MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃOUNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS

INSTITUTO DE BIOLOGIAFACULDADE DE NUTRIÇÃO

APOSTILA PRÁTICA DE MICROBIOLGIA

Elaborado: Giovanna Cavada (Monitora)

Professora Orientadora: Gladis Aver Ribeiro

2010

1. Biosegurança no Laboratório

► O estudante deverá estar na sala de aula prática, obrigatoriamente:

usando avental;

cabelos presos;

sapato baixo e fechado;

calça comprida;

não usar brinco e assemelhados;

não comer no laboratório

► Cuidados que se devem tomar para evitar a contaminação nas aulas práticas:

A bancada de trabalho deve estar a mais desimpedida possível, evitar cadernos,

bolsas e apontamentos que não serão utilizados durante a fase experimental,

evitando acidentes e deixando o local livre para o manuseio do material em

estudo.

► Em todos os trabalhos práticos, observar os seguintes critérios:

Fazer limpeza da bancada com álcool 70ou com álcool iodado.

Bico de Bunsen com chama azulada, a utilização deste, visa flambar a alça ou

agulha bacteriológica e propiciar um ambiente asséptico ao redor do material

que você manuseia. Deve-se trabalhar com a chama a sua frente para evitar

acidentes com fogo, e esse fato indesejado só depende de seu “cuidado”.

Alça ou agulha bacteriológica deve ser flambada até o rubro, antes e após cada

experimento, elas são flambadas para evitar resultados indesejáveis ao seu

estudo, pois microrganismos podem estar assentados sobre o material. A

flambagem é obrigatória, pois, esse material posteriormente poderá contaminar

outras pessoas como colegas, professores e o material de limpeza.

Sempre que utilizar pipetas, lâminas e outros materiais que não podem ser

esterilizados por calor seco (flambagem), solicitem ao professor ou monitor

presente, a orientação quanto ao local adequado onde você deverá desprezá-los.

Nunca abandone esse material sobre a bancada, em lixeiras ou assemelhados,

para evitar contaminação de pessoas desavisadas que não devem pagar pelo seu

descuido.

Sempre que houver algum acidente como quebra de tubos ou placas com

microrganismos, contato com material contaminado, não se desespere, pois saiba

que o objetivo de seu professor ou monitor é prepará-los adequadamente para

seus futuros compromissos profissionais e não de submetê-los a riscos de

infecção. Esses microrganismos têm baixo poder patogênico e você deve sempre

avisar seu professor ou monitor para que ele tome providências adequadas e

imediatas.

Ao final de todo trabalho prático, lavar as mãos com água e sabão e

posteriormente fazer a anti-sepsia com álcool 70% ou iodado.

Todas as vezes que você utilizar o microscópio, você deve ao final do trabalho,

limpar as objetivas com uma gaze embebida em uma solução de álcool-éter

adequada para este fim e mantê-los livre do alcance de pó. Foi através da

manutenção adequada destes instrumentos caros, por colegas que lhe

antecederam, que permitiu que você hoje as utilizasse. Não quebre esta cadeia.

2. Procedimentos Gerais

A) Flambagem da alça ou agulha bacteriológica: colocar o instrumento sobre a

chama, numa inclinação aproximada de 45º e nunca em posição horizontal para

não esterilizar só a porção final e sim toda a alça.

B) Abrir o tubo de cultura: para os destros: sugere o tubo com a mão esquerda e

retire o tampa com os dedos mínimo e anelar da mão direita, deixando livres os

dedos médios, indicador e polegar para manuseio da alça bacteriológica e da

pipeta, evitando assim deixar a tampa sobre a bancada o que livraria a sua

contaminação.

C) Abrir a placa de petri: coloque a placa fechada sobre a bancada, com a tampa

para baixo. Retire o fundo da placa com a mão esquerda e assim você terá a mão

direita livre para semear microrganismos na superfície do meio de cultura.

D) Semeadura por esgotamento: semeie o material contido numa alça ou “Swab”

num dos quadrantes da placa com movimentos de vai e vem. Gire a placa 90º e

repita esses movimentos atingindo apenas um dos quadrantes. Gire novamente a

placa e repita o procedimento anterior. No 4º quadrante da placa faça um zigue-

zague largo. Com isso você obterá colônias isoladas.

E) Semeadura em profundidade, em tubos: semeie o material contido em uma

agulha fazendo picadas até o fundo do tubo, com isso haverá o crescimento de

microrganismos facultativos.

