APÊNDICE A: CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA DA FLORA...
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Apêndice A i APÊNDICE A: CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA DA FLORA DO IOGURTE Material Iogurte Iogurte comercial Meio de cultura L-S Differencial Medium [L-S (DM)] Solução de diluição Água de peptona Reagentes Violeta de cristal Solução de lugol Safranina Cloreto de 2,3,5 – trifeniltetrazolio (TTC) Álcool a 95º Equipamento Fósforos Ansa de inoculação Bico de Bunsen Esguicho com álcool a 70º Esguicho com água destilada Papel absorvente Marcador Caixas de Petri Tubos de ensaio e respectivo suporte Erlenmeyer Vareta de vidro Pipetas de 1 mL esterilizadas Estufa Banho-maria Vórtex Microscópio, lâminas, lamelas e óleo de imersão Preparação e execução do ensaio Preparação da solução de diluição e do meio de cultura A solução de diluição a utilizar é a água de peptona cuja composição e modo de preparação são a seguir descritos: Solução de diluição Composição Peptona trípsica de caseína 0.05 g Peptona pépsica de carne 0.05 g Água destilada 100 mL
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Apêndice A
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APÊNDICE A: CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA DA FLORA DO
IOGURTE Material
Iogurte Iogurte comercial
Meio de cultura L-S Differencial Medium [L-S (DM)]
Solução de diluição Água de peptona
Reagentes Violeta de cristal
Solução de lugol
Safranina
Cloreto de 2,3,5 – trifeniltetrazolio (TTC)
Álcool a 95º
Equipamento Fósforos
Ansa de inoculação
Bico de Bunsen
Esguicho com álcool a 70º
Esguicho com água destilada
Papel absorvente
Marcador
Caixas de Petri
Tubos de ensaio e respectivo suporte
Erlenmeyer
Vareta de vidro
Pipetas de 1 mL esterilizadas
Estufa
Banho-maria
Vórtex
Microscópio, lâminas, lamelas e óleo de imersão
Preparação e execução do ensaio
Preparação da solução de diluição e do meio de cultura
A solução de diluição a utilizar é a água de peptona cuja composição e modo de
preparação são a seguir descritos:
Solução de diluição
Composição Peptona trípsica de caseína 0.05 g
Peptona pépsica de carne 0.05 g
Água destilada 100 mL
Apêndice A
ii
Preparação Dissolver os componentes, em água destilada, aquecendo até à ebulição, se
necessário.
Verter 9 mL de solução de diluição por tubo de ensaio. Preparar um dos tubos
com algumas contas de vidro.
Autoclavar a 121º C durante 15 minutos.
O meio de cultura a utilizar é o L-S Differencial Medium da Oxoid que designar-se-á por
L-S (DM). Apresenta-se em seguida a sua composição e modo de preparação.
Meio de cultura L-S (DM) A. Meio base
Composição Triptona 1.0g
Pó de Lab-Lemco 0.5g
Peptona de Soja 0.5g
Extracto de Levedura 0.5g
Dextrose 2.0g
Cloreto de Sódio 0.5g
Cloridrato de L-cisteína HCl 0.03g
Agar 1.3g
Água destilada 100 mL
Preparação Dissolver os componentes, em água destilada, aquecendo até à ebulição.
Ajustar, se necessário, o pH de modo a que depois da esterilização seja
6.1±0.1 a 25 ºC.
Verter 9 mL de meio por tubo de ensaio.
Autoclavar a 121º C durante 15 minutos.
Arrefecer os tubos de ensaio, com o meio base, em banho-maria até os 50 ºC.
B. Preparar um tubo de ensaio com 20 mL de leite magro a 10%, isento de
antibióticos e/ou outros inibidores.
Autoclavar a 115 ºC durante 15 minutos:
Manter o tubo de ensaio a 50 ºC no banho-maria.
C. Preparar um tubo de ensaio com uma solução de cloreto de 2,3,5 –
trifeniltetrazolio (TTC) a 2%.
Esterilizar por filtração.
Manter o tubo de ensaio a 50 ºC no banho-maria.
Apêndice A
iii
D. Meio de cultura final
Adicionar a cada tubo de ensaio contendo o meio base (já preparado) 1 mL de
leite e 100 µL de solução TTC a 2%.
Manter o tubo de ensaio a 50 ºC.
NOTA: Todas as operações abaixo indicadas têm de ser executadas junto à chama de um bico
de Bunsen com os cuidados normais de assepsia.
Preparação da amostra
Homogeneizar bem um iogurte natural com a ajuda de uma vareta de vidro
esterilizada à chama.
Retirar 1.0 mL do iogurte e juntar a um tubo de ensaio com 9.0 mL de água de
peptona com contas de vidro (a suspensão deve ser agitada no vórtex por forma a obter uma
suspensão uniforme).
Preparação das diluições da amostra
Após obter uma suspensão uniforme e porque esta possui com toda a certeza
um elevado número de bactérias, é necessário diluir a amostra inicial. Fazer diluições decimais
que se representarão pelos respectivos algoritmos (-1 = 1/10 = 0.1; -2 = 1/100 = 0.01;...-9)
Para preparar uma diluição decimal pipeta-se uma unidade da diluição anterior
ajustando a dez unidades
Exemplo: Preparação de uma diluição1/1000 [-3]
- 1º passo – diluição 1/10 [-1]: adicionar 1.0 mL da solução mãe a 9.0 mL de
solução de diluição.
- 2º passo – diluição 1/100 [-2]: adicionar 1.0 mL da solução 1/10 a 9.0 mL de
solução de diluição.
- 3º passo – diluição 1/1000 [-3]: adicionar 1.0 mL da solução 1/100 a 9.0 mL de
solução de diluição.
Marcar os tubos de ensaio, contendo a solução de diluição, com o logaritmo
das diluições pretendidas (-1 a -9).
Preparar as diluições da amostra como se exemplificou acima.
Sementeira por incorporação
Juntar 1.0 mL da diluição -5 à solução de diluição de um dos tubos de ensaio
com o meio.
Agitar vigorosamente o tubo com ajuda do vórtex.
Verter, assepticamente, o conteúdo deste tubo para dentro de uma caixa de
petri esterilizada.
Apêndice A
iv
Repetir o procedimento atrás para cada diluição duas vezes.
Marcar as caixas de Petri.
Repetir os passos anteriores para as diluições -6, -7, -8 e -9.
Proceder à incubação em estufa a 37 ºC durante 48 h. As caixas de Petri
devem ficar em posição invertida.
Observação dos resultados Observar as caixas de Petri.
Seleccionar algumas colónias (as mais isoladas), fazer a coloração de Gram,
que se encontra imediatamente descrita, e observar ao microscópio.
Coloração de Gram Corar o esfregaço preparado com uma gota de violeta de cristal.
Agitar suavemente durante cerca de 60 segundos.
Lavar com água corrente (a água deve começar a correr numa extremidade da lâmina
e passar por cima do esfregaço).
Inundar com soluto de Lugol.
Agitar suavemente durante cerca de 60 segundos.
Lavar com água corrente.
Secar suavemente com papel de filtro.
Descorar com álcool etílico da farmácia a 96 %.
Agitar suavemente durante cerca de 30 segundos.
Secar suavemente com papel de filtro.
Corar com solução de safranina 0,25 %.
Agitar suavemente durante cerca de 30 segundos.
Lavar com água corrente.
Secar suavemente com papel de filtro.
Observar ao microscópio com a objectiva de imersão (100 x).
O álcool etílico nas Gram negativas remove os lípidos da membrana externa da parede
celular, aumentando a sua permeabilidade; assim, o complexo violeta de cristal-iodo no interior
das células pode ser extraído por descoloração, ficando estas bactérias coradas de vermelho
(safranina).
As bactérias Gram positivas, por terem baixo teor lipídico não são afectadas; pelo
contrário, são desidratadas pelo álcool, o que leva à redução da permeabilidade e coloração do
complexo violeta de cristal-iodo.
