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FERNANDO GALATI SÁBIO Análise do padrão de inativação do cromossomo X em tecido extraembrionário bovino Analysis of X chromosome inactivation pattern in bovine extra- embryonic tissue São Paulo 2015

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FERNANDO GALATI SÁBIO

Análise do padrão de inativação do

cromossomo X em tecido

extraembrionário bovino

Analysis of X chromosome inactivation pattern in bovine extra-embryonic tissue

São Paulo

2015

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FERNANDO GALATI SÁBIO

Análise do padrão de inativação do

cromossomo X em tecido

extraembrionário bovino

Analysis of X chromosome inactivation pattern in bovine extra-embryonic tissue

Dissertação apresenta ao Instituto de

Biociências da Universidade De São

Paulo, para a obtenção de Título de

Mestre em Ciências, na Área de

Biologia (Genética).

Orientadora: Profª Drª Lygia da Veiga

Pereira Carramaschi

São Paulo

2015

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Comissão Julgadora:

______________________ ______________________

Prof(a). Dr(a). Prof(a). Dr(a).

___________________________

Prof(a). Dr(a). Orientadora

Sábio, Fernando Galati Análise do padrão de inativação do cromossomo X em tecido extraembrionário bovino

80 páginas Dissertação (Mestrado) - Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo. Departamento de Genética e Biologia Evolutiva. 1. Inativação do cromossomo X. 2. Placenta. 3. Epigenética Universidade de São Paulo. Instituto de Biociências. Departamento de Genética e Biologia Evolutiva.

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Epígrafe

O simples ato de zarpar o levara para longe do mundo de

reversões de expectativas, frustrações e inanidades. No intervalo de

algumas horas, a vida fora transformada, e uma existência altamente

complexa, com milhares de pequenos problemas, fora reduzida a

uma vida de extrema simplicidade, em que só havia uma tarefa real –

chegar ao seu objetivo.

Em seu diário, aquela noite, Shackleton resumiu seus

sentimentos: “...Agora começa o verdadeiro trabalho... vai ser uma

boa luta.”

Alfred Lansing, A incrível viagem de Shackleton

(tradução Sérgio Flaksman; ed Sextante, 2011)

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Agradecimentos

Gostaria de agradecer a todos que de alguma forma contribuiram ao longo do

desenvolvimento deste trabalho.

Gostaria de agradecer a Profª Drª Lygia da Veiga Pereira, pela orientação e

ensinamentos. Acompanhando-me desde a iniciação cientifica até o mestrado, agradeço

pela paciência no último ano conturbado. Esteve sempre disposta a ajudar e disponível para

qualquer problema. Exemplo de cientista pelo seu trabalho em sua área, e também por seu

importante esforço na divulgação da ciência.

Faço um agradecimento em particular à Joana Carvalho, que acompanho desde a

iniciação científica. Teve participação crucial em todas as etapas desse trabalho, e foi

sempre procurada a cada problema que eu encontrei. Agradeço pela pronta disponibilidade

em discutir meus resultados, na interpretação das análises, na revisão do texto deste

trabalho com suas correções, observações e sugestões sempre relevantes.

Agradeço a todo pessoal do Laboratório de Genética Molecular do IB-USP, e a todos

os que por ele já passaram, por sempre estarem dispostos a ajudar.

Agradeço a todos os profesores que encontrei ao longo da pós-graduação e seus

ensinamentos, tanto dentro de sala quanto fora. Agradeço dois professores em especial, por

lições que levarei para toda vida, Dr. Paulo Otto do IB-USP e Dr. Beny Spira do ICB-USP.

Agradeço também ao Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, e todos os

professores que dele fazem parte, pelos equipamentos compartilhados, materiais

emprestados e ajudas científicas.

Agradeço ao Prof. Dr. José Fernando Garcia, e seu aluno de Doutorado Yuri Tani

Utsunomiya do Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular Animal da UNESP –

Araçatuba, pels dados experimentais que nos foram fornecidos, e pela ajuda nas análises.

Agradeço ao Sr. Jovelino Mineiro, proprietário da Fazenda Sant’anna, localizada na

cidade de Rancharia – SP, pela disponibilidade em ajudar nesse trabalho. Agradeço ao

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gerente Sr. José Nilson de Sousa, e todos os funcionários da fazenda Sant’anna e da

fazenda Entroncamento, onde fui extremamente bem recebido, e prestaram toda a ajuda

necessária para as coletas das amostras de placenta bovina.

Agradeço ao Laboratório de Genômica e Elementos de Transposição – GaTE Lab,

do Departamento de Botânica do IB-USP, da Profa. Dra. Marie-Anne Van Sluys, pela

disponibilidade e ajuda com os sequenciamentos. Agradeço a técnica responsável Tatiana

Caroline Silveira Corrêa.

E finalmente agradeço a toda minha família. Pela paciência e apoio ao longo de todo

esse caminho, e ao longo de toda a vida. Por sempre estarem disponíveis para tudo, e

servirem de inspiração. Sobretudo agradeço a Andréia Prata, sem ela nada disso seria

possível. Não existem palavras para agradecer por toda ajuda, tanto na área acadêmica

quanto pessoal. E agradeço ao Sr. Sullyvan e Dino por servirem de exemplo de um jeito

tranquilo de viver a vida.

Agradeço também ao Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo,

instituição pela qual tenho enorme carinho. Nela vivi meus últimos 8 anos, e a ela devo

minha formação acadêmica e científica.

Agradeço também à Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo -

FAPESP, pelo apoio financeiro. Este projeto foi financiado pela FAPESP, sob processo nº

2011/16399-4, com vigência de 01/03/2012 a 31/07/2013.

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Índice

Lista de figuras .................................................................................................................... I

Lista de tabelas ................................................................................................................... II

Lista de abreviaturas ........................................................................................................... III

1. Introdução ....................................................................................................................... 1

1.1. Epigenética ....................................................................................................... 1

1.1.1. Metilação do DNA .............................................................................. 2

1.1.2. Proteínas Histonas ............................................................................ 4

1.1.3. Processamento do RNA e RNAs não codificantes ............................ 5

1.2. Determinação sexual ........................................................................................ 6

1.3. Compensação de dose transcricional .............................................................. 10

1.4. Inativação do Cromossomo X .......................................................................... 11

1.5. Quanto ao padrão de inativação do cromossomo X ........................................ 16

2. Objetivos ......................................................................................................................... 20

3. Materiais e métodos ........................................................................................................ 21

3.1. SNPs ................................................................................................................. 21

3.2. SNPs Bovinos ................................................................................................... 21

3.2.1. Seleção dos polimorfismos através da técnica de

Array de SNPs ................................................................................... 21

3.2.2. Seleção manual dos polimorfismos em banco de dados .................. 21

3.3. Desenho dos Iniciadores .................................................................................. 22

3.4. Animais - Bos taurus ......................................................................................... 23

3.5. Obtenção das amostras .................................................................................... 24

3.6. Extração de ácidos nucleicos ........................................................................... 25

3.6.1. DNA ................................................................................................... 25

3.6.2. RNA ................................................................................................... 26

3.6.3. DNA parental ..................................................................................... 26

3.7. Tratamento das amostras de RNA com DNAse e síntese de cDNA ................ 27

3.8. Amplificação por técnica de PCR e RT-PCR .................................................... 28

3.8.1. Purificação de produtos de PCR com EXO/SAP ............................... 28

3.9. Reação de sequenciamento direto ................................................................... 29

3.10. Análise dos dados .......................................................................................... 30

3.10.1. Análise dos eletroferogramas .......................................................... 30

4. Resultados ...................................................................................................................... 32

4.1. Obtenção das amostras ................................................................................... 32

4.2. Coleta das placentas bovinas .......................................................................... 32

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4.3. Seleção dos polimorfismos através da técnica de Array de SNPs ................... 33

4.4. Seleção manual dos polimorfismos em banco de dados .................................. 36

4.4.1. Uso de banco de dados ...................................................................... 36

4.4.2. Bos taurus taurus e Bos taurus indicus .............................................. 37

4.4.3. Análise dos genes do Cromossomo X bovino .................................... 37

4.4.4. Genes expressos em tecido extraembrionário bovino ....................... 40

4.5. Escolha dos Genes e SNPs ............................................................................. 45

4.6. Genes analisados ............................................................................................. 46

4.7. Padronização das reações de PCR .................................................................. 48

4.8. Genotipagem do DNA genômico ...................................................................... 49

4.9. Análise da expressão gênica através do cDNA ................................................ 51

4.10. Análise da origem parental do alelo expresso ................................................ 54

5. Discussão ........................................................................................................................ 56

5.1. Animais - Bos taurus ......................................................................................... 56

5.2. Padrão da ICX em bovinos ............................................................................... 57

5.3. Análise global do cromossomo X ..................................................................... 60

6. Conclusão ....................................................................................................................... 63

Resumo ............................................................................................................................... 65

Abstract ............................................................................................................................... 67

Referências bibliográficas ................................................................................................... 69

Anexos ................................................................................................................................ 77

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I

Lista de Figuras

Figura 1. Conversão da citosina em 5-metilcitosina pela enzima

DNA metiltransferase ................................................................................................. 2

Figura 2. Determinação sexual controlada pelo ambiente. ................................................... 7

Figura 3. Evolução dos cromossomos sexuais nos mamíferos. ........................................... 8

Figura 4. Determinação sexual genética .............................................................................. 9

Figura 5. Mecanismos de compensação de dose. ............................................................... 10

Figura 6. Centro de Inativação do Cromossomo X. ............................................................. 14

Figura 7. Principais genes do XIC murino ............................................................................ 15

Figura 8. Gado zebuíno da raça GIR ................................................................................... 24

Figura 9. Exemplo da visualização dos padrões esperados de ICX

em eletroferogramas. ................................................................................................ 31

Figura 10. Anatomia da placenta bovina. ............................................................................. 33

Figura 11. Variação do número de genes presentes no cromossomo X

bovino no banco de dados ....................................................................................... 38

Figura 12. Caracterização dos genes presentes no cromossomo X bovino. ..................... 39

Figura 13. Expressão dos genes em diferentes tecidos. ..................................................... 42

Figura 14. Caracterização dos genes e expressão na placenta bovina. ............................ 43

Figure 15. Análise da expressão alelo-específica através de sequenciamento

de cDNA. ................................................................................................................... 52

Figura 16. Análise da origem parental do alelo expresso no cDNA ...................................... 55

Figura 17. Comparação dos conjuntos de genes XIST/TSIX em

camundongo, rato, bovino, humano, e macaco rhesus. ........................................... 60

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II

Lista de Tabelas

Tabela 1. Resumo dos dados gerados através do Array. ..................................................... 35

Tabela 2. Genes analisados, total de SNPs descritos em cada um deles,

e SNPs que se encontram em regiões expressas. ......................................... 44

Tabela 3. Genes e SNPs selecionados. ............................................................................... 47

Tabela 4. Resultados da genotipagem na busca de amostras heterozigotas,

portanto informativas. ................................................................................................ 50

Tabela 5. Resultados da análise da expressão gênica em placenta bovina ........................ 53

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III

Lista de Abreviaturas

ABCGIL - Associação Brasileira de Gir Leiteiro

ART - Tecnologias de Reprodução Assistida, do inglês assisted reproductive technologies

cDNA – DNA complementar

DMSO – dimetilsulfóxido

DNA – Ácido desoxirribonucleico

DNMT - enzimas DNA metiltransferases

dNTPs - Desoxirribonucleotídeos fosfatados

EST – sequência curta expressa, do inglês Expressed Sequence Tag

Exo I - Exonuclease I

FMR1 – nome do gene em inglês, Fragile X mental retardation 1

HDAC - histonas desacetilases, do inglês histone deacetylases

ICX - inativação do cromossomo X

Kb - kilobase

M – molar

Mb – megabase

MBD - proteínas que se ligam às bases metiladas, do inglês methyl-CpG binding domain

protein

mX – cromossomo X de origem materna

ncRNAs - RNAs não-codificantes, do inglês non-coding RNAs

PAR - região pseudoautossômica, do inglês pseudoautosomal regions

PBS – solução tampão fosfato-salina

PCR – reação em cadeia de polimerase

PMGZ - Programa de Melhoramento Genético de Zebuínos

POI – pura origem importado

pX – cromossomo X de origem paterna

rcf – do inglês, relative centrifugal force

RNA – ácido ribonucleico

RNA-Seq - sequenciamento de RNA

RT-PCR – reação em cadeia da polimerase após transcrição reversa

SAM - S-adenosilmetionina

SAP - fosfatase alcalina de camarão, do inglês Shrimp Alkaline Phosphatase

SNP – polimorfismo de base única, do inglês single-nucleotide polymorphism

SRY - região do Y determinante do sexo, do inglês sex-determining region Y

TAE – tampão Tris- Acetato- EDTA

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IV

TBE – tampão Tris-Borato EDTA

TDF - fator de determinação de testículo, do inglês testis determinig factor

TSIX/Tsix – nome do gene em inglês, X (inactive)-specific transcript, antisense

UTRs - região não traduzida, do inglês untranslated region

Xa - cromossomo X transcricionalmente ativo

Xi - cromossomo X transcricionalmente inativo

XIC - centro de inativação do cromossomo X, do inglês X Chromosome Inactivation Center

XIST - transcrito específico do X inativo, do inglês X inactive specif transcript

Xq13 - cromossomo X, banda 13q

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1

1 Introdução

1.1 Epigenética

A definição do termo epigenética tem sido alvo de muito debate desde que Conrad

Waddington o cunhou em 1940 (revisto em Richards, 2006; Bird, 2007; revisto em Holliday,

2006). Hoje podemos defini-lo como “as alterações na expressão dos genes que são

hereditárias através da mitose e/ou meiose, mas que não envolvem mudanças na sequência

do DNA” (Wu e Morris, 2001), ou seja, são modificações estáveis nos nucleotídeos que

alteram o funcionamento dos genes, sem alterar a sequência de bases do DNA.

Em 1948, Rollin Hotchkiss foi o primeiro a descrever o que seria chamado de “a

quinta base do DNA”, fazendo referência a 5-metilcitosina (Hotchkiss, 1948), dando início ao

campo de análise de modificações de nucleotídeos. Esse conhecimento adicionou um novo

nível de complexidade aos genomas, e ajudou a explicar como as células podem se

especializar e originar diferentes tecidos apesar de todas possuírem o mesmo material

genético. Por exemplo, devido à metilação de determinadas regiões do genoma em estágios

iniciais do desenvolvimento embrionário, a diferenciação de células-tronco embrionárias é

direcionada para diferentes tipos celulares, constituindo assim os diversos órgãos e tecidos

do corpo humano. Forneceu também uma explicação para as influências ambientais que

interferem na regulação gênica, demonstrando que mudanças ambientais são capazes de

alterar o padrão de metilação em regiões específicas do DNA (Postovit et al., 2007; revisto

em Novik et al., 2002).

Pesquisas recentes têm mostrado também que assim como fatores ambientais, as

experiências vividas também podem resultar em alterações nos padrões de metilação,

correspondendo a comportamentos herdáveis por várias gerações (revisto em Kriaucionis et

al., 2009).

Os processos epigenéticos estão sendo reconhecidos como fundamentais durante o

desenvolvimento do organismo e o processo de envelhecimento (revisto em Ben-Avraham et

al., 2012), assim como sua participação nos mecanismos de diversas doenças como o

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2

câncer, doenças autoimunes e diversas síndromes, como a de Prader-Willi e de Angelmann

(revisto em Tang e Ho, 2007; Ballestar et al., 2006).

As modificações epigenéticas melhor caracterizadas hoje são: a metilação do DNA,

as modificações das histonas, o processamento do RNA, e a ação de RNAs não-

codificantes (ncRNAs, do inglês non-coding RNAs) (revisto em Richards, 2006). São

modificações bastante estáveis, sendo mantidas durante as sucessivas divisões celulares,

garantindo uma transmissão confiável desses padrões às células filhas.

1.1.1 Metilação do DNA

A metilação do DNA é uma modificação epigenética importante para a regulação da

expressão gênica, e consiste na adição de um grupo metil a uma base específica no DNA.

Em mamíferos a metilação está restrita às citosinas que precedem guaninas, nos chamados

dinucleotídeos CpG (revisto em Bernstein et al., 2007). Essa adição de um grupo metil pelas

enzimas DNA metiltransferases (DNMTs) na posição 5’ do anel de carbonos da citosina gera

a 5-metilcitosina (Figura 1).

