Apostila Biotecnologia-fundamentos

7/22/2019 Apostila Biotecnologia-fundamentos

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Edies BIBLIOTECA MAX FEFFERdo INSTITUTO DE TECNOLOGIA ORT do Rio de JaneiroRua Dona Mariana 213 Rio de Janeiro, 22280-020 RJ-BrasilTel.:(5521) 2539-1842; FAX: (5521) 2286-9174

Copyright2004 by Maria Antonia Malajovich

Texto atualizado em 2009


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MARIA ANTONIA MALAJOVICH

BIOTECNOLOGIAPRIMEIRA PARTE: OS FUNDAMENTOS

SUMRIO

CAPTULO 1. O QUE BIOTECNOLOGIA?A BIOTECNOLOGIA TRADICIONALA BIOTECNOLOGIA MODERNAAS DEFINIES DE BIOTECNOLOGIAO IMPACTO DA BIOTECNOLOGIABIOTECNOLOGIA E DESENVOLVIMENTOCRONOLOGIA DE ALGUNS ACONTECIMENTOS MARCANTESNA HISTRIA DA BIOTECNOLOGIA

Pg. 1

CAPTULO 2. AS CLULAS E OS CROMOSSOMOSA CLULA COMO UNIDADE DOS SERES VIVOS

Unidade estruturalUnidade funcionalRelao entre as estruturas celulares e sua funo

Tcnicas laboratoriaisToda clula deriva de outra preexistente

OS CROMOSSOMOSA TEORIA CROMOSSMICA DA HEREDITARIEDADEAS CLULAS E OS CROMOSSOMOS COMO AGENTES BIOLGICOS

Pg. 9

CAPTULO 3. OS MICRORGANISMOSA DIVERSIDADE MICROBIANA

As eubactriasAs arqueasOs protistasOs fungosOs vrus, na fronteira do vivo e do no vivo

AS TCNICAS MICROBIOLGICASBIOSSEGURANA E BIOSSEGURIDADEOS MICRORGANISMOS COMO AGENTES BIOLGICOS

Pg. 21

CAPTULO 4. AS ENZIMAS E OS ANTICORPOSAS PROTENAS

EstruturaAs bases de algumas tcnicas laboratoriais (Cromatografia,eletroforese, espectrometria de massa)

AS ENZIMASA catlise enzimticaOs diversos tipos de enzimasImportncia econmica

OS ANTICORPOSA molcula de anticorpoA produo de anticorpos no organismo

A produo de anticorpos no laboratrioA utilizao dos anticorpos

Pg. 31

CAPTULO 5. OS CIDOS NUCLEICOS E OS GENESOS CIDOS NUCLEICOS

A DUPLA HLICEO CDIGO GENTICOA AO GNICA

A REGULAO DA AO GNICA

Clulas procariticas

Clulas eucariticasA GENMICA

O genoma humanoA genmica brasileira

Pg. 43


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CAPTULO 6: OS PROCESSOS FERMENTATIVOSOS PROCESSOS FERMENTATIVOS E A INDSTRIA

OS MICRORGANISMOS INDUSTRIAISNoes sobre o metabolismoAs linhagens industriais

A ESCOLHA DA MATRIA-PRIMAOS PROCESSOS TRADICIONAISOS PROCESSOS SUBMERSOS

Os fermentadores ou biorreatoresA mudana de escalaA conduo do processoA recuperao do produto

OS BIOPROCESSOS NA INDSTRIA DE BIOFERTILIZANTES

Pg. 53

CAPTULO 7: A CULTURA DE CLULAS E TECIDOSA MICROPROPAGAO DE PLANTAS

As etapasOs meios de culturaAs diferentes modalidadesMelhoramento econservao da biodiversidade vegetalA difuso da tecnologia

A CULTURA DE CLULAS ANIMAISA manipulao in vitrodas clulas animaisAs aplicaes da cultura in vitrode clulas de mamferos

Pg. 63

CAPTULO 8: A TECNOLOGIA DO DNAAS FERRAMENTAS DISPONVEISAS NUCLEASES OU ENZIMAS DE RESTRIOA ELETROFORESE DO DNA

Hibridizao e sondas gnicasA tcnica de Southern

O fingerprintA SNTESE E AMPLIFICAO DE DNASntese de oligonucleotdeosSntese de cDNAA reao em cadeia da polimerase

O SEQUENCIAMENTO DO DNAOSARRAYS

Pg. 73

CAPTULO 9: A ENGENHARIA GENTICAO NASCIMENTO DA BIOTECNOLOGIA MODERNA

As primeiras experinciasMitos e realidadesAs bibliotecas de genes

A CONSTRUO DE UM MICRORGANISMO RECOMBINANTEEncontrar o gene

Inserir o geneIdentificar os microrganismos recombinantesA CONSTRUO DE PLANTAS TRANSGNICAS

O transgeneA transferncia dos genes a clulas vegetaisO problema dos marcadores seletivosDo laboratrio ao campo

CLULAS E ANIMAIS TRANSGNICOSO supermouseOs animais como modelos para a experimentaoOs animais como biofbricas

O TAMBO FARMACUTICOARGENTINO

Pg. 83

BIBLIOGRAFIA Pg. 99


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Copyright Maria Antonia Malajovich

CAPTULO 1. O QUE BIOTECNOLOGIA?

A BIOTECNOLOGIA TRADICIONAL

Cultivar vegetais, domesticar animais, transformar os alimentos ou aproveitar aspropriedades curativas de algumas plantas so atividades que remontam alvorada dahumanidade e se desenvolveram com base no conhecimento emprico, ignorando aexistncia dos microrganismos ou das leis da hereditariedade.

No incio do sculo XIX, a demanda de mo de obra por uma indstria incipiente estimula amigrao da populao do campo para a cidade. Em condies sanitrias cada vez maisdegradadas, as doenas e a fome acompanham o homem. Ao mesmo tempo, o progressoexige processos industriais mais eficientes. A compreenso dos fenmenos naturais torna-seindispensvel para responder s necessidades da sociedade.

A partir de 1850 surgem novas reas do conhecimento; nascem a Microbiologia, aImunologia, a Bioqumica e a Gentica. A Qumica Industrial se desenvolve aceleradamente

e, tambm, aumenta a interveno da Engenharia Agrcola e da Pecuria no gerenciamentodo campo.

Em 1914, Karl Ereky, um engenheiro agrcola hngaro, desenvolve um gigantesco plano decriao de sunos visando substituir as prticas tradicionais por uma indstria agrcolacapitalista baseada no conhecimento cientfico. Deve-se a Ereky (1919) a primeira definiode biotecnologia, como a cincia e os mtodos que permitem a obteno de produtos apartir de matria-prima, mediante a interveno de organismos vivos. Para ele, a erabioqumica substituiria a era da pedra e do ferro.

O sculo XX assiste a um desenvolvimento extraordinrio da cincia e da tecnologia(eletrnica, informtica). Da convergncia entre ambas resultam logros extraordinrios emvrios setores produtivos, onde os seres vivos constituem a base de itens to diversos comoa produo de variedades vegetais mais produtivas, a fabricao de novos alimentos, otratamento do lixo, a produo de enzimas e os antibiticos.

A BIOTECNOLOGIA MODERNA

A proposta de Watson e Crick (1953) de um modelo helicoidal para a molcula de DNArepresenta, sem dvida, um marco fundamental na histria da Biologia Molecular. Mas adivisria entre a Biotecnologia clssica e a Biotecnologia moderna uma srie deexperincias realizadas por H. Boyer e S. Cohen que culmina em 1973 com a transfernciade um gene de sapo a uma bactria. A partir desse momento possvel mudar o programagentico de um organismo transferindo-lhe genes de outra espcie.

A importncia e os riscos inerentes nova tecnologia no passaram despercebidos para aspessoas envolvidas. Fato indito na histria, em 1975 os cientistas reunidos em Asilomar(USA) estabeleceram uma moratria em seus trabalhos at serem definidas as condies desegurana adequadas, o que aconteceu pouco tempo mais tarde.

Na passagem de uma biotecnologia de laboratrio a uma biotecnologia industrial, aEngenharia Gentica ocupa um lugar de destaque como tecnologia inovadora. Em algunscasos, como os da insulina e do hormnio do crescimento, a inovao consiste em substituiros mtodos de obteno tradicionais. Em outros casos, como o dos anticorpos monoclonaisou do Golden Rice, um arroz com vitamina A, trata-se de produtos inteiramente novos.

Entretanto, a manipulao gnica no a nica ferramenta disponvel. A Biotecnologiaabrange hoje uma rea ampla do conhecimento que decorre da cincia bsica (biologiamolecular, microbiologia, biologia celular, gentica etc.), da cincia aplicada (tcnicasimunolgicas e bioqumicas, assim como tcnicas decorrentes da fsica e da eletrnica), e deoutras tecnologias (fermentaes, separaes, purificaes, informtica, robtica e controle

de processos). Trata-se de uma rede complexa de conhecimentos onde cincia e tecnologiase entrelaam e complementam.


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Autora: Maria Antonia Malajovich

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AS DEFINIES DE BIOTECNOLOGIA

O impacto causado pelas primeiras experincias de Engenharia Gentica estimulounumerosas tentativas de redefinio do campo da Biotecnologia. Mediante a substituio daexpresso interveno de organismos vivos por utilizao de processos celulares e

moleculares tratou-se de diferenciar a Biotecnologia clssica da moderna. Porm, devido enorme difuso das tcnicas de manipulao gnica, elas acabam se superpondo, e, fora docontexto histrico, difcil distinguir o limite entre ambas.

Por outro lado, como a definio de um setor de atividades depende dos interesses dosgrupos envolvidos, muitas vezes reflete a viso dos setores profissionais predominantes. Porisso, se revisitarmos os textos da dcada de 1980, anos em que a expresso biotecnologiase expande, encontraremos mais de uma dzia de definies diferentes do termo.Levantamos, entre as definies encontradas com maior frequncia, as seguintes:

OECD - Organisation for Economic Co-Operation and Development: A aplicao dosprincpios da cincia e da engenharia no tratamento de matrias por agentes biolgicosna produo de bens e servios (1982).

OTA Office of Technology Assessment: Biotecnologia, de uma forma abrangente, inclui

qualquer tcnica que utiliza organismos vivos (ou partes deles) para obter ou modificarprodutos, melhorar plantas e animais, ou desenvolver microrganismos para usosespecficos (1984).

EFB - European Federation of Biotechnology: Uso integrado da bioqumica, damicrobiologia e da engenharia para conseguir aplicar as capacidades de microrganismos,clulas cultivadas animais ou vegetais ou parte dos mesmos na indstria, na sade e nosprocessos relativos ao meio ambiente (1988).

E.H. Houwink: o uso controlado da informao biolgica (1989).

Biotechnology Industry Organization: em sentido amplo, Biotecnologia "bio" +"tecnologia", isto o uso de processos biolgicos para resolver problemas ou fazerprodutos teis (2003).

Observa-se que, com o tempo, o conceito ganha uma expresso mais simples. As definiesmais recentes no fazem mais referncia aos processos tecnolgicos envolvidos; talvezporque, alm de complexos e diversos, estes evoluam muito rapidamente.

