Apostila Experimental

UNIVERSIDADE ESTADUAL DA PARABA

CENTRO DE CINCIAS E TECNOLOGIA

DEPARTAMENTO DE QUIMICA

MICROBIOLOGIA EXPERIMENTAL

PROFESSORAS:

ELIANE ROLIM FLORENTINO HELVIA W. CASULLO DE ARAJO

WERUSKA BRASILEIRO FERREIRA

CAMPINA GRANDE

2010

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Microbiologia experimental Prof.

a Eliane Rolim [email protected]; Prof.a Helvia Casullo [email protected];

Profa Weruska Brasileiro [email protected]

1.Tcnicas Bsicas em Microbiologia e Segurana Laboratorial

A finalidade das aulas prticas de microbiologia demonstrar ao estudante as

metodologias e princpios usados em laboratrio de microbiologia, reforando conceitos

tericos estudados. Nas aulas sero utilizados vrios microrganismos, os quais so bastante

vulnerveis e alguns patognicos. Desta forma, essencial observar normas de segurana

no laboratrio, para evitar principalmente contaminao dos estudantes, tcnicos e

professores e impedir a contaminao dos dispositivos experimentais por microrganismos

estranhos ao estudo.

1.1 Regras Gerais de Conduta e Segurana Laboratorial

O laboratrio um lugar que pode ter o seu potencial de risco de acidentes

diminudo desde que certas regras de conduta e segurana sejam obedecidas.

fundamental se ter critrio, planejamento, conhecimento e calma no trabalho.

O uso de bata de algodo branco, comprido e abotoado, essencial no laboratrio

de Microbiologia, pois o mesmo protege a roupa de contaminao. O aluno deve

usar calas compridas e sapato fechado para evitar acidentes, e aqueles de cabelos

compridos devem mant-los presos.

Deixar os materiais como bolsas, pastas, livros e cadernos em local reservado e

nunca sobre as bancadas de trabalho.

No comer, no beber, nem fumar no laboratrio.

Manter as mos, canetas, lpis e quaisquer objetos sem contato com a boca, olhos

ou ouvidos.

Lavar as mos com detergente e sec-las com papel toalha antes e depois da aula

prtica.

Nunca tentar identificar substncias pela textura, sabor ou odor.

Os extintores de incndios e a caixa de primeiro socorros devem ser colocados em

locais visveis e de fcil acesso.

Manter as bancadas limpas e organizadas.

Ler com ateno o rtulo do produto a ser usado.

Rotular todas as amostras, reagentes, solues, meios de cultura, etc.

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Trabalhar apenas com instrumentos adequados, tomando cuidado especial com os

vidros, que no dever conter pontas ou arestas cortantes.

Proteger o rtulo dos frascos ao verter o seu contedo.

No debruar sobre as bancadas.

Observar as propriedades dos reagentes, solues e meios de cultura para um

adequado acondicionamento e estocagem.

No permitir a entrada de pessoas estranhas no laboratrio.

Manter ateno constante nas aes executadas, evitando movimentao e

conversas desnecessrias que possam causar distraes e provocar acidentes.

O aluno deve deixar o laboratrio apenas aps ter terminado o trabalho prtico do

dia, sem dvidas nas tcnicas realizadas.

1.2. Normas de Trabalho em Microbiologia

No inicio de cada analise traar um plano de trabalho considerando o tempo

necessrio para cada analise e sua leitura.

Trabalhar sempre de maneira ordenada, tranqila, constante e metdica, evitando

movimentos desnecessrios como troca de lugar, assento, etc.

Limpar e sanitizar a superfcie de mesas e balces antes e depois do trabalho de cada

dia.

Efetuar registros de analises, anotando o tipo do produto, procedncia, dia e hora da

entrada no laboratrio e qualquer outra observao previa anlise. Na anlise

propriamente dita anotar: mtodo, meio de cultura empregado e resultados obtidos.

Identificar as amostras antes de iniciar a analise e em geral, no descartar at obter os

resultados.

O material a ser analisado deve ser tocado exclusivamente com instrumentos estreis

e nunca com as mos.

No cheirar os meios de cultura inoculados

Evitar salpicar mesas e pisos com gua ou solues corantes.

Usar bico de Bunsen, entre o material e o analista.

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Cuidado ao acender o bico de Bunsen. Observar se no existem produtos inflamveis

(lcool, ter, acetona etc.) nas proximidades da chama

No caso de derramamento do material inoculado, comunicar imediatamente ao

professor ou ao pessoal tcnico do laboratrio, sanitizar e esterilizar imediatamente (cobrir

a rea com sanitizante adequado e deixar de 15 a 30 minutos antes de limpar).

Vidrarias e materiais devem ser colocados aps o uso em recipientes adequados com

solues de desinfetante.

As pipetas devem colocar algodo na extremidade de suco para evitar contaminao

do material e do analista.

Os tubos de ensaios com cultura devero ser colocados nas estantes ou suportes

adequados, nunca nos bolsos do avental ou deitado sobre as bancadas.

Todo material contaminado (pipetas, bastes, lminas, lamnulas etc.), dever ser

colocado em recipientes adequados (provetas, cubas, ou vidros com desinfetantes), para

serem esterilizados posteriormente; nunca deix-los sobre a mesa de trabalho ou pia.

O material utilizado deve receber a seguinte seqncia de tratamento:

a) Esterilizao em autoclave a 121C durante 30 minutos

b) Lavagem em gua corrente e detergente

c) Secagem em estufa

d) Esterilizao - em autoclave a 121C durante 15 minutos

e) Armazenamento

Os cultivos aps a leitura devem ser esterilizados.

As laminas e lamnulas usadas devem ser colocadas em recipientes com desinfetantes

No retirar qualquer cultivo do laboratrio.

Manter registro do controle dirio de temperaturas das estufas.

Realizar o controle de temperatura ambiental em cmaras asspticas e fluxo laminar.

Analisar conservas e produtos esterilizados somente em cmaras asspticas ou fluxo

laminar.

Ao final do experimento, deve-se limpar a bancada, desligar os aparelhos, fechar o

bico de Busen e lavar as mos antes de sair do laboratrio

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2. Limpeza de Vidraria

2.1 Introduo

O bom desempenho da prtica laboratorial depende da mxima limpeza da

aparelhagem usada.

Para a limpeza da vidraria o cido ntrico ou cido clordrico so meios eficientes.

Os agentes de limpeza alcalinos tais como fosfatos tri-sdico e os detergentes

sintticos so muito teis, mas requerem uma enxaguagem prolongada para eliminao

completa de resduos.

A adio de algumas gotas de azul de bromotimol a 0,04g/L uma maneira de se

testar a presena de resduos alcalinos ou cidos.

Este indicador oferece a vantagem de cor do amarelo ao azul esverdeado na faixa de

pH 6,5 a 7,3.

2.2 Tcnicas de Lavagem

A lavagem deve ser realizada cuidadosamente para que no fiquem resduos cidos

ou alcalinos no material.

Toda a vidraria deve ser guardada limpa e seca. Materiais usados para anlises

microbiolgicas devem ser esterilizados antes e aps o seu uso.

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2.2.1 Limpeza de Material em Uso

Esterilizao em autoclave 121C durante 30 minutos

Retirar todo material lavar com gua da torneira

Deixar o material submerso em gua mais detergente

Escovar o interior de cada utenslio com soluo detergente utilizando escova prpria.

Enxaguar com gua de torneira

Verificar, aps essa operao, se a gua esta escorrendo livremente, sem que haja

reteno.

Enxaguar com gua destilada

Secar em estufa 160/170C durante 1 a 2 horas.

2.3 Preparo de Material Usado em Anlises Microbiolgicas

Preparo de Rolhas de Algodo

As rolhas de algodo so empregadas no vedamento de tubos e frascos em

microbiologia. O algodo utilizado geralmente hidrfobo (no absorvente).

Para se preparar uma rolha, corta-se um quadrado pequeno de algodo (cujo tamanho se

determina pela prtica), dobra-se no lado oposto para fazer um retngulo mais ou menos

3,7 cm de largura e enrola-se formando um cilindro justo. A rolha deve entrar

ajustadamente, devendo estar 1/3 fora da boca do tubo. A fim de se proteger a rolha de

algodo permitindo sua mltipla utilizao, aconselhvel envolver a extremidade da

mesma com um pedao de gaze. Uma rolha deve ser bem feita para poder ser empregada

varias vezes.

Alas de Platina ou de Nquel-Cromo

Empregada para transferncia de um cultivo para um meio de cultura fresco. A ala

empregada para fazer streak (isolamento de culturas) e tambm para inoculao por meio

de repique em tubos de ensaio contendo meio de cultura slido.

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Quando utilizar ala de platina nas prticas, a mesma dever ser aquecida at o rubro,

tanto antes do uso como depois dele. Antes de tocar o material de cultura, deve-se deixar a

ala esfriar, mantendo-a prxima de chama.

Ala de Platina

Pipetas

A pipeta empregada na microbiologia, para transferncia de culturas liquidas e

diluies sucessivas das amostras. O material deve ser aspirado lentamente, mantendo-se a

pipeta com o dedo, mdio e o polegar, com o indicador controlando a vazo do liquido.

importante manter o dedo indicador seco.

