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ANÁLISE DA DIVERSIDADE GENÉTICA DOS LOCI HLA-A, -B, -DRB1 E DA ESTRUTURA DA POPULAÇÃO HUMANA DO ESTADO DE MINAS GERAIS, BRASIL Belo Horizonte 2009 RAQUEL APARECIDA FABRETI DE OLIVEIRA
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ANÁLISE DA DIVERSIDADE GENÉTICA DOS
LOCI HLA-A, -B, -DRB1 E DA ESTRUTURA DA
POPULAÇÃO HUMANA DO ESTADO DE MINAS
GERAIS, BRASIL
Belo Horizonte 2009
RAQUEL APARECIDA FABRETI DE OLIVEIRA
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ii
RAQUEL APARECIDA FABRETI DE OLIVEIRA
ANÁLISE DA DIVERSIDADE GENÉTICA DOS
LOCI HLA-A, -B, -DRB1 E DA ESTRUTURA DA
POPULAÇÃO HUMANA DO ESTADO DE MINAS
GERAIS, BRASIL
Belo Horizonte Instituto de Ciências Biológicas da UFMG
2009
Dissertação apresentada ao Curso de Pós Graduação em
Genética do Departamento de Biologia Geral do Instituto
de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas
Gerais, como pré-requisito parcial à obtenção do título de
Mestre em Genética.
Área de concentração: Genética Evolutiva e de
Populações
Orientadora: Profa Dra
Cleusa Graça da Fonseca
iii
AGRADECIMENTOS Agradeço a todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste
trabalho.
Agradeço de modo especial:
À Universidade Federal de Minas Gerais e ao Programa de Pós-Graduação em
Genética por permitirem a realização deste estudo. A todos os professores do programa
pelos ensinamentos.
À Profa. Dra. Cleusa Graça da Fonseca, pela paciência, confiança, compreensão,
incentivo, orientação e disponibilidade.
Ao Prof. Dr. Evaldo Nascimento por todas as oportunidades que a mim concedeu
propiciando sempre o meu aperfeiçoamento profissional e científico, pelas valiosas
sugestões, pela confiança e, sobretudo, por compartilhar comigo sua brilhante experiência
científica. Enfim, por apoiar inteiramente desde o primeiro dia até hoje a realização deste
estudo.
Ao Laboratório de Imunogenética e Histocompatibilidade de Transplantes
IMUNOLABTx pela disponibilização dos dados utilizados nesta dissertação. A toda equipe
desse Laboratório, em especial à Roselia e ao pessoal do setor de Biologia Molecular
por compreenderem minhas necessidades e ausências.
Ao Prof. Dr. Eduardo Tarazona pelos ensinamentos, sugestões e pela significativa
colaboração para a realização deste trabalho.
À equipe do Laboratório de Genética quantitativa e conservação animal. Aos amigos
Leonardo, Gustavo, Pilar e especialmente à Luciene pela disponibilidade para discussões.
À minha irmã Renata pela importante ajuda na parte de História de MG.
À pessoa por quem tenho um carinho e uma ligação muito especial, minha irmã Cíntia, por
tudo que compartilhamos e vivenciamos juntas, por nossas afinidades e diferenças, pela
amizade, compreensão e apoio sempre.
Aos meus pais, João e Maria, por terem direcionado meus primeiros passos na caminhada
educacional e me apoiado durante todas as etapas da minha vida.
Ao Marcos pelo apoio com sua alegria e compreensão nos dias difíceis.
A Deus, por tudo.
iv
“A manutenção na natureza de variantes favoráveis e a
eliminação de variantes prejudiciais eu chamo Seleção
Natural. Variações que não são nem úteis nem
prejudiciais não serão afetadas pela Seleção Natural e
são como variantes flutuantes, como talvez
observemos nas espécies chamadas polimórficas”.
(Charles Darwin)
v
SUMÁRIO
RESUMO .................................................................................................................. 1
SUMMARY ............................................................................................................... 2
1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 3
1.1. COMPLEXO PRINCIPAL DE HISTOCOMPATIBILIDADE .................................. 3
1.1.1. História ............................................................................................................ 3
1.1.2. Organização gênica do MHC ........................................................................... 4
1.1.3. Estrutura das moléculas HLA ........................................................................... 6
1.1.4. Herança dos alelos HLA .................................................................................. 10
1.1.5. Expressão e função imune das moléculas HLA .............................................. 10
1.1.6. Polimorfismo nos loci HLA ............................................................................... 11
1.1.7. Nomenclatura dos alelos HLA ......................................................................... 14
1.1.8. Aspectos clínicos relevantes envolvendo as moléculas HLA ........................... 15
1.1.8.1. HLA e transplante ........................................................................................ 15
1.1.8.2. HLA e doenças ............................................................................................. 16
1.1.8.2.1. Doenças infecciosas ................................................................................. 16
1.1.8.2.2. Doenças autoimunes e outras ................................................................... 16
1.2. História evolutiva do MHC/HLA .......................................................................... 17
1.3. Desequilíbrio de ligação e recombinação intergênica nos loci HLA ..................... 20
1.4. Seleção natural nos loci HLA .............................................................................. 21
1.4.1. Seleção Balanceadora .................................................................................... 23
1.5. Variabilidade HLA dentro e entre as populações humanas ................................. 24
1.6. Origem e formação da população de Minas Gerais ........................................... 25
2. RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA ......................................................................... 28
3. OBJETIVOS .......................................................................................................... 29
3.1. Objetivo geral ..................................................................................................... 29
3.2. Objetivos específicos . ........................................................................................ 29
4. MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 30
4.1 População ........................................................................................................... 30
4.2. Critérios de inclusão ........................................................................................... 30
4.3. Critérios de exclusão .......................................................................................... 30
4.4. Aspectos éticos .................................................................................................. 31
4.5. Coleta de amostras e extração do DNA ............................................................. 31
4.6. Tipificação dos loci HLA ..................................................................................... 31
4.7. Análises estatísticas .......................................................................................... 33
4.7.1. Diversidade e Heterozigosidade ...................................................................... 33
vi
4.7.2. Equilíbrio de Hardy-Weinberg ......................................................................... 33
4.7.3. Frequências haplotípicas ................................................................................. 34
4.7.4. Desequilíbrio de ligação ................................................................................... 34
4.7.5. Teste de homozigosidade de Ewens-Watterson ............................................. 34
4.7.6. Estrutura genética ............................................................................................ 35
4.7.7. Análise filogenética .......................................................................................... 35
5. RESULTADOS ..................................................................................................... 37
5.1. Análise das famílias ............................................................................................ 37
5.1.1. Aspectos gerais ............................................................................................... 37
5.1.2. Frequências alélicas ....................................................................................... 37
5.1.3. Frequências haplotípicas ................................................................................ 37
5.1.4. Desequilíbrio de ligação (DL) ........................................................................... 38
5.1.5. Taxa de recombinação entre os loci HLA-A e HLA-B ...................................... 39
5.2. Análise da amostra de indivíduos não aparentados ............................................ 39
5.2.1. Diversidade e Heterozigosidade ...................................................................... 39
5.2.2. Desequilíbrio de ligação ................................................................................... 47
5.2.3. Seleção natural ............................................................................................... 47
5.2.4. Diferenciação da população ............................................................................. 47
5.2.5. Análise filogenética .......................................................................................... 47
6. DISCUSSÃO ......................................................................................................... 53
6.1. Diversidade genética nos loci HLA ...................................................................... 53
6.2. Desequilíbrio de ligação ...................................................................................... 54
6.3. Seleção Natural .................................................................................................. 54
6.4. Estrutura genética populacional .......................................................................... 55
6.5. Análise filogenética ............................................................................................ 57
7. CONCLUSÕES ..................................................................................................... 59
8. ANEXOS .............................................................................................................. 60
Anexo 1 ..................................................................................................................... 60
Anexo 2 ..................................................................................................................... 61
Anexo 3 ..................................................................................................................... 62
Anexo 4 ..................................................................................................................... 63
Anexo 5 ..................................................................................................................... 64
Anexo 6 ..................................................................................................................... 65
Anexo 7 ..................................................................................................................... 67
Anexo 8 ..................................................................................................................... 68
Anexo 9 ..................................................................................................................... 70
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................... 84
vii
LISTA DE FIGURAS FIGURA 1: Mapa gênico esquemático da região do MHC. ........................................ 5
FIGURA 2: Estrutura esquemática das moléculas HLA de classe I e classe II. ......... 8
FIGURA 3: Estrutura esquemática da molécula HLA de classe I mostrando que o
polimorfismo encontra-se localizado nos domínios α1 e α2. ...................................... 8
FIGURA 4: Estrutura esquemática da molécula HLA de classe II mostrando que
o polimorfismo encontra-se localizado no domínio β1. ............................................... 9
FIGURA 5: Vista frontal da PBR (Peptide binding Region) das moléculas HLA
de classe I e II.......................................................................................................... 9
FIGURA 6: Descobrimento de novos alelos HLA de classe I e II no período de 1987 a 2009. ............................................................................................................ 12
FIGURA 7: Distribuição do alelo HLA-B 40 na população mundial. ......................... 13
FIGURA 8: Princípios da técnica PCR-SSOP. ........................................................ 33
FIGURA 9: Distribuição dos alelos HLA-A no grupo dos brancos (A), negros (B) e pardos (C) ............................................................................................................. 44
FIGURA 10: Distribuição dos alelos HLA-B no grupo dos brancos (A), negros (B) e pardos (C) ............................................................................................................. 45
FIGURA 11: Distribuição dos alelos HLA-DRB1 no grupo dos brancos (A), negros (B) e pardos (C) ........................................................................................... 46
FIGURA 12: Dendograma gerado com base nas frequências alélicas dos loci
HLA-A, -B e –DRB1. ............................................................................................... 52
viii
LISTA DE TABELAS
TABELA 1: Principais assuntos sobre HLA discutidos nos WIIH. ............................ 4
TABELA 2: Número de alelos, proteínas e alelos nulos nos loci HLA-A, -B e
DRB1. ........................................................................................................................ 11
TABELA 3: Nomenclatura dos alelos HLA. ............................................................... 15
TABELA 4: Fenótipos e doenças associadas aos loci HLA. ..................................... 17
TABELA 5: Imigração no Brasil, por nacionalidade, de 1500 a 1933. ...................... 25
TABELA 6: Escravos africanos no Brasil de acordo com o período. ......................... 26
TABELA 7: Condições de amplificação para a realização da PCR SSOP para
tipificação HLA-A, -B, -DRB1. ................................................................................... 32
TABELA 8: Frequências alélicas dos loci HLA-A e HLA-B. ....................................... 38
TABELA 9: Heterozigosidade nos loci HLA-A e HLA-B. ............................................ 38
TABELA 10: Frequências de haplótipos HLA-A:HLA-B, estimativas de
desequilíbrio de ligação (D’) e sua significância. ....................................................... 40
TABELA 11: Diversidade, heterozigosidade e resultado do teste de HW para os
loci HLA-A, -B e -DRB1. ............................................................................................. 42
TABELA 12: Distribuição da frequência alélica por locus HLA nos grupos de
Brancos, Negros e Pardos. ....................................................................................... 43
TABELA 13: Desequilíbrio de ligação global entre os pares de loci HLA. ................ 47
TABELA 14: Teste de homozigosidade de Ewens-Watterson. .................................. 49
TABELA 15: Medidas de diferenciação genética entre os grupos. ........................... 50
TABELA 16: Matriz de distância genética obtida pelo método de Nei (1972). .......... 51
TABELA 17: Casamentos intergrupos observados na província de Minas Gerais
de 1818-1838. .......................................................................................................... 56
ix
LISTA DE ANEXOS ANEXO 1 - Poster: HLA-A, -B, -DRB1 allele and haplotype frequencies in 1000
human samples from mixed population of the Minas Gerais state, Brazil. .................. 60
ANEXO 2 - Poster: Strong linkage disequilibria between HLA-A*2402, B*0720
and DRB1*1601 in 5000 volunteers from mixed population from Minas Gerais
state, Brazil. ............................................................................................................... 61
ANEXO 3 - Poster: Strong linkage disequilibrium between HLA A*0201, B*1804
and DRB1*1104 in 5000 volunteers from mixed population from Minas Gerais
state, Brazil. ............................................................................................................... 62
ANEXO 4 - Poster: Analysis of allelic, haplotype diversity, linkage disequilibrium
and inter-loci recombination rate of the MHC Class I region of 917 families from
Minas Gerais state, Brazil. ......................................................................................... 63
ANEXO 5: Parecer do Prof. Dr. Eduardo Martin Tarazona-Santos referente ao
projeto de Mestrado. .................................................................................................. 64
ANEXO 6: Parecer da Professora. Dra. Maria Raquel Carvalho referente ao
projeto de Mestrado. .................................................................................................. 65
ANEXO 7: Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Santa Casa de
Misericórdia de Belo Horizonte. ................................................................................ 67
ANEXO 8: Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa da UFMG. .............................. 68
ANEXO 9: Artigo sob revisão a ser submetido ao periódico Human Immunology. ..... 70
x
LISTA DE ABREVIATURAS e SIGLAS AIDS Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
CAP Células Apresentadoras de Antígenos
CEDEPLAR Centro de Desenvolvimento e Planejamento Regional de Minas Gerais
DL Desequilíbrio de ligação
DNA Ácido desoxirribonucléico
EDTA Ácido etilenodiaminotetracético
EM Expectation Maximization
EW Ewens-Watterson
FST Índice de fixação
Fnd Estatística F normalizada
G'ST Medida padronizada da diferenciação genética
H0 Hipótese nula
HGDP-CEPH Genome Diversity Panel Centre d’Etude du Polymorphisme Humain
HLA Human Leucocyte Antigen
Hobs Heterozigosidade observada
HUGO Gene Nomenclature Committee (HGNC)
HW Hardy-Weinberg
IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
IC Intervalo de confiança
Ile Isoleucina
IMGT/HLA IMmunoGeneTic HLA Sequence Database
LSDB Data Base Specific Locus
Mb Mega base
MCMC Monte-Carlo Markov Chain
MHC Major Histocompatibility Complex
MG Minas Gerais
MS Mato Grosso do Sul
OMS Organização Mundial da Saúde
PBR Peptide Biding Region
PCR Polymerase Chain Reaction
PCR-SSOP Polymerase Chain Reaction Sequence Specific Oligonucleotide Probe
PHYLIP Phylogeny Inference Package
PI Piauí
PR Paraná
PYPOP Python for Population Genetics
xi
SE Erro padrão
REDOME Registro Brasileiro de Doadores Voluntários de Medula Óssea
SP São Paulo
SMOGD Software for the Measurement of Genetic Diversity
SNP Single Nucleotide Polimorphism
TCR T Cell Receptor
UFMG–COEP Conselho de ética em Pesquisa da Universidade Federal de Minas
Gerais
WIIH Workshops Internacionais de Imunogenética e Histocompatibilidade
1
RESUMO Análise da diversidade genética dos loci HLA-A, -B e -DRB1 e da estrutura da população humana do estado de Minas Gerais, Brasil. Belo Horizonte: UFMG, 2009. Dissertação (Mestrado em Genética, área Genética de População) – Pós-Graduação em Genética do Instituto de Ciências Biológicas – UFMG. Os antígenos leucocitários humanos (HLA) são codificados por um sistema altamente
polimórfico designado complexo principal de histocompatibilidade (MHC). Os genes HLA são
herdados em blocos chamados haplótipos e expressos codominantemente em cada
indivíduo. Os produtos gênicos dos loci HLA influenciam na rejeição a transplantes de
órgãos e tecidos, suscetibilidade a doenças infecciosas e predisposição a um amplo
espectro de doenças crônicas não infecciosas, como doenças autoimunes e câncer. O
objetivo deste estudo foi analisar a diversidade genética dos loci HLA-A, -B e -DRB1 e a
estrutura genética da população do Estado de Minas Gerais (MG). A amostra foi constituída
com base em duas amostras distintas: (1) indivíduos de 917 famílias que buscavam um
doador HLA compatível para o transplante de células tronco hematopoiética para um
membro da família que possuída doença hematológica e (2) 2868 indivíduos doadores
voluntários de medula óssea, saudáveis, não relacionados e aleatoriamente alocados para
esta pesquisa. Na amostra de indivíduos não relacionados, foi possível categorizar a
amostra em brancos, pretos e pardos segundo autoclassificação baseado nos critérios do
Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE). A tipificação dos loci HLA foi feita pela
técnica PCR SSOP (Polymerase Chain Reaction Sequence Specific Oligonucleotide Probe).
Nas amostras analisadas, foram observados, em média, 20, 37 e 13 diferentes alelos para
os loci HLA-A, -B e -DRB1, respectivamente. Foi observada uma elevada heterozigosidade
para todos os loci HLA analisados, com percentuais chegando a 95,1% de indivíduos
heterozigotos na amostra. Observou-se desequilíbrio de ligação estatisticamente
significativo para todos os pares de loci HLA e, com base no estudo de segregação dos
alelos HLA nas famílias, baixa taxa de recombinação entre os loci HLA-A:HLA-B. Baseado
na diferença estatisticamente significativa da proporção de homozigotos observados e
esperados, a seleção natural balanceadora foi inferida como fator contribuinte para a
manutenção da grande variabilidade alélica e haplotípica observada nestes loci. Além disso,
a seleção balanceadora foi apoiada pela distribuição de alelos HLA com frequências
intermediárias em todos os loci analisados. Com base na análise da diferenciação genética
das amostras, foi observada estruturação genética da população. A partir da análise
filogenética, foi possível observar que a composição genética de MG foi predominantemente
de genes de origem europeia e africana com pouca participação dos genes indígenas.
Palavras chave: MHC, HLA, polimorfismo, frequência alélica, frequência haplotípica, recombinação
inter-loci, desequilíbrio de ligação, seleção natural.
2
SUMMARY
Analysis of genetic diversity at HLA-A, -B and -DRB1 loci and structure of human population of Minas Gerais, Brazil. Belo Horizonte: UFMG, 2009. Dissertação (Mestrado em Genética, área Genética de População) – Pós-Graduação em Genética do Instituto de Ciências Biológicas – UFMG. Human leucocyte antigens (HLA) are coded by a highly polymorphic system, the major
histocompatibility complex (MHC). HLA genes are inherited as haplotypes and their
expression is codominant. HLA gene products are related to transplant rejection, infectious
disease resistance and non infectious chronic diseases, like cancer and autoimmune
diseases. This study was conducted to evaluate genetic diversity at HLA-A, -B and -DRB1
loci and to analyse the genetic structure of Minas Gerais population, on the basis of two
distinct samples: (1) individuals from 917 families who sought an HLA compatible donor for
transplantation of hematopoietic stem cells to a family member who owned and hematologic
disease (2) 2868 individuals volunteer donors of bone marrow, healthy, unrelated and
randomly allocated for this research. HLA genotyping was done by PCR-SSOP (Polymerase
Chain Reaction Sequence Specific Oligonucleotide Probe) technique, resulting in the
detection, on average, of 20, 37 and 13 different alleles at HLA-A, -B and -DRB1 loci,
respectively. The proportion of heterozygotes attained high values in the three loci, with a
maximum of 95,1% at the HLA-B locus. The three pairs of loci showed statistically
significant linkage disequilibrium and the estimated recombination rate between HLA-A:HLA-
B loci was smaller than expected. The statistically significant difference between expected
and observed homozygous proportions pointed to balancing natural selection as an
important cause of the large allelic and haplotypic diversity observed in these loci. The
importance of balancing selection was also supported by the intermediate allelic frequencies
at the three analyzed HLA loci. Population structure was supported by genetic differentiation
analysis. A predominantly Caucasian and African genetic constitution and a small
contribution of Native American genes was demonstrated by phylogenetic analysis.
Key words : MHC, HLA, polimorphism, allele frequency, haplotype frequêncy, inter-loci
recombination, likage desequilibrium, natural selection..
3
1. INTRODUÇÃO
1.1. COMPLEXO PRINCIPAL DE HISTOCOMPATIBILIDADE
1.1.1. História
O MHC (Major Histocompatibility Complex) foi descrito primariamente em
camundongos, na década de 30, por Peter A. Gorer (Gorer, 1936; Gorer, 1937). Estudos
demonstraram a existência de um grupo de antígenos envolvidos nos processos de
rejeições dos transplantes de pele entre diferentes linhagens desses animais. Esses
antígenos responsáveis pela rejeição de tecidos foram denominados antígenos de
histocompatibilidade e a região foi designada de sistema H2 no camundongo estando
localizada no cromossomo 17. Desde a descoberta do MHC em camundongos, o MHC se
tornou uma das regiões gênicas mais estudadas no genoma dos vertebrados (Klein, 1986).
Em 1958, um aloantígeno presente nos leucócitos humanos foi identificado,
tornando-se o “primeiro” antígeno leucocitário humano (HLA) denominado HLA-A2 (Dausset,
1958; Payne e Rolfs, 1958; Van Rood, Eernisse et al., 1958) que mais tarde se denominou
Complexo HLA. O estudo destes autores demonstrava a presença de anticorpos no soro
humano de pacientes politransfundidos ou mulheres multíparas, que reagiam com
leucócitos, mas não de todos os indivíduos testados. Os anticorpos destes soros
detectavam um sistema polimórfico de antígenos nos leucócitos humanos. O crédito da
descoberta do primeiro antígeno HLA foi dado a Jean Dausset, que em 1980, recebeu o
Prêmio Nobel de Medicina. Ele nomeou este antígeno de MAC em homenagem a três
indivíduos voluntários, cujos nomes começavam com M, A e C, respectivamente. O antígeno
MAC, que mais tarde foi denominado HLA-A2, estava presente em 60% da população
francesa. Finalmente, o estudo dos antígenos leucocitários adquiria grande importância em
transplante de tecidos (Thorsby, 2009). Posteriormente, diversos outros investigadores
fizeram identificações originais de antígenos leucocitários e atualmente centenas de novos
alelos continuam a ser descobertos.
