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Projeto de Pós-doutorado

APLICAÇÃO DA ANÁLISE MULTIVARIADA PARA

CARACTERIZAÇÃO DE BEBIDA ALCOÓLICA DESTILADA A

PARTIR DE DETERMINAÇÃO DE COMPOSTOS VOLÁTEIS POR

TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS

Dr. José Carlos Pires Penteado

Projeto submetido e aprovado pelo Instituto de Química – USP

São Paulo, Brazil

Junho/2006

RESUMO DO PROJETO

As bebidas alcoólicas têm sido estudadas principalmente devido ao

impacto social causado pelo consumo excessivo, embora vários produtos

secundários presentes possam contribuir também para agravar a saúde pública

devido a sua toxicidade. Esse agravamento aumenta com a falsificação ou

adulteração das bebidas alcoólicas colocando em maior risco a saúde humana.

Este projeto tem como objetivo classificar e diferenciar a cachaça que é a

principal bebida alcoólica-fermento destilada brasileira usando a técnica

quimiométrica de análise de componentes principais e cluster. Essa avaliação

será realizada através da quantificação de componentes que podem ser

produzidos na fabricação e no armazenamento da bebida, tais como compostos

carbonílicos, álcoois e ésteres entre outros componentes voláteis. Tem-se como

premissa investigar os componentes que possam classificar e diferenciar

podendo se obter os denominados marcadores moleculares, visando fornecer

subsídios para controle de padronização. O desenvolvimento da metodologia

analítica a ser utilizada para compostos carbonílicos tem como objetivos obter

maior sensibilidade, rapidez e minimização de resíduos.

INDICE

1 INTRODUÇÃO................................................................................................ 4

2 JUSTIFICATIVA............................................................................................ 12

3 OBJETIVOS.................................................................................................. 13

4 ESTRATÉGIA DE TRABALHO..................................................................... 14

4.1 Critério para escolha das bebidas alcoólicas......................................... 14

4.2 Otimização das condições analíticas para compostos carbonílicos ...... 14

4.3 Parâmetros de validação ....................................................................... 14

5 MATERIAL E MÉTODO................................................................................ 16

5.1 Metodologia de análise.......................................................................... 16

5.2 Análise de metanol, álcoois superiores e ésteres por GC ..................... 16

5.3 Análise de carbonílicos por SPME-GC (C1~C8)..................................... 17

5.4 Análise de compostos carbonílicos por HPLC....................................... 17

5.5 Compostos voláteis por SPME-GC/MS-FID .......................................... 18

6 ANÁLISE DE RESULTADOS ....................................................................... 18

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................. 19

Projeto de Pesquisa de Pós-Doutorado

Criado por: JCPP [email protected] 4

1 INTRODUÇÃO

Bebida alcoólica é definida como produto refrescante, aperitivo ou

estimulante, destinado à ingestão humana no estado líquido, sem finalidade

medicamentosa e contendo mais de meio grau Gay-Lussac de etanol1. Na

literatura há o relato do provável uso de alguma bebida alcoólica pelo Homus

erectus desde aproximadamente 250.000 anos e também no período paleolítico

tardio (30.000 AC)2. Dependendo da dose, a bebida pode ser benéfica ou

bastante maléfica. O primeiro efeito benéfico do álcool ao homem foi mostrado

em 1772 para doenças da artéria coronária, e mais recentemente estudos

epidemiológicos sugerem que qualquer tipo de bebida alcoólica pode

proporcionar esse benefício devido aos compostos minoritários3. Por outro lado,

deve ser enfatizado que o álcool juntamente com o fumo aumenta em muito o

risco de desenvolvimento de câncer no pulmão devido ao seu efeito sinérgico4.

O abuso de bebidas alcoólicas tem causado grande custo social. Dados

recentes mostram que as ocorrências policiais na Inglaterra estimam que o álcool

seja responsável por 40% dos crimes violentos, 78% dos assaltos e, uma em

cada quatro entradas nos hospitais. Na Alemanha há cerca de 6,5 milhões

alcoólatras com 42.000 mortes por ano, a um custo de 20 bilhões de euros

anuais5.