Figura 1. Conversão da citosina em 5-metilcitosina pela enzima DNA metiltransferase. As

enzimas DNMTs catalisam a transferência de um grupo metil (CH3) oriundo da S-adenosilmetionina

(SAM) para o carbono na posição 5’ do anel de carbonos da citosina. Adaptado de Gibney e Nolan,

2010.

A frequência no genoma de dinucleotídeos CpG é baixa, estando estes concentrados

em regiões promotoras ou adjacentes. Essas concentrações são chamadas de ilhas CpG e

estima-se que ocorram em 75% dos genes humanos (Fazzari e Greally, 2004). A metilação

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3

diferencial dessas regiões é capaz de regular a expressão gênica e, de um modo geral, uma

maior metilação na região promotora de um gene inibe sua expressão (revisto em Klose e

Bird, 2006). Esse silenciamento transcricional dos genes pode ocorrer através de diferentes

mecanismos repressivos, como por exemplo, através de proteínas que se ligam às bases

metiladas (MBDs - methyl-CpG binding domain proteins) ou através de histonas

desacetilases (HDACs - histone deacetylases), proteínas que são atraídas pela metilação do

DNA, mas que irão interagir com as proteínas histonas.

Em mamíferos foram identificadas três DNA metiltransferases: DNMT1, DNMT3A e

DNMT3B. A principal e mais abundante DNA metiltransferase é a DNMT1, cuja preferência

por DNA hemi-metilado está associada com a propagação dos padrões de metilação depois

da replicação do DNA. DNMT1 é tida como a principal metilase de manutenção já que

apresenta uma forte preferência por DNA hemi-metilado (revisto em Bestor, 2000). Em

camundongos, a ausência dessa enzima leva à desmetilação global do DNA e não é

compatível com a vida embrionária (Li et al., 1992). Já em humanos, a inativação de DNMT1

em linhagens de carcinoma levou à perda de apenas 20% da metilação do DNA (Rhee et al.,

2000), resultados diferentes dos encontrados em camundongos.

Já a família de enzimas DNMT3, composta por DNMT3A e DNMT3B metilam tanto

DNA hemi-metilado quanto DNA não metilado, assim possuem como principal função a

metilação de novo (Chen et al., 2003). Curiosamente, DNMT2 não é uma DNA

metiltransferase, sendo descoberto posteriormente que ela age metilando RNA (Schaefer et

al., 2010).

Hoje existem indícios de novas bases modificadas no genoma de eucariotos, como

por exemplo, a 5-hidroximetilcitosina, um nucleotídeo estável que antes só tinha sido

observado em formas de vida simples, como em vírus (Kriaucionis e Heintz, 2009). Esse

nucleotídeo modificado é encontrado em abundância no cérebro humano e de

camundongos, e pode ser apenas uma etapa na desmetilação da 5-metilcitosina ou possuir

um papel ativo na regulação da expressão gênica (Kriaucionis e Heintz, 2009; Tahiliani et al.,

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2009). Foram descobertos genes que produzem enzimas específicas para a conversão da

5-metilcitosina em 5-hidroximetilcitosina, reforçando a ideia que esse nucleotídeo modificado

possui um papel importante na regulação gênica (Tahiliani et al., 2009). Outros estudos

apontam evidências de metilação em adeninas, por exemplo (Kay et al., 1994).

1.1.2 Proteínas Histonas

As histonas são as principais proteínas que compõem o nucleossomo, a unidade

fundamental da cromatina, tendo um papel importante no acondicionamento do DNA

nuclear.

A estrutura das histonas tem se mantido muito conservada em termos evolutivos,

mostrando sua importância. As histonas formam um núcleo no qual o DNA se enrola e ao

compactarem o DNA, permitem que os genomas eucarióticos de grandes dimensões se

organizem dentro do núcleo das células.

As histonas são passíveis de modificações e estas desempenham um papel

importante na regulação dos genes, sendo o conjunto destas modificações conhecido como

“código de histonas”. Tais modificações epigenéticas ocorrem principalmente em sua porção

N-terminal como por exemplo, acetilação, metilação, fosforilação, ubiquitinação, entre

outras, além da existência de variantes de histonas que podem substituir as histonas

convencionais no nucleossomo. Essas modificações alteram as propriedades físicas do DNA

ligado a elas, alterando assim o grau de condensação da cromatina no local e a

conformação do DNA, facilitando ou dificultando o contato com fatores de transcrição

(revisto em Cedar e Bergman, 2009). De modo geral a acetilação de histonas forma

complexos ativos de cromatina, facilitando o acesso da RNA-polimerase ao DNA, regulando

positivamente a expressão gênica; de maneira contrária, a desacetilação remove o grupo

acetil de sua porção N-terminal, promovendo então a condensação da cromatina e

dificultando o acesso da maquinaria celular de transcrição ao DNA (Jenuwein e Allis, 2001).

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5

Estudos recentes demonstram que não existe uma atuação única da metilação do

DNA ou das modificações de histonas, e sim uma complexa interação entre esses dois

mecanismos, que se influenciam mutuamente (Brenner e Fuks, 2007; Vaissière et al., 2008).

1.1.3 Processamento do RNA e RNAs não codificantes

Cada vez mais trabalhos focam na ação de RNAs não-codificantes nos processos

epigenéticos. Os ncRNAs estão ou parecem estar envolvidos em direcionar modificações de

histonas e a metilação do DNA, regulando portanto a expressão gênica em organismos

complexos (revisto em Tao et al., 2015). Estes RNAs possuem também um papel importante

regulando a conformação da cromatina, aproximando regiões promotoras, acentuadores de

expressão (enhancers) e fatores de transcrição alterando a expressão gênica (revisto em

Harmston e Lenhard, 2013; Grant et al., 2004). Todos esses mecanismos de modificações

epigenéticas vão alterar a acessibilidade da maquinaria de transcrição ao DNA.

Um ncRNA bastante estudado é aquele produzido pelo gene XIST (do inglês – X

inactive specif transcript/transcrito específico do X inativo). Esse ncRNA está relacionado

com a inativação do cromossomo X (ICX) em mamíferos, um interessante fenômeno

epigenético, onde um dos dois cromossomos X de fêmeas é silenciado, resultando em um

mecanismo de compensação de dose entre machos e fêmeas (Lyon, 1961). A inativação do

cromossomo X é um exemplo clássico de mecanismo epigenético, onde um cromossomo

inteiro é silenciado, sem que isso altere sua sequência de bases. Sua provável origem se

deve ao desbalanço gênico gerado entre os gêneros daqueles organismos com

determinação sexual genética.

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6

1.2 Determinação sexual

Em um primeiro momento a determinação sexual era controlada pelo ambiente,

como por exemplo, a temperatura de incubação dos ovos. Nos organismos com este tipo de

mecanismo, a temperatura ambiental durante um período específico da incubação é

determinante na determinação sexual, chamado de período termosensitivo, afetando

individualmente a ativação de enzimas esteroidogênicas, bem como dos genes que as

codificam.

Durante este período termosensitivo a enzima denominada aromatase, responsável

pela conversão de hormônios masculinos em hormônios femininos, inicia a sua atividade de

acordo com a temperatura. Os diferentes níveis de atividade da aromatase irão direcionar o

desenvolvimento das gônadas indiferenciadas em ovários ou testículos.

A maior desvantagem desse sistema é que o valor adaptativo da espécie está sujeito

a mudanças climáticas repentinas, como catástrofes ou o aquecimento global. Esta é uma

das hipóteses para a extinção dos dinossauros por exemplo, já que em situações de

mudança climática repentina, haveria um desbalanço entre a proporção de machos e

fêmeas nas proles.

Nesses animais os machos e fêmeas são cromossomicamente idênticos, e assim

não apresentam problemas em relação à dose dos produtos gênicos (Figura 2). Acredita-se

que esse mecanismo onde o sexo do indivíduo é estabelecido durante o desenvolvimento

embrionário seja o modo ancestral de determinação sexual, e os crocodilianos, diversas

tartarugas e lagartos ainda mantém esse sistema (revisto em Graves, 2008; revisto em

Crews, 2003).

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Figura 2. Determinação sexual controlada pelo ambiente. Inicialmente machos e fêmeas eram

cromossomicamente idênticos e o sexo era determinado pelo ambiente, como por exemplo a

temperatura de incubação dos ovos. A figura mostra um par de cromossomos autossomos

precursores dos futuros cromossomos sexuais, PXY = Proto XY. Adaptado de Payer e Lee, 2008.

Outra forma conhecida de determinação sexual de um indivíduo é a determinação

genética, através de cromossomos sexuais. Sabemos que ela ocorre em nematoides como

o Caenorhabditis elegans, dípteros como a Drosophila melanogaster e em vertebrados

como as aves e mamíferos. O sexo genético desses organismos é estabelecido no

momento da fecundação, quando, por exemplo, em mamíferos, um espermatozoide introduz

no óvulo um cromossomo X ou Y; ou quando o óvulo fecundado de uma ave carrega um

cromossomo Z ou W (revisto em Graves, 2008).

Acredita-se que os cromossomos sexuais se originaram de um par de autossomos,

quando um dos cromossomos homólogos adquiriu um gene determinante do sexo, como no

caso dos mamíferos o gene SRY (sex-determining region Y/ região do Y determinante do

sexo), anteriormente conhecido como fator de determinação de testículo (TDF - testis

determinig factor) (Kohn et al., 2004).

Por seleção natural, esses cromossomos homólogos foram divergindo cada vez mais

um do outro pelo acúmulo de mutações, tendo permanecido no Y aqueles genes de

determinação e desenvolvimento sexual masculino. Esse cromossomo acaba sofrendo

erosão genética, perdendo muitos genes e acumulando elementos transponíveis (Malone e

Oliver, 2008). Assim, ele acaba se tornando muito especializado, tendo como principal

função a determinação do sexo e possuindo principalmente genes que conferem vantagens

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masculinas (Figura 3). Esse modelo explica também a diferença de tamanho e de

quantidade de genes entre o cromossomo X e Y (Graves, 2006).

A ausência de recombinação entre os cromossomos homólogos levou a uma rápida

degradação do cromossomo Y, restando apenas uma pequena região com homologia entre

esse par de homólogos. As chamadas regiões pseudoautossômicas (ou PARs, do inglês

pseudoautosomal regions), necessárias para o correto pareamento dos cromossomos

durante a divisão celular. A existência dessa região é uma das evidências que sustenta a

hipótese da origem dos cromossomos sexuais a partir de um par de autossomos ancestrais.

O padrão de elementos repetitivos também foi usado para analisar a história evolutiva do

cromossomo Y (Skaletsky et al., 2003).

Figura 3. Evolução dos cromossomos sexuais nos mamíferos. O surgimento de um gene

determinante de sexo (SRY) em um dos cromossomos homólogos estabelece a distinção entre os

futuros cromossomos sexuais. Ocorre então o acúmulo de outros genes benéficos para o macho,

levando a supressão da recombinação na meiose, resultando em uma progressiva degradação do

cromossomo Y. Adaptado de Gribnau e Grootegoed, 2012.

O surgimento de um gene determinante do sexo possibilita uma especialização mais

precoce das características masculinas ou femininas no embrião, resultando em uma

vantagem no desenvolvimento. No entanto esse mecanismo leva a uma diferenciação entre

os futuros cromossomos sexuais, fazendo assim com que machos e fêmeas possuam

constituições cromossômicas diferentes.

Em Humanos, o sexo é determinando pela presença ou ausência do cromossomo Y,

onde se localiza o gene SRY, necessário para o desenvolvimento dos testículos (Sinclair et

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al., 1990). No caso dos mamíferos, as fêmeas possuem dois cromossomos X enquanto os

machos possuem um cromossomo X e um cromossomo Y.

O cromossomo Y é pequeno, possuindo cerca de 51Mb e possui poucos genes, por

volta de 100, estando estes envolvidos com determinação e desenvolvimento sexual

masculino, ou são genes de manutenção do metabolismo celular (housekeeping genes)

presentes na região pseudoautossômica (Skaletsky et al., 2003). Assim não há problema de

dosagem devido ao cromossomo Y. Porém o cromossomo X é relativamente grande,

possuindo cerca 155Mb e possui mais de mil genes, entre eles genes essenciais para o

desenvolvimento e diversas funções do corpo.

Essa diferenciação entre os cromossomos sexuais resulta em um desequilíbrio em

relação à dosagem dos produtos gênicos entre machos e fêmeas (Figura 4), e também entre

o par de cromossomos sexual e os demais pares de autossomos (revisto em Cheng e

Disteche, 2006; revisto em Payer e Lee, 2008). Em humanos, por exemplo, seria esperado

que as fêmeas possuíssem duas vezes mais produtos oriundos do cromossomo X que os

machos. Porém a quantidade de produtos nos dois sexos é muito semelhante, devido a

mecanismos de compensação de dosagem que equiparam machos e fêmeas quanto aos

produtos do X.

Figura 4. Determinação sexual genética. Com a exclusão da recombinação meiótica e com o

acúmulo de genes específicos do sexo masculino no cromossomo Y, muitos genes localizados no

cromossomo X estão agora presentes em apenas uma cópia nos machos, e em duas cópias nas

fêmeas, criando um desbalanço entre os sexos. Adaptado de Payer e Lee, 2008.

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1.3 Compensação de dose transcricional

Na maioria dos organismos modelo a compensação de dose tem se mostrado

essencial, e problemas nesse mecanismo impedem o desenvolvimento embrionário, sendo

incompatíveis com a vida (Payer e Lee, 2008).

Diferentes táxons exibem diferentes mecanismos de compensação de dosagem

(Figura 5). Em Drosófila os machos possuem um mecanismo de hipertranscrição de seu

único X de forma que o nível transcricional seja equivalente ao que ocorre nas células das

fêmeas, que possuem dois X (revisto em Cheng e Disteche, 2006).

Em C. elegans a presença de dois cromossomos X determina um hermafrodita, e

quando apenas um X está presente o individuo é macho. O hermafrodita (XX) reduz a

expressão de seus dois X de forma que a expressão seja semelhante à das células do

macho (X) (revisto em Cheng e Disteche, 2006). Nestes dois invertebrados o sexo é

determinado pela razão entre cromossomos sexuais e autossomos.

Figura 5. Mecanismos de compensação de dose. Em diferentes

táxons são encontrados diferentes mecanismos de compensação de

dosagem. Em C. elegans o hermafrodita (XX) reduz a expressão de

seus dois X (hipotranscrição) de forma que a expressão seja semelhante

a das células do macho (X). Já em Drosófila os machos possuem um

mecanismo de hipertranscrição de seu único X de forma que o nível

transcricional seja equivalente ao que ocorre nas células das fêmeas,

que possuem dois X. Em mamíferos o mecanismo de compensação de

dose é a inativação do cromossomo X, sugerido por Mary Lyon em 1961.

Modificado de:

http://www.wormbook.org/chapters/www_dosagecomp/dosagecomp.html

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Porém em alguns táxons os mecanismos de compensação de dosagem não são

conhecidos ou mesmo não se sabe se existem, como nas aves por exemplo (revisto em

Graves e Disteche, 2007).

Tanto aves quanto mamíferos possuem o sexo determinado cromossomicamente,

enquanto os mamíferos possuem o sistema XY, sendo a fêmea o sexo homogamético (XX) e

o macho o sexo heterogamético (XY), as aves possuem o sistema WZ, sendo os machos o

sexo homogamético (ZZ) e as fêmeas o sexo heterogamético (WZ). Nesses sistemas o sexo

do indivíduo é determinado no momento da fecundação e depende do gameta produzido

pelo sexo heterogamético (revisto em Graves, 2008).

Em mamíferos o sexo será determinado fundamentalmente pela presença e

funcionamento do gene SRY, presente no cromossomo Y, que específica primordialmente o

desenvolvimento de testículos no macho. Já nas aves o sexo também é determinado

geneticamente, mas o mecanismo ainda não está muito claro: alguns dados apontam para

um gene dominante no cromossomo W que induziria o sexo feminino, enquanto outros

dados apontam que a determinação genética dependeria da proporção de cromossomos Z

(Smith, 2007).