Desde a descoberta do HLA-A2, Workshops Internacionais de Imunogenética e
Histocompatibilidade (WIIH) são realizados, quando os investigadores da área se encontram
e comparam seus reagentes, técnicas, resultados e comunicam novas descobertas. O
primeiro WIIH ocorreu em 1964 em Durham, NC, Estados Unidos, e o último em 2008, em
Búzios, RJ, Brasil. Várias descobertas importantes foram discutidas e publicadas nos WIIH,
conforme Tabela 1 (Thorsby, 2009).
4
Tabela 1: Principais assuntos sobre HLA discutidos nos WIIH.
Workshop Ano Principais assuntos discutidos
3º 1967 Demonstração da associação dos antígenos HLA com doenças
- 1968 Criação de um comitê da Organização Mundial da Saúde (OMS) para
o estabelecimento da nomenclatura para os alelos HLA
4º 1970 Estabelecimento de dois loci HLA, LA (posteriormente HLA-A) e 4
(mais tarde HLA-B) e constatação de que os loci eram ligados e
continham pelo menos sete e oito alelos, respectivamente
5º 1972 Descoberta de que o sistema HLA constituía-se em uma importante
ferramenta para investigações antropológicas devido ao polimorfismo
observado
7º 1977 Mapeamento do MHC no braço curto do cromossomo 6 (já descritos
os loci HLA-A, -B, -C, -DR, -DQ e -DP)
8º 1980 Papel da compatibilidade HLA em transplantes renais
9º 1984 Introdução de várias técnicas para o estudo do polimorfismo dos loci
HLA
10º 1987 Estabelecimento de um painel de referência de linhagens celulares
tipificadas
13º 2002 Estabelecimento da acessibilidade pública a bancos de dados sobre
HLA
15º 2008 Novos dados e aplicações em medicina, antropologia etc.
Em 1987, o grupo de Wiley (Bjorkman, Saper et al., 1987b), usando a técnica de
cristalografia de raio-X, mostrou que parte da molécula HLA-A2 proximal à membrana
celular continha dois domínios parecidos com imunoglobulinas e que o domínio distal à
membrana era uma plataforma antiparalela de filamentos-β, cobertos por duas α-hélices,
que juntos formavam uma grande fenda que constitui o sítio de ligação para antígenos
processados. O grupo ainda mostrou que um peptídeo foi encontrado neste sítio, no cristal
da molécula HLA-A2. Este mesmo grupo, também, foi o responsável por explicar o
fenômeno da restrição HLA-TCR (Receptores de Células T) (Bjorkman, Saper et al., 1987b;
a), discutido mais adiante.
1.1.2. Organização gênica do MHC
O primeiro mapa do MHC baseado em sequência de DNA, publicado em 1999,
descreveu 224 loci, dos quais 128 (57%) eram expressos (Complete sequence and gene
map of a human major histocompatibility complex. The MHC sequencing consortium, 1999).
5
A sequência estendida do MHC foi publicada em 2004 como parte do sequenciamento
completo do cromossomo 6, passando a cobrir 7,6 Mb do braço curto deste cromossomo
(Horton, Wilming et al., 2004). Atualmente, os nomes dos genes e dos alelos do MHC são
definidos pelo HUGO - Gene Nomenclature Committee (HGNC) - e IMGT/HLA Sequence
Database (Robinson, Waller et al., 2003).
O MHC é uma região poligênica e polimórfica situada no genoma humano, no
cromossomo 6, na banda 6p21.3. O MHC é constituído por mais de 3,6 milhões de bases
(3,6Mb) (Complete sequence and gene map of a human major histocompatibility complex.
The MHC sequencing consortium, 1999; A haplotype map of the human genome, 2005), e o
número de loci identificados tem aumentado desde a primeira publicação dos loci na região
HLA, em 1999. O MHC é dividido de acordo com a estrutura e a função dos produtos
gênicos em três regiões classificadas como: classe I, classe II e classe III (Shiina, Inoko et
al., 2004) (Figura 1).
Figura 1: Mapa esquemático dos genes da região do MHC. Os genes HLA clássicos estão representados em vermelho, os genes HLA não clássicos em verde, os pseudogenes em amarelo e os genes em rosa, azul e turquesa são genes relacionados com HLA, como exemplo, os gene TAP2 envolvido no processamento do peptídeo. Fonte: “Site do Instituto Anthony Nolan Trust Histocompatibility Laboratories”. http://hla.alleles.org/alleles/index.html. Os loci de classe III não foram representados nesta figura esquemática.
6
As regiões de classe I e II são altamente poligênicas e polimórficas e codificam dois
grupos de proteínas estruturalmente distintas. A região de classe III encontra-se localizada
entre as regiões de classe I e II e contém um grupo de genes cujos produtos estão
envolvidos nas respostas inflamatórias, tais como: as proteínas da cascata do complemento
(C2, C4 e Bf), citocinas (TNF-α e TNF-β, LTA e LTB), proteínas do choque térmico e muitos
outros genes relacionados com a função imune e inflamatória. A região de classe III contém
mais de 62 loci distribuídos dentro de 0,9 Mb de DNA (Williams, 2001; Shiina, Inoko et al.,
2004).
A região de classe I ocupa aproximadamente 1,8 Mb e constitui a porção mais
telomérica do MHC. Contém 18 loci HLA entre os quais três são clássicos (HLA-A, HLA-B e
HLA-C), expressos por todas as células nucleadas, três são não clássicos (HLA-E, HLA-F e
HLA-G) e 12 pseudogenes (HLA-S/17, HLA-X, HLA-N/30, HLA-L/92, HLA-J/59, HLA-80,
HLA-21, HLA-K/70, HLA-16, HLA-H/54, HLA-90 e HLA-75) (Williams, 2001; Shiina, Inoko et
al., 2004) .
A região de classe II ocupa aproximadamente 0,7Mb de DNA e contém os genes que
codificam as cadeias a e b dos loci clássicos de classe II (HLA-DP, HLA-DQ e HLA DR).
Existem 34 loci identificados dentro da região de classe II com 16 genes expressos, três
genes candidatos e 15 pseudogenes. A região de classe II consiste de uma série de
subregiões, cada uma contendo os genes a e b codificando as cadeias α e β,
respectivamente. A família de gene DR consiste de um único gene DRA e mais de nove
genes DRB. O gene DRA codifica uma cadeia α invariável que se liga a várias cadeias β
codificadas pelos genes DRB. Os haplótipos HLA de certos alelos DRB1 contêm
especificamente os loci DRB3, DRB4 ou DRB5. As famílias DP e DQ têm um gene expresso
para as cadeias α e β e pseudogenes não expressos (Shiina, Inoko et al., 2004).
Apenas nove genes estão envolvidos com a apresentação dos peptídeos e são
chamados de genes HLA clássicos, sendo que na região de classe I se localizam os loci
HLA-A, -B e -C e, na região de classe II, os loci DPA1, DPB1, DQA1, DQB1, DRA, DRB1
(Williams, 2001).
1.1.3. Estrutura das moléculas HLA
As moléculas HLA de classe I e II são heterodímeros, com domínios extracelulares
variáveis, domínios transmembrana e intracitoplasmáticos constantes (Williams, 2001)
(Figura 2). Diferentemente dos genes receptores de células T e das imunoglobulinas, a
diversidade não é obtida somaticamente, mas através da manutenção de muitos alelos na
população.
7
As moléculas HLA de classe I são glicoproteínas constituídas de uma cadeia α
composta por três domínios (α1, α2 e α3) e ligada de forma não covalente a uma molécula
de β-2 microglobulina, codificada fora do MHC por um gene localizado no cromossomo 15.
Os genes que codificam as moléculas HLA de classe I têm uma estrutura característica na
qual os diferentes domínios da proteína são codificados por diferentes exons. O
polimorfismo estrutural na molécula HLA de classe I é observado nos domínios α1 e α2
(Figuras 3 e 5), os quais se ligam ao peptídeo que será apresentado aos receptores dos
linfócitos T (TCR). O domínio α1 é codificado pelo exon 2, e o α2, pelo exon 3 (Marsh, S. G.
E., Parham, P., Barber L.D., 2000). Os domínios α1 e α2 contêm as sequências variáveis de
aminoácidos e determinam a especificidade antigênica das moléculas HLA de classe I. O
domínio α3 e β-2 microglobulina, juntos, formam a região constante da molécula HLA. Os
domínios de cadeia pesada α1 e α2 formam a fenda de ligação do peptídeo, que pode
conter de oito a dez resíduos de aminoácidos (Marsh, S. G. E., Parham, P., Barber L.D.,
2000).
Os produtos dos genes de classe II, também, são glicoproteínas, mas formadas por
duas cadeias polipeptídicas não covalentemente associadas, α e β. As cadeias α e β são
transmembrana tendo a mesma estrutura geral. Uma porção extracelular composta por dois
domínios de cadeia α (α1 e α2) e uma cadeia β, também com dois domínios (β1 e β2), é
ancorada na membrana por uma pequena região transmembrana e um domínio
citoplasmático. O polimorfismo de classe II ocorre na região aminoterminal do domínio β1
(Figuras 4 e 5). Os domínios α1 e β1 formam a fenda de ligação para os peptídeos
estranhos, que podem medir mais de 12 resíduos de aminoácidos. Os genes que codificam
as cadeias α são designados A (por exemplo, DRA, DQA) e os genes que codificam as
cadeias β são designados como B (por exemplo, DRB, DQB). Os genes que codificam as
cadeias α e β do HLA-DR são DRA1 e DRB1. Quanto à organização intron-exon, as cadeias
α e β têm estruturas similares, nas quais os exons 2 e 3 codificam os dois domínios
extracelulares(Marsh, S. G. E., Parham, P., Barber L.D., 2000).
8
Figura 2: Estrutura esquemática das moléculas HLA de classe I e classe II. Fonte: (Williams, 2001).
Figura 3: Estrutura esquemática da molécula HLA de classe I. O polimorfismo estrutural encontra-se localizado nos domínios α1, α2. Fonte: (Janeway, 2006).
9
Figura 4: Estrutura esquemática da molécula HLA de classe II. O polimorfismo estrutural encontra-se localizado no domínio β1. Fonte: (Janeway, 2006).
Figura 5: Vista frontal da PBR (Peptide
binding Region) das moléculas HLA de
classe I e II. Os peptídeos ligados estão
representados em vermelho; pontes
dissulfeto, em amarelo. As linhas
pontilhadas indicam pontes de hidrogênio
conservadas entre aminoácidos da cadeia
lateral da molécula HLA e peptídeos
ligados.
Fonte: (Jensen, 2007).
10
1.1.4. Herança dos alelos HLA
Os alelos HLA são proximamente ligados no cromossomo, e a região MHC completa
é herdada como um haplótipo, com a exceção de haplótipos que sofreram recombinação, de
modo Mendeliano de cada parental. A segregação dos haplótipos HLA dentro das famílias
pode ser determinada por estudos de HLA nessas famílias. Dois irmãos têm 25% de chance
de serem genotipicamente idênticos nos loci HLA, 50% de chance de serem haploidênticos
(compartilharem 1 haplótipo) e 25% de chance de não compartilharem nenhum haplótipo. A
interação entre os alelos HLA é de codominância.
1.1.5. Expressão e função imunológica das moléculas HLA
Apesar de as moléculas HLA terem sido originalmente estudas devido à sua
habilidade em conferir tolerância aos transplantes de tecidos e órgãos, sua função primária
é fornecer proteção contra os patógenos. Isto é obtido através de sofisticadas vias, nas
quais as moléculas HLA de classe I apresentam antígenos endógenos às células T-CD8+ e
as moléculas HLA de classe II apresentam antígenos exógenos às células T-CD4+ (Jensen,
2007).
A via de apresentação de antígenos das moléculas HLA classe I é ativa em todas as
células nucleadas, fornecendo um mecanismo para apresentação, na superfície das células,
de amostras de peptídeos derivados de proteínas que estão sendo sintetizadas na célula em
um dado tempo. Portanto, o proteoma interno é disponibilizado para a vigilância das células
T-CD8+ citotóxicas, que têm a habilidade para detectar e lisar as células que expressam
proteínas virais ou antígenos de tumor. Desse modo os linfócitos T CD8+ reconhecem
peptídeos endógenos apresentados pela molécula HLA de classe I e, uma vez ativados,
desencadeiam uma reação citotóxica, lisando a célula alvo por meio de proteínas
citoplamáticas como a granzima B e a perforina (Rock, York et al., 2004; Jensen, 2007).
A via de apresentação de antígenos das moléculas HLA classe II é ativa somente
nas CAP (Células Apresentadoras de Antígenos), incluindo células dendríticas, linfócitos B,
macrófagos, células epiteliais do timo e linfócitos T ativados. A geração de complexos
peptídeo-HLA classe II e a expressão de moléculas coestimulatórias e citocinas nas CAP
são altamente regulados, refletindo a importância crucial das células T-CD4+ em regular
quase todos os componentes da imunidade adaptativa. Os peptídeos apresentados pelas
moléculas HLA classe II são derivados de proteínas que obtiveram acesso ao
compartimento endossomal, de modo a fornecer uma forma para as células T-CD4+
responderem aos antígenos processados internamente pelas CAP através da fagocitose,
macropinocitose, endocitose mediada por receptor e outros mecanismos (Watts, 2004;
Jensen, 2007).
11
As células T-CD4+ secretam citocinas capazes de recrutar e ativar um grande
número de células efetoras, principalmente macrófagos e linfócitos T e B. A ativação dos
linfócitos T-CD4+ tem múltiplos efeitos, propiciando a diferenciação e a proliferação dos
linfócitos B, que levam à produção de anticorpos e permitem que os linfócitos T se
diferenciem para as funções efetoras (Jensen, 2007).
Zinkernagel e Dougherty demonstraram, em 1974, que, para induzir a resposta
imune, os linfócitos T devem ter a mesma molécula HLA que a da célula apresentadora de
antígeno. O fato de que os peptídeos são ligados às moléculas HLA e estes complexos são
reconhecidos na superfície das células pelos TCR ficou conhecido como restrição ao MHC
(Zinkernagel e Doherty, 1974).
Tal descoberta resultou de experimentos mostrando que um linfócito T somente
reconhecerá peptídeos quando eles estiverem ligados a uma molécula MHC específica. O
descobrimento da restrição imunológica pelo MHC desempenhou papel chave na resposta
imune adaptativa e permitiu que seu alto polimorfismo fosse interpretado no contexto
funcional. A combinação específica MHC-peptídeo foi usada para concluir que a resposta
imune de indivíduos heterozigotos nos loci MHC seria mais efetiva por responderem de
forma bem-sucedida a uma maior variedade de patógenos (Hedrick, P. W., 2000).
1.1.6. Polimorfismo nos loci HLA
Uma ampla lista de alelos de cada loci dentro do sistema HLA não é possível de ser
publicada porque novos alelos são descobertos e adicionados continuamente. Para
pesquisar a lista mais atual destes alelos, foi acessado, em novembro de 2009, o site
http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/, com banco de dados - denominado IMGT/HLA - atualizado
regularmente. O IMGT/HLA, um banco de dados locus específico (LSDB) para as
sequências de genes do sistema HLA, fornece os recursos para os interesses clínicos ou
científicos no sistema HLA. Atualmente, armazena mais de 2850 sequências de alelos dos
loci HLA-A, -B e DRB1 (Tabela 2 e Figura 6).
Tabela 2: Número de alelos, proteínas e alelos nulos nos loci HLA-A, -B e DRB1.
Genes
HLA Classe I HLA Classe II
A B DRB1
Alelos 853 1249 748
Proteínas 652 1046 595
Alelos nulos 51 39 8
Fonte: (Robinson, Waller et al., 2003).
.
12
Figura 6: Descobrimento de novos alelos HLA de classe I e II no período de 1987 a 2009.
Fonte: (Robinson, Waller et al., 2003)
Os genes HLA de classe I e II são altamente polimórficos, com o locus HLA-B sendo
o mais polimórfico gene do genoma humano (Mungall, Palmer et al., 2003). Os SNPs (Single
Nucleotide Polimorphism) são o tipo mais comum de variação. Mas as moléculas HLA
apresentam também polimorfismos de inserção/deleção e originados da conversão gênica
(Mungall, Palmer et al., 2003).
As frequências dos alelos HLA exibem variação entre as regiões e entre os grupos
populacionais (Figura 7), com alguns alelos sendo amplamente distribuídos entre
populações e outros aparecendo quase que exclusivamente dentro de uma região ou grupo
particular.
13
Imigrantes do Estreito de Bering para as Américas há mais de 100 mil anos,
provavelmente trouxeram o alelo DRB1*0802 com alta frequência. Atualmente, variantes do
alelo DRB1*0802, tais como *0807 e *0811, são encontradas nos nativos americanos, assim
como, o DRB1*0802 (Williams, Wu et al., 1994; Mack e Erlich, 1998). Estas variantes se
originaram por mutações nas linhagens germinativas em indivíduos portadores do
DRB1*0802. Novos alelos aparecem regularmente em altas taxas e se tornam fixados na
população, em teoria, se fornecem uma vantagem seletiva na apresentação de peptídeos de
organismos infecciosos. Novos alelos são gerados via mutação de ponto, recombinação e
conversão gênica (Little e Parham, 1999).
A recombinação intragênica pode ser um mecanismo importante na geração da
diversidade alélica nos loci HLA de classe I e II (Satta, 1997). Enquanto as mutações geram
novas variantes em sítios individuais, a recombinação pode produzir múltiplas substituições
Figura 7: Distribuição do alelo HLA-B 40 na população mundial. Fonte: (Cavalli-Sforza, 1994).
14
por evento com o potencial para grandes mudanças no sítio de ligação do antígeno nas
moléculas HLA. Portanto, novas moléculas geradas por recombinação podem ter uma maior
vantagem seletiva (Andersson e Mikko, 1995).
1.1.7. Nomenclatura dos alelos HLA
A nomenclatura dos alelos HLA é amplamente baseada em nomes sorológicos
antigos desde que os grupos de epítopos públicos de antígenos HLA foram originalmente
definidos com base na reação com antissoros em testes de microlinfocitotoxicidade
dependente de complemento. Os alelos dentro de um grupo sorológico podem diferir um do
outro por um ou por diversos nucleotídeos. Os antissoros foram, inicialmente, isolados de
mulheres sensibilizadas durante a gravidez por antígenos HLA codificadas pelos haplótipos
paternos.
A nomenclatura do sistema HLA é formalmente estabelecida pelo Comitê de
Nomenclatura da OMS. O Comitê Internacional da OMS responsável pela normatização da
denominação dos alelos de histocompatibilidade se reúne regularmente em Workshops
Internacionais para determinar os nomes oficiais dos alelos HLA. Uma vez que as
informações das sequências de nucleotídeos dos alelos HLA se tornam disponíveis, a
nomenclatura complementar para os termos sorológicos é elaborada (Tabela 3).
Tornando-se disponível a sequência de nucleotídeos do alelo, a nomenclatura
complementar aos termos sorológicos é necessária. Os primeiros dois dígitos do nome de
um alelo se referem à especificidade sorológica, e o terceiro e o quarto dígitos indicam a
sequência específica desse alelo. Múltipos alelos são encontrados dentro de um sorotipo
conhecido, o B35, por exemplo, tem mais de 40 alelos descritos. Outro exemplo são os
alelos HLA-A*0205 e A*0210, que codificam diferentes polipeptídios dentro do sorotipo A2.
Estes dois alelos codificam um epítopo reconhecido pelo antissoro anti-A2, apesar de terem
cinco nucleotídeos diferentes nos exons 2 e 3 resultando em variações de aminoácidos
(Williams, 2001).
15
Tabela 3: Nomenclatura dos alelos HLA.
Exemplos de alelos Comentários
A*24 e A*2404
A*24 se refere a qualquer um dos 33 alelos conhecidos
com sequências proximamente relacionadas aos
antígenos de classe I codificados que usualmente
reagem com o antissoro A24. A*2404 é um alelo
específico dentro deste grupo.
DRB1*0801 e DRB1*0805
Diferem no exon 2 no códon 74: nesta posição o
DRB1*0801 tem CTG e o DRB1*0805 tem GCG
codificando Leu e Ala, respectivamente.
A*01011 e A*01012
Diferem por um polimorfismo silencioso no códon 142:
nesta posição o A*01011 tem ATC e o A*01012 tem
ATT. Ambos codificam Ile (Isoleucina).
B*1501101 e B*1501102N
O alelo B*1501102N (nulo) tem uma deleção de 10 pb
próximo ao final 3´ do intrón 1. O mRNA é
impropriamente recomposto com um polipeptídeo
traduzido truncado.
Fonte: (Robinson, Waller et al., 2003).
1.1.8. Aspectos clínicos relevantes envolvendo as moléculas HLA
1.1.8.1. HLA e transplante
O sistema imune é capaz de responder aos órgãos e tecidos transplantados,
reconhecendo os antígenos HLA incompatíveis do doador. A atual interpretação para a
rejeição de órgãos e tecidos é baseada na interação de receptores de linfócitos T com as
moléculas HLA, e peptídeos associados determinam a especificidade da interação. Então,
se os tecidos ou órgãos transplantados carregam moléculas HLA que são diferentes
daquelas do receptor, os complexos HLA-peptídeos resultantes serão reconhecidos como
estranhos pelos linfócitos T do receptor. A resposta imune, assim, será montada contra o
enxerto, resultando na sua rejeição (Janeway, 2006).
O primeiro transplante renal foi realizado com êxito entre gêmeos univitelinos no ano
de 1958, demonstrando a importância dos estudos de histocompatibilidade HLA na evolução
e sobrevida do enxerto.
