DE GRAM

O método de coloração diferencial de Gram foi descrito em 1884 pelo médicodinamarquês Hans Christian Joachin Gram. Sua finalidade é facilitar a observaçãomicroscópica das bactérias e separá-las em dois grupos, segundo a cor revelada pelasmesmas ao final do processo de coloração. O método não se aplica a todas as espécies debactérias, além disso, não é um método diferencial para fungos, uma vez que todos eles sãoGram positivos.

O processo de coloração é iniciado com a aplicação de um corante primário (cristalvioleta) sobre o esfregaço, cuja função é corar todas as células bacterianas pertencentes aosdois grupos. A seguir aplica-se o lugol, que forma um complexo insolúvel e de difícil remoção,através de ligações com o corante primário. Em seguida, aplica-se o descorante (álcool eacetona). Dependendo da composição química dos componentes celulares, o agente dadescoloração pode ou não remover da célula o complexo formado pelo corante primário dacélula. Finalmente, é aplicado o corante final (fucsina ou safranina), que tem cor contrastanteem relação ao corante primário. Se o corante primário não for removido após o processo dedescoloração o corante final não será absorvido, neste caso a célula retém a cor inicial (roxo).

Quando ocorre a remoção do complexo formado pelo corante primário e lugol, oscomponentes celulares descorados assumem a cor do corante final (vermelho).


Técnica da coloração:

Preparar o esfregaço em lâmina de vidro, conforme procedimentos detalhadosanteriormente;

Coloque a lâmina sobre o suporte e cubra toda a região do esfregaço com cristal violeta.

Aguardar 1 minuto; escorrer o corante, não sendo necessário lavar a lâmina em águacorrente. Cobrir o esfregaço com solução de Lugol. Aguardar 1 minuto; escorrer o lugol, não

sendo necessário lavar a lâmina em água corrente. Com a lâmina inclinada, proceder a descoloração com Álcool Acetona, gotejar o

descorante, por tempo rápido (máximo 3 segundos). Lavar em filete de água corrente; Cobrir o esfregaço com solução de fucsina. Aguardar 30 segundos; Lavar em filete de

água corrente; Secar a lâmina ao ar e examiná-la microscopicamente, empregando objetiva de imersão

(100 X), conforme instruções do roteiro de normas para a observação de micro-organismo ao microscópio óptico.

Anotar os resultados: células coradas em roxo: Gram positivas, células coradas emvermelho: Gram negativas.

Culturas Empregadas:Staphylococcus aureus, Streptococccus pyogenes, Proteus mirabilis.

Interpretação dos resultados: Observar a forma, o arranjo e o comportamentocromogênico da célula frente ao método de Gram.


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Micro-organismo 1:_________________________________________

Micro-organismo 2: ___________________________________________

Micro-organismo 3: ___________________________________________

Forma Arran o Coloração




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Anexos

Composição das soluções utilizadas na coloração diferencial de GRAM

Solução Estoque de cristal violeta do Gram

Solução de oxalato de amônio 1%

oxalato de amônio 1 gágua destilada 100 mL

Solução de uso do cristal violeta

cristal violeta (estoque) 1 mL

solução de oxalato de amônio 1% 40 mL Água destilada 10 mL

Solução de iodo-iodeto (lugol)

iodo metálico 1 giodeto de potássio 2 gbicarbonato de sódio 3 gágua destilada 300 mL

Solução para descoloraçãomistura v/v de acetona e etanol 95%

Solução estoque de safranina

safranina 2 getanol 95% 100 mL

Solução de uso da safraninaMisturar 1 parte da solução estoque com 5 partes de água destilada.

cristal violeta 20getanol 100 mL


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5- MÉTODO DE COLORAÇÃO PELA TÉCNICA DE ZIEHL-NEELSEN (ÁLCOOL-ÁCIDORESISTÊNCIA)

A maioria das espécies bacterianas é corada por métodos simples ou pela técnica deGram. Porém, espécies de alguns gêneros, particularmente Mycobacterium, são resistentes àcoloração por tais métodos, podendo, entretanto, ser visualizadas pelo método de Ziehl-Neelsen.

As micobactérias possuem fina camada de cera de natureza lipídica, denominada decera D, envolvendo a parede celular. A cera D dificulta a penetração de corantes, tais como ocristal violeta e o azul de metileno.

A fucsina carbólica (corante primário) é um derivado fenólico que é solúvel em materiallipídico da parede celular de micobactérias. A penetração desse corante, através da camadalipídica (cera) em direção ao citoplasma, é facilitada pela aplicação de calor. Após essetratamento, todas as células bacterianas, possuindo ou não cera D, são coradas de vermelho. A fucsina carbólica não pode ser removida das micobactérias, mesmo que sejam utilizadosprocessos drásticos, tal como o tratamento com soluções álcool-ácidas (descorante). Devido a

essa propriedade, estes micro-organismos são denominados de bacilos álcool-ácidoresistentes (BAAR) e continuam corados de vermelho. Porém, a aplicação de mistura de álcooletílico e ácido clorídrico (descorante) remove o corante de todas as bactérias que nãopossuem a camada de cera D, tornando-as incolores. Para a visualização dessas bactérias éutilizado um corante de contraste, o azul de metileno, que cora as células de azul.

Atividade Prática

Preparar esfregaços empregando células mortas de BCG (Bacilos de Calmete Guerin)

Cobrir o esfregaço com solução de fucsina carbólica (Ziehl). Com auxílio de chumaço dealgodão embebido em álcool, aquecer a lâmina até a emissão de vapores, não deixandoa lâmina secar, adicionando mais corante. O processo de aquecimento deverá durarcerca de 5 minutos;

Lavar a lâmina em água corrente;

Descorar o esfregaço com solução de álcool-ácido clorídrico, adicionando o descorantegota a gota, até que não remova mais corante;

Lavar novamente a lâmina em água corrente;

Cobrir o esfregaço com solução de azul de metileno durante 2 minutos;

Lavar a lâmina, secar e observar em microscopia de imersão (objetiva 100X), conformeinstruções do roteiro de normas para a observação de micro-organismo ao microscópioóptico.


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Interpretação dos resultados observados na lâmina

Bacilos corados em vermelho: Positivo para a técnica de BAARBacilos corados em azul: Negativo para a técnica de BAAR

Anexos

Reagentes

1 - Fucsina carbólica (Fucsina de Ziehl)

Solução A

Fucsina básica 0,3 g Álcool etílico 10 mL

Solução B

Fenol 5 g Água destilada 10 mL

Misturar as soluções A e B.

2 - Mistura Álcool-Ácido (Descorante)

Álcool etílico 95% 97 mL Ácido clorídrico concentrado 3 mL

3 - Azul de Metileno

Azul de metileno 0,3 g Água destilada 100 mL



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6- PREPARO DE MEIOS DE CULTURA

A composição dos meios de cultura utilizados para o crescimento dos micro-organismosno laboratório, normalmente, possui grande parte dos nutrientes disponíveis no habitat naturaldos mesmos e devem possuir todos os elementos que compõem a célula, tais como C, N, P,O, H, S, etc.

Alguns micro-organismos podem viver da matéria orgânica morta (saprófitas), outrosparasitando os organismos vivos.

Os meios podem ser sólidos, líquidos, semi-sólidos ou bifásicos. Os líquidos são usadospara produção de biomassa, em fermentação e em estudos de crescimento. Os sólidos paraisolamento do micro-organismo e contagem do número de células. Os semi-sólidos paraestudos de motilidade e para detecção de placas de lise em culturas bacterianas infectadaspor vírus. Os bifásicos para hemocultura (técnica destinada a evidenciar os micróbios acasoexistentes no sangue, e que consiste em pôr certa quantidade de sangue em meio nutritivoapropriado à proliferação deles). O agente solidificante do meio de cultura é o ágar, que possuia propriedade de se fundir a 96ºC e solidificar a 45ºC.

