Apostila de Fundamentos de Patologia Clínica

Colégio Dr. Clóvis Bevilácqua Técnico em Patologia Clínica

Profª Georgia Winkler

FUNDAMENTOS

DA PATOLOGIA CLÍNICA



FUNDAMENTOS DA PATOLOGIA CLÍNICA •••• O Curso – visa fornecer todos os subsídios e todo o conhecimento necessário para habilitar o

aluno na prática técnica da área de Patologia Clínica. •••• O Profissional – atua como Técnico em Patologia Clínica, ou seja, em Laboratório de Análises

Clínicas, sendo capacitado a exercer atendimento ao público, coleta, manipulação e preparo de amostras, e procedimentos técnicos. Essa é uma atividade profissional de suma importância na área da saúde, a qual requer alto comprometimento ético e responsabilidade do profissional.

•••• O Laboratório – antigamente pouco explorado pelos médicos. Atualmente, amplamente utilizado – detecção de distúrbios orgânicos (doenças), confirmação de diagnóstico clínico, prevenção de doenças ou acompanhamento de terapêutica.

•••• Funções do técnico de patologia clínica: preparo de materiais para coleta de materiais biológicos; coleta desses materiais; manipulação, preparo dos materiais colhidos (triagem e distribuição), preparo de materiais utilizados em técnicas analíticas (insumos e amostras) e realização das técnicas competentes a cada setor laboratorial.

•••• Setores laboratoriais: recepção, coleta de materiais, triagem e distribuição de materiais, setor de lavagem e esterilização de materiais, setores técnicos (Urinálise, Parasitologia, Hematologia, Bioquímica, Citologia, Microbiologia, Sorologia - Imunologia, Virologia, Dosagens Hormonais, e Biologia Molecular), Supervisão de Resultados e Emissão de Laudos.

- Recepção: é realizado o cadastro do paciente, cadastro dos exames requeridos pelo médico e encaminhamento da requisição de exames para o setor de coleta. Freqüentemente o setor de recepção também recebe amostras que eventualmente não foram entregues no dia em que foi feita a requisição (amostra de fezes)

- Coleta de Materiais: é realizada a coleta amostras biológicas como sangue venoso, urina, secreção vaginal, esperma, citologia oncótica (Papanicolaou), amostras micológicas. Também é realizada parte de alguns exames específicos, como coagulograma. No final do atendimento, sempre se realiza a conferência entre o material coletado e a requisição.

- Triagem e Distribuição de materiais: é realizada a conferência do material coletado junto à requisição, os materiais são separados por setor, e aqueles que requerem preparo pré-analíticos são manipulados. Após a conferência, a separação e o preparo pré-analítico, realiza-se a impressão dos mapas de trabalho (contém os dados do paciente e os exames a serem realizados).

- Lavagem e Esterilização de Materiais: executa manobras complementares aos setores técnicos e ao setor de coleta de materiais, através da lavagem de materiais reutilizáveis (como vidraria) e esterilização de materiais de todos os tipos, descartáveis ou não.

- Setores técnicos: é realizado o processamento da amostra, ou seja, as provas e análises técnicas.

� Urinálise: estuda o sistema excretor através da análise de urina e de seus componentes.

� Parasitologia: estuda o aparelho digestivo, seu funcionamento e detecta a presença ou a ausência de parasitasitismo, tudo através das fezes.

� Hematologia: estuda o sistema sanguíneo, sua morfologia, componentes, seu funcionamento e detecta anomalias celulares ou presença de parasitismo.

� Bioquímica: executa a qualificação e a quantificação de substâncias presentes em fluídos como sangue, soro, plasma, urina, líquor, suor, saliva através das análises bioquímicas.

� Citologia: estuda a análise da morfologia celular. Esse tipo de análise geralmente é realizada por profissionais especializados em citologia e patologia. O técnico de patologia é restrito ao preparo dos materiais a serem analisados pelo especialista.

� Microbiologia: estuda bactérias e fungos, seres causadores de sérias patologias, em diversos tecidos.



� Sorologia: estuda o soro sanguíneo, dosando e detectando seus componentes (Dosagens Hormonais e Imunológicas e - Virologia)

� Biologia Molecular: estuda, com alto grau de especificidade, sensibilidade e exatidão, vários tecidos corpóreos. É o setor laboratorial que definitivamente certifica a presença ou ausência das propriedades investigadas. Por requerer normas específicas de funcionamento, é um setor que não está presente em todos os tipos de laboratório de análises clínicas.

- Supervisão de Resultados – setor responsável pela averiguação dos resultados obtidos pelos setores técnicos. Geralmente essa averiguação é realizada pelo profissional Biomédico, ou pelo Biólogo ou Farmacêutico especialista em Análises Clínicas.

- Emissão de Laudos – setor responsável pela impressão (emissão) dos laudos dos pacientes. Esses laudos, após serem emitidos, passam pela supervisão do laboratório para serem assinados pelo profissional responsável (Biomédico ou especialista).

Ética Profissional É um conjunto de regras que regulamentam o exercício profissional. O profissional Técnico em Patologia Clínica é registrado no Conselho Federal de Farmácia para fins de trabalho junto a órgãos públicos, porém, deve sempre estar atento e seguir as normas em comum a todos os profissionais da saúde. São tarefas principais e primordiais do profissional Técnico em Patologia Clínica:

1- Tratar os pacientes / clientes de forma humana, ou seja, com respeito, ética, paciência e profissionalismo, independente da origem, sexo, cor, idade, posição social ou aparência do paciente / cliente.