Na transferncia de culturas (principalmente em caso de tubos) deve-se evitar

escorrer o liquido nas paredes internas do mesmo. No trabalho com placas,

normalmente a ultima gota do liquido permanece na ponta da pipeta, devendo toca-la na

regio seca da placa. comum colocar-se algodo na extremidade superior da pipeta,

evitando contaminao por bactrias das vias areas superiores e tambm a finalidade de

impedir que o analista se contamine acidentalmente quando trabalhar com microrganismos

patognicos.

Para a esterilizao, as pipetas devem estar adequadamente limpas e secas. Devero

ser embaladas individualmente empregando-se o papel Kraft ou em conjunto utilizando

pipetadores de inox e, em seguida, procede-se a esterilizao.

Placas de Petri

As placas de Petri so usadas para cultivar com meios de cultura slidos. Essa

vidraria deve estar lavada, seca e posteriormente embalada e esterilizada. As placas podem

ser embrulhadas com papel Kraft individualmente ou em conjunto, de acordo com a

rotina de trabalho.

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As placas de Petri com meios de cultura, com ou sem crescimento de

microrganismos, s podero ser abertos nas proximidades da chama, para evitar

contaminao.

No preparo da placa para contagem do tipo pour plate deve-se abrir placa

somente o necessrio para permitir a introduo das pipetas.

Placas de Petri

3. Esterilizao

Esterilizar um material inativar todos os microrganismos nele existentes. Ao ato

de esterilizar, d-se o nome de ESTERILIZAO, ou seja, o processo capaz de destruir

ou eliminar todas as formas vivas de um material ou ambiente. Atravs da esterilizao dos

meios de cultura e dos instrumentos utilizados nos trabalhos de laboratrio, possvel o

isolamento e a manuteno de culturas puras.

A esterilizao pode ser feitas atravs de diferentes processos, empregando-se

agentes fsicos (calor, atrito, radiao, filtrao) e agentes qumicos. A esterilizao pelo

calor de larga aplicao em microbiologia.

Todo material para isolamento e cultivo de microrganismos no laboratrio ,

obrigatoriamente, esterilizado

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3.1 Mtodos de Esterilizao

3.1.1 Calor seco

Nos ambientes secos, eliminao dos microrganismos ocorre pela oxidao ou

queima das protenas presentes no material celular. Isso requer uso de temperaturas

elevadas durante determinados perodos (160C ou 170C durante 1 a 2 horas). A

utilizao do calor seco como processo de esterilizao demanda, geralmente, a

utilizao de estufas ou fornos apropriados (forno de Pasteur), ou a utilizao

direta da chama.

O calor seco ( como forno ou estufa) penetra nas substncias mais

lentamente que o calor mido (vapor) geralmente usado para esterilizar objetos de metal e

vidros.

3.1.1.1 Flambagem em chama direta

A flambagem realizada em chama direta com bico de Bunsen ou lamparina.

Consiste em se passar a ala ou agulha de platina sobre a chama at o rubro, com a

finalidade de esteriliz-las, ou ento as bocas dos tubos de ensaio, ou outros frascos, para

evitar possveis contaminaes pelo ar na transferncia ou inoculao das clulas.

As alas ou agulhas de platina devem ser mantidas em posio vertical ou

ligeiramente inclinadas, de maneira que toda extenso da ala ou agulha fique

demasiadamente rubra. importante observar que deve-se introduzir a ala na parte mais

quente da chama.

Em relao aos frascos e tubos, deve-se evitar aquec-los demasiadamente para

evitar a quebra. Pipetas no devem ser flambadas, pois com o aquecimento pede ocorrer um

dilatamento ocasionando diferenas no volume a ser medido.

3.1.1.2 Ar quente

Empregado para a esterilizao de placas de Petri, pipetas, tubos de diluio, tubos

de ensaios e outras vidrarias. As vidrarias devem ser embaladas em papel apropriado que

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adquire cor parda, no devendo escurecer muito, nem se tornar quebradio. 170 a 180c por

1 a 2 horas

Deve-se deixar o forno ou estufas de esterilizao esfriar por si, pois a abertura do

forno ainda quente provoca variao brusca de temperatura, podendo-se levar quebra do

material.

3.1.2 Calor mido

Esse mtodo de esterilizao provoca a inativao ou coagulao de protenas dos

microrganismos. Embora a maioria dos microrganismos morra as temperaturas inferiores a

100 C, existem bactrias que produzem endsporos resistentes a essa temperatura. A

utilizao do calor mido no indicada para a esterilizao de materiais que podem ser

afetados pela umidade ou pelas altas temperaturas, como alguns acares, protenas e

vitaminas. Geralmente, na esterilizao pelo calor mido utiliza-se o vapor d gua sob

presso ( autoclavagem) ou a tindalizao.

3.1.2.1 Temperatura a 100C

A gua fervente: a imerso de gua fervente empregada para a esterilizao de

instrumentos cirrgicos, seringas ou injeo. A fervura destri quase que instantaneamente

os germes patognicos no esporulados, todavia, no se deve esquecer que h esporos

resistentes ao da gua fervendo, durante 15 minutos ou mais.

3.1.2.2 Vapor fluente

Pode ser feito em autoclave com o orifcio de escapamento aberto.

3.1.2.3 Tindalizao

Consiste num processo de esterilizao fracionada, efetuado o aquecimento a

100C por em intervalos de 24 horas em trs vezes consecutivas. Tyndall (1877) verificou

que repetindo o aquecimento 2 ou 3 dias consecutivos, consegue-se destruir todas as

bactrias. D-se o nome de tindalizao ou esterilizao fracionada a esse aquecimento,

com intervalo adequado.

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1 aquecimento: destri apenas as formas vegetativas, no destruindo os esporos.

Resfriamento: germinao.

2 aquecimento: morte das formas vegetativas dos esporos poupados no primeiro

aquecimento. Resfriamento: germinao

3 aquecimento: morte dos possveis sobreviventes.

Este processo freqentemente empregado para esterilizao de meios de cultura

que se alteram a temperatura elevada, como soro, meios contendo acar e outros.

3.12.2 Temperatura superior a 100C Vapor sob presso

o meio mais eficaz de esterilizao, realizado em autoclave.

A autoclave consiste, essencialmente, de uma caldeira cilndrica de paredes

resistentes fechada superiormente, por uma tampa, que veda perfeitamente, devido

interposio de uma borracha e parafusos que se apertam.

No interior da caldeira existe um suporte sobre o qual se coloca uma cesta metlica

contendo o material a ser esterilizado. Entre o fundo da cesta metlica e o funda da caldeira

fica um espao que se enche de gua. A tampa da autoclave possui um orifcio de

escapamento, uma vlvula de segurana e um manmetro que indica presso e a

temperatura correspondente.

Eficincia Comparativa entre Calor Seco e Calor mido

O calor mido mais eficiente, pois tem um poder de penetrao maior que o calor

seco. Foi verificado que em um fardo de flanela exposto ao calor seco a 150C/4 horas, a

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temperatura atingida no centro sobe apenas a 83C, ao passo que a temperatura de 120C

em autoclave durante meia hora, a temperatura central chega a 117C.

A razo da maior eficincia do calor mido reside no fato que assim como outra

reao qumica, a termo-coagulao das protenas tambm catalisada pela gua.

4.0Filtrao

Na filtrao empregam-se filtros que so utilizados no laboratrio e na indstria para

esterilizar materiais que no podem ser esterilizados por autoclavao, como vitaminas,

protenas termossensveis. Inicialmente os filtros eram de cermica porosa ou de vidro

sinttico. Muitos deles foram substitudos por membranas filtrantes, filtros de membrana de

celulose extremamente finos (150m), com poros pequenos o suficiente para impedir a

passagem de microrganismo.

5 Contagem de Microrganismo

Introduo

O crescimento de microrganismo medido atravs da estimativa do nmero de

clulas que foram geradas por diviso binria durante uma fase de crescimento. Esta

medida expressa como o nmero de organismos viveis (vivos) por mililitro (mL) de

cultura. Existem vrios mtodos para contagem de microrganismos que so aplicados nas

anlises de alimentos e em anlises de gua.

5.1Contagem direta ou microscpica

Com a ajuda de uma cmara de contagem so contados o numero de clulas existentes em

um determinado volume do material. Um exemplo o mtodo de Breed utilizado

freqentemente na analise de leite cru e que preconiza a contagem do numero de clulas em

vrios campos microscpicos na quantidade de amostra. Atravs da relao existente entre

a rea do estendido e a rea do campo microscpico possvel se calcular o numero de

bactrias por mL.

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5.2.Contagem metablica

Mtodo baseado no aproveitamento de uma dada atividade metablica especifica das

bactrias sobre um dado substrato. Por exemplo: a prova de reduo do azul de metileno

que tambm praticada na anlise do leite cru.

5.3.Contagem de microrganismos viveis em placa

Semeaduras de material contaminado em placa (pour-plate ou superfcie) respeitando as

condies timas do microrganismo que se procura, isto , meio de cultura adequado,

temperatura, oxignio e tempo necessrio para favorece seu crescimento e permitir ao final,

a contagem das colnias formadas.