A característica de uma bebida alcoólica é o fato de ser obtida a partir da

fermentação de fontes naturais próprias de açúcar e amiláceos tais como uva,

milho, centeio, arroz, cana, cevada, aveia e mesmo de raízes e folhas. No

processo de fermentação utilizam-se diferentes leveduras tais como

Saccharomyces cerevisae, como as do gênero Kloeckera, Cândida, Hansenula,



Hanseniopora, Pichia, Zigossacharomyces, entre outras. O crescimento dessas

leveduras durante a fermentação é influenciado por diferentes fatores como pH,

concentração de nitrogênio e açúcar, concentração de dióxido de enxofre,

conteúdo de álcool e temperatura. Dependendo da bebida o processo de

fermentação pode ocorrer em etapas e as leveduras do gênero Kloeckera,

Candida, Hanseniospora, Hansenula, Pichia, Zigossacharomyces participam

apenas do início da fermentação, produzindo compostos secundários que

proporcionam aroma, que tem grande importância para os caracteres

organolépticos da bebida6. A proporção harmônica dessas substâncias

(compostos voláteis) que se formam durante a produção influenciam na

qualidade da bebida e são responsáveis pelas propriedades organolépticas, ou

seja, aroma, gosto e sabor. Estes compostos podem chegar a centenas, dentre

os quais pode-se mencionar aldeídos, álcoois, ácidos e ésteres, entre outros. A

concentração desses compostos pode ser bastante variada, na ordem de mg.L-1

a µg.L-1, como no caso de ésteres e ácidos graxos que são formados durante a

fermentação, destilação, maturação e estão diretamente relacionados com a

matéria prima utilizada7. Para os compostos carbonílicos a literatura apresenta

vários métodos de determinação, sendo que os métodos cromatográficos com

derivatização utilizando os reagentes 2,4 dinitrofenilhidrazina (DNPH)8 e o

O-(2,3,4,5,6 pentaflúorfenil) hidroxilamina (PFBHA)9 são os mais empregados

devido a sensibilidade e seletividade. Ambos reagentes, PFBHA e DNPH,

reagem seletivamente com aldeídos e cetonas em meio aquoso (Figura 1).



C

R2

R1

O

F

FF

F

F

O

NH3Cl

N2O

NO2

N

H

N

F

FF

F

F

O NC

R2

R1

PFBHA

DNPH

C

R2

R1

N2O

NO2

N

NH2

H

+

derivado do PFBHA

derivado do DNPH

composto

carbonílico

Figura 1. Reação de derivatização dos compostos carbonílicos com os

reagentes PFBHA e DNPH.

A cromatografia em fase líquida (HPLC) no modo de fase reversa tem sido

preferencial quando utilizado o derivatizante DNPH para compostos

carbonílicos10. As principais vantagens da HPLC para aplicações analíticas

quantitativas vêm a ser facilidade de uso, pois o produto derivado não precisa ser

isolado, boa reprodutibilidade e recuperação, com limite de detecção de

50,0 µg.L-1 para cetonas. Por outro lado, quando se realiza esta análise por

HPLC, é necessária a utilização de detector de UV-vis com capacidade de

monitorar dois comprimentos de onda simultâneos (390 nm aldeídos furânicos e

365 nm para outros aldeídos)11 ou o detector de arranjo de diodos12, além de

coeluições de isômeros13 e interferência de artefatos (ozônio) devido a

reatividade dos compostos carbonílicos insaturados14.

Com o derivatizante PFBHA para análise de compostos carbonílicos tem-se

usado a cromatografia a gas com o detector de captura de elétrons (ECD) por



formar o derivados halogenados, obtendo-se níveis de limite de detecção de

ng.mL-1 para estes compostos em bebidas alcoólicas15. Este produto derivado

necessita ser isolado antes de se submetido à análise cromatográfica. Para se

isolar o derivado, efetuando a extração e a pré-concentração, se tem utilizado

técnicas clássicas tais como extração líquido–líquido (LLE) ou extração em fase

sólida (SPE). A LLE requer aparelhagem simples e de baixo custo, porém

apresenta eficiência baixa, consumo elevado de solvente, geração significativa de