2- Executar sua função com a máxima responsabilidade, atenção e cuidados em geral. “Você sempre deve lembrar que de seu trabalho, depende a vida de outra pessoa”.

3- Trata qualquer tipo de amostra com respeito, como se você estiver manipulando o próprio paciente. Afinal, a amostra foi / é parte dele.

Devemos salientar também, que: “O não cumprimento da Ética Profissional pode acarretar penalidades graves que vão desde a sua demissão (ou perda do exercício profissional) até complicações com a Justiça”.

RECEPÇÃO

LAUDOS

COLETA

TRIAGEM E DISTRIBUIÇAO

SETORES TÉCNICOS LAVAGEM ESTERILIZAÇÃO



INSTRUÇÕES GERAIS PARA O TRABALHO NO LABORATÓRIO REGRAS DE SEGURANÇA

1- O laboratório é um lugar de trabalho sério. Trabalhe com atenção, método e calma.

2- Prepare-se para realizar cada experiência, lendo antes os conceitos referentes ao experimento e a seguir, leia o roteiro da experiência.

3- Respeite rigorosamente as precauções recomendadas.

4- Consulte seu professor cada vez que notar algo anormal ou imprevisto.

5- Use um avental apropriado.

6- Não fume no laboratório.

7- Faça apenas as experiências indicadas pelo professor. Experiências não autorizadas são proibidas.

8- Se algum ácido ou qualquer outro produto químico for derramado, lave o local imediatamente com bastante água.

9- Não tocar os produtos químicos com as mãos, a menos que seu professor lhe diga que pode fazê-lo.

10- Nunca prove uma droga ou solução.

11- Para sentir o odor de uma substância, não coloque seu rosto diretamente sobre o recipiente. Em vez disso, com sua mão, ,traga um pouco de vapor até o nariz.

12- Não deixe vidro quente em lugar que possam pegá-lo inadvertidamente. Deixe qualquer peça de vidro esfriar durante bastante tempo. Lembre-se de que viro quente tem a mesma aparência do vidro frio.

13- Só deixe sobre a mesa, bico de Bunsen aceso quando estiver sendo utilizado.

14- Tenha cuidado com reagentes inflamáveis, não os manipule em presença de fogo.

15- Quando terminar o seu trabalho, feche com cuidado as torneiras de gás, evitando escapamento.

16- Não trabalhe com material imperfeito.

17- Observe com atenção as técnicas de aquecimento de líquidos.

18- Utilize sempre que necessário materiais que possam garantir maior segurança no trabalho, tais como: pinça, luvas, óculos etc.

19- Comunique ao seu professor qualquer acidente, por menor que seja.

20- Jogue todos os sólidos e pedaços de papel usados num frasco ou cesto para isso destinados. Nunca jogue nas pias, fósforos, papel filtro, ou qualquer sólido ainda que ligeiramente solúvel.

21- Leia com atenção o rótulo de qualquer frasco de reagente antes de usá-lo. Leia duas vezes para Ter certeza de que pegou o frasco certo. Segure o frasco pelo lado que contém o rotulo para evitar que o reagente escorra sobre este.

22- Nunca torne a colocar no frasco um droga não usada. Não coloque objeto algum nos frascos de reagentes, exceto o conta-gotas próprio de que alguns eles são providos.

23- Conserve limpo seu equipamento e sua mesa. Evite derramar líquidos, mas, se o fizer, lave imediatamente o local.

24- Ao término do período de laboratório, lave o material utilizado e deixe-o na ordem em que encontrou no início da aula.



VIDRARIAS O vidro foi escolhido entre outros materiais em virtude de suas características físico-químicas muito favoráveis a sua utilização em laboratório, porque além de não apresentar porosidades, não permitindo que sujeira fique aderida, também mostra-se inerte a inúmeros reagentes, não sendo corroído, ou contaminando a mostra. Apresenta ainda a virtude de sua transparência quando desejada ou ainda sua pigmentação, quando se faz necessário a proteção da substância dos efeitos da luz.

Além destas qualidades, o vidro também apresenta grande estabilidade em sua forma, não sofrendo alteração no tamanho, durante sua vida útil e ainda, em algumas espécies, permite seu aquecimento.

Tipos e Classificações

Com toda esta variedade de características do elemento vidro, devemos classificar as vidrarias utilizadas em laboratório, a fim de evitarmos a utilização inadequada do instrumento. As classificações básicas das vidrarias em geral é a seguinte:

• Resistência ao calor

- Vidrarias refratárias: quando podemos aquecer o vidro. Geralmente possuem indicações como “Pirex”, “Pirobras” ou outras, impressas no vidro. Exs.: balão de fundo chato e de fundo redondo, becker, cadinho, cápsula de porcelana, erlenmeyer, tubo de ensaio etc.

- Vidrarias não refratárias: quando não podemos aquecê-las. Se aquecidas, fatalmente se quebram, podendo ocasionar sérios acidentes. Exs.: funis em geral, vidro de relógio, bastão de vidro, lâminas, lamínulas etc.

• Precisão:

- Vidrarias de precisão: possuem graduação (permite a medida do volume interno de líquido), capacidade e temperatura de aferição (quando fabricada, sua capacidade volumétrica é medida a exatos 20°C, o que permite a confiabilidade volumétrica quando manipulada à esta mesma temperatura). Exs.: proveta graduada, pipeta volumétrica, pipeta graduada, bureta, pipeta de Sahli etc.

