Apostila de Biotecnologia.pdf

27/10/2014 Apostila de Biotecnologia

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Universidade Federal de Santa Catarina - UFSCCentro de Cincias Agrrias - CCA

Laboratrio de Fisiologia do Desenvolvimento e Gentica Vegetal - LFDGV

Material Didtico de Apoio Disciplina de Biotecnologia

Apostila de BIOTECNOLOGIA 1 - Cultura de tecidos vegetais8 Fase do Curso de Agronomia - PARA VERSAO EM PDF CLIQUE AQUI

Prof. Miguel P. Guerra & Prof. Rubens O. Nodari

1. INTRODUO

As biotecnologias em seu sentido mais amplo compreendem a manipulao de microorganismos, plantas e animais, objetivando a obteno de processos e produtos deinteresse. Desta maneira, toda atividade que envolva a aplicao dos conhecimentos de fisiologia, bioqumica e gentica, considerada como tcnica biotecnolgica.Em seu senso mais restrito as biotecnologias esto associadas ao emprego das tcnicas modernas de biologia molecular e celular. Outros conceitos de biotecnologias:a) a utilizao de sistemas celulares para a obteno de produtos e desenvolvimento de processos (CNPq); b) a aplicao dos princpios cientficos e de engenhariapara o processamento de materiais por agentes biolgicos proporcionando produtos ou servios (FAO, 1989); c) o uso das tcnicas de regenerao in vitro e do DNArecombinante (Fernandes, 1987).

Uma das principais caractersticas das biotecnologias modernas sua abrangncia ampla e seu carter multidisciplinar. Sua insero em pases com padres desiguaisde desenvolvimento deve ser baseada no conceito de biotecnologias apropriadas ou pertinentes, proposto pela FAO. Assim, biotecnolgias apropriadas seriam aquelasque contribuem com o desenvolvimento sustentvel por: a) serem tecnicamente factveis no atual contexto de desenvolvimento tecnico-cientfico do pas; b)proporcionarem benefcios mensurveis aos destinatrios; c) serem ambientalmente seguras, socio-economicamente e culturalmente aceitveis no atual estgio dedesenvolvimento do pas.

Dentre as muitas aplicaes destas tcnicas, destacam-se aquelas relacionadas com a transferncia de genes de organismos diferentes para a incorporao decaractersticas como a resistncia de pragas e patgenos e a estresses abiticos, no genoma de uma determinada planta. Outras aplicaes visam o aumento daeficincia fotossinttica ou a produo de metablitos e constituintes importantes do ponto de vista nutricional e farmacutico . Estas tcnicas, quando associadas comprocedimentos de cultura de tecidos, permitem a propagao rpida e massal de gentipos superiores estveis e isentos de doenas.

Novas estratgias para a propagao clonal, para a fixao de ganhos genticos e novas abordagens para gerar variao gentica so requisitos fundamentais para omelhoramento de plantas. Desta maneira, um dos maiores benefcios das tcnicas de cultura de tecidos vegetais para o melhoramento de plantas perenes, refere-se possibilidade de capturar e fixar os componentes aditivos e no aditivos da varincia gentica atravs da propagao clonal. Desta maneira estas tcnicas,baseadas que so na totipotencialidade de explantes, podem se tornar ferramentas poderosas para a propagao massal de gentipos superiores.

A possibilidade de manipulao de sistemas in vitro para a clonagem de gentipos superiores de espcies vegetais dependente de uma srie de fatores. Acompreenso e domnio de conceitos bsicos em fisiologia do desenvolvimento de fundamental importncia para a aplicao deste conhecimento. Um dos objetivosdo presente texto a apresentao e a discusso sucinta dos principais tpicos pelos quais possvel extrair-se respostas morfogenticas orientadas quandocorrelaes morfolgicas, fisiolgicas, genticas e bioqumicas, existentes em uma planta intacta so rompidas e sistemas de culturas de tecidos clulas e rgos soutilizados para "orientar" novos padres morfogenticos.

O texto aborda o cultivo in vitro sob as diversas formas de obteno do explante e planta micropropagada a partir dos principais processos:

1.1 Cultura de tecidos desorganizados

Calos Cultivo e manuteno de massas celulares desorganizadas que se originam da proliferao desordenada a partir de tecidos ou rgos cultivados in vitro.

Suspenses Proliferao de clulas isoladas ou pequenos aglomerados dispersos em um meio lquido, sob agitao.

1.2 Cultura de estruturas organizadas

Cultura de rgos Formas organizadas de crescimento podem ser mantidas continuamente in vitro. Inclui o isolamento assptico de estruturas definidas comoprimrdios e segmentos foliares. Para os propsitos da micropropagao, os mais importantes tipos so:

a)Cultura de meristemas pices meristemticos consistindo do domo apical isentos ou contendo um ou dois primrdios foliares. Originam eixos unipolarescaulinares.

b) Cultura de pices caulinares Iniciada a partir de pices caulinares ou gemas laterais. Empregada para estabelecer culturas que originam multgemas, gemas,eixos ou brotaes caulinares mltiplos.

c)Culturas de segmentos nodais Contm segmentos caulinares que carregam gemas simples ou mltiplas.

d) Cultura (ou resgate) de embries Embries zigticos so excisados e cultivados para dar origem plntulas.

e) Cultura de razes isoladas Razes cultivadas sem conexo com os eixos caulinares, originando novas razes.

1.3 Quanto a rota morfogentica

1. Organognese direta Gemas ou primrdios de gemas pr-existentes que so induzidas proliferao.

2.Organognese indireta Novas gemas e eixos caulinares so induzidos e formados a partir de tecidos no organizados (calos) originados de explantes dediferentes origens.

2. BASE CONCEITUAL

pice caulinar: segmento do pice do caule, composto pelo meristema apical (0,05 a 1,0 mm) juntamente com os primrdios foliares e folhas em desenvolvimento.Porm, no deve ser confundido com o meristema, que o conjunto de clulas indiferenciadas e de caractersticas embrionrias.

Ativao: processo que favorece a reentrada ao novo ciclo bioqumico oi fisiolgico de rgo ou tecido. muito comum referir-se a ativao de gemas. Para ocorrer aativao necessria a existncia de rgo ou tecido pr formado ou formado.

Clulas indiferenciadas: refere-se ao estado caracterizado por clulas isodiamtricas, com pouco ou nenhum vacolo e grande ncleo. Geralmente esto localizadasno meristema e mantm as caractersticas embrionrias.



Ciclo celular: processo ou fases celulares de diviso padro. Enquadra-se em dois grandes grupos: meiose e mitse, que em um organismo diplide pode originarrespectivamente uma nova clula haplide, quando ocorre a sada do ciclo celular no final de G2 (sem a duplicao dos cromossomos) ou diplide, quando do completoprocesso de diviso celular (cdc). Detalhes deste processos esto descritos na figura 1.

Figura 01 Diagrama representativo do ciclo de diviso celular (cdc) de uma clula diplide.(Adaptado de George, 1993).

Clones: Independente da origem e sob o aspecto aplicado, as tcnicas de cultura de tecidos vegetais permitem a propagao clonal massal de gentipos superiores.Segundo o Cdigo Internacional de Nomenclatura de Plantas Cultivadas, clone uma das categorias bsicas da cultivar e designa um conjunto geneticamente uniformede indivduos, derivados originalmente de um individuo simples por propagao assexuada (enxertia, estaquia, mergulhia, apomixia ou micropropagao). O conceito depropagao clonal implica na seleo de gentipos com graus variados de heterozigose e sua fixao nas geraes subseqentes (Kester, 1983). Clones soempregados no melhoramento de plantas para capturar os componentes aditivos e no-aditivos da varincia gentica. Os componentes aditivos da varincia genticabaseiam-se no efeito independente dos alelos, enquanto que os efeitos no-aditivos, muitas vezes perdidos nos cruzamentos sexuais, baseiam-se na interao dosalelos, dentro ou entre locus (Durzan, 1988). Uma das maiores vantagens da propagao clonal a possibilidade de se explorar a varincia gentica total, ao invs doscomponente aditivo apenas. Muitos dos programas de melhoramento gentico de plantas perenes e estabelecidos no hemisfrio norte, a partir da dcada de 50, forambaseados na seleo recorrente. Nestes programas a seleo feita aps cada gerao de intercruzamentos de materiais selecionados para proporcionar arecombinao gentica. Enquanto que o melhoramento convencional permite a fixao dos ganhos genticos nas geraes subseqentes, a micropropagao permite aexplorao da variao gentica em uma gerao, atravs da clonagem de gentipos superiores (Figura 2). Apesar dos benefcios dos clones para a agricultura, aconcentrao de uma produo em larga escala de apenas um gentipo ou de poucos gentipos de origem comum pode tornar todas as plantas igualmente vulnerveis pragas e molstias ou estresses abiticos e pode tambm diminuir o interesse na manuteno de uma diversidade mais ampla nos bancos de germoplasmaexistentes, resultando no estreitamento da base gentica.



Figura 02: Explorao da variao gentica em uma gerao, atravs da clonagem de gentipos superiores

Crescimento desorganizado: Quando, tecidos formados in vitro, no apresentam estruturas claramente definidas e contm um nmero limitado de clulasespecializadas e diferenciadas. Uma clula diferenciada aquela que desenvolveu forma especializada (morfologia) ou funo especializada (fisiologia). Um tecidoorganizado a agregao de clulas diferenciadas (ex. xilema ou epiderme). Por outro lado estruturas indiferenciadas podem ocorrer na induo de calos que soagregados celulares desorganizados que se originam da proliferao desordenada a partir de tecidos ou rgos cultivados in vitro e por meio de suspenses celularesque so a proliferao de clulas isoladas ou pequenos aglomerados de clulas dispersos em um meio lquido, sob agitaoCrescimento organizado Tecido ou rgo de crescimento determinado em produzir um novo rgo (desenvolvimento) de forma a resultar novas estruturas vegetais.Crescimento ps meristemtico.

Competncia celular: Capacidade das clulas reagirem a sinais (que podem ser reguladores de crescimento) especficos de desenvolvimento. Diz respeito capacidade das clulas em expressar um potencial inerente. Esta habilidade da clula pode se dar por: a) Ativao que pode ser definida como a mudana nacompetncia envolvendo a rediferenciao de determinadas clulas (modelos diretos); b) Induo: que pode ser definida como a iniciao de uma resposta particular dediferenciao a partir da desdiferenciao celular (modelos indiretos). A induo est associada processos de desdiferenciao, que pode ser definida como a(re)entrada no ciclo celular. Buvat (1944) demonstrou que a desdiferenciao celular consiste de dois estgios: regresso capacidade de diviso e retorno estruturacitolgica de clula meristemtica (embrionria)

Cultura de rgos: Formas organizadas de crescimento podem ser mantidas continuamente in vitro. Inclui o isolamento assptico de estruturas definidas comoprimrdios e segmentos foliares. Para os propsitos da micropropagao, os mais importantes tipos so:

f) Cultura de meristemas: pices meristemticos consistindo do domo apical isentos ou contendo um ou dois primrdios foliares. Originam eixos unipolares caulinares.

g) Cultura de pices caulinares Iniciada a partir de pices caulinares ou gemas laterais. Empregada para estabelecer culturas que originam multgemas, gemas,eixos ou brotaes caulinares mltiplos.

h) Culturas de segmentos nodais Contm segmentos caulinares que carregam gemas simples ou mltiplas.

i) Cultura (ou resgate) de embries Embries zigticos so excisados e cultivados para dar origem plntulas.

j) Cultura de razes isoladas Razes cultivadas sem conexo com os eixos caulinares, originando novas razes.