1.4 Inativação do Cromossomo X

Em mamíferos eutérios e metatérios (placentários e marsupiais, respectivamente) o

mecanismo de compensação de dose é a inativação do cromossomo X, sugerido por Mary

Lyon em 1961. Esse mecanismo funciona através da inativação transcricional de um dos

dois cromossomos X da fêmea em cada célula, gerando assim um mecanismo de

compensação de dose transcricional. A autora propôs que em todas as células das fêmeas

de mamíferos existe apenas um cromossomo X transcricionalmente ativo (Xa), assegurando

assim que a quantidade dos produtos gênicos produzidos pelo cromossomo X esteja em

equilíbrio entre machos e fêmeas (Lyon, 1961; Lyon, 1962).

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Mary Lyon baseou sua teoria em evidências citológicas da época, como por exemplo

o corpúsculo de Barr. Primeiramente observado por Barr e Bertram em 1949 em células

neurais de gatas, já havia sido associado por Susumo Ohno e seus colaboradores à

cromatina sexual, ou seja um único X altamente condensado. Eles observaram que ela é

encontrada de forma generalizada nas células das fêmeas de mamíferos, e não nas células

dos machos (Ohno et al., 1959; Lyon, 1962).

Outras evidências genéticas disponíveis na época eram o padrão de pelagem em

alguns animais, como por exemplo, nas gatas, onde as cores amarela e preta só aparecem

juntas nas fêmeas. Outra evidência era que a aneuploidia do X (presença de apenas um

cromossomo X) em fêmeas de camundongo não acarretava problemas, sendo essas

fêmeas de camundongo com um único X aparentemente normais e férteis (Lyon, 1961).

A descoberta da ICX levou a compreensão de muitos fenótipos de doenças ligadas

ao cromossomo X em mulheres, como por exemplo a Distrofia Muscular de Duchenne. A

distrofia muscular de Duchenne é um distúrbio genético de caráter recessivo ligado ao

cromossomo X, que afeta principalmente indivíduos do sexo masculino. Caracteriza-se pela

degeneração progressiva e irreversível da musculatura esquelética, sendo a forma mais

frequente de distrofia muscular. O gene afetado está localizado no braço curto do

cromossomo X, na região Xp21. Como a proteína distrofina é codificada no cromossomo X,

o homem afetado sempre apresentará o fenótipo associado à síndrome, ao contrário da

mulher que por possuir dois cromossomos X, quando um desses cromossomos é afetado o

outro compensará seu funcionamento, sendo a mulher portadora e podendo expressar um

fenótipo mais leve.

Sabe-se hoje que a ICX tem início no embrião feminino em estágio pré-

implantacional, mas o estágio exato varia dependendo do organismo. A necessidade da

compensação de dose pela ICX parece estar diretamente relacionada à ativação do genoma

próprio do zigoto, portanto por volta do estágio de duas células em camundongos (Flach et

al., 1982; Schultz, 1993), e por volta de oito células em humanos (van den Berg et al., 2009).

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O processo como um todo pode ser dividido em etapas essenciais como contagem,

escolha, iniciação do processo de silenciamento, e manutenção do X inativo (Xi).

Durante o processo de contagem, mecanismos identificam quantos cromossomos X

estão presentes na célula. E no processo de escolha a célula “seleciona” todos menos um

cromossomo X por genoma haploide para a inativação, sendo este mecanismo dependente

da proporção entre cromossomos X e autossomos e de elementos ligados a eles. Isso

garante que não ocorra a inativação do único X dos machos e que apenas um X esteja

transcricionalmente ativo nas células das fêmeas. Uma vez feita a escolha do X para ser

inativado, todas as células descendentes manterão essa mesma escolha.

Já o processo de silenciamento depende de uma região crucial no cromossomo X,

na banda 13q (Xq13), o chamado centro de inativação do cromossomo X (XIC, no inglês X

Chromosome Inactivation Center) (Brown et al., 1991b). Essa região foi descoberta por

Brown e colaboradores, em 1991, através de análises de camundongos que possuíam

translocações X: autossomos, permitindo assim mapear a região mínima necessária para

que ocorra a correta inativação do X.

Nessa região estão os principais genes responsáveis pela ICX, sendo o mais

estudado o gene XIST, um gene essencial para o processo de inativação (Penny et al.,

1996) expresso apenas no Xi. Esse gene produz um ncRNA nuclear que cobre o futuro Xi

em cis, recrutando as modificações epigenéticas necessárias no processo de inativação

(Brown et al., 1991a; Brown et al., 1992). A expressão desse ncRNA no início do

desenvolvimento embrionário é capaz de recrutar as modificações epigenéticas necessárias

para silenciar todo o cromossomo X (revisto em Payer e Lee, 2008).

Após o silenciamento do cromossomo, ele é mantido neste estado por mecanismos

como a continua transcrição de XIST, intensa metilação das ilhas CpG localizadas nas

regiões promotoras dos genes, e modificações de histonas (Czankovski et al., 2001). Uma

vez que o silenciamento do cromossomo X foi estabelecido, ele é mantido de forma estável

durante as sucessivas divisões celulares.

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Existem outros genes importantes situados no XIC, como o TSIX, localizado na fita

complementar do XIST, sendo transcrito na orientação antisenso em sua relação. Em

camundongos ele se sobrepõe a toda a extensão do gene Xist e a expressão desses dois

genes é mutuamente exclusiva em cis (Lee et al., 1999; Lee e lu, 1999). O cromossomo X

que permanecerá ativo é caracterizado pela transcrição do gene Tsix.

Em humanos ainda há controvérsias sobre a função do homólogo de camundongo

TSIX (Migeon et al., 2001; Migeon, 2003; Lee, 2003). Aparentemente o transcrito de TSIX

em humanos não sobrepõe inteiramente a sequência de XIST como ocorre em

camundongos. Portanto em humanos ainda não se sabe qual mecanismo regula a

expressão de XIST (Figura 6).

Figura 6. Centro de Inativação do Cromossomo X. Parte da região do XIC humano e murino

comparando a localização dos transcritos de XIST e TSIX e ilhas CpGs associadas. Blocos pretos

indicam os éxons de XIST; blocos brancos indicam as ilhas CpGs; as setas indicam o transcrito e a

direção de transcrição. O TSIX humano apresenta sua extremidade 3’ truncada, e a principal ilha CpG

reguladora de Tsix de camundongo não existe em humanos. Não há evidências que indique a

regulação de XIST por TSIX em humanos. Região relevante do XIC humano - 80Kb; Região relevante

do XIC murino - 60Kb. Adaptado de Migeon e col., 2002.

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Atualmente outros genes, como o XITE, e diversos outros transcritos menores

originados do XIC têm sido descobertos e estudados (revisto em Payer e Lee, 2008) (Figura

7).

Figura 7. Principais genes do XIC murino. Imagem esquemática do XIC de camundongo com

alguns de seus principais genes. A imagem mostra a localização e a direção da transcrição de alguns

elementos. Xist é um RNA não codificador, com função de silenciar o Xi. Tsix é um RNA não

codificador antisenso de Xist com função de regulá-lo, e recrutar modificadores da cromatina para a

região promotora do Xist. Xite é um RNA não codificador que age como acentuador (enhancer) de

Tsix, e também atua nos processos de contagem e pareamento dos cromossomos X. Modificado de

Payer e Lee, 2008.

Outro ponto importante é a manutenção do padrão de inativação. Quando a escolha

do X que vai ser inativado é aleatória, esse padrão é perpetuado para as células filhas. Uma

das consequências deste processo é que as fêmeas apresentam duas populações de

células no organismo, uma expressando o cromossomo X de origem materna e outra o X de

origem paterna, resultando em um mosaicismo somático (Thompson et al., 1993). Em

humanos, essa condição é evidenciada em mulheres portadoras de genes mutados para

algumas doenças ligadas ao X, como amelogênese imperfeita, albinismo ocular ou no

padrão de pelagem de alguns animais (Lyon, 1962).

Quando o padrão de ICX é aleatório espera-se que 50% das células tenham

inativado o X paterno e os outros 50% o X materno, entretanto por se tratar de um processo

aleatório, ele segue a distribuição de uma curva normal, podendo assim existir mulheres

com desvios, localizadas nas extremidades da curva.

A inativação do cromossomo X não é completa, e por volta de 15% dos genes no Xi

escapam à inativação e são expressos de forma bialélica, e outros 10% dos genes

apresentam padrões de expressão variáveis entre as mulheres estudadas (Carrel e Willard,

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2005). Dentre os genes que escapam à ICX muitos estão localizados na região

pseudoautossômica, e por estarem presentes tanto no cromossomo X quanto no

cromossomo Y não necessitam de compensação de dose entre machos e fêmeas. Já

aqueles genes que se encontram fora dessa região pseudoautossômica e escapam da

inativação, acabam apresentando duas vezes mais produtos nas fêmeas que nos machos

(revisto em Payer e Lee, 2008). A importância da expressão bialélica desses últimos fica

evidente em pacientes com síndrome de Turner 45,X (síndrome caracterizada por

monossomia parcial ou completa do cromossomo X), ou trissomia do X (47,XXX), ou ainda

em meninos com dois cromossomos X (síndrome de Kleinefelter 47,XXY), visto que se a

inativação fosse completa, esses indivíduos não apresentariam diferenças fenotípicas em

relação à população normal. Em camundongos cerca de 3% dos genes escapam da ICX,

explicando assim o fato de camundongos 39,X serem fêmeas viáveis e férteis, enquanto

humanos 45,X são mulheres com síndrome de Turner, com falha no desenvolvimento sexual

e algumas anormalidades fenotípicas. Na síndrome de Klinefelter onde os indivíduos

apresentam um cromossomo Y e dois ou mais X, também tem seu fenótipo agravado de

acordo com a quantidade de cromossomos X herdados.

1.5 Quanto ao padrão de inativação do cromossomo X

Nas fêmeas marsupiais, a ICX ocorre de forma “imprintada” (do inglês imprinted) e

em todos os tecidos estudados o X de origem paterna é inativado preferencialmente

(Sharman, 1971; Cooper et al., 1971; Johnston e Robinson, 1987; VandeBerg et al., 1979).

A metodologia utilizada por Sharman em 1971 para determinar esse padrão de ICX

foi a observação da replicação do cromossomo X, que é atrasado no X inativo em relação

aos outros cromossomos. Para identificar a origem parental do X inativado ele utilizou como

modelo animais híbridos de Wallaroo, Euro, e Red Canguru. Nesses híbridos a morfologia

do cromossomo X é diferente dependendo da origem parental, e assim ele pôde definir que

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o cromossomo X que se replicava tardiamente era o de origem paterna. Desde então outros

trabalhos usando diversas técnicas chegaram à mesma conclusão.

Hoje acredita-se que ICX “imprintada” seja o mecanismo ancestral de compensação

de dose, sempre inativando o X paterno, e nos eutérios esse sistema foi substituído por um

processo aleatório de escolha do X inativo em todos os tecidos de origem embrionária (Mills

e Moore, 2006; revisto em Deakin et al., 2009). Entretanto, alguns eutérios ainda mantêm o

mecanismo “imprintado” de ICX exclusivamente nos tecidos extraembrionários, como ratos e

camundongos (Okamoto et al., 2004; Wake et al., 1976; Takagi e Sasaki, 1975; Harper et

al., 1982).

Os mamíferos são inteiramente dependentes dos nutrientes maternos obtidos

através da placenta durante o desenvolvimento embrionário, assim este órgão se torna um

local muito importante para a regulação gênica, já que tem a função de controlar as trocas

entre o organismo materno e a prole (Fowden et al., 2006; Georgiades et al., 2001).

Entretanto nosso conhecimento sobre a ICX em tecidos extraembrionários e suas variações

é praticamente todo oriundo de camundongos e humanos. Essa limitação pode distorcer

algumas interpretações, devido à por exemplo, dinâmicas de desenvolvimento dos embriões

completamente diferente entre espécies (Berg et al., 2011), dificultando ou mesmo

impedindo certas extrapolações.

Em camundongos a ICX ocorre em dois momentos durante o desenvolvimento

embrionário. Primeiro, ainda na fase de pré-implantação, no estágio de quatro células, o

cromossomo X paterno é inativado preferencialmente e permanece assim nas células que

darão origem aos tecidos extraembrionários (Huynh e Lee, 2003; Okamoto et al., 2004).

Mais tarde no desenvolvimento embrionário, no estágio de blastocisto, as células da massa

celular interna passam por um processo de desmetilação global, reativando o X paterno,

para em seguida passar por um segundo processo de inativação, que dessa vez ocorre de

maneira aleatória (Mak et al., 2004; Okamoto et al., 2004).

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Já em humanos, o estado da ICX em tecidos extraembrionários foi reavaliado por

nosso grupo utilizando uma análise mais ampla e identificou-se que a placenta humana

apresenta um padrão de ICX aleatório (Moreira de Mello et al., 2010). Na literatura os relatos

eram controversos, com resultados variando desde a expressão preferencial do X materno,

similar ao padrão “imprintado” de murinos (Goto et al., 1997; Harrison, 1989; Harrison e

Warburton, 1986; Ropers et al., 1978; Uehara et al., 2000), até resultados indicando o

padrão de ICX como aleatório (Looijenga et al., 1999; Migeon e Do, 1978; Mohandas et al.,

1989; Willemsen et al., 2002; Zeng e Yankowitz, 2003). A discordância entre estes estudos

se deve à metodologia usada, pois esses trabalhos se basearam na observação da

expressão de apenas um ou no máximo dois genes ligados ao X, e utilizaram poucas

amostras em suas análises (Moreira de Mello et al., 2010).

Moreira de Mello e col., realizaram um estudo onde verificaram a expressão alelo-

específica de 22 genes distribuídos ao longo de todo o cromossomo X, uma metodologia

muito mais robusta que ainda não havia sido empregada nesse tipo de análise. Ao todo

foram utilizados 27 polimorfismos de base única (SNPs - do inglês single-nucleotide

polymorphism) em regiões expressas, tornando esse trabalho muito mais abrangente que os

anteriores. Foram genotipadas 25 amostras de placentas, totalizando mais de 200 SNPs

informativos, representando uma média de 10 amostras informativas para cada gene

(Moreira de Mello et al., 2010).

Moreira de Mello e col., (2010) demonstraram em suas análises a importância de

uma estratégia de análise global de expressão gênica alelo-específica ao longo do X em

células humanas normais. A complexidade dos resultados individuais puderam ainda

explicar a falta de concordância entre os vários estudos publicados até hoje, pois

dependendo da escolha e do número de genes observados os resultados podem ser

diferentes, pois diversos genes apresentam um comportamento diferente dependendo da

amostra analisada (Moreira de Mello et al., 2010).

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Em bovinos, devido à sua importância econômica, diversos métodos reprodutivos

são empregados, como por exemplo a inseminação artificial, fertilização in vitro e clonagem,

agrupados pelo nome de Tecnologias de Reprodução Assistida (ART – do inglês assisted

reproductive technologies). Porém, é reconhecido que a produção e manipulação de

embriões in vitro pode afetar os mecanismos epigenéticos (Allen e Reardon, 2005; Gosden

et al., 2003; Niemann e Wrenzycki, 2000; Rizos et al; 2002), podendo portanto causar

alterações no processo de ICX, o que poderia comprometer a qualidade dos embriões e as

taxas de gravidez.

No entanto, o padrão de ICX em placenta bovina não está claro. Ele foi verificado em

2002 analisando-se a expressão de um único gene e os autores concluíram que o padrão

era “imprintado” (Xue et al., 2002). A análise da expressão desse único gene em placenta

bovina, tanto de animais gerados através de reprodução natural quanto de animais nascidos

vivos a partir de processos de clonagem, mostrou um padrão de inativação preferencial do

cromossomo X paterno (Xue et al., 2002).

Assim, uma determinação mais precisa do padrão de ICX em tecidos

extraembrionários bovinos pode contribuir com nosso entendimento tanto da própria ICX

quanto do impacto dos métodos de reprodução assistida que são empregados. Com novas

informações sobre o genoma bovino disponíveis, como por exemplo o Cow Genome Project

entre outros, torna-se possível estudar tais questões (The Bovine Genome Sequencing and

Analysis Consortium et al., 2009; Reese et al., 2010; Childers et al., 2011; The Bovine

HapMap Consortium, 2009).