Neste texto consideraremos a biotecnologia de uma maneira ampla, definida como umaatividade baseada em conhecimentos multidisciplinares, que utiliza agentes biolgicos parafazer produtos teis ou resolver problemas. Esta definio suficientemente abrangentepara englobar atividades to variadas como as de engenheiros, qumicos, agrnomos,veterinrios, microbiologistas, bilogos, mdicos, advogados, empresrios, economistas etc.

Figura 1.1: O campo da Biotecnologia.


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BIOTECNOLOGIA / Captulo 1: O que Biotecnologia?

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O IMPACTO DA BIOTECNOLOGIA

J no se trata de promessas ou de perspectivas futuras; os produtos e processosbiotecnolgicos fazem parte de nosso dia a dia, trazendo oportunidades de emprego einvestimentos. Trata-se de plantas resistentes a doenas, plsticos biodegradveis,

detergentes mais eficientes, biocombustveis, e tambm processos industriais menospoluentes, menor necessidade de pesticidas, biorremediao de poluentes, centenas detestes de diagnstico e de medicamentos novos.

Tabela 1.1: Produtos e servios de origem biotecnolgica, em diferentes setores.

SETORES TIPOS DE PRODUTOS OU SERVIOS

ENERGIA Etanol, biogs e outros combustveis (a partir de biomassa).

INDSTRIA Butanol, acetona, glicerol, cidos, vitaminas etc. Numerosas enzimaspara outras indstrias (txtil, de detergentes etc.).

MEIO AMBIENTE Recuperao de petrleo, biorremediao (tratamento de guas servidase de lixo, eliminao de poluentes).

AGRICULTURA Adubo, silagem, biopesticidas, biofertilizantes, mudas de plantas livresde doenas, mudas de rvores para reflorestamento. Plantas comcaractersticas novas incorporadas (transgnicas): maior valor nutritivo,resistncia a pragas e condies de cultivo adversas (seca, salinidade,etc.).

PECURIA Embries, animais com caractersticas novas (transgnicos), vacinas emedicamentos para uso veterinrio e humano.

ALIMENTAO Panificao (pes e biscoitos), laticnios (queijos, iogurtes e outrasbebidas lcteas), bebidas (cervejas, vinhos e bebidas destiladas) eaditivos diversos (shoyu, monoglutamato de sdio, adoantes etc.);protena de clula nica (PUC) para raes, alimentos de origemtransgnica com propriedades novas.

SADE Antibiticos e medicamentos para diversas doenas, hormnios, vacinas,reagentes e testes para diagnstico, tratamentos novos etc.

BIOTECNOLOGIA E DESENVOLVIMENTO

Por se tratar de uma coleo de tecnologias diversas, o uso das biotecnologias no serestringe necessariamente aos pases desenvolvidos. Existe um espao que os pasesemergentes podem ocupar, em funo de suas riquezas naturais, desde que existamprioridades econmicas e polticas definidas claramente. A condio fundamental contar

com instituies competentes que formem uma massa crtica de pesquisadores e pessoaltcnico treinado.

A China e a ndia contam hoje com uma indstria biotecnolgica avanada e diversificada.Assim como a Amrica Latina, onde esta se concentra principalmente na Argentina, noBrasil, no Chile, na Colmbia, em Cuba e no Mxico. Pases como Uruguai e Venezuelatambm tm atividade em algumas reas, assim como, em menor escala, Equador, CostaRica, Paraguai, Peru e Bolvia. Na regio, umas 500 empresas incidem em vrios setores:meio ambiente e indstria, agroalimentos e pecuria, sade animal e humana.

No entanto, a Biotecnologia suscita ainda opinies e sentimentos controversos. Enquantoalguns setores a percebem como uma tecnologia baseada em um slido conhecimentocientfico, para outros se trata de uma atividade antinatural e perigosa. O enfrentamento departidrios e opositores ocorre com menos frequncia no terreno das razes que no das

paixes, sejam elas polticas, religiosas ou ideolgicas. Ao discutir se a biotecnologia progressista ou reacionria, boa ou ruim, se esquece que o que caracteriza uma tecnologia o uso que fazemos dela.


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Produtos e processos inimaginveis trinta anos atrs entram em nosso cotidiano antes queos alicerces cientficos e tecnolgicos correspondentes se insiram em nossa cultura, atravsde uma divulgao ampla que atinja tambm o sistema educativo em todos os seus nveis.No existe possibilidade alguma de construir uma sociedade moderna se os seus integrantesignorarem os aspectos mais gerais de cincia e tecnologia. O desconhecimento aumenta orisco de rejeitar tecnologias promissoras, capazes de abrir perspectivas novas, com vistas aum desenvolvimento sustentvel em reas to crticas como a sade, a produo dealimentos, a energia e o meio ambiente.

A proposta deste livro revisar os fundamentos das biotecnologias e mostrar como esses seaplicam em diversos setores produtivos da sociedade, destacando como exemplos algunsempreendimentos latino-americanos bem sucedidos. Esperamos que ele seja de ajuda paratodos os que nos preocupamos com os alcances desta fascinante(r)evoluo tecnolgica.

CRONOLOGIA DE ALGUNS ACONTECIMENTOS MARCANTES NAHISTRIA DA BIOTECNOLOGIA

DATA ACONTECIMENTOS FUNDAMENTAIS

ANTIGUIDADE Preparao e conservao de alimentos e bebidas por fermentao(po, queijo, cerveja, vinho e vinagre); cultivo de plantas (batata,milho, cevada, trigo etc.); domesticao de animais; tratamento deinfeces (com produtos de origem vegetal tais como p de crisntemoe derivados de soja com fungos).

IDADE MDIA

Sculo XII Destilao do lcool.

IDADE MODERNA

Sculo XVI Cronistas registram a colheita de algas para alimentao, nos lagos deMxico, pelos astecas.

Sculo XVII Incio da produo comercial de cerveja; extrao de metais por aomicrobiana na Espanha; cultivo de fungos na Frana; Hooke descobre aexistncia de clulas (1665).

Sculo XVIII Invento da mquina a vapor (1752). Entre 1750 e 1850, aumenta ocultivo de leguminosas na Europa e se difunde a prtica de rotao decultivos que aumenta a produtividade e melhora o uso da terra.

IDADE CONTEMPORNEA

1797 Jenner inocula uma criana com um vrus que o protege contra a varola.1809 Appert utiliza o calor para esterilizar e conservar comida, processo que

ser utilizado nas campanhas napolenicas.1835 a 1855 Schleiden, Schwann e Virchow enunciam a teoria celular.1863 a 1886 Pasteur inventa um processo para conservar alimentos sem alterar suas

propriedades organolpticas (Pasteurizao, 1863), derruba a teoria daabiognese (1864), investiga as doenas do bicho-da-seda (1865),identifica a levedura como o agente responsvel pela fermentaoalcolica (1876), usa microrganismos atenuados para obter vacinascontra o antraz e a clera (1881), faz os primeiros testes de uma vacinacontra a raiva (1881). Paralelamente, Koch inicia o desenvolvimento detcnicas fundamentais para o estudo dos microrganismos (1876), eenuncia quatro postulados sobre os agentes infecciosos como causa de

doenas. Em 1865 Mendel apresenta o seu trabalho Experincias dehibridizao em plantas.

1887 Inaugurao em Paris do Instituto Pasteur.


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1892 Descoberta do vrus do mosaico do tabaco; introduo do trator naagricultura.

1897 Bchner mostra que enzimas extradas da levedura podem transformaracar em lcool.

1899 Primeiro transplante de um rgo: o rim de um cachorro a outrocachorro.

1900 Redescobrimento das leis da hereditariedade, j enunciadas por Mendelem 1865, porm esquecidas.

1905 O primeiro transplante de crnea se realiza com sucesso; isto porque acrnea no tem antgenos.

1906 Ehrlich descobre o primeiro agente quimioterpico, chamado Salvarsan,que ser utilizado contra sfilis.

1910 Em Manchester, na Inglaterra, comeam a ser introduzidos os sistemasde purificao de esgoto baseados na atividade microbiana.

1912 a 1914 Rhm obtm a patente de uma preparao enzimtica para a lavagemde roupas; Weizmann consegue a produo de acetona e butanol pormicrorganismos.

1915 Morgan publica Mechanism of Mendelian Heredity.1916 Imobilizam-se as enzimas, uma tcnica que facilita sua utilizao em

processos industriais.

1918 Morrem de gripe espanhola mais de vinte milhes de pessoas, umnmero de vtimas superior ao da Primeira Guerra Mundial. Constroem-se biodigestores para a produo de metano (China e ndia).

1919 O engenheiro agrcola hngaro Ereky utiliza pela primeira vez a palavrabiotecnologia.

1927 Muller descobre que os raios X causam mutaes.1928 F. Griffith descobre a transformao, isto a transferncia de

informao gentica de uma linhagem bacteriana a outra.1933 Comercializao do milho hbrido, isto de sementes de um milho mais

produtivo.1936 Obteno de cido ctrico por fermentao.1938 Na Frana, produo comercial de um biopesticida (Bacillus

thuringiensis).1940 a 1950 Avanos na mecanizao do trabalho agrcola.

1944 Produo em grande escala da penicilina (descoberta por Fleming em1928, desenvolvida por Florey e Chain).

1951 Inseminao artificial de gado utilizando smen congelado. Descobertada presena de genes saltatrios no milho por Brbara Mc Clintock.

1953 Watson e Crick propem um modelo da estrutura do ADN1959 Reinart regenera plantas de cenoura a partir de uma cultura de clulas

(calo).1960 Aumento da produo de cido lctico, cido ctrico, acetona e butanol

por via fermentativa.1961 Descoberta do cdigo gentico. Desenvolvimento de uma protease

alcalina para uso em sabes para a lavagem de roupas pela empresadinamarquesa Novo.

1962 Plantio de novas variedades de trigo mais produtivas, no Mxico, dando

incio ao que ser chamado de Revoluo Verde.1967 Primeiro transplante de corao, na frica do Sul. O paciente sobrevive18 dias.

1968 Produo industrial de aminocidos utilizando enzimas imobilizadas.1973 Havendo desenvolvido tcnicas de corte e reunio do DNA, Cohen e

Boyer transferem um gene a um organismo de outra espcie. Lanadono Brasil o programa de produo de lcool a partir de biomassa (Pr-lcool)

1975 Khler e Milstein desenvolvem a tecnologia de hibridomas e obtmanticorpos monoclonais. A empresa Novo produz xarope com altocontedo de frutose por via enzimtica como adoante alternativo sacarose. A Conferncia de Asilomar pede ao National Institute of Health(NIH) que sejam estabelecidas normas para a regulao dosexperimentos com DNA-recombinante, o que acontecer meses mais

tarde.1976 Utilizao da tcnica de hibridizao molecular no diagnstico pr-natal

da alfa talassemia.


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1978 Genentech, Inc., a primeira empresa biotecnolgica, fundada um anoantes por Boyer e Swanson, obtm a protena somatostatina (hormniode crescimento) mediante a tecnologia do DNA-recombinante.Nasce na Inglaterra Louise Brown, o primeiro beb de proveta.