São encontradas algumas denominações especiais dos meios de cultura, relacionadasà sua composição ou função. Temos meios sintéticos, como o meio mínimo que fornecesomente os nutrientes essenciais ao desenvolvimento celular. O meio diferencial contémsubstâncias que permitem diferenciar grupos de micro-organismos. O meio de enriquecimentofavorece determinadas populações que terão maior número de células, enquanto o meioseletivo possui substâncias (antibióticos) que inibem o crescimento de determinadaspopulações.

Alguns fatores físicos interferem no crescimento microbiano: pH, temperatura, oxigênio,luz e salinidade. Esses devem ser considerados quando o micro-organismo for cultivado nolaboratório. Para a maioria das bactérias o pH ótimo de crescimento varia entre 6,5 a 7,5.


1. Preparo de alguns meios de cultura

Preparar os meios de cultura conforme demonstrado pelo instrutor e seguindo as instruçõesabaixo:

Bancada 1 – Preparar 100 mL de ágar BHI (conforme instruções do rótulo) e distribuir 7 mL emtubos médios. Fechar os tubos sem apertar totalmente a tampa e colocar em um recipiente deplástico. Embalar e identificar os materiais;

Bancada 2 – Preparar 100 mL de ágar nutriente (conforme instruções do rótulo) e transferir 16mL para tubos grandes. Fechar os tubos sem apertar totalmente a tampa e colocar em umrecipiente de plástico. Embalar 6 placas de Petri. Embalar e identificar os materiais;

Bancada 3 – Preparar 50 mL de caldo BHI (conforme instruções do rótulo) e distribuir 3 mL emtubos pequenos. Fechar os tubos sem apertar totalmente a tampa e colocar em um recipientede plástico. Embalar e identificar os materiais;

Bancada 4 – Preparar 100 mL de ágar Nutriente (conforme instruções do rótulo). Colocar embalão e fechar com tampão. Embalar 6 placas de Petri. Embalar e identificar os materiais;


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2. Esterilização dos meios

O meio de cultura e as placas de Petri serão esterilizados, em autoclave a 120 ºC por 15minutos a 1 atmosfera. Posteriormente 15 mL de ágar nutriente, preparado pelos alunos dabancada 1, serão vertidos na placas de Petri. Os tubos preparados pelos alunos da bancada 4serão colocados para solidificar na posição inclinada.

3. Armazenamento dos meios

O meio, após seu preparo e esterilização, deve ficar à temperatura ambiente até seuresfriamento e, posteriormente, ser armazenado em geladeira devidamente identificado (nomedo meio, data de fabricação, etc.) de uma forma clara a fim de que mesmo um estranho aolaboratório possa identificá-lo.

Composição dos meios de cultura

a - Ágar Nutriente ou Ágar Simples

Peptona 5,0 gExtrato de carne 3,0 g Ágar 15,0 g Água destilada 1.000 mL

1. Em balão acrescentar os componente do meio em 100 mL de água destilada.2. Aquecer com agitações freqüentes e ferver por 1 minuto para a dissolução completa.3. Distribuir em recipientes apropriados e autoclavar a 121°C por 15 minutos.

b - Caldo Nutriente ou Caldo SimplesComposição e preparo como mencionado em “a”, sem a presença de ágar.

c- Agar BHIO meio é comercialmente fornecido desidratado (pó). Sua composição aproximada é a

seguinte:

Fórmula por litro

Infusão de cérebro e coração 8 gTecido animal enzimaticamente digerido 5 gCaseina hidrolizada 16 gDextrose 2 gCloreto de sódio 5 gFosfato dissódico 2.5 g Agar 13.5 g

O pH final deve ser ajustado a 7.4 ± 0.2 a 25°C A fórmula pode ser ajustada e/ou suplementada de acordo com as exigências da cultura..

1. Suspender do meio desidratado uma quantidade suficiente para 100 mL de água destilada.2. Aquecer com agitações freqüentes e ferver por 1 minuto para a dissolução completa do


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3. Distribuir em recipientes apropriados e autoclavar a 121°C por 15 minutos.

d - Caldo BHIComposição e preparo como mencionado em “c”, sem a presença de ágar.

e- Base para o Agar Sangue

Fórmula por litro:

Peptona 15 gDigesto de fígado bovino 2,5 gExtrato de levedura 5 gCloreto de sódio 5 g Agar 12 g

1. Pesar uma quantidade do meio desidratado suficiente para 100 mL de água destilada.

2. Aquecer com agitações freqüentes e ferver por 1 minuto para a dissolução completa do3. Distribuir em recipientes apropriados e autoclavar a 121°C por 15 minutos.


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7- MÉTODOS FÍSICOS DE CONTROLE MICROBIANO

1- Calor

1.1- Úmido: AutoclaveMateriais: Balão com meio sólido, caixa de ponteira, balão com água, tubo – limpos.

Lâminas usadas, tubos com micro-organismos - descarte.

1.2- Seco:

Estufa de esterilização (ar quente)Pipeta de vidro, placa de petri, utensílios (pinça, espátula) – limpos.

Chama diretaBico de bunsen, alça de platina e balão.

2- FiltraçãoSubstâncias liquídasMaterial: membrana filtrante, seringa, água contaminada, pó (antibiótico ou similar), eppendorf,placas;micro-organismos pelo sistema HEPA: câmara de fluxo; Água pelo sistema milli-Q

3- Baixa temperatura: freezer e ultrafreezer

4- Alta pressão

5- Dissecação: liofilizador

6- Pressão osmótica

7- Radiação7.1- Ionizante: raios gama, raio X - Material: placa de petri descartável, seringa, luvas, cateter

7.2- Não ionizante: raio U.V - Exemplo: câmara de fluxo laminar.

Métodos Químicos de Controle Microbiano

Tipos de desinfetantes

fenolbifenolbiguanidashalogênios: PVPIálcoois: etanol e isopropanolmetais pesados: nitrato de prataantibióticos: tubo com antibiótico


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8 - TÉCNICA DE ESTERILIZAÇÃO POR FILTRAÇÃO

Exame microbiológico da água com membrana filtrante

Os métodos de esterilização empregados em microbiologia utilizam temperatura,radiação ou filtração para eliminação do micro-organismo de materiais, instrumentos, meios de

cultura, soluções ou, ainda, para impedir sua liberação ou penetração num determinadoambiente.Em 1884 Charles Chamberland descreveu o uso de um filtro de porcelana porosa para

remover bactérias da água potável.Os filtros existentes são de porcelana porosa, vidro sinterizado ou de celulose.Os filtros de partículas de ar de alta eficiência (HEPA) são usados nas cabines de

segurança biológica e salas de cirurgia. São de celulose e foram desenvolvidos para promoversegurança contra aerossóis contaminados, retendo quase 100% dos micro-organismosmanipulados na câmara.

Normalmente são usadas para a filtração de substâncias que são termolábeis como

soro, antibióticos, vitaminas, colírios, etc. Após a filtração, o liquido já estéril deve ser coletadoem um recipiente limpo e estéril. Como elas não conseguem reter os vírus, elas são usadaspara separá-los de outros micro-organismos, permitindo assim seu isolamento para estudosposteriores.

A capacidade das membranas filtrantes de reterem os micro-organismos sem matá-losfaz com que elas possam ser utilizadas para exames microbiológicos de líquidos. A membranaconcentra os micro-organismos de um grande volume de amostra. A técnica é sensível paralíquidos com pequena contaminação.