Diferenciao: processo de diversificao das caractersticas bioqumicas, anatmicas, morfolgicas e fisiolgicas, ocorrida nas clulas, nos tecidos ou rgos duranteo desenvolvimento a partir do estado meristemtico ou juvenil para o adulto. As clulas do embrio meristema apical so exemplos de estado indiferenciado, as quaisganham novas competncias se tornando diferenciadas.

Desdiferenciao celular: retorno de clulas diferenciadas ao estado meristemtico no diferenciado.

Determinao celular: Processo pelo qual o potencial de desenvolvimento de uma clula torna-se limitado a uma rota especfica (Christianson,1985). A determinaocelular diz respeito a uma canalizao progressiva no desenvolvimento.

Epignese: Ativao seletiva e diferencial de genes (reprogramao celular). Um exemplo comumente citado como representativo em uma planta intacta a transioda fase juvenil para a fase adulta.

Epistasia: refere-se inativao de um (trans)gene (o supressor) sobre um outro (trans)gene.

Induo: o desencadeamento de um processo morfogentico pela exposio do explante a um estmulo fsico, qumico ou biolgico. A induo envolve o controle daexpresso gnica, embora no seja um fenmeno gentico, pois no ocorre ganho ou perda gentica (modificao allica ou genotpica). Refere-se somente aexpresso dos genes pr existentes. Em cultura de tecidos, a sinalizao por um fitormnio a uma resposta especfica a nvel celular.

Haplide: indivduo que apresenta o nmero de cromossomoss igual ao do gametfito ou da haplofase (n). de maneira mais especfica, plantas haplides so aquelascom carga cromossmica no duplicada, monoplides.

Hormnios vegetais: No presente contexto este trmo define uma das classes de compostos que regulam processos de desenvolvimento (morfognese) em plantas,sendo, provavelmente, os mais importantes mediadores na transduo de sinais. Os hormnios so molculas regulatrias de ocorrncia natural que agem como sinaisqumicos para regular o crescimento e o desenvolvimento (morfognese). Fitorreguladores ou reguladores de crescimento so substncias sintticas que mimetizam osefeitos dos hormnios no metabolismo celular.

Meristema: tecido composto de clulas no diferenciadas, envolvido com sntese protoplasmtica e formao de novas clulas por diviso mittica. Semespecificao, o termo refere-se normalmente ao meristema apical do caule (regio localizada numa depresso central que d origem aos mais novos primrdios foliaresde tamanho varivel entre espcies vegetais, normalmente formado por uma poro de 60 a 100 clulas isodiamtricas indiferenciadas, que mantm permanentementeas caractersticas embrionrias primrias.

Micropropagao: Propagao clonal massal de um gentipo selecionado por tcnicas de cultura in vitro. Este trmo, utilizado primeiramente por Hartman e Kester(1975), passou a ser empregado para definir os processos de propagao vegetativa na cultura de tecidos vegetais.

Morfognese: Integrao entre crescimento (mudanas quantitativas) e diferenciao (alteraes qualitativas), mediada por diviso e especializao celular. Amorfognese o resultado de um complexo controle hormonal mltiplo, espacial e temporal, atravs da regulao e expresso de sistemas gnicos mltiplos. Amorfognese na planta intacta mediada pela ao correlativa dos meristemas e de seus produtos. Na cultura de tecidos vegetais, ao se romper as correlaes



endgenas os tecidos ficam sujeitos s condies exgenas, representadas no caso pelos fitorreguladores adicionados ao meio de cultura. A morfognese in vitropassa ento a ser modulada pelo balano de fitorreguladores adicionados ao meio de cultura. Isto foi comprovado experimentalmente por Skoog e Miller (1955) e cujosresultados so sumarizados na figura 03.

Figura 03. Morfognese in vitro modulada pelo balano de fitorreguladores adicionados ao meio de cultura.

Totipotencialidade: Princpio biolgico creditado ao fisiologista vegetal alemo Haberlandt, que em 1902, enunciou que cada clula vegetal possua o potencialgentico para reproduzir um organismo inteiro. Como corolrio, este fisiologista elaborou previses de que tecidos, clulas e rgos poderiam ser mantidasindefinidamente em cultura. De certa forma o conceito de totipotencialidade j era inerente teoria celular de Schleiden e Schwan (1838 apud Vasil et al., 1979) aopostularem que algumas clulas eram capazes de serem separadas do organismo e continuar a crescer independentemente.

3. MECANISMOS REPRODUTIVOS E PADRES DE DESENVOLVIMENTO ENTRE ANIMAIS E PLANTAS

Plantas e animais apresentam similaridades na natureza de seu material gentico e nos mecanismos pelos quais a informao gentica processada e utilizada. Nosoutros nveis as diferenas so bvias e considerveis:

A) Plantas no estabelecem uma linhagem germinativa especfica, no havendo distino entre clulas que formam o organismo e as clulas reprodutivas. Em animaisos gametas so produzidos apenas por clulas-filhas descendentes de uma linhagem germinativa. Todas a clulas vegetais nucleadas, possuem, em princpio, acapacidade de produzir um novo individuo (totipotencialidade) e a possibilidade de uma clula produzir gametas apenas uma funo de sua localizao no organismo.

B) Plantas se reproduzem tanto sexuada como assexuadamente.

C) O ciclo de vida de uma planta mais elaborado e complexo do que em animais. Neste a reproduo resulta da produo direta de gametas como resultado dameiose na linhagem de clulas germinativas. O ciclo de vida das plantas envolve duas geraes alternantes. A gerao dominante a esporoftica e inicia com afertilizao do ovo e culmina com o desenvolvimento e maturao. A gerao gametoftica, atravs da microsporognese e megasporognese gera respectivamenteplen e saco embrionrio. Um dos ncleos da clula espermtica masculina fecunda o ovo para formar o zigto, marcando o fim da gerao gametoftica e o incio daesporoftica. A embriognese acompanhada pela formao da semente. que , em ltima anlise, uma estrutura complexa para nutrir o embrio.

O desenvolvimento animal pode ser confundido com desenvolvimento embriolgico, uma vez que nesta fase so formados os rgos componentes do seu organismo.Possivelmente isto confere maior determinao (canalizao de desenvolvimento) s clulas vegetais e o retorno ao estado embrionrio de uma clula animal adultasomente ocorre por meio da transferncia nuclear que gerou a clonagem da ovelha Dolly (Fig. 4). Ao contrrio, no desenvolvimento embrionrio de plantas superiores amaior parte dos sistemas de tecidos e rgos no esto presentes. Estes somente so formados depois da germinao e a longo da vida da planta atravs dadiferenciao de uma linhagem de clulas embrionrias mantidas nos meristemas.



Figura 04 Processo de obteno de clones animais

Outro aspecto que diferencia a morfognese animal da vegetal que na primeira, as clulas, tornam-se direcionadas para um caminho particular e especfico dedesenvolvimento, enquanto que nas clulas vegetais este direcionamento pode ser reversvel. Toda a clula nucleada, mesmo diferenciada, pode ser induzida uma re-entrada no ciclo mittico, desde que ativada com o sinal adequado. Em clulas animais, portanto, a totipotencialidade encontra-se restrita a uma fase especfica elimitada do desenvolvimento embrionrio. A migrao celular componente importante da morfognese animal. Clulas animais possuem motilidade e migram emdirees definidas de acordo com as informaes recebidas de outras clulas. Por sua vez, a rota de desenvolvimento de uma clula vegetal determinada pela suaposio na estrutura da planta. No apresentando mobilidade, a posio das clulas vegetais determinada pelos planos de diviso da clula-me. Mesmoconsiderando que as interaes entre as clulas tm papel fundamental na morfognese animal e vegetal, a natureza das informaes trocadas mais limitada emplantas do que em animais.

4 MEIOS DE CULTIVO

4.1. INTRODUO

Meios de cultivo so combinaes de sais minerais (macro e micronutrientes), carboidratos, vitaminas e reguladores de crescimento. Podem ser slidos (adicionando-se gar ou outro agente para geleificao) ou lquidos, de acordo com o protocolo para o sistema de cultivo.

Os meios nutritivos utilizados para as culturas fornecem as substncias essenciais para o desenvolvimento dos tecidos e controlam, em grande parte, o padro dodesenvolvimento in vitro (Torres, 1998). A constituio do meio baseada nas exigncias das plantas quanto aos nutrientes minerais, com algumas modificaes paraatender em necessidades especficas.

Um dos primeiros meios de cultura desenvolvidos foi o de White (1942). Esse meio apresenta baixo nvel de nitrognio e de potssio, restringindo o seu uso para muitasclulas; entretanto, esta formulao com baixa concentrao em sais, usada em muitas situaes. O meio MS (Murashige e Skoog, 1962) foi uma das primeirasformulaes melhoradas usadas em cultura de tecidos de plantas, apresentando altos nveis de nitrato, potssio e amnio.

4.2. COMPOSIO DOS MEIOS DE CULTURA

Os meios nutritivos so formados por mltiplos componentes, sendo bastante variveis em funo da espcie vegetal e da origem do explante. constitudo decomponentes essenciais e opcionais. Os essenciais compreendem a gua, os sais inorgnicos, a fonte de carbono e energia, vitaminas e substncias reguladoras decrescimento. Entre os componentes adicionais esto includos os aminocidos e amidas, cidos orgnicos e substncias naturais complexas. Os principaiscomponentes de uso mais freqente nos meios de cultura so:

4.2.1 gua

o componente em maior quantidade do meio de cultura. A qualidade da gua muito importante em cultura de tecidos vegetais. Pode ser uma fonte potencial deimpurezas. Para melhor controle deve-se usar gua destilada, bidestilada e deionizada. A utilizao de gua de torneira pode comprometer o desenvolvimento dacultura.

Em alguns explantes como calos de fumo a quantidade de gua pode ser limitante para o desenvolvimento normal (Linsmaier & Skoog, 1965; Torres, 1998).

