FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DE RIBEIRÃO PRETO - USP

DEPARTAMENTO DE FÍSICA E QUÍMICA

DISCIPLINA DE BIOQUÍMICA

CURSO DE ODONTOLOGIA

Práticas de Bioquímica

Conceitos Gerais

Elaboração: Profa. Dra. Yara Maria Lucisano Valim (Coordenação) Profa. Dra. Ana Isabel de Assis Pandochi Prof. Dr. Augusto César C. Spadaro Profa. Dra. Carem Gledes Vargas Rechia Prof. Dr. Carlos Curti Dra. Luciana Mariko Kabeya Dra. Daniela Trinca Bertazzi

2008

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DE RIBEIRÃO PRETO

Reitora: Profa. Dra. Suely Vilela Vice-Reitor: Prof. Dr. Franco Maria Lajolo Diretor: Prof. Dr. Augusto César C. Spadaro Vice-Diretor: Prof. Dr. Jairo Kenupp Bastos DEPARTAMENTO DE FÍSICA E QUÍMICA Chefe do Departamento: Profa. Dra. Pierina Sueli Bonato

Suplente do Chefe do Departamento: Profa. Dra. Glória Emília Petto de Souza Endereço:

Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – USP Departamento de Física e Química – Disciplina de Bioquímica Via do Café, S/N 14.040-903 - Ribeirão Preto - S.P. - Brasil Fone: (16) 3602-4179 Fax: (16) 3602-4880

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SUMÁRIO

INTRODUÇÃO AO LABORATÓRIO..........................................................5

I. Recomendações gerais ...............................................................5

II. Antes do experimento ...............................................................6

III. Durante o experimento ..............................................................6

III.A. manuseio dos reagentes ......................................................6

III.B. preparo de soluções .........................................................6

III.C. medida do volume de líquidos ................................ 7

III.D. aquecimento de líquidos em tubo de ensaio e chama de bico Bunsen ................................................................

7

IV. Depois do experimento ..............................................................7

V. Acidentes mais comuns em laboratório e primeiros socorros ..........................8

VI. Principais vidrarias e materiais utilizados nas aulas práticas .....................9

PREPARO DE SOLUÇÕES................................................................11

I. Introdução ................................................................11

II. Formas de expressar a concentração das soluções ................................11

II.A. Molaridade ................................................................11

II.B. Concentração da solução expressa em porcentagem ..............................12

II.C. Partes por milhão (ppm) ......................................................13

III. Informações sobre o reagente .......................................................14

III.A. Porcentagem de pureza do reagente ................................14

III.B. Densidade ................................................................15

IV. Diluição de soluções ...............................................................15

IV.A. Fórmula geral ................................................................15

IV.B. Diferença entre diluição A:B e mistura na proporção A:B ......................16

V. Medida do volume de soluções .......................................................18

VI. Procedimento geral para uso de pipetas ................................19

TITULAÇÃO..........................................................................21

I. Definição de termos ................................................................21

II. Preparo do titulante ...............................................................21

III. Titulação ácido-base ...............................................................22

CAPACIDADE TAMPONANTE..............................................................26

I. Dissociação da água ................................................................26

II. Relação entre [H+] e [OH-] em soluções aquosas e o valor do pH ......................26

III. Teoria de Brönsted-Lowry para ácidos e bases ................................28

IV. Dissociação de ácidos fracos .......................................................29

V. Solução tampão ................................................................30

V.A. Aspectos gerais ...............................................................30

V.B.. Como funciona uma solução tampão ................................31

V.C. A equação de Henderson-Hasselbach ................................33

VI. Capacidade tamponante ..............................................................33

VI.A. Aspectos gerais ..............................................................33

VI.B. Capacidade tamponante da saliva ................................34

VI.C. Cálculo da capacidade tamponante ................................34

VII. Resumo ................................................................35

VII.A. Itens levados em consideração na elaboração de uma solução tampão ................................................................

35

4

VII.B. Principias equações citadas neste capítulo ................................35

VII.C. Regras matemáticas envolvendo logarítmos ................................35

VIII. Exemplo de preparo de uma solução tampão ................................36

PROTEÍNAS..........................................................................38

I. Introdução ................................................................38

II. Reações para aminoácidos ...........................................................39

III. Reações para identificação de proteínas ................................39

IV. Separação de proteínas por precipitação ................................40

IV.A. Precipitação pelos reagentes de alcalóides ................................40

IV.B. Precipitação fracionada por soluções salinas concentradas ....................41

GLICÍDEOS..........................................................................42

I. Introdução ................................................................42

II. Parte experimental ................................................................44

II.A.Preparação da solução de amido ................................ 44

II.B.Pesquisa de amido na solução preparada ................................44

II.C.Obtenção de glicose a partir da solução de amido preparada ....................45

II.D. Caracterização química dos glicídeos ................................45

II.D.1.Reação com alfa-naftol (teste de Molisch) ...............................45

II.D.2.Pesquisa de sacarídeos redutores (reação de Benedict) ...................46

LIPÍDEOS...........................................................................48

I. Introdução ................................................................48

II. Ácidos graxos ................................................................48

III. Propriedades gerais ................................................................50

III.A. Solubilidade ................................................................50

III.B. Saponificação ...............................................................50

III.C. Propriedade dos sabões ......................................................50

SALIVA.............................................................................52

I. Introdução ................................................................52

II. Estudo da atividade da amilase salivar ................................53

II.A.Fatores que influenciam na atividade enzimática ...............................53

II.A.1.pH ................................................................54

II.A.2.Temperatura .............................................................54

II.A.3.Concentração de substrato ................................54

II.A.4.Concentração de enzima ..................................................55

II.A.5.Presença dos cofatores e/ou coenzimas ................................55

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INTRODUÇÃO AO LABORATÓRIO

O laboratório é um lugar privilegiado para a realização de experimentos, possuindo instalações de água, luz e gás de fácil acesso em todas as bancadas. Possui ainda local especial para manipulação das substâncias tóxicas, denominado capela, que dispõe de sistema próprio de exaustão de gases.

O laboratório é um local onde há um grande número de substâncias que possuem os mais variados níveis de toxicidade e periculosidade. Este é um local bastante vulnerável a acidentes, caso não se trabalhe com as devidas precauções.

As regras gerais de segurança em laboratório resultam de vários anos de esforços de pessoas preocupadas em tornar o trabalho no laboratório uma atividade segura, minimizando os riscos de acidentes. Para tirar o máximo de proveito delas, é necessário que todos os usuários as conheçam e as pratiquem, desde o primeiro instante em que pretenderem permanecer em um laboratório. São regras simples, fáceis de memorizar e de seguir.

I. RECOMENDAÇÕES GERAIS 1. Tendo qualquer dúvida solicite aos professores os devidos

esclarecimentos. 2. Compareça às aulas nos dias e nos laboratórios designados para sua

turma. 3. Lembre-se que o laboratório é um lugar para trabalhos sérios e não

para experimentos ao acaso; portanto, evite brincadeiras que dispersem a sua atenção e a de seus colegas.

4. Realize somente os experimentos indicados na aula. Nada, além disso. Você não sabe avaliar o perigo e a abrangência do procedimento “inocente” que pretende fazer.

5. Vestimenta Recomendada Não recomendada Avental longo (até os joelhos) Calça comprida Sapato fechado Óculos de segurança Luvas de material adequado Cabelo comprido preso

Bermuda ou short Calçado aberto (sandália, chinelo) Uso de lente de contato Uso de braceletes, correntes ou outros adereços Cabelo comprido solto

6. Não é permitido no Laboratório:

• Fumar, comer e beber

• Sentar no chão, sentar ou debruçar na bancada

• Correr 7. Não deixar livros, blusas, etc., jogados nas bancadas; coloque-os

longe do local do experimento. 8. Quando houver quebra ou danos nos materiais ou aparelhos, comunique

aos professores. 9. Certifique-se da localização dos itens de emergência, principalmente:

chuveiro de emergência, lava-olhos, extintores de incêndio, saídas de emergência.

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II. ANTES DO EXPERIMENTO 1. Leia as práticas com antecedência para obter melhor aproveitamento das

aulas. 2. Vista o avental (guarda-pó, bata). 3. Organize o seu campo de trabalho. 4. Verifique se o material está em condição adequada para uso (não

utilize material de vidro trincado ou quebrado).

III. DURANTE O EXPERIMENTO

III.A. Manuseio dos reagentes 1. Não troque os reagentes de uma bancada para outra. 2. Leia duas vezes o rótulo dos frascos de reativos, antes de utilizá-

los. Nunca utilize um reagente que não esteja identificado ou rotulado.

3. Não manuseie sólidos e líquidos desconhecidos apenas por curiosidade. 4. Identifique imediatamente qualquer reagente ou solução preparada. 5. Para evitar contaminação das soluções:

- Antes de introduzir pipetas nas soluções, certifique-se de que estão limpas;

- Use sempre uma pipeta para cada reagente; - Não troque as rolhas ou tampas dos frascos dos reagentes; - Nunca devolva a solução para o frasco estoque; - Não use a mesma vidraria para medir substâncias ou soluções

diferentes. 6. Nunca teste amostras ou reagentes pelo sabor. Não leve à boca qualquer

reagente, nem mesmo o mais diluído. 7. Para verificar o odor da substância, nunca leve o rosto diretamente

sobre o frasco. Os vapores devem ser abanados com uma das mãos em direção ao nariz, enquanto se segura o frasco com a outra mão.

8. Não leve a mão à boca ou aos olhos enquanto estiver manuseando produtos químicos ou biológicos.

9. Reagentes voláteis ou tóxicos devem ser manuseados na capela. 10.Nunca deixe ou abra frascos de líquidos inflamáveis (éter, álcool,

acetona, benzeno, etc.), nas proximidades de chamas. 11.Para medir substâncias corrosivas ou tóxicas, obturar a extremidade

superior da pipeta com um pouco de algodão, ou usar uma bureta, que é mais seguro.

12.Quando pipetar sangue, ácido concentrado ou soluções alcalinas concentradas lavar imediatamente com água o material utilizado.

13.Não pipetar soluções ou amostras com a boca, use pipetador ou pêra de sucção.

III.B. Preparo de soluções 1. Soluções ácidas: para preparar soluções de ácidos fortes (sulfúrico, clorídrico, nítrico, etc), verter sempre o ácido sobre a água, nunca a água sobre o ácido, porque provoca reação exotérmica violenta. 2. Soluções alcalinas (NaOH, KOH, etc.): tome bastante precaução pois a

reação é exotérmica e corrosiva. Mantenha o frasco em banho de gelo

7

para evitar quebras. Não aspirar os vapores desprendidos, usar a capela). Acondicionar em frascos plásticos.

3. Soluções alcoólicas: o álcool e a água devem ser medidos separadamente

e depois reunidos, porque há diminuição do volume total.

III.C. Medida do volume de líquidos

1. O líquido no interior da vidraria forma menisco. A leitura deve ser

feita na parte inferior do menisco, e na altura da linha dos olhos. 2. O material volumétrico vem calibrado com água destilada a uma dada

temperatura, conforme vem registrado (15, 20, 25oC).

3. As pipetas volumétricas têm maior precisão que as graduadas, sendo utilizadas para preparo de soluções padrões e molares.

4. Para uso das pipetas graduadas, observar o quadro abaixo:

para medir volumes entre usar pipeta de

0 e 1 mL 1 mL (graduada ao centésimo) 1 e 2 mL 2 mL (graduada ao centésimo) 2 e 5 mL 5 mL (graduada ao décimo) 5 e 10 mL 10 mL (graduada ao décimo)

Acima de 10 mL recomenda-se o uso de proveta ou bureta.

III.D. Aquecimento de líquidos em tubo de ensaio e chama de bico de Bünsen 1. Para aquecer o tubo de ensaio na chama direta, no bico de Bünsen,

observe se o tubo está externamente seco, caso contrário, seque o mesmo antes de efetuar a operação.

2. Segure o tubo com o auxílio de pinça adequada, de madeira ou metal, e mantenha-o em constante agitação, em cima da chama e fora dela, para que o aquecimento seja uniforme.

3. Dirigir a boca do tubo para o lado oposto ao seu, nunca em direção a si mesmo ou ao colega, pois poderá ocorrer um esguicho e com isto atingi-lo.

4. Aquecer lentamente, sem permitir que a chama aqueça o vidro na parte sem líquido, para evitar o superaquecimento e a quebra do tubo.

5. Espere sempre que o vidro quente volte a esfriar antes de pegá-lo. Lembre-se, o vidro quente parece sempre estar frio.

6. Terminado o uso do bico de Bünsen, verifique se as torneiras do gás estão bem fechadas, evitando assim explosões e intoxicações.

IV. DEPOIS DO EXPERIMENTO

- Descartar os reagentes conforme recomendado em cada aula.

- Passe água de torneira nos tubos e outros materiais utilizados e deixá-los em bacia na pia.

- As pipetas devem ser colocadas dentro das cubas.

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V. ACIDENTES MAIS COMUNS EM LABORATÓRIOS E PRIMEIROS SOCORROS CORTES

- Lavar o ferimento em água corrente abundante e em seguida comprimir com ajuda de algodão/gaze.