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2 Objetivos

O objetivo geral deste trabalho foi determinar o padrão de inativação do cromossomo

X em tecido extraembrionário bovino através de uma análise mais ampla. Mais

especificamente:

– Determinar qual o melhor método para construção de um painel de polimorfismos

de base única (SNPs) em regiões expressas de genes localizados no cromossomo X

bovino, para análise mais abrangente do perfil de expressão gênica;

– Reavaliar se a inativação do cromossomo X em tecido extraembrionário bovino

ocorre de modo aleatório ou de modo “imprintado” inativando um dos cromossomos X

preferencialmente, através da análise de seu padrão de expressão alelo-específico através

de genotipagem de SNPs em regiões codificadoras de diversos genes;

– Caso o padrão de expressão seja monoalélico, identificar a origem parental do

alelo expresso.

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3 Materiais e métodos

3.1 SNPs

Foram selecionados SNPs localizados em regiões codificadoras e que somente

gerem troca de base com efeito sinônimo. Esses SNPs foram utilizados para a identificação

da expressão alelo-específica. As amostras que forem heterozigotas para determinado SNP

são informativas, e terão seu cDNA analisado.

3.2 SNPs Bovinos

Apesar do genoma da espécie Bos taurus já ter sido sequenciado, ainda não

sabemos a relação completa de genes do cromossomo X, nem a relação completa dos

genes expressos em placenta. Há também o problema de se identificar os genes que

escapam à ICX, e apresentam assim expressão bialélica. Assim, há a necessidade de se

analisar o maior número possível de polimorfismos disponíveis em genes já mapeados no

cromossomo X de bovinos. Para isso foram testadas duas metodologias para seleção e

construção desse painel de SNPs:

3.2.1 Seleção dos polimorfismos através da técnica de Array de SNPs

O ensaio utilizado pelo Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular Animal da

UNESP – Araçatuba, sob direção do Prof Dr José Fernando Garcia foi o Illumina Infinium®

BovineHD BeadChip assay. Ele contém sondas para interrogar 786.799 SNPs no genoma

bovino, e possui marcadores em 429 genes localizados no cromossomo X bovino. Os

experimentos foram feitos pelo aluno de Doutorado Yuri Tani Utsunomiya, e os dados nos

foram fornecidos.

3.2.2 Seleção manual dos polimorfismos em banco de dados

Bancos de dados e ferramentas disponíveis no portal do NCBI

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC

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(http://hgw4.cse.ucsc.edu), Ensembl (http://www.ensembl.org) e no Bovine Genome Project

(https://www.hgsc.bcm.edu/other-mammals/bovine-genome-project), foram utilizados

visando à identificação dos SNPs em éxons de genes em diferentes regiões do cromossomo

X expressos em placenta.

Foram escolhidos os que apresentavam maior frequência, para aumentar as chances

de se encontrar amostras heterozigotas (e, portanto informativas) na população analisada.

No entanto esses dados de frequência, quando disponíveis, geralmente se aplicam a

rebanhos norte americanos ou europeus, não representando muito bem o contexto

brasileiro. Demos preferência também aos SNPs que já possuíam informações e

confirmações na literatura.

3.3 Desenho dos Iniciadores

Os pares de iniciadores (primers) foram feitos utilizando o programa Primer3Plus

Version: 2.3.3 (disponível em http://primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi)

(Untergasser et al., 2012). Foram seguidas as condições padrões fornecidas pelo programa,

exceto nos parâmetros conteúdo de CG, alterado para variar apenas entre 45 e 60, e a

temperatura de anelamento dos iniciadores, alterado para variar entre 58-62; essas

alterações visaram uma maior especificidade dos pares de iniciadores.

O programa Gene Runner versão 3.01 da Hastings Software, Inc. foi utilizado para

buscar autocomplementariedade entre os iniciadores de cada par. Também foi analisado se

eles formavam grampos, o que poderia influenciar negativamente os experimentos. Todos os

pares de iniciadores feitos foram aprovados nos testes feitos nesse programa.

Programas de PCR in silico do banco de dados UCSC (http://genome.ucsc.edu/cgi-

bin/hgPcr) e o Primer Blast do NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) foram

utilizados para testar os pares de iniciadores e confirmar a não amplificação de sequências

inespecíficas, sendo a sequência alvo a única amplificada no genoma.

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Os pares de iniciadores para amplificação de cDNA foram desenhados de modo que

se anelem a dois éxons diferentes, garantindo a especificidade para amplificação de cDNA,

evitando a amplificação de DNA genômico contaminante ou sua fácil detecção.

Foi pedido um total de 35 pares de iniciadores para a análise de 56 SNPs no total.,

sendo 30 pares de iniciadores para amplificação do DNA genômico e genotipagem, e 5

pares de iniciadores pedidos posteriormente exclusivos para o cDNA. Todos os iniciadores

foram desenhados evitando polimorfismos na região de anelamento com a sequência alvo, e

sintetizados pela empresa Exxtend. As informações referentes a esses iniciadores

encontram-se no Anexo 1, onde constam o nome dos genes, identificação do SNP,

polimorfismo, sequência dos pares de iniciadores e tamanho do fragmento amplificado.

3.4 Animais - Bos taurus

Os animais usados nesse estudo foram vacas da raça GIR, com genealogias

fechadas em animais importados da Índia (POI – pura origem importado) (Figura 8). GIR é

uma das principais raças zebuínas (Bos taurus indicus), sendo utilizados como produtores

de carne e leite, com linhagens que se destacam mais pela produção leiteira, como a

utilizada neste trabalho. Todo o rebanho está inscrito no serviço de registro da ABCZ e seus

dados zootécnicos, sob controle da mesma entidade, tanto na produção do leite como em

todas as avaliações processadas pelo Programa de Melhoramento Genético de Zebuínos –

PMGZ.

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Figura 8. Gado zebuíno da raça GIR. Foi utilizada nesse estudo a raça GIR com genealogias

fechadas em animais importados da Índia (POI). Foram utilizadas linhagens que se destacam pela

produção leiteira (Associação Brasileira de Gir Leiteiro - ABCGIL).

3.5 Obtenção das amostras

As amostras bovinas foram obtidas a partir de uma parceria com a Fazenda

Sant’anna, localizada na cidade de Rancharia – SP. A Fazenda Sant’anna é uma fazenda de

pecuária comercial, e atualmente o rebanho está localizado na Fazenda Entroncamento em

Rancharia/SP.

Foi montado um banco de sete amostras de placentas bovinas diferentes coletadas

no momento do nascimento, tendo sido coletados vários segmentos não adjacentes visando

fornecer um panorama mais geral da placenta. Todas colhidas de nascimento de fêmeas e

acompanham amostras de DNA materno.

Os bovinos possuem a placenta do tipo cotiledonária. Nesse tipo de placenta, as

vilosidades coriônicas ficam agrupadas em regiões circulares bem definidas denominadas

cotilédones, de onde foram coletados segmentos de 0,5 cm de espessura das 7 placentas,

sendo colhidos em 2 cotilédones diferentes, 2 segmentos não adjacentes por cotilédone.

Os segmentos foram cuidadosamente lavados em solução tampão fosfato-salina

(PBS) pH 7,4 para remoção do sangue e imediatamente submergidos em 3,0 mL de solução

estabilizadora de RNA total (RNAlater QIAGEN) aliquotados em tubos plásticos estéreis,

visando a estabilização de seu conteúdo de RNA total, tomando-se as devidas precauções

para evitar contaminação com a decídua materna na amostra, visto que um problema ao se

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lidar com a placenta é a possibilidade de contaminação por células maternas, levando a um

desvio na expressão (Khatib, 2007).

De acordo com as indicações do fabricante, os fragmentos imersos nessa solução

foram mantidos de um dia para o outro em ambiente refrigerado entre 2 e 8°C, e depois

transferidos e estocados a -70°C.

A fim de se obter o DNA genômico parental, foram coletadas amostras de pelos das

vassouras das caudas das fêmeas após o nascimento do filhote. Foi tomado o cuidado para

que os pelos estivessem secos e limpos quando da coleta, e o excesso dos pelos foi cortado

com uma tesoura limpa.

Após a coleta, verificou-se se os pelos apresentavam os bulbos intactos, e foram

então estabilizadas imergindo-os imediatamente em microtubos estéreis com tampa de

rosca contendo 500 μL de solução NaOH 50 mM, e mantidos em ambiente refrigerado entre

2 e 8°C, e posteriormente devidamente armazenados em freezer a -20°C, para posterior

extração do DNA adequadamente (Salman e Laureano, 2006).

3.6 Extração de ácidos nucleicos

3.6.1 DNA

O DNA genômico das amostras de placenta foi obtido a partir de fragmentos de

aproximadamente 25 mg. As amostras de placenta retiradas do mesmo cotilédone foram

processadas juntas, evitando assim a obtenção de um resultado desviado, devido ao

mosaicismo somático presente nos tecidos das fêmeas.

Os fragmentos foram inicialmente digeridos em 360 μL de solução de lise celular

(Amersham Biosciences, GE) aos quais foram adicionados 40 µL de proteinase K (20

mg/mL). Após o período de incubação em banho-maria a 55°C por aproximadamente 16

horas, o DNA foi purificado com o auxílio do kit comercial GFX™ Genomic Blood DNA

Purification Kit (Amersham Biosciences, GE) de acordo com as instruções do fabricante.

Após extração e eluição em 500 µL de água deionizada, o DNA foi quantificado utilizando

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um espectrofotômetro e o NanoDrop® da Thermo Fisher Scientific. O DNA foi estocado a

4°C.

3.6.2 RNA

Para se ter acesso ao RNA total das amostras de placenta, fragmentos de

aproximadamente 100 mg foram triturados em almofariz de porcelana adicionando-se

nitrogênio líquido. Foi então adicionado 1,5 mL do reagente comercial TRIzol® (Invitrogen)

com 20 µL de proteinase K (20 mg/mL) dissolvida. O material em solução foi deixado por 30

minutos em banho-maria a 55°C, e a purificação do RNA total seguiu de acordo com o

protocolo fornecido pela Invitrogen. O RNA foi quantificado utilizando um espectrofotômetro

e o NanoDrop® da Thermo Fisher Scientific e estocado a -70°C.

3.6.3 DNA parental

Para extração do DNA dos bulbos capilares dos pelos extraídos das caudas das

fêmeas foi seguido protocolo adaptado de Salman e Laureano, 2006. Foi colocado em tubo

estéril de microcentrífuga (1,5mL) cerca de 120 folículos por animal e centrifugados

rapidamente. Adicionados 500 µL de solução TE-TWEEN (Tris 50 mM, EDTA 1 mM, 0,5%

Tween 20) em cada amostra. Foram incubadas em banho-maria a 65ºC por uma hora com

agitação periódica. Proteinase K foi adicionada para concentração final de aproximadamente

2,4 µg de proteinase K/µL. Incubado a 55ºC por 6 a 12 horas com agitação periódica e

depois a 37ºC por uma noite. Foi adicionado 1 volume de solução PCI (fenol-clolofórmio-

álcool isoamílico) para 1 volume de amostra e agitado vigorosamente os tubos por 10

segundos em agitador automático, seguido de centrifugação por 10 minutos. O

sobrenadante foi transferido para um tubo estéril de microcentrífuga (2 mL), e o DNA foi

precipitado com acetato de sódio 0,3 M na quantidade relativa à 1/10 do volume da amostra

e aproximadamente 1 mL de etanol gelado.

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Os tubos foram misturados por inversão e colocados no freezer -80ºC por 1 hora,

seguido de centrifugação a 23ºC por 20 a 30 minutos a 12.000 rpm. O sobrenadante foi

então descartado e o DNA foi seco em temperatura ambiente. As amostras de DNA foram

então armazenadas em 50 µL de água deionizada.

3.7 Tratamento das amostras de RNA com DNAse e síntese de cDNA

O RNA total obtido daquelas amostras de placenta que foram determinadas

geneticamente heterozigotas para os polimorfismos selecionados foram submetidas ao

protocolo para síntese de cDNA.

Para evitar contaminação com material genômico, todas as amostras de RNA foram

tratadas com DnAse (Turbo DNA-free, Ambion). Utilizando cerca de 1 a 2 µg do RNA total

previamente tratado foi sintetizado o cDNA, utilizando-se iniciadores aleatórios (random

primers) e a transcriptase reversa MML-V de acordo com as especificações do fabricante

(Invitrogen).

Como controle do tratamento para verificar eventual contaminação com DNA

genômico, que levaria a desvios na análise dos dados, o protocolo também foi seguido com

uma alíquota de cada amostra onde não foi adicionada a transcriptase reversa (RT-).

Durante as reações de PCR, além do controle negativo sem adição de cDNA, o respectivo

RT- era também submetido às condições de amplificação, e o material amplificado

submetido à eletroforese em gel de poliacrilamida 10% e a coloração realizada com solução

de nitrato de prata (2 g/L). Devido a alta sensibilidade desde corante, qualquer indício de

contaminação pode ser detectado. Em caso de material amplificado no controle de RT-, o

cDNA era excluído e o RNA correspondente passava por um novo tratamento com DNAse.

As amostras de cDNA (e de RT-) foram mantidas sob refrigeração de -20°C.

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3.8 Amplificação por técnica de PCR e RT-PCR

A genotipagem das amostras de DNA genômico de tecido extraembrionário e

parental foi feita através de amplificação pela reação de PCR, combinadas com técnicas de

sequenciamento direto.

Entre 50 e 100 ng de DNA ou cDNA foram amplificados usando 1,0 U de Taq DNA

Polimerase (Amersham), 1X de tampão (Amershan), 200 μM de dNTPs (Invitrogen), 150 nM

de cada iniciador, num volume final de 20 μL. Para alguns pares de iniciadores a reação foi

realizada na presença de 1 M betaína ou 10% DMSO.

Os produtos amplificados a partir de DNA foram separados por eletroforese a 100 V

por cerca de 20 minutos em gel de agarose 1% 1X TAE (5,5 x 6,0 cm), em solução 1X TAE,

corados com 0,5 μg/mL de brometo de etídio (Invitrogen) e observados sob luz ultravioleta.

Já o material amplificado a partir de cDNA foi submetido à eletroforese a 100 V por 1

hora em gel de poliacrilamida 6 % 1X TBE (10 x 10 cm), em solução 1X TBE, corado com

100 mL de solução de nitrato de prata (2 g/L) (protocolo modificado de Santos et al., 1993),

já que o gel de poliacrilamida apresenta uma resolução superior na separação dos

fragmentos amplificados, importante para a verificação de inespecificidade ou

contaminação.

3.8.1 Purificação de produtos de PCR com EXO/SAP

A reação de PCR utiliza um par de iniciadores, dNTPs (Desoxirribonucleotídeos

Fosfatados) e a enzima DNA polimerase para produzir múltiplas cópias de uma sequência

específica de DNA. Após o fim da reação grande parte dos iniciadores e dNTP não foram

utilizadas na reação, e se não forem retirados poderão interferir na reação de

sequenciamento.

Foram utilizadas então as enzimas Exonuclease I (Exo I) e Shrimp Alkaline

Phosphatase (SAP – fosfatase alcalina de camarão) para a remoção destes materiais

indesejados. A enzima Exo I irá digerir o excesso de iniciadores e a enzima SAP irá

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degradar o excesso de nucleotídeos. Depois deste procedimento o sequenciamento é feito

normalmente. O tratamento foi realizado de acordo com o protocolo da Exonuclease I e

Shrimp Alkaline Phosphatase da GE Healthcare.

3.9 Reação de sequenciamento direto

Os produtos bem-sucedidos na reação de amplificação foram submetidos à reação

de sequenciamento direto. A reação foi empregada na genotipagem das amostras,

utilizando-se o iniciador que traria o melhor resultado, F ou R, de acordo com a distância em

relação à posição do SNP (≥ 100 bases). Os produtos de PCR foram então diluídos em H2O

bi-destilada autoclavada, em proporção de 1:6, e dessa diluição foi usado 1 μL em uma

reação com 1 μL BigDye® Terminator v3.1 do Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems),

1X tampão, 120 nM de iniciador, num volume final de 15 μL, seguindo protocolo do

fabricante. Foi utilizado um programa com 40 ciclagens de 95°C por 18 segundos, 55°C por

12 segundos e 60°C por 4 minutos.

Para a remoção dos excedentes e resíduos da reação de sequenciamento, o produto

da reação foi precipitado acrescendo-se 60 μL de isopropanol 65%, submetido à agitação

moderada por 10 segundos para sua homogeneização, e em seguida deixados à

temperatura ambiente por 20 minutos no escuro, para evitar degradação do BigDye®. A

amostra foi então centrifugada por 45 minutos a 20.800 rcf e o sobrenadante foi descartado.