Atividade Prática

1. Esterilizar por autoclave um conjunto para filtração de líquidos;2. Acoplar uma membrana filtrante 0,2µ estéril na base do conjunto;3. Conectar o conjunto na bomba a vácuo;4. Com auxilio de alça de platina transferir um pouco de água (ou leite) não filtrado

para o meio de cultura fazendo estrias;5. Colocar 100 ml de água (leite) sobre o recipiente;6. Ligar bomba de vácuo (pressão negativa) e após filtração desligá-la;7. Colocar a membrana filtrante sobre o meio de cultura de uma placa de petri;8. Com auxilio de alça de platina transferir um pouco de água (ou leite) filtrado para o

meio de cultura fazendo estrias;9. Incubar as placas de petri a 37ºC por 28-24 h;10. Observar resultados:

Membrana filtrante: crescimento de colônias de micro-organismos. Placa com água (leite) não filtrada: crescimento de colônias de micro-

organismos Placa com água (leite) filtrada: ausência de crescimento.


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9- AVALIAÇÃO DA EFICIÊNCIA DA AUTOCLAVE NA ESTERILIZAÇÃO

O processo de esterilização através do uso da autoclave é obtido após 15 minutos a121°C. O método é muito utilizado na esterilização de materiais cirúrgicos, meios de culturaetc. Dada a sua constante utilização no laboratório, torna-se necessário verificarperiodicamente a sua eficiência. Tal verificação pode ser realizada utilizando bioindicador.

Robert Koch utilizava como bioindicador, esporos de Bacillus anthracis, os quais são destruídos a 121 ºC em 15 minutos. Na atualidade, utilizam-se espécies de bactérias nãopatogênicas com resistência térmica conhecida, como por exemplo esporos do Geobacillussthearothermophilus que são destruídos em autoclave a 121 ºC após 15 minutos.

STERIKONR, bioindicador da MERCK, é composto por ampola que contém caldonutriente, açúcares (glicose), indicador de pH (púrpura de bromocresol) e esporos doGeobacillus sthearothermophilus (ATCC 7953) não patogênico.

FUNDAMENTO: Devido a termo-resistência dos esporos quando aquecidos em vaporsob pressão, só serão destruídos a temperatura de 121 ºC por 15 minutos. Se houveresterilização, não haverá crescimento posterior do Geobacillus sthearothermophilus. Caso

contrário, ocorrerá seu desenvolvimento.Procedimento:

colocar ampola contendo esporos de Geobacillus sthearothermophilus junto com omaterial a esterilizar;

realizar o processo a 121 ºC por 15 minutos; após a autoclavagem, incubar a ampola, juntamente com uma ampola controle (que não

sofreu o processo de autoclavação), em banho-maria a 56 ºC; por 24-48 horas; após tal procedimento, realizar a interpretação do teste.

Interpretação

Ocorrendo a esterilização, a solução contida na ampola permanecerá violeta, nãohavendo mudança do indicador (púrpura de bromocresol).

Não ocorrendo esterilização, os esporos se transformarão em bactérias ativas (formasvegetativas), turvando o caldo. A fermentarão da glicose com a conseqüente produção deácido, modificará o indicador tornando a solução amarela.

O uso de fitas reativas para verificar a autoclavação:

São fitas adesivas empregadas para selar volumes que serão submetidos à ação da

autoclave. Estas fitas contem substância química que muda da cor branca para vários tons decastanho, até ao negro, de acordo com o grau de aquecimento a que foi submetida. É útil paranos revelar que o material atingiu certa temperatura, mas não indica que o mesmo estáestéril. As fitas indicadoras auxiliam na diferenciação dos pacotes que já passaram peloprocesso de esterilização, evitando que pacotes não processados sejam utilizados.

Ao término de um procedimento correto de esterilização, os produtos no interior daautoclave estarão esterilizados. O ar da sala contém partículas de poeira que podem contermicro-organismos. Logo, ao remover a carga da autoclave, esta será superficialmentecontaminada. Além do mais, normalmente os artigos esterilizados são armazenados por algumtempo antes de serem utilizados. O material deve ser acondicionado em embalagens paraevitar a recontaminação após a esterilização. Ao mesmo tempo, o material da embalagemdeve ser adequado para permitir a esterilização dos artigos contidos dentro da mesma.


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10 - LAVAGEM DAS MÃOS

As mãos devem ser lavadas antes e após todo e qualquer procedimento. É a lavagemdas mãos que evita a infecção cruzada, ou seja, a veiculação de micro-organismos. A lavagemdas mãos, tem por finalidade: diminuir o número de micro-organismos; eliminar sujidade,substâncias tóxicas e medicamentosas; evitar a disseminação de doenças; proteger a saúdedo profissional.

As mãos devem ser lavadas: sempre que entrar ou sair da Unidade de Internação;sempre que estiverem sujas; antes e após contato com o paciente; após contato com fonte demicro-organismo (secreções e fluidos corporais); sempre que manipular materiais ouequipamentos que estão ou estiveram conectados a pacientes; antes e após o preparo demedicações, de materiais ou equipamentos.

O Iodo é um agente microbicida de alta eficiência contra todas as espécies de bactérias,e também esporicida, fungicida, viricida e amebicida. É utilizado como um agente anti-sépticona forma de tintura de iodo. É também utilizado na forma de substâncias denominadasiodóforos, que são complexos de iodo com compostos que atuam como carreadores e agentessolubilizadores do iodo, como a polivinilpirrolidona. Os iodóforos são germicidas e não coram e

nem irritam a pele. O filme protetor proporcionado pelo PVPI faz com que o iodo seja liberadogradativamente, tornando seu efeito germicida mais prolongado. Mesmo após váriasaplicações, o efeito residual não provoca irritação. Indicado na anti-sepsia e degermação dasmãos e dos antebraços da equipe cirúrgica, laboratorial, ambulatorial e no preparo do campooperatório.

O Mecanismo de ação não é completamente conhecido, mas acredita-se nahalogenação da tirosina e inativação de enzimas.

O álcool é um desinfetante e anti-séptico, que possui de 70 a 90 % de eficiência contracélulas vegetativas. As propriedades bactericidas aumentam com a cadeia de C. Não éeficiente contra esporos (Bacillus anthracis). Mecanismo de ação: solvente de lipídeos,desnaturação e coagulação de proteínas.

Técnica da lavagem das mãos com água e detergente

1- abrir a torneira;2- molhar as mãos;3- passar o sabão;4- friccionar bem;5- passar as mãos ensaboadas sobre a torneira;6- conserva-la aberta;7- proceder assim:

- palma com palma- palma no dorso da mão (incluso entre os dedos)- dorso na palma (incluso os dedos)- ponta dos dedos- polegares- costas das mãos- unhas.8- esfregar os punhos de maneira circular, até a metade do antebraço;9- Enxaguar as mãos e com as mãos em concha, jogar água sobre a torneira;10- pegar o papel toalha estéril e secar as mãos;11- com o mesmo papel, secar a torneira e fechá-la.


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Técnica da lavagem das mãos com Polivinilpirrolidona-Iodo 10% (PVPI)

Proceder conforme técnica de lavagem das mãos, porém, usar PVPI em vez de detergente.

Técnica da lavagem das mãos com álcool

Proceder conforme técnica de lavagem das mãos, porém, usar álcool em vez de detergente.

Atividade prática:

Aluno da bancada 1:1- passar o dedo indicador sobre o meio de cultura (ágar nutriente) da placa de petri;2- Lavar as mãos com água corrente e água destilada, enxugar com papel toalha estéril;3- passar o dedo indicador sobre o meio de cultura (ágar nutriente) da placa de petri.

Aluno da bancada 2:4- passar o dedo indicador sobre o meio de cultura (ágar nutriente) da placa de petri;5- Lavar as mãos com água e detergente conforme técnica descrita acima;6- passar o dedo indicador sobre o meio de cultura (ágar nutriente) da placa de petri.

Aluno da bancada 3:7- passar o dedo indicador sobre o meio de cultura (ágar nutriente) da placa de petri;8- Lavar as mãos com PVPI conforme técnica descrita acima;9- passar o dedo indicador sobre o meio de cultura (ágar nutriente) da placa de petri.