resíduo e baixo isolamento de interferentes. A SPE proporciona níveis altos de

recuperação com um isolamento do analito superior a LLE, e ainda consome

menor quantidade de solvente. Em ambos métodos de isolamento, LLE e SPE, o

consumo de solventes tóxicos e a geração de resíduos vêm a ser um dos

empecilhos. Com o desenvolvimento da técnica Solid Phase Microextraction

(SPME), ou seja, micro extração em fase sólida, tem-se a vantagem de preparo

de amostra sem o uso de solvente. O custo de análise por SPME vem a ser outro

benefício, sendo cerca de 50% menor que o de SPE16. A essas vantagens se

soma também a agilização da análise em decorrência da automatização do

preparo da amostra, etapa que pode comprometer 75% do tempo de análise17,18

quando as técnicas clássicas de LLE são utilizadas. A SPME está consolidada

nos diversos campos da química analítica com aplicações em ambiental, forense,

fluídos biológicos e na análise de alimentos19. A possibilidade de extração e pré-

concentração em uma única etapa traz grandes avanços na performance

analítica. O processo SPME está baseado em equilíbrios simultâneos em

sistemas multifásicos, onde o sorvente é colocado em contado com a amostra e

os analitos são retidos (adsorção ou absorção), e então transferidos para o

instrumento analítico20. A escolha do sorvente depende da natureza química do



analito tais como polaridade e volatilidade, assim as fibras polares tem maior

afinidades a compostos polares e o mesmo princípio acontece com as fibras

apolares21. A técnica SPME22 tem sido aplicada para análise de compostos

carbonílicos em água potável com derivatização com PFBHA, tendo apresentado

bons resultados (limite quantificação abaixo de µg.L-1). Na determinação de

compostos carbonílicos em bebidas alcoólicas os níveis de detectabilidade por

SPME chegam a ser cerca de 50 vezes menores em relação a LLE para o

formaldeído (LQ = 0,23 µg.L-1 LLE e 0,005 µg.L-1 SPME)23.

A combinação de SPME com cromatografia a gás acoplada a espectrometria

de massas (SPME-GC/MS) utilizando sorbente com característica polar também

tem sido utilizada na identificação de compostos orgânicos voláteis presentes no

mezcal, bebida destilada típica mexicana24. A partir desse estudo foi avaliado que

dois compostos, limoneno e o pentil butanoato, podem ser utilizados como

marcadores de autenticidade do mezcal. Os constituintes voláteis também vêm

sendo investigados na diferenciação de origem de uísque irlandês e escocês25.

Estudos preliminares para marcadores de envelhecimento têm sido propostos

para a cachaça26. Estes compostos são atribuídos à hidrólise da lignina dos

tonéis de madeira que se transferem para bebida no envelhecimento27. Em outro

estudo foi possível diferenciar a cachaça do run através da análise de álcoois

(propanol, iso propanol e isopentanol) e cátions (Ca, Mg e Mg) com ferramentas

quimiométricas28. No Estado de São Paulo, o monitoramento para a autenticidade

das bebidas alcoólicas tem sido realizado a partir da comparação de

componentes voláteis encontrados no produto autêntico e no falsificado29.

A quimiometria a partir da análise de compostos voláteis em bebidas tem

permitido extrair um número maior de informações relevantes, tais como



diferenciação e classificação de vinhos30, uísque31 e cidra32. A utilização da

análise de componentes principais (PCA) entre outras ferramentas

quimiométricas, mais a praticidade da análise por SPME, têm demonstrado

resultados interessantes para caracterização de detergentes,33 café34 e óleos

comestíveis35. A técnica quimiométrica aplicada ao método de índice de difração

por análise em Fluxo (FIA) tem sido proposto com ferramenta alternativa na

adulteração de bebidas alcoólicas destiladas tais como cachaça, run, vodca 36.