5.4.Semeadura em placas

O mtodo de contagem de microrganismos em placas um mtodo geral, que pode

ser utilizado tanto para a contagem de grandes grupos microbianos, como os aerbios

mesfilos, os aerbios psicrotrficos, os bolores e leveduras e os clostrdios sulfitos

redutores, como tambm para a contagem de gneros e espcies em particular como

Staphylococcus aureus, Bacillus cereus e Clostridium perfringens, por exemplo. Esta

versatilidade decorrente do principio do mtodo que se baseia na premissa de que cada

clula microbiana presente em uma amostra ir formar, quando fixada em um meio de

cultura slido adequado, uma colnia visvel e isolada. Variando o tipo de meio (meio de

enriquecimento, meio seletivo, meio diferencial) e as condies de incubao (

temperatura e necessidade de oxignio), possvel selecionar o grupo, gnero ou espcie

que se deseja contar. Como as clulas microbianas muitas vezes ocorrem em

agrupamentos (pares, ttrades, cachos, cadeias, etc), no possvel estabelecer uma

relao direta entre o numero de colnias e o numero de clulas. A relao correta feita

entre o numero de Unidades Formadoras de Colnias (UFC), que podem ser tanto

clulas individuais como agrupamentos caractersticos de certos microrganismos.

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5.4.1Semeadura em profundidade ou pour-plate

Consiste em colocar 1,0 ou 0,1 mL do material, objeto de exame nas placas, agrega-se 15-

20 mL do meio de cultura fundido e resfriado a temperatura de 45C agitando-se com

movimentos rotativos por pelo menos 5 vezes, nos dois sentidos, isto , a favor dos

ponteiros do relgio e contra os mesmos. As placas assim preparadas devem ser incubadas

a temperatura e condies recomendadas pelo mtodo e classe de contagem realizada.

Incubar as placas invertidas e aps incubao proceder contagem das mesmas com ajuda

de um contador de colnias. Trabalhar sempre com 2 placas para cada diluio.

5.4.2 Semeadura em superfcie

Consiste em distribuir o meio de cultura a se trabalhar em prepara placas (15-20 mL)

esperar solidificar e uma vez preparada as diluies semeia-se 0,1 mL das diluies

escolhidas utilizando-se tambm duas placas para cada diluio. Estender toda alquota

semeada com uma ala de Drigalski. Ressalte-se que o Agar preparado e distribudo nas

placas para este procedimento deve ser usado imediatamente ou no mximo em 24 horas.

Para contagem procede-se da mesma forma do mtodo anterior.

5.4.3-Semeadura por gota (em superfcie)

Aps preparar o meio e distribui-lo em placas, esperar solidificar e dividir a placa em 3

segmentos iguais conforme desenho abaixo:

Em seguida, utilizando-se de uma pipeta especialmente calibrada, depositar 2 gotas (0,04

mL) de cada diluio sobre a superfcie do meio. Desta forma logramos semear 6 diluies

com o uso de apenas duas placas.

5.4.4Tcnica da membrana filtrante

Baseia-se na filtrao de um volume conhecido da amostra, atravs de uma membrana

estril de poros de 0,45mm de dimetro, que retm os microrganismos. Aps a filtrao, a

membrana transferida para uma placa de Petri contendo meio de cultura adequado e

incubado a temperatura, oxignio e tempo necessrio para favorece seu crescimento e

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permitir ao final, a contagem das colnias formadas. A filtrao feita em um aparelho que

consta de funil com tampa (para preservar a esterilidade da amostra), suporte de membrana

e frasco receptor. O frasco receptor conecta-se a uma bomba de vcuo, o funil esterilizado

por gua fervura em gua destilada durante 5 minutos.

Vantagens da tcnica

Permite a filtrao de grandes volumes de amostra. ideal para amostra que contem

de 1 a 2 bactrias por litro.

Perodos de incubao mais curtos

fcil de se utilizar, permitindo anlise de um numero grande de amostra em pouco

tempo.

Apresenta alta preciso e reprodutibilidade.

Desvantagem

Alto custo da membrana

As membranas ficam entupidas com amostras que possuam abundantes materiais em

suspenso.

6.0 Nmero mais provvel tubos mais provvel /NMP

Neste mtodo em um meio de cultura liquido, a partir de uma amostra representativa, se

colocam varias series de diluies (srie de 3 ou 5 tubos) paralelas e observar o crescimento

bacteriano. Este se manifesta atravs de turbidez e gs evidenciado nos tubos de Durham

colocados previamente dentro dos tubos de ensaios. Assim os tubos devem ser incubados a

temperatura e condies recomendadas pelo mtodo. Aps incubao a partir dos tubos

onde houve crescimento evidenciado pela presena de turbidez e/ou gs se determina o

numero mais provvel (NMP) consultando a tabela de McCrady onde este nmero estar

referido como sendo N.M.P./100ml ou grama da amostra analisada.

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7.0 COLILERT tecnologia de substrato definido

O Colilert usa uma tecnologia chamada Defined Substrate Technology (DST) para

analisar simultaneamente coliformes totais e E. coli. Dois nutrientes indicadores, ONPG e

MUG so as principais fontes de carbono no Colilert e so metabolizados pelas enzimas -

D-Galactosidase e -D-Glucoronidase indicando as bactrias coliformes e E. coli

respectivamente.

Os coliformes se desenvolvem no Colilert usando a Galactosidase para metabolizar o

ONGP e com isso a amostra incolor passa a amarela. A E. coli usa a Glucoronidase para

metabolizar o MUG e gerar fluorescncia quando a amostra exposta luz UV de 365 nm.

Como a maior parte dos microrganismos no coliformes no possuem essas enzimas, a

interferncia desses muito menor se comparados aos mtodos tradicionais. Os poucos no

coliformes que possuem essas enzimas so inibidos pela matriz antibitica especifica do

Colilert.

Assim essa forma de deteco muito diferente dos mtodos tradicionais, no h formao

de colnias. Aos aucares usados no Colilert permitem que coliformes estressados sejam

recuperados mais facilmente, pois exigem menor nvel de energia para ser metabolizados.

Isso no ocorre nos mtodos tradicionais, pois os meios de cultura nesses mtodos utilizam

aucares comuns como a lactose e tambm, utilizam altos nveis de sais e detergentes a fim

de inibir os no coliformes e por isso prejudicam a recuperao de coliformes

principalmente os injuriados.

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AULA PRTICA N 1

PRESENA DE MICRORGANISMOS NO AMBIENTE

Introduo:

Os microrganismos so encontrados nos mais diversos ambientes, podendo estar em

suspenso ou depositados com a poeira em vrias superfcies, entre elas e as mucosas do

homem. O meio aqutico foi, provavelmente, o ambiente primordial para os diversos

microrganismos, os quais se diversificam e colonizaram outros ambientes. Nas partculas

de poeira, os microrganismos esto presentes em grandes quantidades e, portanto, so

passveis de entrar em nosso organismo atravs de diversos mecanismos. Os

microrganismos presentes no ar depositam-se na superfcie de nosso corpo, cabelos, pele e

mucosas, bem como nos alimentos e bebidas.

Vivemos, portanto, em completa interao com os microrganismos e precisamos

aprender a conviver com eles. Felizmente, a maioria das espcies microbianas benfica ou

incua e uma baixa proporo de microrganismos causa prejuzos ao homem.

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As atividades no laboratrio de microbiologia consistem no isolamento,

conservao e manipulao de culturas de microrganismos A prtica assptica de

fundamental importncia para prevenir que microrganismos contaminantes venham a

crescer nos meios artificiais de estudo. Atravs de tcnicas simples, possvel demonstrar a

presena de microrganismos em diversos locais do ambiente onde nos encontramos.

Objetivos

Reconhecer materiais, equipamentos e normas do laboratrio de microbiologia

Averiguar a presena de microrganismos no ambiente de trabalho, na pele.

Averiguar o efeito da higienizao das mos

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Procedimentos: verificao de contaminao ambiental

AR

Expor uma placa de Petri contendo o meio de cultura (gar nutriente):

1. Manter a placa aberta durante 15 minutos;

PELE

2. Tocar os dedos ou expor ao contato de materiais como fio de cabelo, solo

etc.

RESPIRAO

3. Falar ou tossir sobre o meio de cultura;

Manter uma placa sem exposio ao ambiente, como testemunha.

Identificar as placas, anotando na tampa o tipo de exposio a que foram

submetidas, data, nome do aluno, turma e disciplina.

Incubar as placas na posio invertida temperatura de 35C durante 48 horas.

Avaliar a presena de colnias, sua abundncia e diversidade.

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AULA PRTICA N 2

OBSERVAES E PREPARAES MICROSCPICAS

1.0 Introduo

1.1Microscopia

A Microbiologia pode ser definida como o estudo de organismos muito pequenos

para serem vistos claramente e individualizado pelo olho humano sem nenhuma ajuda. Para

visualizao de microrganismos, necessita-se de aumentos, os quais so conseguidos com o

uso de um microscpio. O termo microscpio deriva do latim, micro, que significa

pequeno; e, do grego Skopos, que significa olhar.

O microscpio rotineiramente utilizado no laboratrio o microscpio ptico

composto. Seu princpio de funcionamento baseia-se no aumento da imagem por um

conjunto de lentes convergentes, associado a uma forte iluminao do campo de

observao, fornecendo uma imagem translcida dos microrganismos.

O microscpio desse tipo utilizado na microscopia de campo claro. Ele permite

um aumento til de aproximadamente mil vezes, e a maioria equipada com quatro

objetivas: a objetiva de imerso e objetivas a seco, sendo uma de grande, outra de mdio e a

ltima de pequeno aumento. A essas objetivas so suplementadas as oculares que, em geral,

fornecem aumento de dez vezes. O aumento total fornecido pelo microscpio obtido pela

multiplicao do poder de aumento da objetiva pelo poder de aumento da ocular. Com o

uso de oculares mais potentes, o aumento total pode ser ampliado de duas a trs vezes.