1979 Produo do hormnio de crescimento humano, utilizando a tecnologiado DNA-recombinante.

1980 A Suprema Corte de Justia dos Estados Unidos aprova o princpio depatentes para as formas de vida de origem recombinante. As primeiraspatentes so de Chakrabarty, para um microrganismo parabiorremediao de petrleo, e de Cohen e Boyer, pelo processo de 1973.Mullis inventa a tcnica da Reao em Cadeia de Polimerase (PCR) cujapatente ser obtida por Cetus, Inc. em 1985 e vendida em 1991 aHoffman-LaRoche, Inc. por 300 milhes de dlares.

1981 Obteno da primeira planta geneticamente modificada. Obteno daprimeira linhagem de clulas-tronco de camundongo.

1982 A insulina humana de origem recombinante da Genentech, Inc. comercializada. Uma licena ser obtida mais tarde pela empresa ElyLilly, que a vender com o nome de Humulina. A primeira vacina deDNA-recombinante para o gado comercializada na Europa.

1983 Realizam-se as primeiras experincias de Engenharia Gentica em

plantas (petnia). Syntex Corporation recebe a aprovao da Food andDrug Administration (FDA) de um teste para Chlamydia trachomatisbaseado na utilizao de anticorpos monoclonais. Isolado o vrus HIV noInstituto Pasteur (Frana) e no NIH (National Institute of Health, EstadosUnidos).

1984 Jeffrey introduz a tcnica do Fingerprint (impresses digitais), que, umano depois, ser utilizada pelos tribunais para a identificao desuspeitos. Clonagem e sequenciamento do genoma do HIV pela empresaChiron Corp.

1986 A Environmental Protection Agency (EPA) dos Estados Unidos aprova aliberao de plantas de tabaco transgnicas. Um grupo de especialistasem segurana em Biotecnologia da Organizao para a CooperaoEconmica e o Desenvolvimento (OECD) declara que a previsibilidadedas mudanas genticas obtidas por Engenharia Gentica

frequentemente maior que a correspondente s tcnicas tradicionais, eque os riscos associados com organismos transgnicos podem seravaliados do mesmo modo que os riscos associados aos outrosorganismos. Aprovada a primeira vacina biotecnolgica para usohumano, trata-se de Recombivax-HB, contra a hepatite B.

1987 Advanced Genetic Sciences libera em campo bactrias DNA-recombinante (Frostban) que inibem a formao de gelo nos cultivos demorango, na Califrnia; a FDA aprova o fator ativador de plasminognio,obtido por engenharia gentica, para o tratamento de ataques cardacos.

1988 A Universidade de Harvard obtm a patente de um rato transgnicodesenvolvido especialmente para o estudo do cncer; na mesma dcada,os europeus obtero a patente de outro rato transgnico, sensvel asubstncias carcinognicas. Genencor International Inc. obtm a patente

de um processo que permite obter enzimas (proteases) resistentes aalvejantes (processo bleach) para a fabricao de sabes para alavagem de roupa.

1989 Com a criao do National Center for Human Genome Research se iniciao mapeamento do genoma humano.

1990 Primeira experincia de terapia gnica para uma doena rara (ADA) emuma menina de quatro anos. Pfizer comercializa Chy-Max TM, umaenzima de origem recombinante para a preparao de queijos.GenPharm International, Inc. consegue uma vaca transgnica queproduz no leite protenas humanas para alimentao infantil. AUniversidade da Califrnia (UCSF) e a Universidade de Stanfordcontabilizam 100 patentes relativas ao DNA-recombinante.

1992 Uma tcnica, elaborada por cientistas americanos e britnicos, permitetestar anormalidades como a fibrose cstica e a hemofilia em embries in

vitro. A FDA declara que os alimentos de origem transgnica nodemandam uma regulao especial.


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1993 Aprovada a utilizao do hormnio de crescimento bovino rBGH/rBST,produzido por Monsanto Co., para aumentar da produo de leite.

1994 Lanamento no mercado do tomate FlavSavr, que, devido inativaode um gene, amadurece na planta.

1995 Decifrado o primeiro genoma de uma bactria, Haemophilus influenzae.1996 Sequenciado o primeiro genoma de um organismo eucarionte, a

levedura Saccharomyces cerevisiae. Desenvolve-se o primeiro GeneChip(Stanford, Affymetrix).

1997 Nascem Dolly, uma ovelha clonada, e, meses mais tarde, uma segundaovelha, Polly, clonada e geneticamente modificada. Os cultivostransgnicos so introduzidos em vrios pases.

1998 Contabilizam-se mais de 1.500 empresas de Biotecnologia nos EstadosUnidos e mais de 3.000 no mundo. Clulas-tronco embrionrias soutilizadas para regenerar tecidos. Sequenciamento do primeiro genomaanimal, o verme Caenorrabditis elegans. Isolada a primeira linhagem declulas-tronco embrionrias humanas.

1999 Sequenciamento do primeiro cromossomo humano. Pesquisadoresdescobrem que as clulas-tronco podem ser induzidas a se diferenciarem diversos tipos celulares.

2000 O rascunho do sequenciamento do genoma humano anunciado

simultaneamente por Collins, do Consrcio do Genoma Humano, eVenter, da Celera Inc. Sequenciados tambm o genoma da moscaDrosophila melanogaster, o primeiro genoma de uma planta (Arabidopsisthaliana) e, no Brasil, o de uma bactria que ataca os ctricos (Xylellafastidiosa).

2001 O rascunho do sequenciamento do Genoma Humano publicadosimultaneamente nas revistas Science e Nature. Sequenciamento dogenoma de plantas de interesse agronmico para os pases emdesenvolvimento (arroz, banana). Sequenciamento do genoma debactrias de importncia agronmica. Obteno de clulas sanguneas apartir de clulas-tronco embrionrias.

2002 Completados o rascunho do proteoma funcional da levedura e osequenciamento do genoma do agente e do vetor transmissor damalria. Identificam-se mais de 200 genes envolvidos na diferenciao

das clulas-tronco. Descoberta da participao de molculas de RNA naregulao de vrios processos celulares. Em diversos pases inicia-se autilizao de clulas-tronco adultas para o tratamento experimental dediversas doenas (leucemia, mal de Chagas, diabetes e anemiafalciforme).

2003 A venda, como mascote, do GloFish, um peixe transgnico que brilha naescurido, originalmente criado para detectar poluentes. Clonagem devrios tipos de animais e de espcies ameaadas de extino.

2004 Sequenciado o genoma do frango. Um grupo de pesquisadores coreanosanuncia a obteno de uma linhagem de clulas-tronco embrionriaspluripotentes, aps uma transferncia nuclear; descobrindo-se maistarde que este resultado era uma fraude. Novos medicamentos e testesde diagnsticos entram no mercado.

2005 A Alemanha aprova os primeiros cultivos de plantas transgnicas.Publicado o genoma da vaca. Obteno de clulas-tronco a partir declulas da pele.

2006 Videiras geneticamente modificadas so testadas na frica do Sul. Ogrupo de pesquisadores liderado por S. Yamanaka consegue induzir apluripotencialidade celular introduzindo, mediante um vetor viral, quatrogenes em clulas somticas murinas.

2007 As autoridades europeias de segurana alimentar concluem que os genesmarcadores de resistncia aos antibiticos no apresentam riscosrelevantes para a sade humana ou animal nem para o meio ambiente.

2008 Pesquisadores japoneses desenvolvem a primeira rosa azul,geneticamente modificada. Cultivam-se plantas transgnicas em 25pases, includos sete da Unio Europeia. Yamanaka anuncia a obtenode clulas pluripotentes induzidas utilizando um plasmdeo como vetor.

2009 Pesquisadores canadenses e britnicos conseguem reprogramar clulasda pele, murinas e humanas, utilizando um transposon como vetor deum pacote de quatro genes.


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CAPTULO 2. AS CLULAS E OS CROMOSSOMOS

A CLULA COMO UNIDADE DOS SERES VIVOS

UNIDADE ESTRUTURAL

A clula a unidade estrutural dos seres vivos. Trate-se de bactrias, amebas,espermatozoides ou neurnios, todas as clulas so formadas por gua, ons inorgnicos emolculas orgnicas (protenas, carboidratos, lipdios e cidos nucleicos). E todas elasapresentam uma membrana plasmtica que separa o citoplasma do meio externo e permiteo intercmbio de molculas entre ambos.

As clulas procariticas se encontram exclusivamente no Reino Monera. Pequenas (0,001 a0,005 mm) e com requerimentos nutricionais simples, estas clulas se multiplicamrapidamente. A informao gentica se encontra em um cromossomo circular formado poruma molcula de DNA e associado a uma invaginao da membrana plasmtica

(mesossomo); pequenas molculas circulares adicionais (plasmdeos) podem tambm estarpresentes. Numerosos ribossomos asseguram a sntese proteica (Figura 2.1).

Bem mais complexa a estrutura das clulas eucariticas, presentes nos quatro Reinosrestantes (Protista, Fungo, Planta e Animal). Com um tamanho variando entre 0,01 e 0,10mm, estas clulas so dez vezes maiores que as procariticas. A presena decompartimentos diferenciados, ou organelas, que cumprem atividades especficas, resultaem uma subdiviso do trabalho que garante a eficincia do funcionamento celular (Figura2.2).

Figura 2.1: Representao esquemtica de uma clula procaritica.

O citoplasma percorrido por um sistema de membranas, o retculo endoplasmtico, queest associado aos ribossomos e, por conseguinte, sntese de protenas. Processados noaparelho de Golgi, os produtos celulares so secretados ou distribudos em outras estruturas(lisossomos, membrana celular). O metabolismo energtico est associado a organelascitoplasmticas, complexas e rodeadas de membranas (mitocndrias, cloroplastos e

peroxissomos). Um citoesqueleto, formado por tbulos e filamentos proteicos, mantm aforma da clula, alm de assegurar o transporte interno das organelas e os movimentoscelulares.


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A informao gentica est distribuda em cromossomos, cada um deles formado por umamolcula linear de DNA associada a protenas. Os cromossomos e o nuclolo se encontramno ncleo, que funciona como um centro de controle celular. A membrana nuclear, umenvoltrio com poros que separa o ncleo do citoplasma, permite o intercmbio desubstncias entre ambos.

Apesar de ter uma organizao muito parecida, as clulas animais diferem das clulas

vegetais em alguns aspectos. Nas clulas vegetais encontramos uma parede celular ao redorda membrana plasmtica; o citoplasma contm cloroplastos, onde ocorre a fotossntese, egrandes vacolos, onde se armazenam substncias e degradam macromolculas. Nenhumadessas estruturas se observa nas clulas animais; estas tm um centrolo que falta nasclulas vegetais.

Figura 2.2: Representaes esquemticas da estrutura celular eucaritica, animal e vegetal.

Clula animal

Clula vegetal


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BIOTECNOLOGIA / Captulo 2: As clulas e os cromossomos

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UNIDADE FUNCIONAL

A clula tambm a unidade funcional de um organismo. O citoplasma uma soluoviscosa onde continuamente ocorrem reaes de sntese e degradao de substncias,consumindo ou liberando energia. Estas reaes constituem o que denominamos

metabolismo.As reaes metablicas so facilitadas por protenas com atividade cataltica, denominadasenzimas. Assim como as protenas estruturais, as enzimas se sintetizam nos ribossomos, queso organelas citoplasmticas pequenas no membranosas. A estrutura das protenasdepende da informao gentica codificada no cido desoxirribonucleico (DNA) e transcritano cido ribonucleico (RNA), que a leva do ncleo at o citoplasma.