F) Confecção de um bom esfregaço: Desengordure a lâmina passando-a

livremente pela chama e limpando-a com um papel absorvente. Coloque no

centro da lâmina o material a ser corado evitando a concentração excessiva num

único local, mas proporcionando a obtenção de um esfregaço denso. Em seguida

passe pela chama a parte oposta da lâmina, para fixar o esfregaço que estará

pronto quando todo o material estiver seco. Não esqueça de identificar o lado da

lâmina onde fez o esfregaço. Em seguida realize a coloração desejada.

3. Equipamentos e Materiais Comumente Utilizados Em Laboratórios De Microbiologia

Alça e agulha de platina Bico de Bunsen Placas de Petri e tubos de ensaio Meios de cultura Solução salina estéril Pipetas Pasteur, zaragatoas (“swabs”) Lâminas e lamínulas para microscopia Corantes Microscópio Estufa Banho-maria Autoclave

4. Cuidados Para Se Evitar Contaminação De Culturas

1) A alça e agulha de platina devem ser flambadas, isto é, aquecidas na chama do bico de

Bunsen até se tornarem vermelhas, antes e depois de qualquer procedimento de semeadura. A

flambagem é mais facilmente e eficientemente conseguida mantendo-se a agulha ou alça num

ângulo de 45º em relação à mesa de trabalho. Antes da coleta do material, deve-se resfriar o

instrumento, na parede do tubo, no próprio meio estéril, ou simplesmente aguardando o seu

desaquecimento natural por alguns segundos.

2) Em relação às semeaduras procedidas em tubos de ensaio, exige-se flambar a boca dos

mesmos após a retirada e antes da colocação do tampão de algodão. O tampão de algodão deve

ser segurado pelo dedo mínimo da mão oposta à que segura o tubo e nunca deixado sobre a

bancada.

3) As pipetas são previamente esterilizadas e embrulhadas em papel. Para sua utilização e ao

mesmo tempo evitar que se contaminem, deve-se torcer o papel na região central da pipeta,

retirar primeiramente a parte superior do papel e depois a inferior (ponta da pipeta). Depois de

utilizada, a pipeta deverá ser colocada dentro de um recipiente apropriado, contendo solução

desinfetante.

4) Todo recipiente (placas de Petri ou tubos de ensaio) com cultura ou meio estéril deverá ser

manuseado com cuidado de modo a não ficarem abertos e expostos ao ambiente. Com esta

medida e mais a exigência de abri-los somente próximo ao bico de Bunsen em tempo suficiente

para a semeadura, colheita do material ou simples inspeção, será evitada a sua contaminação por

microrganismos do ar. Uma vez semeados, devem ser incubados em estufa. As placas de Petri

devem ser envolvidas por filme plástico (tipo Magipack) antes de ser colocadas na estufa e

devem permanecer com as tampas voltadas para baixo.

5.CONTROLE DE MICRORGANISMOS

O bem estar da humanidade depende em grande parte da capacidade do homem em controlar a população dos microrganismos, visando:

- Prevenir a transmissão de doenças.

- Evitar a decomposição de alimentos.

- Evitar a contaminação da água e do ambiente.     Esse controle de microrganismos é possível pela ação de agentes físicos e químicos, que possuem propriedades de matar a célula microbiana, ou de impedir a sua reprodução.A seguir alguns termos:

Esterilização - significa a destruição total da população microbiana e este termo deve

ser empregado sempre em caráter absoluto, não sendo jamais empregado quando não

houver a destruição total dessa população.

Desinfetante - deve ser usado para os agentes capazes de matar as formas vegetativas

dos microrganismos, não impedindo a sobrevivência de determinados estruturas de

resistência, como os endósporos por exemplo.

Antisséptico - termo utilizado para indicar um produto capaz de causar morte

microbiana e utilizado em tecido vivo.

Degermação é o ato de redução ou remoção parcial dos microrganismos da

pele, ou outros tecidos por métodos quimiomecânicos. É o que se faz quando se

lava as mãos usando água, sabão e escova (manilúvio

Anti-sepsia é o método através do qual se impede a proliferação de

microrganismos em tecidos vivos com o uso de substância químicas (os anti-

sépticos) usadas como bactericidas ou bacteriostáticos. Uma mesma substância

química usada em objetos inanimados será chamada de desinfectante e quando

usada em tecidos vivos será chamada de anti-sépticos

Quando um determinado produto exerce uma ação específica sobre determinado grupo de

microrganismos, ele é chamado de fungicida, bactericida, etc., se sua ação for sobre fungos ou

bactérias, respectivamente.