Adicionou-se ao precipitado 170 μL de etanol 60% e submeteu-se a nova centrifugação por

10 minutos a 20.800 rcf. O sobrenadante foi descartado e o tubo foi deixado aberto no

escuro por 20 minutos em estufa a 37°C.

Também foi usada a metodologia para remoção dos excedentes e resíduos da

reação de sequenciamento utilizando kit Sephadex® (Pharmacia Biotech Ab). Esse método

usa a filtração em colunas de gel para separar pequenas moléculas, e garante alta

recuperação do DNA. A purificação das reações de sequenciamento foi realizada por

Sephadex® G-50 Fine DNA Grade (Pharmacia Biotech Ab), em placas com filtro Multiscreen

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HV com 96 orifícios.

Após a purificação as amostras foram encaminhadas para sequenciamento

automático no aparelho ABI PRISM 3730 DNA ANALYZER (Applied BiosystemsTM/Hitashi)

do Laboratório de Genômica e elementos de transposição – GaTE Lab - do Departamento

de Botânica do Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo (Docente

responsável: Profa. Dra. Marie-Anne Van Sluys; técnica responsável: Tatiana Caroline

Silveira Corrêa).

3.10 Análise dos dados

A análise dos dados visa à determinação do padrão de ICX em tecido

extraembrionário bovino. De acordo com o SNP expresso no cDNA é possível determinar o

padrão de expressão desse gene. A análise foi feita no software Chromas 2.4.3

(Technelysium®).

3.10.1 Análise dos eletroferogramas

Na figura 9 estão representados os dois padrões de ICX que poderão ser observados

através do sequenciamento direto. As amostras de placenta que forem geneticamente

informativas (heterozigotas) terão também seu respectivo cDNA sequenciado.

Na análise visual dos eletroferogramas obtidos, podemos interpretar o padrão de

expressão monoalélico como inativação preferencial de um dos cromossomos X, enquanto a

expressão dos dois alelos na posição do polimorfismo significa que a amostra possuía

células contendo os diferentes cromossomos X ativos, ou seja, resultado de uma ICX

aleatória (Vasques e Pereira, 2001) (Figura 9).

Sempre que uma amostra informativa apresentava apenas um dos alelos no

sequenciamento do cDNA, ou seja, expressão monoalélica, e o DNA materno indicava

homozigose para o mesmo locus foi possível determinar a origem parental do alelo

expresso.

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Figura 9. Exemplo da visualização dos padrões esperados de ICX em eletroferogramas. Acima,

amostra de DNA genômico de placenta heterozigoto para o SNP de interesse (A/T). Abaixo do lado

esquerdo: o sequenciamento do cDNA revela apenas um alelo expresso, ou seja, um padrão de

inativação preferencial; abaixo do lado direito: o sequenciamento revela expressão dos dois alelos na

amostra, portanto um padrão aleatório de inativação. O locus polimórfico está evidenciado pelo

retângulo amarelo.

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4 Resultados

4.1 Obtenção das amostras

Para construção do banco de placentas adequado ao nosso estudo, quanto maior a

variabilidade entre os animais maiores as chances de se encontrar indivíduos heterozigotos

para SNPs, e portanto informativos para o trabalho realizado. No entanto, os animais

disponíveis para serem utilizados possuíam um elevado grau de parentesco, reduzindo

assim sua variabilidade genética, já que todas as fêmeas do rebanho estudado são oriundas

de apenas 3 touros reprodutores, reduzindo assim nossas chances de encontrar amostras

informativas.

4.2 Coleta das placentas bovinas

Os bovinos possuem uma placenta do tipo epitélio corial, onde o epitélio do útero se

localiza junto ao córion fetal. Quanto ao modo em que se estabelece a união do córion (fetal)

ao endométrio (materno) a placenta pode ser classificada como zonária, difusa, discoidal ou

cotiledonária. A placenta discoide ocorre, por exemplo, nos humanos, onde as vilosidades

coriônicas ficam dispostas formando um disco, estando as faces materna e fetal em estrito

contato. Já os bovinos possuem a placenta do tipo cotiledonária. Nesse tipo de placenta, as

vilosidades coriônicas não são distribuídas uniformemente por toda a superfície do cório,

ficando agrupadas em regiões circulares bem definidas denominadas cotilédones (Figura

10). Estes cotilédones se desenvolvem em regiões onde o cório faz contato com áreas

predeterminadas do endométrio, aglandulares, conhecidas como carúnculas, dando origem

ao placentoma, por onde existe a comunicação materno-fetal (Oliveira et al., 2010; Boos et

al., 2003).

Em humanos ocorre a placenta hemocorial, que é a placenta de maior intimidade

entre a parte fetal e materna. Isso torna muito mais propenso à contaminação durante a

coleta das amostras. Já a coleta das amostras da placenta bovina é facilitada, evitando

assim um dos maiores problemas que seria a contaminação com material materno, já que

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isso geraria cDNA a partir de RNAs tanto fetais quanto maternos, levando a um desvio para

expressão diferencial, ou mesmo não permitindo a identificação de genes “imprintados”

(Khatib, 2007).

Figura 10. Anatomia da placenta bovina. Na placenta do tipo cotiledonária as vilosidades coriônicas

ficam agrupadas em regiões circulares bem definidas denominadas cotilédones. Fonte

http://eagaspar.com.br/mcguido/placentacao.htm.

4.3 Seleção dos polimorfismos através da técnica de Array de SNPs

Em um primeiro momento foi avaliada a possibilidade de selecionar os SNPs e

genotipar as amostras de placentas através do método de array de SNP. Os experimentos

foram feitos pela equipe do Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular Animal da

UNESP – Araçatuba, sob direção do Prof. Dr. José Fernando Garcia, pelo aluno de

Doutorado Yuri Tani Utsunomiya, e os dados nos foram fornecidos.

O ensaio utilizado foi o Illumina Infinium® BovineHD BeadChip assay, possuindo alta

reprodutibilidade e baixa taxa de erro. Este ensaio contém sondas para interrogar 786.799

SNPs no genoma bovino, e possui marcadores em 429 genes localizados no cromossomo X

bovino.

Para a escolha dos polimorfismos de base única úteis para este trabalho algumas

características são fundamentais. Primeiramente o SNP deve estar presente no

cromossomo X bovino, e em uma região codificadora, deve também ser expresso em

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tecidos extraembrionários, só assim será possível analisar sua expressão e assim

determinar o padrão de ICX e a origem parental do alelo expresso.

Em uma primeira análise dos dados brutos gerados pelo ensaio, o alvo foi identificar

aqueles polimorfismos presentes no cromossomo X. O total de SNPs localizados no

cromossomo X interrogados pelo ensaio foi de 40.253.

Em uma segunda análise, restringimos essa identificação para polimorfismos

presentes no cromossomo X que se encontravam em genes (SNPs intragênicos), excluindo

portanto aqueles localizados em regiões intergênicas. Em decorrência das regiões

regulatórias, a região intragênica também compreende as regiões intergênicas de 5kb

imediatamente após as UTRs (untranslated region/região não traduzida), tanto a 5' UTR

(upstream) quanto 3' UTR (downstream). De acordo com esses critérios foram encontrados

6.319 SNPs.

Uma nova análise foi efetuada visando selecionar aqueles SNPs que se

encontrariam no transcrito maduro, e portanto no cDNA gerado. Excluindo assim SNPs em

íntrons, e selecionando apenas aqueles presentes em éxons e regiões UTR. Foram então

localizados 301 SNPs que potencialmente estariam presentes no cDNA.

Para que sejam utilizados nesse trabalho é necessário que os SNPs selecionados

gerem troca de base apenas com efeito sinônimo ou que estejam nas regiões UTR, não

causando assim alterações na proteína gerada. Dos 301 SNPs selecionados previamente

109 deles possuem trocas de bases que alterariam a proteína produzida devido a mutações

mutações do tipo missense/ocorre troca do aminoácido, ou alterando sítios de

processamento (splicing). Assim foram encontrados 192 SNPs que atendem aos requisitos

para este trabalho, ou seja, estar em regiões expressas (éxons e UTR) e que não alterem a

proteína. A tabela 1 resume a análise dos dados a partir da seleção dos 6.319 SNPs.

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Tabela 1. Resumo dos dados gerados através do Array.

SNPs presentes em regiões não expressas

SNPs presentes em regiões intergênicas próximas 1888

SNPs presentes em sítios de processamento (splicing) 19

SNPs presentes em íntrons 4111

Total de SNPs presentes em regiões não expressas 6018

SNPs presentes em regiões expressas

Outro fator que diminuiria a quantidade de SNPs úteis a este trabalho é que nem

todos os genes do cromossomo X são expressos em placenta, e ainda alguns genes são

expressos apenas em momentos determinados do desenvolvimento. Para determinar quais

genes são expressos ou não, também seria válido o uso do Illumina BovineHD BeadChip

assay com cDNA de placenta para verificar quais genes do cromossomo X presentes nessa

plataforma são expressos em placenta, nos fornecendo uma ideia da expressão gênica do

cromossomo X em placenta bovina de maneira global. No entanto já existem bancos de

dados que possuem essa informação, e podem ser acessados para saber quais dos SNPs

encontrados são realmente expressos em placenta (EST Profile em UniGene - NCBI

UniGene Bos taurus Build 101 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/unigene).

Esses 192 SNPs identificados no ensaio podem então ser utilizados para análise da

expressão gênica, através de PCR convencional seguida de sequenciamento direto. Isso é

possível pois através do SNP ID é possível fazer uma busca no genoma para a obtenção de

toda a sequência. Assim esses dados fornecem um excelente ponto de partida para seleção

dos genes, visto que o universo de 40.253 SNPs presentes no cromossomo X foi reduzido

SNPs presentes na região 3’UTR 62

SNPs presentes na região 5’UTR 6

SNPs que não alteram a estrutura da proteína 124

SNPs que alteram a estrutura da proteína 109

Total de SNPs presentes em regiões expressas 301

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36

para 192 SNPs que poderiam ser utilizados neste estudo, necessitando de apenas mais

uma etapa de análises para selecionar aqueles expressos em tecido extraembrionário.

4.4 Seleção manual dos polimorfismos em banco de dados

4.4.1 Uso de banco de dados

Ao contrário do genoma humano, cujo primeiro rascunho data do ano 2000, as

informações sobre o genoma bovino são muito mais limitadas. O genoma bovino foi

sequenciado somente em 2009 (Zimin et al., 2009; Canavez et al., 2012), tendo como um

dos principais objetivos a descoberta de genes que controlam características de interesse

econômico, com influência direta nos programas de avaliação e melhoramento genético de

bovinos. Os pesquisadores identificaram que o genoma bovino é composto por cerca de 22

mil genes e apresenta altos níveis de conservação em sua estrutura quando comparado ao

genoma humano (Zimin et al., 2009; Canavez et al., 2012; The Bovine Genome Sequencing

and Analysis Consortium et al., 2009; The Bovine HapMap Consortium, 2009).

Devido ao interesse econômico existente em relação a esses animais, muito dos

estudos são realizados ou financiados por empresas privadas, portanto os resultados

desses estudos não estão disponíveis. Um exemplo dessa falta de disponibilidade dos

dados é vista no banco de dados VEGA (The Vertebrate Genome Annotation Database do

Wellcome Trust Sanger Institute). O VEGA é construído sobre o banco de dados Ensembl, e

disponibiliza sequências computacionalmente precisas de alta qualidade, entretanto para os

vertebrados ele só disponibiliza informações para algumas espécies (apenas humano,

camundongo, zebrafish, chimpanzé, gorila, wallaby, porco e cão), não possuindo informação

para o genoma bovino.

Assim nesse trabalho foram utilizados outros bancos de dados, como o UniGene

(NCBI UniGene Bos taurus Build 101 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/unigene) ferramenta

computacional que identifica transcritos de um locus, analisa expressão por tecido, e mostra

sequências relacionadas de proteínas; o dbSNP (NCBI dbSNP Build 138

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37

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp) ferramenta que compila informação sobre SNPs; e o

Nucleotide (NCBI Nucleotide http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore) para acesso às

sequências de nucleotídeos utilizadas nesse trabalho.

4.4.2 Bos taurus taurus e Bos taurus indicus

Alguns bancos de dados separam os dados das subespécies Bos taurus taurus

(Taxonomy ID: 9913) e Bos taurus indicus (Taxonomy ID: 9915), como por exemplo o banco

de dados Genome do NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/), e o Taxonomy

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy). Porém em outros bancos como o UniGene

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/unigene), utilizado para encontrar os genes presentes no

cromossomo X e os genes expressos na placenta, não separam as duas raças,

apresentando resultados apenas para buscas relacionadas com Bos tarus.

Essa situação pode levar a distorções na escolha das sequências nucleotídicas

utilizadas, pois apesar de muito próximas geneticamente seus genomas podem possuir

diferenças fazendo com que determinados experimentos não funcionem, como por exemplo

o desenho de iniciadores.

O genoma de Bos taurus taurus foi publicado em 2009 (Zimin et al., 2009) e seus

dados têm sofrido diversas revisões, que podem ser observadas nas variações dos dados

encontrados nos bancos de dados (Figura 11). Em 2012 foi publicado o genoma do Bos

taurus indicus (Canavez et al., 2012), sendo tão recente isso explica a pouca quantidade de

informação nos bancos de dados, e também a não separação das subespécies em muitos

dos bancos de dados analisados.

4.4.3 Análise dos genes do Cromossomo X bovino

Utilizamos o banco de dados UniGene do NCBI para fazer a busca por genes

localizados no cromossomo X de Bos taurus. Esse banco de dados analisa e identifica

computacionalmente transcritos produzidos por um mesmo locus gênico, analisa a

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38

expressão por tecido e idade, e indica proteínas relacionadas com os transcritos (Pontius et

al., 2003). O UniGene foi desenvolvido como um sistema de análise automatizado para

gerar uma visão organizada do transcriptoma, visto que a tecnologia atual tem produzido

dados em larga escala, como sequenciamentos de regiões transcritas em larga escala,

mapas gênicos, e sequenciamento completo de cDNAs (Pontius et al., 2003).

O número de genes localizados no cromossomo X bovino mostra alguns pontos

interessantes, como a oscilação em relação ao número total de genes no cromossomo X,

mostrando que os dados estão em contínuo refinamento. Por exemplo, no dia 10/11/2011 o

UniGene apresentava 960 genes no cromossomo X bovino. Em 10/01/2012 esse número

subiu para 1015 genes. Em 24/05/2012 esse número subiu novamente para 1035. No dia

06/11/2012 esse número caiu para 952 genes. E desde o dia 16/03/2013 o UniGene passou

a apresentar 995 genes existentes no cromossomo X bovino, número que não se alterou

desde então (Figura 11).

Figura 11. Variação do número de genes presentes no cromossomo X bovino no banco de

dados. Ao longo desse estudo o número de genes indicados como localizados no cromossomo X

bovino variou entre 952 até 1035, de acordo com o com o banco de dados UniGene (NCBI UniGene

Bos taurus Build 101 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/unigene).

No entanto esses 995 genes indicados como presentes no cromossomo X bovino

não possuem o mesmo nível de caracterização, podendo ser separados nas seguintes

categorias:

940

960

980

1000

1020

1040

nov/11

jan/12 mai/12 nov/12 mar/13 out/13 set/14

mero

de g

en

es

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39

418 desses genes são definidos apenas como Transcribed locus (locus transcritos),

sendo sequências que ainda não foram bem caracterizadas, e são baseadas na

análise de poucas amostras. Alguns desses genes são baseados em apenas uma

sequência.

172 genes são definidos como Transcribed locus similar to... (locus transcritos

similares a...), que apresentam similaridades com genes já caracterizados de outros

organismos. Esse grau de similaridade é definido em weakly, moderataly ou strongly

(fraco, moderado ou forte).

33 genes são definidos como Uncharacterized (não caracterizados), e possuem

ainda menos informações disponíveis.

Assim temos um total de 623 genes que não estão totalmente caracterizados,

tornando assim muito difícil sua utilização. Restando portanto 372 genes bem

caracterizados, com diversas informações disponíveis para o uso. A figura 12 ilustra esses

dados.

Figura 12. Caracterização dos genes presentes no cromossomo X bovino. Do total de 995

genes no cromossomo X bovino foram encontrados 418 genes definidos como locus transcritos, 172

genes definidos como locus transcritos similares a..., e 33 genes definidos como não caracterizados;

esses genes possuem poucas informações não sendo possível utiliza-los nesse trabalho. Foram

encontrados 372 genes bem caracterizados.