4.2.2 Nutrio mineral

Os nutrientes empregados nos meios de cultura so os mesmo estabelecidos para a nutrio mineral bsica das plantas no campo. So eles:

a) Nitrognio: pode ser acrescentado aos meios na forma orgnica (prontamente disponvel as culturas) ou na forma mineral. Na forma pode estar disponvel comoamnio (ction) ou nitrato, nitrato (nion), ou ainda na forma de compostos orgnicos, dependendo do material em cultura (George, 1993). constituinte de aminocidos,nucleotdeos e coenzimas, tendo importncia na sntese protica. A toxidez do amnio s clulas diminui ou desaparece quando ele usado como nica fonte denitrognio na forma de sal de um cido orgnico, de preferncia um cido tricarboxlico (ciclo de Krebs), como cido ctrico ou cido alfa-cetoglutarico (Torres, 1998). Aglutamina (precursora de vrios aminocidos) a mais utilizada como fonte de nitrognio orgnico. Meios enriquecidos com nitrognio so fundamentais para aembriognese somtica, bem como diferenciao de parte area (Amirato, et. al. 1983).

b) Fsforo: adicionado ao meio, principalmente, como fosfato de potssio monobsico (H2PO4-), pois a forma que absorvido(George, 1993). O fosfatomonobsico no meio MS utilizado na concentrao de 1,25 mM. Algumas fontes orgnicas podem ser utilizadas quando existem restries aos fosfatos minerais(Torres, 1998). Atua no metabolismo energtico, na regulao de processos enzimticos e na ativao de enzimas (Santiago, 20010). Necessrio para a sntese doATP e na organognese est envolvido na diferenciao da parte area, pois reverte o efeito das auxinas.



c) Potssio: usado na forma de nitrato, fosfato ou cloreto. Ativador de vrias enzimas do metabolismo de carboidratos e protenas. Uma das mais importantes aquinase do piruvato, enzima envolvida nos processos de gliclise e respirao (Santiago, 2001). necessrio para a embriognese somtica (Ammirato, 1983). Adeficincia de potssio pode conduzir a hiperhidricidade e decrscimo na taxa de absoro de fosfato.

d) Enxofre: utilizado na forma de sulfato ou na forma de aminocidos (cistina, cistena e metionina). Envolvido no metabolismo energrtico na formao do fosfosulfatode adenosina, constituinte da tiamina, biotina e coenzima A. Sua absoro relacionada assimilao do nitrognio e, independentemente, do pH (Santiago, 2001).

e) Clcio: usado na forma de nitrato ou cloreto. Est envolvido na diviso celular, uma vez que um dos componentes da lamela mdia o pectato de clcio. Mantm aintegridade da membrana celular e importante para a germinao de gros de plen (George, 1993). um agente quimiotrfico para o direcionamento do tubo polnico.Altas concentraes de clcio (6 a 9 mM) so necessrias para controle da necrose do pice caulinar.Pode ter limitaes na translocao entre as clulas.

f) Magnsio: usado na forma de sulfato de magnsio. um dos componentes da clorofila; co-fator importante para vrias reaes enzimticas que atuam sobresubstratos fosforilados.

g) Carbono: uma fonte importante de energia a forma o esqueleto de todos os compostos orgnicos. A suplemenao gralmente pela adio de acar na formade sacarose, glicose, frutose e outras.

h) Ferro: est numa faixa intermediria entre os macros e micronutrientes. adicionado ao meio na forma quelato Fe-EDTA. Envolvido nas reaes de oxi-reduo nosorganismos vivos. Essencial para a sntese da clorofila, integrante do grupo protico (heme) das porfirinas.

i) Boro: geralmente usado na forma de cido brico. Est envolvido no metabolismo de carboidratos e cidos nuclicos. Importante na germinao de gros de plene crescimento do tubo polnico.

j) Molibidnio: adicionado na forma de molibidato de sdio (Na2Mo04). Co-fator da redutase do nitrato.

k) Cobre: usado como sulfato de cobre. um ction que em dose acima do normal fitotxico s culturas. Constituinte da enzima plastocianina que importantecomponente do transporte de eltrons.

l) Cloro: essencial para a fotossntese, sendo requerido durante a reao de Hill.

m) Zinco: sulfato de zinco. Importante nas reaes de oxi-reduo das plantas. Co-fator de enzimas anidrase carbnica.

n) Mangans: sulfato de mangans. Essencial no metabolismo para a reao de Hill na fotossntese, quando a molcula de gua quebrada produzindo eltrons eoxignio.

o) Cobalto: usado como cloreto de cobalto e est envolvido na expanso foliar.

4.2.3. Constituintes orgnicos

Os compostos orgnicos importantes so os carboidratos, substncias reguladoras de crescimento, vitaminas, aminocidos e amidas, certas purinas e pirimidinas,hexitis e cidos orgnicos.

a) Carboidratos

As clulas, tecidos e plntulas cultivadas in vitro no encontram condies adequadas de iluminao e concentrao de CO2 e, as vezes, no apresentam teores declorofila suficientes para realizar fotossntese (Torres, 1998). Muitas vezes, acares que no so efetivos na manuteno do crescimento do calo, sustentam ainiciao de brotaes adventcias e a embriognese somtica.

Os carboidratos mais usados nos meios de ciultura so a sacarose, a glicose e a frutose nos nveis de 2% a 5% (p/p) (George, 1993). A concentrao de 3% a maisusada. Concentraes de sacarose entre 6% a 12% podem ser usadas em cultura de embries, frutos e anteras, enquanto que o nvel de 1,5% usado em cultura deprotoplastos.

Pode ocorrer a caramelizao do acar quando exceder o tempo de autoclavagem e a sua degradao pode ocorrer a formao de hidroxiacetonas, dihidroxiacetona,furano, 2-metilfurano, 2,5-dimetilfurano e maltol (Ammirato et. al. 1983). Estes compostos formam meladoidinas que so compostos de colorao amarronzada, de altopeso molecular, podendo inibir o crescimento celular. O acar purificado com acetato, para precipitar impurezas e pode conter alto nvel de zinco que txico para otecido.

Glicose e frutose devem ser esterilizadas a frio.

b) Aminocidos e amidas

A suplementao pode ser realizada pela incluso de uma protena hidrolisada ao meio. Qualquer efeito benfico pode ser avaliado pela substituio desta protena poruma mistura de aminocidos e amidas. Os aminocidos e amidas tm importncia na amplificao das respostas morfogenticas, proporcionando maior crescimento efacilitando a diferenciao no sentido da regenerao. As formas "L" dos aminocidos so de ocorrncia natural. A tirosina apresenta influencia na iniciao de partearea em cultura de calos, L-arginina no enraizamento e L-serina na obteno de embries haplides mediante o cultivo de micrsporo. As amidas L-glutamina e L-aspagarina so benficas na obteno de embries somticos, e a cistena includa, s vezes, como agente redutor.

c) Vitaminas

Vitaminas so compostos orgnicos que, em baixas concentraes, desempenham funes reguladoras catalticas no metabolismo celular. A vitamina maiscomumente usada em cultura de tecidos a tiamina (B1). A tiamina solvel em gua. Outras vitaminas utilizadas incluem cido nicotnico (B3) e piridoxina (B6).Embora as vitaminas sejam adicionadas ao meio antes da autoclavagem, a esterilizao a frio recomendada.

Vitamina A: no utilizada nos meio pois, ainda no foi ainda encontrada nas plantas.

Riboflavina (Vit. B2): componente da coenzima FMN (Flavina mononucleotdeo) e o FAD (Flavina-adenina-dinucleotdeo) que atuam em oxidaes biolgicas. Nafotossntese FMN participa do transporte de eltrons (George, 1996).

Tiamina (Vit. B1): atua no metabolismo celular devido funo como coenzima na descarboxilao dos cetocidos. Ex: Piruvato e cetoglutarato (George, 1996).

cido pantotnico: um dos componentes da coenzima A e exerce papel importante no metabolismo de lipdios.

cido nicotnico (Niacina ou Vitamina B3): um componente das coenzimas NAD e NADP importantes na transferncia de hidrognio.

Piridoxina, Piridoxal e Piridoxamina (complexo vit. B6): Fazem parte de coenzima metablicas de aminocidos. Estas vitaminas tm papel importante nasreaes de transaminao e descarboxilao (George, 1996).

Biotina: atua no metabolismo do cido asprtico, e nas reaes do ciclo de Krebs que levam formao deste cido (Ammirato, 1983).

cido ascrbico (vitamina C): Catalisador de fosforilizao fotossinttica devido ao poder de oxidar e reduzir facilmente (Santiago, 2001).

d) Outros suplementos orgnicos

- Misturas complexas:

So preparaes obtidas de produtos naturais, de composio indefinida, que servem para enriquecer o meio de cultivo. A composio destes produtos de difcildeterminao e de uso restrito a algumas culturas e de difcil repetio experimental, quando as tentativas de adequao no forem suficientes para promoverdeterminado processo morfogentico. Em trabalhos de rotina, estas preparaes podem ser usadas caso estimulem respostas desejadas.

Protenas hidrolisadas: a mais comum a casena hidrolisada, por ser importante fonte de aminocidos. Outras tambm so utilizadas: lacto-albumina hidrolisada,



triptona, peptona, etc.

Suco de laranja, tomate e outros: contm cido ctrico e outras substncias de crescimento no identificadas.

Leite de coco: o endosperma de Cocus nucifera na fase lquida ou gelatinosa. um suplemento bastante usado. Recomenda-se que seja esterilizado a frio.

Extrato de leveduras: fonte de aminocidos e vitaminas.

Polpa de Banana: usada na suplementao do meio de cultura de orqudeas.

- Hexitis:

Os hexitis so compostos cclicos com grupos OH em todos os seis carbonos. O mais usado o inositol, myo-inositol a forma inativa e i-inositol a ativa. Omeso-inositol uma mistura das formas d e l. O inositol considerado estimulador de processos de crescimento in vitro e pode servir como fonte de carboidrato.Desempenha papel importante na biossntese do ciclitol, no armazenamento de compostos polihdricos como reserva, na germinao de sementes, no transporte deacar, na nutrio mineral, no metabolismo de carboidratos, na estrutura de membranas, formao de parede celular, homeostase de hormnios e no estressefisiolgico (Santiago et. al. 2001).

- Compostos fenlicos:

So compostos derivados de fenlicos (mono-OH) e atuam em processos que promovem o desenvolvimento areo enquanto que os derivados fenlicos (bi-OH) estoenvolvidos com a iniciao de razes (George, 1996). Estas substncias atuam na degradao oxidativa do AIA. Por outro lado, compostos fenlicos (bi-OH) inibem adegradao oxidativa do AIA, tendo efeito benfico no enraizamento (Santiago et. al. 2001).

- cidos orgnicos:

A adio de cidos de compostos intermedirios do ciclo de Krebs, tais como malato ou citrato, comum em meio destinado cultura de protoplastos (Santiago, 2001).Estes compostos parecem estar envolvidos na minimizao do efeito inibitor da amnia. Por serem solues antioxidantes so preparadas usando uma mistura de 100mg de cido ascrbico e 150 mg de cido ctrico, dissolvido em 1litro de gua e sua esterilizao feita em filtro bacteriolgico de 0,22 ou 0,45 micras (Ammirato,1983; Santiago, 2001). O cido ascrbico e o cido ctrico so usados para prevenir o escurecimento de tecidos excisados de plantas.

- Purinas e Pirimidinas:

A concentrao mais usada varia de 40 a 160 mg/L. As bases nitrogenadas citosina e guanina podem tambm promover o crescimento de cultura de calo. A adenina ouo sulfato de adenina estimulam o crescimento de brotaes in vitro.

4.2.3. Reguladores do crescimento vegetal

Para ocorrer o desenvolvimento ou a entrada de atividade de um determinado possesso necessrio a sinalizao especfica por reguladores de crescimento em stiosregulador por kinases.