Já os termos Fungistático e Bacteriostático devem ser usados apenas quando eles inibem as

atividades vitais daquele determinado microrganismo sem matá-lo.

6. As bactérias podem ser classificadas quanto à forma de 3 grupos básicos: Cocos – células esféricas Bacilos – células cilíndricas, em forma de bastonetes Espirilos – células espiraladas, algumas células se comportam como bacilos curvos que

podem ser denominadas de víbrio

Cocos (A);Diplococos (B);Bacilos (C);Cocobacilos ( D) e Espiroqueta (E)

Formas:

7. COLORAÇÃO DE GRAM A coloração de Gram é uma coloração diferencial, através da qual as bactérias

são classificadas em Gram-positivas ou Gram-negativas, dependendo da retenção ou

não do corante cristal-violeta, esta reação é de grande importância para a sistemática

bacteriana.

Reagentes

- Solução de cristal violeta, Solução de lugol (iodeto de potássio - KI), Solução de

fucsina, Solução álcool – acetona

Material

- Suspensão bacteriana, lâminas, lamínulas, alça de inoculação, bico de Busen, pinças,

microscópio, óleo de imersão, pipeta Pasteur.

Preparação do esfregaço bacteriano

a) Limpar bem uma lâmina de vidro, (passar algodão embebido em álcool).

b) Quando se tratar de uma cultura em meio líquido, com uma alça de inoculação,

tomar uma pequena porção da cultura, observando as precauções de assepsia, e

colocá-la sobre a lâmina espalhando-a para formar uma película bem fina.

c) Quando for uma cultura em meio sólido, colocar uma gota de água destilada estéril

sobre a lâmina e com uma alça de inoculação, colher uma pequena quantidade de

crescimento bacteriano da superfície do ágar e suspendê-la na gota de água

destilada, espalhando suficientemente para obter um esfregaço fino. Esta etapa é

chamada de homogeneização.

d) Deixar o esfregaço secar ao ar próximo da chama. Etapa de dessecação.

e) Fixar o esfregaço, ao ar ou passando a lâmina três vezes sobre a chama. Etapa de

fixação

f) Deixar a lâmina esfriar.

Método de coloração de gram

a) Cobrir a esfregaço seco e fixado com a solução de cristal violeta (corante básico),

esperar um minuto.

b) Remover o excesso da solução de cristal violeta da lâmina, lavando-a levemente

com água corrente ou destilada.

c) Cobrir o esfregaço com solução de lugol durante um minuto. Lavar levente com

água corrente ou destilada

d) Descorar o esfregaço usando uma solução de álcool – acetona (gotejar a solução até

que não saia mais o corante, ou deixar sobre a lâmina por 30 segundos). Lavar

levente com água corrente ou destilada

e) Cobrir o esfregaço com solução de fucsina, durante 30 segundos.

f) Lavar levemente com água corrente.

g) Esperar a lâmina secar naturalmente ao ar livre, ou enxugá-la delicadamente com

papel filtro, através de leve compressão do mesmo sobre a lâmina.

Microscopia

Examinar a lâmina ao microscópio, usando objetiva de imersão (aumento de 100

vezes). As bactérias coliformes são bacilos, Gram-negativos (coradas de vermelho) e

podem aparecer aos pares ou em arranjo paliçada. As bactérias classificadas como

Gram-positivas são coradas de roxo (violeta azulado).

A Tabela abaixo mostra as reações e o aspecto das bactérias coradas por este método.Soluções em ordem de aplicação

GRAM - POSITIVAS GRAM - NEGATIVAS

1- Cristal violeta - CV Células coradas em violeta Células coradas em violeta2- Solução de iodo (lugol) - I Formação do complexo CV-I

no interior das células, que permanecem violetas

Formação do complexo CV-I no interior das células, que permanecem violetas

3- Álcool Desidratação das paredes celulares, diminuição da porosidade e da permeabilidade: o complexo CV-I não pode sair das células que permanecem violetas.

Extração dos lipídios da parede celular, aumentando a porosidade: O complexo CV-I é removido das células

4- Safranina As células não são afetadas, permanecendo violetas.

As células tomam o corante, tornando-se vermelhas.

Resultados: Expressar o resultado evidenciando ou não a presença de bactérias gram-negativas e gram positivas .

Quando as estruturas celulares são cobertas pelo corante cristal violeta, todas se coram

em roxo. Com a adição do mordente (Soluto de Lugol), ocorre à formação do complexo

iodo-pararosanilina, que tem como propriedade fixar o corante primário nas estruturas

coradas.