0 200 400 600 800 1000

Locus transcritos - 418 genes

Locus transcritos similares a... - 172 genes

Genes não caracterizados - 33 genes

Genes caracterizados - 372 geness

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40

A partir dos genes bem caracterizados localizados no cromossomo X, o próximo

passo foi descobrir qual deles são expressos em tecido extraembrionário bovino, nosso

tecido alvo. Para isso foi necessário acessar o EST Profile de cada um desses genes.

4.4.4 Genes expressos em tecido extraembrionário bovino

A lista completa dos genes de uma espécie é um requisito essencial para investigar

os modos como os genes se expressam e interagem no sistema complexo que é o

organismo. Entretanto, muitas espécies de interesse médico e para agropecuária ainda não

tiveram seus sequenciamento genômicos completos. Assim a análise da expressão de

cDNAs tem servido de fonte primária para se deduzir a sequência de genes.

Foi criado então o termo EST (Expressed Sequence Tag, uma curta sequencia de

cDNA) para se referir a essa nova classe de sequências geradas, caracterizadas pelo

tamanho pequeno (geralmente entre 300-600 bases), relativamente imprecisa (por volta de

3% de erro), codificadoras ou não, expressas em uma biblioteca de cDNA (Boguski et al.,

1993).

Projetos em larga escala de ESTs foram lançados para diversos organismos de

interesse na pesquisa biológica. Em 1992, um banco de dados chamado dbEST foi criado

(Boguski et al., 1993), servindo para abrigar e distribuir essas sequências para comunidade

científica, dentro do GenBank (Benson et al., 2002).

Processos de normalização são utilizados para reduzir a abundância de genes muito

expressos, favorecendo os transcritos mais raros, tentando se aproximar o máximo possível

da real da atividade gênica (Soares et al., 1994). Apesar dessas técnicas facilitarem o

encontro de transcritos que são pouco expressos em um tecido em particular, é possível que

um pequeno número de genes não tenham seus transcritos encontrados, pois podem não

ser expressos nos tecidos, tipos celulares ou estágio do desenvolvimento das amostras

utilizadas.

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41

As ESTs representam os genes expressos em um determinado tecido e/ou estágio

do desenvolvimento. O número total de ESTs e os tecidos dos quais foram originados

podem ser acessados nesse banco de dados, através do EST Profile (em UniGene - NCBI

UniGene Bos taurus Build 101 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/unigene), dando uma ideia do

nível de expressão gênica e os tecidos onde são expressos, inferido através da contagem

desses ESTs.

As fontes analisadas para detecção da atividade gênica são tecidos como: útero,

intestino, glândula mamária, tecido adiposo, cérebro, pele, ovário, rim, pulmão, músculo,

cartilagem, tecido extraembrionário, fígado, sangue, além de tecidos misturados, tecidos

não caracterizados, todo o corpo, entre outros. Além de mostrar também esses tecidos em

várias fases do desenvolvimento (Figura 13).

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42

Figura 13. Expressão dos genes em diferentes tecidos. Os tecidos fontes das bibliotecas de

expressão estão listados em seção específica nesse banco de dados, sendo possível acessar os

padrões de expressão aproximados. No exemplo da figura vemos o EST Profile para o gene FMR1.

Tecidos mostrados na figura: abomaso, tecido adiposo, glândula adrenal, sangue, cérebro,

cartilagem, tecido embrionário, tecido extraembrionário, intestino, rim, cristalino, fígado, pulmão,

glândula mamária, músculo, omaso, ovário, pâncreas, glândula pineal, glândula pituitária, rúmen,

glândula salivar, vesícula seminal, pele, testículo, útero.

O uso dos EST Profile mostra algumas limitações, por exemplo, genes que sabemos

serem expressos em placenta, de acordo com os EST Profile não são expressos. Por

exemplo, o gene MAOA que foi utilizado por Xue e col., em 2002 para definição do padrão

de ICX em bovinos, consta como não expresso em tecido extraembrionário bovino, sendo

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43

que já foi alvo de diversos trabalhos que analisaram tal expressão (Wrenzycki et al., 2005;

Ferreira et al., 2010; Liu et al., 2008; Xue et al., 2002).

Assim muitos outros genes podem ser expressos em placenta mas não foram

detectados pela metodologia empregada. No entanto, para o propósito desse trabalho, só

precisamos achar genes expressos, que podem ser primariamente indicados pelo EST

Profile e posteriormente confirmados pelos experimentos.

Foram analisados todos os 995 genes no cromossomo X bovino, sendo encontrados

148 expressos em placenta de acordo com o banco de dados do EST Profile. Desses 148

genes expressos em placenta, 41 deles se enquadram dentro daqueles genes ainda não

totalmente caracterizados, impedindo assim sua utilização (1 classificado como

uncharacterized, 21 classificados como transcribed locus, e 19 classificados como trancribed

locus similar to). Sobrando, portanto 107 genes bem caracterizados e expressos em

placenta (figura 14).

Figura 14. Caracterização dos genes e expressão na placenta bovina. Dos 372 genes bem

caracterizados encontrados no cromossomo X bovino, 107 deles se expressam na placenta bovina,

atendendo aos requisitos para este trabalho.

Desses 107 genes, 61 deles foram completamente analisados no banco de dados

dbSNP (NCBI dbSNP Build 138 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp). A análise de cada SNP

0 200 400 600 800 1000

Locus transcritos - 418 genes

Locus transcritos similares a... - 172 genes

Genes não caracterizados - 33 genes

Genes Caracterizados - 372 geness

Bem caracterizados E expressos na placenta - 107

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44

desses 61 genes escolhidos visou separar aqueles SNPs presentes em regiões expressas

(nos banco de dados são identificados como cds-synon/alteração sinônima, região 3’UTR e

região 5’UTR) daqueles SNPs que não são expressos (nos bancos de dados identificados

como near gene/próximo ao gene, e íntron) ou que causavam alterações na proteína

(mutações do tipo missense/ocorre troca do aminoácido) (tabela 2). Desses 61 genes, 22

deles indicavam a existência de SNPs em regiões expressas, 23 deles possuíam SNPs

apenas em regiões não transcritas, não servindo para esse trabalho, e 16 genes não

apresentavam SNPs anotados.

Tabela 2. Genes analisados, total de SNPs descritos em cada um deles, e SNPs que se

encontram em regiões expressas. Dados NCBI dbSNP Build 138.

Sigla do Gene Total de SNPs SNPs em regiões

expressas

XIST 62 43

ZMYM3 34 7

FLNA 69 3

ATRX 421 3

GDI1 15 1

RPS6KA3 130 2

ABCB7 162 2

PLS3 170 2

L1CAM 43 5

CDK16 23 6

RPS4X 155 5

PRPS2 45 2

PDHA1 39 3

GYG2 177 6

FMR1 40 5

MAOA 123 6

TSPAN7 244 1

SH3BGRL 213 1

MSN 83 4

USP11 30 1

G6PD 23 2

SYTL4 50 4

RPL10 10 0

EIF2S3 25 0

ARAF 29 0

RBM3 10 0

UBA1 23 0

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45

TIMP1 18 0

LOC783730 12 0

LOC615809 220 0

FAM127C 35 0

VMA21 63 0

TIMM8A 12 0

LDOC1 10 0

ARL13A 21 0

DNASE1L1 26 0

EBP 34 0

FAM3A 130 0

CXHXORF26 8 0

PIN4 21 0

IL2RG 17 0

MOSPD1 36 0

CHRDL1 10 0

GEMIN8 5 0

VAMP7 37 0

ARL13A 0 0

VGLL1 0 0

CDKL5 0 0

MAGIX 0 0

TMSB4X 0 0

DNASE1L1 0 0

PDZD11 0 0

LOC781022 0 0

ZMAT1 0 0

PJA1 0 0

RAB33A 0 0

NRK 0 0

PRKX 0 0

LOC783577 0 0

EMD 0 0

TAZ 0 0

Possuem SNPs presentes em regiões expressas

Possuem apenas SNPs em regiões não expressas

Não possuem dados sobre SNPs

4.5 Escolha dos Genes e SNPs

Neste ponto as duas metodologias para busca de SNPs convergiram para a escolha

dos genes a serem utilizados neste trabalho. Através da análise dos dados do array foram

encontrados 192 SNPs que atenderiam os critérios necessários para esse trabalho. Já no

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46

método manual de busca em banco de dados foram encontrados 22 genes que atendiam

aos requisitos.

Foram então escolhidos 12 genes que se encontravam em ambas as listas, ou seja,

genes presentes no cromossomo X bovino, bem caracterizados, expressos em placenta e

que possuíam SNPs anotados em regiões expressas, e esses genes tiveram seus SNPs

analisados.

Esses SNPs foram então utilizados em uma etapa adicional, onde utilizando as

sequências de RNA mensageiro disponíveis nos bancos de dados Nucleotide (NCBI

Nucleotide http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore), Gene (NCBI Gene

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene) e no Ensembl (Genome assembly:

UMD3.1 GCA_000003055.3 http://www.ensembl.org/Bos_taurus/Info/Index), foi verificado se

a sequência nucleotídica da região contendo os SNPs era encontrada nas sequências

expressas fornecidas por esses bancos de dados.

Um dado importante que não foi possível encontrar foi a frequência de heterozigose

dos SNPs selecionados para este trabalho. Quanto maior a frequência de heterozigose

maior a chance de encontrar indivíduos heterozigotos, e portanto informativos. Alguns

pesquisadores, por exemplo, sugerem uma frequência maior de 0,3 como ideal (Carrel e

Willard, 2005). No entanto tal dado não se encontra disponível para o genoma bovino,

tornando necessária a análise de um grande número de SNPs e de indivíduos para

conseguir as amostras informativas.

4.6 Genes analisados

Na tabela 3 estão listados em ordem de localização no cromossomo X bovino os 12

genes selecionados para este trabalho representados pela sigla de seu nome, assim como

seus 56 SNPs escolhidos de acordo com os critérios estabelecidos, sua identificação nos

bancos de dados e sua variante alélica.

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47

Tabela 3. Genes e SNPs selecionados.

Localização# Nome completo# Gene# SNP* Alelos* Posição*

rs137419178 C/T 3'UTR

rs133611120 C/T 3'UTR

rs136680148 C/G 5'UTR

rs135921837 G/T 5'UTR

rs137367316 A/C cds-synon

rs137148671 C/T cds-synon

rs135884117 G/T cds-synon

X:40,411,179-40,416,941

FS

GDP dissociation inhibitor

1GDI1 rs133556372 G/A cds-synon

rs135767054 C/T cds-synon

rs135133373 A/T cds-synon

rs137091008 A/C cds-synon

rs135614359 A/G cds-synon

rs134996127 A/C cds-synon

rs133796132 C/T 3'UTR

rs133182427 A/G cds-synon

rs210181276 A/G ncRNA

rs137829105 A/C ncRNA

rs136820739 C/T ncRNA

rs135654260 A/T ncRNA

rs135023008 G/T ncRNA

rs137826562 C/T ncRNA

rs134725787 A/G ncRNA

rs133367463 G/T ncRNA

rs208571284 A/T ncRNA

rs135531861 G/T ncRNA

rs209725499 C/T ncRNA

rs210161990 C/T ncRNA

rs211479344 C/T ncRNA

rs208201485 A/G ncRNA

rs133055865 C/T ncRNA

rs208385594 A/G ncRNA

rs210809283 C/T ncRNA

rs136637069 -/C ncRNA

rs133060278 A/T ncRNA

rs134589689 C/T ncRNA

rs208603710 A/G ncRNA

rs210168477 C/G ncRNA

rs136048427 A/C ncRNA

rs134655562 G/T 3'UTR

rs133135803 A/C cds-synon

rs137474375 A/C cds-synon

rs133759346 C/T cds-synon

rs135348320 A/C 5'UTR

rs136733192 A/C 3'UTR

rs136900785 C/T cds-synon

rs41626737 G/T 3'UTR

rs41626735 A/G cds-synon

rs41626734 C/T cds-synon

rs41626736 A/G 3'UTR

Região 5' UTR - 5'UTR

rs41626735v A/T cds-synon

rs41758194 G/C 3'UTR

rs41758194v C/T 3'UTR

rs110059742 C/T cds-synon

rs135916988 A/C cds-synon

rs136220790 G/- 3'UTR

rs134118595 T/C cds-synon

# Ensembl, Genome assembly: UMD3.1 (http://www.ensembl.org/Bos_taurus/Info/Index)

* NCBI dbSNP BUILD142 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/)

FS - foward strand; RS - reverse strand

FMR1

FLNA

PLS3

XIST

ABCB7

ATRX

X:140,120,347-

140,138,151 RSglycogenin 2

ribosomal protein S6

kinase, 90kDa, polypeptide

3

X:130,193,741-

130,300,294 FS

X:84,689,654-84,704,026

FSzinc finger, MYM-type 3 ZMYM3

MAOA

TSPAN7

GYG2

RPS6KA3

X:30,922,774-30,962,111

FS

fragile X mental

retardation 1 

monoamine oxidase A

(MAOA)

X:105,380,194-

105,462,564 RS

X:110,055,866-

110,188,380 RStetraspanin 7

X:79,634,445-79,917,815

FS

alpha thalassemia/mental

retardation syndrome X-

linked

X: 81,008,166-81,167,688

FS

ATP-binding cassette, sub-

family B, member 7

X:82,261,156-82,294,467

FS

X-inactive specific

transcript

plastin 3X:71,709,928-71,806,536

FS

filamin A, alpha X:40,310,757-40,332,714

RS

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48

4.7 Padronização das reações de PCR

Foram desenhados um total de 35 pares de iniciadores para a análise de 56 SNPs

no total. Sendo 30 pares de iniciadores para amplificação do DNA genômico e genotipagem,

e 5 pares de iniciadores posteriormente desenhados para amplificação específica de cDNA.

Entre os iniciadores utilizados para genotipagem, foi também desenhado um par para a

análise da região 5’UTR do gene MAOA para a busca de SNPs. Todos eles tiveram suas

reações padronizadas utilizando a técnica de PCR touchdown, bem como diferentes

temperaturas de anelamento, e a quantidade de DNA molde. A técnica de PCR touchdown,

descrita por Don e col., 1991, consiste na elevação da temperatura de associação dos

iniciadores em 10°C no primeiro ciclo da PCR, seguida de redução de 1ºC a cada ciclo até

atingir a temperatura ideal de associação dos iniciadores, a partir de onde se segue a

reação de PCR. Esta estratégia assegura uma maior especificidade do produto amplificado,

proporcionando diminuição de bandas inespecíficas formadas pelas reações de PCR

Localização# Nome completo# Gene# SNP* Alelos* Posição*

rs137419178 C/T 3'UTR

rs133611120 C/T 3'UTR

rs136680148 C/G 5'UTR

rs135921837 G/T 5'UTR

rs137367316 A/C cds-synon

rs137148671 C/T cds-synon

rs135884117 G/T cds-synon

X:40,411,179-40,416,941

FS

GDP dissociation inhibitor

1GDI1 rs133556372 G/A cds-synon

rs135767054 C/T cds-synon

rs135133373 A/T cds-synon

rs137091008 A/C cds-synon

rs135614359 A/G cds-synon

rs134996127 A/C cds-synon

rs133796132 C/T 3'UTR

rs133182427 A/G cds-synon

rs210181276 A/G ncRNA

rs137829105 A/C ncRNA

rs136820739 C/T ncRNA

rs135654260 A/T ncRNA

rs135023008 G/T ncRNA

rs137826562 C/T ncRNA

rs134725787 A/G ncRNA

rs133367463 G/T ncRNA

rs208571284 A/T ncRNA

rs135531861 G/T ncRNA

rs209725499 C/T ncRNA

rs210161990 C/T ncRNA

rs211479344 C/T ncRNA

rs208201485 A/G ncRNA

rs133055865 C/T ncRNA

rs208385594 A/G ncRNA

rs210809283 C/T ncRNA

rs136637069 -/C ncRNA

rs133060278 A/T ncRNA

rs134589689 C/T ncRNA

rs208603710 A/G ncRNA

rs210168477 C/G ncRNA

rs136048427 A/C ncRNA

rs134655562 G/T 3'UTR

rs133135803 A/C cds-synon

rs137474375 A/C cds-synon

rs133759346 C/T cds-synon

rs135348320 A/C 5'UTR

rs136733192 A/C 3'UTR

rs136900785 C/T cds-synon

rs41626737 G/T 3'UTR

rs41626735 A/G cds-synon

rs41626734 C/T cds-synon

rs41626736 A/G 3'UTR

Região 5' UTR - 5'UTR

rs41626735v A/T cds-synon

rs41758194 G/C 3'UTR

rs41758194v C/T 3'UTR

rs110059742 C/T cds-synon

rs135916988 A/C cds-synon

rs136220790 G/- 3'UTR

rs134118595 T/C cds-synon

# Ensembl, Genome assembly: UMD3.1 (http://www.ensembl.org/Bos_taurus/Info/Index)

* NCBI dbSNP BUILD142 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/)

FS - foward strand; RS - reverse strand

FMR1

FLNA

PLS3

XIST

ABCB7

ATRX

X:140,120,347-

140,138,151 RSglycogenin 2

ribosomal protein S6

kinase, 90kDa, polypeptide

3

X:130,193,741-

130,300,294 FS

X:84,689,654-84,704,026

FSzinc finger, MYM-type 3 ZMYM3

MAOA

TSPAN7

GYG2

RPS6KA3

X:30,922,774-30,962,111

FS

fragile X mental

retardation 1 

monoamine oxidase A

(MAOA)

X:105,380,194-

105,462,564 RS

X:110,055,866-

110,188,380 RStetraspanin 7

X:79,634,445-79,917,815

FS

alpha thalassemia/mental

retardation syndrome X-

linked

X: 81,008,166-81,167,688

FS

ATP-binding cassette, sub-

family B, member 7

X:82,261,156-82,294,467

FS

X-inactive specific

transcript

plastin 3X:71,709,928-71,806,536

FS

filamin A, alpha X:40,310,757-40,332,714

RS

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49

(Salman e Laureano, 2006). O tamanho dos fragmentos amplificados neste trabalho

variaram entre 402 pb e 700 pb.