- Vidrarias de semi-precisão: apresentam somente o volume aproximado, indicando sua margem de erro que pode ser de 10% ou 5%. Ex.: becker, balão volumétrico.

- Vidrarias de não-precisão: não apresentam escala nem margem de erro. Exs.: balão de fundo chato e de fundo redondo, vidro de relógio.

As vidrarias de precisão nunca devem ser aquecidas, pois perdem sua precisão em virtude da dilatação sofrida pelo vidro durante o processo de aquecimento.

Existem também outras vidrarias amplamente utilizadas em laboratório, que não acondicionam volumes de líquidos, as quais são: lâminas, lamínulas, bastão de vidro etc.

Seguem alguns desenhos das principais vidrarias e acessórios utilizados em laboratório:

Tubo de ensaio

Becker

Erlenmeyer

Balão de fundo chato

Balão de fundo

redondo

Balão de destilação



Balão

volumétrico

Kitassato

Funil de separação / decantação

Funil de Buchner

Funil de haste

longa

Proveta graduada

Pipeta Pipeta Bureta Condensador Graduada volumétrica

Pipeta de Sahli / Thoma Bico de Bunsen

Frasco de reagentes Pisseta Placa de Petri

Vidro de relógio Garra metálica de condensador Anel para funil

Pinça metálica Pinça de madeira Estante para tubos de ensaio

Escovas



PRINCIPAIS VIDRARIAS E ACESSÓRIOS LABORATORIAIS - Anel para funil: usado como suporte de funis. - Alça de platina: usada basicamente em microbiologia. Pode ser usada para outros fins. - Lâmina: usada por vários setores técnicos e para diversos fins. - Lamínula: usada por vários setores e para diversos fins. - Câmara de Neubauer: usada para contagem global de células vermelhas e brancas; usada em sedimentoscopia urinária.

- Balão de destilação: usado em destilações. Possui saída lateral para condensação de vapores. - Balão de fundo chato: usado para aquecimento e armazenamento de líquidos. - Balão de fundo redondo: usado para aquecimento de líquidos e reações de desprendimento de gases.

- Balão volumétrico: usado para preparar e diluir soluções. - Becker: usado para aquecimento de líquidos, reações de precipitação etc. - Bico de Bunsen: usado para aquecimentos de laboratório. - Bureta: usada para medidas precisas de líquidos. Usada em análises volumétricas. - Capilares: tubos de diâmetro reduzido usados em micropesquisas. São usados também em hematologia (hematócrito) e bacteriologia.

- Condensador: usados para condensar os gases ou vapores na destilação. - Dessecador: usado para resfriar substâncias em ausência de umidade. - Erlenmeyer: usado para titulações e aquecimento de líquidos. - Escovas: usadas para limpeza de tubos de ensaio e outros materiais. - Estante para tubos de ensaio: suporte de tubos de ensaio. - Frasco de reagentes: usado para o armazenamento de soluções. - Funil de Buchner: usado em conjunto com o Kitassato para filtração a vácuo. - Funil de haste longa: usado em transferências de líquidos e em filtrações de laboratório. - Funil de separação / decantação: usado para separação de líquidos imiscíveis. - Garra metálica: usadas em filtrações, sustentação de peças tais como condensador, funil de decantação e outros fins.

- Kitassato: usado para filtração a vácuo. - Pinça de madeira: usada para segurar tubos de ensaio durante aquecimentos diretos no bico de Bunsen.

- Pinça de Mohr e Pinça de Hoffman: usadas para impedir ou diminuir fluxos gasosos. - Pinça metálica: usada para transporte de cadinhos e outros fins. - Pipeta de Pasteur: usada para a transferência de líquidos. - Pipeta de Sahli: usada na dosagem de hemoglobina sangüínea. - Pipeta de Thoma: usada para medir a quantidade de células sangüíneas. - Pipeta de Westergreen: usada na determinação da velocidade de hemossedimentação. - Pipeta graduada: usada para medir volumes variáveis de líquidos. - Pipeta volumétrica: para medir volumes fixos de líquidos. - Pisseta: usada para lavagens, desinfeção, remoção de precipitados e outros fins. - Placa de Petri: usada para fins diversos. - Proveta graduada: usada para medidas aproximadas de volumes de líquidos. - Termômetro: usado para a medida de temperaturas. - Tubo cônico: usados em pesquisas bacteriológicas, sedimentoscopia urinária, pesquisas parasitológicas e bioquímica.

- Tubo de Ensaio: usado em reações químicas, principalmente testes de reação. - Tubo de Wintrobe: usada na determinação do volume celular sangüíneo – hematócrito. - Vidro de relógio: usado para cobrir beckers em evaporações, pesagens e fins diversos.