As bebidas alcoólicas em geral podem ser divididas em dois grupos. As

bebidas fermentadas tais como vinho, cerveja, jeropiga, entre outros

fermentados, e as destiladas, que também passam por um processo fermentativo

e posterior destilação, tais como aguardente, conhaque, run, uísque, gim, arac,

mezcal, tequila, tiquira, pisco, vodca, etc. As bebidas alcoólicas fermentadas

possuem graduação alcoólica de 3 a 5% (v/v) para cervejas e de 5 a 7% para

vinhos. As bebidas destiladas possuem uma concentração mais elevada de

etanol, entre 38 a 54% (v/v). No Brasil a principal e genuína bebida destilada

denomina-se cachaça ou aguardente com fabricação no período colonial a partir

de 1534. A cachaça ocupa o terceiro lugar em bebida destilada a nível mundial

de produção com 1,3 bilhões de litros no Brasil. Cerca de 1 bilhão de litros

denomina-se cachaça de coluna e é produzida industrialmente e os alambiques

artesanais produzem o restante. As exportações da bebida são para mais de

50 países com volume de 15 milhões de litros com crescimento de 10% ao ano. A

meta a ser atingida é estar presente em todos os países do globo até 2010 com

um volume de 40 milhões de litros de acordo com Brazilian Program for the

Development of Cachaça (BPDAC) 37. A produção da cachaça é distribuída em

5 mil marcas, 30 mil produtores gerando 450 mil empregos diretos e 1300000



indiretos de acordo com Associação Brasileira de Bebidas Alcoólicas

(ABRABE)38. Essa pulverização na produção da cachaça faz com que seu sabor,

aroma e cor sejam os mais variados. Outras bebidas alcoólicas em destaques

são as cervejas com volume de consumo anual de 8,41 bilhões de litros (2002) e

o vinho com 300 milhões de litros. Independente do tipo da bebida alcoólica, tão

importante quanto a concentração de etanol vem a ser a concentração de

produtos secundários, que são regulamentados pela portaria nº 55 de 27 de julho

de 2004 e a instrução normativa nº 13 de 29 de junho de 2005 de

responsabilidade do Ministério da Agricultura e Abastecimento, que estabelece a

composição química e seus requisitos de qualidade para bebidas alcoólicas

destiladas com graduação alcoólica entre 38 a 54 % (Tabela 1).

Verifica-se na Tabela 1 que os principais compostos carbonílicos

regulamentados são acetaldeído, acroleína e furfural, sendo que estes dois

últimos são admitidos na concentração menor de 5 mg.100 mL-1 de álcool anidro.

Outros compostos carbonílicos estão ausentes da regulamentação, mas são

freqüentemente encontrados nas bebidas destiladas devido a oxidação do álcool

nos vários estágios da produção tais como formaldeído, propionaldeído,

valeraldeído, isovaleraldeído e o crontonaldeído39. Com base em efeitos de

exposição a cobaias e seus efeitos no DNA existem evidencias que o formaldeído

vem a ser desde irritante a carcinogênico40,41 e o acetaldeído um provável agente

carcinogênico ao humano42,43,44. Em trabalhos realizados para a cachaça foram

encontrados níveis de concentração média de 12,7 mg de aldeídos totais para

100mL-1 de etanol absoluto, sendo que o acetaldeído apresentou a maior

concentração entre os carbonílicos ( 20 mg.100 mL-1 etanol absoluto)48.



Tabela 1- Concentração (mg.100 mL-1) dos compostos orgânicos secundários

regulamentados para bebidas alcoólicas destiladas com etanol de 38 a 54% (v/v).

Conhaque Bagaceira Pisco Cachaça

min. max. min. max. min. max. min. max.

esteresa 200 300 200 200

furfuralb 5 5 5 5

aldeídoc 3 40 3 80 20 30

álcoold 150 400 5 600 120 300

Metanol 300 700 200 20

isobutanol 360

acroleína 5

sec-butanol 10

n-butanol 3

a acetato de etila; b furfural e hidroxifurfural c acetaldeído; álcoois superiores

expresso pela soma de n-propanol, isopropanol e isoamílico

Em um outro estudo foi avaliado a cachaça proveniente do destilador de inox

apresenta concentração superior de álcool amílico e acetato de etila em relação

ao destilador de cobre45. No caso das cetonas em 34 marcas de cachaça

analisadas foram encontrados valores máximos de 23 mg.L-1 para a propanona12.

Nesses trabalhos o método analítico para determinação dos compostos

carbonílicos foi baseado na derivatização com o DNPH e posterior análise por

HPLC. O emprego de um método de análise mais rápido, com maior

sensibilidade analítica, possibilidade de automação, e finalmente podendo tirar

outras informações, seria desejável para o aperfeiçoamento do controle de

qualidade de bebidas alcoólicas.



