ANÁLISIS MOLECULAR EN FIBROBLASTOS PROCEDENTES DE TEJIDO … · ANÁLISIS MOLECULAR EN...
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ANÁLISIS MOLECULAR EN FIBROBLASTOS PROCEDENTES DE TEJIDO CONECTIVO GINGIVAL Albert Ramírez * , Jaume Miranda * , Pepita Giménez-Bonafé ¤ y Carles Mendieta * Departament d'Odontostomatologia * . Departament de Ciències Fisiològiques ¤ Universitat de Barcelona
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ANÁLISIS MOLECULAR EN FIBROBLASTOS PROCEDENTES DE TEJIDO CONECTIVO
GINGIVAL
Albert Ramírez*, Jaume Miranda*, Pepita Giménez-Bonafé¤ y Carles Mendieta*
Departament d'Odontostomatologia*. Departament de Ciències Fisiològiques ¤
Universitat de Barcelona
ANÁLISIS MOLECULAR EN FIBROBLASTOS PROCEDENTES DE TEJIDO CONECTIVO GINGIVAL 2 _________________________________________________________________________________
•
Fibrosis tisular (FT) es un resultado histopatológico ocasional en la respuesta reparativa a una lesión, consistente en un exceso de fibras colágenas.
Diferentes causas: fármacos, infecciosas, tóxicas, radiaciones, genéticas, reacciones autoinmunes, mecánicas,…
•
Inflamación local --
elementos de la Matriz Extracelular (ECM) se obtiene :resolución, inflamación crónica o FT.
•
Agente lesivo -fármaco-
: citocinas y factores de crecimiento (GF) pro-inflamatorios
como mediadores
resultados histológicos similares.(Bartold y Narayanan 2006)
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•
La FT se puede producir en diversos órganos de la economía: hígado, riñón, pulmón, corazón, páncreas…
•
En la encía, consecuencia clínica es el Agrandamiento Gingival (AG): Dismorfismo de la encía queratinizada.
•
Distintos tipos, AG inducido por fármacos. Otras causas:placa bacteriana, inflamación crónica predisposición genética: fibroblastos fenotipo
secretorio y profibróticomanifestaciones gingivales afecciones sistémicas:
diabetes m, leucemias
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•
Exámen histológico, alteración característica:
-epitelio: acantótico escamoso y paraqueratinizadocrestas epiteliales interdigitadas con …
-conectivo: aumento densidad fibras colágenas infiltrado inflamatorio crónico
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•
FT en AG es consecuencia de factores:-Liberación anormal de mediadores de inflamación.-Cambios en la proporción GF/citocina efecto celular alto.-Fenotipo celular miofibroblástico.
•
AG se asocia a actividad reducida y expresión metaloproteinasas (MMP) de la matriz.
•
Fibroblasto se diferencia a miofibroblasto por acción de Factor de crecimiento tumoral (TGF-β), señales paracrinas céls. inflamatorias,lipoproteínas,DNA bacteriano
(Wynn J Clin Invest 2007)
•
Secreta GF, en estrés capacidad contráctil,
expresión proteica de ECM por integrinas.
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ESTUDIO EXPERIMENTAL
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OBJETIVOS
1-Determinar si cultivos de fibroblastos de encía humana son sensibles a la acción de fármacos inductores de AG.
2-Observar el efecto de estos fármacos en cultivos primarios de fibroblastos procedentes de las muestras examinadas-estudio de la viabilidad celular-.
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3-Cuantificar si hay efecto farmacológico en el RNAm
del (TGFß),
del colágeno y de la colagenasa.
4-Observar si hay efecto farmacológico en la síntesis
del colágeno y del TGFß.