O controle qumico da diferenciao da parte area foi primeiramente observado em cultura de calo de tabaco. Foi observada inibio na formao de gemas porauxinas, e reverso deste efeito estimulando brotaes utilizando-se adenina bem como o fosfato inorgnico. Esta foi a constatao de que o processo deorganognese in vitro controlado por substncias hormonais sendo que o desenvolvimento de parte area, raiz ou calo determinado pelo balano entre auxinas ecitocininas.

O balano de auxinas/citocininas em alto/baixo favorecem o enraizamento e o balano inverso promove a formao de parte area. Concentraes iguais promovem aproduo de calos.

As auxinas nos meios variam de 0,01 a 10 mg/L. As auxinas mais usadas so AIA (cido indol-3-actico), AIB (cido indol-3-butirico), ANA, 2,4-D, 2,4,5-T, 4-CPA epicloran. A auxina 2,4-D bastante usada para a induo de calos e tem o efeito de supresso da morfognese. As auxinas 2,4-D e ANA so sintticas e tm efeitossemelhantes s auxinas de ocorrncias naturais, sendo mais estveis degradao. A auxina 2,4,5-triclorofenoxiactico (2,4,5-T) e o picloran induzem a formao decalos em monocotiledneas (Ammirato, 1983). As auxinas so termo-estveis, no decompondo quando autoclavadas. O AIA a auxina natural e a menos estvel,sendo destrudo em pH baixo.

A no ser o 2,4 D e ANA, as solues estoques no devem ser armazenadas por mais de uma semana. A dissoluo das auxinas feita em NaOH 1N. Utiliza-se 0,3mL desta base para dissolver 10 mg de auxina.

As citocininas so derivadas da adenina (aminopurina) e tm um papel fundamental na diferenciao e regenerao de plantas na maioria das espcies (Santiago,2001). Induzem a diviso celular, proliferao e morfognese da parte area. As citocininas mais usadas em cultura de tecidos so a cinetina (CIN), benziladenina (BA),zeatina (Zea), isopentenil adenina (2ip) e thidiazuron (TDZ).

O cido giberlico (GA3) usado, algumas vezes, em cultura de meristemas, na recuperao de plantas livres de vrus. O GA3 deve ser dissolvido em gua com pHajustado a 5,7 ou em base (NaOH 1N). As solues de GA3 devem ser esterilizadas em filtro bacteriolgico uma vez que esta substncia se decompe porautoclavagem. As solues estoques devem ser preparadas na hora.

O cido abscsico (ABA) est envolvido na dormncia e absciso de folhas e frutos. Na cultura de tecidos o papel deste composto aest envolvido principalmente namaturao de embries obtidos na embriognese somtica. Este composto termo-estvel e fotossensvel, recomenda-se sua esterilizao a frio. O ABA dissolvidoem gua ou base.

As substncias reguladoras de crescimento no devem ser dissolvidas em lcool, pois este produto tem efeito inibidor na morfognese.



Figura 06 Estrutura qumica dos principais reguladores de crescimento vegetal.

4.2.4. pH

O pH dos meios nutritivos em culturas de clulas vegetais normalmente ajustado com HCl ou NaOH, depois de adicionar todos os componentes para um valorligeiramente cido, entre 5 e 6 (normalmente 5,8)(Torres, 1998). Recomenda-se este valor para formulaes lquidas. Em meios gelificados com gar, o pH deve serajustado em 5,7, pois em pH 5,0, ocorre a hidrlise de polissacardeos, enquanto que em pH 6,0-6,2 verifica-se a precipitao de sais (George, 1996). No ajuste do pH,lava-se primeiramente o eletrdo e, em seguida, faz-se a leitura em tampo 4,0. Posteriormente lava-se o eletrdo e desta maneira o potencimetro estar calibradopara uso. O pH varia durante o perodo de cultura.

4.2.5. Materiais de suporte

a) gar

gar um polissacardeo obtido pela purificao de algas marinhas. A concentrao usada varia de 0,6% a 1% (de 6 a 10 g/L). O gar impuro constitudo depolissacardeos, aminocidos, sais, acar, etc., devendo ser lavado em gua destilada antes de ser usado. O gar alcalino, lquido temperatura de 80C e sesolidifica 40C. necessrio a aquisio de agar de boa qualidade, pois podem ser txicos em algumas condies de cultivo (Guerra, 2002).

Outros produtos gelificantes so Gelrite (Calbiochem) e Phytagel (Sigma). So mais puros que o gar e provenientes de fermentaes bacterianas (George, 1996).Usados na concentrao de 0,2% (2 g/L). Citam-se que estes produtos podem causar vitrificao em algumas espcies.

Alguns laboratrios fazem o uso de polvilho de mandioca ou de milho (maizena) como gelificantes, porm apresentam restries quanto a longevidade por degradar aolongo do cultivo.

b) pontes de papel

em muitas cultura no possvel utilizar agentes geleificantes ao meio e tambm no possvel o uso em imerso em meios lquidos, nestes casos ento, usa-sepontes de papel com meios lquidos. Utilizado principalmente no resgate de embries imaturos e no cultivo de ovrios.

c) Outros produtos: poliacrilamida, slica gel e papel de filtro.

4.2.6 Carvo ativado

E um p bastante fino e de cor escura, sendo utilizado para eliminar substancias txicas produzidas pelo explante. Concentraes em torno de 0,3% so usadasquando se deseja enraizamento in vitro, pois auxiliam na ao das auxinas e promovem a fixao dos compostos fenlicos produzidos pelo explante. Sugere-se, emalguns casos, aumento da concentrao de auxina, quando na presena de carvo ativado. A pureza deste produto varivel.

4.3 PREPARAO DOS MEIOS

O preparo de solues estoque tem por objetivo facilitar o preparo final dos meios de cultivo e preciso na dosagem dos componentes.

Normalmente se mantm os macronutrientes em solues estoque em concentraes 10 vezes superior ao da concentrao final (Torres, 1998). Para osmicronutrientes as solues estoques so de 1000 vezes superior. Para o quelato EDTA F a soluo estoque de 50 vezes. As pores so mantidas em geladeira epor um perodo no superior a uma semana para a maioria das solues estoques, principalmente aquelas que apresentam precipitao.



Solues estoques de vitaminas devem ser mantidas em geladeira ou em congeladores.

Recomenda-se montar estoques de sais minerais (conjuntos de macrtonutrientes e micronutrientes), Fe EDTA, misturas orgnicas e reguladores de crescimento.

A sacarose e o mio-inositol so pesados e preparados no momento do preparo do meio.

4.4. QUANTIDADE DE MEIO

Como regra geral, quanto menor o explante, menor a quantidade de meio a ser utilizado. Devem ser considerados principalmente as exigncias de luminosidade,temperatura, trocas gasosas e acmulo de produtos txicos no meio, que sero discutidas na morfognese.

4.5. DESINFETANTES E ESTERILIZAO DO MEIO DE CULTURA

Os desinfestantes mais comumente usados em cultura de tecidos de plantas esto apresentados na tabela 2.

Tabela 2: Desinfestantes mais comumente usados em cultura de tecidos de plantas. (Extrado do Catlogo da Sigma).

Desinfestante Concentrao(%) Exposio (min.)Hipoclorito de Clcio 9-10 5-30

Hipoclorito de Sdio 0,5-5,0 5-30

gua Oxigenada 3-12 5- 15

lcool etlico 70-95 5- 15

Nitrato de prata 1 5-30

Cloreto de mercrio 0,1-1,0 2-10

Tabela 3: Perodo mnimo recomendado para esterilizao de meio para cultura de tecidos de plantas. (Extrado do Catlogo da Sigma).

Volume por recipiente (ml) Tempo de autoclavagem (min.)

25 20

50 25

100 28

250 31

500 35

1000 40

2000 48

4000 63

121C e 1,05kg/cm/cm2 = 105kPa

5. PADRES MORFOGENTICOS IN VITRO

A possibilidade de manipulao da morfognese relaciona-se com a exata compreenso dos conceitos enunciados anteriormente. Desta forma, tecidos, rgos ouclulas com intensidades variadas de determinao podem adquirir novas competncias atravs da ao de determinados sinais quimicos (reguladores de crescimento)que ativam seletivamente determinados genes (epignese). A resposta final a expresso morfogentica em dois nveis bsicos: organognese e embriognesesomtica.

Uma representao esquemtica das rotas e sistemas de regenerao in vitro apresentada na figura 7.

Figura 07 Principais mtodos de micropagao e as rotas de crescimento vegetal dos explantes. (Adaptado de George, 1996).



5.1. ORGANOGENESE

A organognese relaciona-se com a obteno de eixos caulinares monopolares originados de gemas pr-existentes ou neoformadas. Estes eixos caulinares soinduzidos ao enraizamento in vitro ou ex vitro resultando em plntulas completas que podem ser ento aclimatizadas. A organognese pode ser direta ou indireta. Noprimeiro caso, a partir de um explante primrio h a formao de um eixo caulinar a partir de gemas apicais, laterais ou axilares. No segundo caso ocorre adesdiferenciao do explante, resultando na formao de calos, que podem ser definidos como a proliferao de clulas no diferenciadas massas, originadomeristemides (Thorpe, 1980). Para finalidades de micropropagao clonal a formao de calos indesejvel uma vez que a constituio cromossmica deste material, em geral, instvel, podendo originar variantes genticos, por meio de um processo chamado variao somaclonal (Larkin & Scowcroft, 1981). Neste caso, o perodode crescimento desorganizado deve ser o menor possvel, ou preferencialmente eliminado (Street, 1975; Murashige, 1977).

A possibilidade de manipulao da organognese depende do tipo e concentrao relativa dos reguladores de crescimento, como indicado pelo j clssico trabalho deSkoog e Miller (1957). Estes autores observaram que a relao entre a auxina e a citocinina no meio de cultura era responsvel pela resposta organogentica emtecidos medulares de tabaco. Desta forma meios de cultura contendo concentraes mais elevadas de citocininas promoviam a formao de brotaes areas ou eixoscaulinares; meios de cultura contendo nveis mais elevados de auxinas induziam a formao de razes e em concentraes equimolares destes reguladores decrescimento verificava-se a formao de calos.

A seleo de uma planta matriz e de um explante adequado condio fundamental para orientar os padro de morfognese (Thorpe, 1980). Murashige (1974) discutiuos vrios fatores que devem ser considerados nesta seleo, tais como o rgo da planta a ser utilizado como fonte de explante, a idade fisiolgica, a poca do ano emque feita a coleta e as condies gerais da planta doadora.

5.1.1. SISTEMAS ORGANOGENTICOS

O termo cultura de rgos usado para todos os tipos de cultura nos quais uma forma organizada de crescimento pode ser continuamente mantida. Inclui o isolamentoassptico de estruturas definidas como primrdio foliar, flores imaturas e frutos, e seu crescimento in vitro. Para a micropropagao os mais importantes tipos deculturas de rgos so:

a) Cultura de meristema

Consiste no estabelecimento do domo meristemtico apical sem os primrdios foliares. A brotao apical tipicamente cresce, originando um nico broto.

b) Cultura de pices caulinares

o estabelecimento in vitro a partir de brotaes apicais maiores do que aquelas utilizadas para iniciar a cultura de meristema, tendo alguns primrdios foliares. Essasbrotaes apicais podem produzir mltiplas brotaes.

c) Cultura de segmentos nodais

Os segmentos nodais so constitudos de gemas laterais isoladas, segmentos de caule com uma ou mltiplas gemas. Cada gema desenvolve para formar uma nicabrotao.

d) Cultura de embries

iniciada a partir de embries zigticos extrados de sementes. Os embries germinam originando brotos.