Apêndice B
v
APÊNDICE B: PREPARAÇÃO DOS MEIOS DE CULTURA E DO
TAMPÃO PBS PREPARAÇÃO DO MEIO LÍQUIDO DE CULTURA MRS (OXOID)
1. Pesar directamente num matraz 52.0 g de meio MRS broth em pó;
2. Adicionar 1 L de água destilada;
3. Colocar o matraz sobre uma placa de agitação e de aquecimento;
4. Corrigir o pH para 6.1±0.2;
5. Deixar levantar fervura e autoclavar a 121 °C durante 15 minutos.
PREPARAÇÃO E COMPOSIÇÃO DO MEIO LÍQUIDO DE CULTURA YEPD
Um dos meios utilizados para crescer S. cerevisiae consiste na composição:
Peptona 20.0 g
Extracto de levedura 10.0 g
Glucose 20.0 g
Água destilada 1000.0 mL
1. Pesar cada um dos reagentes em separado;
2. Adicionar 1 L de água destilada;
3. Colocar o matraz sobre uma placa de agitação e de aquecimento;
4. Corrigir o pH para 7.0±0.2;
5. Deixar levantar fervura e autoclavar a 121 °C durante 15 minutos.
NOTA: Para preparar os meios MRS e YEPD sólidos procede-se do mesmo modo, depois de
adicionar uma concentração de 14 g/L de agar.
PREPARAÇÃO E COMPOSIÇÃO DO TAMPÃO PBS A PH = 7,2 O tampão PBS com pH =7,2 pode ser preparado com a composição:
Di – Hidrogenofosfato de potássio (KH2PO4) 0.34 g
Hidrogenofosfato de di-potássio (K2HPO4) 1.21 g
Cloreto de sódio (NaCl) 8.00 g
Água destilada 1000.0 mL
1. Pesar cada um dos reagentes em separado;
2. Adicionar 1 L de água destilada;
Apêndice C
vi
APÊNDICE C: TÉCNICAS DE MICROBIOLOGIA CULTIVO DE CÉLULAS LIOFILIZADAS CONGELAMENTO D
CONGELAMENTO DE CULTURAS
Esterilizar eppendorfs, pontas azuis, glicerol e meio de cultura.
À chama juntar 1 mL de cultura overnight com 300 µL de glicerol.
Colocar em gelo durante 10 minutos.
Congelar a –80 ºC.
DESCONGELAMENTO DE CULTURAS Retirar da arca a –80 ºC.
Pôr em congelador a –20 ºC algumas horas.
Colocar à temperatura ambiente.
Inocular em meio adequado
1. Ampola que contém cultura de interesse liofilizada.
2. Usar luvas de protecção! Aquecer a extremidade da ampola.
3. Colocar duas ou três gotas de água na extremidade quente para partir o vidro.
4. Cuidadosamente retirar a extremidade de vidro.
5. Deixar entrar um pouco de ar e depois remover o algodão.
6. Introduzir aproximadamente 0,5 mL de meio adequado e misturar bem.
7. Transferir o volume da mistura para o meio líquido ou sólido adequado. Permitir uma re- hidratação lenta da cultura.
8. Incubar a cultura nas condições óptimas de crescimento.
9. Antes de deixar fora, esterilizar a ampola.
Apêndice D
vii
APÊNDICE D: DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO CELULAR
PELO MÉTODO DA CONTAGEM POR TURBIDIMETRIA O método da contagem por turbidimetria baseia-se na lei de Lambert-Beer. Esta lei
mostra que, quando um feixe de luz incidente atravessa uma suspensão de microrganismos,
sofre uma diminuição de intensidade proporcional, dentro de certos limites, à concentração de
células em suspensão. A lei assume o aspecto final: A = K.C em que A é a absorvência da
suspensão e C a sua concentração celular. A linearidade da equação, devida à constante K, só
ocorre para valores de absorvência inferiores a 0,70, onde a reflexão e a dispersão da luz pela
suspensão são fenómenos pouco importantes. Ou seja, a quantidade de luz que atinge o
detector é apenas afectada pela absorção da luz incidente por parte da suspensão celular.
Procedimento experimental:
Montar o sistema de filtração. Pesar 5 membranas estéreis.
Retirar três amostras de 5 mL e uma de 10 mL da suspensão celular.
Filtrar individualmente as três amostras de 5 mL, lavando a biomassa retida no filtro
com 15 mL de água destilada.
Preparar o branco em duplicado, filtrando 20 mL de água destilada por cada
membrana.
Colocar as membranas sobre uma folha de alumínio, dentro de placas de Petri e
proceder à secagem numa estufa a 80 º C durante toda a noite.
Com a amostra de 10 mL, fazer a leitura preliminar no espectrofotómetro e fazer as
diluições de modo a possibilitar a construção de uma curva padrão (densidades ópticas a 620
nm entre 0,2 e 0,8).
Medir a absorvência.
Pesar as membranas depois de as deixar arrefecer num exsicador para evitar adsorção
de vapor de água. Descontar o peso médio dos controlos.
Calcular o peso seco (g/L) das diluições, com base no valor obtido para a amostra.
Construir uma curva padrão tendo em abcissas os valores de absorvência e em
ordenadas o peso seco em g/L.
Retirar uma amostra da suspensão celular a analisar, proceder às diluições
necessárias e ler a absorvência a 620 nm.
Com auxílio da curva padrão, determinar a concentração celular.
De acordo com este procedimento as curvas obtidas para os bacilos e leveduras foram,
no espectrofotómetro JASCO, respectivamente:
Conc. bacilos ( g/L) = 0.0624 DO(620 nm) – 0.0028 R2 = 0.9987
Conc. leveduras (g/L) = 0.1959 DO(620 nm) – 0.0098 R2 = 0.9933
Apêndice E
viii
APÊNDICE E: EXEMPLIFICAÇÃO DE CÁLCULOS PARTE I CONVERSÃO DO NÚMERO DE CÉLULAS OBSERVADAS NA CÂMARA DE NEUBAUER PARA
CONCENTRAÇÃO (N º CÉLULAS/ML) A câmara de Neubauer consiste numa lâmina de microscopia, bem mais alta do que
uma lâmina normal, com marcações em quadrantes, de medidas conhecidas. Observando-se
ao microscópio, percebe-se que existem três tipos de quadrantes denominados A, B e C, que
juntos formam um quadrado maior.
Figura E.1. Retículos da câmara de Neubauer A área total compreendida pelos 9 quadrantes é de 9 mm2 sendo que cada quadrante
(A, B e C) são quadrados de 1 x 1 mm. Ao ser colocada a lamela a distância desta até a lâmina
(profundidade) mede 0,1 mm, o que permite se obter um volume de 0,1 mm3 em cada
quadrante.
O quadrante C divide-se em 25 sub-quadrantes com 0,2 mm de lado. As células são
contadas nos quatro cantos (quadrados c) e no sub-quadrante central. Esses quadrados mais
pequenos encontram-se ainda divididos em 16 quadradinhos de 0,05 mm de lado. O volume de
cada um dos quadrados c é 0,2 × 0,2 × 0,1 mm3 = 0,004 mm3 = 4 × 10 6 cm3. Nas tabelas
apresentadas na secção “Apêndice F: Observações Experimentais” estes sub-quadrantes c
vêm designados por H1,H2,H3,H4 e H5.
A determinação do número de microrganismos por volume pode ser calculado fazendo:
Tomando como exemplo o ensaio A da parte I, para 1 mL de volume recolhido, no caso
dos bacilos vem
6104......º/º −×
=cquadradosdiferentesnoscélulasdemedionmLsmosmicrorganin
6104
52
002
102
022
102
00
/º −×
⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛⎟⎠⎞
⎜⎝⎛ +
+⎟⎠⎞
⎜⎝⎛ +
+⎟⎠⎞
⎜⎝⎛ +
+⎟⎠⎞
⎜⎝⎛ +
+⎟⎠⎞
⎜⎝⎛ +
=mLcélulasn=100000 bacilos/ mL
Apêndice E
ix
PARTE II CONVERSÃO DO NÚMERO DE CÉLULAS OBSERVADAS EM LÂMINA SIMPLES PARA
CONCENTRAÇÃO (N º CÉLULAS/ML) A forma mais correcta de determinar a concentração de microrganismos numa
amostra, em termos de número de células por volume, implica captarem-se várias imagens
(normalmente vinte e cinco) em diferentes pontos da lamela. Para evitar repetir a contagem de
uma mesma célula, e o valor de concentração estimado ser mais plausível, procede-se, em
geral, como está ilustrado na Figura E.2., isto é, as fotografias são tiradas ao longo de uma
trajectória, previamente, determinada.
Figura E.2. Esquema da lâmina com os percursos a seguir na lamela para determinação da
concentração de microrganismos de uma amostra.
Em seguida procede-se à contagem das células em estudo, para cada uma das
imagens captadas, e calcula-se o respectivo valor médio. A partir daqui são extremamente
importantes as características do microscópio e do programa de aquisição de imagem.