16
1.1.8.2. HLA e doenças
1.1.8.2.1. Doenças infecciosas
Descobertas de associação entre alelos HLA e doenças infecciosas mostram que a
variação no sistema HLA está relacionada à resistência ou à susceptibilidade a doenças
infecciosas. Como: 1) Os estudos de associação HLA e doenças infecciosas mostram casos
em que os patógenos contribuem para a distribuição dos alelos HLA em populações
humanas. No caso da malária, o alelo HLA-B*53 e o HLA-DRB1*1302 são super-
representados entre os indivíduos que são resistentes à malária severa, sugerindo que eles
são alelos protetores para a doença. Além disso, esses alelos são mais frequentes entre os
africanos do oeste (que são expostos ao parasito que causa malária) do que em outros
grupos populacionais, indicando seleção que favorece indivíduos com os alelos protetores e,
desta forma, elevando a frequência de tais alelos na população (Hill, Allsopp et al., 1991;
Hill, Yates et al., 1994; Carrington, Nelson et al., 1999). 2) Heterozigotos para os alelos HLA
podem ser mais resistentes a algumas doenças infecciosas do que os homozigotos. No
estudo de progressão para a AIDS entre indivíduos infectados pelo HIV, o tempo de
manifestação da doença foi significativamente mais demorado em indivíduos heterozigotos
para os alelos HLA de classe I (Carrington, Nelson et al., 1999).
1.1.8.2.2. Doenças autoimunes e outras
Além das doenças infecciosas, muitas doenças autoimunes, câncer e doenças de
outras etiologias mostram associação com HLA. Em alguns casos, a associação com as
moléculas HLA de classe I clássicas reflete o Desequilíbrio de Ligação (DL) com o gene real
de predisposição à doença; por exemplo, a hemocromatose. Entretanto, em um número de
exemplos, os riscos para as doenças estão diretamente relacionados às moléculas clássicas
de classe I ou II (Thorsby e Lie, 2005).
Os genes HLA clássicos de classe I e II estão associados a várias doenças (Thorsby,
1997). As moléculas são consideradas associadas com uma determinada doença se a
frequência de um ou mais alelos HLA aumenta ou diminui significativamente quando os
pacientes são comparados com um grupo controle. Nas doenças associadas aos loci HLA,
incluem-se as doenças neurodegenerativas, psiquiátricas, metabólicas, infecciosas,
dermatológicas, oncológicas e as autoimunes (Tabela 4).
17
Tabela 4: Fenótipos e doenças associadas aos loci HLA.
Fenótipo ou doença Classe da doença Genes associados
Leucemia linfoblástica aguda infantil (LLA) Câncer HLA-DRB1
Mieloma múltiplo Câncer HLA
Hepatite autoimune Imune HLA-DRB1
Psoríase Imune HLA classe I
Miastenia de gravis Imune HLA classe II
Lupus eritematoso sitêmico Imune HLA classe II
Pênfico vulgar Imune/Dermatológica HLA DQ beta
Doença de Grave Imune/Endócrina HLA-DRB1, -DQA1
Tireoidite de Hashimoto Imune/Endócrina HLA-A2
Diabetes mellitus tipo 1 Imune/Endócrina/Meta
-bólica
HLA-DRB1*03/*04
Doença celíaca Imune/Gastrointestinal HLA classe II
Doença de Crohn Imune/Gastrointestinal HLA-DRB1
Baixa resposta imune à vacina para
hepatite B
Imune/Infecção HLA-DR14-DR52
Uveíte anterior aguda Imune/Ocular HLA-B27
Doenças de Behcet Imune/Ocular HLA-B51
Asma Imune/Respiratória HLA-DRB1, -DQB1, -
DPB1
Espondilite anquilosante Imune/Reumatológica HLA-B27
Doença do enxerto contra o hospedeiro
aguda (DECH)
Inume/Transplante HLA
Doenças de Alzheimer Neurodegenerativa HLA-A2, DRB1
Narcolepsia Neurológica HLA-DQB*06
Autismo Psíquica HLA-DRB1
Esquizofrenia Psíquica HLA
Fonte: Genetic Association Database (GAD) http://geneticassociationdb.nih.gov/cgi-bin/index.cgi.
1.2. História evolutiva do MHC/HLA
O MHC de classe I e II está presente somente nos vertebrados mandibulados, e esta
distribuição filogenética é paralela à das imunoglobulinas e dos receptores de linfócitos T.
Os genes HLA de classe I e II são partes do sistema imune adaptativo, assim como os
receptores dos linfócitos T e as imunoglobulinas (Flajnik e Kasahara, 2001). Pelo menos
18
quarenta por cento dos loci MHC expressam proteínas envolvidas na resposta imune, o que
pode refletir em coevolução de funções ou em coexpressão de transcritos relacionados
(Meyer e Thomson, 2001).
O MHC é a região mais importante do genoma humano com relação à infecção e
autoimunidade, além de ser crucial na imunidade inata e adaptativa. Esta região gênica é
composta por um grupo de genes ligados envolvidos funcionalmente com o sistema imune
inato e adaptativo. No MHC de mamíferos, existem de dois a cinco diferentes blocos de
duplicações de classe I compreendidos dentro da estrutura dos genes conservados não-
classe I e/ou não-classe II (Flajnik e Kasahara, 2001).
Compreender a história evolutiva dos loci HLA implica compreender uma complexa
estrutura, afinal os loci são compostos por segmentos com diferentes níveis de diversidade
nucleotídica. O comprimento da sequência genômica dos alelos HLA-DRB1 varia
consideravelmente, estendendo-se de 10.278 pb, para o HLA-DRB1*010101, até 15.191 pb,
para o HLA-DRB1*070101. Esta variação pode ser atribuída principalmente a proporções
variáveis de sequências repetidas nos introns (Marsh, S. G. E., Parham, P., Barber L.D.,
2000).
A idade do polimorfismo e a taxa na qual novos alelos são gerados nos loci HLA têm
causado muita controvérsia. Para o locus HLA-DRB1, estudos prévios têm mostrado ser
restrito a 270 pb do exon 2, que representa a parte mais variável do gene. Quando se
excluiu o exon 2 da análise, a diversidade dos sítios sinônimos foi similar à diversidade dos
introns. A diversidade na região não codificante foi, também, similar à média do genoma. O
alelo HLA-DRB1 03 é encontrado em humanos, chimpanzés, bonobos, gorilas e
orangotangos. Quatro alelos HLA-DRB1 01, 04, 07 e 10 são pré-datados da divergência de
humanos e chimpanzés. Com exceção do exon 2, tanto a diversidade na região codificante
quanto a não codificante sugere uma recente origem (<1 milhão de anos atrás) para a
maioria dos alelos no locus DRB1. Os sítios que codificam para os aminoácidos envolvidos
na PBR (Região de ligação do peptídeo) parecem ter uma origem mais remota (Gyllensten,
Sundvall et al., 1991; Gyllensten, Bergstrom et al., 1996).
Tomadas juntas, a recente origem da maioria dos alelos, a alta diversidade entre as
linhagens e a origem mais antiga das sequências motivos do exon-2 são consistentes com a
geração relativamente alta de novos alelos para eventos como conversão gênica. Alguns
dos motivos nas regiões de reconhecimento antigênico podem ter sido preservados como
unidades funcionais por milhões de anos. Mas a idade média da diversidade dentro das
linhagens é, por uma estimativa conservativa, menos que 1 milhão de anos.
Com base na similaridade dos haplótipos entre humanos e chimpanzés, ou na
similaridade da região codificante, tem sido argumentado que novos alelos em muitos loci
MHC são antigos (evolução transespécie) e pré-data dos hominídeos (Arden e Klein, 1982).
19
Em contraste, outros têm sugerido que realmente existem linhagens alélicas antigas, mas
que novos alelos dentro destas linhagens podem ser gerados rapidamente por eventos
como conversão gênica (Von Salome, Gyllensten et al., 2007).
O MHC é denominado de complexo principalmente porque seus genes em humanos
e roedores foram descobertos agrupados dentro de uma única região genômica ou locus.
Este grupamento gênico é considerado biologicamente e evolutivamente significante e tem
características que permitem inferir que os loci estão sob pressão seletiva, possivelmente
apoiando a expressão coordenada de alelos na forma cis e a baixa taxa de recombinação
(Meyer e Thomson, 2001; Solberg, Mack et al., 2008).
O MHC e o sistema imune adaptativo evoluíram principalmente por translocações,
duplicações e outros eventos de recombinação (Michalova, Murray et al., 2000). Não existe
um candidato definitivo para o gene MHC primordial. Entretanto, baseando-se na
similaridade estrutural e funcional, é geralmente aceito que os genes MHC de classe I e II
têm uma origem comum. Os genes de classe II provavelmente evoluíram dos genes de
classe I por uma série de duplicações em tandem, seguida por divergência estrutural e
funcional (Flajnik, Canel et al., 1991).
A densidade gênica no MHC é estimada de um gene ou pseudogene a cada 16 kb,
existindo diferença na proporção entre genes expressos e pseudogenes entre as regiões.
Em relação à proporção de genes expressos e pseudogenes, tanto a região de classe I
quanto a de classe II parecem ter sido duplicadas muitas vezes, gerando novos membros de
famílias gênicas que têm divergido em novas funções. Uma explicação para manter o alto
nível de pseudogenes pode ser o envolvimento deles na geração de novos alelos por
conversão gênica, fenômeno que foi observado em outros loci do sistema imunológico
humano. Novos alelos são gerados por mutação de ponto, recombinação e eventos de
conversão gênica (Marsh, S. G. E., Parham, P., Barber L.D., 2000).
Cinco por cento do genoma humano pode ser atribuído a duplicações de segmentos
gênicos e que as duplicações em grande e pequena escala podem explicar a distribuição
das famílias de genes humanos (Bailey, Gu et al., 2002). A duplicação de seguimentos no
MHC resulta na formação de clusters de genes do sistema imune. Isto pode explicar por que
nos produtos de genes fisicamente associados, como por exemplo, HLA-DRA e HLA-DRB, a
ligação pode garantir que os componentes protéicos sejam coexpressos em quantidades
apropriadas para a formação do heterodímero. A coordenação na expressão dos genes
pode ser uma possível vantagem deste tipo de clusterização. Os genes MHC de classe I e II
são submetidos a duplicação e deleção periódicas dentro e entre as espécies,
possivelmente em resposta à demanda de taxa de mudança dos patógenos (Horton,
Wilming et al., 2004). Os genes do sistema imune, incluindo os genes do MHC, devem estar
sob forte pressão seletiva para a diversidade a fim de lidar com todas as mudanças dos
20
epítopos dos patógenos, e a duplicação seguida por diversificação fornece um dos meios de
se obter (Hedrick, P. W., 2000).
1.3. Desequilíbrio de ligação e recombinação intergênica nos loci HLA
Os alelos de diferentes loci na região HLA são frequentemente encontrados nos
cromossomos em combinações que ocorrem em frequências distintas daquelas esperadas
(baseadas na associação aleatória de alelos em loci diferentes, resultando em DL). Os
genes HLA de classe I e II apresentam significativos DL que foram observados em várias
populações do mundo (Trachtenberg, Vinson et al., 2007; Tu, Mack et al., 2007; Mack, Tu et
al., 2009). O DL é muitas vezes quase completo entre os loci fortemente ligados, enquanto
genes menos fortemente ligados (separados por uma distância física maior) mostram
valores intermediários de DL (Hedrick, P. W., 2000). Desta forma, apesar da grande
quantidade de alelos expressos em cada loci HLA, o número de haplótipos observados na
população é muito menor que o esperado teoricamente (Myers, Bottolo et al., 2005).
Em algumas regiões do MHC a concordância entre a distância física e a taxa de
recombinação é menor que o esperado, dado o padrão de 1% de recombinação por Mb de
DNA na meiose. A taxa de recombinação entre os loci HLA-A e HLA-B, por exemplo, é de
0,31% (Carrington, 1999), o que é menor que o esperado para o segmento de DNA de 1,4
Mb. Esse contraste tem sido atribuído ao DL, que pode estar associado à ocorrência de
sítios de recombinação não aleatórios (Carrington, 1999).
A diversidade haplotípica é inversamente relacionada ao DL entre os loci HLA, e a
diminuição do LD entre os loci é proporcional ao aumento da distância física e genética e, de
uma forma geral, reflete sua probabilidade gradualmente aumentada de recombinação
(Dawson, Abecasis et al., 2002). Sob neutralidade, uma mutação recém-introduzida
inicialmente seria de baixa frequência na população, mas ao mesmo tempo mostra completo
DL com o haplótipo no qual se originou. Com o passar do tempo, a freqüência deve
aumentar para ele ser detectável no restante da população, mas o DL com as variantes
ligadas diminuirá gradualmente devido à recombinação (Hedrick, P. W., 2000). Evidências
empíricas sugerem, entretanto, que esta relação entre DL e distância não é uniforme e que
o genoma humano, ao invés disso, é organizado em blocos regionais de alto DL interno,
com pouco ou nenhum DL entre os blocos. Dentro dos blocos, poucos haplótipos comuns
representam a maioria dos cromossomos até mesmo em diferentes populações, e os
eventos de recombinação são localizados entre os blocos no chamado hotspots de
recombinação (Hedrick, P. W., 2000).
21
1.4. Seleção natural nos loci HLA
Tem sido postulado que a diversidade HLA tem evoluído sob pressões seletivas em
diferentes áreas geográficas. Isto pode estar relacionado com o papel das moléculas HLA
na apresentação de agentes infecciosos prevalentes em diferentes áreas do mundo
(Solberg, Mack et al., 2008) . Os loci HLA-B e HLA-DRB1 têm, respectivamente, mais que
1029 e 556 alelos conhecidos (Robinson, Waller et al., 2003). O evidente alto polimorfismo
indica que esses genes estão sofrendo algum tipo de seleção, provavelmente seleção
balanceadora. A seleção balanceadora mantém novos alelos e alelos com baixa frequência
em frequências mais uniformemente distribuídas que o esperado sob o modelo de evolução
neutra (Bamshad e Wooding, 2003). Assim, nos loci HLA, a diversidade genética é maior
que a esperada com o espectro de frequência alélica caracterizado por um excesso de
alelos com frequência intermediária. A seleção balanceadora aumenta a diversidade dentro
da população relativa à diversidade total, já que os alelos são conservados em uma
frequência parecida se comparado com o locus neutro. Desta forma, uma região que é
caracterizada por excesso de alelos de frequência intermediária ou por uma diferenciação
entre populações menor que a esperada para aquele marcador (baixos valores de Gst) deve
estar sob seleção balanceadora (Bamshad e Wooding, 2003). Sob condições neutras, o
número esperado de alelos é muito menor do que o realmente observado nos loci HLA
(Hedrick, 1983; Hedrick e Thomson, 1983).
A seleção balanceadora envolve a vantagem de alelos raros. Dois tipos de seleção
que caracterizam a vantagem de alelos raros são a seleção dependente de frequência
negativa e a sobredominância. Na seleção dependente de frequência negativa, a adaptação
de um alelo diminui à medida que ele se torna mais comum na população. Na
sobredominância, o heterozigoto mantém uma vantagem seletiva sobre o homozigoto, e,
portanto, um alelo raro se beneficia de sua presença no heterozigoto. Existe uma correlação
positiva entre a riqueza de patógenos, especialmente relacionado aos virais e a
heterozigosidade nos loci HLA, corroborando com o modelo de seleção dirigida por
patógenos na manutenção dos altos níveis de diversidade nos loci HLA (Hedrick, P. W.,
2000).
O número de alelos varia entre as populações, possivelmente na maneira relatada
pela história demográfica e o grau de miscigenação. Populações isoladas (exemplo,
Ameríndios) usualmente têm menos alelos que populações miscigenadas. Populações
africanas comumente têm um maior número de alelos, como é também o caso de outros
genes nucleares (Meyer, Single et al., 2006).
A razão entre substituições não sinônimas (Ka) e sinônimas (Ks) indica se o gene
está sob seleção purificadora (Ka/Ks <1), seleção balanceadora (Ka/Ks >1) ou seleção
neutra (Ka/Ks ~1) (Hedrick, P. W., 2000). De acordo com a teoria neutra, a extensão do
22
polimorfismo é balanceada pelo input mutacional e pela deriva genética aleatória. Quanto
menor o tamanho efetivo da população (Ne), maior a deriva genética e menor o
polimorfismo. A diversidade nucleotídica sinônima em genes humanos não-HLA é cerca de
0,03% a 0,11% (Li e Sadler, 1991). Por outro lado, Satta (1992) analisou as sequências das
regiões codificadoras completas dos loci HLA-A, -B e -DRB1 e descobriu que a diversidade
nucleotídica sinônima é cerca de 4% na classe I e 8% no locus DRB1 (Takahata, 1993).
Este valor é 50 a 100 vezes maior que os loci não-HLA. Klein e colaboradores (1992)
concluíram que a diferença não pode ser atribuída à alta taxa de mutação nos loci HLA,
porque a taxa de substituição nucleotídica sinônima estimada de comparações
interespecíficas de genes DRB1 é tão baixa quanto a de outros genes (Satta, 1992).
As substituições de nucleotídeos entre diferentes linhagens alélicas são somente 1,5
vez maior no exon 2 que nos introns, o que eleva a 20 vezes a magnitude em comparação
com os alelos dentro de cada linhagem alélica. Esta característica pode indicar seleção no
exon 2, que codifica a PBR (Peptide Biding Region). De acordo com Takahata (Takahata e
Satta, 1998), (1) a diversidade nucleotídica tanto intra quanto interlinhagem HLA é maior nos
exons que codificam o PBR do que nos exons que codificam o não-PBR; (2) para a maioria
dos exons, a diversidade entre linhagens é muito maior do que a diversidade nucleotídica
dentro das linhagens; (3) a média de diversidade dentro e entre as linhagens é pelo menos
20 vezes maior que em outros loci não-HLA; e (4) a diversidade nucleotídica é estimada em
3,9 + 1,2% no locus HLA-A, 3,4 +1,1% no locus HLA-B e 6,0 +1,1% no locus HLA-DRB1.
A diversidade nucleotídica sinônima é muito maior nos loci HLA do que a observada
nos loci não-HLA. A maior diversidade encontrada nos exons que codificam a PBR fornece
forte evidência para a operação da seleção balanceadora na substituição nucleotídica não
sinônima na PBR. O alto nível de diversidade nucleotídica sinônima nos exons da PBR e até
mesmo em outros exons é um reflexo da ligação entre sítios sinônimos, que são
presumivelmente neutramente selecionados, e sítios não sinônimos nas PBR, que são alvos
da seleção balanceadora.
Diversas evidências apoiam a hipótese de que o polimorfismo HLA é seletivamente
mantido:
1) O grande número de alelos por si só não é suficiente para evidenciar que os
genes MHC estão sob seleção. Entretanto, diversas outras características podem reforçar
esta evidência.
2) O número de sítios polimórficos entre os alelos nos loci HLA é muito grande.
Mutações não silenciosas são observadas no sistema HLA com frequência relativamente
alta, se comparadas a mutações silenciosas, provendo evidência de que o polimorfismo tem
sido ativamente selecionado na evolução do MHC.
23
3) Poucos alelos são raros e muitos são encontrados com frequências relativamente
similares.
4) A distribuição da variação do gene é proximamente vinculada às funções exibidas
pelas regiões da molécula HLA, com a maior variabilidade sendo observada na PBR. Por
outro lado, mudanças nos sítios que interagem com moléculas invariantes ou que são
críticos para a estrutura terciária serão usualmente prejudiciais à função da molécula. A
seleção, então, eliminará mutantes e conservará tais sítios amplamente constantes, de
modo que os dados de polimorfismos podem ser interpretados à luz de diferentes pressões
seletivas operando em cada região da molécula. Sob neutralidade, a variação deve ser
distribuída aleatoriamente através das regiões genômicas.
1.4.1. Seleção Balanceadora
A sobrevida ao ataque por patógenos requer um grande investimento de muitas e
diferentes estratégias. Isto porque alguns patógenos mudam de alvo por alterar os
antígenos externos (Trowsdale e Parham, 2004). Algumas formas de seleção contribuem
para a manutenção da variação genética na população e aumentam o tempo de vida do
polimorfismo, possivelmente indefinidamente. Estas são coletivamente chamadas de
seleção balanceadora e podem resultar de diversas causas (Hedrick e Thomson, 1983;
Hedrick, P. W., 2000):
1) Vantagem do heterozigoto (sobredominância) - os heterozigotos têm maior adaptação do
que os homozigotos, porque indivíduos que carregam dois alelos nos loci HLA podem
potencialmente responder duas vezes mais peptídeos de patógenos que os homozigotos
sob a hipótese de que cada alelo é capaz de se ligar a diferentes peptídeos patogênicos. A
sobredominância aumenta a proporção de heterozigotos, a heterozigosidade esperada e o
número de alelos no locus e, desta forma, pode contribuir para explicar o polimorfismo HLA
(Hedrick e Thomson, 1983; Hedrick, P. W., 2000).
2) Seleção dependente de frequência - assumindo que os patógenos que sofrem mutação
reduzem as chances de seus peptídeos se ligarem às moléculas HLA, eles são então
favorecidos seletivamente. Mutações nos patógenos que interferem na habilidade de
ligação, como as moléculas HLA, têm maior probabilidade de serem selecionadas,
simplesmente porque a seleção favorecendo tais mudanças de peptídeos nos patógenos
está operando mais frequentemente. Isto resultará em uma diminuição do valor adaptativo
da molécula HLA freqüente. Um alelo HLA novo ou raro, por outro, lado pode ter alto valor
adaptativo, porque poucos patógenos foram expostos e portanto adaptados a eles. Desta
forma, alelos raros favorecidos aumentaram em frequência devido ao seu alto valor
24
adaptativo. Tornando-se estes alelos frequentes, os patógenos se adaptaram a eles e
diminuirão seus valores adaptativos. Um processo cíclico é então gerado, com alelos
flutuando em frequência ao longo do tempo conforme os patógenos vão se adaptando a eles
(Hedrick e Thomson, 1983; Denniston e Crow, 1990; Hedrick, P. W., 2000).