A cultura de meristema e a cultura de embries so descritos com mais detalhes a seguir.

5.1.1. Cultura de meristemas apicais

Esta tcnica compreende o isolamento e a inoculao do domo apical e alguns primrdios foliares, ou do meristema (figura 5) isoladamente (0,10 a 0,20 mm decomprimento). Usualmente, a cultura de meristema refere-se ao crescimento do domo apical da brotao, excluindo as folhas primordiais. O meristema no apresentafololos, sendo constitudo por duas regies diferentes, tnica e corpus. A tnica constituda de uma a trs camadas de clulas, a mais interna forma a epiderme e asoutras duas restantes do origem a folha ou somente a epiderme foliar. O corpus a camada mais interna, responsvel pela formao do restante da planta. O plano dediviso da tnica anticlinal e do corpus periclinal.

O objetivo neste caso a produo de uma microplanta enraizada que deve ser livre de virus, fungos e bactrias. Quanto menor for o explante mais efetiva ser aeliminao de patgenos. Esta tcnica tem obtido sucesso com muitas plantas herbceas exploradas economicamente, como cravo, crisntemo, batatinha, batata-doce, mandioca, banana. No caso do morango a simples utilizao de mudas obtidas por cultura de meristemas propiciou um aumento na produtividade de 3 para 12t/ha em lavouras do RS (Peters, 1986). Atualmente com a introduo de tecnologias adicionais na cadeia produtiva do morango, j so obtidas produtividades de at 80t/ha, em cultivos no RS, SC e SP. Para plantas lenhosas a cultura de meristemas apresenta algumas dificuldades havendo a necessidade de utilizao de tcnicasauxiliares como a microenxertia (Hartmann et al., 1990).

A histria da erradicao na cultura de tecidos de virus iniciou em 1934 quando White observou que sub-cultivos de segmentos de razes de plantas infectadas porvirus, levavam sua eliminao. Observou-se posteriormente que a gema apical de crescimento tambm se encontrava livre de vrus. Morel e Martin Lo, na dcada de40, cultivaram meristemas caulinares de plantas infectadas, obtendo sucesso. Hoje esta tcnica universalmente utilizada e apresenta grande impacto na produoagrcola vegetal.

Em uma planta infectada, a concentrao de virus no uniforme e maior em tecidos maduros e menor em tecidos meristemticos. Na primavera quando ocrescimento intenso, os meristemas alongam-se rapidamente e a concentrao de virus menor.



Figura 09- Corte longitudinal do meristema apical do caule de Coleus sp. Seta grossa = gema axilar; seta fina = protoderme; cabea de seta = procmbio; MF = meristema fundamental; PM =promeristema. Barra = 500 mm. (Apezzato, 2003).

Estudos demonstram que plantas obtidas por cultura de tecidos esto livres de vrus. A hiptese mais aceita para a ausncia de vrus nestes tecidos diz que ainterrupo temporal da organizao normal do tecidos meristemticos, ocasiona uma inibio da multiplicao do vrus devido a no disponibilidade de enzimaschaves. Esta hiptese do efeito da desorganizao celular foi reforada pela presena de baixas concentraes de vrus em calos friveis de tabaco, quandocomparados com calos compactos e com maiores nveis de organizao. Alm disto, a ausncia de tecido vascular na regio do meristema apical, a presena deconexes plasmodesmticas em dimenses diminutas nestas clulas e o ritmo ativo de divises celulares nesta regio, tambm so fatores que podem explicar abaixa concentrao ou a ausncia de vrus nesta clulas. O processo ativo de diviso celular poderia utilizar a maior parte da energia para a formao demacromolculas e componentes celulares estruturais, deixando os vrus em condies pouco competitivas para a prpria multiplicao. Comprovou-se tambm que aconcentrao de vrus aumenta na regio sub-apical dos meristemas de plantas tratadas com substncias inibidoras de crescimento, as quais reduzem as taxas dediviso celular.

Em resumo, a inexistncia de vrus nos meristemas apicais pode ser atribuda aos seguintes aspectos:

a) O domo apical mantm certa distncia das terminaes vasculares e, nestas condies os virus necessitariam passar de clula a clula at o domo apical;

b) Quando as clulas meristemticas do domo apical esto em diviso ativa, o RNA do virus no consegue introduzir-se no genoma destas clulas;

c) Clulas meristemticas podem ter sistemas qumicos de inativao, que podem ser potencializados em meristemas isolados;

d) Altas concentraes de auxinas presentes nos meristemas caulinares seriam responsveis pela ausncia de virus.

A propagao massal das plantas isentas de viroses poder ser feita atravs de outras tcnicas como as que so descritas posteriormente.

5.5.1.1. Aplicaes da cultura de meristema

A cultura de meristemas utilizada para estudos do efeito de fitorreguladores na iniciao foliar e no estudo do florescimento, na propagao vegetativa para obtenode plantas livres de patognos e, na multiplicao clonal rpida. Os meristemas so amplamente utilizados na limpeza pois estes materiais so livres de vrus. Isto explicado plos seguintes fatos:

a) Crescimento contnuo do tecido. A diviso celular intensa, o que aumenta a competio por metablitos e desta forma o vrus no tem energia suficiente para suamultiplicao.

b) Ausncia do tecido vascular (floema e xilema) no meristema. muito difcil a passagem do vrus clula a clula (o DNA do vrus maior que o plasmodesmata).

Vrios fatores so determinantes para se obter sucesso na limpeza. Dentre estes, pode-se destacar:

Tamanho ideal do meristema: de 0,1 a 1 mm. Menor tamanho implica num maior sucesso na limpeza, mais a sobrevivncia menor;

Localizao do explante: explantes retirados da ponta do broto esto em um estdio mais jovem de desenvolvimento do que explantes da base;

poca de coleta: os explantes devem ser de fase de crescimento ativo.

5.1.1.2. Proliferao de gemas axilares (segmentos nodais)

Esta tcnica fundamentada pela induo das gemas laterais existentes. Inclui o isolamento e a inoculao de segmentos nodais contendo gemas vegetativasaxilares, propiciando a multiplicao direta (ausncia de calo) de brotaes que podem ser separadas em microestacas para enraizamento in vitro ou in vivo. Esteprocedimento pode originar respostas de propagao massal em progresso geomtrica. Por ser um sistema direto, apresenta menores possibilidades de gerarvariantes somaclonais. Um dos exemplos de utilizao desta tcnica a propagao clonal do abacaxi atravs da liberao das gemas axilares. Atualmente umsistema utilizado em laboratrios junto a viveiros comerciais de espcies lenhosas, pois fcil de fcil manipulao e de alta taxa de regenerao de explante. Almdisso, o material vegetal mantm as caractersticas genticas com quase ausncia absoluta de variaes epigenticas.

5.1.2. INDUO E PROLIFERAO DE GEMAS ADVENTICIAS

Consiste na induo e formao direta ou indireta de meristemides a partir de discos foliares, pices caulinares ou radiculares, segmentos caulinares nodais einternodais, cotildones, hipoctilos e outras estruturas de plntulas, segmentos de flores e inflorescncias imaturas (monocotiledneas: Gladiolus, Hemerocallis, Iris,Freesia; Dicotiledneas: Gerbera, Chrysanthemum), escamas de bulbos (tecidos meristemticos na placa basal). Neste modelo, a escolha do explante e o tipo econcentrao do regulador de crescimento determinam o sucesso da iniciao das brotaes adventcias. No caso de iniciao direta, algumas clulas parenquimticasepidrmicas ou sub-epidrmicas tornam-se meristemticas e grupos celulares (meristemides) com forte reao a corantes especficos se desenvolvem. No modeloindireto ocorre a desdiferenciao das clulas parenquimticas e a organizao dos meristemides e as brotaes adventcias surgem a partir da periferia dos calos.

Este modelo organogentico resulta nas maiores taxas de multiplicao, sendo de uso mais geral e comum em plantas hortcolas. Por outro lado ele pode originar a



produo de variantes ou quimeras por estar baseado na formao de calos. Outro uso freqente deste modelo o co-cultivo com Agrobacterium em tcnicas detransformao de plantas.

5.1.2. ESTGIOS E MODULAO DA ORGANOGNESE

A microproagao de plantas atravs da cultura de tecidos pode ser operacionalizada em uma seqncia laboratorial de trs estgios, cada qual apresentando objetivos,pressuposies e necessidades especficas em termos de composio dos meios de cultura, tipo e balano dos reguladores de crescimento e condies fsicas comoluz, temperatura, foto perodo. Em condies laboratoriais cada estgio deve ser identificado e as condies timas devem ser estabelecidas (Murashige 1974).Debergh e Read (1991) propuseram a incluso do estgio 0 nesta seqncia de operaes e, desta maneira, a induo e a expresso de respostas organogenticas invitro deve obedecer aos passos listados a seguir:

Estgio 0 - Consiste em selecionar e cultivar a planta matriz doadora de explantes em condies adequadas e, eventualmente, controladas. Isto significa que pode sernecessrio modificar as condies de fotoperodo e temperatura, ou aplicar a essa planta fitorreguladores do grupo das giberelinas e auxinas, alterando com isto a suacondio fisiolgica.

Estgio I - Consiste no estabelecimento da cultura assptica. O objetivo deste estgio a definio do tipo de explantes a ser utilizado, o estabelecimento de culturasisentas de microorganismos contaminantes, a obteno de altos ndices de sobrevivncia e de rpido crescimento dos explantes. Neste estgio torna-se necessriomonitorar e controlar as reaes de oxidao que ocorrem: a) pela oxidao de compostos fenlicos presentes no explante, como resposta ao ferimento provocado pelaexciso de um rgo ou tecido e; b) pela sntese de compostos mono e polimricos por parte do explante. A incubao destas culturas na ausncia da luz por algunsdias pode inibir os processos oxidativos.

Estgio II - Multiplicao: este estgio fundamentado na diviso e diferenciao celular, objetivando a obteno de uma plntula, de acordo com as diferentes rotasmorfogenticas possveis. De maneira geral procura-se promover a liberao de gemas axilares pr-formadas ou a induo de gemas adventcias. Em muitos casosestgios intermedirios de calo esto envolvidos, contudo, quando o objetivo a manuteno da conformidade clonal, a passagem por estgios de calo deve serevitada, tendo em vista a possibilidade de ocorrncia de variaes somaclonais. Neste estgio deve-se determinar o nmero e intervalo de sub-cultivos, bem comodeterminar e otimizar a taxa de multiplicao, ou seja, o nmero de gemas ou de eixos caulinares que podem ser obtidos a partir de cada inculo nos sub-cultivos. Parabananeira e abacaxizeiro, partindo-se de gemas apicais e laterais respectivamente, a taxa mdia de multiplicao de 10 eixos caulinares a cada sub-cultivo realizadoa cada 20 dias. A experincia adquirida com esses dois sistemas indica que podem ser efetuados cinco sub-cultivos com certa garantia de manuteno de fidelidadeclonal. A partir deste sub-cultivo podem aparecer mutantes ou variantes somaclonais. No Laboratrio de Fisiologia do Desenvolvimento e Gentica Vegetal do Depto. deFitotecnia do CCA/UFSC, no foram observadas alteraes morfolgicas na organognese do abacaxizeiro at o quinto sub-cultivo, a partir do qual se identificarammutantes, na freqncia de 1 para 700.