UNIDADES DE MEDIDA

As três principais grandezas físicas são: massa (medida em gramas), espaço (medido em metros) e tempo (medido em horas). Os múltiplos e submúltiplos do padrão são indicados por prefixos. Os principais prefixos utilizados são:

Nome Símbolo Fator de multiplicação da unidade

Tera T 1012 ou 1.000.000.000.000 Giga G 109 ou 1.000.000.000 Mega M 106 ou 1.000.000 Kilo k 103 ou 1.000 Hecto h 102 ou 100 Deca da 101 ou 10

Unidade padrão g, m, h 100 ou 1 Deci d 10-1 ou 0,1 Centi c 10-2 ou 0,01 Mili m 10-3 ou 0,001 Micro µ 10-6 ou 0,000001 Nano n 10-9 ou 0,000000001 Pico p 10-12 ou 0,0000000000001 Fento f 10-15 ou 0,000000000000001

Exercício: Converta os valores abaixo: a) 0,20 kg em g = b) 100 mL em litro = c) 200 mg em decagramas = d) 50 mL em µL = e) 10-3 kg em g = f) 5,0.102 mg em cg = g) 54 µg em g = h) 98 µl em L = i) 1000 mL em L = j) 100 mg/dL em µg/dL = k) 2,45 g/100mL em cg/dL = l) 34 g/dL em g/L = m) 0,245 g/L em mg/mL = n) 98,5 cg/L em mg/L = o) 67 g/dL em mg/L = p) 34 µg/L em g/dL = q) 22 µg/mL em g/L = r) 0,00015 kg/ml em g/ dl = s) 4,8 mg/10mL em g/L =



SOLUÇÕES O mundo que nos rodeia é constituído por sistemas formados por mais de uma substância: as misturas. A água que bebemos e o ar atmosférico são exemplos de sistemas comuns.

Soluções são misturas de duas ou mais substâncias que apresentam aspecto uniforme. Existem as soluções sólidas (latão = Cu + Zn), gasosas (ar atmosférico = N2 + O2 + CO2 etc) e as líquidas (água do mar = sais + O2 ; álcool = etanol + água).

Nos laboratórios e nas indústrias as soluções líquidas são as mais utilizadas. Essas soluções são sistemas homogêneos, formados por uma ou mais substâncias dissolvidas (soluto) num líquido (solvente), que não formam depósito no fundo do recipiente (corpo de chão). Portanto, SOLUÇÃO = SOLUTO + SOLVENTE. Concentração Comum (C) É a relação entre a massa do soluto e o volume da solução. C = massa do soluto__ C = m_ g/L; g/mL; mg/dL; ... volume da solução V

O rótulo do frasco de reagentes ao lado, nos indica que existe 50 g de NiSO4 em 1,0 L de solução: C = m_ = 50 g = C = 50 g/L V 1,0 L Assim, temos: 50 g de NiSO4 1,0 L de solução 25 g de NiSO4 0,50 L de solução

Exercícios: 1- Uma solução foi preparada adicionando-se 40 g de NaOH em água suficiente para produzir 400 mL de

solução. Calcule a concentração da solução em g/mL e g/L. 2- (Puccamp – SP) Evapora-se totalmente o solvente de 250 mL de uma solução aquosa de MgCl2 de

concentração 8,0 g/L. Quantos gramas de MgCl2 são obtidos? 3- Considere o esquema a seguir, dos qual foram retirados três alíquotas A, B, C, a partir de uma mesma

solução aquosa.

Responda às seguintes questões: a) Qual é a massa de soluto existente no

recipiente A? b) Qual é a concentração em g/mL da solução

contida no recipiente B? c) Qual é a concentração em mg/mL da

solução contida no recipiente C? d) Se toda a água presente na solução original,

após a retirada das três amostras, fosse evaporada, qual seria a massa de soluto obtida?



Concentração Molar (M) É a relação entre o número de mols do soluto e o volume da solução em litros.

M = nº de mols do soluto__ M = n _ mol/L ou M volume da solução(L) V(L)

Um mol é a soma das massa moleculares dos elementos que compõem uma determinada molécula. Exemplo: 1 mol de NaCl = Massa atômica do Na + Massa atômica do Cl 1 mol de NaCl = 23,0g + 35,5g 1 mol de NaCl = 58,5g Portanto, pode-se dizer que uma solução de NaCl a 1M, possui 58,5g de NaCl (soluto), diluída em 1L de solvente. Exercícios: 1- Identifique as palavras que preenchem corretamente as lacunas do texto a seguir:

Uma solução 2,0 molar, ou 2,0 M, de NaOH apresenta _____ mols de soluto para cada litro de solução. Assim, em 10 L dessa solução encontramos ____ mols de soluto.

2- Observe o frasco ao lado, que contém uma solução aquosa de ácido sulfúrico

(H2SO4), utilizada em laboratório, e responda às questões a seguir, sabendo que o volume da solução contida no frasco é 2,0 L.

a) Qual é o número de mols do soluto presente nessa solução?

b) Qual é a massa de soluto presente nessa solução? c) Qual é o volume dessa solução que contém 0,01

mol de H2SO4? d) Qual é a massa de soluto presente em 500 mL

dessa solução? (dado: massa molar do H2SO4 = 98g)



Diluição No laboratório clínico, é bastante freqüente o emprego de diluições de reagentes e amostras. Diluir é acrescentar solvente em uma substância ou solução para a alcançar a concentração desejada. As fórmulas mais utilizadas em laboratório clínica para se realizar diluições são:

C . V = C´. V´ M . V = M´. V´

Muitas vezes, as diluições são expressas como uma parte de solução original em um determinado número de partes de volume final. Isso é chamado de coeficiente de diluição. Por exemplo, um coeficiente de diluição 1:5, representa uma parte de solução original em um volume final de 5 partes, ou seja, 1 parte de solução final + 4 partes de solvente. Exercícios 1- A partir de uma solução aquosa de NaOH a 2M, como se deve preparar:

a) 10 mL a 0,1 M b) 50 mL a 0,2 M c) 300 mL a 1M d) 1000mL a 40g/l 2- (Fuvest-SP) Se adicionarmos 80 mL de água a 20 mL de uma solução 0,1 molar de hidróxido de

potássio, obteremos uma solução de concentração molar igual a: a) 0,010 b) 0,020 c) 0,025 d) 0,040 e) 0,050

3- (UFPI) A uma amostra de 100 mL de NaOH de concentração 20g/L foi adicionada água suficiente para completar 500 mL. A concentração, em g/L, dessa nova solução é igual a:

a) 2 b) 3 c) 4 d) 5 e) 8 4- (UFRN) O volume de água, em mL, que deve ser adicionado a 80 mL de solução aquosa 0,1 M de

uréia, para que a solução resultante seja 0,08 M, deve ser igual a: a) 0,8 b) 1 c) 20 d) 80 e)100

5- Para se realizar determinada análise bioquímica, é necessário o preparo de 1 L de solução tampão. Para o preparo dessa solução, deve-se diluir um reagente intitulado reagente A num solvente intitulado reagente B, sob um coefiente de diluição de 1:4. Como proceder?

Diluição seriada Em laboratório clínico, é comum a utilização da diluição seriada, que nada mais é do que uma série de diluições sucessivas, a partir de um índice inicial de diluição. O intuito da diluição seriada é a obtenção proporcional de concentrações decrescentes de uma solução ou amostra. Exemplo: O técnico de laboratório precisa realizar uma diluição seriada de sangue total em solução fisiológica, por 6 vezes, com coeficiente de diluição (índice) 1:2, obtendo o volume final de 0,5mL da solução em cada tubo de ensaio. Isso significa que o técnico terá de diluir o sangue 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32 e 1:64. Para fazer isso, ele fará o seguinte procedimento: - Identificar os tubos com o nome do paciente e o coeficiente de diluição - Pipetar 0,5 mL de solução fisiológica em cada um dos 6 tubos - Deverá pipetar 0,5 mL do sangue total (1:1), no tubo 1:2 e homogeneizar - Deverá pipetar 0,5 mL da solução do tubo 1:2 no tubo 1:4 - Deverá pipetar 0,5 mL da solução do tubo 1:4 no tubo 1:8 - Deverá pipetar 0,5 mL da solução do tubo 1:8 no tubo 1:16 - Deverá pipetar 0,5 mL da solução do tubo 1:16 no tubo 1:32 - Deverá pipetar 0,5 mL da solução do tubo 1:32 no tubo 1:64 - Deverá retirar 0,5 mL da solução do tubo 1:64 e desprezar, para que todos os tubos permaneçam

com o mesmo volume final.



ESPECTROFOTOMETRIA

Os métodos fotométricos compreendem os métodos analíticos baseados na medida da

energia radiante transmitida pelas soluções, emitidas pelas soluções fluorescentes ou, transmitidas ou refletidas pelas suspensões.

A energia radiante é formada de radiações eletromagnéticas com comprimento de onda ou freqüência, que cobrem uma extensa faixa que constitui o espectro eletromagnético total. Raios

gama Raios X Ultra-

violeta Espectro visível

Infra-vermelho

Radar TV Rádio

ANGSTRONS (Å) 1 10 1800 3800 7000 - - - NANÔMETROS (nm) - - 180 380 700 - - - MICRÔMETROS (µm) - - - - 0,7 - - - CENTÍMETROS (cm) - - - - - 0,1 103 106

Regiões espectrais - Ultravioleta (UV) = 200 < λ < 380-400 nm - Visível (Vis) = 380-400 nm < λ < 700-800 nm - Infravermelho (IF) = 800 nm < λ < 3300 nm

Espectro visível – cores

Uma solução se apresenta corada quando absorve radiações cujos comprimentos de onda se situam na região visível do espectro. Assim, uma solução, na mistura de todas as cores menos a amarela, se apresenta como tal por absorver as radiações do espectro visível com exceção daquelas de comprimento de onda correspondentes a porção do amarelo. Em outros termos, a coloração de um meio é complementar à da luz absorvente.

Nem todas as cores são absorvidas igualmente, a cor mais absorvida é a cor complementar. FAIXA DE COMPRIMENTO DE ONDA (λ) COR TRANSMITIDA COR COMPLEMENTAR

380 a 420 nm Violeta Laranja 420 a 490 nm Azul Amarelo 490 a 540 nm Verde Vermelho 540 a 580 nm Amarelo Azul 580 a 620 nm Laranja Violeta 620 a 800 nm Vermelho Verde

Os instrumentos que utilizam a medida da absorção e energia radiante por soluções e que tem maior aplicação em laboratório clínico são: 1- Colorímetro: aparelhos que se utilizam de filtros compostos para selecionar porções o

espectro a serem utilizadas como cromadores. 2- Espectrofotômetros: aparelhos que se utilizam de redes de difração ou prima-filtro na

seção da porção desejada do espectro com cromadores. Conceitos: - Luz: forma de energia radiante que se propaga através de ondas, cujo comprimento

determina sua cor. - Luz Policromática: luz branca emitida pelo sol ou pelas lâmpadas de incandescência que

contém todos os comprimentos de onda visíveis. - Luz Monocromática: é o resultado da passagem de luz branca por um monocromador, e

que contém apenas uma faixa de comprimento de onda, sendo caracterizada por apresentar cor.