O programa de aquisição de imagem empregado foi o programa Axioskop. Este
programa indica, para a ampliação correspondente, a relação que existe entre micrómetros e
pixeis. Com o valor da resolução da imagem, calcula-se a área da fotografia em termos de
pixeis. De forma mais clara, nos ensaios realizados utilizou-se uma ampliação que verificava a
relação de 0,26408451 micrómetros/pixeis para o eixo X e Y. Uma vez que a resolução era de
1300 (eixo X) ×1030 (eixo Y) micrómetros, determinou-se o valor da área de cada fotografia,
sendo este de 93382,70 pixeis. Com o valor médio de células por fotografia e a sua área, pode
determinar-se a concentração:
( )22 .......ºº.
mfotografiacadadeÁreasfotografianascélulasdemedion
mcélulasncélulasConc
µµ=⎟⎟
⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛
No caso do ensaio A da parte II para os bacilos, por exemplo, vem:
2.00013056,070,93382
19231,12.m
bacilosbacilosConcµ
==
O valor encontrado corresponde à concentração de células numa fotografia. Este valor
de concentração pode ser alargado à lamela, dado que é conhecida a área das lamelas
utilizadas – 20 × 20 mm. Vem então, seguindo o mesmo exemplo:
Apêndice E
x
( )22 ..º.º. mmlameladaÁrea
mmbacilosnbacilosConc
lamelabacilosnbacilosConc ×⎟
⎠⎞
⎜⎝⎛=⎟
⎠⎞
⎜⎝⎛
lamelabacilosbacilosConc .52225202056,130. =××=
Conhecendo o volume de amostra que se deita na lâmina (15 µL), e partindo do
princípio de que a gota fica uniformemente espalhada pela lamela, calcula-se o valor da
concentração de células na lamela em termos de número de células por volume. Ainda com o
mesmo exemplo:
( )LVolumelamelabacilosnbacilosConc
LbacilosnbacilosConc
µµ .
º.º.
⎟⎠⎞
⎜⎝⎛
=⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛
LbacilosbacilosConcµ
348215
52225. ≅=
Uma vez que neste trabalho é atribuída uma grande importância à forma das células,
era necessário, além de observá-las ao microscópio e saber se estavam ou não aglomeradas,
conhecer as suas dimensões.
Esse conhecimento, depois de avaliar os programas de tratamento de imagem
disponíveis, foi auxiliado pelo programa Sigma Scan Pro 5, que tem-se mostrado satisfatório,
sobretudo, na contagem de objectos. Em seguida exemplifica-se como o programa permite a
determinação do tamanho de bacilos.
Figura E.3. Fotografia de L.bulgaricus captada com uma ampliação de 40×10 DIC no
microscópio Leitz do Laboratório de Imagem do DEB, a ser tratada pelo Sigma Scan Pro 5,
inicialmente.
Apêndice E
xi
Figura E.4.Fotografia de L.bulgaricus captada com uma ampliação de 40×10 DIC no
microscópio Leitz do Laboratório de Imagem do DEB, e modificada pelo Sigma Scan Pro 5 com
base na diferença de cor.
Figura E.5. Fotografia de L.bulgaricus captada com uma ampliação de 40×10 DIC no
microscópio Leitz do Laboratório de Imagem do DEB, modificada pelo Sigma Scan Pro 5 e a
ser optimizada para a contagem dos objectos e determinação das suas dimensões.
Apêndice E
xii
Figura E.6. Fotografia de L.bulgaricus captada com uma ampliação de 40×10 DIC no
microscópio Leitz do Laboratório de Imagem do DEB, modificada pelo Sigma Scan Pro 5 e a
serem definidos os parâmetros de interesse para avaliação das suas dimensões.
Figura E.7. Fotografia de L.bulgaricus captada com uma ampliação de 40×10 DIC no
microscópio Leitz do Laboratório de Imagem do DEB, modificada pelo Sigma Scan Pro 5 e com
o número de objectos contados e com a área, comprimento e altura de cada um dos objectos
numa folha de cálculo Excel.
Apêndice E
xiii
Foi a partir da folha de Excel e a observar cada um dos objectos contados nas imagens
modificadas pelo Sigma Scan Pro 5, tentando desprezar resíduos e lixos, que se elaboraram as
tabelas de distribuição de tamanhos e histogramas apresentados no Apêndice F –
Observações Experimentais.
Ao iniciar a contagem das diferentes células, depois de realizar um ensaio de filtração,
preenchia-se uma tabela semelhante à Tabela F.16. das Observações Experimentais – Parte II
, e desencadeavam-se todas as tabelas seguintes. Os cálculos envolvidos são muito parecidos
aos já descritos e/ou bastante óbvios pelo que não são aqui exemplificados.
Apêndice F
xiv
APÊNDICE F: OBSERVAÇÕES EXPERIMENTAIS PARTE I
Na primeira parte do trabalho realizaram-se os ensaios A, B e C. São apresentadas,
inicialmente, as condições com que se cumpriram estes ensaios.
Tabela F.1 – Propriedades da coluna e do leito de filtração nos ensaios A, B e C durante a
parte I da investigação.
Propriedades da coluna e do leito de filtração Altura do leito 16,7 cm Volume do leito 231,37 cm3 Volume de espaços vazios 48 cm3 Porosidade 0,217 Posição da bomba 30
Recorreu-se ao microscópio invertido do laboratório de imagem do DEB para observar
as amostras na câmara de Neubauer. O microscópio invertido foi utilizado com as propriedades
descritas na Tabela F.2.
Tabela F.2 – Características do microscópio utilizado nos ensaios A, B e C durante a parte I da
investigação.
Características do microscópio invertido Potenciómetro 6 V Objectiva 40x Filtro acima da objectiva PH2,2 Condensador Todo voltado para cima Polarizador Todo aberto
Para avaliação das dimensões dos microrganismos utilizou-se o programa Image Pro
Plus.
No final de cada um destes primeiros ensaios de filtração agitava-se a amostra a
analisar (enquanto as outras eram mantidas a 4ºC). Um pequeno volume desta amostra era
colocado, de forma adequada, na câmara de Neubauer e observado no microscópio de luz
invertida do Laboratório de Imagem do DEB. Fazia-se, então, a contagem das células, em duas
leituras, anotando-se os valores para cada um dos cinco pequenos quadrados (H1, H2,...) do
retículo central. Este procedimento era repetido para cada amostra, tendo-se obtido as Tabelas
F.3, F.4 e F.5.
O ensaio A prosseguiu com leveduras S.cerevisiae com 5,3 µm de diâmetro médio e
Lactobacillus bulgaricus com 4,3 µm de comprimento médio. As concentrações iniciais das
leveduras e dos bacilos, determinadas com a câmara de Neubauer, foram de, respectivamente,
2,805×107 células/mL e 6,915x107 células/mL.
Apêndice F
xv
Tabela F.3 – Número de leveduras (L) e bacilos (B) observados no retículo central da câmara
de Neubauer ao longo do volume recolhido, com uma ampliação de 40×10 DIC no microscópio
invertido, para o ensaio A da parte I. Câmara de Neubauer
H1 H2 H3 H4 H5 Volume
(mL) Leitura
L B L B L B L B L B 1ª 2 0 1 0 0 2 1 0 0 0 1 2ª 0 0 1 1 0 0 1 1 1 0 1ª 0 0 0 1 0 0 1 1 0 1 2 2ª 0 1 0 0 0 1 0 2 0 1 1ª 0 0 1 3 0 1 0 1 0 1 3 2ª 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1ª 2 0 0 3 1 0 0 1 0 1 4 2ª 0 1 1 0 1 1 0 2 0 0 1ª 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 5 2ª 1 0 0 1 1 2 0 1 1 2 1ª 0 0 5 2 2 4 2 1 1 3 6 2ª 1 0 2 1 0 1 0 1 2 1 1ª 0 0 0 2 0 0 0 3 2 1 7 2ª 1 0 1 3 0 2 3 0 3 1 1ª 1 1 0 1 0 0 0 2 0 3 8 2ª 0 2 0 0 0 1 0 0 0 1 1ª 1 0 1 1 4 2 2 1 4 1 9 2ª 1 0 0 1 3 1 0 0 0 3 1ª 3 4 3 4 2 3 3 2 2 4 10 2ª 3 6 5 5 6 2 4 2 6 1 1ª 0 1 0 2 1 0 1 3 0 1 11 2ª 0 0 0 4 1 2 0 2 1 1 1ª 0 2 0 1 1 0 1 0 1 1 12 2ª 0 0 0 1 0 3 0 1 0 3 1ª 0 2 0 0 0 0 1 0 1 1 13 2ª 0 1 1 0 0 1 0 0 1 1 1ª 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 14 2ª 1 0 0 2 0 0 0 1 1 0 1ª 0 1 0 2 0 3 1 0 0 1 15 2ª 0 1 0 2 0 1 0 0 1 2 1ª 0 3 1 1 1 1 1 2 1 4 16 2ª 1 12 1 6 0 8 1 3 1 8 1ª 0 2 0 1 1 3 0 2 0 1 17 2ª 0 3 2 2 0 3 0 2 0 2 1ª 1 3 0 1 0 1 0 33 0 3 18 2ª 1 1 0 0 0 6 1 2 0 1 1ª 1 2 0 1 0 3 1 4 1 2 19 2ª 2 4 2 5 0 2 7 0 1 5 1ª 2 1 1 4 2 5 1 4 1 5 20 2ª 2 1 1 2 0 2 5 2 1 1
Apêndice F
xvi
No ensaio B o diâmetro médio das leveduras era 6,1 µm e a concentração usada,
determinada por contagem na câmara de Neubauer, foi de 3,105×107 células/mL. O
comprimento dos bacilos era de 4,07 µm e a concentração usada foi de 4,665×107 células/mL.