Contudo, o aumento de mil a duas mil vezes o limite da ampliao til obtido como

microscpio ptico. A limitao no uma questo de aumento, mas do poder de

resoluo, ou seja, da capacidade de distinguir e separar dois pontos adjacentes. O poder de

resoluo funo do comprimento de onda da luz utilizada e da abertura numrica, que

uma caracterstica do sistema de lentes utilizado. O limite de mxima resoluo obtido

com o menor comprimento de onda da luz visvel e com a objetiva de maior abertura

numrica.

Ao longo dos anos, algumas modificaes foram introduzidas no microscpio com a

finalidade de aumentar ou melhorar a visibilidade:

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a) Microscopia de campo escuro:

Ela baseada no efeito Tyndall, segundo o qual a poeira existente no ar invisvel a

olho nu, tornando-se visveis como pontos brilhantes. Os microscpios de campo

escuro tm um condensador especial que impede a penetrao dos raios luminosos

na objetiva, mais deixa passar a luz refratada por um objeto presente na lmina.

Assim a imagem do objeto surge luminosa e brilhante.

Sua utilizao recomendada para a visualizao de preparados a fresco, como a

gota pendente, em que o objeto a ser observado tem ndices de refrao muito

prximos aos do ambiente e que seria invisvel, ou quase, com a microscopia de

campo claro. Ex: espiroquetas.

b) Microscopia de luz ultravioleta

Esse tipo de microscopia permite observar objetos menores do que os observados

em microscopia com luz visvel. No entanto, como o comprimento de onda no

muito menor, o aumento obtido de apenas duas vezes. Como a luz ultravioleta no

visvel a olho nu e no atravessa o vidro, h a necessidade de lentes de quartzo e

de mquina fotogrfica. Isso torna o custo elevado, por isso um mtodo pouco

utilizado.

Entretanto, algumas modificaes tornaram esse tipo de microscopia bastante til na

identificao de microrganismos

b.1) Microscopia de fluorescncia

Ela baseia-se no fato de que determinadas substncias, ao absorverem a energia da

luz ultravioleta, emitem luz de comprimento de onda maior (visvel), permitindo a

observao de substncias que absorvem especificamente essa radiao.

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b.2) Microscopia de imunofluorescncia

uma modificao da tcnica anterior que tem grande utilidade, usa-se a

conjugao de anticorpos com substncias fluoresecentes, tendo, assim, grande

aplicao na identificao de microrganismos principalmente patognicos e estudos

ecolgicos.

c) Microscopia de contraste de fase

Usa objetiva e condensador especial que tm por objetivo permitir uma observao

mais ntida sem o aumento da imagem. Os ndices de refrao no so mudados,

mas acentuam-se as diferenas existentes.

Ela utilizada no estudo de clulas vivas, particularmente das estruturas celulares,

em que o ndice de refrao pouco diferente do ndice do ambiente e no seria

possvel a observao com microscpio comum.

d) Microscopia eletrnica

Usa-se feixe de eltrons, o que permite conseguir aumento de at 250.000 vezes.

Isso permite a visualizao de partculas virais e avaliao da ultraestrutura das

clulas. No entanto, o procedimento sofre limitaes devido necessidade de

preparo do material (dessecao, congelamento etc.) os quais podem afetar a

morfologia e impedir a visualizao dos microrganismos vivos.

23




1.2 Partes do Microscpio

O microscpio ptico constitudo de um sistema de lentes e de um suporte mecnico, cada

um dos quais apresentando vrias partes:

a) P ou base: parte que sustenta todo o aparelho;

b) Corpo ou brao: pea que faz a ligao entre o p e a parte superior do aparelho;

c) Platina: dispositivo retangular localizado paralelamente base, destinado

recepo da lmina, o qual uma perfurao central para dar passagem luz;

d) Charriot: conjuntos de parafusos destinados movimentao da lmina no plano

horizontal;

e) Fonte de luz: lmpada localizada na base do aparelho;

f) Filtro: placa de vidro colorida que pode ser encaixada sobre a fonte de luz para

torn-la mais apropriada observao do material;

g) Diafragma ou ris: dispositivo localizado acima do filtro para controlar a

intensidade do feixe de luz que atinge o orifcio da platina.

h) Condensador: Conjunto de lentes localizado logo abaixo da platina, o qual serve

para concentrar e tornar paralelo o feixe de luz, fornecendo a iluminao

necessria e uniforme do objeto em estudo;

i) Parafuso do condensador: Localizado na lateral do brao, serve para controlar a

posio do condensador;

j) Revlver: pea circular na qual se inserem as objetivas, as quais podem ser

trocadas atravs da rotao;

k) Objetivas: Os microscpios mais comuns possuem quatro objetivas, que

proporcionem aumento de quatro, dez, quarenta e cem vezes;

l) Canho: parte superior do microscpio onde so encaixadas as lentes oculares;

m) Lentes Oculares: Lente superior do microscpio que se encaixa no canho

atravs delas que o observador olha. A ocular geralmente produz aumentos de

10 vezes, entretanto, existem oculares de 5 e 15 aumentos;

n) Parafuso macromtrico: parafuso situado na lateral do microscpio, que permite

grandes avanos ou recuos da platina em relao objetiva;

24




o) Parafuso micromtrico: geralmente encaixado sobre o parafuso macromtrico,

de menor dimetro, que permite pequenos avanos ou recuo da platina( ajuste

fino);

p) Trava: alavanca que fixa o movimento do parafuso macromtrico em uma

determinada posio, impedindo a movimentao ascendente da palatina,

protegendo as objetivas contra possveis choques e a quebra de lminas.

1 Preparaes Microscpicas

A perfeita visualizao dos microrganismos e/ou de suas estruturas s possvel se,

alm da escolha do tipo mais eficiente de microscopia, a preparao estiver adequada. A

escolha do tipo de preparao depende da informao desejada e do microrganismo a ser

avaliado. Duas tcnicas gerais so empregadas: a fresco e Fixados e corados.

25




26




1.1 A fresco

As preparaes deste tipo permitem o exame de organismos nas condies

normais de vida

1.2 Fixados e corados

As preparaes fixadas e coradas so usadas para verificar as caractersticas

morfolgicas dos microrganismos, sendo bastante utilizadas na identificao, pois tornam

mais fcil a visualizao das formas e permitem a verificao do comportamento tintorial

do organismo em relao s coloraes diferenciais. As etapas dessas preparaes so:

Preparo do esfregao;

Fixao;

Colorao

1.2.1 Preparo e fixao de esfregao

A preparao inicial do esfregao do tipo de cultura disponvel. Ele constitudo de

uma camada muito fina de material sobre a lmina e deve ser secado ao ar. A fixao do

material na lmina pode ser feita pela ao do calor, lcool, formol, cido actico e outros

produtos, e destina-se a imobilizar os constituintes celulares, fixando o esfregao na lmina,

atravs de precipitao ou coagulao do material protico.

2.0 Objetivo

Identificar as diferentes partes do microscpio e manuse-lo adequadamente;

Aprender a focalizar preparados no microscpio;

Compreender o princpio do funcionamento do microscpio ptico composto;

Aprender a utilizar a tcnica de preparao microscpica a fresco entre lmina e

lamnula.

Preparar e fixar esfregaos de culturas em meios slidos e lquidos.

27




3.0 Materiais

Cultura de microalgas em meio lquido

Lminas para microscopia

Ala de platina

Microscpio ptico

leo de imerso

Bico de Bunsen

4.0 Procedimentos Para Preparao a Fresco

1. Coloca-se uma ou duas gotas no centro da lmina de cultivo de microalgas,

recobrindo-se em seguida com uma lamnula e levando-se ao microscpio para a

focalizao;

2. Coloca-se a lmina preparada a fresco sobre a platina, fix-la e, com o auxlio do

charriot, ajustar o campo a ser observado sobre a abertura que existe na platina;

3. Focalizar, com o auxlio do macromtrico, aproximando a objetiva de menor

aumento o mximo possvel da lmina. Observa-se, atravs da ocular, a imagem

obtida e, a partir deste ponto, usa-se o macromtrico afastando-se a objetiva da

lmina at a observao da imagem procurada. Em seguida, usa-se o micromtrico

para focalizar e obter melhor nitidez da imagem. Necessitando-se de um aumento

maior, gira-se o revlver para a objetiva seguinte e torna-se a focalizar com

micromtrico, e assim sucessivamente.

4. Para observar a preparao com objetiva de imerso, colocar uma gota de leo de

cedro sobre a lmina e girar o revolver para colocar a objetiva de imerso em foco;

5. Olhando pelo lado, fazer descer o canho como parafuso macromtrico, at que a

lente frontal da objetiva fique encostada no leo de imerso;

6. Mover o parafuso micromtrico at conseguir uma boa focalizao.

28




Preparao de lmina a fresco

3.1 Procedimentos para preparo e fixao de esfregao

a) Culturas em meio lquido

Retirar uma gotcula da cultura com ala de platina esterilizada e colocar no centro

da lmina, tomando cuidado para no atingir as bordas. Esterilizar a ala de platina

na chama.