3) Seleção oscilante - este modelo assume que a intensidade de seleção muda no tempo e
no espaço. Se a frequência do patógeno muda constantemente, diferentes moléculas HLA
serão selecionadas em tempos diferentes. O polimorfismo HLA será então o resultado da
variação HLA acompanhada da variação do patógeno. Este modelo difere do modelo
dependente de frequência porque o valor adaptativo na seleção oscilante muda em função
da frequência do patógeno, enquanto que no modelo dependente de frequência os valores
adaptativos estão realmente mudando com a frequência alélica (Hedrick e Thomson, 1983;
Hedrick, P. W., 2000).
1.5. Variabilidade HLA dentro e entre as populações humanas
O nível de diversidade genética HLA atualmente observado dentro e entre as
populações humanas é o resultado de um complexo mecanismo evolutivo que aconteceu
durante a longa história do Homo sapiens. Nesse mecanismo, seleção natural, deriva
genética, fluxo gênico, isolamentos por distância e expansões demográficas atuaram em
paralelo com a diferenciação cultural no passado da espécie (Hedrick, P. W., 2000; Meyer,
Single et al., 2006).
Os resultados da análise da diversidade genética HLA na população humana
mundial, feita dentro das populações, entre as populações dentro dos continentes e entre
continentes, indicam que os loci HLA A, B e DRB1 exibem uma maior quantidade de
diversidade entre indivíduos da mesma população que o observado pelo polimorfismo
neutro (diversidade média de 90,3% comparada com 84,4%-87,6% para os marcadores
neutros). Além dos resultados da análise de variância, testes de seleção neutra indicam que
os loci HLA-B e HLA-DRB1 são os mais afetados pela seleção balanceada. Este padrão
mostra que as variações nos loci HLA devem ser interpretadas com base tanto na
demografia como nos fatores seletivos (Meyer, Single et al., 2006; Sanchez-Mazas, 2007).
Rosenberg et al, 2002 (Rosenberg, Pritchard et al., 2002) analisaram a diversidade
do genoma humano com 377 loci autossômicos de microssatélites em amostras de 52
populações do HGDP-CEPH (Genome Diversity Panel- Centre d’Etude du Polymorphisme
Humain). No estudo, relatou-se que a população humana mundial encontra-se estruturada
em cinco regiões geográficas: América, África Subsaariana, Ásia oriental, Oceania e um
agrupamento na Europa, Oriente Médio e Ásia central. Também foi observado que o
25
componente intrapopulacional contribui para 93-95% e que a porção da variação observada
no âmbito interpopulacional foi de 3,6% do total da variância genética.
O polimorfismo dos loci HLA tem sido analisado em populações humanas com o
objetivo de investigar a relação genética e reconstruir eventos de migração ocorridos no
passado (Imanishi, 1992). A aplicação dos dados de HLA em estudos antropológicos é
atrativa porque se trata de loci altamente polimórficos necessários para a comparação de
populações (Sanchez-Mazas, 2001).
1.6. Origem e formação da população de Minas Gerais
A população mineira é miscigenada e representada por indivíduos de diversos
grupos populacionais, incluindo caucasianos imigrantes de vários países da Europa (Itália,
Espanha, Alemanha e principalmente de Portugal) (Tabela 5), população africana (Tabela 6)
e população de nativos americanos. A migração forçada de africanos para o continente
Americano ocorreu do século XV ao século XIX. Os africanos que foram trazidos para o
Brasil como escravos se originaram principalmente de duas regiões geográficas: (1) Centro-
oeste/Sudeste Africano (Angola, Moçambique e Congo) e (2) Oeste Africano, cobrindo todas
as regiões ao norte do Golfo da Guiné (Klein, 2002). A maioria dos escravos de Minas
Gerais veio de Angola. Entretanto, as consideráveis migrações de escravos ocorridas entre
os estados, no século XIX, homogenizaram sua distribuição. Entre os anos de 1500 e 1972,
58% dos imigrantes que chegaram ao Brasil foram europeus, 40% foram africanos e 2%
foram asiáticos de acordo como o Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (I.B.G.E,
2000).
Tabela 5: Imigração no Brasil, por nacionalidade, de 1500 a 1933.
Nacionalidade
Efetivos decenais**
1500-1808* 1884-1893 1894-1903 1904-1913 1914-1923 1924-1933
Portugal 465.000 Alemães 22778 6698 33859 29339 61723
Espanhóis 113116 102142 224672 94779 52405
Italianos 510533 537784 196521 86320 70177
Japoneses - - 11868 20398 110191
Portugueses 170621 155542 384672 201252 233650
Sírios e turcos 96 7124 45803 20400 20400
Outros 66524 42820 109222 51493 164586
Total 883668 852110 1006617 503981 717223
Fonte: Adaptado de: *(Pena, S. D. J., Carvalho-Silva, D. R. , Alves-Silva, J , Prado, V. F. , Santos, F. R. , 2000) e **(I.B.G.E, 2000).
26
Tabela 6: Escravos africanos no Brasil de acordo com o período.
PERÍODO NÚMERO
1551-1700 580.000
1701-1810 1.891.000
1810-1857 1.145.000
TOTAL 3.616.000
Fonte: (Pena, S. D. J., Carvalho-Silva, D. R. , Alves-Silva, J , Prado, V. F. , Santos, F. R. , 2000).
Os primeiros bandeirantes chegaram a Minas Gerais em 1596, mas a colonização
efetiva do Estado somente se deu com a descoberta do ouro, em 1693, e sua exploração
sistemática a partir do início do século XVIII (I.B.G.E, 2000). Assim começou o ciclo do ouro.
Entretanto, a história de Minas Gerais antecede a chegada dos bandeirantes paulistas e
colonizadores europeus o que se comprova pela existência de centenas de sítios
arqueológicos (Campos, 2005). Estudos mais recentes demonstram que o atual território
mineiro foi habitado por mais de cem tribos diferentes de índios. Quatro grupos indígenas
que se localizam em Minas pelo menos desde o período colonial ainda vivem no território
mineiro: Maxakalí, Krenak, Aranã e Xacriabá. Atualmente, restam, além dos quatro grupos
citados acima, apenas alguns povos indígenas entre os quais estão: os Pataxós, os Xucuru-
Kariri, os Pankararu e os Kaxixó (Campos, 2005).
A colonização da Minas Colonial tem sua raiz na busca pelo ouro, prata e pedras
preciosas. Informações sobre as riquezas minerais levaram à organização de bandeiras
paulistas, que iniciaram a exploração do território no final do século XVII. Os primeiros
portugueses chegaram a Minas Gerais ainda no século XVII. A partir de 1710, os
portugueses passaram a monopolizar as minas de ouro, o que atraiu pessoas de todo o
território luso-brasileiro e, principalmente, de Portugal. Os escravos vieram em sua maioria
de Angola, embora pertencessem a diversas etnias. Nesse período, MG tornou-se a região
brasileira com o maior número de escravos, que passaram a compor a maioria da população
mineira no século XVIII (Martins, 1980). Além dos bandeirantes paulistas, também houve
uma corrida de outros brasileiros para a região. Estes eram resultado do processo de
miscigenação ocorrido nos 200 anos anteriores de colonização. Os bandeirantes paulistas,
por exemplo, eram mamelucos, filhos de euro-descendentes e ameríndios. Veio também
grande número de pessoas da Bahia e do Rio de Janeiro. Estes indivíduos, juntamente com
os portugueses, ficaram conhecidos como emboabas, inimigos dos bandeirantes. Os
conflitos entre os dois grupos foram constantes durante todo o período minerador (Souza,
1994).
27
A partir da metade do século XVIII, o ciclo do ouro atingiu seu auge e, assim, sua
posterior decadência. Apesar de ter ocorrido uma emigração do estado, as atividades da
mineração foram substituídas pela agricultura e pecuária, e parte da população se manteve
no estado dispersando-se pelo interior (Prado, 1999).
Em 1873, mesmo após o fim do tráfico negreiro, a população escrava no estado era
de 380.000. Os imigrantes também contribuíram para a formação da identidade mineira. No
final do século XIX e início do XX, chegaram a Minas Gerais grandes quantidades de
estrangeiros com destaque para imigrantes italianos, destinados principalmente ao trabalho
nas lavouras cafeeiras; os espanhóis; os sírio-libaneses, dedicados ao comércio; e os
alemães (Tabela 5). Atualmente, a maior parte da população mineira é descendente de
colonos portugueses e de escravos africanos que chegaram nos séculos XVIII e XIX. Além
desses, contribuíram para a diversidade da população mineira índios, bandeirantes
paulistas, italianos, espanhóis, alemães e sírio-libaneses. Assim, a formação da população
de Minas Gerais pode ser resumida em três aspectos: imigração de portugueses, brasileiros
e escravos devido ao ciclo do ouro; posterior sustentação do povoamento pela substituição
da mineração pela agricultura e pecuária; imigração europeia nos séculos XIX e XX
(Campos, 2005).
De acordo com a Pesquisa Nacional por Amostra de Domicílios realizada pelo
Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE) em 2005, a população mineira,
estimada em aproximadamente 19,3 milhões de habitantes – naquele ano –, se distribuía da
seguinte forma: 46% de brancos, 46,3% de pardos (cafuzo, mameluco, mulato ou mestiço),
e 7,5% de negros e 0,2% amarelos e indígenas. Em relação à região metropolitana de Belo
Horizonte, a distribuição da população segundo autodeclaração de cor de cada indivíduo foi
da seguinte forma: 40,4% de brancos, 50,5% de pardos, 8,9% de negros e 0,2% de
amarelos/indígenas (I.B.G.E, 2000)
28
2. RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA
O sistema HLA é altamente informativo em estudos de genética de população e
demografia humana devido ao seu elevado polimorfismo e DL. Estas propriedades permitem
que o sistema HLA seja utilizado como um instrumento de investigação antropológica e
demográfica (bottlenecks e efeito fundador) para caracterizar a composição genética das
diferentes populações, uma vez que a frequência dos alelos HLA e o padrão de haplótipos são
característicos de cada população. Além disso, as diferenças nas frequências alélicas e
haplotípicas entre populações têm sido utilizadas para entender melhor as associações entre
os alelos HLA e algumas doenças infecciosas e autoimunes.
No contexto clínico, o conhecimento da distribuição da frequência alélica em várias
populações é crítico para delinear estratégias de pesquisa em bancos de doadores de medula
óssea, tais como determinação de potenciais compatibilidades de pacientes com o registro de
doadores. Além do que, esses estudos fornecem background essencial para determinar o
desenvolvimento do tamanho ótimo do registro de doadores.
O Registro Brasileiro de Doadores Voluntários de Medula Óssea (REDOME/INCA) tem a
missão de desenvolver, manter e coordenar a reposição de tipificações HLA de doadores para
promover o transplante de células tronco hematopoiéticas entre indivíduos não relacionados.
Para este fim, tem sido feito um pool de doadores de diversos milhões de indivíduos para os
quais a tipificação HLA tem sido realizada. O conhecimento dos parâmetros genéticos
populacionais dos loci HLA assume papel relevante no contexto do transplante de medula
óssea quando se trata de encontrar um doador não relacionado para pacientes que não
encontram um doador compatível em seu núcleo familiar. Para este paciente é efetuada uma
busca de doador no REDOME. Uma classificação dos alelos e haplótipos mais frequentes por
etnia pode diminuir o tempo de procura de um doador ideal, pois a busca inicial poderá ser
efetuada dentro do próprio grupo populacional do paciente, onde há, teoricamente, maiores
chances de se encontrar um doador compatível (Pedron, Duval et al., 2003). Além disso, o
conhecimento destes parâmetros permitirá estimar as reais chances de um paciente, em lista
de espera por transplante, encontrar um doador não relacionado com HLA idêntico.
Ainda no contexto clínico, os estudos envolvendo as moléculas HLA são importantes no
desenvolvimento de vacinas no sentido de melhorar a especificidade da ligação HLA-epítopos
antigênicos. Os alelos HLA-B7, B44, B58 e B62 desempenham um papel na modulação da
resposta imune ao sarampo. Esta informação pode ter um grande valor na construção de
vacina baseadas em epítopos (Ovsyannikova, Jacobson et al., 2007).
29
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo geral
Caracterizar geneticamente a população do Estado de Minas Gerais quanto ao
polimorfismo dos loci HLA-A, -B e -DRB1 e inferir a estrutura genética da população com base
no polimorfismo destes loci .
3.2. Objetivos específicos
1) Estimar os parâmetros de diversidade genética dos grupos estudados.
2) Verificar se os loci HLA-A, -B e -DRB1 estão em equilíbrio de Hardy-Weinberg (HW).
3) Estimar o DL entre os pares de loci HLA-A:HLA:B, HLA-A:HLA:DRB1 e HLA-
B:HLA:DRB1 e entre os haplótipos HLA-A:HLA-B.
4) Inferir a atuação da seleção natural nos loci HLA.
5) Estimar a taxa de recombinação homóloga entre os loci HLA-A e HLA-B.
6) Verificar a diferenciação genética entre os grupos previamente definidos com base
na autodeclaração de cor de cada indivíduo.
7) Avaliar as relações filogenéticas entre os grupos do presente estudo e outras
populações brasileiras e mundiais.
30
4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1. População
O estudo foi realizado com base na análise do banco de dados Nefrodata, gerado a
partir de resultados de tipificação HLA disponibilizados pelo Laboratório IMUNOLABTx (Belo
Horizonte, MG). O laboratório possui um setor de tipificação HLA que realiza um grande
número de exames para a seleção do par doador-receptor com o maior grau de
compatibilidade HLA para transplante de órgãos e tecidos. A amostra foi constituída com base
em duas amostras distintas: (1) indivíduos de 917 famílias que buscavam um doador HLA
compatível para o transplante de células tronco hematopoiética para um membro da família
que possuía doença hematológica e (2) 2868 indivíduos doadores voluntários de medula
óssea, saudáveis, não relacionados e aleatoriamente alocados para esta pesquisa. Para
ambas os indivíduos eram cadastrados no banco de dados Nefrodata do IMUNOLABTx,
juntamente com a respectiva tipificação dos loci HLA-A, -B e -DRB1. Os indivíduos não
relacionados foram assim categorizados: brancos (n=1889), negros (n=327) e pardos (n=652).
Um pequeno grupo de 24 indivíduos se autodeclararam indígenas. As freqüências alélicas dos
loci HLA-A, -B e -DRB1 deste grupo foi utilizada na análise filogenética.
As informações referentes à autodeclaração de cor foram obtidas de todos os 2868
indivíduos não relacionados, de acordo com a classificação adotada pelo IBGE.
4.2. Critérios de inclusão
Foram admitidas no estudo as famílias residentes em Minas Gerais cujos haplótipos
maternos e paternos foram determinados com base nos genótipos da prole.
No grupo de 2868 indivíduos não relacionados, foram admitidos no estudo os
indivíduos saudáveis, de ambos os sexos, residentes em Minas Gerais e que foram ao
laboratório IMUNOLABTx para realizar tipificações dos loci HLA-A, -B e -DRB1 no período
de janeiro de 2005 a junho de 2008.
4.3. Critérios de exclusão
No grupo das famílias, foram excluídas deste estudo aquelas cujos haplótipos não
puderam ser definidos pela análise de segregação dos alelos HLA-A e -B observando-se os
genótipos da prole.
Dos 2868 indivíduos não relacionados, foram excluídos do estudo aqueles que
possuíam grau de parentesco com outros indivíduos deste grupo.
Foram excluídos do estudo todos os indivíduos que não eram residentes no Estado
de Minas Gerais.
31
4.4. Aspectos éticos
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Santa Casa de
Misericórdia de Belo Horizonte sob o número 073/2007 em 31 de janeiro de 2008 (Anexo 7),
e também pelo COEP-UFMG (Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de
Minas Geras) em 11 de março de 2009, sob o parecer número 675/08 (Anexo 8).
4.5. Coleta de amostras e extração do DNA
Para a tipificação dos loci HLA, o sangue de cada indivíduo foi coletado a vácuo em
tubos Vacuntainer (BD, Brasil) contendo o anticoagulante EDTA (ácido
etilenodiaminotetracético). O DNA genômico foi extraído dos leucócitos do sangue periférico
a partir de 0,5 ml de sangue total pelo método de Salting-out. Após a extração, o DNA foi
submetido à análise de pureza e acertado para a concentração de 20ng/µl com a razão
A260/A280 de 1,65 -1,80.
4.6. Tipificação dos loci HLA
As regiões polimórficas dos genes HLA de classe I e II foram amplificadas a partir do
DNA genômico por meio da PCR (Polymerase Chain Reaction), usando primers que anelam
em 5’ e 3’ das regiões flanqueadoras que são conservadas entre os indivíduos.
Os alelos HLA foram tipificados pelo método PCR-SSOP (PCR - Sequence-Specific
Oligonucleotide Probe) que se trata de hibridização em fase sólida do produto amplificado
com sondas de alelos HLA. A tipificação HLA pela ténica PCR-SSOP se baseia na detecção
simultânea de múltipos polimorfismos HLA. Este método não envolve o sequenciamento de
genes HLA, mas ao invés disso, baseia-se na genotipagem de diversas regiões polimórficas
dentro dos genes HLA. Cada variante dentro de uma região polimórfica é definida pela
combinação de nucleotídeos e é referida como uma sequência motivo. A combinação de
sequências motivos presentes é usada para determinar o par de alelos de um indivíduo.
Todos os procedimentos foram feitos baseado no protocolo recomendado pelo
fabricante e constituiu-se primeiramente em uma etapa de amplificação da região do gene
de interesse, sendo o produto desta amplificação biotinilado (Figura 8-1). Para a tipificação
HLA de classe I (loci HLA-A e -B) foram amplificados os fragmentos gênicos contendo os
exons 2 e 3 usando primers locus específicos. Para a tipificação HLA de classe II (locus
HLA-DRB1) somente o fragmento contendo o exon 2 foi amplificado.
Os kits comerciais utilizados para a tipificação HLA-A, -B e -DRB1 foram,
respectivamente RSSO1A, RSSO1B e RSSO2B1 (One Lambda, CA-USA). Os primers
foram adquiridos comercialmente da empresa fabricante, juntamente com os kits.
32
Para a realização da reação de amplificação foi utilizada a Taq DNA polimerase
Cenbiotic (Ludwig Biotec -RS- Brazil); os demais reagentes da mistura de reação (dNTPs,
tampão da enzima, cofatores da enzima) estavam presentes no kit para tipificação HLA. A
realização da amplificação do segmento específico foi realizada no termociclador Applied
Biosystems 9700, e as condições de amplificação são mostradas na tabela 7. Após a
amplificação, o produto de PCR foi aplicado em gel de agarose 2,5% e corado com brometo
de etídeo, com a finalidade de verificar o padrão da amplificação.
O produto de PCR marcado foi então desnaturado e mantido na forma de fita simples
por meio do uso de tampões (Figura 8-2). O produto de PCR em fita simples foi re-
hibridizado com oligonucleotídeos-sonda sequência-específicos dos alelos HLA-A, -B e -
DRB1. Estas sondas estavam conjugadas na superfície de microesferas codificadas por
cores (Figura 8-3). Após a re-hibridização, foi feita a marcação com Estreptavidina
conjugada com Ficoeritrina (SAPE) (Figura 8-4). As reações de fluorescência foram lidas no
citômetro de fluxo LABScan 100™, o qual emprega a tecnologia conhecida como Luminex,
em que um laser na cor vermelha, com comprimento de onda de 633nm, reconhece a cor da
microesfera e outro laser na cor verde, com comprimento de onda de 532nm, reconhece se
esta microesfera está ou não marcada com SAPE, o que determina sua positividade e os
traduz, em tempo-real, em quantidade de dados para cada reação. As análises das
tipificações foram realizadas com o pelo do software HLA Fusion versão 3.0 (One Lambda,
CA-USA), que fez a determinação dos genótipos.
Tabela 7: Condições de amplificação da PCR SSOP para tipificação HLA-A, -B, -DRB1.
Etapas Temperatura e tempo
Número de cliclos de incubação
1 96ºC 03:00 1
2
96ºC 00:20
5 60ºC 00:20
72ºC 00:20
3
96ºC 00:10
30 60ºC 00:15
72ºC 00:20
4 72ºC 10:00 1
5 4ºC ∞ 1
Fonte: Bula do Kit fornecida pelo fabricante.
33
Figura 8: Princípios da técnica PCR-SSOP para tipificação HLA. Fonte: Website www.onelambda.com. da empresa fabricante do kits para tipificação HLA.
4.7. Análise estatística
4.7.1. Diversidade e Heterozigosidade
A diversidade genética em cada locus HLA foi caracterizada a partir dos seguintes
parâmetros: (a) riqueza de alelos ou número de alelos por locus (b) a riqueza de haplótipos
e (c) a heterozigosidade esperada (Hesp), definida como a probabilidade de que dois alelos
escolhidos aleatoriamente sejam diferentes na amostra (Hesp = 1-∑pi2
).
4.7.2. Equilíbrio de Hardy-Weinberg (HW)
Para avaliar a significância do desvio do equilíbrio de HW, foi utilizado o
procedimento, análogo ao teste exato de Fisher, descrito por Guo e Thompson (Guo e
Thompson, 1992), adotando-se como limite de significância p=0,05. Para isto, foi usado o
programa Pypop (Python for Population Genetics) versão 0.7.0 (Lancaster, Nelson et al.,
2003). O número total de passos na Cadeia Monte-Carlo Markov foi 1.000.000.
34
4.7.3. Freqüências haplotípicas
Na amostra das famílias, os haplótipos HLA-A:HLA-B foram obtidos por contagem
direta através da análise da segregação dos alelos HLA-A e -B nos membros das famílias.