Aluno da bancada 4:

10- passar o dedo indicador sobre o meio de cultura (ágar nutriente) da placa de petri;11- Lavar as mãos com álcool 70 conforme técnica descrita acima;12- passar o dedo indicador sobre o meio de cultura (ágar nutriente) da placa de petri.Incubar as placas invertidas em estufa a 37°C/ 18 a 24 h. Observar os resultados.


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11- AVALIAÇÃO DA AÇÃO ANTIMICROBIANA DE ANTISSÉPTICOS E DESINFETANTES

As substâncias químicas utilizadas para desinfecção ou anti-sepsia são divididas emvários grupos: fenol e compostos fenólicos, álcoois, halogênios (iodo e cloro), metais pesadose seus compostos e detergentes.

Um agente químico ideal deve ter as seguintes características: atividade antimicrobiana,solubilidade em água ou solventes, estabilidade durante armazenamento, ausência detoxicidade para homem e animais, inativação mínima por material estranho, atividade emtemperaturas ambiente, poder de penetração limitado ao local de aplicação, ausência depoderes corrosivos e tintoriais, poder desodorizante, capacidade detergente, disponibilidade ebaixo custo.

A seleção de uma substância química antimicrobiana deve levar em consideração:1. Natureza do material a ser tratado: tecido vivo ou objeto inanimado2. Tipo de micro-organismo3. Condições ambientais: tempo de contato, temperatura, pH, presença de matéria

orgânica, presença de água, etc.

Principais grupos de desinfetantes e anti-sépticos

FENÓIS: Mata rapidamente as células vegetativas. São muito tóxicos para os tecidos.Mecanismo de ação: desnaturação de proteínas; agente ativo de superfície (surfactante)precipita proteínas celulares e rompe a membrana citoplasmática.

ÁLCOOIS: 70 a 90 % eficientes contra células. vegetativas. Propriedades bactericidasaumentam com a cadeia de C. Não é eficiente contra esporos (Bacillus anthracis). Mecanismode ação:solvente de lipídeos, desnaturação e coagulação de proteínas.

HALOGÊNIOS: são fortes agentes oxidantes.Iodo: bactericida, esporicida, fungicida, amebicida e viricida. Pouco solúvel em água e maissolúvel em álcool. Mecanismo de ação:não está completamente conhecido, mas acredita-se nahalogenação da tirosina e inativação de enzimas.Cloro: desinfetante mais utilizado. Atuam sobre bactérias, fungos, vírus. Hipocloritos contém ogrupo químico -OCl. Os mais usados são Ca(OCl)2 e NaOCl. Cloraminas são mais estáveisque os hipocloritos.Mecanismo de ação:desnaturação de proteínas; dissolvidos em água hidrolisam originandoácido hipocloroso oxigênio nascente (agente oxidante poderoso).

DETERGENTES ou SURFACTANTES: São compostos que diminuem a tensão superficial esão utilizados para limpar superfícies.Os detergentes são classificados em 3 grupos principais: aniônicos (Duodecil sulfato de sódio),catiônicos (cloreto de cetilpiridínico), não-iônicos (polissorbato 80)Muitos detergentes antimicrobianos pertencem ao grupo catiônico, sendo que os não-iônicosnão possuem esta atividade.

A avaliação do poder antimicrobiano dos desinfetantes e anti-sépticos pode ser feita emlaboratório. São empregadas as técnicas de diluição em tubo, inoculação em placas, e a docoeficiente fenólico. Os micro-organismos usados para o teste são Staphylococcus aureus ouSalmonella typhi


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Atividade prática

Preparar placa de Petri com meio Agar nutriente. Após solidificação fazer orifícios no Agar para colocação do agente químico a ser testado

Preparo da suspensão bacteriana em soro fisiológico. Obter turvação equivalente aotubo 0,5 da escala de McFarland, feita com sulfato de bário. Isto é, 10 5 a 106 UFC/ mL(Unidades Formadoras de Colônias).

Espalhamento da suspensão bacteriana no meio sólido com auxilio de “swab” (técnicade sementeira de superfície)

Secagem da placa por 5 a 10 minutos em estufa a 37°C Colocar um pequeno volume das substâncias a serem testadas nos orifícios Incubar a placa por 24-48 h a 37ºC Observar aparecimento de zona de inibição, isto é ausência de crescimento.

Resultados:Substâncias: fenol, Pinho, água sanitária.

Tamanho do halo de inibição (mm)Concentrações100% 1:2 (50%) 1:4 (25%) 1:8 (12,5%) 1:16 (6,25%) 1:32 (3,125%)

FenolPinho Águasanitária

Conceitos: Anti-sepsia - eliminação de micro-organismos de tecidos vivos Assepsia – conjunto de medidas para evitar a contaminação de materiais, instrumentos, meiosde cultura, etc com micro-organismos.Desinfecção – eliminação de micro-organismos de tecidos mortos ou de objetos inanimados


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12- TÉCNICAS DE INOCULAÇÃO DE BACTÉRIAS EM MEIOS DE CULTURAS

Os micro-organismos necessitam de um meio de cultura adequado para seucrescimento “in vitro”. Além dos componentes presentes no meio, existem outros fatoresambientais que interferem no seu desenvolvimento, tais como temperatura (psicrófilas,mesófilas, termófilas e termófilas extremas), tensão de oxigênio (aeróbias, anaeróbiasobrigatórias, microaerófilas e anaeróbias facultativas), pH, intensidade luminosa, pressãoosmótica e salina.

A inoculação de um micro-organismo em um meio de cultura que possua todos osrequisitos físico-químicos favoráveis permite que o mesmo inicie seu desenvolvimento. Nestedesenvolvimento da cultura ocorrem todas as fases do crescimento (fase de latência ouadaptação, fase logarítmica, fase estacionária, e morte). Estas fases podem ser plotadas emum gráfico em função do tempo de incubação, gerando a curva de crescimento.

A fase logarítmica (exponencial) é caracterizada por divisões sucessivas (cissiparidade),originando a formação de um agrupamento de bactérias da mesma espécie, que em meiosólido, é denominada colônia. Teoricamente a colônia se origina a partir de uma célula,podendo ser visualizada sem o auxílio de microscópio, sendo, portanto, considerada como

característica macroscópica das bactérias.Como cada espécie possui um tipo morfológico colonial diferente, estas deverão seranalisadas quanto à elevação, forma, tamanho, bordas e pigmentação, sendo, portanto maisum critério a ser empregado na identificação da cultura bacteriana.

Culturas puras propiciam o desenvolvimento de um único tipo de colônia, ao contráriodo resultado do crescimento de tipos variados de colônias em culturas mistas. Emmicrobiologia, há várias técnicas de inoculação de micro-organismos; algumas são utilizadaspara exames qualitativos e outras para exames quantitativos (contagem de bactérias).

TÉCNICAS DE INOCULAÇÃO

NORMAS UTILIZADAS

A) O fio e a alça de platina devem sempre ser esterilizados antes e depois de qualquerinoculação. Para a coleta de material, devem ser esfriados na parte interna do recipiente com omeio, antes de tocar na cultura.B) Os recipientes (tubos de ensaio, placas de Petri, etc) com meio de cultura devem sersempre abertos próximo ao bico de Bunsen;C) A boca do tubo de ensaio deve ser flambada na chama do bico de Bunsen após a retirada eantes da colocação da tampa(algodão ou plástico). A tampa nunca deve ser colocada sobre obalcão, sendo retirada e mantida segura pelo dedo mínimo da mão direita durante o processode inoculação.

TÉCNICAS DE SEMEADURA EM MEIOS LÍQUIDOS (CALDOS)

Com auxilio de alça de platina, retirar inóculo de E. coli do meio liquido e transferir parameio liquido.

TÉCNICA DE SEMEADURA EM MEIO SÓLIDO INCLINADO

Com auxílio da alça de platina, retirar inóculo de Serratia marcescens do meio sólido efazer estrias na superfície do ágar.