Secar o esfregao ao ar.

Fixar o esfregao passando a lmina, com o lado do esfregao virado para cima, trs

vezes sobre a chama do bico de Bunsen. Aps resfriamento, procede-se colorao.

a) Culturas em meio slido Colocar uma gotcula esterilizada na lmina.

Colocar uma gotcula de gua esterilizada na lmina;

Retirar uma pequena quantidade da cultura e misturar com gua;

Espalhar o material no centro da lmina, tomando cuidado para no atingir as

bordas. Esterilizar a ala de platina na chama.

Fixar o esfregao passando a lmina, com o lado do esfregao virado para

cima, trs vezes sobre a chama do bico de Bunsen.

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AULA PRTICA N 3

COLORAO DE GRAM

1Introduo

As coloraes podem ser simples (azul de metileno, Giemsa) ou diferenciais (Gram,

Ziehl-Neelsen). As simples so efetuadas pela aplicao de um nico corante, sendo as

clulas geralmente coloridas de maneira uniforme. Nas diferenciais entre elas ou entre

estruturas de uma mesma clula.

A colorao com azul de metileno utilizada principalmente na avaliao da

morfologia, pois os danos causados clula so menores devido ao menor nmero de

manipulaes. Ela realizada colocando-se o corante sobre o esfregao previamente

fixado. Deixa-se corar por 3-5 minutos, escorre-se o corante, lava-se em gua corrente e

deixa-se secar para posterior observao ao microscpio. A colorao de Giemsa utilizada

em clulas que no possuem parede celular e a Ziehl- Neelsen para a identificao de

microrganismos cido- resistentes.

A Colorao de Gram a tcnica de colorao diferencial mais importante e mais

utilizada em bacteriologia, foi introduzida pelo dinamarqus Hans Christian Joachim Gram,

em 1884. muito utilizado at hoje na sistemtica bacteriana. Alm das caractersticas

morfolgicas, este mtodo permite evidenciar determinadas propriedades das bactrias, as

quais so classificadas em Gram positivas e Gram negativas, de acordo com diferenas

na composio e estrutura da parede celular.

1.1 Finalidades da colorao de GRAM

A parede celular de bactrias Gram- positivas composta basicamente por

peptdeoglicano, que constitui uma espessa camada ao redor da clula. Imersos nesta

camada, podem estar presentes outros polmeros, como cidos lipoteicicos e

polissacardeos. Nas bactrias Gram negativas o peptideoglicano constitui uma camada

basal delgada, sobre a qual se encontra uma outra camada, composta por lipoprotenas,

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fosfolipdeos, protenas e lipopossacardeos, denominada membrana externa. A colorao

de Gram consiste, basicamente, em tratar bactrias sucessivamente com cristal violeta,

lugol, lcool e Safranina ou fucsina. O cristal violeta e o lugol penetram tanto nas bactrias

Gram- positivas quanto nas Gram- negativas, formando um complexo de cor roxa. O

tratamento com lcool a etapa diferencial; nas Gram- positivas, o lcool no retira o

complexo cristal violeta+ lugol, pois a sua ao desidradante faz com que a espessa camada

de peptdeoglicano se torne menos permevel, retendo o corante. Nas Gram-negativas,

devido pequena espessura da camada de peptdeoglicano, o complexo corado extrado

pelo lcool, deixando as clulas descoradas. O tratamento com safranina ou fucsina no

altera a cor roxa das Gram- positivas, ao passo que as Gram- negativas, descoradas pelo

lcool tornam-se avermelhadas.

A diferena de comportamento das bactrias frente colorao de Gram significa a

existncia de diferenas marcantes e fundamentais entre as bactrias Gram- positivas e

negativas:

Na permeabilidade da parede celular;

Na composio qumica e estrutura bacteriana;

No metabolismo.

Estas diferenas que refletem na patogenicidade.

Gram- Positiva Gram - Negativa

Objetivo:

Discutir o mecanismo da reao de Gram;

peptdeoglicano

Membrana

citoplasmtica Membrana

citoplsmatica

Membrana

externa Espao

periplsmatico

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Familiarizar o estudante com as vrias etapas da tcnica de colorao;

Caracterizar as diferentes espcies bacterianas de acordo com sua reao

colorao de Gram.

Material: Lmina; Bico de Bunsen; Estufa; Microscpio; Cristal violeta; Lugol; Safranina

e lcool.

Procedimento

2. Lavar a lmina com gua e sabo e/ou lcool e ter. Secar a lmina e verificar se

toda gordura foi removida.

3. Colocar uma ou duas gotas do liquido contendo a suspenso na lmina. Espalhar

sobre uma rea de cerca de 1,5 cm de dimetro.

4. Deixar o esfregao secar temperatura ambiente ou em estufa.

5. Passar o esfregao 3 vezes sobre a chama do bico de Bunsen para fixao do

mesmo.

6. Adicionar o Cristal violeta, aguardar 1 minuto.

7. Aplicar soluo de Lugol esperar 60 segundos. Lavar com gua.

8. Descorar com lcool absoluto at que todo o corante seja removido.

9. Corar com Safranina esperar por 30 segundos. Lavar e secar.

10. Examinar ao microscpio com a objetiva de imerso.

OBSERVAES:

1. Quando o material a ser analisado for viscoso, deve-se proceder diluio

usando-se uma gota de gua destilada.

2. A fixao do esfregao faz-se necessria para manter o microrganismo aderido

lmina.

3. O Lugol uma substancia mordente empregada com o objetivo de fixar o

corante clula.

4. O lcool agente descorante que remove o corante de certas bactrias.

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5. Cultivos antigos de algumas bactrias Gram positivas podem perder a

propriedade de reter o Cristal violeta, e, conseqentemente, podero se corar

com a safranina.

Gram positiva (roxa) Gram negativa (vermelha)

Exerccio

Com os conhecimentos que voc adquiriu, indique a colorao de cada tipo de clula

bacteriana aps o uso de cada reagente, durante o procedimento de colorao:

PROCEDIMENTO GRAM + GRAM -

Cristal de violeta

Lugol

lcool

Safranina

Esquematizar os preparados observados:

a)Bactrias Gram- positivas b) Bactrias Gram- negativas

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AULA PRTICA N 4

PREPARAO E ESTERILIZAO DE MEIOS DE CULTURA

1INTRODUO

1.1Meios de culturas

O estudo dos microrganismos, sua identificao e a avaliao de suas populaes nos

diferentes materiais e ambientes requerem seu cultivo nas condies de laboratrio.

Meios de cultura so substratos adequados ao crescimento, multiplicao e

desenvolvimento de microrganismos fora de seu habitat natural.

Os primeiros meios utilizados foram naturais e lquidos como o caldo de pimenta, a urina,

o sangue e o leite.

O cultivo dos microrganismos exige que determinadas condies sejam atendidas. As

exigncias nutritivas e ambientais so viveis como o tipo de microrganismo, tornando

impossvel a produo de um nico meio que satisfaa todas as condies de todos os tipos

de microrganismos. Por outro lado, difcil e impraticvel a formulao de um meio de

cultura ideal para cada tipo de microrganismo. No cultivo de bactrias heterotrficas, o

meio mais utilizado o caldo nutriente (CN) e a sua respectiva forma slida, o gar

nutriente (AN). Para fungos, o meio comumente utilizado o gar dextrose ou Sabouraud.

No preparo de um meio de cultura necessrio conhecer as exigncias nutricionais dos

microrganismos. So considerados componentes essenciais do meio de cultura:

a) Fonte de energia: no caso de microrganismos quimiotrficos, esta exigncia

satisfeita pela presena de compostos orgnicos ou inorgnicos especficos a ser

oxidados, como por exemplo o enxofre ou o amnio. Para os fotossintetizantes, h a

necessidade de luz, que deve ser fornecida pelo ambiente.

b) Fonte de carbono: para microrganismos heterotrficos, h a necessidade da

presena de compostos orgnicos, enquanto que para os autotrficos necessrio

CO2, que pode ser suprido pelo ambiente.

c) Fonte de nitrognio: protenas, aminocidos, nitrato, amnio ou N2.

d) Fatores de crescimento: Vitaminas.

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e) Fonte de minerais: P, K, S, Ca, Fe, Mg, Mn, Zn, Cu etc.

f) gua

Devido s dimenses dos microrganismos, alm dos nutrientes, o meio de cultura deve

suprir algumas condies ambientais:

a) pH: cada organismo exige um pH adequado para seu crescimento. A maioria das

bactrias, por exemplo, exige um pH em torno de 7.

b) Atmosfera: presena de O2,CO2; condies para o crescimento de aerbios,

anaerbios, facultativos ou microaerfilos.

c) Presso osmtica: regulada pelos constituintes do meio. Para organismos marinhos

e haloflicos, h necessidade da adio de uma certa quantidade de sal, de modo a

obter a concentrao adequada para seu crescimento.

Nem todas as condies ambientais podem ser controladas no meio de cultura.

Temperatura, luz, presso hidrosttica e, na maioria das vezes, a atmosfera devem ser

controladas no ambiente (incubadora ou estufa).

Alguns nutrientes, como as substncias termolbeis (vitaminas, acares, aminocidos e

antibiticos), exigem cuidados especiais. Eles devem ser esterilizados por filtrao, sendo

adicionado aos meios aps a autoclavagem e resfriamento acima do ponto de solidificao

do meio.