- Sempre que possível, elevar a parte ferida acima do nível do corpo. QUEIMADURAS

- Superficiais: quando atingem algumas camadas da pele. - Profundas: quando há destruição total da pele.

A)QUEIMADURAS TÉRMICAS - causadas por calor seco (objetos aquecidos ou

chama) A1) Tratamento para queimaduras leves - pomada picrato de butesina,

paraqueimol, furacim solução, etc. A2) Tratamento para queimaduras graves - elas devem ser cobertas com

gaze esterilizada umedecida com solução aquosa de bicarbonato de sódio a 1%, ou soro fisiológico, encaminhar logo à assistência médica.

B) QUEIMADURAS QUÍMICAS - causadas por ácidos, álcalis, fenol, etc. B1) Por ácidos: lavar imediatamente o local com água em abundância. Em

seguida, lavar com solução de bicarbonato de sódio a 1% e, novamente com água. (ATENÇÃO: no caso de contato da pele com ácido sulfúrico concentrado, primeiramente enxugue a região com papel absorvente, para somente depois lavá-la com água).

B2) Por álcalis: lavar a região atingida imediatamente com água. Tratar com solução de ácido acético a 1% e, novamente com água;

B3) Por fenol: lavar com álcool absoluto e, depois com sabão e água; ATENÇÃO: Não retire corpos estranhos ou graxas das lesões.

Não fure as bolhas existentes. Não toque com as mãos a área atingida. Procure atendimento médico com brevidade.

C) QUEIMADURAS NOS OLHOS

Lavar os olhos com água em abundância ou, se possível, com soro fisiológico, durante vários minutos, e em seguida aplicar gaze esterilizada embebida com soro fisiológico, mantendo a compressa, até atendimento médico.

ENVENENAMENTO POR VIA ORAL A) A droga não chegou a ser engolida: Deve-se cuspir imediatamente e

lavar a boca com muita água. Levar o acidentado para respirar ar puro.

B) A droga chegou a ser engolida: Deve-se chamar um médico imediatamente. Dar por via oral um antídoto, de acordo com a natureza do veneno.

INTOXICAÇÃO POR VIA RESPIRATÓRIA Retirar o acidentado para um ambiente arejado, deixando-o descansar. Dar água fresca. Se recomendado, dar o antídoto adequado.

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"A CALMA E O BOM SENSO SÃO AS MELHORES PROTEÇÕES CONTRA ACIDENTES NO LABORATÓRIO"

VI. Principais vidrarias e materiais utilizados nas aulas práticas

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Exemplos de utilização dos materiais de laboratório

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PREPARO DE SOLUÇÕES I. INTRODUÇÃO Solução é uma mistura homogênea, constituída por dois ou mais

componentes por exemplo: água salgada, gasolina, vinagre, ar. As soluções

podem ser sólidas, gasosas ou líquidas. As mais empregadas são as

soluções líquidas aquosas (ou simplesmente soluções aquosas), nas quais o

solvente é a água.

Uma solução líquida consiste de duas partes: o material que foi

dissolvido (soluto) e um material líquido no qual este foi dissolvido

(solvente). Se dissolvêssemos 1 g de cloreto de sódio e de açúcar em 100

g de água, referir-nos-íamos à água como solvente e ao NaCl e açúcar como

soluto. Pode-se pensar no solvente como o componente no qual as

partículas do soluto encontram-se dispersas ao acaso.

Dois outros termos bastante empregados quando se refere a soluções

são: concentrado e diluído. São termos relativos e geralmente usados para

dar uma indicação qualitativa da concentração de um soluto em uma

solução. Assim, uma “solução concentrada de NaCl” tem uma proporção maior

de NaCl do que uma “solução diluída de NaCl”. A palavra concentrado é

também empregada para especificar certas soluções disponíveis

comercialmente. Por exemplo, “ácido sulfúrico concentrado” se refere à

solução que é fornecida pelos laboratórios fabricantes de produtos

químicos, constituída de cerca de 95% de ácido sulfúrico e 5% de água, em

massa.

A quantidade de soluto (em massa ou moles) contida no volume da

solução, ou seja, a concentração da solução, pode ser expressa por

diferentes unidades de concentração. As mais utilizadas em Bioquímica

são: mol/L, g/mL, ppm, %(m/v). Essas unidades descrevem de forma

quantitativa a composição de uma solução.

II. FORMAS DE EXPRESSAR A CONCENTRAÇÃO DAS SOLUÇÕES II.A. Molaridade Molaridade (M) é o número de moles do soluto (n) dissolvido por litro de solução. Ela é calculada tomando-se a relação do número de moles do soluto pelo volume da solução em litros, e expressa em mol/L. M (mol/L) = n sendo que n = massa (gramas) V (litros) massa molecular (g/mol)

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Exemplo 1: Um aluno dissolveu 8,70 g de NaCl (M.M. = 58 g/mol, pureza = 100%) em água destilada suficiente para preparar 100 mL de solução. Qual é a molaridade da solução? a. Calcular o número de moles.

n = m = 8,70 g = 0,15 moles M.M. 58 g/mol

b. Converter o volume para litros.

V = 100 mL = 0,1 L

c. Calcular a molaridade. M = n = 0,15 moles = 1,5 mol/L V 0,1 L

II.B. Concentração da solução expressa em porcentagem

• Porcentagem em massa por volume (%m/v): indica a massa do soluto (em gramas) presente em cada 100 mL de solução. A unidade utilizada é o símbolo de porcentagem (%), que pode ser seguido pela notação m/v (massa/volume).

% em massa/volume = massa do soluto (g) X 100

volume da solução (mL) Exemplos: - solução de dextrose a 5%(m/v) contém 5 g de dextrose em cada 100

mL de solução. - concentração do soro fisiológico: NaCl 0,9% ou NaCl 0,9%(m/v) [cada 100

mL de solução contém 0,9 g de NaCl]

• Porcentagem em massa (%m/m): indica a massa de soluto (em gramas) presente em 100 g de solução.

% em massa = massa do soluto (g) X 100

massa da solução (g) Exemplo: uma solução de ácido nítrico a 70%(m/m) contém 70 g de ácido nítrico em cada 100 g de solução.

• Porcentagem em volume (%v/v): indica o volume do soluto (em mL) presente em cada 100 mL de solução. É usada para expressar a concentração de uma solução que consiste de líquidos apenas.

% em volume = volume do soluto (mL) X 100

volume da solução (mL) Exemplo: uma solução de formol a 10%(v/v) contém 10 mL de formol em cada 100 mL de solução. Quando não houver anotação após o símbolo de %, entende-se por

(massa / volume).

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II.C. Partes por milhão (ppm)

Uma unidade empregada para expressar baixas concentrações é ppm (partes por milhão). Mais recentemente, tem-se adotado a notação

microgramas por mililitro (µg/mL). Uma parte por milhão é equivalente a 1 mg/L ou 1 g/KL. (ver conversão de unidades no quadro 2, página 16)

Exemplo 2: Um frasco contém 200 mL de solução de NaF a 0,5 mol/L. Qual a concentração da solução de NaF em %(m/v) e em ppm? E qual a concentração do íon Fluoreto em %(m/v) e em ppm? (massas atômicas: Na = 23; F = 19). * Concentração da solução: refere-se à concentração do sal (Na+F-) a. Massa molecular do NaF.

M.M. = 23 + 19 = 42 g/mol

b. Número de moles de NaF contidos em 200 mL de solução. 0,5 mol/L ____ 0,5 mol de NaF ___ 1000 mL de solução x ___ 200 mL de solução x = 0,1 mol de NaF

c. Massa do NaF em 200 mL de solução.

1 mol NaF ___ 42 g 0,1 mol NaF ___ Y

y = 0,42 g de NaF d. Concentração em %(m/v): massa (g) em 100 mL de solução.

0,42 g de NaF ___ 200 mL de solução z ___ 100 mL de solução z = 0,21 g de NaF

Portanto, a concentração da solução de NaF é de 0,21% (m/v).

e. Concentração em ppm (µg/mL). 0,42 g de NaF ___ 200 mL de solução

z ___ 1 mL de solução z = 0,0021 g de NaF

1 g ___ 1000000 µg

0,0021g ___ w W = 2100 µg

Portanto, a concentração da solução de NaF é 2100 µg/mL ou 2100 ppm. *Concentração de flúor: refere-se apenas à concentração do íon F-. a. Massa molecular do NaF.

M.M. = 23 + 19 = 42 g/mol

b. Número de moles de NaF contidos em 200 mL de solução. 0,5 mol/L ____ 0,5 mol de NaF ___ 1000 mL de solução x ___ 200 mL de solução x = 0,1 mol de NaF

c. Massa do F em 200 mL de solução. 1 mol NaF ___ 19 g de F

0,1 mol NaF ___ y y = 0,19 g de F

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d. Concentração em %(m/v): massa (g) em 100 mL de solução. 0,19 g de F ___ 200 mL de solução

Z ___ 100 mL de solução Z = 0,095 g de F

Portanto, a concentração de F na solução é de 0,095% (m/v).

e. Concentração em ppm (µg/mL). 0,19 g de F ___ 200 mL de solução

Z ___ 1 mL de solução Z = 0,00095 g de F

1 g ___ 1000000 µg

0,00095g ___ w W = 950 µg

Portanto, a concentração de F na solução é de 950 µg/mL ou 950 ppm. III. INFORMAÇÕES SOBRE O REAGENTE III.A. Porcentagem de pureza do reagente É comum encontrar, no laboratório, reagentes que não são 100% puros contendo percentuais variados de outros componentes (geralmente indicado no rótulo do frasco). A porcentagem de pureza de um reagente X, seja ele sólido ou líquido, refere-se à massa do composto X (em gramas) contida em 100 gramas do reagente.

Exemplos de reagentes sólidos: fluoreto de sódio, cloreto de cálcio, hidróxido de sódio, ácido cítrico, glucose.

Exemplos de reagentes líquidos: ácido sulfúrico, ácido clorídrico, dimetilsulfóxido, dimetilformamida.

Exemplo 3: Suponha que o reagente NaCl utilizado pelo aluno, no exemplo 1, era de pureza igual a 80%. Qual é a molaridade da solução preparada?

a. Calcular a massa de NaCl contida no reagente pesado

80% de pureza: 100 g do reagente ____ 80 g de NaCl 8,70 g do reagente ____ x x = 6,96 g de NaCl

b. Calcular o número de mols n = m = 6,96 g = 0,12 mols M.M. 58 g/mol

c. Converter o volume para litros

V = 100 mL = 0,1 L d. Calcular a molaridade

M = n = 0,12 mols = 1,2 mol/L V 0,1 L

NaCl

impurezas

NaClpureza: 95%

REAGENTEPureza do reagente NaCl igual a 95%

significa que cada 100 g do reagente contém

95 g de NaCl

5g de impurezas

NaCl

impurezas

NaClpureza: 95%

REAGENTEPureza do reagente NaCl igual a 95%

significa que cada 100 g do reagente contém

95 g de NaCl

5g de impurezas

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III.B. Densidade Uma das propriedades que servem para caracterizar uma substância é a sua densidade. Ela expressa a quantidade de matéria contida em uma dada unidade de volume. Empregando unidades métricas, as densidades dos sólidos são comumente expressas em unidades de gramas por centímetro cúbico (g/cm3), as dos gases em gramas por litro (g/L), e as dos líquidos em gramas por mililitro (g/mL) ou quilogramas por litro (Kg/L).

Para os reagentes líquidos, a densidade indica a razão entre a massa da solução e o seu volume.

d = m V

Os reagentes líquidos geralmente não podem ser pesados. Assim, para preparar soluções a partir de um reagente líquido é fundamental conhecer o valor da sua densidade, pois a partir dele obtém-se o valor do volume do reagente a ser medido.

Exemplo 4: Preparar 1 L de solução de ácido acético a 0,1 mol/L. (d = 1,058 g/mL; M.M. = 60,05; pureza = 90%). a. Calcular a massa teórica de ácido acético

1 mol de ácido acético ____ 60,05 g 0,1 mol de ácido acético ____ y

y = 6,0 g

b. Calcular a massa real de ácido acético a ser utilizada no preparo da solução, considerando a porcentagem de pureza do reagente. 90% de pureza: 100 g do reagente ____ 90 g de ácido acético z ____ 6,0 g de ácido acético z = 6,7 g do reagente

c. Calcular o volume do reagente a ser medido

d = m ou V = m = 6,7 g = 6,3 mL V d 1,058 g/mL

d. Importante: seqüência de passos para preparar a solução

1. Colocar no balão volumétrico cerca de 500 mL de água destilada 2. Adicione o volume de ácido calculado (6,3 mL)

3. Completar o volume para 1 litro com água destilada IV. DILUIÇÃO DE SOLUÇÕES IV.A. Fórmula geral

Soluções aquosas são freqüentemente preparadas por diluição, ou seja, pela adição de água a uma solução mais concentrada, cuja concentração é conhecida. Quando diluímos uma solução, evitamos o ato de pesar e dissolver a quantidade necessária de soluto. Visto que a quantidade de soluto não se altera, uma equação simples permite calcular a nova concentração:

C1 x V1 = C2 x V2

C1 e V1 são os valores iniciais de molaridade e volume C2 e V2 são os valores finais de molaridade e volume

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Atenção: as unidades de C1 e de C2 devem ser as mesmas, e as unidades de V1 e V2 também devem ser as mesmas.