- Cor: resultado do fenômeno físico a absorção da luz.



Espectrofotômetro O espectrofotômetro é empregado para medir a quantidade de luz que uma amostra absorve ou a quantidade de luz que é transmitida através da solução quando se incide luz sobre a mesma. O princípio da espectrofotometria é passar um feixe de luz através da amostra e medir a intensidade da luz que atinge o detector. Portanto, espectrofotômetros em geral, são instrumentos compostos por um conjunto de componentes do seguinte tipo: uma fonte de radiação eletromagnética, um conjunto de componentes ópticos que levam esta radiação até a amostra, um compartimento de amostra e um ou mais detectores que medem a intensidade de radiação emitida. Segue abaixo o esquema de um espectrofotômetro.

a. Luz – Fonte de energia radiante capaz de emitir uma mistura de comprimento de onda b. Fenda de entrada c. Prisma óptico d. Fenda de saída

b + c + d = Monocromador usado para isolamento da porção desejada do espectro e. Porta cubeta – recipiente onde se coloca a cubeta contendo a solução a ser medida f. Detector – utilizado para receber a energia radiante transmitida através da solução e

transformá-la em energia elétrica g. Circuito medidor ou Galvanômetro – recebe energia elétrica emitida pelo detector

apresentando-a ao operador sob uma forma útil de medida. Tipos de componentes - Fontes de Energia Radiante:

- Lâmpada de tungstênio: utilizada para região UV próximo e visível - Lâmpada de deutério: utilizada para a região do UV - Lâmpada de xenônio: utilizada para a região do IV

- Monocromadores:

- Filtros de vidro: transmite faixa ampla de comprimento de onda - Prismas: transmite pequena faixa de onda - Redes de difração: transmite pequena faixa de comprimento de onda

- Cubetas:

- Vidro: utilizada para a região do visível - Quartzo: usada para a região do UV - Plástico: usada para a região do visível e UV

- Detectores: Foto células ou Foto multiplicadores



Lei de Lambert-Beer Quando uma radiação monocromática passa através de uma solução, ,uma parte da energia é absorvida pelo meio, enquanto a parte restante é transmitida. Através da espectrofotometria, podemos verificar duas grandezas: 1- Transmitância: quantidade de energia radiante transmitida pela solução. A transmitância

é dada pela relação entra a intensidade da radiação transmitida (I) e a intensidade da radiação incidente (Io), ou seja, T = I/Io. Seu valor varia de zero a 1 (ou 0 a 100%), sendo que, quando T=O, toda a luz incidente é absorvida (I=O); quando T=1 toda a luz incideente é transmitida (I=o).

2- Absorbância: quantidade de energia radiante absorvida pela solução. A absorbância ou densidade óptica (DO) é diretamente proporcional à concentração da amostra.

Para se determinar a concentração de uma determinada solução, geralmente utiliza-se um Fator de Proporcionalidade (ou Fator de Calibração), o qual é obtido através da relação entre a concentração e a absorbância de uma solução padrão de concentração exatamente conhecida (no caso de uma análise bioquímica, a solução padrão vem juntamente com o kit industrializado comprado, e sua concentração vem impressa no rótulo). [padrão]

Portanto, F = abs. padrão

Uma vez conhecido o Fator de proporcionalidade, fica fácil se descobrir a concentração da solução teste. Basta realizar a seguinte equação:

[solução teste] = F x absorbância da solução teste

Exemplo: Determinação da [Hb] de uma amostra. [padrão] = 13,6 g/dL abs. padrão = 0,412 abs. amostra = 0,390

13,6 [Hb amostra] = 0,390 x 33 F = = 33 [Hb amostra] = 12,87 g/dL 0,412

Realização de Análise Bioquímica Manual por Espectrofotometria (Colorimetria) Para se realizar qualquer análise colorimétrica manual, utiliza-se, no mínimo, 3 tubos de ensaio: - Tubo Branco (B): deverá conter apenas o reagente de uso (cromógeno ou reagente de

cor) utilizado para a reação. Esse tubo tem a finalidade de “zerar” o aparelho, e deve ser o primeiro a passar pelo aparelho.

- Tubo Padrão (P): deverá conter o reagente de uso e o padrão (do kit). A reação que ocorrerá entre esses dos reagentes deverá obter um resultado de absorbância e concentração conhecidos. Esse tubo serve para se obter um Fator de Calibração, além de servir como um meio de se saber se a pipetagem dos reagentes está sendo feita corretamente.

- Tubo Teste (T): deverá conter o reagente de uso e a amostra a ser analisada. A absorbância obtida através dessa análise deverá ser multiplicada pelo Fator obtido, afim de se obter a concentração final da mesma.



FOTOMETRIA DE CHAMA

A fotometria de chama é uma técnica da espectroscopia de emissão, baeada no uso da chama. A amostra, em forma de uma solução, é nebulizada, em condições controladas, em uma chama. O número de elementos excitáveis, depende da temperatura da chama. A chama ordinária de ar-gás (ar comprimido seco e gás liquefeito de petróleo – GLP) chega a atingir cerca de 1700°C, e é muito utilizada em laboratório de análises clínicas, para a dosagem de íons como Na, K, Li e Ca.