Para a amplificação dos fragmentos de alguns genes foi necessário otimizar ainda

mais a reação de PCR. Nesses casos a temperatura ideal de anelamento dos iniciadores foi

determinada por meio de um gradiente de temperatura, onde são testadas simultaneamente

várias temperaturas diferentes visando sua otimização. O PCR gradiente foi feito com a

temperatura de anelamento dos iniciadores variando entre 53°C e 65°C. Posteriormente, o

número de ciclos foi ajustado para evitar a formação de bandas inespecíficas. Foi testada

também a adição de reagentes como betaína (1M) e DMSO (10%), que aumentam a

estabilidade da enzima facilitando a amplificação quando o molde ou os iniciadores são ricos

em conteúdo G/C, ou quando eles formam estruturas secundárias.

O par de iniciadores para amplificação da região 5’UTR do gene MAOA, e o par de

iniciadores para a amplificação dos SNPs rs210181276, rs137829105, rs136820739,

rs135654260, rs135023008 do gene XIST não funcionaram e foram redesenhados,

buscando uma nova configuração mais favorável.

Dos 35 pares de iniciadores para a análise dos SNPs, 31 deles tiveram suas reações

padronizadas e puderam ser utilizados neste trabalho. No entanto 4 pares de iniciadores

que amplificavam os genes FMR1, ZMYM3, FLNA, e XIST não puderam ter suas reações de

PCR padronizadas, excluindo portanto 10 SNPs das análises (FMR1 SNPs rs136680148 e

rs135921837; ZMYM3 SNP rs135348320; FLNA SNP rs135884117; XIST SNPs

rs136637069, rs133060278, rs134589689, rs208603710, rs210168477, rs136048427).

4.8 Genotipagem do DNA genômico

A genotipagem das amostras bovinas foi realizada, e dos 47 SNPs que puderam ser

analisados, 5 deles se mostraram informativos em pelo menos uma de nossas amostras,

enquanto 42 não eram informativas nas amostras estudadas (tabela 4). Assim foi reunido

um total de 17 SNPs informativos distribuídos ao longo das 7 placentas bovinas.

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50

Tabela 4. Resultados da genotipagem na busca de amostras heterozigotas, portanto

informativas. Genes e SNPs localizados nas linhas, e as amostras localizadas nas colunas.

Em azul, casos de heterozigose; em cinza homozigose.

Gene SNP pl.01 pl.02 pl.03 pl.04 pl.05 pl.06 pl.07

rs134655562

rs133135803

rs137474375

rs133759346

rs136733192

rs136900785

rs137367316

rs137148671

rs137091008

rs135614359

rs134996127

rs41758194

rs41758194v

rs136220790

rs134118595

rs137419178

rs133611120

rs133796132

rs133182427GDI1 rs133556372

rs135767054

rs135133373

rs110059742

rs135916988

rs41626737

rs41626735

rs41626734

rs41626736

rs41626735v

5'UTR

rs210181276

rs137829105

rs136820739

rs135654260

rs135023008

rs137826562

rs134725787

rs133367463

rs208571284

rs135531861

rs209725499

rs210161990

rs211479344

rs208201485

rs133055865

rs208385594

rs210809283

RPS6KA3

MAOA

XIST

FMR1

ABCB7

PLS3

ZMYM3

FLNA

ATRX

TSPAN7

GYG2

Informativo

Não Informativo

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51

4.9 Análise da expressão gênica através do cDNA

Nas amostras heterozigotas, ou seja, geneticamente informativas, o RNA foi extraído,

convertido em cDNA e amplificado pela técnica de RT-PCR, combinadas com

sequenciamento direto, permitindo a verificação do padrão de expressão gênica. Todos os

SNPs informativos foram analisados conforme o modelo da figura 15, onde se encontram o

resultado para o gene XIST (SNP rs137826562) na placenta 4, e o resultado do gene GDI1

(SNP rs133556372) na placenta 2.

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52

Figura 15. Análise da expressão alelo-específica através de sequenciamento de cDNA. No topo

das figuras encontra-se a identificação da placenta analisada, sigla do gene e identificação do SNP

analisado. A posição do polimorfismo está destacada na imagem. a) Eletroferograma de um caso de

ICX aleatória, mostrando o DNA da amostra de placenta heterozigoto para o SNP analisado, e o

cDNA também heterozigoto indicando a expressão dos dois alelos. b) Eletroferograma de um caso de

ICX desviada, mostrando o DNA da amostra de placenta heterozigoto para o SNP analisado, e o

cDNA mostrando que os dois alelos eram expressos, porém em todos os resultados analisados um

dos alelos apresentava expressão superior a do outro alelo de forma consistente

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53

Dos 17 SNPs informativos, 11 puderam ter sua expressão analisada. Em 8 deles o

padrão apresentado foi de expressão bialélica, onde os dois alelos estavam sendo

igualmente expressos (TSPAN7 SNP rs41758194v pl.03 e pl.05; FMR1 SNP rs137419178

pl.04 e pl.05; GDI1 SNP rs133556372 pl.03; XIST SNP rs137826562 pl.03, pl.04 e pl.05).

Em 2 SNPs foi encontrada uma expressão desviada, mostrando que os dois alelos

eram expressos, porém em todos os resultados analisados um dos alelos apresentava

expressão superior a do outro alelo de forma consistente (TSPAN7 SNP rs41758194v pl.06;

GDI1 SNP rs133556372 pl.02). E em 1 SNP foi encontrada a expressão de um único um

alelo (TSPAN7 SNP rs41758194v pl.02). A tabela 5 reúne todos os dados obtidos na análise

das 7 amostras de tecidos extraembrionários.

Tabela 5. Resultados da análise da expressão gênica em placenta bovina.

Em 6 casos não foi possível visualizar a expressão gênica. No caso da placenta pl.01

é possível que o problema seja com a qualidade do material extraído da amostra de tecido

extraembrionário. Apesar da extração dos ácidos nucleicos ter sido realizado 3 vezes,

mesmo assim não foi possível obter RNA com qualidade suficiente, e o padrão de expressão

não pode ser visualizado.

Gene SNP pl.01 pl.02 pl.03 pl.04 pl.05 pl.06 pl.07

TSPAN7 rs41758194v

FMR1 rs137419178

GDI1 rs133556372

MAOA rs41626735v

XIST rs137826562

Locus onde não foi possível a análise

Expressão Aleatória

Expressão Monoalélica

Expressão Desviada

Locus homozigoto (não informativo)

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54

Já no caso do gene MAOA, o par de iniciadores para análise do cDNA não obteve

sucesso na amplificação da sequência alvo. Apesar dos pares de iniciadores terem sido

refeitos e as reações de PCR otimizadas, não foi obtido sucesso na amplificação, talvez

indicando que a sequência de nucleotídeos utilizada nesse trabalho não condiz com os

animais estudados, ou o polimorfismo encontra-se em uma região de difícil amplificação

devido a sequências repetidas, alto conteúdo C/G ou outro motivo.

4.10 Análise da origem parental do alelo expresso

Para verificação da origem parental do alelo expresso é necessária que a amostra de

placenta seja heterozigota enquanto a amostra materna precisa ser homozigota para o SNP

analisado. Dos 11 SNPs analisadas, 3 deles apresentaram ou um desvio de expressão em

favor de um alelo (TSPAN7 SNP rs41758194v pl.06; GDI1 SNP rs133556372 pl.02), ou um

desvio completo com a expressão de apenas um alelo (TSPAN7 SNP rs41758194v pl.02).

Nessas 3 amostras, em apenas 1 delas foi possível determinar a origem parental do

alelo expresso, sendo o DNA materno da placenta pl.02 homozigota para o SNP

rs41758194v no gene TSPAN7, foi possível concluir que o alelo expresso era o materno

(Figura 16). Nos outros 2 casos de desvio de expressão não foi possível determinar a

origem do alelo expresso devido aos pais não serem informativos.

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55

Figura 16. Análise da origem parental do alelo expresso no cDNA. No topo da figura encontra-se

a identificação da placenta analisada, sigla do gene e identificação do SNP analisado. A posição do

polimorfismo está destacada na imagem. O Eletroferograma mostra um caso de ICX completamente

desviada mostrando o DNA da amostra de placenta heterozigoto para o SNP analisado, e o cDNA

mostrando apenas um pico, indicando expressão de apenas um alelo. O DNA materno é homozigoto

para o SNP analisado, permitindo assim determinar que o alelo expresso na placenta é o de origem

materna.

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56

5 Discussão

5.1 Animais - Bos taurus

Os bovinos (Bos taurus) são animais de grande interesse econômico, tendo um

papel muito importante para a agropecuária. Nos Estados Unidos, a indústria de carne e

leite é a maior indústria de manufatura, além dos bovinos serem organismos modelos para

pesquisas médicas em diversas áreas, como obesidade, doenças infecciosas, em estudos

sobre endocrinologia, fisiologia, e técnicas reprodutivas (revisto em Tellam et al., 2009;

revisto em The Bovine HapMap Consortium, 2009).

O genoma bovino é importante para estudos de genômica comparativa, representado

os eutérios não-primatas e não-roedores. Seu genoma é estimado em 3000 MB, organizado

em 29 pares de autossomos e 2 cromossomos sexuais (revisto em Tellam et al., 2009;

revisto em The Bovine HapMap Consortium, 2009).

Na pecuária brasileira, os bovinos das raças denominadas zebuínas (Bos taurus

indicus) são os animais mais utilizados. Originários do sul da Ásia, e domesticados na Índia,

hoje encontram-se espalhados pelo mundo em regiões de clima tropical e subtropical. São

animais rústicos com grande resistência e adaptabilidade ao clima tropical, com alto

desempenho reprodutivo, e de fácil manejo. Comparados com o gado taurino (Bos taurus

taurus), os zebuínos possuem maior resistência a temperaturas elevadas e a algumas

doenças (ABCZ, 2015).

A raça utilizada nesse estudo foi a GIR, uma das principais raças

zebuínas originárias da Índia. São animais utilizados como produtores de carne e leite. Sua

natureza gregária e o temperamento dócil contribuíram para sua expansão no Brasil, tendo

grande resistência a temperaturas quentes e doenças tropicais. Também tem sido utilizada

em cruzamentos para melhoria de outras raças, adicionando sua rusticidade e resistências a

raças mais delicadas (revisto em Associação Brasileira de Gir Leiteiro - ABCGIL).

O genoma de Bos taurus taurus foi publicado em 2009 (Zimin et al., 2009), e o

genoma de Bos taurus indicus apenas em 2012 (Canavez et al., 2012). Isso mostra uma

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57

tentativa de fornecer informações mais precisas para cada subespécie, gerando assim

dados mais confiáveis que facilitarão novas pesquisas. Ainda poucos bancos de dados

separam essas duas subespécies, como visto na seção 4.4.2 dos resultados, no entanto

essa situação deve mudar com o tempo.

5.2 Padrão da ICX em bovinos

A tabela 5 mostra que a maioria dos SNPs informativos apresentou uma expressão

bialélilca, mostrando que existiam nas amostras analisadas populações de células com

diferentes cromossomos X ativos. Talvez o dado mais importante para a verificação da ICX

aleatória em placenta bovina venha das amostras informativas para o gene XIST, um gene

essencial para ICX, que mostrou expressão bialélica. Devido à falta de informação sobre o

comportamento de outros genes no cromossomo X bovino, o gene XIST é o único gene que

tem seu padrão de expressão conhecido, sendo um gene essencial para o início e

manutenção da ICX, e expresso sempre pelo X inativo. Portanto, sua expressão bialélica é

um forte indício que a ICX ocorre de modo aleatório na placenta bovina.

Acredita-se que ICX “imprintada” seja o mecanismo ancestral de compensação de

dose, que ainda hoje está presente nos marsupiais, sendo o X paterno inativado em todos

os tecidos (Sharman, 1971; Cooper et al., 1971; Johnston e Robinson, 1987; VandeBerg et

al., 1979). Esse mecanismo foi substituído nos eutérios por um processo aleatório de

escolha do X inativo em todos os tecidos de origem embrionária (Mills e Moore, 2006;

revisto em Deakin et al., 2009). Entretanto, alguns eutérios ainda mantêm o mecanismo

“imprintado” de ICX exclusivamente nos tecidos extraembrionários, como ratos e

camundongos (Okamoto et al., 2004; Wake et al., 1976; Takagi e Sasaki, 1975; Harper et

al., 1982; Wake et al., 1976). E devido aos resultados de um trabalho que analisava o

comportamento de apenas um único gene, os bovinos também foram apontados como

tendo a ICX imprintada nos tecidos extraembrionários (Xue et al., 2002).

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58

Apesar dos camundongos serem o modelo mais utilizado para o estudo da ICX em

eutérios, estudos recentes tem mostrado que a maioria dos outros eutérios estudados

apresentam mecanismos de ICX diferentes daquele visto no camundongo. Estudos em

humanos (Moreira de Mello et al., 2010), primatas não humanos (Tachibana et al., 2012), e

espécies de equinos como o cavalo e a mula (Wang et al., 2012), têm mostrado que a ICX

nesse animais ocorre de modo aleatório, tanto no embrião quanto no tecido

extraembrionário.

Apesar de Xue e col., (2002) terem apontado que a ICX em tecido extraembrionário

ocorre da mesma forma em camundongos e bovinos, diversas diferenças que podem ter

influência direta na ICX entre esses animais já foram mostradas na literatura.

O início do desenvolvimento embrionário difere entre camundongos e bovinos. Em

camundongos, a massa celular interna do blastocisto expressa principalmente o fator de

transcrição Oct4, entre outros. Já a camada de células externa, a trofoectoderme que irá dar

origem à placenta, expressa principalmente o fator Cdx2. Em bovinos, a expressão de Oct4

não é restrita apenas à ICM nos estágios iniciais de desenvolvimento do blastocisto. Oct4 é

expresso juntamente com Cdx2 na trofoectoderme após a formação do blastocisto. (Berg et

al., 2011). Nesse sentido, essas etapas do desenvolvimento embrionário de bovinos são

mais parecidas com o que acontece em embriões humanos e de porcos por exemplo, que

também apresentam esse padrão (Rossant, 2007; revisto em Blomberg et al., 2008)

O motivo da existência da ICX imprintada nos tecidos extraembrionários do

camundongo tem sido atribuído à ativação precoce do genoma zigótico que ocorre nesses

animais, resultando assim em uma necessidade de compensação de dose já no embrião

pré-implantação (revisto em Dupont e Gribnau, 2013). Nos estágios iniciais de clivagem do

embrião, a ICX imprintada forneceria uma mecanismo mais rápido e eficiente de ICX,

comparada com a ICX aleatória mais complexa. E ao longo do desenvolvimento embrionário

a ICX imprintada é revertida e ocorre de forma aleatória no embrião, fornecendo os

benefícios da expressão bialélica dos genes no cromossomo X através das duas

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59

populações de células (revisto em Dupont e Gribnau, 2013). No entanto enquanto em

camundongos a ativação do genoma do zigoto ocorre de forma plena no estágio de 2

células (Flach et al., 1982; Schultz, 1993), na maioria dos outros eutérios estudados a

ativação do genoma zigótico ocorre mais tarde no desenvolvimento, em bovinos por

exemplo, ocorre por volta do estágio de 8-16 células (Frei et al., 1989; Viuff et al., 1996).