As semelhanas de estrutura e funcionamento celulares decorrem de uma origem evolutivacomum, aproximadamente 3,8 milhes de anos atrs. Os dois tipos celulares quereconhecemos hoje, as clulas procariticas e as eucariticas, apareceram entre um e ummilho e meio de anos mais tarde.

RELAO ENTRE AS ESTRUTURAS CELULARES E SUA FUNO

Tabela 2.1: A funo e a distribuio das estruturas celulares.

ESTRUTURA FUNO CLULA BACTERIANA CLULAANIMAL

CLULAVEGETAL

PAREDE CELULAR Manuteno da forma eproteo da clula.

Presente ou ausente Ausente Presente

MEMBRANA PLASMTICA Manuteno daestabilidade do meiointracelular; controle dastrocas entre a clula e omeio extracelular.

Presente

CARIOTECA ou

MEMBRANA NUCLEAR

Controle do fluxo desubstncias entre o ncleoe o citoplasma.

Ausente Presente

CROMOSSOMO(S) Controle da estrutura e dofuncionamento celular.

nico e circular;apenas DNA.

Mltiplos e lineares; ADN eprotenas.

NUCLOLO(S) Formao de ribossomos. Ausente Presente

CENTROLOS Formao de clios eflagelos; participao nadiviso celular.

Ausente Presente Ausente

RIBOSSOMOS Sntese de protenas. Presente

RETCULO ENDOPLASMTICORUGOSO

Sntese de protenas.

Ausente Presente

RETCULO ENDOPLASMTICO LISO Sntese de lipdios;armazenamento einativao de substncias.

COMPLEXO DE GOLGI Secreo celular.

LISOSSOMOS Digesto intracelular.

VACOLO CENTRAL Equilbrio osmtico earmazenamento.

Ausente Presente

MITOCNDRIAS Respirao celularaerbia.

Ausente Presente Presente

CLOROPLASTOS Fotossntese. Ausente Presente

CITOESQUELETO Manuteno da formacelular; contrao;

ancoragem de organelas.

Ausente Presente


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TCNICAS LABORATORIAIS

O estudo das clulas se v facilitado por um conjunto de tcnicas laboratoriais, tais como:

Tcnicas microscpicas que permitem uma visualizao detalhada da clula:

- Microscopia ptica, que se utiliza para observar os cortes de tecidos. Geralmente,estes so fixados (lcool, cido actico, formaldedo) e tingidos com corantes quereagem com as protenas ou com os cidos nucleicos, aumentando o contrasteda imagem.

- Microscopia de contraste de fase, que transforma as diferenas de espessura oude densidade do fragmento observado em diferenas de contraste.

- Microscopia fluorescente, que associa anticorpos especficos a um reagente comoo PVF (protena verde fluorescente de medusa), de forma a marcar as molculase visualizar sua distribuio nas clulas.

- Microscopia confocal, que combina a microscopia fluorescente com a anliseeletrnica da imagem, fornecendo uma imagem tridimensional.

- Microscopia eletrnica, que permite a observao em um plano de cortes tingidoscom sais de metais pesados (microscopia de transmisso) e a observaotridimensional de clulas (microscopia de varredura).

- Microscopia de tunelamento, com os diversos tipos de microscpios de varredurapor sonda (SPM, do ingls scanning probe microscope) que, alm de forneceruma imagem de molculas e tomos, permitem medies e a manipulao demolculas e tomos.

Tcnicas fsicas como a centrifugao diferencial (ultracentrifugao, centrifugao emgradiente) para separar os componentes celulares para estudos bioqumicosposteriores.

Tcnicas instrumentais que possibilitam a contagem de clulas e a separao depopulaes celulares (cell sorter) ou de cromossomos (flow sorter).

Tcnicas de cultura de clulas com objetivos diversos.

TODA CLULA DERIVA DE OUTRA PREEXISTENTE

Assim como uma planta se forma a partir de outra planta e um animal de outro animal, todaclula deriva de outra preexistente. Este conceito, enunciado por R. Virchow em 1855, nofoi plenamente aceito at dez anos mais tarde, quando L. Pasteur mostrouexperimentalmente que a proliferao de microrganismos em um meio orgnico estril sedeve contaminao deste com os microrganismos presentes no ar, que, ao encontrar ummeio propcio, se multiplicam rapidamente.

Todo organismo multicelular se forma a partir da multiplicao de uma nica clula-ovo ouzigoto. As contribuies dos genes maternos e paternos para o desenvolvimento do embriono so idnticas (imprinting). As clulas embrionrias se diferenciam, formando mais de200 tipos de clulas em animais, e um pouco menos nos vegetais. Os diferentes tiposcelulares cumprem funes especficas que, integradas, asseguram a unidade do organismo.

Nos vegetais, a persistncia de tecidos embrionrios totipotentes (meristemas) na plantaadulta permite o crescimento e a regenerao durante a vida toda do organismo. Emcondies apropriadas, clulas especializadas podem reverter a um estado no diferenciado eregenerar um organismo completo e diferenciado. Nessas propriedades se fundamenta apropagao de plantas in vitro.

Nos animais superiores, a totipotncia se restringe s clulas do embrio com menos dequatro dias, que so as nicas capazes de regenerar um organismo inteiro. No entanto, noembrio de mais de quatro dias, algumas clulas internas do blastcito (clulas-tronco

embrionrias) podem originar todos os tecidos do organismo, sendo consideradaspluripotentes (Figura 2.3).


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Figura 2.3: As clulas-tronco embrionrias.

As clulas-tronco podem ser extradas do blastcito com 5 a 7 dias e cultivadas in vitro; colocadas emcondies experimentais adequadas, diferenciam-se nos distintos tipos celulares.

Tambm tecidos adultos (medula ssea, sangue, crnea e retina, polpa dentria, fgado,pele, trato digestivo e pncreas) apresentam clulas-tronco. Elas podem permanecer nostecidos, multiplicando-se durante longos perodos de tempo sem que ocorra a diferenciao.No entanto, em determinadas condies fisiolgicas, estas clulas-tronco adultas originamclulas especializadas de vrios tipos, assegurando a manuteno e o reparo do tecido ondese encontram. Um nico tipo de clula-tronco multipotente da medula ssea, por exemplo,gera todas as clulas sanguneas (hemcias, leuccitos e plaquetas). Clulas-troncounipotentes se diferenciam em uma nica linhagem celular como, por exemplo, osqueratincitos da pele.

Por ser mais fceis de conseguir, as clulas-tronco adultas encontraram rapidamenteaplicaes teraputicas promissoras. No aconteceu o mesmo com as clulas-tronco

embrionrias. Estas podem ser obtidas seja a partir de um embrio, obtido por transfernciade um ncleo a um ovcito anucleado, seja a partir dos embries supernumerrioscongelados nas clnicas de fertilizao assistida. Os dois mtodos suscitaram grandesdebates ticos em torno de quem forneceria os ovcitos e do statusdo embrio.

A polmica deveria esmorecer com o desenvolvimento de uma tecnologia que permite obter,a partir de clulas somticas, a obteno de clulas iPS (do ingls, induced pluripotent stemcells) com propriedades equivalentes s das clulas-tronco embrionrias.

A induo de pluripotencialidade mediante a insero de alguns genes em clulas adultas um passo importante para acabar com a necessidade de dispor de embries congelados.Entender os mecanismos que controlam o crescimento e a diferenciao celular um dosmaiores desafios atuais, porque as clulas-tronco possibilitaro novos tratamentos deregenerao celular para doenas cardacas, diabetes e doena de Parkinson.

A tecnologia de reprogramao celular se desenvolve rapidamente, aumentando nossoconhecimento sobre o controle gentico da diferenciao e abrindo uma nova senda para aimplementao de testes, medicamentos e tratamentos novos.

OS CROMOSSOMOS

Cada cromossomo est formado por um filamento de DNA enrolado, a espaos regulares,sobre protenas (histonas). Durante a maior parte do ciclo celular, os cromossomos seencontram distendidos, formando uma rede de filamentos finos (cromatina). Na divisocelular, a cromatina se condensa, possibilitando a observao microscpica doscromossomos. Do ponto de vista morfolgico, estes se caracterizam pelo tamanho e aposio do centrmero, uma constrio que divide o cromossomo em dois braos.


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O nmero de cromossomos n constante em todos os indivduos de uma mesma espcie;n = 4 em Drosophila melanogaster e n = 23 no homem, por exemplo. Como nas clulassomticas os cromossomos se encontram sempre em pares, na espcie humana o nmerode cromossomos (2n) de 46, sendo que um par determina o sexo. Os cromossomossexuais so idnticos na mulher (46, XX) e diferentes no homem (46, XY). Em outrasespcies, a determinao do sexo segue mecanismos diversos.

Um pouco antes da diviso de uma clula, os cromossomos se duplicam, de maneira quecada uma das clulas filhas recebe 2n cromossomos. A mitose mantm constante o nmerode cromossomos nas clulas somticas dos indivduos de uma mesma espcie. J nas clulasreprodutivas, a meiose reduz a n o nmero de cromossomos; na fecundao, a fuso dosgametas ir restaurar o nmero n caracterstico da espcie. Durante a meiose, oentrecruzamento dos cromossomos permite a permuta e recombinao dos genes (Figura2.4).

Durante a formao dos gametas, erros na disjuno dos cromossomos podem dar origem aindivduos com frmulas cromossmicas alteradas. Na sndrome de Down, por exemplo, apessoa apresenta geralmente um cromossomo 21 adicional. (mulheres 47, XX + 21; homens47, XY + 21).

Estima-se que a percentagem de recm-nascidos com alguma anomalia cromossmicaestaria em torno de 0,85%, dos quais 0,65% apresentariam algum sintoma. Alteraescromossmicas tambm podem ser relacionadas com alguns tipos de cncer. Na leucemiamieloide crnica, por exemplo, se observa a translocao recproca de dois pedaos doscromossomos 9 e 22. De um modo geral, frequente encontrar alteraes no nmero decromossomos das clulas cancerosas.

Figura 2.4: Mitose e meiose.

Durante a meiose, a permuta de fragmentos cromossmicos homlogos possibilita a recombinao dosgenes.


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A TEORIA CROMOSSMICA DA HEREDITARIEDADE

Em 1865, Gregor Mendel apresentou seu trabalho Experincias de hibridizao em plantas;este reunia os resultados experimentais realizados com ervilhas (Pisum sativum), durantesete anos, no jardim do monastrio Agostino de Brno (Morvia). Apesar de passar quase

despercebido, o trabalho acabou sendo distribudo por vrias bibliotecas da Europa eAmrica, graas a sua publicao um ano mais tarde nos Anais da Sociedade de HistriaNatural.

No texto figuram algumas generalizaes. Conhecida como Primeira Lei de Mendel, Lei deSegregao ou Monoibridismo, a primeira delas se refere segregao dos fatores (alelos)de um par (um gene) na formao de gametas. A segunda, que conhecida como SegundaLei de Mendel, Lei de Segregao Independente ou Diibridismo, se refere segregao dosfatores (alelos) de dois ou mais pares (dois ou mais genes) independentes na formao degametas.