OBJETIVOS
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DNAinf genética
RNA mRNA m
TRANSCRIPCIÓN NÚCLEO
RNA m
PROTEÍNASColágeno, TGF, MMP
TRADUCCIÓN
m nuclear
ribosomas
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•
Estudio histológico2 muestras gingivales caso y control
MATERIAL Y MÉTODO
--1 y 2: Sensibilidad a los fármacos y efecto en su viabilidad•
Establecimiento de cultivos primarios
•
Pruebas de viabilidad:
1/Aplicación de los fármacos en los cultivos, 24h:2000 cel/100µl medio 8 dosis progresivas/fármaco:
Fenitoína (Ft) Nifedipina (Nf) Ciclosporina (CsA)
2/Aplicación del MTT, 4h10 µl sal/100µl
3/Lectura por reducción del MTT
MATERIAL Y MÉTODO
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RESULTADOS VIABILIDAD CELULAR
--1 y 2: Sensibilidad a los fármacos y efecto en su viabilidad•
Encía sana -a 24h-
Fenitoína
0
20
40
60
80
100
120
0 5 10 15 20 25 30 35
Dosis μM
% Viabilidad
Nifedipina
0
20
40
60
80
100
120
0 10 20 30 40 50 60 70 80Dosis nM
% Viabilidad
Nifedipina
0
20
40
60
80
100
120
0 0,1 0,3 0,6 1 3 6 10 13
Dosis μM
% Viabilidad
Ciclosporina A
0
20
40
60
80
100
0 100 200 300 400 500 600 700
Dosis ng/ml
% Viabilidad
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RESULTADOS
VIABILIDAD CELULAR
--1 y 2: Sensibilidad a los fármacos y efecto en su viabilidad• Encía patológica -a 24h y 72h, combinación con SFB-:
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DNAinf genética
RNA mRNA m
TRANSCRIPCIÓN NÚCLEO
RNA m
PROTEÍNASColágeno, TGF, MMP
TRADUCCIÓN
m nuclear
ribosomas
C-DNA
RT-PCRRT-PCRRT-PCR
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MATERIAL Y MÉTODO--3: Cuantificar RNAm de TGFß,
colágeno y colagenasa
•
Expresión del RNAm de las proteínas mediante PCR* a tiempo real (Real time-PCR)
106
fibroblastos + fármacos (11 dosis progresivas 72h)
EXTRACCIÓN DEL RNA
cDNA PCR cuantitativa expresión RNAm colágeno
TGFβ
colagenasa
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RESULTADOS TRANSCRIPCIÓN
--3: Cuantificar RNAm de TGFß
Nº
veces de
expresión/control
0,000,501,001,502,002,503,00
tgf C
t
tgf Ft n
M D1
tgf Ft n
M D2
tgf Ft µ
M D1
tgf N
f nM D1
tgf N
f nM D2
tgf N
f µM D1
tgf C
s D1
tgf C
sD2
* = p<0,05*
*
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0,000,501,001,502,002,503,00
col Ct
col Ft nM D1
col Ft nM D2
col Ft µM D1
col Nf nM D1
col Nf nM D2
col Nf µM D1
col Cs D1
col Cs D2
Nº
veces
expresión/control
* = p<0,05
RESULTADOS TRANSCRIPCIÓN--3: Cuantificar RNAm de colágeno
*
**
*
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--3: Cuantificar RNAm de colagenasa
Nº
veces
expresión/control
0,001,002,003,004,005,006,007,008,00mmp Ct
mmp Ft nM D1
mmp Ft nM D2
mmp Ft µM D1
mmp Nf nM D1
mmp Nf nM D2
mmp Nf µM D1
mmp Cs D1
mmp Cs D2
* = p<0,05
*
*
RESULTADOS
TRANSCRIPCIÓN
*
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MATERIALY MÉTODO--4: Comprobar síntesis colágeno y TGFß
• Expresión a nivel de proteína de colágeno y TGFß
2x106 fibroblastos + fármacos: 10 dosis progresivas* 72h
EXTRACCIÓN PROTEÍNAS TOTALES
ELECTROFORESIS
IDENTIFICACIÓN PROTEÍNAS Anticuerpos -Western-Blott-
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Ft Nf Cs
15 35 15 35 40 80 1 13 300 700Ct nM
nM
μM
μM nM nM μM
μM
ng/ml ng/ml
RESULTADOS TRADUCCIÓN
--4: Comprobar síntesis colágeno y TGFß
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CONCLUSIONES
• Los fibroblastos gingivales de cultivos primarios son sensibles a fármacos inductores de AG -Ft, Nf, CsA-.
• Estos fármacos no han provocado hiperplasia gingival por proliferación celular de fibroblastos.
• Se ha obtenido un incremento significativo de la transcripción del TGFß, colágeno y colagenasa.
• No se ha producido un incremento de la traducción del
colágeno, con repercusión en la matriz extracelular por la acción de los fármacos inductores.
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Gracias por su atención
Albert Ramírez*, Jaume Miranda*, Pepita Giménez-Bonafé¤ y Carles
Mendieta*
Departament
d'Odontostomatologia*. Departament
de Ciències
Fisiològiques
¤
Universitat
de Barcelona