Exemplo 5: qual o volume de H2SO4 18 mol/L necessário para preparar 500 mL de uma solução a 0,15 mol/L?

C1 x V1 = C2 x V2

18 mol/L x V1 = 0,15 mol/L x 500 mL V1 = 0,15 x 500

18 V1 = 4,2 mL

- Procedimento para diluição: em um frasco volumétrico de 500 mL, colocar um pouco de água, pipetar 4,2 mL de H2SO4 18 mol/L e completar para um volume final de 500 mL.

IV.B. Diferença entre diluição A:B e mistura na proporção A:B Para descrever o procedimento de obtenção de uma solução de uma determinada concentração a partir da diluição de uma solução de concentração maior, duas expressões comumente usadas são diluição A:B e mistura na proporção A:B.

Ambas têm a mesma representação gráfica (A:B), o que causa uma certa confusão, mas significado químico diferente (veja abaixo). Por isso, deve-se prestar bastante atenção na palavra que antecede a notação A:B. * Diluição A:B - Pegar um volume A e adicionar o solvente para obter o volume final B - Volume final = B * Mistura A:B - Pegar um volume A e adicionar um volume B - Volume final = A + B

Exemplo 6: Uma aluna está no laboratório preparando soluções para avaliar a atividade de enzimas salivares. Ela precisa de solução aquosa de NaCl na concentração de 0,9%. Entretanto, ela não dispõe do sal na forma sólida, apenas de soluções de NaCl mais concentradas. Os rótulos dos frascos contêm informações para diluição. Qual o procedimento de obtenção da solução a 0,9%?

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Solução A: • Concentração: NaCl 3,6 %(m/v) • Instrução do rótulo: diluir 1:4 com água para obter NaCl 0,9% • Procedimento para diluição:

- Pipetar 1 mL da solução de NaCl 3,6%

- Transferir para uma proveta ou balão volumétrico

- Adicionar água destilada até obter o volume de 4 mL - Volume final: 4 mL

Solução B: • Concentração: NaCl 4,5 %(m/v) • Instrução do rótulo: misturar com água na proporção 1:4 para

obter NaCl 0,9%

• Procedimento para diluição:

- Pipetar 1 mL da solução de NaCl 4,5%

- Transferir para uma proveta - Adicionar 4 mL de água destilada - Volume final: 5 mL

Exemplo 7: Considerando o exemplo 6: A aluna estava distraída, e inverteu os procedimentos para preparar as soluções. Quais as concentrações finais das soluções preparadas? solução A: NaCl 3,6 %(m/v) - ao invés de diluir 1:4 com água, Maria misturou com água na proporção 1:4

CA x VA = CB x VB 3,6% x 1 mL = CB x 5 mL

CB = 0,72% solução B: NaCl 4,5%(m/v) - ao invés de misturar com água na proporção 1:4, Maria diluiu 1:4 com água

CA x VA = CB x VB 4,5% x 1 mL = CB x 4 mL

CB = 1,13% Exemplo 8: O volume de solução preparado pela aluna no exemplo 6 foi insuficiente para o ensaio. Ela precisa preparar mais 100 mL de NaCl 0,9%, partindo das soluções A e B. Como ela deve proceder? Solução A: • Concentração: NaCl 3,6 %(m/v) • Instrução do rótulo: diluir 1:4 com água para obter NaCl 0,9%

C1 = 3,6% C2 = 0,9% V2 = 100 mL V1 = ?

Resolução 1 C1 x V1 = C2 x V2

3,6% x V1 = 0,9% x 100 mL V1 = 25 mL

18

Resolução 2 Diluir 1:4 ___ 1 mL NaCl __ 4 mL solução x __ 100 mL solução x = 25 mL NaCl

• Procedimento para diluição:

- Medir 25 mL da solução de NaCl 3,6% em pipeta ou proveta

- Transferir para uma proveta ou balão volumétrico

- Adicionar água destilada até obter o volume de 100 mL

Solução B: • Concentração: NaCl 4,5 %(m/v) • Instrução do rótulo: misturar com água na proporção 1:4 para

obter NaCl 0,9%

C1 = 4,5% C2 = 0,9% V2 = 100 mL V1 = ?

Resolução 1 C1 x V1 = C2 x V2

4,5% x V1 = 0,9% x 100 mL V1 = 20 mL

Resolução 2 Misturar na proporção 1:4 ___ 1 mL NaCl __ 5 mL solução x __ 100 mL solução x = 20 mL NaCl • Procedimento para diluição:

- Medir 20 mL da solução de NaCl 4,5% em pipeta ou proveta

- Transferir para uma proveta ou balão volumétrico

- Adicionar água destilada até obter o volume de 100 mL V. MEDIDA DO VOLUME DE SOLUÇÕES

Quando adicionamos soluções aquosas em provetas, buretas e pipetas, observamos que: a superfície de separação entre o líquido e o ar não é plana, mas geralmente tem formato côncavo. Essa superfície é denominada menisco. O mesmo pode também ser observado na porção alongada de um balão volumétrico, quando completamos o volume da solução. A leitura do volume em tais vidrarias deve ser realizada na parte inferior do menisco.

19

VI. PROCEDIMENTO GERAL PARA USO DE PIPETAS

Quando usar uma pipeta (graduada ou volumétrica), coloque um pipetador adequado na parte superior do tubo de sucção. Nunca use a boca para encher as pipetas, e jamais coloque uma pipeta nos lábios, seja qual for o líquido que esteja sendo medido.

1. Antes de medir o volume do líquido, lave a pipeta com uma pequena quantidade do líquido.

2. Encha a pipeta com o líquido, levando-o até 1 a 2 cm acima da marca da graduação.

3. Remova o pipetador, e coloque o dedo indicador para fechar a extremidade superior da pipeta.

4. Com o auxílio de um papel absorvente, remova todo o líquido que aderiu à parte externa da haste inferior.

5. Mantenha a pipeta na posição vertical e a marca no nível do seus olhos.

6. Deixe o líquido escorrer lentamente até que a parte inferior do menisco fique na posição correta.

7. Encoste a ponta da pipeta na parte interna do recipiente de trabalho (proveta ou balão volumétrico), remova o dedo da parte superior e deixe o líquido escoar.

8. Remova a pipeta e lave-a sob água corrente ou conforme recomendações específicas.

Quadro 1. Resumo dos conceitos relacionados ao preparo de soluções

Para uma solução X

concentração em molaridade: n. de mols do composto X / volume em litros

concentração expressa em %

% massa/volume:

% massa:

% volume:

massa em g do composto X em 100 mL de solução

massa em g do composto X em 100 g de solução

volume em mL do composto X em 100 mL de solução

concentração em ppm: 1 ppm = 1 µg/mL = 1 mg/L = 1g/1000 L

Para um reagente Y

% de pureza do reagente Y

(sólido ou líquido):

massa em g do composto Y em cada 100 g de reagente

densidade (líquido): massa em g do composto Y / volume em mL

Diluição de soluções

fórmula geral: C1 x V1 = C2 x V2

(C1 e V1: valores iniciais; C2 e V2: valores finais)

diluição (A:B) : V1 = A ; V2 = B

mistura na proporção (A:B) : V1 = A ; V2 = A + B

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Quadro 2. Resumo de conversões métricas Conversões de massa Conversões de volume

1 g = 0,001 Kg = 1 x 10-3 Kg 1 L = 0,001 KL = 1 x 10-3 KL

1 g = 1000 mg = 1 x 103 mg 1 L = 1000 ml = 1 x 103 mL

1 g = 1000000 µg = 1 x 106 µg 1 L = 1000000 µL = 1 x 106 µL

1 mg = 0,000001 Kg = 1 x 10-6 Kg 1 mL = 0,000001 KL = 1 x 10-6 KL

1 mg = 0,001 g = 1 x 10-3 g 1 mL = 0,001 L = 1 x 10-3 L

1 mg = 1000 µg = 1 x 103 µg 1 mL = 1000 µL = 1 x 103 µL

1 µg = 0,000000001 Kg = 1 x 10-9 Kg 1 µL = 0,000000001 KL = 1 x 10-9 KL

1 µg = 0,000001 g = 1 x 10-6 g 1 µL = 0,000001 L = 1 x 10-6 L

1 µg = 0,001 mg = 1 x 10-3 mg 1 µL = 0,001 mL = 1 x 10-3 mL

21

TITULAÇÃO I. DEFINIÇÃO DE TERMOS

Análise titrimétrica: análise química em que se determina o volume de uma substância de concentração exatamente conhecida necessário para reagir com um volume definido de uma amostra. Anteriormente, era denominada análise volumétrica. Titulante: solução cuja concentração é exatamente conhecida, sendo também chamada de solução padrão ou solução padronizada. É adicionado com o auxílio da bureta. Titulado: amostra (solução de concentração desconhecida). Titulação: é o nome da operação de adição do titulante ao titulado até que a reação se complete. Ponto estequiométrico ou ponto de equivalência: é o volume exato do titulante necessário para reagir com toda a amostra. Ponto final da titulação ou ponto de viragem: é o momento em que o titulante acabou de reagir com toda a amostra. Indicador: é um reagente auxiliar que permite identificar o ponto final da titulação, geralmente por mudança de cor. É adicionado na amostra, antes do início do procedimento. Figura 1. Esquema ilustrativo dos componentes de uma análise titrimétrica.

II. PREPARO DO TITULANTE

Quando se dispõe de um reagente com alto grau de pureza, fácil de

obter, purificar e secar, que não absorva umidade da atmosfera ou perca

umidade facilmente, a solução do titulante pode ser preparada pesando-se

uma massa conhecida, dissolvendo o material em um solvente apropriado

(geralmente água) e completando com solvente até um volume conhecido. O

titulante obtido por este procedimento é também denominado solução padrão

primária ou padrão primário.

titulante

(solução padronizada)

titulado(amostra)

+ indicador

suporteuniversal

garra

bureta

erlenmeyer

titulante

(solução padronizada)

titulado(amostra)

+ indicador

suporteuniversal

garra

bureta

erlenmeyer

22

Algumas substâncias adequadas ao preparo de soluções padrões

primárias: carbonato de sódio, hidrogenoftalato de potássio, tetraborato

de sódio, hidrogenoiodato de potássio, oxalato de sódio, nitrato de

prata, cloreto de sódio, cloreto de potássio, iodato de potássio, iodo,

bromato de potássio, nitrato de chumbo, iodato de potássio.

Quando o reagente não está disponível em pureza suficiente, como

ocorre com a maior parte dos hidróxidos básicos, alguns ácidos

inorgânicos e várias substâncias higroscópicas (que absorvem umidade

atmosférica) ou deliqüescentes (que perdem umidade facilmente), prepara-

se inicialmente uma solução de molaridade próxima à desejada. Em seguida,

esta solução é padronizada, isto é, o valor exato da sua molaridade é

determinado por titulação com um padrão primário. O titulante obtido por

este método é também denominado solução padrão secundária ou padrão

secundário.

Emprega-se este método indireto, por exemplo, na preparação de

soluções da maior parte dos ácidos, hidróxido de sódio, hidróxido de

potássio, hidróxido de bário, permanganato de potássio, amônia,

tiocianato de potássio, tiossulfato de sódio.

III. TITULAÇÃO ÁCIDO-BASE

A titulação ácido-base envolve reações de neutralização, onde um

ácido e uma base reagem, formando sal e água. Este procedimento é

utilizado para determinar a concentração de uma solução ácida ou básica.

HCl + NaOH → NaCl + H2O

A determinação da concentração de uma solução básica através da

adição de um ácido padrão é denominada acidimetria. O oposto, ou seja, a

determinação da concentração de uma solução ácida através da adição de

uma base é chamada alcalimetria.

Na titulação de uma solução de um ácido de concentração

desconhecida, um volume medido do ácido é adicionado a um erlenmeyer e

uma solução de concentração conhecida de base, é adicionado com o auxílio

de uma bureta até que o ponto de equivalência seja atingido. Este é o

ponto no qual todos os íons H+ provenientes do ácido foram neutralizados

pelos íons OH- provenientes da base, formando água.

No procedimento mais simples, o ponto de equivalência é indicado

pela mudança de cor de um indicador adicionado antes do início da

23

titulação. Normalmente, o pH no ponto de equivalência muda bruscamente

com a adição de volumes muito pequenos de titulante. Assim, uma nítida

mudança de cor fornece uma indicação clara do ponto de equivalência.

Um indicador de pH é um par conjugado de ácido e base de BrØnsted-

Lowry cujo ácido apresenta uma coloração e a base outra. A maioria dos

indicadores são moléculas orgânicas com estruturas relativamente

complexas. Portanto, usaremos simplesmente a abreviação HIn para

representar a forma ácida e In- a forma básica conjugada de um indicador.

Assim, em solução aquosa,

Indicador HIn + H2O ↔ In- + H3O+

(forma ácida) (forma básica)

Fenolftaleína pH ácido pH básico incolor rosa

Como pode ser observado nesse equilíbrio, o indicador existe na

forma ácida em soluções mais ácidas e na forma básica em soluções menos

ácidas, ou mais básicas.