Outra diferença entre camundongos e bovinos seria em relação ao gene XIST e seu

comportamento. O gene XIST é um gene essencial para o início e manutenção da ICX,

sendo expresso sempre pelo X inativo. Enquanto que a ICX imprintada em embriões pré-

implantação de camundongo é caracterizada pela expressão exclusiva do Xist do X paterno

(revisto em Dupont e Gribnau, 2013), nos embriões bovinos pré implantação a expressão de

XIST ocorre nos dois cromossomos X parentais (Dindot et al., 2004). Alguns trabalhos

chegaram a sugerir que essa diferença na expressão de XIST entre camundongos e bovinos

implicaria que os camundongos possuiriam um imprinting muito mais robusto no X materno

que os bovinos (Peippo et al., 2002; Merighe et al., 2009).

Na ICX imprintada o gene XIST se expressa apenas no cromossomo X paterno, e no

cromossomo X materno ele é completamente silenciado. Esse comportamento tem sido

apontado que ocorra devido a um imprinting materno em XIST e/out TSIX (Lee, 2000; Sado

et al., 2001; Marahrens et al., 1997). Enquanto no camundongo e no rato, espécies que

comprovadamente possuem ICX imprintada nos tecidos extraembrionários, Tsix cobre toda

a extensão de Xist (Shevchenko et al., 2011), em outras espécies isso não ocorre (Figura

16), com o TSIX cobrindo apenas parcialmente o XIST em bovinos e em primatas (Horvath

et al., 2011). Em humanos, o TSIX apresenta sua extremidade 3’ truncada, e a principal ilha

CpG reguladora de Tsix de camundongo não existe em humanos. Assim não há evidências

que indiquem a regulação de XIST por TSIX em humanos (Migeon et al., 2002).

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60

Figura 17. Comparação dos conjuntos de genes XIST/TSIX em camundongo, rato, bovino,

humano, e macaco rhesus. Camundongo e rato possuem ICX imprintada nos tecidos

extraembrionários, e seu gene Tsix cobre toda a extensão de Xist. Já em bovinos, humanos e

primatas não-humanos o gene TSIX cobre apenas parcialmente o gene XIST, não atuando em sua

regulação. Modificado de Dupont e Gribnau, 2013.

Assim a expressão de XIST a partir dos dois alelos parentais durante o começo do

desenvolvimento embrionário em bovinos (Peippo et al., 2002; Merighe et al., 2009), coelhos

(Okamoto et al., 2011), humanos (Okamoto et al., 2011; Ray et al., 1997; Daniels et al.,

1997), macaco rhesus (Tachibana et al., 2012), e porcos (Park et al., 2011), é apontado

como sendo devido a uma fraca ou nula atividade de TSIX (revisto em Dupont e Gribnau,

2013).

Assim novos estudos deverão explorar a questão se a ICX imprintada encontrado

nos camundongos representa de fato a forma ancestral de ICX dos eutérios, e que persistiu

nesse grupo de animais, ou se esse é um mecanismo que surgiu depois exclusivamente

nesse grupo para se adaptar a particularidades da espécie.

5.3 Análise global do cromossomo X

O estudo da expressão gênica é de grande importância porém devido a sua

complexidade não pode ser feito de modo simplificado, principalmente quando regulação

epigenética está envolvida. Devido a essa complexidade não é incomum na literatura

estudos com resultados contraditórios (Moreira de Mello et al., 2010).

Esse tipo de metodologia mais ampla na análise do comportamento do cromossomo

X mostrou sua capacidade de representar o comportamento complexo dos genes, ao

contrário dos estudos anteriores (Moreira de Mello et al., 2010). Essa análise mais robusta

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61

visa evitar os desvios e erros ao se analisar o estado transcricional do cromossomo X como

um todo a partir do comportamento de um único ou poucos genes.

Na análise da tabela 5 (seção 4.9 dos resultados) é mostrado que 3 SNPs em duas

amostras de placenta mostraram resultados de expressão desviada para um determinado

alelo, ou mesmo um desvio completo de expressão, onde apenas um alelo era expresso.

Esses resultados mostram o diferente comportamento entre os genes e a ICX, reforçando a

necessidade de uma análise ampla, para se evitar a análise baseando-se nesses desvios.

O baixo número de resultados mostrando desvio da expressão, quando comparado

ao trabalho de Moreira de Mello e col., 2010 em humanos, pode ter sido causado pela

metodologia utilizada neste trabalho, já que amostras de tamanho grande foram

processadas juntas, evitando assim que manchas clonais de ICX fossem selecionadas. No

trabalho de Moreira de Mello e col. (2010), com placenta humana foram encontrados

diferentes comportamentos nas diferentes amostras, desde expressão aleatória, desvio de

expressão, e expressão completamente desviada para um dos alelos, sugerindo através de

seus dados que a placenta humana seja composta por um mosaico em relação à escolha do

Xi, apresentando regiões com células onde o X paterno teria sido inativado, e outras com o

X materno inativo.

A metodologia utilizada neste trabalho, no qual amostras de tamanhos relativamente

grandes foram utilizadas, impede a visualização desse padrão de manchas, caso ele exista

na placenta bovina. Assim para elucidação se a placenta bovina também é formado por

regiões onde o X paterno foi inativado, e regiões onde o X materno foi inativado, seria

necessária a análise de amostras de regiões menores, tentando localizar esse diferente

comportamento entre as duas populações celulares.

Nesse tipo de metodologia utilizada no presente trabalho, quanto mais dados do

genoma da espécie analisada estiverem disponíveis, mais fácil é o trabalho, e mais próximo

da realidade são os resultados gerados. Poucos dados disponíveis nos bancos de dados

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dificultam as escolhas das sequências utilizadas, assim como podem levar a erros e não

funcionamento de experimentos, problemas sumarizados na seção 4.4 dos resultados.

Uma maior quantidade de dados permite, por exemplo, a construção de um painel de

SNPs mais amplo, permitindo acessar o comportamento individual de diferentes regiões no

cromossomo X, e quanto mais SNPs distribuídos pelo cromossomo X mais robusta é a

análise. Assim como dados sobre a frequência de heterozigose dos SNPs ajudariam na

escolha de SNPs mais prováveis de serem heterozigotos, aumentando a quantidade de

amostras informativas e criando um painel de SNPs mais amplo.

Outros dados importantes como a determinação das regiões pseudoautossômicas, e

os genes localizados nelas, ajudariam a entender os resultados conflitantes, pois genes

nessas áreas mostram comportamento diferente dos outros genes. Dados a respeito de

genes que escapam da ICX e são expressos tanto pelo X ativo quanto pelo X inativo

também são importantes, pois permitem que tais genes funcionem como controles na

análise da expressão dos demais genes submetidos à ICX.

O uso de metodologias de nova geração, produzindo dados em larga escala ajudará

a expandir ainda mais nosso conhecimento. Por exemplo, na metodologia conhecida como

RNA-Seq é feito o sequenciamento total do exoma (conjuntos dos éxons do genoma),

permitindo medir a presença e a quantidade dos transcritos de um genoma em determinado

momento. Utilizando essa metodologia é possível analisar a expressão gênica alelo-

específica na placenta de diversos animais de forma global, identificando o padrão de ICX e

ajudando traçar a história evolutiva desse mecanismo.

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6 Conclusão

A análise dos resultados encontrados nesse trabalho mostra que a ICX em tecidos

extraembrionários bovinos ocorre de modo aleatório, padrão semelhante àquele encontrado

em humanos, primatas não-humanos e equinos, e diferente daquele encontrado em ratos e

camundongos.

Esse resultado foi encontrado através do uso de uma análise mais robusta, que

acessava o funcionamento de diversos genes ao longo do cromossomo X em diversas

amostras, evitando assim os possíveis desvios de expressão e outros artefatos. No entanto

esses resultados sempre podem ser refinados utilizando uma análise ainda mais ampla,

utilizando por exemplo técnicas de larga escala. Conforme novos dados forem sendo

disponibilizados para o genoma bovino será possível utilizar informações referentes apenas

à espécie animal utilizada no estudo (seja Bos taurus taurus, ou Bos taurus indicus), assim

como informações a respeito da região pseudoautossômica, genes que escapam da ICX, e

informações quanto à prevalência de determinados genótipos. Apesar dessas dificuldades,

os resultados desse trabalho ainda mostram um comportamento do cromossomo X de modo

mais fiel à realidade do que trabalhos anteriores.

A maioria dos estudos sobre os mecanismos da ICX é feito utilizando camundongos,

já que nesse modelo é possível atingir uma maior precisão nos trabalhos. Conforme novas

informações genômicas vão se tornando disponíveis, estudos em outras espécies de

eutérios têm indicado que as descobertas em camundongos não podem ser simplesmente

extrapoladas para outras espécies, indicando diferenças nos mecanismos de ICX. É

necessário que os resultados obtidos nos modelos utilizados sejam sempre comparados

com o que ocorre em outras espécies.

Muitas das inconsistências encontradas na literatura referentes à comparação de

camundongos e bovinos, pode ser explicadas pelos resultados desse trabalho. Apesar de

todas as diferenças listadas na seção 5.1, os trabalhos tentavam agrupar bovinos e

camundongos sob o mesmo tipo de padrão de ICX. Porém todos esses dados podem ser

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melhor explicados a partir do momento que se considera que esses animais não possuem o

mesmo padrão de ICX nos tecidos extraembrionários.

Novos trabalhos sobre a ICX feitos diretamente em outros eutérios seriam

extremamente interessantes, pois ajudarão a traçar um panorama mais geral de como

funcionam e como evoluíram os mecanismos de compensação de dose nos mamíferos.

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Resumo

Na inativação do cromossomo X (ICX) um dos dois cromossomos X presentes nas

fêmeas de mamíferos placentários é silenciado transcricionalmente. Esse é um mecanismo

de compensação de dose que assegura que a quantidade dos produtos gênicos oriundos do

cromossomo X esteja em equilíbrio entre machos e fêmeas. A ICX pode ocorrer de modo

aleatório, onde cada célula escolhe ao acaso qual será o cromossomo X inativado:

cromossomo X paterno ou cromossomo X materno; ou de forma “imprintada” (termo

adaptado do inglês imprinted), ou seja, dependente da origem parental do cromossomo X.

Enquanto nas fêmeas marsupiais a inativação ocorre de forma “imprintada”, sendo o X

paterno inativado em todos os tecidos, nos mamíferos eutérios a ICX nos tecidos somáticos

ocorre de modo aleatório. Porém alguns eutérios mantiveram o mecanismo “imprintado” de

ICX exclusivamente nos tecidos extraembrionários, como ratos e camundongos.

Em humanos, o estado controverso da ICX em tecidos extraembrionários foi

reavaliado por nosso grupo utilizando uma análise mais ampla e identificou-se um padrão

aleatório (Moreira de Mello et al., 2010), demonstrando a importância de se realizar uma

análise global para se determinar o perfil de atividade do cromossomo X.

Em bovinos o padrão de ICX em placenta não está claro. Ele foi verificado

analisando-se a expressão de um único gene, e os autores concluíram que o padrão era

“imprintado” (Xue et al., 2002). Porém a análise de um único gene pode não representar o

estado epigenético de um cromossomo inteiro. Assim o padrão de ICX em tecidos

extraembrionários bovinos se mostra uma questão importantíssima para ser esclarecida.

No presente trabalho o cromossomo X bovino foi analisado em busca de SNPs

(polimorfismos de base única) localizados em regiões codificadoras em genes expressos no

tecido extraembrionário, permitindo assim através da análise da expressão alelo-específica

determinar o padrão de expressão do cromossomo X.

Os resultados apresentados neste trabalho mostram um padrão de expressão

bialélica, indicando que em populações diferentes de células, diferentes cromossomos X

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estavam ativos. Portanto a ICX em tecidos extraembrionários bovinos ocorre de modo

aleatório, padrão semelhantes àquele encontrado em humanos, e diferente daquele

encontrado em ratos e camundongos.

Este trabalho mostra a importância de uma análise global da expressão gênica no

cromossomo X, permitindo assim traçar um perfil de atividade mais próximo possível da

realidade.

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Abstract

In X chromosome inactivation (XCI), one of the two X chromosomes present in

female mammals is transcriptionally silenced, resulting in a dosage compensation

mechanism. The XCI can occur randomly, so that each cell chooses randomly which one will

be the inactivated X chromosome: paternal (pX) or maternal (mX); or dependent on parental

origin of X chromosome, ie, imprinted. While in female marsupials the inactivation occurs in

an imprinted fashion, with the Xp inactivated in all tissues, both somatic and extra-embryonic,

in the mammalian eutherians XCI in the somatic tissues occurs randomly. However some

eutherians still retain the imprinted XCI mechanism exclusively in extra-embryonic tissues,

such as rats and mice.

In humans, the controversy of the XCI in placenta was re-evaluated by our group.

Using a broader analysis, a random pattern was identified, in contrast to the previously

published works. It demonstrated the importance of conducting a comprehensive analysis to

determine the profile of X chromosome (Moreira de Mello et al., 2010).

In cattle the pattern of XCI in bovine placenta is unclear. It was verified by analyzing

the expression of a single gene, and the authors concluded that the pattern was imprinted

(Xue et al., 2002). Because the analysis of a single gene may not represent the epigenetic

state of an entire chromosome, the pattern of XCI in cattle extra-embryonic tissues is an

important issue to be clarified.

In the present study the cattle X chromosome was analyzed searching for SNPs

(single nucleotide polymorphisms) located in coding regions of genes expressed in extra-

embryonic tissue. So that, by analyzing the allele-specific expression it is possible to

determine the X chromosome expression patter.

The preset results show a bi-allelic expression pattern. This indicates that in different

cells populations, different X chromosomes are active. Thus, the XCI in extra-embryonic

tissues of bovines occurs randomly, similar to the human pattern but different to that verified

in rats and mice.

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This work shows the importance of a global analysis of the gene expression in X

chromosome, through which it can trace the closest activity profile as possible to reality.

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77

Anexos

Anexo 1

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Ge

ne

SNP

Po

lim

orf

ism

oP

rim

er

FP

rim

er

R

Tam

anh

o d

o

Frag

me

nto

amp

lifi

cad

o (

pb

)

rs21

0181

276

A/G

GC

CTT

GC

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TCC

CTA

CTC

TC

CC

TTA

TTG

AC

AG

GG

GA

TTG

AG

700

rs13

7829

105

A/C

GC

CTT

GC

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TCC

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700

rs13

6820

739

C/T

GC

CTT

GC

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700

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700

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G/T

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700

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7826

562

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GC

CA

CA

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TATC

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CC

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GA

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577

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787

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GC

CA

CA

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577

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CA

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GA

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577

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284

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CG

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AA

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AG

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591

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CTG

AG

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684

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CA

TTG

CA

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CTG

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1479

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CA

TTG

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CTG

AG

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684

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A/G

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CA

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CA

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CTG

AG

TCC

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GC

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CA

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684

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C/T

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CTG

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CA

TTG

CA

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684

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CA

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TCC

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C/T

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GA

TCA

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CC

TGC

GTC

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A/T

GG

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A/G

GG

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0168

477

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A/C

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AC

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GG

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GC

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GTG

699

XIS

T

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Ge

ne

SNP

Po

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ism

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er

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er

R

Tam

anh

o d

o

Frag

me

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amp

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o (

pb

)

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562

G/T

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CC

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CTG

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CA

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CTC

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AA

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TCA

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GG

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375 

A/C

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GG

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3759

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2

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785

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359 

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7

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Ge

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