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TÉCNICA DE SEMEADURA EM MEIO SÓLIDO EM TUBO (PICAGEM PROFUNDA)

Inocular a cultura em meio sólido utilizando a agulha de platina. A inoculação deverá tera profundidade de 2/3 do meio e não deverá ser mais do que uma única picada.

TÉCNICA DE SEMEADURA EM MEIO SÓLIDO EM PLACA (TÉCNICA DE ESGOTAMENTO)

Consiste em depositar sobre um ponto da superfície do meio de cultura uma alíquota doinóculo e depois espalhá-lo em dois ou três setores, por meio de alça de platina, semrecarregá-la, de maneira a obter quantidades progressivamente menores do inóculo. Temosque obter rarefação suficiente do inóculo, de modo a formar colônias perfeitamente isoladas.

O sucesso da semeadura depende:- tomada de pequena quantidade de inóculo para semear;- grande número de estrias;- não perfurar o meio;- não voltar a alça sobre a estria.

Com auxilio de alça de platina, transferir o inóculo de Micrococcus luteus do meio liquido paraplaca de Petri fazendo estrias compostas.

TÉCNICA DE SEMEADURA EM PLACA EM PROFUNDIDADE (POUR-PLATE)

Pode ser realizada com o objetivo de se obter colônias isoladas (estudo qualitativo) ou pararealizar a contagem de colônias em placa (estudo quantitativo):

Realizar diluições de um cultivo bacteriano:1. Retirar 0,1 ml de inóculo de S. epidermidis do meio liquido e transferir para tubo

contendo 0,9 ml de salina. Retirar 0,1 ml do tubo 1 (diluição 10 -1) e transferir para tubo2, e assim sucessivamente até o tubo 8.

2. Transferir 0,1 mL dos tubos de diluição para a placa de Petri vazia e estéril; (bancada1: diluição 10-5, bancada 2: diluição 10-6, bancada 3: diluição 10-7, bancada 4: diluição10-8);

3. Depositar na placa 15 a 20 mL de ágar fundido (+/- 45ºC);4. Realizar movimentos circulares para que ocorra a incorporação do inóculo diluído no

meio;5. Esperar solidificar e inverter a placa.


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TÉCNICA DE INOCULAÇÃO POR SEMENTEIRA DE SUPERFÍCIE

É realizada com “swabs” contendo o inóculo do micro-organismo, sendo este espalhadopor toda a superfície do meio de cultura sólido contido em placa de Petri.Observação: Geralmente, o inóculo é padronizado segundo o tubo 1 da escala de Macfarland.

IDENTIFICAÇÃO DAS PLACAS E TUBOS:Identifique seu material com as siglas do curso, bancada, bactéria e técnica.

CONDIÇÕES DE INCUBAÇÃO

Após a inoculação, as bactérias deverão ser incubadas em ambiente com tensão deoxigênio e temperatura ideais para o seu desenvolvimento. Como as bactérias que estamostrabalhando são aeróbias ou anaeróbias facultativas e mesófilas, elas devem ser incubadasentre 35oC e 37ºC (estufa bacteriológica) com tensão de oxigênio ambiental. O período deincubação deve ser de 18 a 24 horas porque estas bactérias possuem tempo de geração decerca de 20 a 30 minutos; isto significa que após este período estarão na fase logarítmica decrescimento, sendo visíveis macroscopicamente.

0,1 mL

0,9 mL

0,1 mL

Placa apósincubação


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13- IDENTIFICAÇÃO DE COCOS GRAM-POSITIVOS

Os cocos Gram-positivos são divididos em grupos de acordo com as diferenças dearranjo e tipo de metabolismo celular. Um de seus subgrupos contém os cocos aeróbios e umgênero comum é o Micrococcus, cujas células estão dispostas irregularmente ou em tétrades. As espécies de Micrococcus são saprófitas que vivem no solo e na água. Outro subgrupo decocos Gram-positivos contém aqueles que são facultativos em relação à necessidade deoxigênio. As espécies do gênero Staphylococcus, com suas células agrupadas são os maisconhecidos. Os estafilococos vivem na pele e nas membranas das mucosas do homem e deoutros animais de sangue quente. A principal espécie patogênica é o Staphylococcus aureus,que pode causar infecções pós-operatórias, síndrome do choque tóxico e intoxicação alimentarno homem. Outro gênero conhecido é o Streptococcus, cujas células estão arranjadas empares ou cadeias. O Streptococcus pyogenes é a espécie mais importante sendo o agente daangina estreptocócica, da escarlatina e da febre reumática. Outro patógeno importante é o S. pneumoniae, que constitui a principal causa de pneumonia bacteriana no homem. Outrasespécies como o E. faecalis, fazem parte da flora normal do trato intestinal do homem e dosanimais. Um terceiro grupo de cocos Gram-positivos inclui gêneros de bactérias anaeróbias

tais como os Peptococcus, Peptostreptococcus e Coprococcus. Muitas espécies fazem parteda flora normal do homem e de outros animais de sangue quente.

Estafilococos e Estreptococos

Os estafilococos são cocos Gram-positivos (0,5 a 1,5 μm de diâmetro), que seencontram isolados, aos pares, em tétrades ou em agrupamentos irregulares, semelhantes aum cacho de uvas. São imóveis, não esporulados, geralmente CATALASE positivos e nãoencapsulados. A maioria das espécies é OXIDASE negativa. As espécies de maior interesseclínico (homem: Staphylococcus aureus; animais: S. intermedius) são COAGULASE positivos. A coagulase é uma enzima que reage com um co-fator existente no plasma de algumas

espécies (coelho, cavalo, humano), transformando o fibrinogênio em fibrina. O co-fator éindistinguível da protrombina, porém a enzima se diferencia da tromboquinase, pois, aocontrário desta, não requer a presença de íons Ca2+, nem os fatores 5, 6 e 7 para a suaativação. A capacidade de coagular o plasma continua sendo o critério mais amplamenteutilizado para a identificação dos estafilococos patogênicos.

Os estreptococos são bactérias cocóides Gram-positivas, OXIDASE negativas, quegeralmente crescem em forma de cadeias. A principal diferença bioquímica com osestafilococos é a enzima CATALASE, caracteristicamente AUSENTE nos estreptococos(CATALASE negativos). A catalase é uma enzima capaz de desidrogenar o peróxido dehidrogênio segundo a reação:

2H2O2 2H2O + O2

catalase

A ação ou atividade HEMOLÍTICA dos estreptococos é também útil para a identificaçãodesses micro-organismos. Dependendo da espécie, diferentes tipos de hemólise podem serobservados:

1. Hemólise alfa () leva a destruição parcial dos eritrócitos presentes no meio de cultivo,sendo muitas vezes acompanhada de uma coloração esverdeada.

2. Hemólise beta () leva a formação de uma zona clara, incolor, ao redor da colônia,indicando destruição total dos eritrócitos. Um exemplo de estreptococos -hemolítico é oStreptococcus pyogenes, agente etiológico de faringites, amigdalites, sinusites,erisipela, endocardites e febre reumática.


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ATIVIDADE PRÁTICA

Prova da Catalase

A prova pode ser feita em lâmina ou em tubo. Cultivar o micro-organismo a testar emágar inclinado, por 18 a 24 horas a 37ºC.

Técnica da Prova em lâmina: retirar uma colônia do meio de cultivo e transferir para umalâmina contendo uma gota de peróxido de hidrogênio a 30%. Neste caso, deve-se evitar retirarcolônias de meios contendo sangue para este teste, pois a enzima catalase está presente emeritrócitos e o transporte de eritrócitos para o local da reação pode resultar em resultadosfalso-positivos.

Técnica da Prova em tubo: Adicionar sobre o material cultivado 1 ml de uma solução deperóxido de hidrogênio (água oxigenada) a 30%.

O desprendimento de bolhas de gás indica uma prova positiva.