Esses íons emitem radiações intensas, na região do visível, as quais são isoladas com filtro ótico ou monocromadores. A intensidade da radiação emitida é diretamente proporcional à concentração do elemento emissor. Essa intensidade é medida por uma célula fotomultiplicadora associada a um galvanômetro.

O fotômetro de chama é composto, basicamente, por seis partes: - Reguladores de pressão e os medidores de fluxo de gases - Nebulizador da solução - Combustor para a produção da chama - Sistema ótico, comportando filtros óticos ou monocromador - Detector fotossensível - Galvanômetro

Segue esquema simplificado do fotômetro de chama:

a- Amostra (soro); b- Oxidante: ar comprimido seco; c- Combustível (GLP); d- Chama; e- Refletor de energia radiante; f- Filtro ou monocromador; g- Fenda de saída; h- Detector fotossensível; i - Galvanômetro

Certos cuidados e detalhes devem ser observados para o perfeito funcionamento desse

sistema, tais como: - Acúmulo de sujeira na câmara de mistura, obstruindo a passagem da amostra provocam

oscilações na medida. - Obstrução do cateter, ou capilar, impede a entrada da amostra; - Deterioração dos filtros óticos e foto - detetores, causa perda da sensibilidade ou a não

leitura; - Oscilações na rede elétrica ocasionam variações na leitura. - Equipamento conectado em tensão inadequada, poderá levar a danos na fonte de

alimentação. - Válvulas de ar e/ou gás travadas, não permitem o correto ajuste da chama.



CROMATOGRAFIA A cromatografia é um método de permite separar, isolar e quantificar substâncias mesmo em misturas muito complexas. Existem várias técnicas cromatográficas que vão das mais simples, como a cromatografia de coluna e camada fina, até as mais sofisticadas e computadorizadas, como a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). O ponto comum entre essas técnicas e que caracteriza o método é o fato de os componentes da mistura, ou amostra, serem distribuídos entre duas fases. Uma delas permanece fixa, e por isso é chamada de fase estacionária (FE), enquanto outra percola através da FE, sendo então chamada de fase móvel (FM). - FE: geralmente é um material sólido, podendo ser um papel filtro, ou colunas de vidro, gel

de agarose, acetato de celulose, gel de poliacrilamida etc. - FM: pode ser composta por uma solução líquida (soluções tampão ou diluentes) ou gasosa

no caso das cromatografias gasosas.

Os componentes da amostra ou mistura a ser estudada se separam segunda sua afinidade com a FE ou com a FM.

Exemplos de cromatografia: - Cromatografia em papel: o papel filtro é a FE. Fixa-se a amostra a ser analisada neste

papel, e coloca-o em contato com a FM líquida, a qual, por capilaridade, é absorvida pelo papel, possibilitando a separação das frações da amostra estudada.

- Eletroforese de proteínas lipídeos ou hemoglobina: permite a separação proteínas séricas, frações lipídicas e frações de hemoglobina sanguínea. Num suporte de gel de agarose (FE), pipeta-se o volume da amostra a ser analisada. O suporte contendo a amostra, é colocado numa câmara de eletroforese, a qual deve conter dois eletrodos (polo negativo e positivo) interligados pela FM, que seria uma solução tampão com pH específico que permite a formação da corrente elétrica. Essa corrente elétrica permite a separação das frações estudadas, fazendo com que elas “corram” pelo gel do suporte de acordo com seu peso molecular e carga elétrica. Após a corrida eletroforética, o suporte é corado e depois descorado, a fim de possibilitar a visualização de bandas.

- Cromatografia gasosa: é uma técnica que separa e analisa misturas de substâncias voláteis. A amostra é vaporizada e introduzida em um fluxo e gás adequado ou gás de arraste (FM). Este fluxo de gás com a amostra vaporizada passa por um tubo contendo a FE (coluna cromatográfica), onde ocorre a separação da mistura. As substâncias separadas saem da coluna dissolvidas no gás de arraste e passam por um detector que gera um sinal elétrico proporcional à quantidade de material eluido. O registro deste sinal em função do tempo é o cromatograma, sendo que as substâncias parecem nele como picos com área proporcional à sua massa, o que possibilita a análise quantitativa da amostra.



MICROSCOPIA Microscópio Óptico

É o microscópio mais utilizado em laboratórios de análises clínicas. Assim como outros tipos de microscópios, o microscópio óptico (MO) é composto pelo sistema mecânico e pelo sistema óptico, os quais, em conjunto, permitem a visualização de estruturas invisíveis a olho nu.

Sistema Mecânico - Base ou pé = deve ser firme e com grande diâmetro para uma boa estabilidade do aparelho - Braço = local por onde o aparelho deverá ser pego para movimentação - Tubo ou canhão = é a parte de comunicação entre as oculares e as objetivas - Revólver = local onde estão fixadas as lentes objetivas - Mesa ou platina = recebe a lâmina que contém o material a ser pesquisado - Charriot = permite fazer a variação do campo de pesquisa. Prende a lâmina deslocando-a

horizontalmente sobre o plano de pesquisa - Botão macrométrico = realiza os primeiros ajustes para uma perfeita focalização - Botão micrométrico = ressalta detalhes durante a pesquisa Sistema Óptico - Oculares = fazem o aumento da imagem formada pela objetiva. Sua capacidade de aumento pode

ser de 4x, 10x, 12x e 15x - Objetivas = possuem a capacidade de aumentos de 10x, 40x, 45x, 60x. são usadas em quaisquer

tipos de pesquisa - Objetiva de imersão (100x)= é utilizada quando há necessidade de grande precisão na pesquisa - Condensador = concentra a luz e projeta um feixe luminoso sobre o objeto de estudo - Diafragma = parte constituinte do condensador, a qual permite a regulagem da quantidade de

luminosidade a ser projetada sobre a amostra - Filtro = parte constituinte do condensador, a qual permite melhorar a visualização do objeto

analisado através da seleção de comprimentos de onda. Geralmente, o filtro pode ser azul, verde ou vermelho