Tabela F.4 – Número de leveduras (L) e bacilos (B) observados no retículo central da câmara
de Neubauer ao longo do volume recolhido, com uma ampliação de 40×10 DIC no microscópio
invertido, para o ensaio B da parte I.
Câmara de Neubauer H1 H2 H3 H4 H5 Volume
(mL) Leitura L B L B L B L B L B
1ª 1 3 2 1 2 1 3 2 2 0 1
2ª 3 0 2 1 0 1 5 2 1 2 1ª 1 1 8 4 6 2 0 2 1 2
2 2ª 7 1 1 2 21 1 1 1 2 2 1ª 1 3 5 0 0 1 0 0 2 2
3 2ª 0 1 0 1 0 2 1 1 0 1 1ª 4 2 2 1 4 1 8 0 1 1
4 2ª 1 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1ª 0 1 1 3 0 2 1 3 0 3
5 2ª 0 2 2 0 0 2 1 2 2 2 1ª 0 4 1 1 0 1 1 4 0 4
6 2ª 0 2 1 1 0 3 0 1 3 1 1ª 0 2 0 1 0 1 0 1 0 0
7 2ª 0 0 0 1 1 2 1 0 0 0 1ª 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
8 2ª 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1ª 1 0 0 2 0 0 0 1 1 0
9 2ª 0 0 1 5 1 3 0 0 3 2
1ª 0 1 1 4 0 1 1 1 0 0 10
2ª 0 2 0 2 0 3 2 0 0 0 1ª 2 4 0 3 1 1 1 4 2 4
11 2ª 0 2 0 2 1 1 0 2 1 3 1ª 3 0 0 3 0 3 1 5 1 2
12 2ª 0 3 0 2 0 2 0 1 0 0 1ª 0 7 0 1 2 6 0 3 0 2
13 2ª 0 2 0 3 1 3 0 2 0 1 1ª 3 2 1 3 0 5 1 2 0 4
14 2ª 0 0 2 3 1 0 0 3 2 2 1ª 0 3 0 3 0 0 0 3 0 2
15 2ª 0 0 0 2 0 0 0 1 1 1 1ª 0 2 0 3 0 1 0 2 0 3
16 2ª 0 0 1 2 0 4 0 1 0 3 1ª 0 1 0 2 0 0 0 0 0 1
17 2ª 0 1 0 2 1 1 1 0 0 1 1ª 0 0 3 0 0 1 2 1 0 1
18 2ª 2 0 0 2 0 0 1 3 1 1 1ª 0 0 0 4 0 1 2 0 2 0
19 2ª 0 0 0 1 0 1 0 2 0 0 1ª 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0
20 2ª 0 1 0 1 0 2 0 1 0 2
Apêndice F
xvii
No ensaio C utilizaram-se S.cerevisiae com 5,6 µm de diâmetro e Lactobacillus
bulgaricus com 3,73 µm de tamanho médio. Respectivamente as concentrações iniciais foram
de, 2,045×107 células/mL e 5,555x107 células/mL.
Tabela F.5 – Número de leveduras (L) e bacilos (B) observados no retículo central da câmara
de Neubauer ao longo do volume recolhido, com uma ampliação de 40×10 DIC no microscópio
invertido, para o ensaio C da parte I.
Câmara de Neubauer H1 H2 H3 H4 H5 Volume
(mL) Leitura L B L B L B L B L B
1ª 1 0 0 0 2 0 2 0 1 0 1
2ª 0 0 0 0 2 0 1 0 2 3 1ª 5 0 4 0 6 0 5 1 6 0
2 2ª 4 0 3 0 4 0 8 0 8 0 1ª 1 0 0 0 0 0 1 0 1 0
3 2ª 0 0 1 1 0 1 1 0 1 0 1ª 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1
4 2ª 1 0 0 0 0 0 0 3 1 0 1ª 0 1 0 0 0 0 0 2 0 2
5 2ª 1 0 0 0 1 0 0 1 1 0 1ª 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
6 2ª 0 0 0 0 1 0 1 1 3 3 1ª 0 1 0 2 0 1 0 1 1 1
7 2ª 0 1 1 1 0 2 0 1 0 2 1ª 3 2 5 3 0 0 0 1 3 2
8 2ª 1 2 0 1 1 1 0 1 0 1 1ª 0 2 0 0 0 1 0 0 1 0
9 2ª 0 0 0 1 0 1 0 1 0 1 1ª 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0
10 2ª 0 1 1 1 0 1 0 2 3 0 1ª 0 1 0 2 1 1 1 0 0 3
11 2ª 1 1 0 1 0 0 4 1 0 2 1ª 0 0 2 3 0 3 0 2 2 5
12 2ª 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1ª 1 2 0 1 1 2 0 0 1 0
13 2ª 0 0 0 1 0 3 0 3 1 1 1ª 0 1 0 1 0 1 0 0 1 1
14 2ª 1 0 1 1 0 0 0 1 0 1 1ª 0 1 0 1 0 0 2 2 2 1
15 2ª 0 0 0 1 2 0 0 0 0 1 1ª 0 0 1 1 0 0 0 0 2 0
16 2ª 1 2 0 2 1 2 0 1 0 1 1ª 0 0 0 1 1 1 1 0 2 0
17 2ª 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1ª 2 0 0 0 0 1 0 1 0 0
18 2ª 1 0 1 2 1 0 0 3 0 1 1ª 1 4 0 1 0 3 0 1 2 1
19 2ª 2 2 0 1 0 2 0 1 1 2 1ª 0 0 0 0 1 1 2 0 0 0
20 2ª 0 1 0 1 1 1 0 0 0 1
Apêndice F
xviii
Ao esboçar o gráfico para cada uma das tabelas evidencia-se uma grande semelhança
entre os ensaios B e C. Partindo deste facto, calculou-se o valor médio da concentração de
cada um dos microrganismos, ao longo do volume recolhido, para os ensaios B e C. O
resultado é apresentado no gráfico da Figura F.1.
0 5 10 15 200
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
S.cerevisiae L.bulgaricus
Nº m
édio
de
célu
las
(ens
aio
B eC
) /m
L
Volume recolhido (mL) Figura F.1. Valor médio da concentração de S.cerevisiae e L. bulgaricus nos ensaios B e C da
parte I ao longo do volume recolhido.
PARTE II Na segunda parte do trabalho realizaram-se vários ensaios. Dado que em cada um
estão envolvidos vários gráficos e tabelas, estes só são apresentados na totalidade para o
ensaio A. Para os restantes ensaios apresentam-se apenas os gráficos finais.
Tabela F.6 – Propriedades da coluna e do leito de filtração no ensaio A da parte II da
investigação.
Propriedades da coluna e do leito de filtração Altura do leito 15,0 cm Volume do leito 207,82 cm3 Volume de espaços vazios 43 cm3 Porosidade 0,227 Posição da bomba 30
Tabela F.7 – Características do microscópio utilizado nos ensaios da parte II da investigação.
Características do microscópio Leitz Potenciómetro 6 V Filtro junto à ocular 3x Objectiva 40x Filtro abaixo a objectiva PH2,2 Condensador Todo voltado para cima Polarizador Todo aberto
Apêndice F
xix
Tabela F.8 – Características do programa da aquisição de imagem Axiovision 3.1 utilizado nos
ensaios da parte II da investigação.