Em titulações ácido-base, o ponto de equivalência não ocorre

necessariamente em pH 7,0. Isto significa que deve ser escolhido um

indicador adequado antes de ser iniciado o procedimento. Normalmente, o

pH aproximado no ponto de equivalência pode ser previsto, desta forma o

problema se resume em escolher um indicador adequado para este pH.

Tabela 1. Exemplos de indicadores de pH e suas mudanças de coloração.

Indicador pK indicador intervalo de pH

aproximado para

mudança de cor

mudança de cor

correspondente

azul de bromofenol 3,8 3,0 – 4,6 amarelo para azul

vermelho de clorofenol 6,0 5,2 – 6,8 amarelo para vermelho

Fenolftaleína 9,4 8,0 – 10,0 incolor para rosa

Timolftaleína 10,0 9,4 – 10,6 incolor para azul

24

Figura 2. Titulação de um ácido com uma base, empregando fenolftaleína como indicador.

Figura 3. Exemplos de curvas de titulação. A: ácido forte-base forte (HCl/NaOH).

B: ácido fraco-base forte (CH3COOH/NaOH).

EXEMPLO:

Suponha que você queira determinar a concentração de ácido acético

numa amostra de vinagre através de titulação. O procedimento experimental

geral é o seguinte:

1. Enchemos uma bureta com uma solução de base de concentração

conhecida, digamos NaOH 0,5 mol/L. A bureta nos permite dispensar

precisamente volumes variáveis de solução.

2. Em um erlenmeyer, colocamos um volume medido de vinagre, por exemplo:

10 mL, e adicionamos algumas gotas de solução de um indicador de pH

apropriado,tal como fenolftaleína.

NaOH

solução do ácido+

fenolftaleína

início da titulação(incolor)

final da titulação(rosa)

NaOHNaOH

solução do ácido+

fenolftaleína

solução do ácido+

fenolftaleína

início da titulação(incolor)

final da titulação(rosa)

25

3. Depois adicionamos lentamente o titulante, contido na bureta, sobre a

amostra (vinagre) até que o indicador mude de cor. Não se esqueça de

manter a amostra sob agitação.

4. Assim que o indicador mudar de cor, fechamos a torneira da bureta.

Podemos então ler o volume de base que foi adicionado. Suponha que

foram necessários 17,1 mL de NaOH 0,5 mol/L para neutralizar o ácido

acético do vinagre.

5. O cálculo da concentração de ácido é baseado na razão molar de ácido

para base. Escrevemos a equação da reação:

CH3COOH + NaOH → CH3COONa + H2O

CH3COO- + H+ + Na+ + OH- → CH3COO

-Na+ + H2O

Resolução 1: a. Inicialmente, calculamos o número de mols de NaOH contidos em 17,1 mL. NaOH 0,5 mol/L __ 0,5 mol de NaOH ____ 1000 mL de solução

x ____ 17,1 mL de solução x = 0,00855 mol de NaOH

b. Pela equação da reação, verificamos que cada mol de NaOH reage com um mol de ácido. A partir dessa relação, podemos calcular o número de mols de ácido acético contidos no volume titulado (10 mL).

1 mol de NaOH ____ 1 moL de CH3COOH 0,00855 mol de NaOH ____ Y

y = 0,00855 mol de CH3COOH c. No final, calculamos a concentração do ácido acético em mol/L.

0,00855 mol de CH3COOH ____ 10 mL de amostra z ____ 1000 mL z = 0,855 mol de CH3COOH

d. Portanto, a concentração de ácido acético na amostra de vinagre é 0,855 mol/L.

Resolução 2:

a. Como a reação envolve números iguais de moles de ácido e base, podemos também obter a concentração do ácido acético no vinagre de modo direto, utilizando a relação:

CA x VA = CB x VB sendo: CA e VA - concentração e volume do ácido CB e VB - concentração e volume da base

CA x VA = CB x VB

CA x 10 mL = 0,5 mol/L x 17,1 mL CA = 0,855 mol/L

b. Portanto, a concentração de ácido acético na amostra de vinagre é 0,855 mol/L.

26

CAPACIDADE TAMPONANTE I.DISSOCIAÇÃO DA ÁGUA

A água pura apresenta uma condutividade elétrica definida, como conseqüência de sua habilidade de sofrer autodissociação. A dissociação da água pode ser escrita como:

H2O

H+ + OH-

ou como: H2O + H2O

H3O+ + OH-

Para esta dissociação, a condição de equilíbrio pode ser escrita como

[H+].[OH-] = K’ [H2O]

ou como: [H3O+].[OH-] = K”

[H2O]2

Em qualquer um dos casos, como a concentração de moléculas de H2O é essencialmente constante,

[H+].[OH-] = [H2O] . K’ = Kw

ou: [H3O+].[OH-] = [H2O]

2 . K” = Kw

O valor de Kw é 1,0 x 10-14 a 25ºC. Kw é a constante de dissociação da água, também chamada de produto iônico da água.

II. RELAÇÃO ENTRE [H+] e [OH-] EM SOLUÇÕES AQUOSAS E O VALOR DO pH

A equação [H+].[OH-] = Kw = 1 x 10-14 (a 25ºC) aplica-se não somente

à água pura, mas também às soluções aquosas, nas quais as [H+] e de [OH-] podem ser diferentes. Podemos afirmar, então, que o produto da concentração de íons hidrogênio e íons hidróxido em solução aquosa é uma constante, e que à temperatura ambiente (25ºC, usual em laboratório) é igual à aproximadamente 1 x 10-14. Se a [H+] ou a [OH-] for conhecida, a outra poderá ser calculada.

Exemplo 1: Suponha que você tem uma solução de HCl 0,01 mol/L, que está completamente dissociado em H+ e Cl-. Determinar a concentração de H+ e OH- na solução.

HCl

H+ + Cl-

Considerando-se que o ácido está totalmente dissociado, então [H+] = [HCl] = 0,01 mol/L ou 1 x 10-2 mol/Le a [OH-] na solução será:

[H+].[OH-] = 1 x 10-14 1 x 10-2+.[OH-] = 1 x 10-14

[OH-] = 1 x 10-12 mol/L

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Exemplo 2: Para uma solução de NaOH 0,0001 mol/L, que está completamente dissociado, qual a concentração de H+ e OH- na solução?

NaOH

Na+ + OH-

Considerando-se que a base está totalmente dissociada, então [OH-] = [NaOH] = 0,0001 mol/L ou 1 x 10-4 mol/L.

[H+].[OH-] = 1 x 10-14

[H+].1 x 10-4 = 1 x 10-14 [H+] = 1 x 10-10 mol/L

Pode-se observar que existe uma relação inversa entre [H+] e [OH-]

em soluções. Quando uma delas aumenta, a outra diminui. Geralmente, expressa-se o valor de [H+], e não de [OH-].

A concentração total do íon hidrogênio em uma solução, ou [H+], é expresso pelo valor do pH. Matematicamente, o pH é definido como o valor negativo do logaritmo (log) da concentração do íon hidrogênio:

pH = - log[H+] ou pH = log 1/[H+]

Deve-se lembrar que os valores de pH são funções logarítmicas das

concentrações reais de íons H+. Portanto, uma diferença de pH de uma unidade representa uma diferença de 10 vezes na concentração real de H+. Exemplos:

pH = 3 → [H+] = 0,001 mol/L pH = 4 → [H+] = 0,0001 mol/L A acidez ou a alcalinidade de uma solução é determinada pelas

proporções de H+ e OH- presentes. Assim,

solução neutra: [H+] = [OH-] pH = 7 solução ácida: [H+] > [OH-] pH < 7

solução alcalina: [H+] < [OH-] pH > 7 Por que o pH de uma solução neutra é igual a 7? Em uma solução neutra [H+]=[OH-]. Assim, a concentração hidrogeniônica, [H+], em uma solução neutra

Kw = [H+].[OH-] = 1,0 x 10-14

como [H+]=[OH-]: [H+].[H+] = 1,0 x 10-14

[H+]2 = 1,0 x 10-14

[H+]= 1,0 x 10-7 mol/L

pH = -log [H+] = - log 1,0 x 10-7 = -(-7) = 7

O pH de uma solução contendo 1 mol/L de H+ é zero e uma contendo 1 mol/L de OH- é 14. A escala de pH de 0-14 cobre a faixa de acidez e alcalinidade das soluções normalmente encontradas.

28

Tomando-se o logaritmo

negativo da equação:

[H+][OH-] = Kw = 1 x 10-14

Tem-se: -log[H+] -log[OH-] = -logKw = 14

Como: -log[H+] = pH; -log[OH-] = pOH, -logKw = pKw

Pode-se escrever: pH + pOH = pKw = 14

III. TEORIA DE BRÖNSTED-LOWRY PARA ÁCIDOS E BASES

Brönsted, Lowry e colaboradores desenvolveram um conceito amplo de ácidos e bases que é muito útil. Ácido é qualquer substância que doa prótons (íons H+) e base é qualquer substância que combina com prótons. Em outras palavras, ácidos são doadores de prótons e bases são aceptores de prótons.

Exemplos: ácido base

HCl

H+ + Cl-

HCN

H+ + CN-

CH3COOH

H+ + CH3COO-

H2CO3

H+ + HCO3-

HCO3-

H+ + CO32-

H2SO4

H+ + HSO4-

HSO4-

H+ + SO42-

NH4+

H+ + NH3

NH3

H+ + NH2-

HOH

H+ + OH-

H3O+

H+ + H2O

De acordo com essa visão, um ácido se dissocia em um próton e uma

base, enquanto a base combina com um próton para formar um ácido. Um doador de próton e o seu correspondente aceptor de prótons formam um par ácido-base conjugado. Assim HCN produz H+ e CN-, onde HCN é o ácido e CN- é a base conjugada. A base conjugada correspondente ao ácido acético (CH3COOH) é o íon acetato (CH3COO

-). HSO4- é a base produzida por

dissociação de H2SO4; entretanto, HSO4- é também o ácido correspondente à

base SO42-.

HCN

ácido (fraco)

H+ + CN-

base conjugada (forte)

HCl

ácido (forte)

H+ + Cl-

base conjugada (fraca)

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De acordo com a teoria de Brönsted-Lowry, o ácido mais fraco tem a base conjugada mais forte, e o ácido mais forte tem a base conjugada mais fraca. Assim, HCN é um ácido fraco porque sua base conjugada forte, CN-, combina-se firmemente com prótons, enquanto que HCl é um ácido forte porque sua base conjugada, Cl-, combina-se fracamente com prótons.

Uma substância que atua tanto como ácido quanto como base é chamada anfotérica ou anfótero. Exemplos: água, hidróxido de zinco, amônia, aminoácidos.

NH3 + H+

NH4+

NH3

H+ + NH2-

H2O

H+ + OH-

H2O + H+

H3O+

IV.DISSOCIAÇÃO DE ÁCIDOS FRACOS

Ácidos e bases fortes estão completamente ionizados (dissociados) em soluções aquosas diluídas. Os ácidos e as bases fracas não se ionizam completamente quando dissolvidos em água. Os últimos são mais comuns em sistemas biológicos e desempenham importantes funções no metabolismo e sua regulação.

Exemplo 3: Considere as soluções de CH3COOH 0,2 mol/L (1% dissociado) e de HCl 0,2 mol/L. Calcular o pH de cada uma delas. a) HCl é um ácido forte, portanto está completamente dissociado em solução. Isso significa que a concentração de H+ é igual a concentração de HCl.

HCl 0,2 mol/L

H+

0,2 mol/L + Cl-

pH = -log [H+] = -log 0,2 = 0,7

b) CH3COOH é um ácido fraco, portanto, não está completamente dissociado em solução. A porcentagem de dissociação informada, correspondente a 1%, significa que a concentração de H+ é igual a 1% ou 0,01 da concentração de CH3COOH.

CH3COOH 0,2 mol/L

CH3COO

- + H+ 0,2 x 0,01 = 0,002 mol/L

pH = -log [H+] = -log 0,002 = 2,7

A dissociação de ácidos fracos ocorre de acordo com a lei de ação

das massas. As equações de equilíbrio podem ser formuladas para sua dissociação. Tais equações não se aplicam para dissociação de ácidos fortes. Considerando que a fórmula geral para qualquer ácido fraco monobásico é HA, sua equação de dissociação é:

HA

H+ + A-

30

De acordo com a lei de ação das massas, o equilíbrio pode ser expresso matematicamente como:

[H+][A-]= Ka [HA]

Onde Ka é chamada de constante de dissociação do ácido. As constantes de dissociação de ácidos e bases fracas podem ser

calculadas a partir dos dados obtidos pela medida da condutividade elétrica de suas soluções ou pela determinação do valor do pH de suas soluções. O valor de Kw da água é geralmente calculado a partir da medida de condutividade. Quanto maior o valor de Ka, mais ionizado está o ácido e, portanto, maior a sua força relativa.