Observação: Esta prova não é específica para catalase, e sua interpretação deve ser feita levando-se

em consideração demais aspectos de crescimento do micro-organismo. Micro-organismos produtores de uma outra enzima, a PEROXIDASE (também atua sobre operóxido de hidrogênio), como alguns Streptococcus e Aerococcus podem oferecerresultados falsos. Neste caso, pode-se usar a prova da benzidina, específica para adeterminação da peroxidase.

Prova da Coagulase

A prova pode ser feita em lâmina ou em tubo. Contudo a prova em lâmina é menosprecisa e é recomendada apenas para se realizar uma triagem, devendo a prova em tubo serrealizada para confirmação do resultado.

Técnica da Prova em Lâmina: em lâmina de vidro bem limpa, adicionar uma gota dasuspensão bacteriana (densa) a testar, e uma gota de plasma. Misturar com auxílio de umaespátula plástica e observar o aparecimento de grumos nos primeiros 10 segundos.

Técnica da Prova em Tubo: retirar 0,1 ml do meio líquido ou uma colônia isolada do meiosólido de uma cultura da bactéria (a partir de meio BHI, após 24 horas de cultivo) e transferirpara tubo de ensaio contendo 0,5 ml de plasma (ver observações). Incubar em banho-maria a

37ºC, por 1 a 4 horas. Observar a formação de um coágulo no tubo.

Observações: Qualquer plasma pode ser usado, porém o plasma de coelho (obtido usando-se

CITRATO ou EDTA como anticoagulantes) é o mais recomendado. 10 a 15 % das cepas podem produzir resultados negativos em lâmina. Reações após 10

segundos, assim como o uso de células provenientes de meio com alta concentraçãosalina (Ex: ágar manitol salgado), podem dar resultados falso-positivos.

Organismos contaminantes, incluindo bactérias Gram-negativas podem dar resultadosfalso-positivos. Por isso, antes de se testar uma cepa bacteriana, deve-se assegurarque esse micro-organismo possui características morfo-tintoriais compatíveis comestafilococos.


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Pesquisa de estreptococos -hemolíticos na garganta

As melhores placas de ágar sangue para um isolamento primário contém 5% de sanguede carneiro.

Com auxílio de um “swab” estéril coletar material na região das amígdalas e orofaringe(evitar tocar na língua e na úvula). Realizar estrias em meio de ágar sangue (pH 7,3 a 7,4) eincubar a 37ºC. Após 24 horas de cultivo, observar o aparecimento de halos de hemólise aoredor das colônias.Observação: O halo hemolítico é visível, sendo que o crescimento de colônias em meio ágarsangue não é indicativo de hemólise.

Preparo do Meio Agar Sangue:

a) Base para Ágar-Sangue

Extrato de Carne 3,0

Triptose 5,0Cloreto de Sódio 5,0 Agar 15,0 Água destilada 1000 ml

b) Preparo do Agar Sangue

Base para ágar sangue fundido e resfriado a aproximadamente 50ºC 95 mlSangue total ou desfibrinado de coelho ou carneiro 05 ml

Prova de fermentação do Manitol

S. aureus, ao contrário de S. epidermidis e de outras espécies coagulase-negativas, écapaz de fermentar o manitol. A alta concentração de sais presente no meio ágar-manitol inibeo crescimento de outros micro-organismos (exceto enterococos) e permite isolar, de modoseletivo, estafilococos.

Ágar-Manitol

Peptona de carne 10 gExtrato de carne 1 gD-Manitol 10 g

Cloreto de sódio 75 gVermelho de fenol 0,025 g Ágar 15 g Água destilada 1000 mL pH a 25ºC = 7.4


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ATIVIDADE PRÁTICA:

Primeira aula: inoculação da bactéria a ser identificada pelos testes bioquímicos

Alunos da Bancada 1, 3 e 5 – inocular bactéria A conforme procedimento técnico descrito noroteiro para cada teste Alunos da Bancada 2 e 4 – inocular bactéria B conforme procedimento técnico descrito noroteiro para cada teste

Segunda aula:

Execução e avaliação dos testes conforme procedimento descrito no roteiro.Identificação da bactéria inoculada a partir dos testes bioquímicos.

RESULTADOS DOS TESTES E IDENTIFICAÇÃO DAS BACTÉRIAS

Bancada Gram Célula Testes BactériaForma Arranjo Catalase Coagulase Manitol

1234


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14- IDENTIFICAÇÃO DE BASTONETES GRAM NEGATIVOS – PROVAS BIOQUÍMICAS

1 - Provas do IMViC

A identificação de bacilos entéricos é de grande importância para determinar a etiologiade infecções intestinais e outras infecções, bem como contaminações de águas e alimentos.Este grupo de bactérias pode ser encontrado nos intestinos do homem e de certos animais,sendo as mesmas classificadas como pertencentes à família Enterobacteriaceae. Sãobactérias em forma de bastonete, Gram negativas, e sem capacidade de esporulação.Encontramos os seguintes gêneros dentro desta família: Salmonella, Shigella, Proteus,Klebsiella, Escherichia, Enterobacter , Serratia, etc.

A diferenciação das enterobactérias pode ser feita com base em suas propriedadesbioquímicas, em presença de substratos específicos. Um conjunto de provas que auxilia aidentificação e classificação destas bactérias, são as provas do IMViC (Indol, Vermelho deMetila, Voges Proskauer e Citrato).

Neta prática serão utilizadas, na identificação das bactérias, alguns testes bioquímicosincluindo as provas do IMVIC.

A - Prova de Produção do Indol

Objetivo: Determinar a habilidade de certos micro-organismos em decompor o aminoácidotriptofano. A oxidação do referido aminoácido é catalisada pela enzima triptofanase;

N

C H 2

C H C O O H

N H 2

t r i p t o f a n a s e

N

I n d o l

+

a mô n i a

Ác i d o p i r ú v i c

A presença do indol é detectada pela adição do reativo de Kovacs ao meio de cultura. Oreagente é composto por p-dimetilaminobenzaldeido, álcool amílico e ácido clorídrico. O indolforma complexo com o p-dimetilamino-benzaldeido, o qual têm cor vermelha. Culturas quedesenvolvem a cor vermelha, após adição do reativo de Kovacs, são consideradas indolpositivas.

Procedimento técnico:

Cultivar a bactéria em tubo de ensaio contendo água de peptona, durante 4 dias a 37ºC. Adicionar 0,5 mL (10 gotas) do reativo de Kovacs através da parede interna do tubo. Agitarsuavemente e observar. A formação de um anel de coloração vermelha é indicativo depositividade do teste.

B - Reação do Vermelho de Metila (V. M.).

Objetivo: Determinar a capacidade de certos micro-organismos, em utilizar a glicose com aprodução e estabilização de altas concentrações de ácidos como produtos finais dosprocessos fermentativos.

Nesta prova o vermelho de metila indica a presença de elevadas concentrações de

ácidos como produtos finais. Em pH em torno de 4 o indicador se torna vermelho, o qual éindicativo de positividade do teste. Em pH 6, ainda indicativo da presença de ácidos em baixas

triptofano


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concentrações, o vermelho de metila assume a coloração amarela, o que é indicativo danegatividade do teste.

A prova é útil para separar a Escherichia coli de Enterobacter aerogenes. Ambos osmicro-organismos produzem inicialmente ácidos orgânicos em estágio precoce da incubaçãoda cultura. O pH baixo é estabilizado e mantido por E. coli até o final da incubação. Durante otempo que a cultura de E. aerogenes permanece na estufa, ocorre a conversão enzimáticadestes ácidos em produtos não acídicos, tais como o álcool etílico e a acetoína (acetil metilcarbinol), resultando em elevação do pH (aproximadamente 6).


Cultivar a bactéria durante 4 dias, em tubo de ensaio contendo meio de Clark & Lubs,em estufa a 37ºC. Adicionar 8 gotas de solução de vermelho de metila. Agitar e observar.Coloração avermelhada é indicativo de positividade do teste, já a cor amarela indicanegatividade do mesmo.

C - Teste de Voges-Proskauer (V.P.)