Em 1900, depois de chegar de maneira independente a concluses semelhantes, ospesquisadores K. Correns, E. Von Tschermak e H.de Vries redescobriram nas bibliotecas otrabalho de Mendel. Nesse intervalo de 35 anos tinha sido descrita a diviso celular (mitose,1875; meiose, 1890); o prximo passo correspondeu a Sutton e Boveri (1902), sugerindoque os fatores hereditrios de Mendel estariam nos cromossomos.

A confirmao desta hiptese decorreu dos trabalhos de T.H.Morgan e sua brilhante equipena Universidade de Columbia (Nova York), com a mosca da fruta, Drosophila melanogaster(Figura 2.5).

Figura 2.5: Drosophila melanogaster, a mosca do vinagre.

Em 1910, depois de uma srie de cruzamentos e de anlises estatsticas, Morgan mostrouque a herana da cor branca do olho do mutante white est associada transmisso docromossomo X, que determina o sexo.

Morgan e seus colaboradores identificaram numerosos outros mutantes de Drosophilamelanogastercom um padro mendeliano de hereditariedade (Figura 2.4). Alm de moscascom olhos brancos em vez de vermelhos, encontraram outras com asas curtas em vez delongas, com corpo de cor marrom ou preta em vez de amarela etc. Os genes

correspondentes se classificam em quatro grupos de ligao, sendo que cada um deles estassociado a um dos quatro pares de cromossomos da Drosophila.

Como durante a meiose se produzem permutas entre segmentos cromossmicos, noscruzamentos aparecem indivduos recombinantes, isto , com outras combinaes gnicasdiferentes das previstas pelas leis mendelianas. A partir dos dados obtidos em milhares decruzamentos sobre a recombinao dos genes de um mesmo grupo de ligao chega-se aestabelecer a distncia gentica entre estes.

Com a descoberta de clulas com cromossomos gigantes (politnicos) nas glndulassalivares das larvas de Drosophila, comearam os primeiros trabalhos de mapeamento,associando os dados genticos aos dados fsicos.

A observao microscpica das bandas nos cromossomos mostrou com enorme riqueza dedetalhes uma sucesso consistente de bandas largas e estreitas. Da associao entre os

mtodos genticos e os mtodos citolgicos surgiram os primeiros mapas fsicos, associandouma regio cromossmica a cada gene.


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Das descobertas de Morgan e sua equipe, nasce a Teoria do Gene, segundo a qual:

Os caracteres de um indivduo correspondem a elementos pares, os genes.

Os genes esto ligados uns aos outros nos cromossomos, formando um determinadonmero de grupos de ligao.

Os genes de cada par se separam durante a gametognese, de acordo com a Primeira

Lei de Mendel e, em consequncia, cada gameta fica contendo apenas um conjunto degenes (Figura 2.5).

Os genes pertencentes a grupos de ligao diferentes segregam independentemente, deacordo com a Segunda Lei de Mendel (Figura 2.6).

Entre os elementos pertencentes a cada grupo de ligao, ocorre uma troca ordenadachamada permuta ou crossing-over, que leva recombinao dos genes (Figura 2.4).

A frequncia da permuta fornece a prova da linearidade dos genes em cada grupo deligao e permite determinar sua posio relativa.

Figura 2.5: Monoibridismo.

A cor do corpo da Drosophiladepende de um gene, localizado no cromossomo III, com dois alelos (e =corpo preto ou ebony, e+= corpo amarelo). O cruzamento entre duas linhagens puras de moscas quediferem pela cor do corpo (amarelo ou preto) gera, na primeira gerao (F1), moscas de corpo amarelo,mostrando a recessividade do alelo e. Do cruzamento entre indivduos da F1 nasce uma segundagerao (F2) com uma proporo fenotpica de 3 moscas amarelas: 1 mosca preta. Esta proporodecorre da segregao dos alelos de um gene, na formao de gametas.


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Figura 2.6: Diibridismo.

A cor do corpo da Drosophiladepende de um gene, localizado no cromossomo III, com dois alelos (e =corpo preto ou ebony; e+= corpo amarelo). A presena ou ausncia de olhos depende de um gene,localizado no cromossomo IV, com dois alelos (ey = sem olhos, ey+= com olhos). O cruzamento entreduas linhagens puras de moscas que diferem pela cor do corpo (amarelo ou preto) e a presena ouausncia de olhos gera, na primeira gerao (F1), moscas com olhos e de corpo amarelo, mostrando arecessividade dos alelos ey e e. Do cruzamento entre moscas da F1 nasce uma segunda gerao (F2)com uma proporo fenotpica de 9 moscas amarelas com olhos: 3 moscas amarelas sem olhos, 3moscas pretas com olhos: 1 mosca preta sem olhos. Esta proporo decorre da segregaoindependente dos alelos dos genes localizados em diferentes cromossomos homlogos na formao degametas.


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Os estudos posteriores mostraram a complexidade dos padres de hereditariedade, queincluem casos de:

Alelismo mltiplo, quando um gene admite mltiplos alelos; dominantes, recessivos oucodominantes (Sistema ABO, por exemplo).

Pleiotropia, quando um gene determina diversos caracteres (pelagem e sobrevivncia emratos, por exemplo).

Herana polignica, quando um carter est determinado por vrios genes de efeitocumulativo (altura, cor dos olhos). Interao gnica, quando uma caracterstica depende da ao de muitos genes.

Finalmente, deve-se destacar que o fentipo de um indivduo o resultado da interaoentre o gentipo e o ambiente em que este se expressa.

CLULAS E CROMOSSOMOS COMO AGENTES BIOLGICOS

Um dos testes pioneiros de diagnstico gentico est baseado na observao microscpicados cromossomos de clulas somticas durante a diviso celular (mitose). A identificao sev facilitada pela presena de regies ou bandas reveladas mediante algumas tcnicas decolorao. O nmero e a estrutura dos cromossomos so analisados e apresentados em umarranjo (caritipo) que segue uma classificao convencional (Figura 2.7).

Figura 2.7: Representao dos cromossomos humanos.

O arranjo segue uma classificao convencional que leva em conta o tamanho, a posio do centrmero(tracejado no esquema) e o padro das bandas de cada cromossomo.Fonte: https://reader009.{domain}/reader009/html5/0308/5aa03b8114954/5aa03b8fd18a7.png

Os testes de diagnstico gentico envolvendo a anlise de caritipos esto amplamentedifundidos na prtica mdica, sendo facilitados atualmente pela utilizao de corantesespecficos para cada par cromossmico.

Como agentes biolgicos, as clulas encontram outras aplicaes (Tabela 2.2). Clulasvegetais cultivadas in vitroproduzem substncias de alto valor agregado, importantes paraas indstrias alimentar, cosmtica e farmacutica. Tambm se utilizam para regenerarplantas. A multiplicao de vrus em cultivos de clulas de insetos permite a comercializaode prticas de controle biolgico.


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A sntese de algumas substncias importantes para a indstria farmacutica, como o fatorativador de plasminognio, depende do cultivo in vitro de clulas animais. Estas tambmsubstituem os animais nos testes toxicolgicos e so utilizadas na multiplicao de vrus paraa preparao de vacinas. Tambm possibilitam a produo de anticorpos.

Combinando as tcnicas de cultivo celular com o desenvolvimento de materiais biolgicossemelhantes ao colgeno, uma rea nova de engenharia de tecidos visa a reparao ou

substituio de tecidos lesionados. Os enxertos de pele artificial, cultivada in vitro, saramferimentos e/ou queimaduras em seres humanos.

Tabela 2.2: As clulas como agentes biolgicos.

CLULAS

Vegetais

Indstria alimentar e cosmtica(Adoantes, corantes, flavorizantes e aromatizantes)

Indstria farmacutica(Alcaloides e esteroides)

Animaise/ouhumanas

Estudos toxicolgicos

Diagnstico clnico

Indstria farmacutica(Produo de anticorpos, soros e vacinas)

Medicina regenerativa(Produo de tecidos de substituio)


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CAPTULO 3. OS MICRORGANISMOS

A DIVERSIDADE MICROBIANA

O termo microrganismos se aplica a um grupo heterogneo de seres que vivem comoclulas independentes ou como agregados celulares: bactrias, arqueas, protozorios, algase fungos e, tambm, vrus. Salvo estes ltimos, que esto na fronteira entre o vivo e o novivo, os encontramos dentro dos trs domnios em que se classificam os seres vivos:Bacteria, Archaea e Eukarya (Tabela 3.1).

Os microrganismos mostram uma diversidade surpreendente de estrutura e modos de vida.Alguns so procariontes, como as bactrias; outros eucariontes, como os protozorios, asalgas e os fungos. Os aerbios crescem se houver oxignio, os anaerbios se no o houver.Formas livres colonizam todos os ambientes terrestres, desde o cume das montanhas at asprofundidades dos oceanos. Mas h tambm parasitas que crescem custa de outros seresvivos, onde encontram abrigo e alimento, e os que mostram diversos graus de dependncia

de outros seres vivos.Os auttrofos sintetizam seus alimentos a partir de dixido de carbono; os fotossintticosutilizam a luz como fonte de energia e os quimiossintticos, algumas reaes qumicasinorgnicas. Os hetertrofos dependem das molculas orgnicas elaboradas pelos auttrofos,que absorvem ou ingerem.

O fato de mant-los agrupados sob a denominao de microrganismos talvez obedeamenos a uma questo de semelhana que a razes prticas; j que os mesmos mtodosbsicos de estudo (isolamento, cultura in vitro, identificao) podem ser aplicados, compequenas variaes, a esses grupos.

Tabela 3.1: Os microrganismos dentro do marco da uma classificao biolgica atual.

DOMNIO BACTERIA ARCHAEA EUKARYAREINO EUBACTERIA ARCHAEBACTERIA PROTISTA FUNGI PLANTAE ANIMALIA

TIPO DECLULA

Procaritica Procaritica Eucaritica Eucaritica Eucaritica Eucaritica

ESTRUTURACELULAR

Parede celularcompeptidoglicano

Parede celularsempeptidoglicano

Paredecelular decelulose, emalguns;cloroplastos,em alguns

Parede celularde quitina

Parede celularde celulose;

cloroplastos

Sem paredecelular nemcloroplastos

ORGANIZAO Unicelular Unicelular Uni oupluricelular

Uni oupluricelular

Pluricelular Pluricelular

NUTRIO Autotrfica (*)ouHeterotrfica(**)

Autotrfica (*) ouHeterotrfica (**)

AutotrficaouHeterotrfica

Heterotrfica(absoro)***

Autotrfica Heterotrfica(ingesto)***

EXEMPLOS Eubactrias Arqueas Protozoriose Algas

Leveduras,Mofos, Bolorese Cogumelos.

Brifitas(musgos),Pteridfitas(samambaias),GimnospermaseAngiospermas.

Invertebradose Cordados

* Nutrio autotrfica: o organismo produz seu prprio alimento a partir de substncias inorgnicas e de uma fonte deenergia. Os seres autotrficos podem realizar fotossntese (para a qual a fonte de energia a luz solar) ouquimiossntese (para a qual a fonte de energia uma reao qumica exotrmica).

**Nutrio heterotrfica: o organismo se alimenta de molculas orgnicas elaboradas por outros seres vivos porabsoro (captao de nutrientes dissolvidos na gua), ou ingesto (entrada de partculas de alimentos no

dissolvidas).*** A absoro permite a captao de nutrientes dissolvidos na gua; a ingesto se refere s partculas de alimentosno dissolvidas.