As condies ambientais neste estgio relacionam-se com a temperatura, cuja faixa tima est entre 22 e 27oC para plantas de clima temperado e tropical,respectivamente. O perodo de luz deve permanecer em torno de 16 a 18 horas em intensidades luminosas mdias de 5 W.m-2.

Estgio III - Nesta fase busca-se o elongamento, a induo e iniciao radicular e a preparao para a aclimatizao. O objetivo deste estgio a preparao para aconverso das condies heterotrficas para autotrficas. As estratgias deste estgio incluem eventuais incluses no meio de cultura de: a) GA3 para induzir oelongamento de eixos caulinares; b) AIB para induzir a iniciao radicular e; c) carvo ativado para favorecer a iniciao radicular. Redues nas concentraes dossais e das fontes de carboidratos do meio de cultura podem trazer benefcios iniciao radicular, bem como facilitar o processo de aclimatizao.

Tendo em vista que este estgio da cultura in vitro pode representar 30 a 60% do custo de uma planta micropropagada, muitos laboratrios preferem promover oenraizamento ex-vitro e esta estratgia deve ser considerada sempre que possvel. O emprego da tcnica da dupla-camada que consiste em adicionar uma pequenaquantidade de AIB sobre a superfcie do meio slido, para que ocorra a induo radicular dos eixos caulinares tem gerado execelentes resultados em muitos sistemas.

Estgio IV - Aclimatizaco: Neste estgio ocorre a transio da condio heterotrfica para autotrfica. O principal objetivo neste estgio diminuir ao mximo asperdas que ocorrem principalmente pela desidratao dos tecidos da microplanta. O emprego de estufas, tneis plsticos, sistemas de nebulizao e deantitranspirantes deve ser considerado para cada situao, tendo em vista que as plantas neste estgio normalmente no apresentam estmatos funcionais e suasfolhas tem reduzida capacidade de formao cutculas cerosas protetoras.

Composies adequadas de substratos tambm so importantes e na maior parte dos casos o emprego de areia, terra, vermiculita, casca de arroz carbonizadaisoladamente ou em misturas proporcionais, resulta em elevados ndices de sobrevivncia.

De maneira geral este estgio inicia com a retirada das plntulas dos frascos e a cuidadosa remoo por lavagem de resduos de meio de cultura solidificado junto aosistema radicular. Um segundo passo consiste em repicar estas plntulas para bandejas de isopor contendo o substrato autoclavado, cuja composio foi previamentedeterminada. O terceiro passo consiste em manter estas bandejas, por perodos de at 15 dias, em sala de cultura cuja temperatura e durao e intensidade luminosapossam ser controladas. A manuteno de uma cmara mida sobre as bandejas pode ser feita pela utilizao de filmes plsticos em cobertura. Posteriormente,transfere-se esta bandeja para uma estufa com sistema de nebulizao intermitente por perodos mdios de 15 a 30 dias, podendo-se aps, repicar estas plntulas parasacos plsticos contendo uma mistura convencional no autoclavada de solo argiloso, arenoso e matria orgnica e mant-las em condio de ripado ou cobertura comsombrite que deixem passar em torno de 50% da luminosidade. Por fim procede-se uma retirada gradual da cobertura para que as mudas sejam submetidas scondies normais que se verificam aps o transplante para o local definitivo. importante salientar que determinada seqncias destas operaes podem sereliminadas em algumas espcies. Para abacaxizeiro, por exemplo, o segundo passo anteriormente descrito pode ser eliminado e no h a necessidade de ser feita arepicagem para sacos plsticos, podendo as mudas ser comercializadas ou enviadas ao campo nas bandejas de isopor. Torna-se necessrio, portanto, estabelecerprocedimentos especficos para cada espcie a ser trabalhada em um laboratrio de micropropagao.

5.1.3. CULTURA DE EMBRIES

A cultura de embries pode ser definida como o isolamento estril e crescimento de um embrio imaturo ou maturo in vitro, com o objetivo de se obter uma plantavivel.

Embries zigticos ou de sementes so frequentemente usados vantajosamente como explantes em cultura de tecidos, por exemplo, para iniciar a cultura de calo. Emcultura de embries, entretanto, os embries so retirados das sementes e so individualmente isolados e "germinados" in vitro desenvolvendo uma planta por explante.A cultura de embries isolados pode ajudar na produo rpida de plntulas de sementes que apresentam dormncia embrionria ou embrio imaturo.

5.1.3.1.Tipos de cultura de embries:

a) Cultura de embrio imaturo

Originado de sementes imaturas, usado para evitar o abortamento natural. mais difcil, devido a exciso e meio de cultura mais complexo.

b) Cultura de embries maduros

Originado de sementes maturas, usado para evitar a inibio de germinao de semente.

5.1.3.2. Estdios de desenvolvimento do embrio

Quanto mais imaturo for o embrio maior ser o requerimento nutricional. No estdio globular h requerimento de meios mais complexo (fitormnios, altasconcentraes de acares, gua de coco, etc.). Antes do formato de corao, os embries so bastante heterogneos, no sintetizando fitormnio ou mobilizandocompostos de carbono.

No estdios heterotrficos, os embries requerem sais, acares, vitaminas, nitrognio, citocininas, auxinas, gua de coco (algumas substncias podem ser opcionais).Quando aumentam de tamanho, tornam-se autotrficos e neste estdio requerem um meio mais simples.

Os embries geralmente requerem alta taxa de acar (fonte de carbono e agente osmtico), pois tm um potencial hdrico muito negativo (contedo alto de slidos).Uma alternativa para resolver a dificuldade imposta pelo potencial hdrico do embrio fixar a sacarose e elevar o teor de manitol (agente osmtico).

5.1.3.3 Fatores que afetam o sucesso da cultura de embrio

1) Gentipo: em algumas espcies o embrio cresce facilmente enquanto que em outras muito difcil (h tambm diferenas entre cultivares de uma espcie).



2) Estdio de desenvolvimento do embrio no isolamento: muito difcil desenvolver embrio muito pequeno in vitro.

3) Condio de crescimento da planta-me. crescer a planta-me em condies controladas resulta em um melhor desenvolvimento do endosperma, portanto melhorao crescimento do embrio isolado.

4) Composio do meio: embries imaturos requerem uma composio mais crtica do que embries maturos. Em ambos (maduro e imaturo) os macro emicroelementos so importantes.

Os meios usados so slidos: MS, White e 85, em uma faixa de pH entre 5 a 6. Carboidratos (sacarose, usada na concentrao de 2-3% e 8-12% para embriesmaturos e imaturos, respectivamente) so fontes de energia e tambm agem abaixando o potencial osmtico, especialmente em embrio jovens.

O gar usado em concentraes entre 0,6 a 0,8% (valores abaixo resultam em inibio de crescimento). Os reguladores de crescimento auxinas e citocininasgeralmente no so usados. As vezes se utiliza giberelina. Substncias de contribuio complexa como a gua de coco so bastante utilizadas, especialmente paraembries imaturos.

5) Luz: fator pouco estudado. Algumas vezes mantm-se o embrio isolado no escuro por 7 a 14 dias.

6) Temperatura: a temperatura tima dependente da espcie, variando, geralmente entre 22 e 28C).

5.1.3.4. Aplicaes prticas da cultura de embries

a) Eliminao da inibio (dormncia) da germinao de semente

Em algumas espcies absolutamente impossvel obter a germinao in vivo devido a caractersticas genticas ou fisiolgicas.

b) Recuperao de hbridos de cruzamentos incompatveis

No melhoramento, cruzamentos interespecficos e intergenricos para transferir genes de interesse da espcie selvagem para a cultivada (aumenta a variabilidadegentica) podem produzir embries abortivos devido a incompatibilidade.

Isto ocorre tambm em cruzamentos onde existam barreiras pr ou ps-zigticas (sementes murchas e embries abortivos). Os embries hbridos so salvos eremovidos antes que ocorra o aborto e, posteriormente cultivados in vitro.

c) Superao da dormncia das sementes

Em algumas sementes ocorrem inibidores qumicos endgenos ou h requerimentos especficos de luz e temperatura ou ainda a resistncia fsica presente nasestruturas que recobrem o embrio. A cultura de embries uma alternativa para superar estes problemas.

d) Superao da esterilidade das sementes.

As causas de ocorrncia de sementes estreis em algumas espcies podem ser o desenvolvimento incompleto do embrio, mutaes das estruturas que cobrem oembrio ou algum tipo de dormncia recalcitrante para a qual nenhum mtodo tem sido desenvolvido.

e) Germinao de sementes de parasitas obrigatrios. Sem o hospedeiro, impossvel a ocorrncia in vivo. Assim tambm a retirada dos embries e cultivo in vitropode suprir esta necessidade, permitindo o desenvolvimento de plantas.

f) Preveno do embrio abortivo que ocorre com o amadurecimento precoce de frutos carnosos

Em cruzamento dos frutos (pssego, ameixa, cereja) o transporte de gua e nutrientes para o embrio imaturo algumas vezes cortado muito cedo, ocorrendo o aborto.

g) Propagao vegetativa

Devido a sua natureza juvenil com alto potencial regenerativo, embries so excelentes explantes para propagao clonal in vitro. Especialmente para conferas egramneas.

5.1.4. MICROENXERTIA

Esta tcnica (figura 10) consiste em excisar de uma planta matriz uma gema apical ou o meristema propriamente dito que enxertado sobre uma plntula porta-enxertoque foi obtida em condies asspticas. Sua principal aplicao a eliminao de viroses e de outros microorganismos de natureza sistmica que tendem a seacumular em plantas propagadas vegetativamente, quando da impossibilidade de se usar a tcnica de cultura de meristemas

Na citricultura esta tcnica tem sido empregada rotineiramente nos laboratrios de micropropagao porque no sistema tradicional baseado na propagao de clonesnucelares de espcies poliembrinicas, o tempo necessrio para a superao da juvenilidade muito longo. Alm disto, em espcies monoembrinicas ocorrevariabilidade gentica uma vez que o embrio pode ser resultante de um processo de fecundao cruzada.

A termoterapia tambm pode ser empregada para a limpeza de virus em plantas de propagao vegetativa, contudo nem todas as plantas apresentam-se isentas dosvrus aps serem submetidas a este processo.

Figura 10 Microenxertia da cultivar de ma Gala sobre porta enxerto Marubakaido. LFDGV. Fitotecnia. UFSC/CCA, 2002.