Objetivo: Detecção da acetoína Algumas bactérias fermentam a glicose com produção de ácido acético que, posteriormente,se transforma em produtos neutros como acetil-metil-carbinol (acetoína).

Em presença de oxigênio, acetoína forma diacetil que, ao reagir com KOH, forma umcomplexo de cor róseo-avermelhada.

Glicose acido acético (ac. orgânico) acetoina (neutro) +O2 diacetil +KOH complexoróseo avermelhado


Cultivar a bactéria durante 4 dias em tubo de ensaio contendo caldo Clark & Lubs, emestufa a 37ºC. Adicionar ao tubo 10 gotas de solução A de Barritt (alfa-naftol 5%) e agitar.Imediatamente adicionar 10 gotas da solução B de Barritt (KOH 40%) e deixar em repouso por15 minutos. Examinar e registrar a cor do meio. O aparecimento de coloração rósea éindicativo da positividade do teste.

D - Prova de Assimilação do Citrato

Objetivo: Verificar a capacidade do micro-organismo em assimilar citrato como fonte de

carbono. É detectada a presença da enzima citrato permease. Alguns micro-organismos são capazes de utilizar citrato como única fonte de carbono na

ausência de glicose ou outro açúcar fermentável. A enzima citrato permease, transporta ocitrato para o interior da célula, onde sofre a ação da enzima citrase, produzindo o ácidooxaloacético e o ácido acético. Estes produtos são enzimaticamente convertidos em ácidopirúvico e dióxido de carbono. Durante esta reação o meio se torna alcalino, pois o dióxido decarbono combina com o sódio do meio formando carbonato de sódio, um produto alcalino. Apresença do carbonato de sódio muda a cor do indicador azul de bromotimol incorporado aomeio, do verde para o azul.

As culturas citrato-positivas são identificadas pela presença de crescimento de colôniasna superfície do meio que possui coloração azul.


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Inocular a bactéria na superfície inclinada de um tubo contendo ágar citrato de Simmons(pH=7,3-verde). Incubar a cultura a 37ºC durante 24 a 48 horas. Observar os tubos paraverificar ou não a presença de crescimento e cor azul.

2 - Produção de Ácido Sulfídrico (H2S)

Objetivo: detecção da produção de ácido sulfídrico

Alguns micro-organismos são capazes de produzir ácido sulfídrico através da utilizaçãode substratos que contêm aminoácidos com enxofre, ou compostos inorgânicos de enxofre.

O ácido sulfídrico pode ser produzido pela redução do enxofre orgânico presente nacisteína, a qual é componente das peptonas incorporadas ao meio de cultura. As peptonas sãodegradadas por enzimas microbianas em aminoácidos, incluindo a cisteína. Este aminoácido,em presença da enzima cisteína desulfurase, perde o enxofre, o qual é reduzido para formar oácido sulfídrico, segundo a equação abaixo representada.

HS-CH2 -CHNH2-COOH H3C-CO-COOH + NH3 + H2Scisteína ácido pirúvico amônia ácido sulfídrico

O ácido sulfídrico produzido é liberado do meio e reage com o acetato de chumbocontido em tira de papel de filtro colocada na parte inferior da boca do tubo de cultura. Aformação de coloração negra indica a presença de H2S, de acordo com a seguinte equação:

H2S + (H3C-COO)2Pb PbS + 2 H3C-COOHácido sulfídrico acetato de chumbo sulfeto de chumbo ácido acético

O sulfeto de chumbo é um precipitado de cor negra.


Inocular a bactéria em estudo em tubo de ensaio contendo água de peptona. Após ainoculação colocar no interior do tubo, na parte superior e fixa na tampa, uma tira de papel defiltro impregnada com solução de acetato de chumbo. Cultivar a bactéria durante 4 dias a37ºC. O aparecimento de cor negra no papel indica positividade do teste.

3 - Cultivo em Agar-Eosina Azul de Metileno (EMB, Eosin Methylene Blue Agar)

Os meios diferenciais são utilizados para caracterizar grupos de micro-organismos,baseando-se em modificações visuais que podem ocorrer nas colônias ou no meio de cultura.O ágar EMB contendo lactose e os corantes eosina azul de metileno permite a diferenciaçãoentre micro-organismos entéricos que fermentam e que não fermentam a lactose, bem comoidentificar colônias de Escherichia coli , a qual produz colônias azul-escuras com brilho metálicodevido a grande quantidade de ácido que ela produz.


Inocular as bactérias em estudo em placas contendo ágar EMB. Incubar a 37ºC por 48horas. Observar o aparecimento de colônias e a cor das mesmas.


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4 – Hidrólise do amido

Objetivo: detecção da atividade da enzima amilase

O amido é um polímero composto de moléculas de glicose unidas entre si por ligaçõesglicosídicas. Esse precisa ser hidrolisado antes de ser transportado para o interior da célulabacteriana. A enzima extracelular responsável pela hidrólise do amido é a amilase. A açãodessa enzima é evidenciada pela ausência de amido ao redor da colônia crescida em meiosólido contendo amido (0,2%), após adição de iodo (lugol) sobre o meio.

Se o iodo reagir com o amido, será formado um complexo de cor azul, indicando testenegativo para a amilase. O aparecimento de zonas claras ao redor das colônias indica testepositivo para a presença de amilase.


Inocular as bactérias em estudo, fazendo estrias simples sobre a superfície do meioágar amido. Incubar as placas por 48 horas a 37ºC.

Após incubação, adicionar solução saturada de iodo (Lugol) sobre o meio de cultura.ATIVIDADE PRÁTICA:

Primeira aula: inoculação da bactéria a ser identificada pelos testes bioquímicos

- Alunos da Bancada 1 e 3 – inocular bactéria A conforme procedimento técnico descrito noroteiro para cada teste;- Alunos da Bancada 2 e 4 – inocular bactéria B conforme procedimento técnico descrito noroteiro para cada teste;- Alunos da Bancada 5 – inocular bactéria C conforme procedimento técnico descrito no roteiro

para cada teste.

Segunda aula:1. Execução e avaliação dos testes conforme procedimento descrito no roteiro.2. Identificação da bactéria inoculada a tabela de diferenciação de Enterobacteriaceae por

testes bioquímicos.


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ANEXOS

Meios de Cultura e Reagentes.

1 - Água de peptona

Peptona 2 gCloreto de sódio 0,5 g Água destilada 100 ml

Ajustar o pH entre 7,4 e 7,6. Distribuir em tubos e esterilizar a 120 ºC durante 15minutos.

2 - Agar Eosina Azul de Metileno (EMB Agar).

Peptona 10 gLactose 5 g

Sacarose 5 gFosfato monoácido de potássio 2 gEosina amarela 0,4 g Azul de metileno 0,065 g Agar 13,5 g Água destilada 1000 mL

Fundir o ágar na água destilada e, a seguir, acrescentar os outros componentes. Acertaro pH em 7,2. Autoclavar a 120 ºC por 15 minutos.

3 - Meio de Clark & Lubs

Glicose 0,5 gPeptona 0,5 gFosfato dibásico de potássio 0,5 g Água destilada 100 ml

Autoclavar a 120 ºC durante 15 minutos. Deixar esfriar e acrescentar 5 ml de solução deglicose a 10 % previamente esterilizada por filtração. Distribuir o meio em tubos de ensaio emporções de 10 ml.

4 - Agar Citrato de Simmons.

Fosfato biácido de amônio 1 gFosfato monoácido de potássio 1 gCloreto de sódio 5 gCitrato de sódio 2 gSulfato de magnésio 0,2 g Azul de bromotimol 0,08 g Agar 15 g Água destilada 100 mL

Fundir o ágar na água destilada. Dissolver os outros componentes e acertar o pH em

6,9. Distribuir o meio em tubos de ensaio em volume suficiente para uma placa de Petri. Autoclavar a 120ºC por 15 minutos.


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5 - Solução de Barrit A.