1.1 Classificao dos meios de cultura

1. Quanto origem:

a) Naturais: aqueles que j existem prontos na natureza. Ex: leite, sangue, caldo

de frutas, caldo de cana e outros.

b) Artificiais: aqueles que so elaborados. Ex: gar nutriente.

2- Quanto composio:

a) Complexos: so aqueles que no apresentam uma composio qumica

definida, como os que contm extrato de carne ou extrato de levedura, sangue,

leite, ovos e outros.

b) Sintticos: meios que tm a composio qumica definida.

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3- Quanto ao estado fsico:

a) Slidos: so meios que j existem na natureza no estado slido, ou que

foram tornados slidos pela adio de uma substncia solidificante como o gar (

1,5%), a gelatina ou a slica-gel. So utilizados para o isolamento e avaliao de

populaes (contagens), ou mesmo para o cultivo normal. Ex: fatias de batata e gar

nutriente. O gar-gar o solidificante mais utilizado em microbiologia. Ele um

polissacardeo extrado de algas marinhas do gnero Gelidium, constitudo de

unidades monomtricas de galactose e cido galacturnio. Foi introduzido na

microbiologia por Robert Koch e at hoje vem sendo utilizado devido a suas

seguintes caractersticas:

inerte para a maioria dos microrganismos;

transparente;

neutro;

Possui ponto de fuso a 100 C

Possui ponto de solidificao de 40-45C, o que permite a sua mistura com

microrganismos ou com substncias que se alteram em temperaturas

elevadas (Ex: protenas).

b) Semi slidos: meios que apresentam consistncia intermediria, como por

exemplo o meio semi-slido ( 0,5% de gar) utilizado para a verificao da

mobilidade ou para a caracterizao de microrganismos microaerfilios.

c) Lquidos: so meios utilizados na forma de caldo. Eles permitem obter

maior concentrao celular em menor tempo. O crescimento de microrganismos

unicelulares pode ser avaliado nesses meios pelas mudanas de turvao. Ex: Caldo

nutriente.

4- Quanto finalidade

a) Meios gerais ou bsicos: so aqueles que permitem o crescimento de um

grande nmero de espcie microbiana dentro de um grupo: gar nutriente para

bactrias, Sabouraud ou gar dextrose para fungos.

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b) Meios enriquecidos: so meios de culturas adicionados de misturas

complexas e naturais como leite, sangue, soro e extrato de tecidos animais ou

vegetais, que permitem o crescimento de microrganismos nutricionalmente mais

exigentes (fastidiosos). Ex: gar sangue para isolamento e cultivo das bactrias

dos gneros Neisseria, Staphylococcus e Streptococcus.

c) Meios seletivos: So aqueles que possuem uma composio ou uma ou mais

condies que seleciona o tipo de microrganismo que vai crescer. So muito

teis no isolamento e na identificao. Ex: meio SS gar para Salmonella e

Shigella.

d) Meios indicadores ou diferenciais: so aqueles que destacam (indicam)

determinadas caractersticas metablicas do microrganismo. So tambm muito

teis no isolamento e na identificao. Ex: meio Mac Conkey, para bactrias

entricas.

e) Meios de enriquecimento: So aqueles que permitem o desenvolvimento

diferenciado de microrganismos, favorecendo o crescimento de um grupo em

detrimento de outros.

f) Meios de dosagem: so empregados na dosagem de substncias, tais como

vitaminas, aminocidos e desinfetantes.

g) Meios de transporte, estocagem ou manuteno: mantm a viabilidade

dos microrganismos por mais tempo. Por exemplo, a presena de glicose no

meio de cultura faz com que o microrganismo se multiplique mais rapidamente,

exaurindo toda a fonte de energia. A mudana do tipo de acar permitir um

crescimento mais lento, e a cultura sobreviver mais tempo.

Meios desidratados

A maior parte dos meios de cultura pode ser obtida na forma desidratada e neste

caso alguns aspectos devem ser obtidos:

1.3 Armazenamento e conservao

Anotar em livro prprio a data da recepo dos meios de cultura e ingredientes

empregados na formulao.

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Armazena-lo de acordo com as especificaes contidas no rotulo, em uma rea de

pouca umidade, afastada da luz direta do sol, das autoclaves, estufa de secagem e

qualquer outra fonte de calor.

Quando especificado no rotulo, manter sob refrigerao.

Aps o uso assegurar-se de que o frasco esta bem fechado e armazena-lo em local

prprio.

Descartar o meio caso o p no esteja fluindo facilmente ou se houver alteraes na

cor e/ou consistncia.

1.4 Pesagem

Ao preparar meios e cultura deve-se usar primeiro o estoque mais velho. No se

deve abrir um novo lote de meio ate que o anterior tenha esgotado.

Usar uma balana cuja exatido se verifique freqentemente. Os meios desidratados

so hidroscpicos e desta forma, a pesagem deve ser feita rapidamente e em local de

pouca umidade.

1.5 Dissoluo

Usar vidros bem lavados e enxaguados. No usar gua suspeita de conter cloro,

cobre ou detergentes. Usar gua deionizada ou destilada.

Antes a aplicar calor dissolver meios desidratados deve-se ler o rotulo. Alguns

meios no devem ser submetidos a temperaturas acima de 55C, (Caldo urea, Agar

urea) enquanto que outros meios desidratados devem ser aquecidos a fim de garantir a

completa dissoluo e distribuio uniforme dos ingredientes.

O aquecimento deve ser feito sob agitao continua e suave, evitando que o mesmo

se queime no fundo do frasco. A agitao do meio durante o aquecimento deve ser feita

com cautela porque alguns meios, especialmente os que contm Agar, podem formar

espuma e transbordar.

Os meios que contm Agar devem permanecer, em geral durante 5 a 10 minutos em

repouso na gua, antes de serem aquecidos, para permitir que as partculas de Agar se

38




reidratem adequadamente, elevando a solubilidade do Agar resultando em gel mais

uniforme.

O meio preparado deve ser distribudo em frasco ou tubo (permitindo uma pequena

folga da tampa) apropriado e levado para esterilizao.

Ao distribuir o meio em recipientes adequados, no devemos colocar mais de 2/3 da

capacidade do mesmo.

1.6 Esterilizao

Alguns meios no devem ser esterilizados em autoclave. Em alguns casos, os meios

devem ser esterilizados por filtrao, outros so to seletivos que no necessitam de

calor nem de filtro (Agar Salmonella-shiguella, Agar citrato desoxicolato, Caldo de

tetrationato, Caldo de selenito). A atividade seletiva destes meios destruda durante a

autoclavao.

O microbiologista dispe de numerosos filtros de diferentes tipos e poros de

tamanhos variveis. Os filtros de membrana (Millipore, Belford, Mass) so

provavelmente o sistema de filtro mais usado e podem ser empregados com adaptadores

prprios permitindo a esterilizao de grandes volumes.

Na esterilizao por autoclavao o meio no deve ser tratado deficientemente ou

excessivamente. O excesso de tratamento em um meio pode acarretar um erro pior do

que a subesterilizao. necessrio pr-aquecer meios em volumes maiores, para evitar

demora em alcanar a temperatura de esterilizao. Nunca deve ser autoclavado mais de

dois litros por recipiente. Antes de esterilizar o pH do meio deve ser comprovado em

potencimentro (ajustado com tampes). Esta medida deve ser tirada a 25C e

normalmente no precisa ser ajustada. A adio de componentes pode afetar o

equilbrio do meio.

1.7Armazenamento do meio pronto

De forma geral, os meios prontos devem ser armazenados a temperatura entre 2 e

8C (geladeira). O efeito nocivo comumente associado ao armazenamento a

desidratao. Esta no ser problema em meios lquidos e sim em meios em placas,

39




principalmente em laboratrios pequenos onde certos meios so usados ocasionalmente.

Estes meios em placas devem ser conservados em sacos plsticos, selados, para

minimizar a perda de umidade, e estocados em posio invertida. Todos os meios

devem ser levados a temperatura ambiente antes de seu uso.

Meios como Agar padro, Agar batata e outros, podem ser guardados em volumes

para serem adicionados em placas (15 mL). No momento da analise sero fundidos e

resfriados.

2.0 Objetivo:

Familiarizar o aluno na preparao e esterilizao de meios de cultura

3.Procedimento

3.1 preparo do meio lquido

Pesar o meio de cultura indicado pelo professor de acordo com as especificaes do

fabricante, em papel alumnio ou vidro de relgio e, transferi-lo para um becker;

Colocar a quantidade de gua de acordo com a quantidade do meio a ser preparado.

Dissolver na chapa de aquecimento

Medir o pH e se necessrio ajustar pela adio de NaOH ou HCl 1N

.Distribuir em tubos (na proporo de 5,0 ml)

Esterilizar em autoclave a 121C por 15 minutos;

3.1 preparo do meio slido

Pesar o meio de cultura indicado pelo professor de acordo com as especificaes do

fabricante, em papel alumnio ou vidro de relgio e, transferi-lo para um frasco de

Erlenmeyer;

Colocar a quantidade de gua de acordo com a quantidade do meio a ser preparado.