Freqüentemente, encontramos os valores de pKa, ao invés dos valores de Ka.

pKa = - log Ka ou pKa = log 1/Ka Por exemplo, no caso do ácido acético, temos:

[H+][CH3COO-] = Ka = 1,86 x 10-5 = 0,0000186 (pKa = 4,73)

[CH3COOH] Para o ácido cianídrico: [H+][CN-] = Ka = 7,20 x 10-10 = 0,00000000072 (pKa = 7,14) [HCN]

O valor do Ka para CH3COOH (1,86 x 10

-5) é milhares de vezes maior que o valor do Ka para HCN (7,20 x 10-10); em contrapartida, o valor de pKa do ácido acético (4,73) é menor que o pKa do ácido cianídrico (7,14). Dessa forma, podemos determinar a força relativa de ácidos através da consulta de uma tabela de Ka ou pKa.

Assim, quanto mais forte um ácido, maior a sua tendência de dissociar um próton. Portanto maior a sua constante de dissociação (Ka) e menor o seu pKa.

Os ácidos polibásicos, que contém mais de um hidrogênio ionizável, dissociam-se em estágios, e há uma equação de equilíbrio e uma constante de dissociação para cada estágio. Isto pode ser ilustrado pelo caso do ácido fosfórico:

H3PO4

H+ + H2PO4-

H2PO4-

H+ + HPO42-

HPO42-

H+ + PO43-

As equações de equilíbrio para cada estágio de dissociação são:

[H+][ H2PO4-] = K1 = 1,1 x 10-2

[H3PO4]

[H+][ HPO42-] = K2 = 2,0 x 10-7

[H2PO4-]

[H+][ PO4

3-] = K3 = 3,6 x 10-13 [HPO4

2-] Onde K1, K2 e K3 são designadas primeira, segunda e terceira

constantes de dissociação do ácido.

31

V. SOLUÇÃO TAMPÃO V.A.Aspectos gerais

O pH da água pura (uma solução neutra) é 7,0. Se um ácido é adicionado à água, o seu pH diminui; se uma base é adicionada à água, o pH aumenta para mais que 7,0. O quanto o pH se afastará de 7,0, em cada caso, dependerá da quantidade de ácido ou de base adicionados e de suas forças.

Contudo, quando pequenas quantidades de ácido ou base são adicionadas a uma solução tampão, o seu pH não varia apreciavelmente. Uma solução tampão é definida como uma solução que resiste às variações de pH, quando ocorre a adição de pequenas quantidades tanto de ácidos como de bases.

As soluções tampão usualmente são constituídas de:

• Um ácido fraco (HA) e um sal correspondente a esse ácido (A-). ex: ácido acético e acetato de sódio

CH3COOH

CH3COO- + H+

CH3COONa

CH3COO

- + Na+

• Um sal de caráter ácido e um sal de caráter básico ex: di-hidrogenofosfato de sódio e mono-hidrogenofosfato de sódio.

NaH2PO4

Na+ + H2PO4-

Na2HPO4

2Na+ + HPO42-

• Uma base fraca (B) e um sal correspondente a essa base (BH+). ex: hidróxido de amônia e cloreto de amônia

NH4OH

NH4+ + OH-

NH4Cl

NH4

+ + Cl-

V.B. Como funciona uma solução tampão

Em uma solução contendo ácido acético e acetato de sódio, por exemplo, têm-se as seguintes equações de dissociação:

CH3COOH

CH3COO- + H+

CH3COONa

CH3COO

- + Na+

Os íons acetato provenientes da dissociação do ácido são poucos em

comparação com as moléculas do ácido não dissociado. Por outro lado, o número de íons acetato provenientes do acetato de sódio é igual ao número de moléculas do sal dissolvido, devido à ionização.

O mecanismo químico pelo qual os tampões funcionam podem ser ilustrados pelas modificações provocadas pela adição de NaOH e HCl ao tampão ácido acético/acetato de sódio.

• Adição de NaOH: O doador de próton, o ácido acético (HAc), contém uma reserva de H+ ligado, que pode ser liberada para neutralizar uma adição de OH- ao sistema, formando H2O; em conseqüência, a concentração de CH3COOH no tampão diminui e a concentração de CH3COONa aumenta.

• Adição de HCl: a base conjugada, o íon acetato (Ac-), pode reagir com ions H+ adicionados ao sistema, formando CH3COOH; em conseqüência, a concentração de CH3COONa no tampão diminui e a de CH3COOH aumenta.

32

Figura 1. Esquema simplificado do mecanismo de ação do tampão ácido acético/acetato de sódio, frente à adição de ácidos (H+) e bases (OH-).

Portanto, o sistema é capaz de absorver tanto H+ quanto OH- devido à

reversibilidade da dissociação do ácido acético. A ação tamponante é simplesmente a conseqüência de duas reações reversíveis ocorrendo simultaneamente e alcançando seus pontos de equilíbrio conforme expresso por suas constantes de equilíbrio Ka e Kw.

Cada par ácido-base conjugado tem uma zona de pH característico na

qual é efetiva como tampão: pH = pKa ± 1. Por exemplo, o par H2PO4-/HPO4

2- tem um pKa de 6,86 e serve como tampão efetivo entre aproximadamente pH 5,9 epH 7,9; o par NH4

+/NH3, com um pKa de 9,25, atua como tampão entre aproximadamente pH 8,3 e pH 10,3.

Figura 2. Curvas de titulação ilustrando as zonas de tamponamento de diferentes pares ácido-base conjugados.

Kw = [H+] [OH-]

OH- H2O

HAc Ac-

H+

Ácido acético(CH3COOH)

Acetato(CH3COO-)

[H+] [Ac-][HAc]Ka =

Kw = [H+] [OH-]

OH- H2O

HAc Ac-

H+

Ácido acético(CH3COOH)

Acetato(CH3COO-)

[H+] [Ac-][HAc]Ka =

Kw = [H+] [OH-]

OH- H2O

HAc Ac-

H+

Ácido acético(CH3COOH)

Acetato(CH3COO-)

[H+] [Ac-][HAc]Ka =

[H+] [Ac-][HAc]Ka =

33

V.C. A equação de Henderson-Hasselbach A equação de Henderson-Hasselbach é derivada da expressão da

constante de dissociação de um ácido, conforme descrito abaixo.

• Escreve-se a equação de dissociação de um ácido fraco: HA

H+ + A-

• A respectiva constante de dissociação: Ka = [H+].[A-]

[HA]

• Isola-se o termo [H+]: [H+] = Ka .[HA] [A-]

• Tira-se o logaritmo negativo de ambos os lados: -log[H+] = -logKa -log[HA] [A-]

• Substitui-se -log[H+] por pH e –logKa por pKa: pH = pKa -log[HA]

[A-]

• Inverte-se termo -log[HA]/[A-], para obter a equação de Henderson-Hasselbach: pH = pKa + log[A-] ou: pH = pKa + log [base conjugada]

[HA] [ácido conjugado]

A equação de Henderson-Hasselbach descreve o formato da curva de titulação de qualquer ácido fraco e permite deduzir diversas relações quantitativas importantes. Por exemplo, é possível verificar por que o pKa de um ácido fraco é igual ao pH da solução no ponto médio de sua titulação, neste ponto [HA]=[A-], então:

pH = pKa + log[A-] = pKa + log[A-] = pKa + log 1,0 = pKa + 0

[HA] [A-] pH = pKa

A equação permite calcular: • O pKa, quando o pH e a razão molar entre o doador e o aceptor de

prótons são conhecidos;

• o pH, quando o pKa e a razão molar entre o doador e o aceptor de prótons são conhecidos;

• a razão molar entre o doador e o aceptor de prótons, quando o pKa e o pH são conhecidos.

VI. CAPACIDADE TAMPONANTE VI.A. Aspectos gerais

As soluções tampão, ou simplesmente tampões, são encontrados em todos os fluidos corporais (sangue, saliva, lágrimas, urina, etc.) e são responsáveis pela manutenção do pH apropriado desses fluidos. Dois termos importantes que se referem a essas soluções:

34

• Efeito tampão: é a propriedade de uma solução de resistir a mudanças de pH (concentração de íons hidrogênio) ao se adicionar pequenas quantidades de ácido ou base.

• Capacidade tamponante: é o quanto uma solução tampão resiste às mudanças de pH, quando se adiciona pequenas quantidades de ácido ou base.

A capacidade tamponante de uma solução é indicada pela alteração de

pH provocada pela adição de ácido ou base. Quanto menor a alteração de pH causada pela adição de uma dada quantidade de ácido ou base, maior é a capacidade tamponante da solução, ou vice-versa.

VI.B. Capacidade tamponante da saliva

A saliva constitui um dos sistemas de defesa natural da cavidade oral contra o desenvolvimento de cáries dentárias. Estas ocorrem devido à desmineralização do esmalte e da dentina causada pelos ácidos produzidos pelo metabolismo bacteriano de açúcares. A saliva desempenha um importante papel contra a desmineralização, porque ajuda a repor cálcio e fosfato na superfície do dente. Em pH 7, a saliva está supersaturada com esses dois minerais, o que favorece a deposição de cálcio nas áreas desmineralizadas. A cárie ocorre quando a remoção de minerais dentários é maior que a reposição. O pH da saliva depende dos tipos de ácidos e bases secretados pelas glândulas salivares. O pH da saliva pode variar de 5,6 na saliva não-estimulada até 7,8 quando o fluxo salivar é alto, como na saliva estimulada.

Outra importante função da saliva é o tamponamento dos ácidos produzidos, por meio de diversos sistemas tampões. O sistema fosfato é de menor importância na saliva estimulada, devido à sua baixa concentração, mas de maior importância na saliva não estimulada. O sistema tampão mais importante na saliva estimulada é o ácido carbônico/bicarbonato. Alguns trabalhos indicam que uma boa capacidade tamponante da saliva, associada a um elevado fluxo salivar, contribuem para uma menor incidência de cáries. VI.C. Cálculo da capacidade tamponante A capacidade tamponante pode ser calculada com o uso da fórmula:

Cap. tamponante = β = 2,3 Ka [H+] [C]

(Ka + [H+])

2

onde: Ka : constante de dissociação do ácido [H+] : concentração hidrogêniônica do tampão [C] : concentração do tampão

β : número de mols/litro de H+ ou OH- necessários para causar mudança de 1 unidade no valor do pH do tampão

35

VII. RESUMO VII.A. Itens levados em consideração na elaboração de uma solução tampão: * O par ácido-base conjugado. Os elementos do par podem ser usados

separadamente, ou haver a formação de um a partir do outro.

Ex.: HA H+ + A

-

ácido base * O pKa do ácido do item acima. * A região de tamponamento desejada: pKa + 1 * Os cálculos de concentração e de pH, utilizando as equações: a)Henderson-Hasselbach

pH = pKa + log [base conjugada] [ácido conjugado]

b) [tampão] = [ácido conjugado] + [base conjugada]

VII.B. Principais equações citadas neste capítulo

HA

H+ + A- Ka = [H+][A-] [HA] pKa = log 1/Ka = -logKa pH = log 1/[H+]= -log[H+] [H+] = 10-pH [H+].[OH-] = Kw = 1 x 10-14 (a 25ºC) pH + pOH = pKw = 14 pH = pKa + log [base conjugada]

[ácido conjugado] [tampão] = [ácido conjugado] + [base conjugada]

Capacidade tamponante = β = 2,3 Ka [H+] [C]

(Ka + [H+])

2

VII.C.Regras matemáticas envolvendo logaritmos

Log a.b = loga + logb Log a/b = loga – logb Log 1/a = - loga log ab = b.loga log 1 = 0

36

VIII. EXEMPLO DE PREPARO DE UMA SOLUÇÃO TAMPÃO Preparar 500 mL de tampão fosfato 0,8 mol/L pH 7,4, empregando Na2HPO4 (M.M.=142,0) e NaH2PO4 (M.M.=120,0). pKa = 6,9. a. Montar as equações de dissociação dos sais, para identificar o ácido e a base conjugada que compõem o sistema tampão.

NaH2PO4

Na+ + H2PO4-

Na2HPO4

2Na+ + HPO42-

- Ácido conjugado (doador de próton): NaH2PO4

- Base conjugada (aceptor de próton): Na2HPO4 b. Calcular as concentrações de ácido e base conjugados

b1. pH = pKa + log [base conjugada] [ácido conjugado]

7,4 = 6,9 + log [base conjugada]

[ácido conjugado] log [base conjugada] = 0,5

[ácido conjugado] [base conjugada] = 100,5 = 3,162 [ácido conjugado] [base conjugada] = 3,162 x [ácido conjugado] (equação 1)

b2. [tampão] = [ácido conjugado] + [base conjugada] 0,8 = [ácido conjugado] + 3,162 x [ácido conjugado] 0,8 = 4,16 x [ácido conjugado] [ácido conjugado] = 0,192 mol/L b3. Voltando na equação 1: [base conjugada] = 3,16 x [ácido conjugado] [base conjugada] = 3,16 x 0,192 [base conjugada] = 0,608 mol/L

Portanto, as concentrações de NaH2PO4 e de Na2HPO4 na solução tampão são, respectivamente 0,192 mol/l e 0,608 mol/L.

b. Calcular a massa de cada sal necessária para o preparo do volume desejado de tampão (500 mL)

c. para o NaH2PO4: para o Na2HPO4:

0,192 mol ____ 1000 mL tampão 0,608 mol ____ 1000 mL tampão

x ____ 500 mL tampão x ____ 500 mL tampão x = 0,096 mol x = 0,304 mol

1 mol ____ 120 g 1 mol ____ 142 g 0,096 mol ____ Y 0,304 mol ____ y

y = 11,52 g y = 43,17 g

37

d. Preparo da solução: - Pesar os sais de acordo com as quantidades calculadas - Dissolver em béquer, com aproximadamente 400 mL de água destilada

- Medir o pH

- Ajustar o pH se necessário

- Transferir a solução para um frasco volumétrico

- Completar o volume para 500 mL com água destilada

38

PROTEÍNAS I. INTRODUÇÃO

As proteínas são macromoléculas complexas, compostas de aminoácidos, e necessárias para os processos químicos que ocorrem nos organismos vivos. São os constituintes básicos da vida. Tanto que seu nome deriva da palavra grega "proteios", que significa "em primeiro lugar". A importância das proteínas, entretanto, está relacionada com suas funções no organismo, e não com sua quantidade.