Programa AxioVision exposure 1371 ms white balance picking scaling to 8 bits none
Câmara
basic adjustment RGB, 1300x1030 X – 0,2640845 micrómetros/pixeis Escalas 2-scaling Y – 0,2640845 micrómetros/pixeis
Tabela F.9 – Propriedades das imagens adquiridas com uma objectiva de 40 × e contraste de
fase pelo programa AxioVision nos ensaios da parte II da investigação.
Propriedades da imagem X Y Área 1300 pixeis 1030 pixeis 1339000 pixeis2 343,309863 micrómetros 272,0070453 micrómetros 93382,70146 micrómetros2
As lamelas utilizadas tinham uma área de 20 mm×20 mm = 400 mm2
Apêndice F
xx
Tabela F.10 – Determinação da concentração de bacilos, no início do ensaio de filtração A, da parte II da investigação.
Imagem
Nº células
Media do nº de células
Concentração (n células/µm2) Concentração (n células/mm2)
Concentração lamela (n células/mm2)
Concentração lamela (n células/µL)
1 9 2 12 3 7 4 12 5 6 6 8 7 16 8 6 9 14
10 12 11 23 12 13 13 18 14 10 15 10 16 15 17 9 18 12 19 11 20 11 21 22 22 13 23 10 24 15 25 10 26 13
12,1923 1,3056 E-4 130,5628 52225 3482
Apêndice F
xxi
Tabela F.11 – Conversão do comprimento dos bacilos de pixeis para micrómetros, no ensaio A da parte II da investigação. Comprimento
(pixeis) Comprimento (µm)
Comprimento (pixeis)
Comprimento (µm)
Comprimento (pixeis)
Comprimento (µm)
Comprimento (pixeis)
Comprimento (µm)
1 16,5529 4,3714 21 12,0830 3,1909 41 17,2047 4,5435 61 64,3273 16,9878
2 15,2643 4,03108 22 28,3196 7,4788 42 49,3964 13,0448 62 14,1421 3,7347
3 40,2492 10,6292 23 11,1803 2,9526 43 20,6155 5,4442 63 17,2627 4,5588
4 32,5269 8,5899 24 41,3400 10,9173 44 10,2956 2,7189 64 29,5466 7,8028
5 13,4164 3,5431 25 14,4222 3,8087 45 7,6158 2,0112 65 36,6879 9,6887
6 21,0238 5,5521 26 39,9625 10,5535 46 7,2111 1,9043 66 11,4018 3,0110
7 49,0918 12,9644 27 33,2866 8,7905 47 21,8403 5,7677 67 36,6742 9,6851
8 26,0192 6,8713 28 16,1555 4,2664 48 21,0238 5,5521 68 66,4830 17,5571
9 22,5610 5,9580 29 8,4853 2,2408 49 10,6301 2,8072 69 13,0000 3,4331
10 63,9531 16,8890 30 12,8062 3,3819 50 23,7698 6,2772 70 18,9737 5,0107
11 14,7648 3,8992 31 19,2354 5,0798 51 13,4164 3,5431 71 34,4383 9,0946
12 26,1725 6,9118 32 32,6497 8,6222 52 14,3178 3,7811 72 11,7047 3,0910
13 18,6010 4,9123 33 29,7321 7,8518 53 13,4536 3,5529 73 39,4588 10,4204
14 35,3411 9,3331 34 25,4951 6,7329 54 27,7308 7,3233 74 46,0109 12,1507
15 8,0623 2,12912 35 19,4165 5,1276 55 25,7099 6,7880 75 15,2315 4,0224
16 60,4070 15,9525 36 26,1725 6,9118 56 22,5610 5,9580
17 28,7924 7,6036 37 32,5269 8,5899 57 62,5859 16,5280
18 12,0830 3,1909 38 50,5371 13,3460 58 14,8660 3,9259
19 10,0499 2,6540 39 15,5242 4,0997 59 15,0333 3,9701
20 7,2801 1,9226 40 42,9534 11,3433 60 6,7082 1,7715
Apêndice F
xxii
Tabela F.12 – Distribuição do comprimento dos bacilos, no ensaio A da parte II da
investigação.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 MaisComprimento ( m)
Freq
uênc
ia
,00%
20,00%
40,00%
60,00%
80,00%
100,00%
120,00%
Frequência% Acumulada
Figura F.2. Distribuição do comprimento dos bacilos, frequência e percentagem acumulada, no
ensaio A da parte II da investigação.
Bloco (µm) Frequência % Acumulada 1 0 0,00% 2 3 4,00% 3 7 13,33% 4 15 33,33% 5 8 44,00% 6 9 56,00% 7 6 64,00% 8 5 70,67% 9 4 76,00%
10 4 81,33% 11 4 86,67% 12 1 88,00% 13 2 90,67% 14 2 93,33% 15 0 93,33% 16 1 94,67% 17 3 98,67% 18 1 100,00% 19 0 100,00% 20 0 100,00%
Mais 0 100,00%
µ
Apêndice F
xxiii
Tabela F.13 – Determinação da concentração de leveduras, no início do ensaio de filtração A, da parte II da investigação. Imagem
Nº células
Media do nº de
células Concentração (n células/µm2) Concentração (n
células/mm2) Concentração lamela
(n células/mm2) Concentração lamela
(n células/µL)
1 9 2 5 3 7 4 8 5 9 6 4 7 6 8 6 9 7 10 8 11 11 12 7 13 5 14 5 15 4 16 9 17 5 18 2 19 7 20 6 21 4 22 4 23 15 24 8 25 6 26 11
6,8462 7,3313E-05 73,3129 29325 1955
Apêndice F
xxiv
Tabela F.14 – Conversão da área das leveduras de pixeis para micrómetros, e cálculo do respectivo diâmetro no ensaio A da parte II da investigação.
Área (pixeis2)
Área (µm2)
Diâmetro (µm) Área
(pixeis2) Área (µm2)
Diâmetro (µm) Área
(pixeis2) Área (µm2)
Diâmetro (µm) Área
(pixeis2) Área (µm2)
Diâmetro (µm)
1 261 18,2023 4,8141 21 168 11,7164 3,8624 41 209 14,5758 4,3080 61 270 18,8300 4,8964
2 253 17,6444 4,7398 22 347 24,2000 5,5509 42 58 4,0450 2,2694 62 282 19,6669 5,0041
3 150 10,4611 3,6496 23 188 13,1112 4,0858 43 180 12,5533 3,9979 63 290 20,2248 5,0745
4 280 19,5274 4,9863 24 154 10,7401 3,6979 44 166 11,5769 3,8393 64 245 17,0865 4,6642
5 368 25,6646 5,7164 25 288 20,0853 5,0570 45 105 7,3228 3,0535 65 243 16,9470 4,6452
6 158 11,0190 3,7456 26 134 9,3452 3,4495 46 325 22,6657 5,3720 66 371 25,8738 5,7396
7 120 8,3689 3,2643 27 103 7,1833 3,0242 47 574 40,0311 7,1393 67 205 14,2968 4,2665
8 182 12,6928 4,0201 28 282 19,6669 5,0041 48 253 17,6444 4,7398 68 218 15,2035 4,3997
9 96 6,6951 2,9197 29 169 11,7862 3,8738 49 147 10,2519 3,6129 69 279 19,4576 4,9774
10 155 10,8098 3,7099 30 153 10,6703 3,6859 50 267 18,6207 4,8692
11 257 17,9233 4,7771 31 242 16,8772 4,6356 51 248 17,2957 4,6927
12 227 15,8311 4,4896 32 234 16,3193 4,5583 52 179 12,4836 3,9868
13 170 11,8559 3,8853 33 169 11,7862 3,8738 53 307 21,4104 5,2212
14 171 11,9256 3,8967 34 64 4,4634 2,3839 54 448 31,2438 6,3072
15 128 8,9268 3,3713 35 152 10,6006 3,6738 55 236 16,4588 4,5778
16 428 29,8490 6,1648 36 194 13,5297 4,1505 56 155 10,8098 3,7099
17 245 17,0865 4,6642 37 148 10,3216 3,6252 57 287 20,0156 5,0482
18 213 14,8548 4,3490 38 116 8,0899 3,2094 58 84 5,8582 2,7311
19 138 9,6242 3,5006 39 343 23,9210 5,5188 59 230 16,0403 4,5192
20 277 19,3182 4,9595 40 220 15,3429 4,4199 60 288 20,0853 5,0570
Apêndice F
xxv
Tabela F.15 – Distribuição dos diâmetros das leveduras, no ensaio A da parte II da
investigação.