- Fonte luminosa = pode ser própria (lâmpada) ou natural (raios solares convergidos através de um espelho)

Obs.: - A imagem proporcionada pelo MO é aumentada, virtual e invertida em relação ao objeto

examinado - Calcula-se o aumento da imagem, multiplicando-se o aumento da ocular pelo aumento da

objetiva. Ex.: Ocular de 10x e objetiva de 40x = Aumento de 400x - Campo microscópico é a área da preparação que se está observando ao MO Quanto maior o

aumento da imagem, menor é a abrangência do campo - Em virtude do último item, sempre se inicia a observação ao MO com uma combinação de

lentes que proporcione o menor aumento, a fim de se ter uma visão panorâmica da região que se quer observar com maior aumento

MANEJO DO MICROSCÓPIO 1. Acender a lâmpada do sistema de iluminação. 2. Abrir totalmente o diafragma e colocar o sistema condensador - diafragma na posição mais elevada,

pois é aquela que permite melhor iluminação. 3. Movimentar o revólver, colocando em posição a objetiva de menor aumento (4x). 4. Tomar a lâmina (com ou sem a lamínula) para cima e colocá-la na platina, prendendo-a com os

grampos. 5. Movimentar o charriot, fazendo com que o preparado fique em baixo da objetiva. 6. Com o botão macrométrico, elevar a platina ao máximo, observando que a objetiva não toque na

lamínula, pois poderá quebrá-la. 7. Focalizar a preparação para a obtenção de uma imagem nítida, movimentando o botão macrométrico

e abaixando a platina até que se possa visualizar a imagem. 8. Aperfeiçoar o foco com o botão micrométrico. 9. Colocar a região do preparado que se quer ver com maior aumento bem no centro do campo visual

da lente. 10. Movimentar o revólver, colocando em posição a objetiva de 10X (aumento médio). 11. Aperfeiçoar o foco com o botão micrométrico.



12. Colocar a objetiva de 40X (maior aumento) em posição e aperfeiçoar o foco com o botão micrométrico.

13. A objetiva de 100x é chamada de imersão. Para utilizá-la, deve-se proceder da seguinte maneira: a) Acender a lâmpada do sistema de iluminação b) Abrir totalmente o diafragma e colocar o sistema condensador - diafragma na posição mais

elevada, pois é aquela que permite melhor iluminação c) Movimentar o revólver, colocando em posição a objetiva de 100x d) Tomar a lâmina (com ou sem a lamínula) para cima e colocá-la na platina, prendendo-a com

os grampos e) Pingar uma gota de óleo de imersão no campo a ser focalizado f) Com o botão macrométrico, elevar a platina ao máximo, até que a objetiva de 100x toque a

superfície do óleo de imersão g) Aperfeiçoar o foco com o botão micrométrico h) Sempre que terminar a análise, baixar a platina, retirar a lâmina, e limpar a objetiva com

solução de limpeza (xilol ou éter). A lâmina pode ser limpa com papel, fazendo-se movimentos leves e retilíneos.

Microscópio de Contraste de Fases

O estudo microscópio de tecidos vivos é difícil, uma vez que seus componentes, com raras exceções, são incolores e transparentes. A velocidade com que a luz atravessa um corpo transparente depende da quantidade de matéria presente. Como diversas estruturas celulares (núcleo, mitocôndrias, grânulos de secreção) têm índices de refração diferentes, o microscópio de contraste de fases consegue transformar essas diferenças, através de dispositivos específicos, em diferenças de intensidade luminosa. Isso possibilita uma melhor visualização dos componentes celulares.

Microscópio Confocal

No microscópio confocal, o preparado é iluminado por um delgado feixe de raios laser que varre o corte iluminando ponto por ponto um determinado plano da célula, realizando assim, um “corte óptico”. Geralmente, as células são tratadas com substância fluorescentes, as quais emitem luz que é captada e tratado por um computador que fornece os sinais para um monitor de vídeo. Microscopia de Florescência O material a ser analisado é tratado com corantes específicos fluorescentes. A luz utilizada nesse tipo de microscópio é a ultravioleta, a qual permite que somente as partes fluorescentes apareçam em campo escuro. Depois da lente objetiva são colocados filtros que deixam passar a luz, mas eliminam a radiação ultravioleta, para proteger os olhos do observador. Microscopia Eletrônica O microscópio eletrônico tem alta resolução e as imagens obtidas mostram uma riqueza de detalhes surpreendente. Ao invés de serem utilizadas ondas de energia luminosa, utiliza-se um feixe de elétrons, os quais acabam por formar imagens muito mais nítidas, por não serem absorvidos, mas sim desviados pelas estruturas celulares.



MODELO DO MICROSCÓPIO ÓPTICO

Apostila de Fundamentos de Patologia Clínica

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