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AS EUBACTRIAS

As eubactrias ou bactrias so organismos unicelulares procariticos em que uma paredecelular pode cumprir uma funo protetora. Alm do DNA cromossmico, podem apresentarmolculas circulares extras de DNA denominadas plasmdeos.

Em condies favorveis de umidade, acidez e temperatura, as bactrias se multiplicamrapidamente por fisso celular produzindo milhes de clulas em poucas horas (Figura 3.1).Em uma de suas acepes, a palavra clone se aplica s clulas que derivam de uma nicaclula Algumas espcies bacterianas tambm mantm formas de reproduo sexuada,possibilitando a recombinao do material gentico.

Figura 3.1: Bactrias e clones.

Por diviso binria de uma bactria gera-se um clone de bactrias semelhantes.

As eubactrias formam um grupo com mais de 5.000 espcies conhecidas. Pequenas

(0,0005-0,005 mm) e de formas diversas (esfricas, bastonetes, helicoidais), elas podem serencontradas isoladas ou em pares, cadeias ou agregados. Algumas se locomovemlivremente, mediante um ou mais flagelos distribudos na superfcie celular, outras seaderem mediante pelos ou fmbrias a um organismo hospedeiro. O grupo inclui tambm ascianobactrias, que sero comentadas mais adiante junto com as algas.

Em condies desfavorveis, algumas bactrias formam esporos que resistem em formalatente at que a situao mude, germinando e retomando sua atividade fisiolgica. Umexemplo interessante, na Europa do sculo XIX, o da existncia de campos malditos,campos em que as ovelhas no deviam transitar, devido ao alto risco de contrair ocarbnculo ou antraz. De fato, os bacilos presentes nos animais vitimados pela doena eenterrados nesses campos formavam esporos que, trazidos superfcie pelas minhocas,contaminavam as pastagens.

Uma tcnica laboratorial (colorao de Gram) permite diferenciar as bactrias pela estruturada parede celular. Entre as Gram-positivas, cuja parede celular mais simples, encontramosgneros como Clostridium, Bacillus, Mycobacterium (com algumas espcies que causam atuberculose e a lepra) e os Actinomicetes, como Streptomyces, produtora de antibiticoscomo a estreptomicina.

Entre as Gram-negativas, encontramos os micoplasmas, Escherichia coli, uma colonizadorado trato digestivo de muitos organismos, Salmonella, um agente de muitas intoxicaesalimentares, as cianobactrias fotossintticas, os espiroquetas (Treponema pallidum eBorrelia burgdorferi, causa da sfilis e da doena de Lyme, respectivamente) e as clamdias(responsveis por tracoma e uretrites).

Estima-se que as bactrias sejam responsveis por aproximadamente metade das doenashumanas. As Gram-negativas resultam mais difceis de tratar que as Gram-positivas, devidoa uma camada adicional na parede celular que as protege e dificulta a entrada de

antibiticos. Assim como o homem, os animais e as plantas tambm so afetados porpatgenos bacterianos. O dano decorre da invaso dos tecidos do hospedeiro ou da liberaode substncias txicas (exo e endotoxinas). Mas nem todas so patognicas.


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BIOTECNOLOGIA / Captulo 3: Os microrganismos

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A participao das bactrias na reciclagem dos elementos fundamental do ponto de vistaecolgico, possibilitando o tratamento de resduos e de guas servidas e, tambm, aeliminao de compostos recalcitrantes (biorremediao) e a extrao de minrios(biolixvia). Por outro lado, a fixao de nitrognio e a produo de toxinas pesticidascontribuem para melhorar as prticas agrcolas.

Devido a suas propriedades metablicas, muitas eubactrias so utilizadas na produo dealimentos (laticnios, vinagre, picles e azeitonas) e de aditivos (vitaminas, aminocidos,gomas emulsificantes e estabilizantes), na indstria qumica (acetona, butanol e plsticosbiodegradveis) e na indstria farmacutica (vacinas, toxinas e antibiticos). Tambm seutilizam na produo de enzimas para uso industrial e mdico (Tabela 3.2).

AS ARQUEAS

As arqueobactrias, ou arqueas, diferem das eubactrias pela estrutura da parede celular e,tambm, por alguns aspectos metablicos relacionados com a sntese de protenas que as

aproximam dos eucariontes.Algumas vivem em habitats inspitos, como as solfataras dos vulces ou giseres, atemperaturas superiores a 60-800C (Islndia, Costa Rica). Outras prosperam em lagos ondea concentrao salina altssima, como o Grande Lago Salgado (Estados Unidos) ou o MarMorto (Israel). Entre as arqueas existem tambm gneros com vias metablicas peculiaresque as tornam dependentes de enxofre ou produtoras de metano.

Devido a estas propriedades, nos ltimos anos tem-se acelerado a prospeco de arqueascom propriedades potencialmente interessantes, para serem utilizadas em processosindustriais que exijam condies ambientais extremas.

No entanto, estudos recentes de ecologia molecular mostram que as arqueas no se limitama ambientes extremos, sendo sua diversidade bem maior do imaginado previamente.

Tabela 3.2: As bactrias (Eubactrias e Arqueas) como agentes biolgicos.

BACTRIAS

Tratamento de resduos e de guas servidas

Produo de energiaEx: Metano

Biorremediao, extrao de minrio

Indstria qumicaEx: Acetona, butanol, cido lctico, cido actico

Enzimas industriais

AgriculturaEx: Rizbios, biopesticidas

AlimentosEx: Laticnios, vinagres, picles, azeitonas, silagem

Indstria de alimentosEx: Vitaminas B12e -caroteno, aminocidos lisina e cido glutmico;polissacardeos xantana e dextrana*

Indstria farmacuticaEx: Enzimas de uso mdico, antibiticos, vacinas e toxinas

(*) A dextrana tambm tem usos mdicos


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OS PROTISTAS

Os Protozorios se classificam no reino Protista, um grupo mal definido de seres eucariticosunicelulares ou pluricelulares, auttrofos ou hetertrofos, de reproduo sexuada ouassexuada.

Trata-se de organismos unicelulares heterotrficos, cujo tamanho varia entre 0,002 e 1mm.Alguns vivem livres em ambientes marinhos, de gua doce, ou simplesmente muito midos.Outros parasitam outras espcies, nas quais causam doenas: Girdia, Amoeba,Trichomonas, Plasmodium, Toxoplasma, Leischmania etc. De importncia fundamental parao ser humano do ponto de vista mdico, sua caracterizao molecular pode dar origem atestes diagnsticos e vacinas.

Classificadas junto com os protozorios no reino Protista, as algas so organismos uni oupluricelulares, autotrficos e aquticos. Situadas na base das cadeias alimentcias aquticas,as algas cumprem um papel fundamental na biosfera por serem capazes de fixar gscarbnico e produzir oxignio. Algumas participam na formao de solos e na fixao denitrognio.

Apesar de no ter rgos diferenciados, as macroalgas marinhas (algas pardas, algasvermelhas e parte das algas verdes) formam filamentos e talos que podem chegar a medirmais de trinta metros. So utilizadas na alimentao humana (Porphyra ou norie Laminaria,como o kombu, no Oriente; cochayuyo no Chile); e, tambm, como adubo. Devido a suacapacidade de formar gis e emulses, os ficocoloides extrados delas (Agar, carragenina,alginato) so empregados em anlises clnicas (preparao de meios de cultivo para cultivode bactrias e fungos) e em vrias indstrias, tais como a alimentcia (sorvetes, cremes,geleias etc.), a farmacutica (laxantes, cpsulas de remdios) e a cosmtica (cremes,sabonetes, xampus, dentifrcios etc.).

As microalgas representam um grupo extremamente diversificado de umas 25.000 espciesdas quais s um pequeno grupo est bem estudado. Este compreende aproximadamentecinquenta espcies de microrganismos fotossintticos, tanto eucariontes (diatomceas,dinoflagelados, euglenoides e outras algas verdes) como procariontes (cianobactrias,antigamente algas azul-esverdeadas).

Tabela 3.3: As algas como agentes biolgicos.

ALGAS

Biomassa

Tratamento de efluentes, biomonitoramento de poluio,energiaEx: Biomassa para a produo de energia.

AgriculturaEx: Adubo.

Produo de alimentosEx: Alimentao humana, rao para avicultura e aquicultura.

Molculas

Indstria de alimentosEx: Aditivos, espessantes e emulsionantes, substitutos proteicos ecomplementos nutricionais.

Indstria de cosmticos

Ex: cidos graxos e outras substncias tais como ficocoloides,pigmentos, glicerol, abrasivos finos etc.

Indstria farmacutica

Ex: Compostos biologicamente ativos, tais como toxinas,antibiticos, antivirais e antitumorais.


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A proliferao de microalgas como floraes na natureza (mars vermelhas) ou emreservatrios, geralmente devido eutrofizao das guas, causa a morte de outrosorganismos, sendo muito perigosa se estiver acompanhada pela liberao de toxinas. Porm,em alguns sistemas de tratamento de efluentes as microalgas so incorporadas nos tanquespara remover nutrientes inorgnicos e adicionar oxignio. Tambm so usadas como

indicadores de poluio.O metano, um gs combustvel, resulta da degradao de biomassa de algas pormicrorganismos anaerbios. Por outro lado, a produo de hidrognio por algas representauma alternativa energtica promissora.

As microalgas so aproveitadas na alimentao animal como rao para a avicultura e aaquicultura. Algumas das substncias que elas sintetizam so includas na alimentaohumana como complementos nutricionais e substitutos proteicos; trata-se de aminocidos,cidos graxos e vitaminas (B12, -caroteno ou provitamina A). Tambm so utilizadas naformulao de cosmticos e na indstria farmacutica (Tabela 3.3).

OS FUNGOS

O Reino Fungi comporta mais de 100.000 espcies. Os fungos so organismos eucariticos,uni ou pluricelulares, com uma parede celular formada por quitina. Todos eles sohetertrofos e podem se reproduzir sexuada ou assexuadamente.

As leveduras so fungos unicelulares que se desenvolvem em lugares midos e sereproduzem por brotamento. Pertence a este grupo um dos microrganismos de maiorimportncia econmica: Saccharomyces cerevisiae, o popular levedo de cerveja (ou,simplesmente, levedura) utilizado tradicionalmente na preparao de alimentos e debebidas, assim como na produo de etanol, vitaminas e outros metablitos. Transformadamediante tcnicas de engenharia gentica, esta levedura produz uma vacina contra ahepatite B (Tabela 3.4). Entretanto, nem todas as leveduras so benficas; Candida albicans,um microrganismo oportunista da flora normal humana pode, em certas condies, proliferar

de maneira anormal, tornando-se patognica.

Tabela 3.4: Os fungos como agentes biolgicos.

FUNGOS

AgriculturaEx: Controle biolgico de insetos e nematoides, micorrizas.

Produtos de fermentaoEx: Etanol, glicerol, cido ctrico.

Enzimas industriais

Biomassa

Ex: Fermento de padaria, micoprotena.Indstria de alimentosEx: Panificao, queijaria.

Indstria de bebidasEx: Cervejas e vinhos, destilados.

Produtos metablicosEx: Extrato de levedura, hormnios de crescimento vegetal.