4.7.4. Desequilíbrio de Ligação (DL)
O teste exato para o DL foi feito para detectar a presença de associação entre os
pares de loci HLA ou entre haplótipos específicos. O LD global, somando as contribuições
(D´ij = Dij / Dmax) de todos os haplótipos em um sistema multialélico de dois loci, pode ser
medido utilizando a estatística D´ (Hedrick, 1987), ponderada pelos produtos das
freqüências alélicas dos loci, pi e qj:
O DL foi computado e a H0 (hipótese nula) de equilíbrio de ligação foi testada entre
todos os pares de loci (HLA-A:HLA-B, HLA-B:HLA-DRB1 e HLA-A:HLA-DRB1). Valores de
D´ij = 0 indicam segregação independente; por outro lado, valores de D´ij = +1 indicam
completa associação entre alelos de loci diferentes.
4.7.5. Teste de neutralidade de Ewens-Watterson
Desvios da neutralidade foram avaliados para cada locus pelo teste de Ewens-
Watterson (EW) (Watterson, 1977; 1978). Através da análise de modelos populacionais em
que a seleção opera, Watterson (1977) demonstra que a homozigosidade populacional
constitui um teste estatístico poderoso para verificar afastamentos da neutralidade, tanto em
direção à vantagem quanto à desvantagem do heterozigoto. Neste sentido, o autor propõe a
utilização da estatística que ele denomina homozigosidade observada (Fobs, definida como a
soma do quadrado das freqüências alélicas) e a compara com a Fexp, a homozigosidade
esperada sob a evolução neutra, para uma amostra de tamanho 2n e número de alelos k,
obtida por meio de simulação.
A diferença entre Fobs e Fexp é descrita pelo desvio da homozigosidade normalizado
(Fnd) que é a diferença entre a homozigosidade observada e a homozigosidade esperada,
dividida pela raiz quadrada da variância da homozigosidade esperada. Desvios
normalizados significativamente negativos resultam de valores mais baixos de
homozigosidade observada que homozigosidade esperada (Fobs << Fexp) e indicam seleção
35
balanceadora. O valor de p é a probabilidade de obter a homozigosidade estimada pela
estatística-F sob a evolução neutra. O teste foi executado usando-se o programa Pypop.
4.7.6. Estrutura genética
Para avaliar o grau de diferenciação na distribuição da freqüência alélica HLA em
cada locus entre os grupos previamente definidos, foi adotada a estatística G’ST, segundo o
método proposto por Hedrick (Hedrick, 2005) usando o programa SMOGD (Software for the
Measurement of Genetic Diversity) versão 1.2.5 (Crawford, 2009). O G’ST é um análogo ao
FST adaptado para alelos múltiplos e que pode variar entre 0 e 1. O programa SMOGD
calcula os seguintes índices de diversidade: GST est (Nei e Roychoudhury, 1972), G’ST
(Hedrick, 2005) e Dest (Jost (Jost, 2008). Ele também gera re-amostragens bootstrap dos
dados e utiliza estas re-amostragens para estimar o erro padrão (SE), variância e o intervalo
de confiança (IC) de 95%.
GST = HT - HS HT
GST (max) = 1 - HS
1 + HS
G’ST = GST___ GST (max)
4.7.7. Análise filogenética
A análise filogenética foi feita pelo pacote de programas Phylip (Felsenstein, 2004),
versão 3.69. Primeiramente, uma matriz de distância genética baseada nas diferenças das
distribuições das freqüências alélicas HLA-A, -B e -DRB1 foi construída utilizando-se o
método de distância genética proposto por Nei (Nei e Roychoudhury, 1972) por meio do
programa Gendist (Phylip). Posteriormente, uma árvore filogenética foi desenhada a partir
da matriz de distância gerada pelo Gendist utilizando-se o algoritmo Neighbor-Joining
proposto por Saitou e Nei (Saitou e Nei, 1987). O desenho final da árvore foi feito pelo
programa TreeView (Page, 1996). Os dados utilizados para esta análise consistiram de
freqüências alélicas dos loci HLA-A, -B e -DRB1 das seguintes populações: Itália
(n=159311), Espanha (n=407), Portugal (n=562), brancos do Paraná (PR) (n=2775), cafusos
do PR (n=319), mulatos do PR (n=186), pardos de São Paulo (SP) (n=239), mestiços de
Onde:
HT = Heterozigosidade total dos grupos
HS = Heterozigosidade dentro dos grupos
G’ST = Medida padronizada da diferenciação genética
36
Teresina-Piauí (PI) (n=97), Guiné-Bissau (n=65), Zimbábue (n=230), negros do PR (n=77),
indígenas da tribo Terena do Mato Grosso do Sul (MS) (n=60) e os grupos previamente
descritos neste estudo. As freqüências HLA das populações citadas acima foram obtidas do
banco de dados de freqüências HLA: New Allele Frequency Database:
http://www.allelefrequencies.net.
37
5. RESULTADOS
5.1. Análise das famílias
5.1.1. Aspectos gerais
Após encontrar um possível doador com base na compatibilidade HLA-A e -B, a
busca por doador na família pode continuar para 44.7% dos receptores, com base nos
outros loci HLA. Dentre os doadores compatíveis, 95.56% eram irmãos, 2.97% eram
progenitores e 1.47% tinham outros tipos de parentesco com os receptores. Cinco dos 18
doadores potenciais, que não eram irmãos, pertenciam a famílias cujos progenitores eram
primos e compartilhavam um haplótipo.
5.1.2. Frequências alélicas
O número de alelos observados nos loci HLA-A e -B foi 20 e 38, respectivamente
(Tabela 8). Para o locus HLA-A, A2 (0,2394), A3 (0,0913), A1 (0,0900) e A24 (0,0862) foram
os alelos mais frequentes. Para o locus HLA-B, B44 (0,1198), B35 (0,1077), B15 (0,0818) e
B51 (0,0796) foram os alelos mais frequentes. Não se observaram desvios das frequências
genotípicas de Hardy-Weinberg em ambos os loci (p> 0,05) (Tabela 9), com alta
heterozigosidade tanto no locus HLA-A quanto no HLA-B (91,7% e 94,3%), respectivamente.
O teste exato, descrito por Guo and Thompson (1992), foi feito para os haplótipos, e não
foram observados desvios das proporções de Hardy Weinberg (p = 0,70928).
5.1.3. Frequências haplotípicas
De um total de 450 diferentes haplótipos HLA-A:HLA-B observados, 194 (43,1%)
tinham mais de cinco cópias (Tabela 10). Os cinco haplótipos HLA-A:HLA:B mais comuns,
cujas frequências excedem 2% foram A2:B44 (0,037350), A2:B51 (0,032443), A1:B8
(0,029989), A29:B44 (0,022901) e A3:B7 (0,020447). Os 47 haplótipos HLA-A:HLA-B com
20 ou mais cópias correspondem a 50,4% do gene pool. Eventos de recombinação
resultaram em dois novos haplótipos: A25:B38 and A31:B72.
Os 403 haplótipos menos frequentes (<20 copies) responderam por 49,6% do total
de haplótipos. Destes, 137 haplótipos foram representados por apenas uma cópia.
38
Tabela 8: Frequências alélicas dos loci HLA-A e HLA-B.
Entre parêntese, estão as especificidades amplas do locus HLA-B.
Tabela 9: Heterozigosidade nos loci HLA-A e HLA-B.
Locus Número de
genótipos
Heterozigosidade
observada
Heterozigosidade
esperada
Valor de
p
HLA-A 1834 0,91167 0,89630 0,47330
HLA-B 1834 0,94929 0,94412 0,48330
5.1.4. Desequilíbrio de ligação (DL)
Observou-se DL entre os loci HLA-A e -B (p<0,003). A intensidade de associação
(D`) foi significativa para 92 (47,4%) dos 194 haplótipos que tinham cinco ou mais cópias
(Tabela 10). Os alelos B44, B35, B51, B7 e B8 foram os mais frequentes no locus HLA-B e
apresentaram um forte DL com os alelos mais frequentes A2, A3 e A1 do locus HLA-A. O
DL mais intenso foi o observado no haplótipo A2:B48 (D´=0,7371, p<0,0000). De fato, doze
das quinze cópias do alelo B48 estavam associadas com A2. O haplótipo com a menor
intensidade de associação negativa foi o A30:B44 (D´=-0,7930, p<0,0000) (Tabela 10).
Alelos HLA-A
Frequência Número de cópias
Alelos HLA-B
Frequência Número de cópias
Alelos HLA-B
Frequência Número de cópias
2 0,2394 877 44 0,1198 439 61 (40) 0,0166 61
3 0,0913 335 35 0,1077 395 38 0,0164 60
1 0,0900 330 51 0,0796 292 71 (15) 0,0150 55
24 0,0862 316 7 0,0763 280 63 (15) 0,0134 49
30 0,0657 241 8 0,0559 205 41 0,0120 44
23 0,0649 238 65 (14) 0,0540 198 64 (14) 0,0109 40
68 0,0641 235 18 0,0466 171 13 0,0106 39
11 0,0523 192 58 0,0316 116 37 0,0087 32
29 0,0466 171 49 0,0297 109 55 0,0071 26
33 0,0420 154 53 0,0292 107 81 0,0041 15
31 0,0327 120 62 (15) 0,0286 105 48 0,0041 15
32 0,0297 109 50 0,0275 101 47 0,0030 11
26 0,0262 96 57 0,0273 100 56 0,0030 11
74 0,0188 69 42 0,0259 95 73 0,0019 7
66 0,0158 58 39 0,0248 91 75 (15) 0,0014 5
34 0,0115 42 45 0,0240 88 82 0,0011 4
25 0,0115 42 72 (15) 0,0234 86 54 0,0003 1
36 0,0079 29 60 (40) 0,0236 87 78 0,0003 1
80 0,0025 9 27 0,0174 64
69 0,0011 4 52 0,0172 63
39
5.1.5. Taxa de recombinação entre os loci HLA-A e HLA-B
O número de meioses informativas foi cerca de 6860 e foram observados 31 eventos
de recombinação entre HLA-A e HLA-B, correspondendo a 0,45%. Em 16 dos 31 casos de
recombinação, os genitores foram genotipados, tornando possível verificar se a
recombinação ocorreu no cromossomo paterno ou materno. Em 56,25% (9/16) dos casos, o
cromossomo recombinante veio da mãe, uma proporção que permitiu aceitar a hipótese nula
de taxas semelhantes de recombinação em cromossomos paternos e maternos (χ2 = 0,617,
valor de p=0,432).
Em oito (25,8%) casos de doadores HLA-compatíveis, o evento de recombinação
reduziu de quatro para três as compatibilidades entre receptor e doador. Em oito (25,8%)
casos os eventos de recombinação facilitaram a procura de doador, por que o número de
compatibilidades doador-receptor aumentou de 2 para 3.
5.2. Análise da amostra de indivíduos não aparentados
5.2.1. Diversidade e Heterozigosidade
O número de alelos e a heterozigosidade observados por loci HLA está mostrado na
Tabela 11. A heterozigosidade observada não teve diferença estatisticamente significativa
da heterozigosidade esperada, conforme o resultado do teste de HW (Tabela 11). A
frequência alélica dos loci HLA-A, -B e -DRB1 observada em todos os grupos está mostrada
na Tabela 12. Os alelos mais freqüentes no locus HLA-A foram HLA-A2, seguido de A24,
A1, A3 nos nos brancos, A23, A68, A3 nos negros e A3, A30, A1 nos pardos. O alelo HLA-
A43 foi pouco freqüente e observado somente no grupo branco. No locus HLA-B, os dois
alelos mais freqüentes em todos os grupos foram o B44 e o B35, seguidos de B51, B7, B8
nos brancos, B7, B51, B53 nos negros e B7, B51 e B8 nos pardos. O alelo HLA-B47 foi
observado nos brancos e pardos, o B67 somente nos brancos e o B78 somente nos pardos.
No locus HLA-DRB1, os cinco alelos mais frequentemente observados foram DRB1 3, DRB1
4, DRB1 7, DRB1 11, DRB1 13 e DRB1 15. No locus HLA-DRB1 não foram observados
alelos exclusivos de um grupo.
40
Tabela 10: Frequências de haplótipos HLA-A:HLA-B, estimativas de desequilíbrio de ligação
(D’) e sua significância.
Haplótipo AB
Frequência relativa
Número de cópias
D´ij Valor de p*
Haplótipo AB e
Frequência relativa
Número de
cópias
D´ij Valor de p*
2 44 0,037350 137 0,0919 0,0002 1 38 0,002726 10 0,0843 0,0363
2 51 0,032443 119 0,2211 0,0000 31 62 0,002726 10 0,0675 0,0002
1 8 0,029989 110 0,4908 0,0000 2 63 0,002454 9 -0,2327 0,3577
29 44 0,022901 84 0,4246 0,0000 2 41 0,002454 9 -0,1455 0,5860
3 7 0,020447 75 0,1943 0,0000 29 35 0,002454 9 -0,5084 0,0184
2 35 0,019629 72 -0,2385 0,0049 23 41 0,002454 9 0,1494 0,0002
33 65 0,017448 64 0,3844 0,0000 34 8 0,002454 9 0,1678 0,0000
3 35 0,017176 63 0,0901 0,0000 30 72 0,002454 9 0,0474 0,1007
24 35 0,016085 59 0,0886 0,0000 68 60 0,002454 9 0,0581 0,0505
30 42 0,014995 55 0,5495 0,0000 3 27 0,002454 9 0,0542 0,1673
2 7 0,014995 55 -0,1794 0,0798 24 57 0,002454 9 0,0042 0,8894
2 18 0,013359 49 0,0620 0,1386 30 45 0,002454 9 0,0394 0,1572
2 50 0,013359 49 0,3231 0,0000 33 7 0,002454 9 -0,2344 0,3929
11 35 0,012541 46 0,1478 0,0000 68 49 0,002454 9 0,0198 0,4232
23 44 0,011996 44 0,0729 0,0017 31 52 0,002454 9 0,1139 0,0000
2 62 0,009542 35 0,1364 0,0127 11 8 0,002181 8 -0,2545 0,3782
2 39 0,008997 33 0,1621 0,0053 2 42 0,002181 8 -0,6482 0,0003
2 60 0,008724 32 0,2389 0,0002 24 38 0,002181 8 0,0516 0,1891
23 7 0,008451 31 0,0584 0,0012 30 8 0,002181 8 -0,4036 0,1156
1 57 0,008179 30 0,2308 0,0000 36 53 0,002181 8 0,2541 0,0000
30 18 0,007906 29 0,1115 0,0000 23 42 0,002181 8 0,0207 0,4385
2 65 0,007634 28 -0,3711 0,0036 31 60 0,002181 8 0,0750 0,0003
2 58 0,007361 27 -0,0276 0,8654 32 27 0,002181 8 0,0982 0,0000
2 53 0,007361 27 0,0171 0,7497 32 51 0,002181 8 -0,0780 0,8078
26 38 0,007088 26 0,4184 0,0000 23 50 0,002181 8 0,0153 0,5535
24 44 0,006816 25 -0,3449 0,0174 11 52 0,001908 7 0,0620 0,0346
31 35 0,006543 24 0,1035 0,0009 26 44 0,001908 7 -0,3834 0,1628
68 44 0,006543 24 -0,1544 0,3646 74 7 0,001908 7 0,0272 0,4277
3 65 0,006270 23 0,0356 0,1163 32 61 0,001908 7 0,0876 0,0001
24 62 0,005998 22 0,1417 0,0000 68 45 0,001908 7 0,0165 0,5484
23 49 0,005998 22 0,1465 0,0000 3 57 0,001908 7 -0,2336 0,4528
74 72 0,005998 22 0,3033 0,0000 2 57 0,001908 7 -0,7076 0,0001
11 51 0,005725 21 0,0323 0,1175 68 57 0,001908 7 0,0063 0,8060
24 7 0,005725 21 -0,1294 0,4890 29 45 0,001908 7 0,0348 0,1338
3 44 0,005725 21 -0,4810 0,0006 23 65 0,001908 7 -0,4200 0,1215
25 18 0,005725 21 0,4756 0,0000 68 58 0,001908 7 -0,0581 0,8678
2 45 0,005725 21 -0,0031 0,9870 2 71 0,001908 7 -0,4683 0,0496
31 39 0,005725 21 0,2048 0,0000 30 57 0,001908 7 0,0049 0,8514
2 27 0,005725 21 0,1167 0,0932 32 60 0,001908 7 0,0643 0,0012
24 18 0,005453 20 0,0337 0,1414 1 62 0,001908 7 -0,2372 0,4449
2 8 0,005453 20 -0,5924 0,0000 26 35 0,001908 7 -0,3085 0,2925
68 35 0,005453 20 -0,2097 0,2484 74 53 0,001908 7 0,0744 0,0003
1 44 0,005453 20 -0,4982 0,0004 68 65 0,001908 7 -0,4126 0,1308
24 51 0,005453 20 -0,2050 0,2623 23 53 0,001908 7 0,0006 0,9818
23 45 0,005453 20 0,1737 0,0000 24 52 0,001908 7 0,0273 0,4763
2 49 0,005453 20 -0,2335 0,1651 74 18 0,001908 7 0,0575 0,0292
3 18 0,005453 20 0,0282 0,2335 2 38 0,001908 7 -0,5126 0,0247
1 35 0,005180 19 -0,4653 0,0021 74 35 0,001908 7 -0,0579 0,8660
3 51 0,004907 18 -0,3250 0,0664 68 42 0,001636 6 -0,0142 0,9707
41
68 53 0,004907 18 0,1113 0,0000 2 64 0,001636 6 -0,3733 0,1829
68 7 0,004907 18 0,0003 0,9876 3 58 0,001636 6 -0,4337 0,1324
1 37 0,004907 18 0,5192 0,0000 31 44 0,001636 6 -0,5860 0,0156
24 39 0,004635 17 0,1102 0,0005 30 44 0,001636 6 -0,7930 0,0000
1 51 0,004635 17 -0,3529 0,0481 25 51 0,001636 6 0,0687 0,1277
68 51 0,004635 17 -0,0913 0,6705 36 35 0,001636 6 0,1112 0,0836
3 49 0,004635 17 0,0711 0,0174 33 42 0,001636 6 0,0221 0,2971
23 58 0,004635 17 0,0873 0,0003 29 49 0,001636 6 0,0091 0,6610
32 35 0,004635 17 0,0541 0,0988 29 65 0,001636 6 -0,3040 0,3482
2 72 0,004635 17 -0,1339 0,4915 29 7 0,001636 6 -0,5376 0,0391
1 7 0,004362 16 -0,3648 0,0458 68 39 0,001636 6 0,0020 0,9413
23 72 0,004362 16 0,1393 0,0000 68 8 0,001636 6 -0,5432 0,0363
11 44 0,004362 16 -0,3100 0,1020 11 18 0,001636 6 -0,3297 0,2994
30 65 0,004362 16 0,0220 0,2438 66 57 0,001636 6 0,0783 0,0003
68 71 0,004362 16 0,2424 0,0000 66 41 0,001636 6 0,1225 0,0000
33 44 0,004089 15 -0,1935 0,3632 11 65 0,001636 6 -0,3837 0,2068
30 53 0,004089 15 0,0800 0,0015 25 62 0,001636 6 0,1183 0,0000
30 35 0,004089 15 -0,4196 0,0195 68 52 0,001636 6 0,0333 0,3081
24 50 0,003817 14 0,0574 0,0567 33 51 0,001636 6 -0,5106 0,0569
66 58 0,003817 14 0,2166 0,0000 26 55 0,001636 6 0,2105 0,0000
2 61 0,003817 14 -0,0412 0,8556 66 44 0,001636 6 -0,1435 0,6832
26 51 0,003817 14 0,0753 0,0119 66 35 0,001363 5 -0,1995 0,5947
31 51 0,003817 14 0,0403 0,1273 3 50 0,001363 5 -0,4580 0,1390
30 13 0,003817 14 0,3141 0,0000 11 60 0,001363 5 0,0142 0,5949
34 44 0,003544 13 0,2147 0,0002 23 8 0,001363 5 -0,6241 0,0154
11 49 0,003544 13 0,0706 0,0014 11 64 0,001363 5 0,0767 0,0380
32 44 0,003544 13 -0,0125 0,9609 33 50 0,001363 5 0,0078 0,7024
2 52 0,003544 13 -0,1379 0,5356 1 41 0,001363 5 0,0260 0,5809
30 58 0,003544 13 0,0499 0,0390 30 71 0,001363 5 0,0273 0,4414
1 58 0,003272 12 0,0148 0,6061 1 50 0,001363 5 -0,4497 0,1495
2 48 0,003272 12 0,7371 0,0000 32 64 0,001363 5 0,0982 0,0004
24 61 0,003272 12 0,1210 0,0019 68 62 0,001363 5 -0,2349 0,5291
11 57 0,003272 12 0,0714 0,0021 1 65 0,001363 5 -0,7012 0,0020
33 35 0,003272 12 -0,2764 0,2234 24 13 0,001363 5 0,0460 0,3467
23 51 0,003272 12 -0,3666 0,0854 74 41 0,001363 5 0,0966 0,0000
30 7 0,003272 12 -0,3450 0,1120 1 49 0,001363 5 -0,4901 0,1024
24 8 0,003272 12 -0,3205 0,1470 30 52 0,001363 5 0,0149 0,6519
24 65 0,002999 11 -0,3135 0,1778 1 52 0,001363 5 -0,1178 0,7667
24 45 0,002999 11 0,0425 0,1886 2 13 0,001363 5 -0,4644 0,1019
3 8 0,002999 11 -0,4125 0,0540 31 61 0,001363 5 0,0509 0,0292
1 63 0,002999 11 0,1478 0,0009 32 65 0,001363 5 -0,0954 0,8152
29 51 0,002999 11 -0,1872 0,4623 3 62 0,001363 5 -0,4633 0,1325
68 61 0,002726 10 0,1067 0,0013 3 13 0,001363 5 0,0406 0,4216
33 53 0,002726 10 0,0537 0,0071 24 64 0,001363 5 0,0425 0,3786
11 7 0,002726 10 -0,3177 0,1936 29 58 0,001363 5 -0,0700 0,8659
68 63 0,002726 10 0,1496 0,0001 24 27 0,001363 5 -0,0932 0,8174
3 71 0,002726 10 0,0996 0,0189 30 51 0,001363 5 -0,7383 0,0005
23 35 0,002726 10 -0,6098 0,0007 23 81 0,001363 5 0,2871 0,0000
*Nível de significância = 0.05. Em negrito, estão os valores de p estatisticamente significativos.