Algumas estruturas perdem a cor violeta rapidamente, quando ocorre a lavagem, com

ácool etílico, enquanto outras perdem sua coloração mais devagar ou a perdem

completamente. O corante de fundo, fucsina colore novamente as estruturas que foram

descoradas.

As bactérias Gram-positivas, que têm a parede celular composta por mureína

(peptídeoglicano – peptídeo de ácido n-acetil murâmico e ácido n-ácetil glicosamina),

durante o processo de descoloração com álcool etílico, retém o corante, permanecendo

com a coloração conferida pelo corante primário (roxo).  Já as bactérias Gram-negativas

com parede celular composta predominantemente por ácidos graxos (lipopolissacarídeos

e lipoproteínas), perdem o complexo iodo-pararosanilina, são incapazes de reter o

cristal violeta, assumindo a cor do corante de fundo (vermelha).

São as diferenças da estrutura da parede bacteriana, com relação à composição química

da parede celular e espessura da camada de peptidoglicano, que é responsável pelo

diferente comportamento das bactérias diante da coloração de Gram.

Questões da ténica de Gram

Comente cada uma das etapas da coloração de Gram Descreva a estrutura e composição das paredes das bactérias Gram-positivas

e Gram-negativas.

8. COLORAÇÃO DE ESPOROS (Método de Wirtz-Conklin)O esporo ou endósporo bacteriano é uma estrutura de parede espessa formada no

interior de algumas bactérias. É muito resistente ao calor, à dessecação e outros agentes

químicos e físicos, sendo capaz de permanecer em estado latente por longos períodos e,

em seguida, germinar, dando origem a uma nova célula vegetativa. O esporo é formado

por vários envoltórios. O primeiro, mais externo, fino, formado por proteínas, é

denominado exospório. Abaixo do exospório fica a capa do esporo, formada por várias

camadas de proteínas ricas em ligações de dissulfetos, resposáveis pela resistência do

esporo a agentes químicos e físicos. Mais internamente fica o córtex do esporo, formado

por camadas de peptidioglicano. Abaixo do córtex localiza-se o protoplasto ou cerne do

esporo formado pela parede celular, citoplasma, material genético, provenientes da

célula vegetativa. Os esporos são difíceis de serem corados, pois os corantes geralmente

não atravessam a parede do esporo a não ser que seja utilizado o calor.

Exemplo, espécies de Bacillus e Clostridium, forma esporos (ou endosporos) .

Reagentes

- Verde malaquita 5%, safranina/ fucsina

Material

- Suspensão bacteriana, lâminas, alça de inoculação, bico de Busen, pinças,

microscópio, óleo de imersão, pipeta Pasteur.

Método de coloração de esporos

a) Cobrir a esfregaço seco e fixado com a solução de verde malaquita.

b) Aquecer até que se desprendam vapores () 5 – 8 min , sem deixar ferver ou secar.

c) Lavar em água corrente.

d) Cobrir a lâmina com solução de safranina, durante 30 segundos.

e) Lavar em água corrente e secar.

Microscopia

Examinar a lâmina ao microscópio, usando objetiva de imersão. Observar os

microrganismo que se apresentarão da seguinte maneira:

- célula vegetativa: vermelha

- endósporo: verde

- esporos bacterianos livres: verdes brilhantes

- microrganismos não esporulados: vermelhos

Resultados: Examinar a amostra ao microscópio óptico. As células vegetativas

apresentarão coloração avermelhada e os esporos serão corados em verde.

1.Em qual cor é visto o esporo? E a célula vegetativa? Explique como isso ocorre.2. Por que essa coloração é feita a quente?

9.COLORAÇÃO DE ESPIROQUETA (Método de Fontana-Tribondeaux)

As espiroquetas são bactérias espiraladas, delgadas e flexíveis. Amplamente distribuídas

na natureza, muitas são encontradas na cavidade oral humana e algumas podem causar

doenças como a sífilis, a leptospirose e a doença de Lyme. Esses microrganismos

podem ser observados ao microscópio em preparações a fresco ou pela técnica de

Fontana-Tribondeaux, em que sais de prata impregnam a superfície da bactéria

tornando-a mais espessa. Espirilos e espiroquetas tem pouca afinidade pelos corantes

comumente empregados e coram-se fracamente. Quando tratados com sais de prata, as

espiroquetas podem ser visualizadas em marrom-escuro ou negro

contra um fundo castanho-amarelado.