Indstria farmacuticaEx: Antibiticos, vitaminas, vacinas, esteroides.


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Nos bolores e mofos, as clulas formam um emaranhado de filamentos ou hifas, denominadomiclio. Os mofos crescem rapidamente por fragmentao do miclio e se disseminammediante esporos; comoAspergillus niger, um produtor de cido ctrico; ou comoRhizopus,o fungo preto do po, que se expande sobre a superfcie deste apesar dos conservantesacrescentados; ou ainda como Aspergillus flavus, um bolor que ataca as sementes deleguminosas (amendoim, feijo, soja) e produz uma toxina poderosa, a aflatoxina, causandograves intoxicaes.

Neste grupo tambm se encontra o Penicillium, um gneroque conta com diversas espcies,uma das quais utilizada na indstria farmacutica, para a produo de penicilina, e outrasna indstria de alimentos, para a maturao de queijos como o Roquefort, o Gorgonzola e oCamembert.

Os cogumelos so os corpos reprodutivos de muitos fungos. Alguns so venenosos(Ammanita), outros produzem substncia alucingena, tais como a psilobicina, utilizada porgrupos nativos mexicanos em rituais religiosos, ou a ergotamina, sintetizada quimicamenteno sculo XX com o nome de LSD (cido lisrgico). Mas tambm os h comestveis como oAgaricusou champignon, o Shiitakee o Pleurotus, que so cultivados e comercializados pelohomem.

Em termos ambientais, um quarto da colheita de frutas e vegetais destrudo pelos fungos;pragas como a ferrugem do caf, o esporo do centeio e a vassoura-de-bruxa afetamgravemente a agricultura. Na Irlanda no sculo XIX, o Phytophtora infestansatacou a batata,destruindo a fonte bsica de alimentao; a praga causou um milho de mortes e aemigrao forada de boa parte da populao.

Os liquens resultam da simbiose entre um fungo e uma alga. Alguns so comestveis,supondo-se que a Lecanora esculentaseja o man referido na Bblia. O grupo no tem sidomuito explorado economicamente, apesar de ter encontrado aplicaes como corantes(tintura de tornassol, um indicador de pH), no tingimento de tecidos e como fixadores naindstria de perfumes. Tambm so indicadores de poluio (biomonitoramento).

Em contrapartida, outra associao, desta vez entre um fungo filamentoso e as razes dasplantas vasculares, as micorrizas, ocupam um lugar de destaque na agricultura em solostropicais por facilitarem a solubilizao dos fosfatos.

OS VRUS, NA FRONTEIRA DO VIVO E DO NO VIVO

Os vrus so partculas inertes sem nenhuma atividade metablica, no limite entre o vivo eo no vivo. Os menores medem 20 nanmetros (1nm = 10-4 mm). Podem atravessar filtrosextremamente finos e cristalizar. Sua estrutura muito simples: um cido nucleico (ADN ouARN, como filamento simples ou duplo) dentro de uma capa proteica ou capsdeo. Muitospossuem enzimas que sero liberadas dentro da clula hospedeira (Figura 3.2)

Figura 3.2: Alguns tipos de vrus.

Os adenovrus e o HIV parasitam

clulas humanas; o bacterifago,bactrias.

Como parasitas obrigatrios de bactrias, plantas ou animais, ao infetar uma clula vivapassam a utiliz-la para sua prpria reproduo. Alguns se integram no genoma da clulainfetada (bacterifagos, retrovrus). Devido a esta propriedade, os vrus tm sido utilizadoscomo vetores para introduzir genes em uma clula hospedeira (Figura 3.3).


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microrganismo desejado evitando as contaminaes, isto a multiplicao de outrosmicrorganismos.

Trabalha-se em condies asspticas, o que demanda a esterilizao prvia do material devidro, dos meios nutrientes e dos instrumentos (alas, pipetas) que sero utilizados. E natransferncia do material biolgico, evita-se cuidadosamente toda contaminao com osmicrorganismos do ar. Equipamentos especialmente desenhados para trabalhar sob um fluxo

de ar esterilizado ajudam o profissional. Tambm se evitam as contaminaes na hora deeliminar o material utilizado, a fim de no liberar microrganismos prejudiciais no ambiente.

Os microrganismos so isolados a partir de amostras de solo, gua, ar ou fluidos corporais.As linhagens obtidas se conservam como culturas puras. Microrganismos com caractersticasdiferentes so obtidos induzindo mutaes e selecionando as linhagens mutantes. Cadalaboratrio mantm os estoques microbianos necessrios, que tambm podem ser solicitadosa centros especializados (Colees de cultura).

O nmero de microrganismos em uma amostra pode ser estimado por diversos mtodos:contagem microscpica, contagem eletrnica, contagem em placa, turvao do meio, massaseca, contedo de nitrognio ou medidas indiretas da atividade microbiolgica.

Em geral, as tcnicas clssicas so trabalhosas e muito demoradas para o diagnstico clnico,por isso esto sendo substitudas por tcnicas miniaturizadas mais rpidas que identificam os

microrganismos com base em algumas reaes bioqumicas em kits padronizados. Atendncia geral de automatizao do laboratrio microbiolgico.

Em outra linha de ao, a partir do incio do sculo XX surge a Microbiologia Ambiental,trazendo uma nova viso em relao s populaes microbianas presentes na natureza. Noentanto, nossa ignorncia em relao aos microrganismos ainda enorme. O nmero deespcies que conseguimos cultivar no laboratrio no representa ainda mais do que 1 a 5 %da totalidade existente; dependemos dos avanos na rea da genmica para ampliar nossoconhecimento das comunidades microbianas do ambiente.

BIOSSEGURANA E BIOSSEGURIDADE

Os microrganismos so classificados segundo o risco de causarem danos aos profissionaisque trabalham com eles e coletividade. Os critrios so: a patogenicidade para o homem, avirulncia, o modo de transmisso, a endemicidade e a existncia ou no de uma teraputicaeficaz. Definem-se assim quatro grupos de risco:

Grupo 1: Baixo risco individual e coletivo. Microrganismos que nunca foram descritos comoagente causador de doenas para o homem e que no constituem risco para o meioambiente. Exemplos: Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Escherichia coli (algumaslinhagens).

Grupo 2: Risco individual moderado, risco coletivo limitado. Microrganismos que podemcausar doenas no homem, com pouca probabilidade de alto risco para os profissionais dolaboratrio. Exemplos: Salmonella, Toxoplasma, Schistosoma mansoni, vrus do sarampo,vrus da hepatite B.

Grupo 3: Risco individual elevado, risco coletivo baixo. Microrganismos que podem causardoenas graves aos profissionais do laboratrio. Exemplos: Mycobacterium tuberculosiseHIV.

Grupo 4: Srio risco para os profissionais do laboratrio e para a coletividade.Microrganismos que causam doenas graves para o homem. Exemplos: vrus Ebola, vrusMarburg.

A cada grupo de microrganismos correspondem normas estritas de trabalho, que abrangemdesde a arquitetura do laboratrio e as caractersticas dos equipamentos at as precauesque devem ser tomadas pelos profissionais e a forma em que o lixo ser descartado.

O conceito de biossegurana se complementa com o de biosseguridade, isto , o conjunto de

medidas necessrias para evitar a remoo intencional de material biolgico valioso como,por exemplo, em caso de bioterrorismo.


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OS MICRORGANISMOS COMO AGENTES BIOLGICOS

Tabela 3.5: Principais destaques entre os agentes biolgicos microbianos.

EUBACTRIAS UTILIZAO

Bactrias lcticas Os gneros Lactobacillus eStreptococcusso responsveis por vriosprocessos, tais como a elaborao de queijos e de iogurtes, oenvelhecimento dos vinhos, a conservao de alimentos ( sauerkrautou repolho fermentado, silagem para o gado); a produo de cidolctico, um aditivo utilizado na indstria de alimentos como acidulantee estabilizante.

Bacillus thuringiensis Este microrganismo prolifera no solo e na superfcie das plantas,sintetizando uma toxina fatal para as larvas de insetos. Esta produzida comercialmente h mais de 40 anos, representando 90%das vendas de inseticidas biolgicos e reduzindo a necessidade deaplicao de pesticidas qumicos nas lavouras. Nos ltimos anos, ogene codificador da toxina tem sido transferido a plantas (algodo,milho) para que estas sintetizem diretamente o inseticida.

Streptomyces Alm do cheiro caracterstico da terra removida, este gnero debactrias do solo produz substncias antibiticas (estreptomicina,tetraciclina, eritromicina), antifngicas (nistatina), herbicidas,antitumorais e supressoras de rejeio a transplantes.

Pseudomonas Vrias linhagens se utilizam na eliminao de poluentes. Algumasquebram molculas de hidrocarbonetos, como os existentes nosacidentes de derramamento de petrleo; outras podem remover omercrio aqutico.

Agrobacterium tumefaciens Agente patognico para as plantas dicotiledneas que desenvolvemum tumor ou galha quando infetadas. Com a remoo de um gene,perde a capacidade de provocar tumores, conservando a capacidadeinfecciosa, utilizada na engenharia gentica de vegetais.

Bactrias butricas Na indstria txtil, Clostridium butiricum libera as fibras vegetaisdurante a macerao do cnhamo e do linho. Clostridium

acetobutyricum utilizado na produo industrial de acetona ebutanol. Clostridium botulinum produz uma toxina poderosssima;calcula-se que um grama desta bastaria para matar um milho depessoas. A ingesto de conservas contaminadas e mal esterilizadasresulta quase sempre em um desfecho fatal. Devido a sua aoinibitria da contrao muscular, a toxina botulnica utilizada emconcentraes muito pequenas, para reduzir as rugas e marcas deexpresso durante certo tempo (efeito cosmtico).

Escherichia coli Descoberta em 1855, esta bactria Gram-negativa vive notrato digestivo do homem e de outros animais. Tm forma debastonete (0,002 mm de comprimento, 0,0008 mm de dimetro), 1 a4 molculas de DNA e 15.000 a 30.000 ribossomos. Flagelos e peloslhe permitem movimentar-se rapidamente. Algumas linhagens sopatognicas, podendo contaminar os alimentos (carne, leite, vegetais)que devem ser cozidos adequadamente. Os seus requerimentosnutricionais bsicos so simples: gua, sais minerais, uma fonte denitrognio e uma fonte de energia. Em condies adequadas, sedivide a cada 20-40 minutos; tambm pode se reproduzir de maneirasexuada (conjugao).

Devido facilidade com que ela pode ser cultivada no laboratrio,Escherichia coli tem se tornado uma ferramenta indispensvel paraestudos bioqumicos e genticos, incluindo a Engenharia Gentica. Oseu genoma compreende 4,6 milhes de pares de bases quecodificam em torno de 4.000 protenas diferentes.

A introduo de transgenes em Escherichia coli K12, uma linhageminofensiva de laboratrio, possibilitou os primeiros processos deproduo de insulina, de interferon e de hormnio de crescimento.Entretanto, por se tratar de uma clula procaritica, nem sempre amelhor opo de "fbrica" para a sntese de produtos de origem

animal ou vegetal, tendo sido aos poucos substituda por outrasclulaseucariticas, como a levedura.