5.2. EMBRIOGNESE SOMTICA



Uma das mais claras demonstraes da totipotencialidade em clulas de plantas superiores a obteno de estruturas embrionrias bipolares em sistemas in vitro. Demaneira geral este modelo morfogentico inicia com a seleo e ativao de clulas embriogenticas competentes (modelo direto) ou com a induo destas clulas(modelo indireto) e progride atravs de seqncias idnticas aquelas observadas para a embriognese zigtica. Na definio de Haccius (1978) embriognese somticaou adventcia o processo pelo qual novos indivduos se originam a partir de clulas simples, que no so produto da fuso de gametas e que no apresentamconexes vasculares com os tecidos maternos.

A iniciao e o desenvolvimento de embries somticos em sistemas in vitro foi obtida quase simultaneamente por Steward et al. (1958) e por Reinert (1959) emDaucus carota. No final dos anos 70, a ocorrncia deste padro morfogentico j era relatada para 32 famlias, 81 gneros e 132 espcies vegetais.

Existem claras evidncias de que a ocorrncia da ES in vitro favorecida por uma adequada manipulao de uma auxina forte no meio de cultura. O 2,4-D parece seresta auxina na maior parte dos sistemas experimentais. Segundo Vasil (1982), a competncia embriogentica aparentemente adquirida durante o perodo inicial emcultura na presena de altos nveis desta auxina. Contudo a expresso da embriognese somtica somente ocorre na presena de baixos nveis deste regulador decrescimento.

5.2.1. EMBRIOGENESE SOMTICA ADVENTICIA

Ocorre a partir de clulas ou calos originados em aparatos reprodutivos. As clulas que iniciam o processo (clulas-mes) so proembriogeneticamente determinadas(PEDC). Exemplos ilustrativos deste sistema incluem a regenerao a partir do tecido nucelar em citros (Button & Kochba, 1977), de vulos imaturos de mamo (Litz,1987) e de videira (Mullins, 1987). Embries adventcios podem ter origem direta a partir de clulas simples localizadas na epiderme dos embries zigticos, viaalterao nos planos de diviso, como o caso do palmiteiro (Guerra e Handro, 1988), ou indireta a partir de calos de embries zigticos de cacau (Pence et al., 1979).

5.2.2. POLIEMBRIOGNESE SOMTICA

uma forma de multiplicao que captura o processo natural de reconstituio do embrio zigtico. Inicia com o transplante para culturas in vitro de massassuspensor-embrionrias, que so massas celulares derivadas dos primeiros estgios da embriognese zigtica. A correta manipulao deste sistema permite aclonao em larga escala destas clulas em um ciclo repetitivo. A alterao das condies de cultura permite a progresso destes pr-embries para estgiossubseqentes (ciclo de maturao) e a obteno de um grande nmero de embries somticos que podem ser encapsulados em cpsulas de hidrogel paraarmazenamento ou semeadura (sementes artificiais ou sintticas). Este processo distinto daquele verificado para a embriognese somtica adventcia porque osestgios de desenvolvimento ocorrem sem a necessidade de se excisar um tecido, induzir a desdiferenciao e a posterior rediferenciao celular, o que implica dizerque na poliembriognese somtica no h formao de calos. Alm disto, algumas das clulas transplantadas podem dividir-se sem a necessidade da adio dereguladores de crescimento ao meio de cultura. Este fenmeno atribudo a superioridade gentica e aos altos nveis endgenos de fitorreguladores nestas clulas.

A poliembriognese somtica de ocorrncia ampla nas gimnospermas, mas pode ocorrer tambm em angiospermas. Revises completas sobre o assunto soencontradas nos artigos de Gupta e Durzan (1986) e Durzan e Gupta (1988) e no livro "Plant Morphogenesis" de Sinnot (1960).

5.2.3. EMBRIOGNESE SOMTICA INDUZIDA

Este modelo resulta de calos e suspenses celulares depois que o tecido matriz (explante) submetido a tratamentos que induzem competncia embriogentica(detalhes na figura 12). Isto significa que necessrio que ocorra a desdiferenciao e posterior rediferenciao celular atravs de uma reprogramao gentica(epignese) cujos determinantes bsicos so o estgio fisiolgico do explante e o tipo e concentrao do regulador de crescimento que atuar como sinal qumico paraa ativao gnica diferencial. De maneira geral, a perspectiva de sucesso em extrair resposta embriogentica neste modelo depende da utilizao de explantes juvenisou embrionrios e da manipulao adequada de uma auxina forte, como o 2,4-D. Esta auxina atua como indutora do processo (efeito "pulse"), contudo sua presena nomeio de cultura depois da induo pode causar anormalidades ontogenticas. Portanto, neste modelo em particular e na embriognese somtica em geral, a ativao ouinduo desencadeada pelo uma auxina forte como o 2,4-D mas a expresso desta rota morfogentica somente ocorrer em meios de cultura isentos ou com baixasconcentraes deste regulador de crescimento.

Exemplos ilustrativos deste modelo foram obtidos e/ou citados para o cafeeiro por Sondahl et al. (1981), para palmeiras por Tisserat et al. (1979), para gramneas porVasil (1982), para soja por Christianson (1985) e para cenoura por Litz et al. (1985), cujos artigos ampliam e aprofundam detalhes sobre este modelo.

Figura 12. Ciclos da Embriognese somtica e a seqncia de eventos celulares da desdifenciao e diferenciao (Adaptado de Durzan, 1988)

5.2.4. SUSPENSES CELULARES

Suspenses celulares consistem de clulas e agregados celulares dispersos em meios lquidos em agitao. O crescimento celular baseia-se nas mudanas das taxasde diviso em fases definidas. No incio as clulas dividem-se lentamente (lag fase), posteriormente ocorrem fases de rpido crescimento (exponencial e linear) e porfim, as clulas tendem a taxas menores de diviso por efeito de competio (fase estacionria). Neste momento, atravs da subcultura de uma amostra destas clulas, possvel reiniciar a cultura e este procedimento pode ser mantido indefinidamente (Street, 1977).

Suspenses celulares podem ser iniciadas pela inoculao de calos friveis ou outros tecidos que possam originar linhagens celulares organogenticas ouembriogenticas. Uma suspenso celular de primeira passagem contem uma mistura de clulas vivas, mortas e resduos. Filtragem seletiva, uso de pipetas ou seringasauxiliam na obteno de culturas puras e homogneas.

A possibilidade da manipulao e do cultivo de clulas em escala comercial pode exigir o uso de biorreatores. Estes equipamentos foram desenvolvidos originalmentepara o cultivo de microorganismos e outras clulas vivas para propsitos de fermentao e/ou para a produo de produtos secundrios para uso industrial. Parasuspenses celulares vegetais, os meios de cultura so praticamente idnticos aqueles exigidos para a obteno de calos e incluem os macro e micronutrientes,



sacarose, vitaminas e um adequado balano de reguladores de crescimento.

De maneira geral a maior utilidade dos biorreatores relaciona-se com a obteno de um grande nmero de clulas ("scale-up") em ciclos repetitivos de diviso celular epara a obteno de metablitos secundrios. Para efeitos de micropropagao, as clulas obtidas so plaqueadas e manipuladas para a ativao de processosregenerativos nas rotas de organognese ou embriognese somtica. A induo/ativao de linhagens celulares embriogenticas atravs de suspenses em meioslquidos pode propiciar a obteno de uma relao direta (1 clula pr-embrionria/ 1 plntula) e parece ser o melhor sistema pelo qual tecnologias de encapsulamentoem hidrogel possam gerar sementes sintticas. Alm disto, o estabelecimento de linhagens celulares embriogenticas a maneira mais elegante de se manipular emodular a embriognese somtica para a propagao massal de gentipos superiores. Suspenses celulares so tambm as melhores fontes para a obteno deprotoplastos para propsitos de fuso, transformao e introduo de organelas.

5.2.4.1. Aplicaes da suspenso celular:

usada para obteno de sementes sintticas (embriognese somtica isolamento de protoplastos, isolamento de mutantes, obteno de resistentes certos elementos(Alumnio, toxinas, herbicidas, sal), produo de metablito secundrios e nos processos de transformao de plantas.

5.2.4.2. Mtodos mais utilizados para medir o crescimento celular:

Para quantificar o crescimento de clulas em suspenso, so utilizado:

principalmente os mtodos baseados no nmero de clulas, peso de matria seca peso de matria fresca, volume de clulas e protena total da clula.

Um calos tpico iniciado de um explante passa por trs estgios de desenvolvimento, que compreende a induo da diviso celular, um perodo de diviso celular ativadurante o qual as clulas diferenciadas perdem a; caractersticas especializadas para tornarem-se desdiferenciada e um perodo no qual a diviso celular reduzida oumesmo cessa, iniciando ento a especializao celular. Esses estdios podem ser acompanhados numa curva de crescimento caracterizadas por seis fases (figura13).

Fase lag: caracterizada por no ter ganho em nmero de clulas, pelo inicio da mobilizao de metablitos sem ocorrer qualquer diviso celular, pela sntese deprotenas e sntese de metablitos especficos. A ateno deve ser dada densidade do incuo que afeta o comprimento da fase lag. Quanto menor o peso do calosutilizado, maior a fase lag.

Fase exponencial: caracterizada por diviso celular intensa, aumento no nmero de clulas, porm clulas de tamanho pequeno com formao de agregados declulas.

Fase linear, a fase exponecial seguida pela fase linear. O crescimento celular ativo e as clulas adquirem competncia para proceder a repicagem.

Fase de desacelerao: ocorre uma reduo na diviso celular. no final dessa fase que se deve iniciar o processo de repicagem.

Fase estacionria: a repicagem deve ser terminada ainda no inicio dessa fase quando no h diviso celular. As culturas no podem ser mantidas nessa fase por umperodo longo.

Fase de declnio: as clulas comeam a morrer, culminando com a lise celular.

Figura 13. Dinmica de crescimento de uma suspenso celular.(Adaptado de George, 1993).

5.2.4.3. Importncia da dinmica de crescimento

A curva de crescimento de calos calculada com o objetivo de se obter a poca de repicagem (subcultura), para determinar onde h a maior produo de metablitos(quando o estudo objetiva o metabolismo secundrio). Esta fase de desacelerao, pois os metablitos secundrios no constituem prioridade no metabolismo celular.

5.2.5 .BIORREATORES

Os biorreatores so equipamentos usados para micropropagao clonal e massal de plantas, cujo objetivo a imerso temporria ou permanente de cultura de clulasou tecidos vegetais ao meio de cultivo lquido. Tem propsito fundamental de facilitar o trabalho rotineiro e melhorar as condies ambientais e aspticas para asculturas, produzindo em larga escala..

Historicamente, os biorreatores foram mais conhecidos por fermentadores e estavam direcionado para o cultivo de clulas ou microrganismos, com vistas a produzirmetablicos secundrios, alcalides, antibiticos, entre outros (Barruetto, 2002). O nome fermentador est relacionado etimologicamente com fermentao que, na suaraiz latina, deriva de fermentare, cujo significado ferver, isto , produzir bolhas de ar, numa aluso ao fato de os fermentadores serem destinados a processosfermentativos como, por exemplo, a produo de lcool, onde as leveduras regeneram NAD a partir de sua forma reduzida NADH, com produo de etanol e C02, naqual este ltimo, pela apario de bolhas, d a idia de fazer ferver o meio lquido nutritivo (Leveau & Bouix,1985).