α - naftol 5 g Alcool etílico absoluto 95 mL

6 - Solução de Barrit B.

Hidróxido de potássio 40 gCreatina 0,3 g Água destilada 100 mL

Dissolver o hidróxido de potássio na água destilada.

7 - Solução de vermelho de metila.

Vermelho de metila 0,1 g

Álcool etílico 95 % 300 mL Água destilada 200 mL

Dissolver o vermelho de metila no álcool. Acrescentar a água destilada.

8 - Reativo de Kovacs.

Álcool amílico 75 mLp-dimetilaminobenzaldeido 5 g Ácido clorídrico concentrado 25 mL

Dissolver o p-dimetilaminobenzaldeido no álcool amílico e, a seguir, acrescentar o ácidoclorídrico.

9- Ágar amido

Peptona 15 gExtrato de carne 3 g Amido solúvel 2 g Ágar 15 Água destilada qsp 1000 ml


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15- ANTIBIOGRAMA

Introdução

O antibiograma é uma prova laboratorial para avaliar a sensibilidade ou resistência dedeterminado micro-organismo frente a diferentes antimicrobianos.

A proposta primária deste teste é guiar o clínico na escolha do agente apropriado para aterapia. Além disso, estes testes são utilizados para avaliar “in vitro” a atividade de novosagentes, e auxiliar no mapeamento bactérias resistentes emergentes. A suscetibilidadeantimicrobiana pode ser reportada qualitativamente como sensível, intermediário ou resistente;ou quantitativamente em termos de MIC (minimum inhibitory concentration) ou MBC (minimumbactericidal concentration).

1. Teste Quantitativo da sensibilidade aos antimicrobianos: Método de diluição: consisteem preparar sucessivas diluições dos antibióticos em meio sólido ou líquido e emseguida semear a bactéria em estudo. Após incubação determina-se MIC e/ou MBC.

2. Método de difusão de Bawer e Kirby: é um teste qualitativo, no qual discos de papelimpregnados com o antibiótico são colocados na superfície do ágar uniformementesemeado com o micro-organismo. A droga se difunde no ágar e produz inibição doagente sensível, formando um halo de inibição que deve ser medido e comparado comtabelas padronizadas.

O método deverá ser executado a partir de culturas puras, pois o padrão desensibilidade ou resistência dos micro-organismos é muito variado. Se em determinadomaterial biológico encontrarmos tipos de bactérias diferentes, temos que realizar umantibiograma para cada espécie de micro-organismo isolado.

O resultado do antibiograma só é válido para o micro-organismo em estudo. Assim

temos, por exemplo, que os resultados para determinada amostra de Staphylococcus aureus isolado de uma urocultura não serve para um Staphylococcus aureus isolado de umacoprocultura.

Realização do antibiograma

Técnica do método de difusão:

O inóculo bacteriano tem que ser padronizado devendo conter de 105 a 106 UFC/mL(Unidades Formadoras de Colônias por mL). Padronizar suspensão da bactéria em soluçãofisiológica, com turvação equivalente ao tubo nº 0,5 da Escala de McFarland. A Escala de

McFarland constitui-se de 10 tubos numerados onde temos volumes crescentes de mistura deácido sulfúrico e hidróxido de bário, a qual dará um precipitado de sulfato de bário, produzindoturbidez característica.

1. Sature um swab de algodão com a suspensão bacteriana.2. Remova o excesso de umidade girando o swab contra a parede do tubo.

3. Semeie a suspensão por espalhamento, em placa contendo ágar Muller-Hinton,utilizando sucessivamente três direções para obter um inóculo uniformementeespalhado sobre toda a superfície do ágar (Fig 2).

O ágar Mueller Hinton contém baixos teores de timina e timidina, substâncias que sãoantagonistas das sulfas. As sulfas bloqueiam na bactéria a síntese do ácido fólico, não

SWAB

Figura 1


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ocorrendo assim síntese de ácidos nucléicos e, tendo como conseqüência, a morte dabactéria. Altos níveis de timina e timidina favorecem a formação de ácidos nucléicos por outravia impedindo a ação das sulfas. O meio contém ainda baixos teores de íons cálcio emagnésio, os quais, quando em concentrações elevadas, interferem na ação dosaminoglicosídeos.

Com auxílio de uma pinça, distribua cinco discos de diferentes antibióticos sobre asuperfície do ágar inoculado, seguindo o esquema abaixo (Fig 3). A seleção dos discos develevar em consideração o tipo de bactéria e a procedência do material biológico (local dainfecção). Os discos serão colocados à distância considerável uns dos outros e da borda da

placa, a fim de evitar a confluência dos halos de inibição.

4. Pressione levemente os discos para que não se desprendam durante a incubação.5. Incube as placas por 24 horas a 37°C.

Análise dos Resultados

Medir o halo de inibição do crescimento (em milímetros) e comparar com tabelaspadronizadas. A simples formação do halo não é indicativo de sensibilidade da bactéria aoantibiótico, em níveis terapêuticos. Temos que levar em consideração o tamanho do halo, tipode bactéria e a concentração do antibiótico. Deve-se observar halos nítidos e bem definidos. Otamanho do halo não indica necessariamente que uma bactéria é mais sensível a umdeterminado antibiótico que a outro.

Os valores das tabelas vão se alterando à medida que as bactérias vão se tornandomais resistentes.

Através da análise dos resultados poderemos classificar os micro-organismos testadosem: “resistente”, “intermediário”, “moderadamente sensível”, e “sensível”, dependendo daformação ou não de halo inibitório e também de seu diâmetro.

No caso de formação de um halo inibitório, este deve ter seu diâmetro medido, e amedida encontrada deve ser comparada com tabelas padronizadas (Fig 5) . De modo geral,estas tabelas determinam medidas de diâmetro, e dessa forma a medida encontrada em cadacaso pode então ser enquadrada em uma das quatro categorias supracitadas.

Figura 2

Figura 3


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Exemplo de Tabela de Halos de Sensibilidade

AntimicrobianoCódigo

[µg]Halos de Inibição (mm)

Resistente IntermediárioModeradamente sensível

Sensível

Bacitracina BAC 10 < 8 9 a 12 - > 13Cefotaxima CTX 30 < 14 - 15 a 22 > 23Gentamicina GEN 10 < 12 13 a 14 - > 15

Tetraciclina TET 30 < 14 15 a 18 - > 19Vancomicina VAN 30 < 9 10 a 11 - > 12

Exemplo: Se para um determinado micro-organismo, utilizando-se o antimicrobianoGentamicina, foi medido o diâmetro de um halo de inibição e constatou-se que este era de 16mm, tal micro-organismo deve ser classificado como sensível para a Gentamicina. Entretantose o diâmetro do halo fosse de 13 mm o micro-organismo seria classificado como intermediárioa Gentamicina. No caso de não formação de um halo de inibição, o micro-organismo seriaconsiderado resistente.

Observações

1) Na leitura do halo de inibição, pode-se observar o aparecimento de “véu” dentro do mesmo(Pseudomonas e Proteus). Fazer a leitura normalmente, ignorando o véu. Esse fato ocorreporque estes micro-organismos são extremamente móveis.

2) Poucas colônias dentro do halo sugerem mutantes, os quais devem ser ignorados.

Figura 4


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16 - PROPRIEDADE OLIGODINÂMICA DE METAIS

Alguns metais pesados são muito tóxicos e altamente reativos, como por exemplo, Hg(mercúrio), Ag (prata), Pb (chumbo), Zn (zinco) e Cu (cobre). Eles possuem capacidadeoligodinâmica, isto é capacidade de exercer efeito letal sobre as bactérias mesmo emquantidades extremamente pequenas.

No inicio do XX o cloreto de mercúrio era amplamente usado como um desinfetantegeral, porém pelo seu efeito tóxico foi substituído por outros agentes.

Compostos de Mercú

Appostilas de Práticas de Microbiologia

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