Técnica:a) cobrir a lâmina com algumas gotas de solução fixadora e

renová-la durante 30 a60 segundos, afim de desemoglobinizar e

fixar o esfregaço;

b) cobrir a lâmina com álcool absoluto e deixar evapovar;

c) cobrir com solução de tanino (mordente),aquecendo a lâmina

até a emissão de vapores, durante 30 segundos;

d) tratar pela solução impregnada de nitrato de prata amoniacal,

durante 10 a 15 segundos e em seguida aquecer ligeiramente a

lâmina,até o desprendimento de vapores,por 30 segundos(a

preparação deve adquirir a cor marrom);

e) lavar bem em água destilada

f) secar com papel-filtro,sem aquecer;

g) examinar com objetiva de imersão.

Qual o princípio da coloração para espiroquetas?

FUNGOSCOLORAÇÃO COM LACTOFENOL AZUL ALGODÃOa) finalidade: O método de coloração com Lactofenol Azul Algodão é usado para

preparar exame microscópico de colônias de fungos. É uma técnica que tem a finalidade

de visualizar o micélio vegetativo e reprodutor de um fungo filamentoso, como também

as características da célula vegetativa e reprodução por brotamento de leveduras.

b) técnica:

1. Colocar uma gota de lactofenol azul-algodão sobre a lâmina.

2. Retirar pequeno fragmento da cultura de bolor ou uma alíquota da

cultura de levedura, utilizando alça ou fio de platina.

3. Colocar o fragmento da cultura ou a alíquota de levedura sobre a gota

de lactofenol.e homogeneizar.

4. Cobrir com lamínula e examinar ao microscópio nas objetivas de 10 e

40 vezes.

c) interpretação

Na coloração com lactofenol azul algodão é possível observar que existem dois

tipos morfológicos de fungos: as leveduras e os filamentos (bolores ou micélios).

As leveduras são unicelulares e podem ter diferentes formatos (oval, circular,

naveta, etc) e se reproduzem por brotamento ou por fissão.

Os bolores são fungos filamentosos possuindo hifas septadas ou não septadas.

c) interpretação

Na coloração com lactofenol azul algodão é possível observar que existem dois tipos

morfológicos de fungos: as leveduras e os filamentos (bolores ou micélios).

As leveduras são unicelulares e podem ter diferentes formatos (oval, circular, naveta, etc) e se

reproduzem por brotamento ou por fissão.

Os bolores são fungos filamentosos possuindo hifas septadas ou não septadas.Na sua

reprodução assexuada, é possível visualizar no micélio vegetativo os clamidósporos e

artrósporos, e no micélio reprodutor, os esporos endógenos (esporangiósporos) em esporângios

(estrutura fechada) e esporos exógenos (conidiósporos, também denominados simplesmente

conídios ou conídias) em conidióforos.

A vantagem desta técnica é de ser fácil e rápida a sua preparação, e a

desvantagem é que em muitos fungos não se observa os órgãos de frutificação.

CULTURA EM LÂMINA PARA FUNGOS FILAMENTOSOS

a) finalidade: Utiliza-se este método quando há necessidade de se obter orgãos de frutificação

em boas condições para estudo morfológico detalhado.

b) fundamento: A cultura cresce na lâmina e na lamínula, aparecendo os órgãos bem separados

e intactos quando se retira o bloco de ágar, permitindo estudo minucioso da micromorfologia.

c) material:

- Placas de Petri com lâminas dispostas sobre bastão de vidro em “U” ou “V”,

esterilizadas;

- Lamínulas;

- meio de cultura;

- Água destilada esterilizada;

- Algodão;

- Formol;

- Lactofenol azul algodão;

- Culturas: - suspeita de dermatófitos ou outro filamentoso

d) técnica (Método de Riddel)

1. Cortar o meio de cultura em pequenos fragmentos (± 1 cm2);

2. Colocar, com assepsia, um fragmento sobre a lâmina esterilizada;

3. Semear o fungo em cada lado do fragmento do meio de cultura;

4. Colocar uma lamínula limpa e previamente flambada sobre o referido

meio;

5. Adicionar, à placa, algodão embebido em água destilada, a fim de manter

a umidade no meio;

6. vedar a placa com filme plástico;

7. Incubar à temperatura ambiente e observar diariamente o crescimento;

8. Quando houver desenvolvimento satisfatório, submeter à ação do formol

(adicionar 1,0 mL sobre o algodão e deixar agir por 1 hora);

9. Retirar a lamínula e o fragmento do meio;

10. Corar a lâmina, colocando-se uma gota de lactofenol-azul-algodão;

11. Depositar a lamínula e fechar com esmalte;

12. Observar ao microscópio e desenhar os órgãos de frutificação.