Inicialmente, e pelo fato de serem destinados a usos industriais, esses fermentadores foram de grande capacidade: de 20 a 4.000 mil litros de meio lquido nutritivo. Emdecorrncia disso, esses fermentadores devem ter acurados sistemas de oxigenao, agitao mecnica do meio lquido, monitoramento do pH, da temperatura e daformao de espuma, tudo o que os converte em verdadeiras obras da engenharia e da automatizao, que asseguram parte bitica (microrganismos) sobreviveremnesse ambiente abitico artificial, visando aumentar seus rendimentos (biomassa, metablicos secundrios, antibiticos, etc.), porm com altos custos de instalao.

Paralelamente biotecnologia da fermentao, a cultura de tecidos vegetais vinha desenvolvendo seu trabalho biotecnolgico de manipulao de clulas, tecido ergos com vistas a propagar material clonal para uso comercial.

Os primeiros biorreatores adaptados para plantas datam de, aproximadamente, 26 anos atrs (Levin et al., 1988) De l para c, muitos tipos tm sido propostos, issoporque um biorreator concebido em funo do tipo de processo que se deseja obter. Assim, para embriognese somtica, se requer um tipo de biorreator, mas, paramicropropagar atravs de organogense, gemas, o desenho mais eficiente pode ser outro (Merchuk, 1990).

5.2.5.1. Sistemas de biorreatores

Biorreatores de imerso temporria; Consiste geralmente de um conjunto de dois recipientes com capacidade de 1 a 5 litros. Um que contm o meio de cultivo lquido(menos de 20% da capacidade do frasco), outro que comporta os explantes. Em tempo pr-determinado ocorre a transferncia do meio de cultivo para o frasco quecontm os explantes por um breve perodo (de 1 a 3 minutos). Depois o meio sugado para o depsito em mesmo nvel ou escoado em depsito com nvel inferior.



Este ciclo repetido a cada hora, ou ento, conforme as exigncias do explante. Sua utilizao efetiva tem sido para sistemas morfognicos, j que uma dasdificuldades a fixao de pequenos explantes (figura 14).

Figura 14 Tipos de biorrteatores e sistemas de funcionamento

Biorreatores de imersso permanente; Em geral so os biorreatores utilizados para a micropropagao massal de plantas, mais especificamente para a cultura declulas isoladas, calos ou de protoplastos. Tem pequena capacidade (1 a 5 litros), e, no caso de serem desenhados para multiplicao de clulas ou embriessomticos.

Devem possuir um sistema de oxigenao, um outro de agitao mecnica, por meio de ps giratrias ou um sistema vibratrio para produzir a turbulncia necessria homogenizao e homeostase no interior do biorreator, e ainda, sensores de pH, temperatura, 02 e espuma (Preil et al. 1988; Takayama & Akita, 1994). Tambm outraopo so bales volumtricos com depresses laterais, os quais so rotacionados em sentido orbital (figura 14).

Biorreatores de tipo air-lift; No tocante propagao de plantas atravs de gemas, existem os biorreatores de imerso temporria (Alvard et al.,1993) e os deborbulhamento contnuo ou imerso permanente (BIPER) tipo air-lift (George, 1993-96) Nos de imerso temporria, as gemas a serem multiplicadas ficam expostas aciclos de imerso, evitando a presena de dispositivos de agitao e arejamento e, portanto, simplificando o desenho do biorreator. Este biorreator, basicamente umsistema de engenharia simples e barata. Consta de um recipiente de vidro com capacidade de 500 a 1000 ml, cuja tampa apresenta dois furos, um para a entrada do are outro para sada, sendo que, em ambos os casos, esses orifcios esto providos de dutos de ao inox com filtro Millipore (0,2 m de poro) a fim de evitar acontaminao interna.

O ar provido atravs de um microcompressor (aproximadamente 3 litros/ minuto), e conduzido ao fundo do recipiente atravs de uma mangueira de silicone, de ondesai, atravs de um tubo poroso, formando bolhas que agitaro o meio lquido. Com exceo da borracha que liga o filtro de entrada ao compressor, todos oscomponentes do sistema so autoclavveis (120C e 20 minutos) (figura 14).



Figura 15: Culturas de bromlia cultivada em processos de biorreatores de imerso temporria e a seqncia de formao, determinao e regenerao dos explentes. LFDGV, Fitotecnia, UFSC/CCA,2001.

5.2.5.2. Inoculao dos explantes

feita a autoclavagem, o frasco, contendo o meio nutritivo. Depois em cmara de fluxo laminar aberto para a inoculao de brotos, suspenses celulares ou calos. Omeio lquido normalmente constitudo do meio SP (Barrueto Cid et al., 1999) complementado com diferentes concentraes de BAP (6-benzilamino purina) segundo setrate de orqudeas (Ionopsis ochlereuca), abacaxi (Ananas comosus L. cv. Perola) caf (Coffea arabica), mamo (Carica papaya L. cv Tainug), lamo (Populus tremula xP. alba). As touceiras contendo um nmero variado de brotos so previamente obtidas em meio slido e uma precondio ter seu protocolo de multiplicaoestabelecido, antes de iniciar os trabalhos com o biorreator. Os explantes em geral podem ser de origem do prprio sistema dos biorreatores, dando a possibilidade deprocessar cultivos seqncias de explantes em escalas comercias, as biofbricas.

5.2.6. PROTOPLASTOS

Protoplastos so a parte viva das clulas vegetais. Contm o ncleo, citoplasma, vacolo e outros componentes celulares circundados por uma membrana semi-permevel. A clula vegetal, em contraste com a clula animal, circundada por uma parede celular constituda de celulose, hemicelulose e materiais pcticos.Protoplastos podem ser obtidos a partir de clulas em suspenso ou diretamente a partir de clulas do mesfilo foliar.

A obteno de protoplastos foi possvel a partir da descoberta de que a parede celular das clulas vegetais poderia ser removida por enzimas que a digerem (Cocking,1960). Preparaes enzimticas comerciais so baseadas em misturas de celulase e pectinase. A manuteno de uma presso osmtica adeuqada necessria paraprevenir a ruptura da membrana celular e para contrabalanar a remoo da parede celular. A utilizao de alguns corantes tais como carmin actico, azul de Evans ecompostos de reao de fluorescncia pode indicar a viabilidade ou no dos protoplastos obtidos.

As aplicaes das tcnicas de isolamento e regenerao de protoplastos podem ser vistas sob dois ngulos. Do ponto de vista do conhecimento bsico possvel o



estudo dos aspectos relacionados com a formao da parede celular e com a ontognese de processos regenerativos a partir de clulas simples. Do ponto de vistaaplicado torna-se possvel a utilizao de tcnicas de transformao como a fuso de protoplastos de espcies no aparentadas, rompendo com isto os limitesimpostos pela propagao sexual. A fuso de protoplastos de gentipos distintos gerando a combinao de dois ncleos e citoplasmas chamado de hibridizaosomtica ou parasexual. Alm disto, protoplastos so considerados como o material ideal para a utilizao de tcnicas de transformao direta atravs de metodologiasenvolvendo DNA recombinante.

5.2.7. CULTURA DE POLN E ANTERAS

A cultura de anteras uma tcnica para a obteno de plantas haplides a partir de plantas normalmente diplides. A descoberta que o gro de plen poderiadesenvolver embries foi feita por acaso na dcada de 60. Atualmente, muitas plantas so produzidas a partir do gro de plen imaturo ou calo que desenvolve a partirdo micrsporo.

A cultura de anteras tem grande potencial para o melhoramento de plantas e usada para a obteno de plantas haplides. A palavra haplide refere-se a plantas quepossuem o nmero gametoftico de cromossomos em seus esporfitos, ou seja, so originrias de um esporfito e contm metade do nmero de cromossomos daespcie.

Plantas haplides podem ser obtidas in vivo atravs de polinizao com plen irradiado, polinizao com plen abortivo (estril), tratamento do plen com choquestrmicos, hibridao distante. In vitro pode ser obtido pelo desenvolvimento da oosfera no fertilizada, pela cultura de anteras e ou gros de plen (diretamente porembriognese e indiretamente via formao de calos).

As fontes de explantes usadas so anteras imaturas, que fornecem plen uninucleado (por ocasio da primeira mitose) se constituindo no material mais promissor parainduo de andrognese e botes florais fechados.

5.2.7.1. Obteno de haplides por cultura de anteras

O protocolo para cultura de anteras pode ser descrito resumidamente:

a) os botes florais fechados so desinfestados;

b) faz-se uma inciso de um dos lados do boto floral e estames so delicadamente removidos. O filamento do estame removido (com bastante cuidado para nodanificar as anteras) e

c) as anteras so inoculadas em meio de cultura.

5.2.7.2. Fatores que influenciam a andrognese

1) Gentipo da planta doadora: tem sido observado que gneros, espcies e cultivares apresentam diferentes respostas na cultura de anteras.

2) Condies fisiolgicas e idade da planta: flores das plantas relativamente novas, no incio da florao so mais adequadas do que botes florais de plantas velhase em final de seu perodo de crescimento.

3) Estdio de desenvolvimento do plen: o micrsporo no estgio uninucleado o mais adequado (antes ou logo aps a primeira antese). Existe correlao entre otamanho do boto floral e o estdio do desenvolvimento do plen (importante ao se considerar a ploidia do embrio produzido). O estgio do desenvolvimento do plenna antera pode ser determinado pelo corante acetocarmicima ou reagente de Schiff.

4) Pr-tratamento dos botes ou anteras:

a) Tratamento trmico: deve ser feito em baixa temperatura (3 a 5 C). Assim se retm a viabilidade do plen por mais tempo, retardando a senecncia, sincronizandoas clulas e prevendo o aborto do plen.

b) Tratamento qumico: aplicaes de qumicos como o etrel (paclobutrazol), hidrazida maleica, carvo ativado, podem induzir as anteras a formar em embries.

c) Tratamento fsico: radiaes ionizantes, presses atmosfricas reduzidas (uso de dissecador); centrifugao.

5) Composio do meio de cultura: os meios mais utilizados so o MS, White, Nitsch. A sacarose a fonte de carbono mais efetiva de carboidratos e suaconcentrao varia com as espcies.

A necessidade de reguladores de crescimento, tambm varivel. Suplementos orgnicos como casena hidrolizada, gua de coco, extraio de leveduras, aminocidos,cido ascrbico tem sido utilizados com sucesso.

5.2.7.3. Identificao de haplides

A identificao de haplides pode ser feita com genes marcadores, que produzem cor, cuja manifestao possa ser mostrada na semente ou plntulas. Marcadoresmorfolgicos e por contagem de cromossomos, atravs de tcnicas citolgicas.

5.2.7.4. Problemas

Alguns problemas relacionados cultura de anteras podem ocorrer quando so usadas tcnicas inadequadas para se produzir plantas dipides a partir de haplid

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