0
5
10
15
20
25
30
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 MaisDiâmetro (µm)
Freq
uênc
ia
,00%
20,00%
40,00%
60,00%
80,00%
100,00%
120,00%
Frequência
% acumulada
Figura F.3. Distribuição do diâmetro das leveduras, frequência e percentagem acumulada no
ensaio A da parte II da investigação.
Bloco (µm) Frequência % Acumulada 1 0 0,00% 2 0 0,00% 3 4 5,80% 4 24 40,58% 5 26 78,26% 6 12 95,65% 7 2 98,55% 8 1 100,00% 9 0 100,00%
10 0 100,00% Mais 0 100,00%
Apêndice F
xxvi
Tabela F.16 – Contagem de bacilos e leveduras, para cada fotografia captada, ao longo do volume recolhido, no ensaio A da parte II da investigação.
Nº total Volume (mL)
Foto
Célula 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
Leveduras Bacilos leveduras 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 2 1 bacilos 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 leveduras 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 2 bacilos 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 leveduras 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 3 bacilos 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 2 leveduras 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 bacilos 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 leveduras 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 5 bacilos 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 leveduras 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6 bacilos 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 leveduras 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 7 bacilos 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 leveduras 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 3 8 bacilos 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 leveduras 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 2 9 bacilos 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 leveduras 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 2 0 0 7 10 bacilos 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 3 leveduras 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 2 0 1 1 1 0 1 0 0 9 11 bacilos 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 leveduras 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 1 0 0 0 0 4 12 bacilos 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 leveduras 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 4 13 bacilos 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 leveduras 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 4 14 bacilos 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 4 leveduras 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 3 15 bacilos 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 4 leveduras 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 2 16 bacilos 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 5 leveduras 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 17 bacilos 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 leveduras 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 18 bacilos 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2
Apêndice F
xxvii
Tabela F.17 – Determinação da concentração de bacilos, ao longo do volume recolhido, no ensaio A da parte II da investigação.
Tabela F.18 – Determinação da concentração de leveduras, ao longo do volume recolhido, no ensaio A da parte II da investigação.
Volume (mL) Nº células Media do nº células
nas 25 imagens Concentração (nº
células/µm2) Concentração (nº
células /mm2) Concentração lamela (nº
células /mm2) Concentração lamela (nº
células /µL) 1 2 0,0800 0,0000 0,8567 342,6759 22,8451 2 2 0,0800 0,0000 0,8567 342,6759 22,8451 3 1 0,0400 0,0000 0,4283 171,3379 11,4225 4 0 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 5 1 0,0400 0,0000 0,4283 171,3379 11,4225 6 0 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 7 2 0,0800 0,0000 0,8567 342,6759 22,8451 8 3 0,1200 0,0000 1,2850 514,0138 34,2676 9 2 0,0800 0,0000 0,8567 342,6759 22,8451 10 7 0,2800 0,0000 2,9984 1199,3656 79,9577 11 9 0,3600 0,0000 3,8551 1542,0415 102,8028 12 4 0,1600 0,0000 1,7134 685,3518 45,6901 13 4 0,1600 0,0000 1,7134 685,3518 45,6901 14 4 0,1600 0,0000 1,7134 685,3518 45,6901 15 3 0,1200 0,0000 1,2850 514,0138 34,2676 16 2 0,0800 0,0000 0,8567 342,6759 22,8451 17 1 0,0400 0,0000 0,4283 171,3379 11,4225 18 2 0,0800 0,0000 0,8567 342,6759 22,8451
Volume (mL) Nº células Media do nº células
nas 25 imagens Concentração (nº
células/µm2) Concentração (nº
células /mm2) Concentração lamela (nº
células /mm2) Concentração lamela (nº
células /µL) 1 0 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 2 1 0,0400 0,0000 0,4283 171,3379 11,4225 3 2 0,0800 0,0000 0,8567 342,6759 22,8451 4 0 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 5 0 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 6 2 0,0800 0,0000 0,8567 342,6759 22,8451 7 1 0,0400 0,0000 0,4283 171,3379 11,4225 8 1 0,0400 0,0000 0,4283 171,3379 11,4225 9 1 0,0400 0,0000 0,4283 171,3379 11,4225 10 3 0,1200 0,0000 1,2850 514,0138 34,2676 11 3 0,1200 0,0000 1,2850 514,0138 34,2676 12 4 0,1600 0,0000 1,7134 685,3518 45,6901 13 2 0,0800 0,0000 0,8567 342,6759 22,8451 14 4 0,1600 0,0000 1,7134 685,3518 45,6901 15 4 0,1600 0,0000 1,7134 685,3518 45,6901 16 5 0,2000 0,0000 2,1417 856,6897 57,1126 17 0 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 18 2 0,0800 0,0000 0,8567 342,6759 22,8451
Apêndice F
xxviii
Tabela F.19 – Concentração de bacilos e de leveduras ao longo do volume recolhido, no
ensaio A da parte II da investigação.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
Nº c
élul
as / µL
Volume recolhido (mL) Figura F.4. Variação da concentração de bacilos e de leveduras ao longo do volume recolhido, no ensaio A da parte II da investigação.
Volume (mL) Bacilos presentes na lamela (nº células/µL)
Leveduras presentes na lamela (nº células/µL)
1 0 23 2 11 23 3 23 11 4 0 0 5 0 11 6 23 0 7 11 23 8 11 34 9 11 23
10 34 80 11 34 103 12 46 47 13 23 47 14 47 47 15 47 34 16 57 23 17 0 11 18 23 23
- × - L. bulgaricus - ●- S. cerevisiae
Apêndice F
xxix
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
L.bulgaricus S.cerevisiae Aprox. Lorentz L.bulgaricus Aprox. Lorentz S.cerevisiae
Nº c
élul
as / µL
Volume recolhido (mL) Figura F.5. Variação da concentração de bacilos e de leveduras ao longo do volume recolhido,
com aproximação de Lorentz, no ensaio A da parte II da investigação.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 200
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Nº c
élul
as / µL
Volume recolhido (mL)
L. bulgaricus S.cerevisiae Aprox. Lorentz S.cerevisiae Aprox. Lorentz L. bulgaricus
Figura F.6. Variação da concentração de bacilos e de leveduras ao longo do volume recolhido,
com aproximação de Lorentz depois de remover alguns pontos, no ensaio A da parte II da
investigação.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 200
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
Nº c
élul
as / µL
Volume recolhido (mL)
L. bulgaricus S. cerevisiae Aprox. Gauss L. bulgaricus Aprox. Gauss S. cerevisiae
Figura F.7. Variação da concentração de bacilos e de leveduras ao longo do volume recolhido,
com aproximação de Gauss depois de remover alguns pontos, no ensaio A da parte II da
investigação.
Apêndice F
xxx
Os gráficos ilustrados da Figura F.4. à Figura F.7. foram esboçados com o auxílio do
programa OriginPro 7.0.
Depois de remover alguns pontos e acrescentar funções de aproximação aos dados,
ao analisar os gráficos alcançados, conclui-se que a aproximação de Lorentz, no caso do
ensaio A da parte II da investigação, é a que se ajusta melhor.
Os resultados que se apresentam, de imediato, para os outros ensaios foram tratados
de igual forma.
Assim, no caso do ensaio B, tem-se: Tabela F.20 – Concentração de bacilos e de leveduras ao longo do volume recolhido, no
ensaio B da parte II da investigação.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 200
10
20
30
40
50
60
70
80
L. bulgaricus S. cerevisiae Aprox. Lorentz L. bulgaricus Aprox. Lorentz S. cerevisiae
Nº c
élul
as / µL
Volume recolhido (mL)
Figura F.8. Variação da concentração de bacilos e de leveduras ao longo do volume recolhido,
com aproximação de Lorentz depois de remover alguns pontos, no ensaio B da parte II da
investigação.
Volume (mL) Bacilos presentes na
lamela (nº células/µL)
Leveduras presentes na
lamela (nº células/µL)
1 0 0 2 11 0 3 0 0 4 11 23 5 11 11 6 23 0 7 0 11 8 0 23 9 11 23
10 0 11 11 23 57 12 11 23 13 0 34 14 11 11 15 11 23 16 23 23 17 23 11 18 11 11
Apêndice F
xxxi
No caso do ensaio C obtiveram-se muito maus resultados pelo que os valores são
expostos sem qualquer tipo de aproximação.
Tabela F.21 – Concentração de bacilos e de leveduras ao longo do volume recolhido, no
ensaio C da parte II da investigação.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
L. bulgaricus S. cerevisiaeN
º cél
ulas
/ µL
Volume recolhido (mL) Figura F.9. Variação da concentração de bacilos e de leveduras ao longo do volume recolhido,
no ensaio C da parte II da investigação.