2 JUSTIFICATIVA

A produção das bebidas alcoólicas depende de uma matéria prima complexa

sob ação de processos fermentativos nos quais existe a importância vital de

microorganismos. Embora modernos métodos de biotecnologia sejam aplicados

na fabricação de bebidas, há uma dificuldade em manter um padrão de

qualidade uniforme, o que tem dificultado no aumento de exportação. Essa

complexidade está atrelada a inúmeras variáveis do processo. As bebidas

destiladas, por conterem mais etanol na sua composição, sofrem um processo

fermentativo mais intenso e conseqüentemente geram mais produtos secundários

que dificultam sua separação no processo de destilação. Inúmeros compostos

orgânicos podem ser produzidos e são ingeridos diretamente pelo consumidor.

Muitos desses compostos não são regulamentados e podem caracterizar um tipo

de bebida alcoólica. Com o uso de uma metodologia analítica mais abrangente

será possível trazer novas informações da composição das bebidas. O

conhecimento maior da cachaça juntamente com a análise quimiométrica poderá

caracterizar o tipo de bebida alcoólica, seja ela adulterada ou não, que está

disponível para consumo.



3 OBJETIVOS

Objetivo Geral

Caracterizar e diferenciar os diferentes tipos e procedências de cachaça,

bem como a adulteração através de quantificação de várias famílias de

compostos químicos.

Objetivo Específico

• Otimização da metodologia analítica para determinação de compostos

carbonílicos utilizando microextração em fase sólida juntamente com

cromatografia em fase gasosa após de derivatização com PFBHA e

detecção com captura de elétrons;

• Validação do método acima comparando com determinação por

cromatografia em fase líquida e detecção na região do Uv-vis após

derivatização com DNPH;

• Quantificação de outros compostos minoritários como álcoois e ésteres por

injeção direta;

• Investigar as possíveis correlações entre os compostos a serem

quantificados e as procedências e tipos de cachaça aplicando a

ferramenta quimiométrica;



4 ESTRATÉGIA DE TRABALHO

4.1 Critério para escolha da bebida alcoólica

Será estudada a cachaça, de diferentes procedências e tipos tais como

envelhecida, transparente, amarela46, tipo exportação, por ser a principal

representante e de grande preferência do mercado de bebidas destiladas

nacional38.

4.2 Otimização das condições analíticas para compostos carbonílicos e

outros voláteis

A técnica SPME de extração e pré-concentração deve ser utilizada

juntamente com cromatografia a gás para os compostos carbonílicos (C1~C8) e

outros compostos voláteis. Para a análise de carbonílicos deve-se utilizar o

sorvente polimetilsiloxano (PDMS) com característica apolar empregando o

detector de captura de elétrons (ECD), enquanto para outros compostos voláteis

será utilizados outro sorvente o poliacrilato (PA) com característica polar e o

detector de ionização de chama (FID) e/ou espectrometria de massas (MS).

4.3 Parâmetros de validação

As estratégias de validação de um método dependem entre outros fatores

da instrumentação disponível e dos propósitos analíticos. Nesse trabalho serão

avaliados parâmetros tradicionais tais como determinação de repetibilidade,



linearidade, limites de detecção e quantificação para todas as classes de

compostos orgânicos analisados. Devido a ausência de material de referência

certificado para análise de compostos orgânicos em bebidas alcoólicas

destiladas, a exatidão dos métodos propostos será avaliada por procedimentos

de recuperação. A adição de padrão interno ou adição de padrão se torna uma

alternativa interessante no processo de validação. Na análise de álcoois e

ésteres serão analisados por cromatografia a gás utilizando o padrão interno 3

pentanol 32. No caso da análise de carbonílicos com o método com HPLC será

utilizados a adição de padrão em triplicata com três níveis de concentração na

amostra para que sejam determinados os níveis de recuperação47. A equivalência

analítica será realizada entre a análise de compostos carbonílicos com o método

SPME proposto comparada com o método usual com HPLC para bebidas

alcoólicas48. Os resultados obtidos a partir das duas metodologias serão tratados

estatisticamente a fim de se avaliar suas variâncias ( 2

1s e 2

2s )49. A razão entre 2

1s e

2

2s nos fornece o teste estatístico F que é comparado com o valor de F crítico

(Fcrít) em um determinado nível de confiança. Caso seja F < Fcrít poderemos

concluir que as duas metodologias fornecem precisões equivalentes50,51.