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ARQUEOBACTRIAS UTILIZAO

Thermus aquaticus Isolada em uma poa do parque nacional de Yellowstone (EstadosUnidos), esta bactria produz uma enzima que copia o DNA a umatemperatura alta. Esta enzima permite obter milhes de cpias de umfragmento de DNA em um processo automatizado que revolucionou aBiotecnologia, chamado PCR (Polymerase Chain Reaction ou Reao

em cadeia da polimerase).Bactrias metanognicas Vivem em lugares onde h ausncia de oxignio, seja no tubo

digestivo de alguns animais (gado, cupins) ou nos pntanos. Estasbactrias transformam o acetato resultante da degradao de celulosepor outras bactrias em metano, um gs combustvel.

ALGAS UTILIZAO

Spirulina O seu alto teor proteico, que corresponde a 60% do peso seco, lheconfere um elevado valor nutritivo; as protenas representamaproximadamente 2% do peso seco da batata e 6-10% do trigo.Quando da chegada dos espanhis, os astecas j preparavam umasbolachas (tecuitlatl) com a Spirulina coletada no lago Texcoco. Nafrica, no lago Tchad, ainda hoje ela coletada e consumida como

alimento. Spirulina, assim comoChlorella, so vendidas em tabletescomo complemento nutritivo.

Dunaliella Acumula glicerol em condies de alta salinidade, com o qualconsegue evitar a desidratao. Pode crescer no Mar Morto, sendotambm cultivada em tanques ou lagoas, perto do Mar Vermelho,para extrao do glicerol e de -caroteno, outro produto metablico.

FUNGOS UTILIZAO

Saccharomyces cerevisiae Conhecido como levedo de cerveja ou levedura, utilizado napreparao de alimentos (po, biscoitos, fermento de padaria) e debebidas (cerveja, vinho e destilados), assim como na produo deoutras substncias de importncia industrial (etanol, vitaminas eoutros metablitos). A levedura cresce facilmente em laboratrio.Tambm pode ser manipulada geneticamente. Nos fermentadores ou

biorreatores industriais onde se multiplica rapidamente a partir dematrias-primas de baixo custo, ela permanece ativa duranteperodos longos e, ao concluir o processo, pode ser separada porfiltrao ou centrifugao. Com 12.000.000 de pares de bases e 6.000genes em 16 cromossomos,Saccharomyces cerevisiae foi, em 1997,o primeiro organismo eucaritico a ter o seu genoma sequenciado.

Aspergillus Algumas espcies alcanam grande importncia industrial, comoA.niger, utilizada para a produo de cido ctrico ou de enzimas (emlinhagens modificadas geneticamente).

Penicillium Algumas espcies so utilizadas na indstria farmacutica (penicilina)ou indstria de alimentos (queijos azuis, como o Roquefort e oGorgonzola; queijo Camembert).


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CAPTULO 4. AS ENZIMAS E OS ANTICORPOS

AS PROTENAS

Todos os organismos esto formados por gua e molculas de diversos tipos, inorgnicas eorgnicas (Figura 4.1). Entre estas ltimas, se encontra um grupo de macromolculas, asprotenas, que participam em numerosas atividades, cumprindo um papel fundamental paraos seres vivos. Pertencem a este grupo as enzimas, molculas de ao cataltica, e osanticorpos, molculas que participam na defesa do organismo.

Tabela 4.1: As funes das protenas no organismo.

FUNO EXEMPLOS

Componentes estruturais Queratina do cabelo, colgeno da derme, actina e miosina das fibrasmusculares.

Substncias de reserva Albumina do ovo, casena do leite.

Ao cataltica Enzimas que controlam as reaes qumicas celulares.

Outras Transmisso de informao (hormnios proteicos), participao nosmecanismos de defesa (anticorpos, citocinas), transporte earmazenamento de pequenas molculas (hemoglobina).

Figura 4.1: A composio qumica de uma bactria.

Apesar de algumas diferenas nas propores de alguns componentes, a composio qumica de outrosmicrorganismos ou das clulas eucariontes comparvel de uma bactria.

ESTRUTURA

As protenas so macromolculas formadas por 20 aminocidos diferentes. Estes secaracterizam por ter, unidos ao tomo de carbono, um grupo amino (bsico), um grupocarboxila (cido) e um radical varivel (Figura 4.2 A). A presena de um carbono assimtrico

resulta em duas formas moleculares (L) e (D) que diferem por suas propriedades pticas. Osaminocidos que compem as protenas correspondem forma (L).


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A reao de condensao entre o grupo carboxila de um aminocido e o grupo amina deoutro cria uma ligao peptdica (Fig.4.2 B). A unio de vrios aminocidos forma umacadeia peptdica que se caracteriza no s pelo nmero e tipo de aminocidos que acompem, como pela sequncia em que estes se encontram, denominada estrutura primria.Ao se estabelecerem ligaes entre os grupos que formam os enlaces peptdicos, a cadeia

adota uma estrutura regular ou estrutura secundria, geralmente em forma de hlice ou defolha. As interaes entre as cadeias laterais dos aminocidos causam o dobramento daprotena, resultando uma configurao espacial que chamada de estrutura terciria. Aforma final de uma protena depender ainda da associao entre vrios polipeptdios, noque se denomina de estrutura quaternria (Figura 4.2 C).

Quando sintetizada dentro da clula, uma protena adotar espontaneamente a configuraoespacial que decorre de sua estrutura primria. Entretanto, fatores ambientais como o pH, aconcentrao salina ou a temperatura podem causar alteraes momentneas ou definitivasna forma da molcula.

Figura 4.2: Aminocidos e protenas


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BIOTECNOLOGIA / Captulo 4: As protenas e os anticorpos

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AS BASES DE ALGUMAS TCNICAS LABORATORIAIS

Cromatografia

Esta tcnica permite separar as substncias de uma mistura com fins analticos epreparativos. Est baseada na migrao diferencial das molculas de uma mistura, colocadaem uma fase mvel, sobre um suporte estacionrio ou matriz. Em funo das caractersticasda fase estacionria, distinguem-se diferentes modalidades: cromatografia em papel, emcamada delgada, cromatografia em gs, cromatografia lquida etc.

Na cromatografia em coluna, por exemplo, a separao das protenas de uma misturadepende da estrutura da matriz, slida e permevel, que se encontra imersa em um solvente(Figura 4.3). A separao obedece a trs tipos de mecanismos:

Troca inica. A matriz est formada por pequenas partculas carregadas que retm asmolculas de carga contrria. Como a associao depende de fatores como o pH e a forainica da soluo, a modificao destes fatores permite controlar a separao.

Filtrao em gel. A matriz consiste em partculas porosas que separam as protenas emfuno de seu tamanho, como uma peneira molecular.

Afinidade. As partculas da matriz esto unidas por ligaes covalentes a molculas(enzimas, anticorpos) que interagem com a protena de interesse. Para liberar a protenaretida na coluna, muda-se o pH ou a concentrao salina. Desse modo se consegue aprotena purificada.

Figura 4.3: Cromatografia em coluna

O processo est baseado na velocidade de migrao diferencial das molculas proteicas em uma matrizimersa em um solvente.

Eletroforese

Molculas ionizadas colocadas em um campo eltrico migram de acordo com suas cargas epesos moleculares. Se a carga for positiva, elas migraro para o plo negativo ou ctodo e,inversamente, se ela for negativa, a migrao ocorrer na direo do plo positivo ou nodo.Este o fundamento de outra tcnica analtica, a eletroforese.

Se uma mistura de peptdeos for colocada em um campo eltrico, eles migraro de acordocom sua carga, forma e tamanho, formando cada um deles uma banda caracterstica queser visualizada mediante um corante ou uma reao qumica especfica (Figura 4.4).

Observe-se que a carga de um peptdeo resulta da soma das cargas correspondentes aosgrupos amina e carboxila terminais e dos radicais dos aminocidos que o compem, e queessa carga varia com o pH do meio.


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A eletroforese permite separar os componentes de uma mistura. Existem numerosasvariaes desta tcnica em funo do suporte (papel de filtro, slica-gel, membranas deacetato de celulose, gel de agarose, amido ou poliacrilamida), da disposio da cuba(horizontal ou vertical), da direo da migrao (unidirecional ou bidirecional) etc.

Figura 4.4: Eletroforese

Separao dos peptdeos de uma mistura, por migrao diferencial em um campo eltrico.

Espectrometria de massa

Esta tcnica analtica mede a massa molecular a partir da razo entre a massa e a carga demolculas ionizadas, medida que permite a identificao de uma substncia. Com adescoberta de mtodos de ionizao adaptados s molculas biolgicas como o MALDI (doingls Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization), a espectrometria de massa se tornou nosltimos anos uma ferramenta indispensvel na identificao de protenas, acares, cidosnucleicos, lipdios e outros compostos orgnicos.

Aplicada s protenas, a espectrometria de massa identifica a molcula por comparao comoutras de um banco de dados. Tambm fornece uma anlise estrutural da molculaindicando a sequncia de aminocidos. Com esta tcnica possvel estudar o conjunto deprotenas de um organismo (proteoma) e dissecar as interaes das protenas com outrasmolculas. Por ser um mtodo automatizado e rpido, tem alcanado mltiplas aplicaesem farmacologia e diagnstico.

AS ENZIMAS

A CATLISE ENZIMTICA

As reaes qumicas que ocorrem nos seres vivos dependem da atividade cataltica dasenzimas. Estas molculas agem diminuindo a energia de ativao necessria de uma reaoqumica, sendo capazes de promov-las e aceler-las, sem ser alteradas ou destrudas.

A molcula de enzima reconhece um substrato especfico, formando com ele um complexomolecular ou estado de transio. O encaixe no stio ativo da molcula facilita atransformao do substrato no(s) produto(s) da reao. A enzima recuperada no fim dareao, podendo atuar inmeras vezes. O processo pode ser representado como a seguir:

S + E SE P + E


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BIOTECNOLOGIA / Captulo 4: As protenas e os anticorpos

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A primeira caracterstica das enzimas a especificidade; uma enzima como a lactase, queopera sobre a lactose, no agir sobre a sacarose; duas enzimas que hidrolisem o amidopodero faz-lo cortando a molcula de maneira diferente, como a -amilase e a -amilase.A segunda que, em funo de sua origem biolgica, as enzimas so biodegradveis e agemem condies brandas de temperatura e pH.

A ao enzimtica depende do pH, da temperatura, da presena de cofatores inorgnicos(zinco, ferro, cobre) e/ou orgnicos (coenzimas, muitas das quais so vitaminas). Os metaispesados alteram a estrutura molecular da enzima de maneira irreversvel impedindo suaao cataltica (desnaturao).

Uma inibio da atividade enzimtica ocorre quando molculas muito parecidas com osubstrato competem com este para ocupar o stio ativo da enzima (inibio competitiva). Ouquando outras molculas se ligam a determinadas partes da enzima, alterando a estruturaespacial e dificultando o encaixe com o substrato (inibio no competitiva).

Figura 4.5: O mecanismo da atividade enzimtica.

A atividade enzimtica no modifica o equilbrio da reao.

OS DIVERSOS TIPOS DE ENZIMAS

Uma forma de classificar as enzimas pelo tipo de reao que catalisam, acrescentando osufixo ase ao nome do substrato que transformado: protease, lactase, amilase, lipase,celulase. Tambm se pode adicionar ase ao nome da reao catalisada: hidrolase,oxirredutase. Quando combin

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