42
Tabela 11: Diversidade, heterozigosidade e resultado do teste de HW para os loci HLA-A, -B
e -DRB1.
Locus
Número de alelos Hobs Hardy-Weinberg (valor-p)
Brancos
(n=1889)
Negros
(n=327)
Pardos
(n=652) Brancos Negros Pardos Brancos Negros Pardos
HLA-A 21 20 20 0,886 0,901 0,897 0,7248 0,4137 0,1153
HLA-B 36 36 38 0,945 0,951 0,948 0,8789 0,8224 0,3999
HLA-DRB1 13 13 13 0,896 0,900 0,903 0,6874 0,9610 0,2561
Hobs=Heterozigosidade observada.
A distribuição observada dos alelos HLA-A, -B e -DRB1 também foi representada nas
figuras 9 (A,B,C), 10 (A,B,C) e 11 (A,B,C).
43
Tabela 12: Distribuição da frequência alélica por locus HLA nos grupos de Brancos, Negros
e Pardos.
Alelos HLA-A
Brancos Negros Pardos Alelos HLA-B Brancos Negros Pardos
1 0,0993 0,0612 0,0752 13 0,0188 0,0077 0,0146
11 0,0514 0,0428 0,0483 18 0,0453 0,0275 0,0429
2 0,2568 0,2232 0,2385 27 0,0230 0,0138 0,0153
23 0,0498 0,1040 0,0736 35 0,1122 0,0933 0,0959
24 0,1022 0,0566 0,0637 37 0,0117 0,0031 0,0107
25 0,0122 0,0061 0,0153 38 0,0212 0,0107 0,0138
26 0,0323 0,0229 0,0399 39 0,0246 0,0184 0,0222
29 0,0543 0,0428 0,0499 41 0,0169 0,0138 0,0153
3 0,0990 0,0780 0,1005 42 0,0127 0,0398 0,0245
30 0,0450 0,0734 0,0836 44 0,1144 0,0749 0,1112
31 0,0323 0,0306 0,0299 45 0,0281 0,0382 0,0391
32 0,0320 0,0184 0,0314 47 0,0011 0,0000 0,0008
33 0,0334 0,0443 0,0261 48 0,0042 0,0046 0,0038
34 0,0106 0,0184 0,0169 49 0,0363 0,0291 0,0276
36 0,0037 0,0245 0,0130 50 0,0304 0,0122 0,0222
43 0,0003 0,0000 0,0000 51 0,0850 0,0688 0,0729
66 0,0114 0,0184 0,0138 52 0,0172 0,0291 0,0184
68 0,0590 0,1025 0,0575 53 0,0230 0,0658 0,0391
69 0,0032 0,0031 0,0008 55 0,0082 0,0077 0,0107
74 0,0106 0,0260 0,0207 56 0,0013 0,0015 0,0023
80 0,0016 0,0031 0,0015 57 0,0312 0,0367 0,0245
Total 1,000 1,000 1,000 58 0,0254 0,0489 0,0414
60 0,0180 0,0092 0,0169
Alelos HLA-DRB1 Brancos Negros Pardos 61 0,0185 0,0138 0,0215
1 0,1080 0,0964 0,0966 62 0,0392 0,0184 0,0299
3 0,1057 0,1208 0,1104 63 0,0151 0,0107 0,0161
4 0,1271 0,0963 0,0989 64 0,0140 0,0061 0,0130
7 0,1469 0,1086 0,1204 65 0,0519 0,0489 0,0368
8 0,0521 0,0627 0,0713 67 0,0000 0,0015 0,0008
9 0,0124 0,0184 0,0215 7 0,0606 0,0719 0,0882
10 0,0180 0,0184 0,0215 71 0,0123 0,0443 0,0245
11 0,1183 0,1162 0,1104 72 0,0123 0,0489 0,0291
12 0,0180 0,0291 0,0146 73 0,0019 0,0015 0,0008
13 0,1334 0,1422 0,1411 75 0,0016 0,0077 0,0023
14 0,0312 0,0229 0,0261 78 0,0000 0,0000 0,0015
15 0,0940 0,1453 0,1288 8 0,0574 0,0535 0,0429
16 0,0347 0,0229 0,0383 81 0,0045 0,0153 0,0054
Total 1,000 1,000 1,000 82 0,0005 0,0031 0,0008
Total 1,000 1,000 1,000
44
Distribuição dos alelos HLA-A no grupo dos brancos
0,0000
0,0500
0,1000
0,1500
0,2000
0,2500
0,3000
1 11 2 23 24 25 26 29 3 30 31 32 33 34 36 43 66 68 69 74 80
Alelos HLA-A
Fre
qu
ên
cia
Distribuição dos alelos HLA-A no grupo dos negros
0,0000
0,0500
0,1000
0,1500
0,2000
0,2500
1 11 2 23 24 25 26 29 3 30 31 32 33 34 36 43 66 68 69 74 80
Alelos HLA-A
Fre
qu
ên
cia
Distribuição dos alelos HLA-A no grupo dos pardos
0,0000
0,0500
0,1000
0,1500
0,2000
0,2500
0,3000
1 11 2 23 24 25 26 29 3 30 31 32 33 34 36 43 66 68 69 74 80
Alelos HLA-A
Fre
qu
ên
cia
A
Figura 9: Distribuição dos alelos HLA-A no grupo dos brancos (A), negros (B) e pardos (C).
B
C
45
Distribuição dos alelos HLA-B no grupo dos brancos
0,0000
0,0200
0,0400
0,0600
0,0800
0,1000
0,1200
0,1400
13 18 27 35 37 38 39 41 42 44 45 47 48 49 50 51 52 53 55 56 57 58 60 61 62 63 64 65 67 7 71 72 73 75 78 8 81 82
Alelos HLA-B
Freq
uên
cia
Distribuição dos alelos HLA-B no grupo dos negros
0,0000
0,0200
0,0400
0,0600
0,0800
0,1000
13 18 27 35 37 38 39 41 42 44 45 47 48 49 50 51 52 53 55 56 57 58 60 61 62 63 64 65 67 7 71 72 73 75 78 8 81 82
Alelos HLA-B
Freq
uên
cia
Distribuição dos alelos HLA-B no grupo dos pardos
0,0000
0,0200
0,0400
0,0600
0,0800
0,1000
0,1200
13 18 27 35 37 38 39 41 42 44 45 47 48 49 50 51 52 53 55 56 57 58 60 61 62 63 64 65 67 7 71 72 73 75 78 8 81 82
Alelos HLA-B
Fre
qu
ên
cia
Figura 10: Distribuição dos alelos HLA-B no grupo dos brancos (A), negros (B) e pardos (C).
A
C
B
46
Distribuição dos alelos HLA-DRB1 no grupo dos brancos
0,0000
0,0500
0,1000
0,1500
0,2000
1 0301 0302 4 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Alelos HLA-DRB1
Fre
qu
ên
cia
Distribuição dos alelos HLA-DRB1 no grupo dos negros
0,0000
0,0500
0,1000
0,1500
0,2000
1 0301 0302 4 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Alelos HLA-DRB1
Fre
qu
ên
cia
Distribuição dos alelos HLA-DRB1 no grupo dos pardos
0,0000
0,0500
0,1000
0,1500
1 0301 0302 4 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Alelos HLA-DRB1
Fre
qu
ên
cia
Figura 11: Distribuição dos alelos HLA-DRB1 no grupo dos brancos (A), negros (B) e pardos (C).
A
C
B
47
5.2.2. Desequilíbrio de ligação
Os valores de desequilíbrio de ligação global observados para todos os pares de loci
foram estatisticamente significativos ao nível de 5% (Tabela 13), podendo-se, portanto,
rejeitar a h0 de equilíbrio de ligação.
Tabela 13: Desequilíbrio de ligação global entre os pares de loci HLA.
Pares de loci D' Valor de p
A:B 0.36603 0.00259
A:DRB1 0.20525 0.00237
B:DRB1 0.41003 0.00340
5.2.3. Seleção natural
Os resultados do teste de neutralidade de EW são mostrados na Tabela 14. Valores
negativos de Fnd foram observados para todos os loci HLA. Os valores de p para os três loci
nos grupos analisado foram significativamente baixos, consistentes com a ação da seleção
balanceadora nestes loci, e, portanto, rejeita-se a hipótese nula de neutralidade. A mais forte
evidência da seleção foi observada no locus HLA-DRB1 que apresentou os menores valores
de Fnd em todos os grupos.
5.2.4. Diferenciação da população
As medidas de diferenciação genética entre os grupos considerados indicaram
diferenças genéticas significativas nas frequências alélicas. Como esperado, a medida de
diferenciação genética G’ST, que considera, além das frequências alélicas, a existências de
alelos diferentes nas populações, apresentou o maior valor de diferenciação genética entre
os grupos quando comparado com o Gst e o Dst (Tabela 15).
Com a metodologia empregada na análise dos loci HLA-A, B- e -DRB1, foi
demonstrada a existência de estruturação genética na amostra analisada.
5.2.5. Análise filogenética
O dendograma apresentado na figura 12 e construído com base na matriz de
distância (Tabela 16) mostra as relações evolutivas entre os grupos estudados. O
comprimento dos ramos é diretamente proporcional à distância genética. As populações da
Espanha e Itália formaram um agrupamento separado exibindo maior distância genética em
relação às outras populações analisadas. Os brancos do PR se mostraram mais próximos
das populações de Portugal, Itália e Espanha. Os pardos de SP, MG, PR e PI formaram um
agrupamento intermediário entre os europeus, ameríndios e africanos. Este fato indica que o
48
grupo dos pardos resulta de miscigenação que envolve também os ameríndios. Os negros
de MG e do PR estão mais próximos geneticamente das populações africanas do Zimbábue
e de Guiné-Bissau.
Baseando-se na análise filogenética, observa-se que a subpopulação brasileira de
origem européia, de uma forma geral, está mais próxima geneticamente das populações
européias. Por outro lado, as subpopulações de origem africana estão mais próximas
geneticamente de populações africanas. As duas populações de índios formam um
agrupamento separado, o que demonstra uma grande distância genética entre eles e as
outras populações analisadas.
49
Ta
be
la 1
4:
Te
ste
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eutr
alid
ad
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A-A
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BR
AN
CO
0,1
143
0,2
540
-1,3
50
8
0,0
070
0,0
555
0,1
417
-1,6
34
3
0,0
000
0,1
038
0,3
181
-1,6
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51
52
Figura 12: Dendograma gerado com base nas frequências alélicas dos loci HLA-A, -B e -DRB1.
53
6. DISCUSSÃO
6.1. Diversidade genética nos loci HLA
Foi observada uma grande diversidade alélica nos loci HLA conforme tem sido
relatado para outras populações do Brasil e do mundo (Belich, Madrigal et al., 1992; Moraes,
Fernandez-Vina et al., 1993; Petzl-Erler, Luz et al., 1993; Braun-Prado, Vieira Mion et al.,
2000; Middleton, Williams et al., 2000; Williams, Meenagh et al., 2001; Middleton, Menchaca
et al., 2003; Tu, Mack et al., 2007; Mack, Tu et al., 2009). A heterozigosidade nos três loci
HLA, em razão do grande número de alelos com frequências pouco diferenciadas, foi
superior a 88%.
A probabilidade de se encontrar um doador HLA compatível entre os irmãos,
seguindo as regras de Mendel, é de 25%. Edi et al. (Eid, Miranda et al., 2003) demonstraram
que 43,6% dos pacientes transplantados na Universidade de Campinas (São Paulo, Brasil)
encontraram um doador entre os familiares. Foi observado no presente estudo que esta
proporção é de 44,7% de receptores, bem similar à proporção encontrada por estes autores.
Moraes et al, (Moraes, Alencar et al., 2004) demonstraram que, no Brasil, mais de 50% dos
pacientes que necessitam de um transplante de células tronco hematopoiéticas não
encontram um doador HLA compatível entre os familiares.
A distribuição das freqüências dos loci estudados foi consistente com a observada
em populações brasileiras (Braun-Prado, Vieira Mion et al., 2000; Monte, Moita Neto et al.,
2004). Os quatro alelos mais comuns no locus HLA-A forma HLA-A2, A3, A1 e A24 que
foram também os mais freqüentes nas populações de SP e PR (Middleton, Menchaca et al.,
2003). O mesmo comentário se aplica aos alelos do locus HLA-B que se mostrou o mais
polimórfico entre os três loci analisados com os alelos HLA-B44, B35, B51 e B7 sendo os
mais frequentes. Diversos haplótipos HLA-A:HLA-B comumente observados em outras
populações de outras regiões do mundo foram também observados aqui, embora com
frequências diferentes. Estes haplótipos estão presentes em europeus (A1:B8, A2:B7,
A11:B35, A2:B44 e A3:B7) e africanos (A30:B42, A36:B53, A29:B53, A23:B72). A amostra
estudada também compartilha haplótipos com ameríndios, como A31:B35 e A31:B:39 (Petzl-
Erler, Luz et al., 1993). Os quatro haplótipos mais frequentes são também os quatro mais
comuns de uma população do sul de Portugal (Middleton, Menchaca et al., 2003). Foram
ainda observados haplótipos característicos da população de Taiwan, como A2:B48, e da
população espanhola, como A25: B18 (Middleton, Menchaca et al., 2003). Também foram
observados haplótipos característicos de Zambia, como A30:B42, cuja frequência naquela
população é 11,6%. A diversidade genética dos marcadores estudados sustenta a
conhecida característica miscigenada da população de Minas Gerais.
54
6.2. Desequilíbrio de ligação
O DL global entre os loci HLA-A, -B e -DRB1, conforme observado neste estudo,
também tem sido verificado em várias populações do mundo sendo relatado por vários
estudos (Trachtenberg, Vinson et al., 2007; Tu, Mack et al., 2007; Mack, Tu et al., 2009). Por
exemplo, na população Han (Sul da China) (Trachtenberg, Vinson et al., 2007) os valores
observados de DL entre os pares de loci HLA foi: HLA-A:B 0,614, HLA-A-DRB1 0,386, HLA-
B:DRB1 0,51045.
O desequilíbrio de ligação entre os loci HLA pode ser afetado por diversos fatores:
(1) baixa taxa de recombinação observada entre estes loci, (2) seleção natural, (3)
miscigenação e (4) redução do tamanho populacional (bottleneck). Apesar de essas forças
evolutivas atuarem para alterar o equilíbrio de ligação entre loci, é interessante notar que
quanto mais antigo for o aparecimento da mutação, mais próxima a população estará do
equilíbrio.
A taxa de recombinação de 0,45% entre os loci HLA-A e HLA-B é pequena,
comparadada ao valor, considerado padrão, de 1% de recombinação por Mb de DNA por
meiose (13). Deve-se notar que a recombinação originou dois novos haplótipos, ausentes
nos progenitores, mas já observados em outras populações (33). Satta (Satta, 1997) indicou
que a recombinação desempenha um papel importante na geração da diversidade
haplotípica do HLA, que passa a ser mantida pela seleção.
Diferentes padrões de DL podem ser observados em diferentes populações
(Trachtenberg, Vinson et al., 2007; Tu, Mack et al., 2007; Mack, Tu et al., 2009), uma vez
que a origem, manutenção ou decaimento do DL depende de diversos fatores relacionados
à dinâmica populacional, tais como migrações e miscigenação entre diversas populações
com frequências gênicas diferentes, níveis de endogamia e eventos demográficos. O estudo
dos haplótipos com base na segregação familiar proporciona uma definição mais precisa
dos haplótipos e do DL.
6.3. Seleção Natural
O teste de neutralidade de EW tem sido uma ferramenta útil e amplamente utilizada
para detectar seleção nos loci HLA em várias populações do mundo (Meyer e Thomson,
2001; Meyer, Single et al., 2006; Tu, Mack et al., 2007; Mack, Tu et al., 2009). Como
exemplo, os valores Fnd foram negativos em populações norte americanas descendentes de
europeus do leste e de afro-descendes, respectivamente: HLA-A: -0,2169, -1,2379; HLA-B: -
1,0892, -0,8741 e HLA-DRB1: -1,0000, -1,1456 (Mack, Tu et al., 2009). No presente estudo, o teste
EW também levou à rejeição da hipótese nula de neutralidade.
A história demográfica das populações humanas, em particular a brasileira, também
pode ser uma explicação para a alta proporção de populações com desvio significativo da
55
neutralidade nos loci HLA. A expansão populacional pode resultar em valores de
homozigosidade que excedem o esperado em equilíbrio neutro (Watterson, 1977; 1978). O
excesso global de alelos com frequência intermediária (Figuras 9 a 11) observado nos três
loci HLA estudados pode também ser atribuído ao regime de seleção balanceadora que atua
nestes loci.
Para explicar a alta diversidade das moléculas HLA, tem sido sugerido que a
apresentação de uma ampla variedade de peptídeos endógenos como, por exemplo, de
virus, pelas moléculas HLA-A e HLA-B, por indivíduos heterozigotos, pode aumentar a
sobrevida, frente à infecção por tais patógenos. Os valores do teste de neutralidade podem
variar entre as populações, de acordo com diferentes pressões seletivas que atuam em
cada população.
6.4. Estrutura genética populacional
Considerando as estimativas G’ST (Hedrick, 2005) obtidas para os loci HLA-A, -B e -
DRB1, observa-se que a divergência genética entre populações diferiu estatisticamente de
zero, com o locus HLA-B demonstrando maior diferenciação entre os grupos. Os resultados
são semelhantes ao de Rosenberg et al. (Rosenberg, Pritchard et al., 2002) que, usando
marcadores microssatélites, observaram variação interpopulacional, entre populações de
todos os continentes, de 3,6%. Estes autores também observaram que o componente intra-
populacional explica 93-95% do total da variância genética.
A estimativa da diferenciação genética entre as populações, medida pelo método de
Hedrick (Hedrick, 2005), foi maior que a estimativa de GST (Nei e Chesser, 1983) e Dest
(Jost, 2008). A superioridade na estimativa obtida pelo método de Hedrick (2005) se deve às
peculiaridades do método, que considera não só a frequência dos alelos, como também o
tipo de alelo presente nas populações. O método de Nei (1983), assim como a estatística
clássica FST é muito dependente de níveis de heterozigosidade presentes dentro das
populações e independente do tipo de alelos. O uso de tais estatísticas para loci
polimórficos e com alta heterozigosidade, como é o caso dos loci HLA, pode subestimar a
verdadeira diferenciação genética entre populações, diante daquelas contendo alelos
exclusivos. Os valores de G´st observados indicam baixa divergência entre as populações
que pode ser explicado pela miscigenação crescente observada documentada por Martins et
al. (Martins, 2004) no século XIX (Tabela 17). Segundo estes autores, pode-se verificar um
aumento da frequência de casamentos entre indivíduos de diferentes grupos populacionais,
que se torna cada vez mais relevante nos dias atuais. Também as taxas de migração
aumentaram devido à facilidade de deslocamento com diversos meios de transporte
disponíveis entre as diferentes cidades e países. Segundo Oliveira et al. (Oliveira, 2004) as
56
maiores causas de migração no Brasil são: a necessidade de acompanhar a família, busca
por trabalhos, melhores oportunidades e salários e busca por melhores serviços sociais e
políticas sociais, como a Saúde e Educação.
A deriva genética está presente em todas as populações reais, ainda que sua
influência seja maior quanto menor for o tamanho efetivo populacional. A análise dos
resultados permite a constatação de que a endogamia não tem sido suficiente para garantir
a diferenciação genética nas sub-regiões e nos grupos analisados.
O G’ST associa-se com a medida do quanto a deriva genética tem contribuído para a
diferenciação entre os grupos e do quanto a população total encontra-se estruturada por
suas subdivisões. No entanto, considerando que deriva e fluxo gênico concorrem para
situações distintas no sentido de que a primeira tende a afastar geneticamente as
populações enquanto o último tende a aproximá-las, o balanço entre estas duas forças tem
sido desfavorável ao processo de diferenciação.
Os resultados observados de que os loci HLA analisados tendem a uma maior
heterozigosidade que o esperado sob neutralidade, é consistente com a ação da seleção
balanceadora. Como esperado para os loci que estão sob este tipo de seleção, os valores
de G’ST são reduzidos.
Tabela 17: Casamentos intergrupos observados na província de Minas Gerais de 1818-
1838.
1818 1838
Grupo Branco Africano Crioulo Pardo Índio Branco Africano Crioulo Pardo Índio
Brancos 98,0 5,9 7,3 96,7 4,1 1,3 4,7 3,1
Africano 88,2 2,4 0,2 0,1 80,2 9,0 0,4
Crioulo 78,3 0,5 7,4 76,8 2,2 1,5
Pardo 2,0 5,9 19,3 92,0 3,2 8,3 12,9 92,6 10,8
Índio 100,0 0,1 84,6
Total 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0
Fonte: (Martins, 2004) XIV Encontro Nacional de Estudos Populacionais, ABEP, realizado em Caxambú- MG – Brasil, de 20- 24 de Setembro de 2004.