A qualidade do desempenho dos cromatógrafos utilizados será

constantemente avaliada a partir de soluções padrão de álcoois para análise no

GC/FID, carbonílicos derivados com DNPH para HPLC, pesticidas (aldrin e

lindane) para GC/ECD e perfluortributilamina para GC/MS. A partir dos resultados

obtidos será construído um gráfico de controle estabelecendo os limites de

variação que são permissíveis para cada medida52.



5 MATERIAL E MÉTODO

5.1 Metodologia de análise

Para a análise dos compostos de interesse serão utilizadas as seguintes

técnicas:

• Cromatografia a gás com injeção direta para análise de álcoois e ésteres

• Cromatografia a gás acoplada a SPME e cromatografia a líquido para

análise de compostos carbonílicos (C1~C8)

• Cromatografia a gás acoplada a SPME para análise de outros compostos

voláteis

Todos os equipamentos a serem utilizados estão disponíveis no

Departamento de Química Fundamental do IQ-USP.

5.2 Análise de metanol, álcoois superiores e ésteres por GC

Na análise de metanol, álcoois superiores (isopropanol, isobutanol, 3 metil 1

butanol) e ésteres (acetato de etila) serão utilizadas as condições descritas na

literatura53 para a cromatografia a gás com a coluna capilar de polietilenoglicol

com o detector de ionização de chama (FID). As condições, se necessário, serão

otimizadas para melhorar a separação das espécies estudadas.



5.3 Análise de carbonílicos por SPME-GC (C1~C8)

Inicialmente serão empregadas as condições de análises para compostos

carbonílicos (formaldeído, acetaldeído, acetona, acroleína, propionaldeído,

crotonaldeído, butiraldeído, benzaldeído e valeraldeído) derivatizados com o

agente PFBHA54 extraídos em sistema headspace com microextração em fase

sólida (HS-SPME)55,, utilizando o sorvente polidimetilsiloxano. Para a

quantificação será utilizado o cromatógrafo a gás com a coluna capilar 5% fenil e

95 % dimetilpolisiloxano com detector de captura de elétrons. Estas condições

devem ser avaliadas para análise de cetonas (ciclopentanona, 2,3 butanodiona e

acetofenona), aldeídos furânicos (5 hidroxi furfural e furfural) e, se necessário,

serão otimizadas para melhorar o método de análise.

5.4 Análise de compostos carbonílicos por HPLC

Para a avaliação da performance analítica da metodologia de análise de

compostos carbonílicos por SPME-GC/ECD e análise dos outras cetonas

(ciclopentanona, 2,3 butanodiona e acetofenona)12 e aldeídos furânicos (5 hidroxi

furfural e furfural)56, será empregada cromatografia líquida (HPLC) em fase

reversa. Os compostos carbonílicos serão derivatizados com o agente DNPH e

quantificados por HPLC com a fase estacionária octadecilsilano (C18) com o

detector Uv-vis.



5.5 Compostos voláteis por SPME-GC/MS-FID

Os compostos voláteis das bebidas destiladas serão extraídos diretamente

pela técnica de headspace associada a microextração em fase sólida (HS-SPME)

com o sorvente poliacrilato57. Para a separação será utilizado o cromatógrafo a

gás com a coluna capilar de polietilenoglicol com o detector de espectrometria de

massas (GC-MS) no modo scan e ionização de chama. A identificação dos

compostos será realizada através da comparação dos espectros de massas com

a biblioteca NIST 98 (National Institute of Standards and Technology). Estas

condições, se necessário, serão otimizadas para melhorar o método de análise.

6 ANÁLISE DE RESULTADOS

Os resultados obtidos serão submetidos a métodos quimiométricos tais como

PCA e cluster para sua interpretação. Será utilizado o programa Statistica versão

6.0 (Statsoft Inc., Tulsa-Ok, USA ) que permite analisar parâmetros de estatística

básica a avançada, bem como análise multivariada. Pretende-se fazer um

possível agrupamento entre as diferentes cachaças e sua composição química58.

Esse possível agrupamento poderá servir de ferramenta na diferenciação dos

tipos de cachaça, e na possível avaliação de adulteração.



8.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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