Volume (mL) Bacilos presentes na
lamela (nº células/µL)
Leveduras presentes na
lamela (nº células/µL)
1 11 0 2 23 0 3 11 0 4 11 0 5 0 11 6 11 11 7 23 11 8 23 0 9 11 0
10 11 0 11 23 0 12 0 0 13 0 0 14 0 23 15 0 23 16 0 91 17 0 23 18 0 11
Apêndice F
xxxii
Para o ensaio D:
Tabela F.22 – Concentração de bacilos e de leveduras ao longo do volume recolhido, no
ensaio D da parte II da investigação.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 200
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
L. bulgaricus S. cerevisiae Aprox. Lorentz L. bulgaricus Aprox. Lorentz S. cerevisiae
Nº c
élul
as / µL
Volume recolhido (mL) Figura F.10. Variação da concentração de bacilos e de leveduras ao longo do volume
recolhido, com aproximação de Lorentz depois de remover alguns pontos, no ensaio D da parte
II da investigação.
Volume (mL) Bacilos presentes na
lamela (nº células/µL)
Leveduras presentes na
lamela (nº células/µL)
1 0 0 2 0 11 3 0 0 4 0 0 5 11 11 6 0 11 7 11 11 8 0 0 9 11 0
10 11 0 11 11 11 12 0 11 13 23 23 14 11 46 15 0 34 16 0 34 17 23 11 18 23 0
Apêndice F
xxxiii
Para o ensaio E:
Tabela F.23 – Concentração de bacilos e de leveduras ao longo do volume recolhido, no
ensaio E da parte II da investigação.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 200
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
L. bulgaricus S. cerevisiae Aprox. Lorentz L. bulgaricus Aprox. Lorentz S. cerevisiae
Nº c
élul
as / µL
Volume recolhido (mL)
Figura F.11. Variação da concentração de bacilos e de leveduras ao longo do volume
recolhido, com aproximação de Lorentz depois de remover alguns pontos, no ensaio E da parte
II da investigação.
Volume (mL) Bacilos presentes na
lamela (nº células/µL)
Leveduras presentes na
lamela (nº células/µL)
1 0 0 2 0 26 3 26 0 4 26 0 5 13 0 6 0 13 7 0 0 8 0 13 9 13 13
10 13 26 11 0 13 12 0 13 13 13 26 14 0 40 15 0 66 16 13 40 17 40 26 18 26 26
Apêndice F
xxxiv
No caso do ensaio D:
Tabela F.24 – Concentração de bacilos e de leveduras ao longo do volume recolhido, no
ensaio F da parte II da investigação.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 200
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
L. bulgaricus S. cerevisiae Aprox. S. cerevisiae Aprox. L. bulgaricus
Nº c
élul
as / µL
Volume recolhido (mL) Figura F.12. Variação da concentração de bacilos e de leveduras ao longo do volume
recolhido, com aproximação de Lorentz depois de remover alguns pontos, no ensaio F da parte
II da investigação.
Reunindo os resultados da parte I e II, para colunas com um intervalo de porosidade
entre 0,217 e 0,227, a distância entre o pico das leveduras (primeiro pico) e o dos bacilos
(segundo pico) situa-se entre 6 mL e 8 mL. O gráfico da Figura F.13. ilustra isso mesmo,
Volume (mL) Bacilos presentes na
lamela (nº células/µL)
Leveduras presentes na
lamela (nº células/µL)
1 0 0 2 0 0 3 13 13 4 13 0 5 13 13 6 13 0 7 0 0 8 13 13 9 13 0
10 13 0 11 0 0 12 0 26 13 0 26 14 0 26 15 0 13 16 0 13 17 0 40 18 13 0
Apêndice F
xxxv
tendo-se normalizado a concentração das células pelo seu valor máximo, e feito um ajuste pela
distribuição Gaussiana.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 200,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
Con
cent
raçã
o no
rmal
izad
a (n
º cél
ulas
/µL)
Volume recolhido (mL)
L. bulgaricus S. cerevisiae Aprox. Gauss L. bulgaricus Aprox. Gauss S. cerevisiae
Figura F.13. Variação da concentração normalizada de bacilos e de leveduras ao longo do
volume recolhido, com aproximação de Gauss, baseada nos resultados obtidos da parte I e II.
PARTE III
Depois dos ensaios realizados com Saccharomyces cerevisiae e Lactobacillus
bulgaricus, testou-se, para o mesmo empacotamento de esferas, o comportamento de
microesferas verde – fluorescente de 1 µm de diâmetro, e para comparação, diferentes
soluções de azul dextrano.
Uma vez que as microesferas contêm no seu interior um corante fluorescente, e é
conhecida a sua concentração inicial (quer em termos de massa por volume, quer a nível do
número de células por volume), a sua concentração final (depois de um ensaio de filtração)
poderia ser medida num espectrofotómetro.
As esferas apresentam excitação máxima a 468 nm e emissão máxima a 508 nm.
Inicialmente, tentou-se fazer uma curva de calibração para as microesferas a 468 nm num
espectrofluorímetro, que como o nome indica, é próprio para partículas fluorescentes. A escala
de unidades de fluorescência, neste aparelho, vai de 0,01 a 900. Para uma concentração de
1,80E+08 nº esferas/mL o aparelho registou um valor médio de 9,133, que é um valor
extremamente baixo. Como para o empacotamento binário a testar não se devem usar
concentrações de células com ordem superior à dezena de milhões por mililitro, conclusão que
foi tirada no final da parte I, decidiu-se usar outros espectrofotómetros.
Na tentativa de encontrar o comprimento de onda onde as microesferas apresentariam
o pico de absorvência, achou-se, no espectrofotómetro JASCO, o espectro de absorção das
microesferas que é apresentado na Figura F.14.
Apêndice F
xxxvi
Figura F.14. Espectro de absorção das microesferas verde – fluorescente obtido no
espectrofotómetro JASCO, entre 300 nm e 700 nm, a uma velocidade de varrimento de 1000
nm/min.
Este espectro não deu também bons resultados. O que acontece é que as microesferas
têm valores elevados de absorvência a vários comprimentos de onda. Posto isto, resolveu-se
utilizar o espectrofotómetro ELISA. Estudaram-se os valores de absorvência obtidos a 468nm,
a 568 nm e a 600 nm, para concentrações distintas de microesferas.
Nesta fase interessava, principalmente, saber o ponto em que as esferas sairiam da
coluna. Ao experimentar traçar a curva de calibração, nos comprimentos de onda referidos no
parágrafo anterior, a equação obtida foi idêntica para os comprimentos de onda distintos,
períodos de tempo diferentes e exposição à luz natural diferente. Por este motivo, embora os
valores não sejam alcançados da forma mais legítima (esta seria pelo espectrofluorímetro), e
porque vai ser calculada a razão dos valores de concentração ou estes vão ser normalizados, a
partir daqui, decidiu-se usar o espectrofotómetro ELISA, a 468 nm.
De imediato apresenta-se a curva de calibração para as microesferas nestas
condições.
Tabela F.25 – Concentração de microesferas versus absorvência, registada no
espectrofotómetro ELISA a 468 nm.
Absorvência (468 nm) Conc.
Microesferas (g/mL)
Conc. Microesferas (nº esf/mL)
1ª Leitura
2ª Leitura
3ª Leitura
Valor médio
Valor médio – Branco
0,000000 0,00 0,021 0,029 0,019 0,023 0,0000,015000 2,70E+08 0,898 0,896 0,901 0,898 0,8750,006000 1,08E+08 0,445 0,439 0,444 0,443 0,4200,004500 8,10E+07 0,339 0,339 0,350 0,343 0,3200,003000 5,40E+07 0,253 0,242 0,244 0,246 0,2230,001500 2,70E+07 0,135 0,134 0,151 0,140 0,1170,000750 1,35E+07 0,089 0,079 0,076 0,081 0,0580,000375 6,75E+06 0,050 0,051 0,061 0,054 0,031
Apêndice F
xxxvii
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,70,000
0,002
0,004
0,006
0,008
0,010
Regressão linear para as microesferas
Con
cent
raçã
o m
icro
esfe
ras
(g/m
L)
Absorvência (468 nm)
Conc. microesferas (g/mL) = 0,017*Abs. (468 nm) - 0,0005 R
2= 0,99563
Figura F.15. Curva de calibração das microesferas verde – fluorescente obtida no
espectrofotómetro ELISA a 468nm.