A ausência de estruturação da amostra estudada pode ser explicada pel fato de não
ter havido tempo suficiente para a formação de agrupamentos e pela grande mobilidade
humana. A ausência de barreiras físicas e as conseqüentes migrações não permitem que
diferenças genéticas, geradas estocasticamente e selecionadas pelas circunstâncias
ambientais, possam se acumular na espécie humana, apesar da percepção das diferenças,
sobretudo morfológicas (mas também culturais e intelectuais) entre os humanos.
57
6.5. Análise filogenética
A distância genética baseada na frequência alélica HLA-A, -B e -DRB1, permitiu
construir um dendograma (Figura 12) que demonstra a relação entre as populações
estudadas.
Pena et al. (Alves-Silva, Da Silva Santos et al., 2000; Pena, S. D. J., Carvalho-Silva,
D. R. , Alves-Silva, J , Prado, V. F. , Santos, F. R. , 2000; Hunemeier, Carvalho et al., 2007)
confirmaram que o brasileiro considerado branco é um mestiço tri-híbrido, com 39% de
linhagens européias, 33% ameríndias e 28% africanas, mas variando de região para região,
na dependência dos fatos históricos que nortearam a colonização de cada região. Segundo
os mesmo autores, o DNA dos cromossomos Y dos indivíduos euro-descendentes
brasileiros tem predominantemente origem portuguesa na linhagem masculina
(patrilinhagem). Quanto à linhagem feminina (matrilinhagem), os brasileiros
autodenominados brancos eram predominantemente não euro-descendentes, ou seja, o
DNA das mitocôndrias de homens e mulheres euro-descendentes era uma mistura de DNAs
de linhagens afro-descendentes, indígenas e euro-descendentes. Para a formação atual do
povo brasileiro, colaborou muito o fato bastante comum de os portugueses senhores de
terras terem filhos com índias e, sobretudo com negras, em contraposição à pequena
frequência com que africanos ou índios tinham filhos com mulheres euro-descendentes.
Os dados obtidos no presente estudo consolidam os relatos históricos da
colonização de Minas Gerais. Desta forma, o pool de genes de origem euro-descendente de
Minas Gerais é originário principalmente da população portuguesa. Foi comprovado também
que a população de pardos mostra um padrão de distribuição dos alelos HLA-A, -B e -DRB1
intermediário entre os euro-descendentes e os afro-descendentes. Estes resultados também
confirmam os relatos históricos da colonização do estado de Minas Gerais, no qual o
processo de miscigenação entre os grupos populacionais não foi pacífico. A forma de
ocupação do território mineiro, que praticamente extinguiu as populações indígenas, foi
refletida na maior distância genética observada entre a população de Minas Gerais e os
povos indígenas. Foi observada maior similaridade genética da população de Minas Gerais
com os povos europeus, principalmente a Portuguesa, e com os povos africanos.
A maior proximidade genética da populações do PR com os europeus, mostra que
houve uma menor taxa de miscigenação na população do Paraná do que na de Minas
Gerais. Esta observação pode ser explicada pela história mais recente de ocupação do
território do Paraná quando comparado ao de Minas Gerais. Portanto pode-se observar que
os eurodescendentes do PR são mais parecidos geneticamente com as populações
européias do que os euro-descendentes de MG, confirmando os achados de Pena (Pena, S.
D., 2000) de que o brasileiro da região sul do Brasil, que recebeu grande quantidade de
imigrantes europeus, tem 66% de herança européia, no norte do Brasil 54% ameríndia e no
58
nordeste do Brasil 46% de afro-descendente. Os pardos de Minas Gerais, São Paulo, Piauí
e Paraná formam um agrupamento intermediário entre as três raízes europeus, africanos e
ameríndios. Os afrodescendentes de Minas Gerais e do Paraná estão mais próximos
geneticamente das populações de países africanos Zimbábue e Guiné Bissau.
A taxa de miscigenação do estado do Paraná é menor do que a de Minas Gerais o
que foi realmente confirmado pela maior proximidade dos Brancos do PR do que de MG
com as populações européias e dos afro-descendentes do PR com as populações africanas
do que as de MG. O grupo cafuso do PR se auto-classificou baseado nas características
morfológicas e da cor, porém, conforme observado pela figura 12, este grupo está mais
próximo dos brancos do que dos afro-descententes e distante dos ameríndios,
Os Terenas são indígenas que chegaram ao estado do Mato Grosso do Sul no
século XVIII vindos do Paraguai. A grande distância genética dos Terenas em relação aos
demais grupos pode ser explicada pelo fato de terem permanecido isolados.
Os resultados deste estudo reforçam o conceito do uso dos genes HLA como
instrumento de investigação da composição étnica de população e permite concluir que a
amostra da população de MG apresenta características genéticas predominantemente de
origem euro-descendente e afro-descendente. Estes dados têm implicações para os
programas de transplante de órgãos com doador não aparentado de MG, que tem como
determinante da distribuição de órgãos a compatibilidade HLA. Uma vez conhecidas as
frequências alélicas HLA dentro de cada grupo populacional do estado, pode-se predizer o
tempo de espera do receptor para os programas de transplante de rim e medula óssea com
doador não aparentado.
Embora existam similaridades entre os resultado aqui relatados e os observados em
outras populações, a distribuição de frequências alélicas e haplotípicas foi diferente em
alguns casos, destacando a variabilidade interpopulacional. Neste sentido, os dados de HLA
apresentados podem contribuir para estudos antropológicos e microevolutivos. Eles também
podem ser usados em estudos de associação com doenças. Além disto, poderão
proporcionar base para estudos imunogenéticos de transplantes, investigação forense e
estudos de epidemiologia genética.
59
7. CONCLUSÕES
Baseando nos resultados obtidos neste estudo, pode-se concluir que a região do
cromossomo 6 humano que codifica para os alelos HLA apresenta várias características
importantes:
1. Os loci HLA apresentam elevado polimorfismo.
2. Existe desequilíbrio de ligação global e alélico e baixa taxa de recombinação entre os
loci HLA-A e -B.
3. A seleção natural balanceadora inferida pode ser um fator para explicar a grande
diversidade observada nos loci HLA.
4. As estimativas G’ST, em geral, apresentaram valores de divergência maiores do que
as medidas de divergência genética clássicas, mostrando que os loci HLA são
adequados para estudos de diferenciação populacional.
5. O conhecimento da distribuição dos alelos HLA nos diferentes grupos populacionais
é importante para determinar as chances de encontrar um doador para transplante e
diminuir, portanto o tempo de busca.
60
8. ANEXOS Resumos apresentados em Congressos e Simpósios durante o Mestrado
Anexo 1 I Simpósio de Biotecnologia da UFMG e I Encontro de Alunos e Ex-alunos da PG Genética – Profa. Cleusa Graça da Fonseca (Belo Horizonte – julho 2008)
HLA-A, -B, -DRB1 allele and haplotype frequencies in 1000 human samples
from mixed population of the Minas Gerais state, Brazil
1,2Raquel A. Fabreti Oliveira, 1Cleusa G. Fonseca, 2Eliane M. G. Vale, 2Roselia M. Carvalho, 2,30Evaldo Nascimento
1Human Genetics, Department of General Biology, Federal University of Minas Gerais, Minas Gerais, Brazil.2Laboratory IMUNOLABTx – Transplant
Immunology. 3Transplantation Center, Hospital of Santa Casa, Belo Horizonte, Minas Gerais and Clinical Hospital, Federal University of Minas Gerais,
Minas Gerais, Brazil.
*Correspondent author: [email protected]
Introduction
The human leukocyte antigen (HLA) system is
composed of a cluster of genes on the short arm of
human chromosome 6. HLA plays a central role in
immune responsiveness to pathogens, and its
polymorphism is a causal factor for rejection graft or
grafts versus host disease in organ transplantation.
The HLA genes are highly polymorphic with over 649
alleles identified at the locus A, over 1029 for locus B
and over 556 alleles for the locus DRB1 (June 2008
ImMunoGeneTics/HLA database release)1. Information
on allele an haplotype frequencies of the HLA loci also
provides a better understanding of the origin of human
population and investigation of genetic predisposition
to immune-mediated disorders including emerging
infectious diseases2-4.
Purpose
The goal of this study was to analyze the HLA-A, -B,
-DRB1 alleles and haplotypes frequencies in 1000
unrelated individuals randomly selected from mixed
population of the Minas Gerais state, Brazil.
Materials and Methods
Genomic DNA of each volunteer was prepared by
the standard salting-out method using PMNC (Miller et
al., 1988). HLA typing for HLA-A, -B, and -DRB1 was
done by polymerase chain reaction-sequence-specific
oligonucleotide probe SSOP (One Lambda, USA). All
statistical analyses and haplotype estimations were
performed using the PyPop package 0.6.0 version.
Results
The genotype frequencies of all three HLA loci were in
Hardy-Weinberg equilibrium [Guo and Thomson p values
0.8547 (HLA-A), 0.4590 (HLA-B) and 0.3951 (HLA-
DRB1)]. The number of heterozygotes observed wasn't
significantly different from that results expected (Table
1). Negative Fnd values for Ewens–Watterson
homozygosis were observed at all three loci, and the Fnd
values were significantly low for all loci (P=0.0031 for the
HLA-A, 0.0011 for B and 0.0000 for DRB1), suggesting
that an action of balancing selection in shaping allelic
diversity at all loci. A total of 20 HLA A alleles were
identified. Four alleles, contributed approximately to 50%
of the allele frequency A*02 (0.2355), A*03 (0.0975),
A*01 (0.0810) and A*24 (0.0805). A total of 44 HLA B
alleles were identified. The most frequent alleles were
B*44 (0.1175), B*35 (0.1150), B*15 (0.0795) and B*51
(0.0715). A total of 15 HLA DRB1 alleles were identified.
The most frequent alleles were DRB1*13 (0.1565),
DRB1*07 (0.1420), DRB1*04 (0.1145), DRB1*11 and
DRB1*15 with the same frequencies (0.1080) and
DRB1*03 (0.1050). The most common ABDRB1
haplotype predicted by EM algorithm was A*01-B*08-
DRB1*03 (0.0274), followed by A*29-B*44-DRB1*07
(0.0150) and A*02-B*44-DRB1*07 (0.0101). The Linkage
Disequilibrium measures of the strength of association
between pairs of HLA loci were calculated. The B:DRB1
(D’=0.4432) associations are stronger than the
associations between other loci, but all pair wise
associations are statistically significant A:B (P=0.0029)
and A:DRB1 (P=0.0027).
Table 1: Heterozigosity at the HLA –A, B and DRB1 loci.
0.9040.8960.893A
0.8000.8970.890DRB1
0.6820.9460.934B
PExpected H-W
heterozygotes
Observed
heterozygotes
Locus
References1. Robinson J, Waller M.J., Parham P. et al. 2003. IMGT/HLA and IMGT/MHC: sequence databases for the study of the major histocompatibility
complex. Nucleic Acids Res. 31:311-4.
2. Cavalli-Sforza, L.L and Bodmer W.F. 1971 The Genetics of Human Populations.W.H. Freeman, San Francisco.
3. Hartl D.L. and Clark A.G. 1989. Principles of Population Genetics. 2nd edition. Sinauer Associates, Sunderland.
4. B. Tu, S. J. Mack, A. Lazaro, A. Lancaster, G. Thomson, K. Cao, M. Chen, G. Ling, R. Hartzman, J. Ng & C. K. Hurley. 2007. HLA-A, -B, -C, -DRB1
allele and haplotype frequencies in an African American population. Tissue Antigens 69:73-85.
Conclusions
These results provide information that can be used for
future anthropological studies. It also can guides the
search for HLA-matched unrelated hematopoietic stem
cell donor in the bone morrow donor Brazilian bank.
61
Anexo 2 15th International Histocompatibility and Immunogenetics Workshop (Búzios – setembro/2008)
STRONG LINKAGE DISEQUILIBRIUM BETWEEN HLA-A*2402, B*0720 AND DRB1*1601 IN
5000 VOLUNTEERS FROM ADMIXED POPULATION OF THE MINAS GERAIS STATE, BRAZIL
1,2Raquel A. Fabreti Oliveira, 1Cleusa G. Fonseca, 2Roselia M. Carvalho, 2,3Evaldo Nascimento. 1Department of General Biology and Genetics, Federal University of
Minas Gerais, Minas Gerais, Brazil. 2IMUNOLABTx – Laboratory of Transplant Immunology, Belo Horizonte, Minas Gerais. 3Transplantation Center, Hospital of Santa
Casa, Belo Horizonte, Minas Gerais, Brazil. *Correspondent author: [email protected]
INTRODUCTION
The HLA-B*0720 allele was first described in a white male of
Cuban origin showing typing HLA-A*2402, 6602, B*0720, 5801,
Cw*07, DRB1*02, 04 (Williams et al. 2001)1. The B*0720 is
considering a rare allele, but it was reported in Caucasoid from
Brazil, France and Portugal (IMGT/HLA)2. The variant allele
most closely aligns with HLA-B*070201 with three nucleotide
changes occurring in exon 3 at positions 216 (G C), 217 (A T)
and 229 (G C)1.
PURPOSE
The purpose was to study the allele and haplotype
frequencies and the linkage disequilibrium between the HLA
A*2402, B*0720 and DRB1*1601 in 5000 healthy admixed
volunteers, unrelated, randomly selected from Minas Gerais,
state.
MATERIALS AND METHODS
Genomic DNA from the volunteers was extracted from PMNC
using the standard salting-out procedure. The samples were
typed for exon 2 and 3 to class I (HLA-A, -B) and exon 2 to class
II (HLA-DRB1) by Polymerase Chain Reaction (PCR) and
Sequence Specific Oligonucleotide Probes-SSOP (One
Lambda, CA, USA). The Sequencing-Based-Typing (PCR-SBT
Applied Biosystems, USA ABI 3130, USA) for three loci were
done with the same exons in all volunteers with B*0720-positive
in SSOP. The PyPop 0.6.0 version was used to carry out all
statistical calculations and population data analysis3.
RESULTS
The genotypes frequencies of HLA A, B and DRB1 loci in this
population were in Hardy-Weinberg equilibrium (Guo and Thomson
P values were 0.0745 for HLA A, 0.2313 for HLA-B and 0.2899 for
HLA-DRB1). The A*24 frequency was 0.0795. Six Hundred eighty-
six were found to be B*07 (13.72%). Those 686 volunteers the
frequency of 0.0189 was obtained for the B*0720 allele. The
frequency of the DRB1*16 was 0.0310. The Haplotype frequencies
using EM algorithm and Linkage Disequilibrium (LD) were
performed in the 686 HLA-B*07 volunteers. The association
between A*2402:B*0720:DRB1*1601 was observed in 10 of 13
volunteers (0.7693) B*0720-positive. The LD measures of the
strength of association between pairs of HLA loci were
A*2402:B*0720 (D’=0.8181), A*2402:DRB1*1601 (D’=0.8611) and
B*0720:DRB1*1601 (D’=0.9849), all pair wise associations are
statistically significant (P< 0.002). The others two haplotypes were
A*0301-B*0720-DRB1*1601 (0.1538) and A*0101-B*0720-
DRB1*1001 (0.0769). The haplotype HLA 2402:0720:1601 was
also assigned in one family studied and segregation analysis was
confirmed.
REFERENCES
1. F. Williams, M.D. Curran, M. Paradoa Perez, A. Acosta, D. Middleton. Characterisation of a new HLA-B allele, HLA-B*0720, identified in the Cuban population .
Tissue Antigens 2001: 57: 80–82
2. Robinson J, Waller M.J., Parham P. et al. IMGT/HLA and IMGT/MHC: sequence databases for the study of the major histocompatibility complex. Nucleic Acids
Res.:2003: 31:311-4.
3. Lancaster A, Nelson MP, Meyer D, Thomson G, Single RM. PyPop: a software framework for population genomics: analyzing large-scale multi-locus genotype
data. Pac Symp Biocomput: 2003 514.
CONCLUSIONS
These data suggested that the strong LD has been selected to
improve the immune response against pathogenes. The LD found
in this population can match with previous data (Williams et al.,
2001)
62
Anexo 3 15th International Histocompatibility and Immunogenetics Workshop (Búzios – setembro/2008)
STRONG LINKAGE DISEQUILIBRIUM BETWEEN HLA A*0201, B*1804 AND DRB1*1104 IN
5000 VOLUNTEERS FROM ADMIXED POPULATION FROM MINAS GERAIS STATE, BRAZIL
1,2Raquel A. Fabreti Oliveira, 1Cleusa G. Fonseca, 2Roselia M. Carvalho,3Walter Pereira, 2,3Evaldo Nascimento1Department of General Biology and Genetics, Federal University of Minas Gerais, Minas Gerais, Brazil. 2IMUNOLABTx – Laboratory of Transplant Immunology, Belo
Horizonte, Minas Gerais. 3Transplantation Center, Hospital of Santa Casa, Belo Horizonte, Minas Gerais, Brazil.
*Correspondent author: [email protected]
INTRODUCTION
The linkage disequilibrium (LD) describe the non-random
association of alleles at different loci. The presence of significant
LD at HLA loci can be due to history for very closely linked
genes and can also indicate he operation of balancing selection
in these loci1,2. The B*1804 was considered a rare allele and
have reported in caucasoid population (IMGT/HLA Database)3
and had be finding at Australia New South Wales population.
The B*1804 allele differed of HLA-B*180101 by four nucleotides
non-synonymous substitutions on exon 2 at positions 25 (codon
9 C-to-T), 31(codon 11 T-to-G), 34 (codon 12 G-to-A) and 70
(codon 24 T-to-G), resulting in His-to-Tyr, Ser-to-Ala, Val-to-Met
and Ser-to-Ala substitutions, respectively. There is also a silent
mutation on exon 2 at position 69 (codon 23), a C-to-T
nucleotide switch.
PURPOSE
The purpose of this study was to evaluate the allele, haplotype
frequencies and the linkage disequilibrium between the HLA
A*0201, B*1804 and DRB1*1104 in 5000 healthy admixed
volunteers, unrelated, randomly selected from Minas Gerais
state, Brazil.
MATERIALS AND METHODS
Genomic DNA of the volunteers was extracted of the PMNC
using the standard salting-out procedure. The samples were
typed for exon 2 and 3 to class I (HLA-A, -B) and exon 2 to class
II (HLA-DRB1) by Polymerase Chain Reaction (PCR) and
Sequence Specific Oligonucleotide Probes-SSOP (One
Lambda, CA USA). The Sequencing-Based-Typing (PCR-SBT
Applied Biosystems, USA ABI 3130, USA) for the three loci was
done with the same exons in all volunteers with B*1804-positive
in SSOP. The PyPop 0.6.0 version was used to carry out all
statistical and population data analysis4.
RESULTS
The genotypes frequencies of HLA-A, -B and -DRB1 loci in this
population were in Hardy-Weinberg equilibrium (Guo and Thomson
P values equilibrium p = 0.0745 for locus A, 0.2313 for B and
0.2899 for DRB1). A total of 21 HLA-A alleles were identified, and
the A*02 frequency was 0.2445. For HLA B alleles 48 were
identified. Four hundred fifth-nine (9.18%) of the 5000 volunteers
were found to be B*18, but the B*1804 allele was 0.0196. For HLA
DRB1 17 alleles were identified, and the DRB1*11 allele frequency
was 0.1064. The haplotype frequencies predicted by EM algorithm
and LD were performed among the 459 HLA-B*18 volunteers. The
association between A*0201:B*1804:DRB1*1104 was observed in
all volunteers B*1804-positive. The LD measures of the strength of
association between pairs of HLA loci were D’=1.0000 for
0201:1804 and 1804:1104. The association was D’=0,7000 for
0201:1104. All pair wise associations were statistically significant
(P<0.002). This haplotype was also assigned in families studied
and segregation analysis was confirmed.
REFERENCES
1. Cavalli-Sforza, L.L and Bodmer W.F. The Genetics of Human
Populations.W.H. Freeman, 197: San Francisco.
2. Hartl D.L. and Clark A.G. Principles of Population Genetics. 1989: 2nd edition.
Sinauer Associates, Sunderland.
3. Robinson J, Waller M.J., Parham P. et al. IMGT/HLA and IMGT/MHC:
sequence databases for the study of the major histocompatibility complex.
Nucleic Acids Res.:2003: 31:311-4.
4. Lancaster A, Nelson MP, Meyer D, Thomson G, Single RM. PyPop: a software
framework for population genomics: analyzing large-scale multi-locus
genotype data. Pac Symp Biocomput: 2003 514.
CONCLUSIONS
These data suggested that the strong linkage disequilibrium has
been selected to provide high fitness in the immune response to
pathogens.
63
Anexo 4 XIII Congresso da Sociedade Brasileira de Transplante de Medula Óssea (Curitiba – agosto/2009)
Analysis of allelic, haplotype diversity, linkage disequilibrium and inter-loci recombination rate of the
MHC Class I region of 917 families from Minas Gerais state, Brazil 3,4Oliveira, RAF., 1,2,4*Nascimento, E., 3Tarazona, EMS., 4Carvalho, RM.,. 4Vale, EMG., 4Oliveira, CKF., 4Goreti, CQ., 3Fonseca, CG.
1Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte. 2Núcleo de Pós-Graduação e Pesquisas, Hospital Santa Casa de Belo Horizonte, MG.
3Departamento de Biologia Geral – ICB/UFMG. 4IMUNOLABTx – Laboratório de Histocompatibilidade e Imunologia de transplantes, Belo Horizonte, MG.