Os aminoácidos possuem um átomo de carbono assimétrico, ao qual estão ligados um grupo amino livre, um grupo carboxila livre, um átomo de hidrogênio e uma cadeia lateral. Esta última é diferente para cada aminoácido.

Nas moléculas protéicas, os resíduos de aminoácidos ligam-se

covalentemente, formando longos polímeros não-ramificados. As ligações peptídicas, que unem um aminoácido a outro, são formadas pela reação entre o grupo amino de um aminoácido e o grupo carboxílico do aminoácido subseqüente, eliminando moléculas de água.

Figura 1. Fórmula estrutural geral dos aminoácidos.

Figura 3. Exemplo de peptídeo, formado por cinco aminoácidos.

Figura 2. Reação geral da formação de uma ligação peptídica.

39

II. REAÇÕES PARA AMINOÁCIDOS

As reações orgânicas características dos aminoácidos são aquelas de seus grupamentos funcionais, isto é, os grupos carboxílicos, os grupos amino, e os grupos funcionais presentes nas diversas cadeias laterais. Essas reações permitem, por exemplo, a identificação de aminoácidos nos hidrolisados protéicos, identificação da seqüência de aminoácidos de uma proteína, identificação de aminoácidos essenciais para a atividade de uma enzima.

Uma reação bastante utilizada para verificar a presença de aminoácidos em pequenas amostras é a Reação da Ninidrina, devido à sua elevada sensibilidade.

Princípio da reação da ninidrina: pelo aquecimento, o grupo α-amino

de um aminoácido reage com duas moléculas de ninidrina, produzindo um complexo de cor azul, denominado “Púrpura de Ruhemann”.

A cor azul é obtida na reação da ninidrina para todos os

aminoácidos que apresentam um grupo α-amino livre. Enquanto que a

prolina e a hidroxiprolina, em que o grupo α-amino está substituído, produzem derivados com uma cor amarela característica.

Figura 4. Reação da ninidrina.

III. REAÇÕES PARA IDENTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS

Na literatura, podem ser encontrados vários métodos para

identificação e/ou quantificação de proteínas. Eles são baseados em alguma característica da molécula de proteína, tal como a presença das ligações peptídicas, o conteúdo de aminoácidos aromáticos ou de grupos R fenólicos.

Uma reação bastante utilizada para verificar a presença de proteínas é a Reação do Biureto, devido à sua alta sensibilidade.

Princípio da Reação do Biureto: em meio moderadamente alcalino, os

íons Cu2+ do reagente de Biureto interagem com átomos de nitrogênio das ligações peptídicas das proteínas, formando complexos de cor violeta.

Para a formação do complexo são necessárias quatro ligações peptídicas para cada íon Cu2+, conforme ilustrado na figura abaixo.

Púrpura de Ruhemann

(Complexo azul, formado pela reação

de 2 moléculas de ninidrina com o N)

ninidrina

aminoácido

40

A Reação do Biureto pode ser empregado também para determinar a concentração de proteínas em uma amostra, pois a intensidade da cor é diretamente proporcional à concentração de proteínas.

Figura 5. Esquema da reação do Biureto.

IV. SEPARAÇÃO DE PROTEÍNAS POR PRECIPITAÇÃO

As proteínas consistem em cadeias longas, nas quais os aminoácidos

ocorrem em seqüências lineares específicas para cada tipo de proteína. Os tipos de aminoácidos (polares ou apolares) e as seqüências em que eles se encontram direcionam o enovelamento da cadeia polipeptídica, levando a uma conformação tridimensional específica, que é indispensável para sua função biológica.

Devido às diferenças nessas características estruturais, as proteínas possuem diferentes propriedades físico-químicas, tais como: tamanho, massa molecular, carga elétrica e solubilidade. Essas propriedades, por sua vez, permitem que as proteínas contidas em uma mistura sejam separadas umas das outras.

Um método bastante utilizado para separação de proteínas de uma amostra é a precipitação, que pode ser realizada de diferentes maneiras. Duas delas serão utilizadas nesta aula, e estão descritas a seguir.

IV.A. Precipitação pelos “reagentes de alcalóides” Os reagentes ácidos utilizados para identificação de alcalóides,

uma classe de compostos naturais, tais como: o ácido tricloroacético (TCA), combinam-se com partes positivas de proteínas, formando complexos insolúveis, que precipitam na solução. Esses reagentes também têm ação desnaturante, ou seja, provocam a perda da conformação tridimensional da proteína de forma irreversível. Conseqüentemente, a proteína separada por esse método perde a sua função.

Esse método é bastante utilizado para remover proteínas de amostras de soro, plasma e leite, quando se deseja analisar a presença de minerais, tais como cálcio e magnésio, ou a contaminação por metais pesados, tais como chumbo e níquel.

41

IV.B. Precipitação fracionada por soluções salinas concentradas

Os sais neutros têm efeitos pronunciados na solubilidade das

proteínas globulares, podendo tanto aumentar quanto diminuir a solubilidade da proteína na solução. A capacidade desses sais de influenciar a solubilidade das proteínas é uma função de sua força iônica, que depende tanto de sua concentração como do número de cargas elétricas dos cátions e ânions que formam o sal.

Entretanto, o efeito do aumento ou da redução da força iônica na solubilidade pode ser diferente para cada tipo de proteína, o que permite que elas sejam separadas de uma mistura apenas variando-se a concentração de sal na solução. SALTING-IN

Em concentrações reduzidas, os sais aumentam a solubilidade de muitas proteínas, um fenômeno denominado solubilização por salificação ou "salting-in".

Os sais de íons divalentes, tais como MgCl2 e o (NH4)2SO4, são mais eficientes na solubilização por salificação do que os sais de íons monovalentes como NaCl e KCl.

Os efeitos da salificação na solubilidade são ocasionados por alterações na tendência à ionização dos grupos R (cadeias laterais dos aminoácidos) dissociáveis da proteína.

SALTING-OUT

Por outro lado, à medida que a concentração do sal é aumentada, a solubilidade da proteína se reduz gradativamente. Em forças iônicas suficientemente elevadas, uma proteína pode ser quase completamente precipitada de sua solução, um efeito denominado precipitação por salificação ou “salting – out”.

Um dos fatores é que a concentração elevada de sais pode remover a água de hidratação das moléculas de proteína, reduzindo, dessa maneira, sua solubilidade; porém outros fatores podem estar envolvidos.

Os precipitados protéicos resultantes da precipitação por salificação mantêm sua conformação nativa e podem ser dissolvidos novamente, em geral sem haver desnaturação. Conseqüentemente, a função da proteína pode ser recuperada após o término do processo e remoção do sal.

Tabela 1. Perfil de precipitação das proteínas plasmáticas em função da concentração de (NH4)2SO4.

Fração

Eletroforética % de saturação de (NH4)2SO4

para precipitação Albuminas 100

α1- globulinas 46

α2- globulinas 46

β- globulinas 40

γ- globulinas 33

Fibrinogênio 20

42

GLICÍDEOS

I.INTRODUÇÃO Os carboidratos, ou sacarídeos, são mais simplesmente definidos como poliidroxialdeídos ou cetonas e seus derivados. Muitos possuem a fórmula empírica [CH2O]n, que originalmente sugere “hidratos” de carbono.

Os monossacarídeos, também chamados de açúcares simples, consistem numa só unidade poliidroxialdeídica ou cetônica, de fórmula empírica [CH2O]n, onde n = 3 ou um número maior. O esqueleto de carbono dos monossacarídeos comuns é não-ramificado e cada átomo de carbono, exceto um, possui um grupo hidroxílico no átomo de carbono remanescente, há um oxigênio carbonílico. Se o grupo carbonílico estiver na extremidade da cadeia, o monossacarídeo é um aldeído derivado, denominado aldose; se estiver em qualquer outra posição, o monossacarídeo é uma cetona derivada, denominada cetose. (figura 1).

Figura 1. Exemplos de aldose (D-glucose) e cetose (D-frutose) com seis átomos de carbono, mostradas em fórmulas estruturais de cadeia aberta.

A partir de várias considerações químicas, deduziu-se que os

monossacarídeos (aldoses e cetoses) com cinco ou mais átomos de carbono não são estruturas de cadeia aberta, mas estruturas cíclicas. No caso da D-glucose, formam-se estruturas cíclicas de seis elementos, pela reação do grupo hidroxílico alcoólico do átomo de carbono 5 com o átomo de carbono aldeídico 1, conforme ilustrado na figura 2.

As formas isoméricas dos monossacarídeos, que diferem entre si apenas na configuração ao redor do átomo de carbono carbonílico, são denominadas anômeras ou anoméricas, e o átomo de carbono carbonílico é denominado carbono anomérico.

O monossacarídeo mais abundante é o açúcar de seis carbonos D-glucose, de onde muitos outros são derivados. A D-glucose é o principal combustível para a maioria dos organismos, e faz parte da composição de dissacarídeos comuns, como maltose, lactose e sacarose, e de polissacarídeos abundantes na natureza, tais como o amido e a celulose.

As unidades de monossacarídeos são unidas por ligações glicosídicas, as quais são formadas pela reação do carbono anomérico de um monossacarídeo com um grupamento hidroxílico de outro monossacarídeo (figura 3). Dessa forma, os dissacarídeos consistem em dois monossacarídeos unidos por uma ligação glicosídica, e os oligossacarídeos e polissacarídeos são cadeias de monossacarídeos unidos por ligações glicosídicas.

D-glucose D-frutose

43

Figura 2. Reação de ciclização da molécula de glucose, produzindo as formas anoméricas α e β. A reação envolve o grupo hidroxila ligado ao carbono 5 e o átomo de carbono carbonílico 1, formando moléculas cíclicas com 6 átomos de carbono.

Figura 3. Exemplo da formação de uma ligação glicosídica entre duas moléculas de glucose, produzindo maltose. A ligação glicosídica é formada pela reação do carbono anomérico de um monossacarídeo com um grupamento hidroxílico de outro monossacarídeo.

carbono carbonílico

carbono anomérico

carbono anomérico

α - D -glucopiranose β- D -glucopiranose

D -glucose

carbono carbonílico

carbono anomérico

carbono anomérico

α - -glucopiranose β- D -glucopiranose

D -glucose

carbono carbonílico

carbono anomérico

carbono anomérico

α - D-glucopiranose β- -glucopiranose

D-glucose

álcool

α - D - glucopiranosil -(1 4)- D - glucopiranose

condensaçãohidrólise

hemiacetal acetal

hemiacetal

álcool

α - D - glucopiranosil -(1 4)- D - glucopiranose

condensaçãohidrólise

hemiacetal acetal

hemiacetal

álcool

α - D- glucopiranosil -(1 4) - D - glucopiranose

condensaçãohidrólise

hemiacetal acetal

hemiacetal

44

II. PARTE EXPERIMENTAL II.A. Preparação da solução de amido O amido é encontrado nas células de vegetais (grãos, frutas e tubérculos) na forma de grânulos de grão. Com o aquecimento em água, os grânulos são rompidos, liberando o amido. Este, por sua vez, sofre intensa hidratação, e a solução adquire aspecto transparente ou translúcido, e torna-se levemente viscosa.

II.B. Pesquisa de amido na solução preparada

Na maioria dos vegetais, o amido é a principal forma de armazenamento de combustível. Ele é constituído de dois componentes principais: amilose e amilopectina (geralmente na proporção de 1:3). A amilose é um polímero de glicose sem ramificações, no qual todas as

unidades de D-glucose estão ligadas por ligações α(1→4). Já a amilopectina é um polímero de glicose muito ramificado, no qual as

ligações do esqueleto glicosídico são do tipo α(1→4), mas os pontos de ramificação são ligações α(1→6); possui uma massa molecular cerca de 20 vezes maior que a amilose.

O glicogênio é o principal polissacarídeo de reserva das células animais, assim como o amido o é nas células vegetais. Semelhante à amilopectina, o glicogênio é um polissacarídeo de D-glucose em ligação

α(1→4). Contudo, é uma molécula mais altamente ramificada e mais compacta do que a amilopectina; as ramificações ocorrem após oito a doze

resíduos de glicose. Nas ramificações, as ligações são α(1→6). Tanto no amido como no glicogênio, a cadeia polissacarídica assume

a forma helicoidal, em decorrência do grande número de unidades de

glucose ligadas por ligações do tipo α(1→4). Devido a essa característica estrutural, ambos os polissacarídeos formam complexos de coordenação com o iodeto, presente na solução de lugol.