Dissolver na chapa de aquecimento at completa dissoluo do meio de cultura

Colocar a boneca (tampa) e a coifa de papel com nome do meio e a data do preparo

Medir o pH e se necessrio ajustar pela adio de NaOH ou HCl 1N

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Esterilizar em autoclave a 121C por 15 minutos;

Seqencia do preparo de meio de cultura para a produo de meio lquido (caldo), slido

(gar)

Instrues para o Manejo da Autoclave

1.Adicionar a quantidade de gua se necessrio para evitar danos resistncia;

Cesto de Inox Resistncia

coberta com gua

MEIO AGAR OU

CALDO

gua destilada

Dissolver

Corrigir pH

Esterilizar em autoclave

Armazenar

Distribuir

Agitao

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2.Colocar o material na cesta de inox devidamente acondicionado

3.Tornear a tampa, apertar os parafusos por porcas sempre opostas, de forma que a tampa

encaixe perfeitamente sobre o friso existente para isto.

4.Abrir a vlvula de vapor e ligar a corrente eltrica ou ligar e aceder o gs.

5.Ao sair vapor pela vlvula de forma contnua, esperar 5 minutos para a expulso de todo

ar e s ento fechar a vlvula.

6.Vigiar o manmetro e a vlvula de segurana. Quando a vlvula deixar escapar vapor,

verificar a presso.

7. Quando a temperatura atingir 121 C, controlar para que permanea estvel (regular

mediante vlvula de escape do vapor).

8. Inicia-se a contagem de esterilizao, geralmente de 15 a 30 minutos.

9. Desligar o aparelho, deixar esfriar e diminuir a presso.

10.Esperar que o ponteiro do manmetro desa at o zero e ento abrir a vlvula de vapor

Manmetro

Vlvula de vapor

Manmetro

Parafusos

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11. Terminando o tempo necessrio para esterilizao, pode-se abrir lentamente o orifcio

de escapamento, para a presso descer mais rapidamente;

12.Abrir autoclave somente quando a presso interna for igual externa. A abertura

antecipada da autoclave muito perigosa. O lquido com temperatura acima de 100 C no

evapora quando a presso elevada, baixando bruscamente a presso, o lquido evapora

rapidamente, podendo causar uma violenta exploso, fazendo saltar rolhas e meios, alm de

causar queimaduras no operador.

Autoclave com tampa aberta

Importncia da Eliminao do Ar Residual na Autoclave

O ar um mau condutor de calor. A ao esterilizante do vapor devida facilidade

com que ele se condensa sobre as superfcies mais frias dos objetos a serem esterilizados,

cedendo-lhes o seu calor latente. O ar interfere nessa condensao, formando um filme

protetor em torno do material evitando assim a penetrao do calor.

Tampa

Chave de controle

do termostato

43




AULA PRTICA N 5

PREPARO DE DILUIO

1.0 Introduo

Para utilizar os mtodos para efetuar a contagem de microrganismos geralmente

utiliza-se diluio em srie por ser difcil realizar a contagem de milhares ou centenas de

colnias. Assim sendo, efetua-se a diluio da cultura que se pretende contar antes de

plaquear (transferir) um volume conhecido de cultura para a placa slida.

Para se fazer uma diluio em srie, comea-se com organismos em meio lquido.

Acrescentando 1 ml deste meio a 9ml de gua diluio, cria-se uma diluio de 1:10;

acrescentando 1 ml da diluio 1:10 a 9ml de gua de diluio , cria-se uma diluio de

1:100, e assim por diante. O nmero de bactrias por mililitro de fluido reduzido em 9/10

a cada diluio.

IMPORTANTE:

Para se determinar o nmero de unidades formadoras de colnias na cultura original, deve-

se multiplicar o nmero de colnias encontradas na placa pelo o fator de diluio; se esta

for uma frao deve-se usar o denominador. Um fator de diluio de 1000 seria expresso

por 1:1000.

Objetivo

Familiarizar o estudante coma tcnica de diluio, para utilizar nas tcnicas de contagem de

microrganismos.

Procedimento

1. Preparar uma srie de tubos estries contendo 9 mL de liquido de diluio estril.

2. Com uma pipeta estril, transferir 1 mL da amostra ao primeiro tubo contendo 9mL

do liquido de diluio estril, esta diluio 1/10. Etiquetar o tubo com a diluio

correspondente.

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3. Agitar a amostra energicamente para obter uma boa distribuio das bactrias na

massa liquida.

4. Descartar a pipeta usada

5. Usando nova pipeta estril, transferir assepticamente 1 mL da diluio 1/10, esta a

diluio 1/100. Etiquetar o tubo.

6. Descartar a pipeta usada.

7. Agitar o tubo de diluio 1/100

8. Usando nova pipeta estril, transferir assepticamente 1 mL da diluio 1/100 a outro

tubo de diluio com 9 mL diluio, esta a diluio 1/1000. Etiquetar o tubo.

9. Da mesma forma, segue-se preparando maiores diluies 1/10.000; 1/100,000

quantas forem precisas.

Lquido de Diluio

Utilizar soluo Ringer diluda a . A composio a seguinte

Cloreto de sdio 9,0 g

Cloreto de potssio 0,42g

Cloreto de clcio anidro 0,24g

Bicarbonato de sdio 0,20g

gua destilada 1000mL

Antes do uso, selecionar parte da soluo acima trs partes da gua destilada. O

liquido de diluio deve ser acondicionado em garrafas apropriadas que contenham 99;

90 ou 9mL aps esterilizao.

OBSERVAES

Todo material usado deve ser esterilizado.

Em cada diluio, deve-se descartar a pipeta usada. O uso da mesma pipeta

no preparo de duas diluies consecutivas implica incorporar diluio

maior, bactrias provenientes de diluio anterior que, por exemplo ficaram

nas pipetas. O erro assim causado altamente significativo e a contagem

final no ter validade.

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AULA PRTICA N 5 -

CONTAGEM DE MICRORGANISMOS EM PLACAS

Objetivo:

Familiarizar o estudante com uma das tcnicas de contagem, para avaliao do crescimento

de bactrias.

Procedimento:

A) Contagem em superfcie

Preparar diluies decimais da cultura transferindo1 ml para o tubo contendo 9ml de

gua de diluio, diluio de fator 10 (concentrao 1:10 ou1/10)

Homogeneizar a suspenso.

Transferir, a partir da diluio anterior, 1 ml para outro tubo contendo 9 ml de gua

de diluio, homogeneizar a suspenso, e assim sucessivamente, de modo a obter as

diluies: 102; 10

3;10

4;10

5;10

6;10

7.

Colocar o meio de cultura nas placas e deixar solidificar;

Identificar as placas marcando o nome, turma, data, diluio (105;106;107) e

repetio (I, II e III);

Inocular as placas, previamente identificadas com 1ml das respectivas diluies;

Espalhar rapidamente lquido, com ala de Drigalski, at que este seja absorvido

pelo meio.

Colocar as alas em soluo desinfetante;

Incubar as placas na posio invertida temperatura adequada no mnimo 24 horas.

Escolher a diluio cujas placas apresentem de 30 a 300colnias.

Proceder a contagem das colnias;

Calcular o nmero de bactrias ( UFC unidades formadoras de colnias) /ml da

cultura original utilizando a seguinte frmula.

N de bactrias ( UFC)/mL = mdia do n de colnias x fator de diluio

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B) Contagem pelo mtodo pour plate

Preparar as diluies e identificar as placas conforme descritos no procedimento de

contagem em superfcie.

Inocular as placas com 1 ml das respectivas diluies.

Verter o meio de cultura a 50C e misturar realizando movimento de rotao no

sentido horrio e no sentindo anti- horrio durante alguns segundos.

Deixar solidificar.

Incubar as placas na posio invertida temperatura adequada durante no mnimo

24 horas.

Escolher a diluio cujas placas apresentem de 30 a 300 colnias.

Proceder a contagem das colnias.

Calcular o nmero de bactrias (UFC)/mL da cultura original utilizando a seguinte

frmula:

N de bactrias ( UFC)/mL = mdia do n de colnias x fator de diluio

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Esquema de contagem em placa

Repeties Diluio utilizada Contagem

1

2

3

Mdia =

II UNIDADE TEMTICA

AULA PRTICA N 6

ANLISE MICROBIOLOGICA DE GUA TCNICA DOS TUBOS

MLTIPLOS

1.Coleta de Amostras

As guas a serem coletadas para o exame bacteriolgico devem ser colhidas com

esterilidade e em pontos representativos da planta de tratamento, do sistema de

distribuio ou do manancial. A anlise deve ser feita atravs dos mtodos padres a fim

de poder comparar os resultados obtidos em diferentes pocas e em diferentes regies.

2.Frascos de Coleta

Deve-se utilizar frascos escuros com tampas de boca larga e capacidade mnima de

120 mL. O frasco ser esterilizado, com tiossulfato de sdio (100mg de tiossulfato por 1

litro de gua), se destinado gua clorada ou sem tiossulfato para outros tipo de gua. A

tampa e o gargalo do frasco devem ser protegidos com papel tipo Kraft ou papel

alumnio.

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3.Coleta de Amostra de Torneira

No deve fazer coletas em torneiras com vazamento. Abre-se a torneira, deixa-se

correr a gua para eliminar a que ficou retida na tubulao. Fecha-se, seca-se com um

pano limpo. Esteriliza-se a torneira com um cotonete grosso de algodo embebido em

lcool e aceso. Abre-se novamente a torneira deixa-se sair um pouco de gua. Abre o

frasco, enche deixando 2 cm de ar para poder agitar a amostra antes da anlise. Fecha o

frasco e a torneira.