Para um leito com porosidade 0,227, a filtração de 5mL de uma solução de
microesferas com 2,70E+08 nº esferas/mL ou 0,015 g/mL, deu origem à Figura F.16.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
Raz
ão d
a C
once
ntra
ção
de M
icro
esfe
ras
Volume recolhido (mL) Figura F.16. Variação da razão da concentração de microesferas ao longo do volume
recolhido, partindo de uma concentração inicial de 0,015 g/mL.
Em seguida, testou-se o comportamento do azul dextrano. Para encontrar o
comprimento de onda para o qual o azul dextrano teria o pico de absorvência, achou-se, no
espectrofotómetro JASCO, o espectro de absorção que é apresentado na Figura F.17.
Apêndice F
xxxviii
200 300 400 500 600 700 8000,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
Abs
.
Comprimento de onda (nm)
Figura F.17. Espectro de absorção do azul dextrano obtido no espectrofotómetro JASCO, entre
190 nm e 800 nm, a uma velocidade de varrimento de 1000 nm/min.
Pelo resultado do espectro do azul dextrano, nota-se que é possível medir
absorvências a 620 nm, utilizando-se também o espectrofotómetro ELISA.
Foi nestas condições que se obtiveram a tabela e gráfico subsequentes.
Tabela F.26 – Concentração de azul dextrano versus absorvência, registada no
espectrofotómetro ELISA a 620 nm.
Absorvência (620 nm) Conc. Azul dextrano
(mg/L) 1ª Leitura 2ª Leitura 3ª Leitura Valor médio Valor
médio – Branco
2500,0 1,181 1,177 1,174 1,141 1,164 2000,0 0,955 0,950 0,948 0,915 0,940 1500,0 0,740 0,722 0,732 0,699 0,734 1000,0 0,500 0,505 0,503 0,469 0,503 750,0 0,378 0,379 0,378 0,345 0,377 500,0 0,262 0,293 0,270 0,236 0,254 250,0 0,143 0,146 0,144 0,110 0,142 125,0 0,089 0,090 0,089 0,056 0,088 62,5 0,068 0,062 0,063 0,030 0,060 0,0 0,034 0,033 0,033 0,000 0,033
Apêndice F
xxxix
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,20
500
1000
1500
2000
2500
Regressão linear para o Azul dextrano
Con
cent
raçã
o az
ul d
extra
no (m
g/L)
Absorvência (620 nm)
R2=0,99989
Conc. Azul Dextrano (mg/L) =2182,098* Abs.(620 nm)-4,307
Figura F.18. Curva de calibração do azul dextrano obtida no espectrofotómetro ELISA a 620
nm.
Estabelecida a curva de calibração realizaram-se ensaios com concentrações distintas
de azul dextrano.
Para um leito com porosidade 0,227, testou-se a filtração de um volume de 5 mL com
diferentes soluções de azul dextrano, descritas no gráfico da Figura F.19.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 300,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
Ensaio 1 Ensaio 2 Ensaio 3
Raz
ão d
a C
onc.
de
Azu
l Dex
trano
Volum e recolh ido (m L) Figura F.19. Variação da razão da concentração de azul dextrano ao longo do volume
recolhido, partindo de uma concentração inicial de 2500 mg/L no ensaio 1 e 2, e de uma
concentração inicial de 1000 mg/L no ensaio 3.
Para certificar alguns dos resultados conseguidos, realizaram-se alguns ensaios “extra”
numa mistura idêntica de esferas. Assim, para uma porosidade de 0,227 realizou-se a filtração
de 5 mL de uma solução de leveduras, de 5 mL de uma solução de bacilos, e de 5 mL de uma
mistura de bacilos e microesferas.
Apêndice F
xl
Uma vez que a determinação da concentração das microesferas e do azul dextrano era
determinada no espectrofotómetro ELISA, decidiu-se que era melhor passar a medir a
concentração dos microrganismos também neste aparelho. De acordo com o procedimento
apresentado no Apêndice D (determinação da concentração por turbidimetria) as curvas
obtidas para os bacilos e leveduras, no espectrofotómetro ELISA, foram respectivamente:
Conc. bacilos ( g/L) = 1.3587 DO(620 nm) + 0.044 R2 = 0.9963
Conc. leveduras (g/L) = 1.9348 DO(620 nm) – 0.0749 R2 = 0.9974
Apresentam-se em breve as observações registadas ao longo dos ensaios “extra” para
o empacotamento binário.
0 5 10 15 20 250,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
Raz
ão d
a C
onc.
de
céllu
las
Volume recolhido (mL)
S. cerevisiae
Figura F.20. Variação da razão da concentração de S. cerevisiae ao longo do volume
recolhido, partindo de uma concentração inicial de 0,358 g/L
0 5 10 15 20 25
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
1,2
Raz
ão d
a C
onc.
de
célu
las
V o lum e reco lh ido (m L)
L. bulgaricus
Figura F.21. Variação da razão da concentração de L. bulgaricus ao longo do volume
recolhido, partindo de uma concentração inicial de 0,194 g/L
Apêndice F
xli
0 5 10 15 20 25 30 35
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
Raz
ão d
a C
onc.
de
célu
las
Vo lum e recolhido (m L)
L. bulgaricusM icroesferas
Figura F.22. Variação da razão da concentração de Microesferas e L. bulgaricus ao longo do
volume recolhido, partindo de uma concentração inicial de 10,9 g/L e 0,208 g/L,
respectivamente.
PARTE IV
Depois dos ensaios realizados com o empacotamento binário decidiu-se avaliar o
comportamento das mesmas partículas e microrganismos num leito formado pelas partículas
de menor tamanho do empacotamento binário e com uma quantidade de esferas de d = 111.5
µm idêntica.
O empacotamento originado apresentava uma altura de 5.6 cm e ficou com uma
porosidade de 0.381. Realizaram-se duas filtrações com o azul dextrano, microesferas e
Lactobacillus bulgaricus, em separado.
Apresentam-se agora as observações médias registadas.
0 5 10 15 20 25 300,0
0,10,2
0,30,4
0,50,6
0,70,8
0,91,0
1,1
Raz
ão d
a C
onc.
de
célu
las
Volume recolhido (mL)
1
2
Figura F.23. Variação da razão da concentração de 1 – azul dextrano com concentração inicial
0C = 1000 mg/L e 2 – microesferas com concentração inicial 0C = 0.015 mg/L ao longo do
volume recolhido.
Apêndice F
xlii
0 5 10 15 20 25 30 350,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Raz
ão d
a on
c. d
e cé
lula
s
Volume recolhido (mL) Figura F.24. Variação da razão da concentração de 1 – azul dextrano com concentração inicial
0C = 1000 mg/L e 2 – microesferas com concentração inicial 0C = 0.015 mg/L ao longo do
volume recolhido.
PARTE V
Da mesma forma que se explicou na parte IV o empacotamento com partículas do
mesmo tamanho, na parte V vão ser apresentados os resultados obtidos num leito formado
pelas partículas de maior tamanho do empacotamento binário e com uma quantidade igual de
esferas de d = 1125 µm
O empacotamento deu origem a uma altura de 13.1 cm tendo-se descoberto uma
porosidade de 0.385. Realizaram-se, em separado, três ensaios com azul dextrano, dois com
microesferas, Lactobacillus bulgaricus e Saccharomyces cerevisiae.
0 5 10 15 20 25 30 350,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
Raz
ão d
a C
onc.
das
par
tícul
as
Volume recolhido (mL) Figura F.25. Variação da razão da concentração de azul dextrano com concentração inicial
0C = 1741 mg/L ao longo do volume recolhido.
Apêndice F
xliii
0 5 10 15 20 25 30 35
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
Raz
ão d
a C
onc.
das
par
tícul
as
Volume recolhido (mL) Figura F.26. Variação da razão da concentração de microesferas com concentração inicial
0C = 0.015 mg/L ao longo do volume recolhido.
0 5 10 15 20 25 30 350,50
0,55
0,60
0,65
0,70
0,75
0,80
0,85
0,90
0,95
1,00
Raz
ão d
a C
onc.
de
célu
las
Volume recolhido (mL) Figura F.27. Variação da razão da concentração de Lactobacillus bulgaricus com concentração
inicial 0C = 0.392 g/L ao longo do volume recolhido.
0 5 10 15 20 25 30 35
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Raz
ão d
a C
onc.
de
célu
las
Volume recolhido (mL) Figura F.28. Variação da razão da concentração de Saccharomyces cerevisiae com
concentração inicial 0C = 0.240 g/L ao longo do volume recolhido.