Entretanto, a cor do complexo formado geralmente é azul para o amido e avermelhada para o glicogênio. A cor varia de acordo com a quantidade de polissacarídeo que assume, quando em solução, a conformação de hélice.

Quando se aquece a solução de amido, a estrutura helicoidal se

desfaz, conseqüentemente, não é mais possível a formação do complexo entre o amido e o iodeto. Ao resfriar a solução, o amido recupera a sua forma helicoidal.

amido + lugol Complexo azul

glicogênio + lugol Complexo avermelhado

amido + lugol Complexo azul

glicogênio + lugol Complexo avermelhado

45

II.C. Obtenção de glicose a partir da solução de amido preparada

O aquecimento de uma solução de amido com ácidos fortes provoca a quebra das ligações glicosídicas, liberando unidades de monossacarídeos. De modo semelhante ao que se observa para uma reação enzimática, a hidrólise química do amido ocorre de forma gradual, ou seja, a quantidade de substrato (amido) degradado depende do tempo de reação.

II.D. Caracterização química dos glicídeos

II.D.1. Reação com alfa-naftol (Teste de Molisch)

Há um grande número de reações colorimétricas para caracterização de carboidratos. A maioria delas emprega soluções de ácidos fortes, que hidrolisa os polissacarídeos, produzindo monossacarídeos, e causam a desidratação dos açúcares, produzindo furfurais. Esses furfurais são aldeídos derivados do furano, que têm a capacidade de reagir com fenóis,

como orcinol e α-naftol, produzindo compostos coloridos característicos. Assim, essa reação detecta a presença de açúcares de um modo geral, sejam eles monossacarídeos, dissacarídeos ou polissacarídeos.

- 3H2O

+ H2SO4

H- 3H2O

+ H2SO4

H

CH HC

CHOH

C

CHOHOH2C

OHHO

H

OH

HEXOSE

CH HC

CHOH

C

CHOHOH2C

OHHO

H

OH

HEXOSE

OOH2C C

H

O - 2 H2O

+ H2SO4+ α-naftol

HIDROXIMETILFURFURAL

OOH2C C

H

O - 2 H2O

+ H2SO4+ α-naftol

HIDROXIMETILFURFURAL

O

C

SO3H

OH

HO3S

OHOH2C

+

COMPOSTO COLORIDO

O

C

SO3H

OH

HO3S

OHOH2C

+

COMPOSTO COLORIDO

Amido

H+

Calor

n GlicoseAmido

H+

Calor

n Glicosen glucose

I 3I 3I 3I 3

LUGOL

amido + iodeto( azul )

Amido( incolor )

I3I3I3I3I3I3I3I3

AQUECER

amido( incolor )

amido + iodeto( azul )

RESFRIARI3I3I3I3I3

-I3I3I3I3I3

-I 3I 3I 3I 3I 3I 3I 3I 3

LUGOL

amido + iodeto( azul )

Amido( incolor )

I3I3I3I3I3I3I3I3

I3I3I3I3I3I3I3I3

AQUECER

amido( incolor )

amido + iodeto( azul )

RESFRIARI3I3I3I3I3I3I3I3I3

-I3I3I3I3I3

-I3I3I3I3I3I3I3I3I3

-

46

II.D.2. Pesquisa de sacarídeos redutores (Reação de Benedict) Os sacarídeos cujo grupo hidroxila ligado ao carbono anomérico está

livre (ou seja, não está envolvido em ligações químicas), possuem a capacidade de reduzir íons metálicos, tais com: Cu2+, Ag+ ou ferricianeto, em meio alcalino. Os açúcares capazes de reduzir tais agentes são denominados açúcares redutores. De modo geral, os monossacarídeos são açúcares redutores, enquanto que os sacarídeos de cadeia maior nem sempre apresentam essa propriedade. O dissacarídeo lactose é encontrado no leite, não tendo outra ocorrência na natureza e sua hidrólise produz galactose e glucose. A lactose é um dissacarídeo redutor, uma vez que possui um carbono anomérico livre na unidade de glucose.

A sacarose, ou açúcar de cana, é um dissacarídeo de glucose e frutose, sendo extremamente abundante no reino vegetal e é conhecida como açúcar de mesa. Em contraste com a maioria dos dissacarídeos e oligossacarídeos, a sacarose não possui átomos de carbono anomérico livres, uma vez que os átomos de carbono anoméricos de ambos os monossacarídeos estão ligados entre si e não podem sofrer oxidação. Por esta razão, a sacarose não age como açúcar redutor.

O amido e a sacarose são açúcares não-redutores, cujas ligações

glicosídicas são hidrolisadas pelo tratamento com ácidos fortes à quente, produzindo monossacarídeos. Estes produtos, por sua vez, são açúcares redutores, pois possuem uma hidroxila livre no carbono anomérico. A comprovação da hidrólise ácida do amido e da sacarose se dá pela positividade da reação de Benedict.

amidoH+

calorglucose

sacarose glucose + frutoseH+

calor

amidoH+

calorglucose

sacarose glucose + frutoseH+

calor

lactose

sacarose

glucose

frutose

Carbono anoméricoGrupamento redutor

lactoselactose

sacarosesacarose

glucoseglucose

frutosefrutose

Carbono anoméricoGrupamento redutor Carbono anoméricoGrupamento redutor

47

REAÇÃO DE BENEDICT A ação redutora de açúcares em meio alcalino é bastante utilizada

para a determinação quantitativa e qualitativa de açúcares. Nesta aula, utilizaremos o Reagente de Benedict, que contém íons Cu2+ ligados a agentes complexantes, em meio alcalino.

Com o aquecimento do açúcar com grupamento redutor, em presença dos íons Cu2+ e OH-, o Cu2+ é reduzido a Cu+ e o açúcar é oxidado, e ocorre a formação de precipitados de Cu2O (óxido cuproso). A cor do precipitado depende do conteúdo de açúcar redutor.

Precipitado esverdeado -------- traços Precipitado amarelado --------- 10 g/L Precipitado vermelho -----------20 g/L

OH- Cu++ + açúcar redutor →→→→ Cu2O + açúcar oxidado ∆∆∆∆

48

LIPÍDEOS I.INTRODUÇÃO Lipídeos são biomoléculas orgânicas insolúveis na água que podem ser extraídas de células e tecidos por solventes não polares, como, por exemplo, clorofórmio, éter ou benzeno. Podem ser de origem animal ou vegetal e possuem importantes funções biológicas. Eles são componentes estruturais de membranas, atuam como forma de armazenamento e transporte de combustível metabólico. São precursores para biossíntese de algumas vitaminas, hormônios e mediadores inflamatórios, funcionam como isolante térmico em animais como a foca. A classificação dos lipídeos pode ser baseada na estrutura de seus esqueletos. Os lipídeos simples não contêm ácidos graxos (ex: esteróides, prostaglandinas) enquanto que os lipídeos complexos são constituídos de ácidos graxos e diferem na estrutura dos esqueletos aos quais esses ácidos estão covalentemente ligados. Por exemplo:

• Triacilgliceróis ou triglicerídeos: ácidos graxos ligados ao glicerol, na forma de éster.

• Fosfolipídeos ou Fosfoglicerídeos: ácidos graxos ligados ao glicerol-3-fosfato, com diferentes grupos ligados ao grupo fosfato. Os diferentes tipos de fosfolipídeos são denominados de acordo com o grupo ligado à sua cabeça polar. Ex: cardiolipina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol.

• Ceras: ácidos graxos ligados a álcoois de cadeia longa, na forma de éster.

• Esfingolipídeos: ácidos graxos de cadeia longa ligados a esfingosina (aminoálcool de cadeia longa). Ex:esfingomielina, cerebrosídeos.

II. ÁCIDOS GRAXOS

Os ácidos graxos possuem uma longa cadeia hidrocarbonada (cauda apolar) e um grupo carboxílico terminal (cabeça polar) (figura 1). Eles ocorrem apenas em pequenas quantidades na forma livre; a quase totalidade dos ácidos graxos encontra-se ligada a diferentes compostos, geralmente na forma de ésteres, conforme citado acima (figura 2).

A cadeia hidrocarbonada pode ser saturada, isto é, com átomos de carbono unidos apenas por ligações simples; ou insaturada contendo uma ou mais ligações duplas ou triplas. Os ácidos graxos diferem um do outro primariamente no comprimento da cadeia e no número e posição de suas ligações insaturadas.

49

O número relativo de ligações duplas em uma dada amostra de ácidos

graxos ou lipídeos pode ser determinado empregando-se compostos halogenados, como iodo, cloro e bromo. Esses halogênios adicionam-se às duplas ligações, sendo que a cada lado da dupla ligação se adiciona um átomo de halogênio. A quantidade de halogênio absorvido é, portanto, proporcional ao número total de duplas ligações. Quando se empregam soluções de iodo em clorofórmio, observa-se que quanto maior o grau de insaturação do lipídeo, mais rápido ocorre o desaparecimento da cor da solução (figura 3).

Figura 3. Reação de adição de iodo em duplas ligações de ácidos graxos insaturados.

Figura 1.Estrutura simplificada de ácidos graxos livres, saturados e insaturados.

Figura 2. Fórmula estrutural e representação simplificada da estrutura de um triacilglicerol.

Grupo carboxílico

(cabeça polar)

Cadeia hidrocarbonada

(cauda apolar)

insaturação

ácido graxo saturado

ácido graxo insaturado

Grupo carboxílico

(cabeça polar)

Cadeia hidrocarbonada

(cauda apolar)

insaturação

ácido graxo saturado

ácido graxo insaturado

+ I2R CH2 CH CH CH2 C

O

OHR CH2 CH

OH

O

CCH2CH

I

I

+ I2R CH2 CH CH CH2 C

O

OHR CH2 CH

OH

O

CCH2CH

I

I

CH2 O C R1

O

CH2 O C R3

O

CH O C R2

OCH2 O C R1

O

CH2 O C R3

O

CH O C R2

O

50

III. PROPRIEDADES GERAIS III.A. Solubilidade

Os glicerídeos de ácidos graxos inferiores (menores), como o ácido butírico, são ligeiramente solúveis em água, enquanto os de ácidos graxos superiores são insolúveis. Todos são solúveis em éter, clorofórmio e benzeno. São pouco solúveis em etanol a frio, mas a solubilidade aumenta muito em etanol quente.

Os lipídeos, por definição, são moléculas de baixa polaridade, portanto praticamente insolúveis em solventes polares, como a água. Desse modo, a ordem de solubilidade esperada para o óleo vegetal é: éter> álcool > água. III.B. Saponificação Os ácidos graxos complexos são também denominados “lipídeos saponificáveis”, uma vez que produzem sabões, sais de ácidos graxos, sob hidrólise alcalina.

Os triglicerídeos, ácidos graxos esterificados com glicerol, decompõem-se facilmente em glicerol e sais de ácido graxo (sabões) por ebulição em bases fortes como NaOH ou KOH. Como os lipídeos são insolúveis em água, o processo é facilitado adicionando-se solução alcoólica da base. Ao acidificar o meio de reação, o sal de ácido graxo, que é solúvel em água, é convertido em ácido graxo. Este, por sua vez, não é solúvel em água, e separa-se do meio de reação. Além disso, o ácido graxo fica na superfície da solução, pois é menos denso que a água, e o glicerol permanece dissolvido na fase aquosa, devido à sua natureza polar.

O ácido graxo separado pode novamente ser convertido em sabão, pela adição de uma base forte e sob aquecimento. Por esta razão, ao se agitar o tubo contendo água quente, solução de NaOH 1 mol/L e o ácido graxo (insolúvel), ocorre formação de espuma, que é indicativa da presença do sabão. III.C. Propriedades dos sabões

Os sabões de metais alcalinos particularmente de Na e K são solúveis em água. Os sabões de massa molecular mais alto são menos solúveis. Os de Ca2+ e Mg2+ são muito insolúveis em água e precipitam. Os sais de Pb dos ácidos graxos saturados possuem solubilidade limitada em água enquanto que os dos ácidos graxos insaturados são muito mais solúveis (Isto pode servir para separar ácidos graxos saturados de ácidos graxos insaturados).

Quando acrescentamos solução saturada de cloreto de sódio no sabão, este precipita o sabão por seqüestrar a água que envolve as moléculas deste, de modo semelhante ao fenômeno de precipitação de proteínas por solução saturada de sulfato de amônio. Os detergentes são estáveis em água dura (com Ca2+ e Mg2+) bem como em soluções ácidas, o que não ocorre com o sabão.