4.Coleta de Amostra de Piscina

Recomenda-se coletar gua da superfcie e a 30 cm de profundidade. Na superfcie

forma-se um filme de gorduras proveniente do corpo do banhista, e o nmero de bactrias

maior e no necessariamente representativo da massa de gua restante. O frasco deve

conter tiossulfato e as coletas devero ser feitas na hora de maior concorrncia.

5.Coleta de Amostra de Rios, Lagos, etc.

O ponto de amostragem depender do que se deseje pesquisar. Em reservatrios

naturais utilizados como fonte de gua potvel, os pontos de coleta sero prximo ao

ponto de captao e na mesma profundidade que este.

No devem coletar-se amostra nas bordas dos reservatrios, rios, etc, porque nesta

regio a gua mais poluda e h acmulos de matria orgnica e crescimento de plantas

e insetos o que eleva o teor bacteriolgico e o resultado no seria representativo.

6. Balnearios

Os pontos de coleta so os lugares mais concorridos; amostras devem ser tomadas

na hora de pico, a freqncia de coleta ser aumentada na poca de chuva.

Todos os fracos com amostras devem ser etiquetados com data, hora lugar e

profundidade da coleta. Outros parmetros que so teis na analise dos resultados so

temperatura da gua no momento da coleta e pH.

s vezes precisa-se de barcos, frascos para coleta em profundidade, etc. Para

mergulhar frascos em rios, lagos etc, passa-se arame pelo gargalo, deixando-se um

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extremo comprido, sustenta-se a garrafa pela base e coloca-se na gua e se mexe em

contra-corrente desde o extremo do arame.

7. Conservao da Amostra

As amostras devem chegar ao laboratrio sem modificao de sua populao

bacteriana. A situao ideal proceder nas amostras 2 horas seguintes coleta. Quando

no possvel, deve-se conservar em isopor com gelo para manter a temperatura inferior

a 10C. Nestas condies a amostra se preserva durante 6 horas e deve ser processada nas

2 horas seguintes (ou seja, em um total de 8 horas aps a coleta).

8. Procedimento das Anlises:

8.1. Ensaio Presuntivo

2. Semear trs series de 5 tubos, utilizando 10mL;1mL e 0,1mL em caldo lactosado (CL)

ou caldo lauril triptose (CLT), contendo tubos de fermentao (Duhan) invertido. Para

inoculaes das pores de 10 mL da amostra, usar o CL ou o CLT em concentrao

dupla.

3. Identificar os tubos anotando a amostra a data e as pores da amostra. Identificar

tambm os frascos de diluio.

4. Homogeneizar a amostra

5. Preparo de diluies: Com uma pipeta estril de 1 mL e obedecendo aos cuidados de

assepsia, transferir 1 mL da amostra para um frasco contendo 9 mL do liquido de

diluio, antecipadamente identificado. Prepara-se assim, a primeira diluio decimal (10-

1), sendo que 1 mL da mesma corresponde a 0,1mL da amostra. Homogeneizar.

6. Com uma pipeta estril transferir 10 mL da amostra para os 5 tubos da primeira serie

contendo o meio CL ou CLT de concentrao duplo. Desprezar a pipeta, homogeneizar os

frascos.

7. Com uma pipeta estril transferir 1 mL da amostra para os 5 tubos da segunda serie

contendo o meio CL ou CLT. Desprezar a pipeta, homogeneizar os frascos.

8. Com uma pipeta estril transferir 1 mL da diluio 10-1 para os 5 tubos da terceira

serie contendo o meio CL ou CLT. Desprezar a pipeta, homogeneizar os frascos.

9. Colocar a estante contendo os tubos inoculados na estufa a 35C durante 24-48 horas.

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10. Aps esse perodo de incubao, retirar os tubos da estufa para efetuar a primeira

leitura dos resultados. Para isso, agitar cada tubo e verificar a presena de turbidez e/ou

gs nos tubos. Descartar os tubos negativos.

FIGURA COM TUBOS POSITIVOS

8.2. Ensaio Confirmativo para Coliformes a 35C

O ensaio confirmativo efetuado utilizando-se o caldo lactosado verde bile

brilhante 2% (CLVBB) para determinao de coliformes totais e caldo EC para

coliformes termotolerante.

1. Identificar os tubos de CLVBB, contendo tubos de Duhan invertido, correspondente

respectivamente a cada tubo de CL ou CLT com resultado presuntivo positivo.

2. Agitar bem o tubo de CL ou CLT com resultado presuntivo positivo e, com uma haste

de madeira ou ala de platina, repicar o material e inocular no tubo correspondente de

CLVBB. Agitar

3. Incubar os tubos de CLVBB inoculados, durante 24-48 horas a 35C

4. Proceder a leitura aps o tempo de incubao, considerando como teste confirmativo

para coliformes totais todos os tubos que apresentarem gs nos tubos de Duhan

invertido com ou sem turbidez. Anotar os resultados e verificar o NMP de coliformes

totais na tabela em anexo.

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EXEMPLO:

TUBOS 1 2 3 4 5 TUBOS +

10 mL + + - - - 2

1 Ml + - - - + 2

0,1mL (10-1

) - - - - - 0

De acordo com a tabela o NMP de CT = 21g/100mL

8.3. Diferenciao para Termotolerantes

Esta diferenciao, feita a partir dos tubos positivos de CL ou CLT.

1.Identificar os tubos com caldo EC, contendo tubos de Duhan invertido, correspondente

respectivamente a cada tubo de CLVBB com resultado presuntivo positivo.

2.Agitar bem o tubo de CLVBB com resultado presuntivo positivo e, com uma haste de

madeira ou ala de platina, repicar o material e inocular no tubo correspondente de caldo

EC. Agitar

3.Incubar os tubos de caldo EC inoculados, durante 24 horas a 44,5C

Proceder a leitura aps o tempo de incubao, considerando como teste confirmativo para

coliformes termotolerantes todos os tubos que apresentarem gs nos tubos de Duhan

invertido com ou sem turbidez. Anotar os resultados e verificar o NMP de coliformes

termotolerantes na tabela em anexo.

Se a finalidade do ensaio for o exame completo, prosseguir a partir dos tubos CLVBB com

resultado positivo no ensaio confirmativo.

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84. Ensaio Completo (Opcional)

1. Identificar placas contendo o meio solidificado Agar eosina azul de metileno

(EAM), correspondendo a cada uma, a um tubo de CLVBB com resultado positivo.

2. Flambar e resfriar uma ala de platina.

3. Agitar e inclinar o tubo de CLVBB e mergulhar a extremidade da ala de platina no

liquido do tubo a uma profundidade de, aproximadamente, 1 cm.

4. Depositar o inculo em um ponto das bordas da placa de Agar EAM, gira-la e

iniciar seu espalhamento na superfcie do primeiro quadrante, tomando cuidado para

que a parte encurvada da ala toque apenas a superfcie do meio, evitando racha-lo.

5. Girar novamente a placa e continuar o espalhamento no segundo quadrante.

6. Proceder dessa maneira ate completar a semeadura em toda superfcie do Agar.

7. Fechar e incubar a placa em posio invertida durante 24 horas a 35C.

8. Aps o perodo de incubao, efetuar a leitura, considerando as colnias tpicas de

coliformes as colnias nucleadas, com ou sem brilho metlico.

9. Considerar como colnias atpicas de coliformes as colnias rosas, mucoides,

opacas e sem ncleo e, como colnias negativas, todos os outros tipos de colnias.

2 Contagem total de microrganismos hetertrofos aerbios

1. Meio de cultura: Agar padro para contagem(APC)

2. Tcnica

Pipetar assepticamente pores de 1mL das diluies selecionadas,

transferindo-as para as placas de Petri devidamente identificadas. Semear em

duplicatas, utilizando no mnimo duas diluies diferentes. Adicionar a cada placa

aproximadamente 15mL do meio previamente fundido.

O espao de tempo decorrido entre a semeadura e a adio do meio no deve

utrapassar a 20 minutos.

Homogeneizar cuidadosamente, em movimento de vai-vem, sentido horrio e ante-

horrio.

FIGURA DAS PLACAS COM MOVIMENTO

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Como prova de esterilidade, adicionar 15mL do meio previamente fundido em placa

sem amostra. Deixar solidificar em superfcie plana

Incubar s placas invertidas em estufa a 35C por 48 horas

Aps o perodo de incubao selecionar as placas que contenha entre 30 e 300 colnias

Clculo

Calcular a media aritmtica dos resultados encontrados em uma mesma diluio e

multiplicar pela diluio

Exemplo:

Diluio 10 -2

placa 1 = 36 colnias

Diluio 10 -2

placa 2 = 39 colnias

36 + 29/2 = 37,5 x 100 = 3750 colnias

N de bactrias = 3,7 x 103

UFC/ mL da amostra

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AULA

PRTICA N 7

ANLISE MICROBIOLOGICA DE GUA TCNICA

COLILLERT

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AULA PRTICA N 8

ANLISE MICROBIOLGICA DE ALIMENTOS FRESCOS

CARNES/QUEIJOS/LINGUIAS

A qualidade global de um alimento determinada por diversos fatores de natureza

fsica, qumica nutricional e microbiolgica.

1 DIA DE TRABALHO

Procedimento

1. Pesar 25 ou 10 gramas da amostra

2. Emulsion

Apostila Experimental

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