R-COOH + 2H2 → RCH2OH + H2O

↓ R-CH2-O-SO2ONa

51

HO C R 2

O

HO C R 3

O

HO C R 1

O

ÁCIDOS GRAXOS(insolúveis em água)

KCl

CH2 OH

CH2 OH

OHCH

K+O

-C R 1

O

K+O

-C R 3

O

K+O

-C R 2

O

TRIGLICERÍDEO

+

GLICEROL SABÃO(sais de ácidos graxos)

CH2 OH

CH2 OH

OHCH

Na+O

-C R 1

O

Na+O

-C R 3

O

Na+O

-C R2

O

HCl

∆

+

GLICEROL(solúvel em água)

SABÃO(sais de ácidos graxos)

NaOH

∆

KOH

∆

+

CH2 O C R1

O

CH2 O C R3

O

CH O C R2

O

SAPONIFICAÇÃO

SEPARAÇÃO DOS

ÁCIDOS GRAXOS

REDISSOLUÇÃO DOS

ÁCIDOS GRAXOS

HO C R 2

O

HO C R 3

O

HO C R 1

O

ÁCIDOS GRAXOS(insolúveis em água)

KCl

CH2 OH

CH2 OH

OHCH

K+O

-C R 1

O

K+O

-C R 3

O

K+O

-C R 2

O

TRIGLICERÍDEO

+

GLICEROL SABÃO(sais de ácidos graxos)

CH2 OH

CH2 OH

OHCH

Na+O

-C R 1

O

Na+O

-C R 3

O

Na+O

-C R2

O

HCl

∆

+

GLICEROL(solúvel em água)

SABÃO(sais de ácidos graxos)

NaOH

∆

KOH

∆

+

CH2 O C R1

O

CH2 O C R3

O

CH O C R2

O

SAPONIFICAÇÃO

SEPARAÇÃO DOS

ÁCIDOS GRAXOS

REDISSOLUÇÃO DOS

ÁCIDOS GRAXOS

HO C R 2

O

HO C R 3

O

HO C R 1

O

HO C R 2

O

HO C R 3

O

HO C R 1

O

ÁCIDOS GRAXOS(insolúveis em água)

KCl

CH2 OH

CH2 OH

OHCH

CH2 OH

CH2 OH

OHCH

K+O

-C R 1

O

K+O

-C R 3

O

K+O

-C R 2

O

K+O

-C R 1

O

K+O

-C R 3

O

K+O

-C R 2

O

TRIGLICERÍDEO

+

GLICEROL SABÃO(sais de ácidos graxos)

CH2 OH

CH2 OH

OHCH

CH2 OH

CH2 OH

OHCH

Na+O

-C R 1

O

Na+O

-C R 3

O

Na+O

-C R2

O

Na+O

-C R 1

O

Na+O

-C R 3

O

Na+O

-C R2

O

HCl

∆

+

GLICEROL(solúvel em água)

SABÃO(sais de ácidos graxos)

NaOH

∆

KOH

∆

+

CH2 O C R1

O

CH2 O C R3

O

CH O C R2

O

CH2 O C R1

O

CH2 O C R3

O

CH O C R2

O

SAPONIFICAÇÃO SAPONIFICAÇÃO

SEPARAÇÃO DOS

ÁCIDOS GRAXOS

SEPARAÇÃO DOS

ÁCIDOS GRAXOS

REDISSOLUÇÃO DOS

ÁCIDOS GRAXOS

REDISSOLUÇÃO DOS

ÁCIDOS GRAXOS

52

SALIVA

I.INTRODUÇÃO

A saliva refere-se a mistura de secreções presentes na cavidade bucal, e consiste de fluidos derivados das glândulas salivares principais: parótida, submandibular e sublingual, das glândulas salivares acessórias da mucosa bucal e resíduos do exsudato gengival. Este último não é uma secreção glandular sendo, portanto, proposto o termo "fluido bucal", que é mais abrangente, em substituição a saliva.

Este fluido é constituído de cerca de 99% de água, sendo que o restante constitui-se de diversos compostos orgânicos e eletrólitos (tabela 1). As principais funções da saliva estão listadas na tabela 2.

Tabela 1. Principais constituintes da saliva.

Componentes Componentes Orgânicos mg/mL Inorgânicos mg %

Proteínas 2,8 – 3,0 Cl- 0,5 Açúcares 0,009 H2PO4

- 50 Uréia 0,13 – 0,22 HPO4

2- 30 Aminoácidos 0,0005 SO4

- 10 Lactato 0,0214 S2- 9 Lipídeos traços F- 0,2 Mucinas traços HCO3

-(CO2) 90-180 Ca++ 3-7 NH3+ 10 Na+ 78 K+ 98 Mg++ 0,5

Tabela 2. Principais funções da saliva.

Função Mecanismos envolvidos

Lubrificação Lubrificação da cavidade oral. Facilitando a fala, mastigação e deglutição dos alimentos.

Prevenção de cáries dentárias

Promove o clearance oral. Tamponamento de ácidos. Veículo para transporte de fluoreto e minerais para a superfície dental, participando do processo de remineralização. Proteínas salivares previnem a precipitação de íons cálcio, presentes em alta concentração na saliva.

Prevenção de infecções orais

Presença de imunoglobulinas, lactoferrina, lisozima, aglutininas e peroxidases, que têm propriedades antibacterianas.

Sensação gustativa

Sólidos são solubilizados na saliva e transportados para as papilas gustativas.

Digestão Atividade da amilase salivar inicia digestão do amido. Hidrólise da sacarose pela invertase.

53

II. ESTUDO DA ATIVIDADE DA AMILASE SALIVAR Dentre as diversas funções citadas na tabela 2, nesta aula será

estudada a atividade da amilase salivar na digestão do amido. A amilase salivar é uma alfa-amilase, a qual catalisa a hidrólise

das ligações alfa-1,4-glicosídicas do amido, de forma casual, produzindo uma mistura de glucose e maltose. De forma diversa das proteínas ricas em prolina, a amilase não tem alta afinidade pela superfície dentária. A finalidade desta enzima parece ser estritamente a catálise da digestão do amido. Na maior parte das vezes, o contato do alimento com a amilase se dá por breve espaço de tempo. No entanto, esta enzima está em alta concentração na saliva, tornando provável que ao menos uma parte do amido seja digerida na cavidade bucal.

II.A. Fatores que influenciam na atividade enzimática A parte da enzimologia que estuda a velocidade das reações

enzimáticas, e os fatores que influenciam nesta velocidade é denominada cinética enzimática. A cinética de uma reação catalisada por enzima é estudada avaliando-se a quantidade de produto formado ou a quantidade de substrato consumido por unidade de tempo de reação.

Nesta aula, a atividade da amilase salivar será monitorada pela medida do consumo do substrato (amido). O amido será detectado através da reação com solução de lugol, que se baseia na formação de um complexo azul, resultante da interação entre o iodeto (presente na solução de lugol) e a estrutura helicoidal do amido.

I3I3I3I3

I3I3I3I3

amido

amilase

maltose glicose

+

SUBSTRATO ENZIMA PRODUTOS

LUGOL

Complexo de cor azul(amido + iodeto)

monossacarídeos unidos

por ligações α-1,4

pontos de ramificação

(ligações α-1,6)

Estrutura do amido:

+

I3I3I3I3I3I3I3I3

I3I3I3I3

amido

amilase

maltose glicose

+

SUBSTRATO ENZIMA PRODUTOS

LUGOL

Complexo de cor azul(amido + iodeto)

monossacarídeos unidos

por ligações α-1,4

pontos de ramificação

(ligações α-1,6)

Estrutura do amido:

monossacarídeos unidos

por ligações α-1,4

monossacarídeos unidos

por ligações α-1,4

pontos de ramificação

(ligações α-1,6)

pontos de ramificação

(ligações α-1,6)

Estrutura do amido:

+

glucose

54

De modo geral, a atividade de uma enzima, expressa pela velocidade

de atuação da enzima sobre um determinado substrato, pode ser influenciada por diversos fatores, tais como: temperatura, pH, concentração de substrato, concentração de enzima, presença de cofatores e/ou coenzimas, presença de inibidores, concentração do(s) produto(s) da reação e tempo de reação. Alguns deles serão estudados nesta aula.

Esses fatores podem ser ajustados experimentalmente, de modo que se obtenham as condições ótimas para atuação da enzima. Uma condição ótima (de pH, temperatura, concentração de substrato, etc.) é aquela em que a enzima atua com maior velocidade, ou seja, consome a maior quantidade de substrato (ou forma a maior quantidade de produto) por unidade de tempo.

II.A.1. pH A maioria das enzimas apresenta um pH característico em que a sua

atividade é máxima, denominado pH ótimo, Acima ou abaixo desse pH, a atividade se reduz. Ainda que os perfis de atividade em função do pH de muitas enzimas tenham a forma em sino, eles podem variar consideravelmente em forma.

A inter-relação da atividade enzimática com o pH para qualquer enzima depende do comportamento ácido-básico da enzima e do substrato, bem como de outros fatores que são difíceis de analisar quantitativamente. Sabe-se que o pH afeta o estado de ionização dos resíduos de aminoácidos das proteínas, levando a alterações na distribuição de cargas elétricas e grupamentos químicos da molécula da enzima, em especial do sítio catalítico e também na conformação tridimensional da proteína. Essas alterações podem prejudicar a interação entre o sítio ativo e o substrato, diminuindo a velocidade de atuação da enzima. Em valores extremos de pH, há ainda a possibilidade de ocorrer desnaturação da enzima.

O pH ótimo de uma enzima não é necessariamente idêntico ao pH de seu meio intracelular normal, que pode estar situado na parte ascendente ou descendente do seu perfil de atividade em função do pH. Isso sugere que a inter-relação pH-atividade enzimática pode ser um fator de controle intracelular da atividade enzimática. II.A.2. Temperatura Tal como ocorre para a maioria das reações químicas, a velocidade das reações catalisadas por enzimas aumenta geralmente com a temperatura, dentro de certa faixa de temperatura na qual a enzima é estável e mantém atividade integral, até que se atinja a temperatura ótima. A partir dessa temperatura, a atividade enzimática diminui à medida que a temperatura é elevada, uma vez que as enzimas são desnaturadas pelo calor. Entretanto, uma vez que a desnaturação é um processo dependente do tempo, o formato do gráfico de atividade enzimática X temperatura dependerá da quantidade de tempo que a enzima foi mantida em determinada temperatura. II.A.3. Concentração de substrato

A formação e ruptura de ligações químicas por uma enzima são precedidas pela formação de um complexo enzima-substrato. Em concentração constante da enzima, a velocidade de reação aumenta com o aumento da concentração de substrato até que a velocidade máxima é alcançada. Em concentração de substrato suficientemente alta, os centros catalíticos estão cheios e assim a velocidade da reação alcança um máximo.

55

II.A.4. Concentração de enzima Dentro de limites bastante amplos, a velocidade de uma reação enzimática é proporcional à concentração de enzima. Este princípio pode ser aplicado a uma grande variedade de enzimas, desde que não haja interferentes na reação e a concentração de substrato seja mantida constante. II.A.5. Presença dos cofatores e/ou coenzimas

Algumas enzimas não requerem nenhum grupo químico, além de seus resíduos de aminoácidos para sua ação outras requerem um componente químico adicional chamado de cofator, os quais são íons inorgânicos como: Fe2+, Mg2+, Mn2+ ou Zn2+, Cl-; chamado de coenzima se for uma molécula orgânica complexa ou uma molécula metalorgânica. Algumas enzimas requerem ambos a coenzima e o cofator para sua atividade.

Quadro 1. Exemplos da influência de diferentes fatores na atividade da amilase salivar. A: pH. B: temperatura. C: concentração de substrato. D: concentração de enzima. E: presença do cofator.

0 2 4 6 8 10

pH

Ati

vid

ad

e E

nzi

máti

ca

Rela

tiva

0 10 20 30 40 50 60 70

temperatura (ºC)

Ati

vid

ad

e E

nzim

áti

ca

Rela

tiva

Concentração de Substrato

Ati

vid

ad

e E

nzi

máti

ca

Rela

tiva

Concentração da Enzima

Ati

vid

ad

e E

nzi

máti

ca

Rela

tiva

Sem NaCl

Com NaCl

Tempo

Ati

vid

ad

e E

nzi

máti

ca

Rela

tiva

A B C

D E

0 2 4 6 8 10

pH

Ati

vid

ad

e E

nzi

máti

ca

Rela

tiva

0 10 20 30 40 50 60 70

temperatura (ºC)

Ati

vid

ad

e E

nzim

áti

ca

Rela

tiva

Concentração de Substrato

Ati

vid

ad

e E

nzi

máti

ca

Rela

tiva

Concentração da Enzima

Ati

vid

ad

e E

nzi

máti

ca

Rela

tiva

Sem NaCl

Com NaCl

Tempo

Ati

vid

ad

e E

nzi

máti

ca

Rela

tiva

A B C

D E

56

BIBLIOGRAFIA ARANHA, F.L. Bioquímica odontológica. Sarvier Editora de Livros Médicos Ltda., 1a edição, São Paulo, SP, 1996. EDGAR, W.M.; O’MULLANE, D.M. Saliva and dental health. British Dental Association, 1a edição, Londres, 1990. KRETCHMER, N. e HOLLEMBECK, C.B. Sugar and sweetenss. CRC Press, Londres, 1991. LEHNINGER, A. Princípios de bioquímica. 3a edição – Ed. Sarvier, 2002. LEHNINGER, A.L. Principles of Biochemistry. 4a.edição – Ed. W H Freeman, 2005, NY USA NEWBRUM, E. Cariologia. Livraria Editora Santos – 2a Edição Americana, 1988. PINTO, V.G. Saúde bucal coletiva. Santos Livraria Editora, 4a edição, São Paulo, SP, 2000. STRYER, L. Biochemistry. 5a Quinta Edição, W.H. Freeman and Company, 1995, New York, USA.