*Corresponding author: [email protected]
RESULTS
The three most common allele lineage in the HLA-A and -B
loci were A2 (0.24), A3 (0.09), A1 (0.09), B44 (0.12), B35
(0.11), B51 (0.08), respectively. Four hundred and fifty
haplotypes were observed with ten founded in 55 or more
copies (Table 1). Deviations of the Hardy–Weinberg
proportion were not observed for both loci analyzed
(p>0,05). Strong individual haplotypic associations (D´ij)
were observed for this pair of loci such as A2:B48
haplotype (D´=0.7371, p<0.0000). The ten more frequents
haplotypes and its statistically significant p-value were
show in the table 1.The global LD was also statistically
significant (p=0.0029). The inter-loci recombination rate
observed was 0.42%.
INTRODUCTION
The HLA loci are highly polymorphic. In multilocus
models the allele frequencies for each locus is insufficient
to describe the genetic variation, instead, the frequency of
multilocus gametes should be used because the
association of alleles may occur in gametes1. The
segregation analysis of haplotypes in families is important
for the accurate calculation of Linkage Disequilibrium
(LD) and estimating of the inter-loci recombination rate2.
MATERIAL AND METHODS
The sample was consisted of 917 families. The haplotypes
were obtained of HLA-A and -B typing of the parents or
by reconstruction of parents haplotypes based on
offspring genotypes. The polymorphisms at the exons 2
and 3 in these loci were identified using the PCR-SSOP
(One lambda, CA USA). The statistical analysis was
performed using Arlequin program version 3.11
(Approved by Ethic Committee #675/08).
OBJECTIVE
To measure LD between the HLA-A and -B loci based on
haplotypes segregation in families, to estimate the
recombination rate and to evaluate the allele and
haplotype diversity in Minas Gerais state population
CONCLUSIONS
The strong association between these HLA loci and the low
recombination rate in the HLA region has been observed in
many populations in the world and also shown in this study.
REFERENCES
1.Hedrick P. Genetics of Populations. 2nd ed: Jones & Bartlett Pub., 2000.
2.Sanchez-Mazas A, Djoulah S, Busson M, et al. A linkage disequilibrium map of
the MHC region based on the analysis of 14 loci haplotypes in 50 French families.
Eur J Hum Genet. 2000;8:33-41.
Table 1: HLA-A:HLA-B haplotypes frequencies.
0.00000.5495550.01499530 42
0.00000.0886590.01608524 35
0.00000.0901630.0171763 35
0.00000.3844640.01744833 65
0.0049-0.2385720.0196292 35
0.00000.1943750.0204473 7
0.00000.4246840.02290129 44
0.00000.49081100.0299891 8
0.00000.22111190.0324432 51
0.00020.09191370.0373502 44
p-valueD´ij# copiesAbsolute
Frequence
HLA-AB
Haplotype
64
Anexo 5 Projeto de Mestrado: parecer do Prof. Dr. Eduardo Tarazona Santos
65
Anexo 6 Projeto de Mestrado: parecer do Profa. Dra. Maria Raquel Carvalho
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA GERAL
Parecer
Referente ao Projeto de pesquisa (mestrado): IDENTIFICAÇÃO DE NOVOS ALELOS E
ANÁLISE DA DIVERSIDADE GENÉTICA DOS LOCI HLA-A, -B, -DRB1 E DA
ESTRUTURA GENÉTICA DA POPULACÃO HUMANA DO ESTADO DE MINAS
GERAIS, BRASIL
Autores: Aluna: Raquel Aparecida Fabreti de Oliveira (PG Genética), Orientadora:
Profa. Dra. Cleusa Graça da Fonseca (Departamento de Biologia Geral).
Histórico: O projeto de pesquisa prevê a análise dos resultados da genotipagem dos
loci HLA-A, HLA-B e HLA-DRB1, já disponíveis na base de dados do Nefrodata, o
banco de dados de compatibilidade doador-receptor de transplantes do Laboratório
Imunolab. Serão avaliadas as frequências alélicas, haplotípicas e genotípicas, a
contribuição das diferentes populações fundadoras (conforme auto-definição com
base nos critérios do IBGE) para a constituição da população do Estado, a frequência
de recombinações no intervalo genético em estudo. Serão analisados os resultados
de 5000 doadores e de 1000 famílias de receptores. Esta análise de dados permitirá
estimar a probabilidade, com base nos genótipos destes loci, de que se encontre um
doador compatível para um determinado indivíduo, fora da sua família, na base de
66
dados de doadores de órgãos e também na população em geral. Esta informação
permitirá aos autores estimarem o tamanho necessário das bases de dados para que
um doador compatível esteja presente nelas, considerando as frequências dos
diferentes genótipos. Além disto, o projeto gerará dados para estudos de associação
HLA-doença.
Mérito: Trata-se de uma situação típica, onde há clara necessidade de atuação da
expertise, disponível nas Universidades públicas, para a solução de problemas
teóricos complexos. A colaboração estabelecida vai permitir responder questões
científicas, relacionadas à estrutura genética da população de Minas Gerais, mas
também questões de ordem prática, resultando em maior eficiência dos sistemas de
identificação de pares de doador-receptor compatíveis para transplante de órgãos do
Estado de Minas Gerais e do Brasil.
Parecer: Por considerar que há mérito científico e que este projeto vai gerar
informações que podem servir de base para um melhor funcionamento dos sistemas
de localização de doadores compatíveis do estado de Minas Gerais e no Brasil,
recomendo à aprovação.
Belo Horizonte, 09 de fevereiro de 2009.
Maria Raquel Carvalho
Prof. Adjunto III
67
Anexo 7 Aprovação do estudo pelo Comitê de ética em Pesquisa da Santa Casa de Misericórdia de Belo Horizonte.
68
Anexo 8 Aprovação do estudo pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de Minas Gerais
69
Anexo 8 (Continuação) Aprovação do estudo pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de Minas Gerais
70
Anexo 9
Artigo sob revisão a ser submetido ao periódico Human Immunology
Analysis of allelic, haplotype diversity, linkage disequilibrium and inter-loci
recombination rate of the MHC Class I region of 917 families from Minas Gerais state,
Brazil
Raquel Aparecida Fabreti Oliveira a, b, Evaldo Nascimento2,3*, Eduardo Tarazona-Santos1, R. M. Carvalho2, E. M. G. Vale2, C. K. F. Oliveira2, Cleusa G. Fonseca1 a Department of General Biology, Federal University of Minas Gerais, Belo Horizonte, MG, Brazil. b IMUNOLABTx – Lab of Histocompatibility, Immunogenetics and Transplant Immunology, Belo Horizonte, MG, Brazil. c Núcleo de Pós-Graduação e Pesquisas do Hospital Santa Casa, Belo Horizonte, MG, Brazil. * Corresponding Author: [email protected]
71
ABSTRACT
Volunteer subjects from 917 Brazilian families were genetically evaluated in the study. The
haplotypes were inferred based on offspring genotypes or by typing HLA-A and -B loci of the
relatives. The three most common allelic lineages in the HLA-A and -B loci were A2 (0.2394),
A3 (0.0913), A1 (0.0900), B44 (0.1198), B35 (0.1077), B51 (0.0796), respectively. Four
hundred and fifty haplotypes were observed with A2:B44 (0.037350), A2:B51 (0.032443) and
A1:B8 (0.029989) being the more frequents. Deviations from the Hardy–Weinberg
proportions were not observed for both loci. The global linkage disequilibrium was statistically
significant (p value=0.0029). Strong individual haplotypic associations, such as A2:B48
haplotype (D´=0.7371, p<0.0000) were observed. The observed inter-loci recombination rate
was 0.45%. The study of haplotypes in a large sample, based on family segregation,
provides accurate definition of haplotypes and the exact pattern of linkage disequilibrium.
Key words: Allele and haplotype frequencies, Brazilian population, HLA, linkage
disequilibrium, recombination rates.
72
INTRODUCTION
The Major Histocompatibility Complex (MHC) is the most polymorphic region of the
human genome (1). The Human Leukocyte Antigens (HLA) complex spans four Mega bases
(Mb), and is mapped in the chromosome region 6p21.3 within the MHC region. HLA genes
are highly polymorphic, with the HLA-B locus exhibiting the greatest allelic variation and
being considered as the most polymorphic gene of the human genome, with around 86 SNPs
per kb (2, 3). Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) are the most common type of
variation observed across the HLA loci (4), showing marked differences in the distribution of
HLA allele frequencies among human populations (5-8).
HLA molecules present endogenous peptides in the linear form to the T-CD8+
lymphocytes after being processed by antigen presenting cells (APC). The HLA molecules
are directly involved in the allorecognition (9). Moreover, the gene products of MHC class I
are involved in the immune response mediated by Natural Killer cells (NK), by interacting
with KIR receptors (Killer Immunoglobulin-like Receptor) of NK cells (10). The specific
combination MHC-peptide indicates that the immune response of heterozygous subjects in
the HLA loci were more effective by responding successfully to a large repertoire of
pathogens (10).
The highest matching probability of HLA haplotypes among close relatives is impaired
by inter-loci recombination events that have been reported in family studies (11).
Recombination occurs at a rate of 0.31% between HLA-A and -B loci, separated by 1.4 Mb
(1). Given the small distance between HLA-A and HLA-B, more than one crossing over in the
same family is very rare. Moreover, maternal recombination is more frequent than the
paternal recombination (12, 13). In general, both inter-loci and intra-locus recombination
contributes to HLA and MHC haplotype diversity.
Inversions, deletions or other chromosomal rearrangements can make pairing of
homologues in the meiosis difficult, reducing the frequency of recombination. As a result of
deletions, insertions and duplications, physical distance between the MHC human loci vary
even from one haplotype to another (14). It is also possible that structural barriers such as
the length of haplotypes and gene organization inhibit the correct alignment of homologous
chromosomes necessary for recombination (14, 15).
Recombination does not occur randomly in the genome and a number of
recombination hotspots has been proposed based on linkage disequilibrium inferred from
family data (16). The low recombination rate among HLA loci may reflect the absence of
sequences motifs that are known as intensifiers of recombination (3). Additionally, the
preservation of HLA-A and -B genes in specific combinations can influence immune
response to foreign antigens and the susceptibility to autoimmune diseases (17).
73
An important feature of the MHC region is a strong linkage disequilibrium (LD, non-
random association of alleles at two or more loci) (13). The analysis of LD can be a powerful
tool to identify the action of natural selection that maintain certain haplotypes (11). Due to the
low frequency of recombination between HLA-A and -B, a large number of meiosis are
required to properly estimate the frequency of recombination in this region (11). Studies on
families are the most informative approach to define haplotypes and hence, to determine the
pattern of LD in a given population (18).
Our aims in this study were to measure LD between the HLA-A and -B loci based on
haplotypes segregation in families, to estimate the recombination rate and to evaluate allele
and haplotype diversity in the Minas Gerais state population, whose composition received
contributions from European and African, and native Americans (19).
MATERIAL AND METHODS
Sample
We analyzed 917 Brazilian families from the Minas Gerais State, for whom typing of
HLA-A and -B were recommended to find a compatible donor for hematopoietic stem cells
transplantation in family members. These families are usually composed by parents with an
average number of four children (one to 11 children for each family). When parents were
absent in a family, typing a minimum of four relatives, mainly siblings, per family, was
required to determine the haplotypes. In each family with detectable recombination between
the HLA-A and -B loci, the haplotypes were deduced from at least five individuals, of which at
least three had to be relatives with no recombination events. This study was approved by the
Research Ethics Committees for human research from the Federal University of Minas
Gerais, MG (#675/2008), and Hospital Santa Casa of Belo Horizonte, MG, Brasil
(#073/2007).
HLA typing
Genomic DNA was extracted from Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC) by
Salting-out method (Miller et al., 1988) (20), with modifications. Briefly, 500 μl of whole blood
obtained from anticoagulated blood (EDTA) was resuspendend in 1.5 ml Eppendorf tube and
lysed during 10 min with hypotonic saline buffer (8 mM Tris-HCl, 119 mM NH4Cl and 4 mM
Na2EDTA) to remove red blood cells. The supernatant was discarded after centrifuge for 2
min at 10,000 rpm. The cell lysates were digested at 65°C at 30 min under 100 rpm with 300
μl of sterile water, 150 μl of Guanidine Hydrochloride (Gu-HCl 7,54 M and 12 M Tris-HCl,
pH=7,6) (Invitrogen CA-USA), 150 μl of 10% SDS (Invitrogen CA-USA) to solubilized the
membrane lipid of the cells and 30 μl of a proteinase K solution 10 mg/ml (Ludwig Biotec -
RS- Brazil). After digestion was completed, centrifuged at 14,000 rpm for 4 min. The
74
precipitated protein pellet was left at the bottom of the tube and the supernatant contained
the DNA was transferred to another 1.5 ml Eppendorf tube with 500 μl of isopropanol P.A
(Merck - Brazil). The tube should be inverted several times until DNA precipitated followed by
centrifuged at 14,000 rpm for 2 min. The pellet of DNA was washing with 500 μl of 70% P.A
ethanol (Merck - Brazil) and centrifuged 14,000 rpm for 2 min. The DNA was allowed
dissolved in sterile water 30 min at 65º C under 100 rpm. The concentration used was 20 to
30 ng/µl A260/A280 nm and the ratio of 1.65 to 1.80 to verify the DNA purity. The HLA-A and
-B typing were performed in all donor family members and in the bone marrow recipient. The
HLA-A and -B typing were performed in all donor family members and in the bone marrow
recipient. We identified polymorphisms at the exons 2 and 3 of the HLA-A and HLA-B loci by
the PCR-SSOP (Sequence Specific Oligonucleotide Probe), using commercial kits LabtypeTM
SSO (RSSO1A, RSSO1B - One Lambda, Canova, CA, USA) following the manufacturer
recommendations. All results were converted to serologically defined HLA antigens. The
determination of antigenic splits was based on HLA World Health Organization nomenclature
(2, 21), the database sequences of HLA IMGT/HLA database (http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla)
(2) and HLA Dictionary (22).
Statistical analysis
The knowledge of the gametic phase, based on analysis of pedigrees, allows for the
estimation of allele and haplotype frequencies by direct counting. The observed
heterozygosity (Hobs) was calculated for each locus. It is defined as the proportion of
heterozygote expected under Hardy-Weinberg proportions for allele frequencies observed
(Hobs = 1-∑pi2).
The exact the test of Guo and Thompson (1992) (23) was used to assess the Hardy-
Weinberg equilibrium for HLA-A and HLA-B loci, using 100,000 steps in the Markov chain
(24).
Linkage disequilibrium
An exact test of linkage disequilibrium was used to detect the presence of association
between loci. We also used the D` statistics for alleles of the pair of loci [Lewontin (25) and
Weir (26)]. D´ij = 0 indicates independent segregation. A value of +1 indicates complete
association of a given pair of alleles on a haplotype, thus, that there are at most three
observed two-loci haplotyes and therefore, no evidence of recombination between the loci.
D´ij < 1 is indicative of the presence of the various possible two-loci HLA haplotypes. All
these analyses were carried out by Arlequin version 3.11 software (27). Calculation of the
recombination rate was done as the ratio between the number of recombinant chromosomes
to the total number of informative meiosis.
75
RESULTS
General aspects of population
After finding a possible donor on the basis of the HLA-A and -B matching, the search
for a donor in the family could be continued for 44.7% of recipients, on the basis of other HLA
loci. Among the matched donors, 95.56% were siblings, 2.97% were parents and 1.47%
were other relatives of the recipents. Five of the 18 potential donors, who were not siblings,
belong to families whose parents were cousins and shared one haplotype.
Genetic diversity
Allele frequencies
The observed allelic lineages at HLA-A and -B loci were 20 and 38, respectively
(Table 1). For the HLA-A locus, A2 (0.2394), A3 (0.0913), A1 (0.0900) and A24 (0.0862)
showed the highest frequencies. For the HLA-B locus, B44 (0.1198), B35 (0.1077), B15
(0.0818) and B51 (0.0796) were the most common allelic lineages. No deviations from
Hardy-Weinberg genotype frequencies for both loci were observed (p> 0.05) (Table 2), with
the HLA-A and -B showed high allelic diversity: 91.17% and 94.93%, respectively. The exact
test using the modified version of the Markov chain algorithm, described by Guo and
Thompson (1992), was done for all haplotypes, and deviations from the Hardy Weinberg
proportions were not observed (p = 0.70928).
Haplotype frequencies
A total of 450 different haplotypes HLA-A:HLA-B were observed, of which 194
(43.1%) being observed greater than 5 copies (Table 3). The five most common HLA-
A:HLA:B haplotypes, with frequencies exceeding 2% were A2:B44 (0.037350), A2:B51
(0.032443), A1:B8 (0.029989), A29:B44 (0.022901) and A3:B7 (0.020447). The 47 HLA-
A:HLA-B haplotypes with 20 or more copies in the sample accounted for 50.4% of population
gene pool. The events of recombination resulted in two new haplotypes: A25:B38 and
A31:B72.
The 403 haplotypes that were less frequent in the samples (<20 copies) accounted
for 49.6% frequency of haplotypes. Of these, 137 haplotypes were represented by only one
copy in the sample.
Linkage disequilibrium
We observed LD between the HLA-A and -B loci (p<0.003). The strength of
association (D`) was significant for 92 (47.4%) of 194 haplotypes that have 5 or more copies
in the sample (Table 3). The B44, B35, B51, B7 and B8 alleles were the most frequent in the
76
HLA-B locus and showed a strong LD with the most frequent A2, A3 and A1 allelic lineages
of the HLA-A locus. The strongest LD was the observed in the A2:B48 haplotype (D´=0.7371,
p<0.0000). In fact, twelve of the fifteen copies of the B48 were associated with A2. The
haplotype with the smallest strength of association was the A30:B44 haplotype (D´=-0.7930,
p<0.0000) (Table 3).
Recombination rate between HLA-A and HLA-B loci
The number of informative meiosis tested was about 6860 and we observed 31
recombination events between HLA-A and HLA-B, for a recombination rate of 0.45%. In 16 of
31 cases of recombination parents were genotyped, making it possible to verify if
recombination occurred in the paternal or maternal chromosome. In 56.25% (9/16) of cases,
the recombinant chromosomes came from the mother, a proportion that does not allow us to
reject the null hypothesis of different recombination rates among paternal and maternal
chromosomes (χ2 = 0.617 p=0.432).
In eight (25.8%) cases of HLA-matched donors, the recombination event decreased
from 4 to 3 the matches between the receptor and donor. In eight (25.8%) cases the events
of recombination favored the search for a donor because the number of matches donor-
receptor has increased from 2 to 3.
DISCUSSION
The probability of finding an HLA-matched donor among siblings, following Mendel’s
rules, is 25%. Eid et al., 2003 (28) demonstrated that 43.6% of patients transplanted at the
University of Campinas (São Paulo State, Brazil) found a matched donor in their families.
The proportion of 44.7% of receptors that found a donor in the family, observed in this study,
was similar to the study of Eid et al. Moraes et al., 2004 (29) demonstrated that in Brazil,
more than 50% of patients needing a transplant of hematopoietic stem cells did not find an
HLA matched donor in their families.
The distribution of allele frequencies in the examined loci was consistent with those
observed in Brazilian populations, with HLA-B locus being the most polymorphic (5, 7). The
high heterozygosity in the HLA-A and -B loci provide individuals with better immune
responses (13). The four most common HLA-A (HLA-A2, A3, A1 and A24) and HLA-B (HLA-
B44, B35, B51 and B7) alleles in this sample were the same four most common HLA-A and -
B alleles in other Brazilian population from São Paulo and Paraná states (30). Various HLA-
A:HLA-B haplotypes that were commonly observed in other populations in the world (5-8, 30-
33) were also observed here, although with different frequencies. Those haplotypes were
characteristic of different ethnic groups, such as Europeans (A1:B8, A2:B7, A11:B35, A2:B44
and A3:B7), Black (A30:B42, A36:B53, A29:B53, A23:B72) (5). Our sample also share
77
haplotypes such as A31:B35 and A31:B:39 with American Indians (34). The four most
frequent haplotypes in the studied sample match with the four most common haplotypes of a
sample from southern Portugal population (30). We observed haplotypes characteristic of the
oriental population from Taiwan such as A2:B48 and haplotypes characteristic from Spanish
population such as A25: B18 (30). Also was observed haplotypes characteristic from Zambia
such A30:B42 whose frequency is 11.6% in that population. The genetic diversity of the
markers studied support the known genetic background of the mixed population of Minas
Gerais.
The study of haplotypes based on family segregation provides a more accurate
definition of haplotypes and of the LD. Consequently, this data may be used as a priori
information for further studies.
The recombination rate of 0.45% observed between the loci HLA-A and HLA-B was
lower than expected given the standard 1% recombination rate per megabase of DNA per
meiosis (17). In particular, recombination originated two new haplotypes that were not
observed in the sample, but were already seen in other populations (32). Satta (1997)
indicates that recombination plays a role in the generation of HLA diversity, which is then
maintained by selection (35). LD between HLA-A and HLA-B loci has been observed in many
populations in the world and in this study (18, 33), which is consistent with the observed low
rate of recombination and admixture.
Although, there are similarities among the reported results and those found in other
populations (29-33), the distribution of allele and haplotypes frequencies was different in
some cases, highlighting the interpopulation variability. Therefore, the present data may
contribute to anthropological and microevolutionary studies of HLA. They can be used as the
basis for further disease association studies and calculation of the possible frequency of
donors for patients from the area. Furthermore, they will provide the ground for studies on
immunogenetics of transplantation, forensic investigations and genetic epidemiology
involving the HLA loci.
78
Table 1: Allelic lineage frequencies of the loci HLA-A and HLA-B.
In parenthesis are the original broad specificities of the HLA-B.
Allelic lineage Frequency Count Allelic lineage Frequency Count Allelic lineage Frequency Count
HLA-A HLA-B HLA-B
2 0.2394 877 44 0.1198 439 61 (40) 0.0166 61
3 0.0913 335 35 0.1077 395 38 0.0164 60
1 0.0900 330 51 0.0796 292 71 (15) 0.0150 55
24 0.0862 316 7 0.0763 280 63 (15) 0.0134 49
30 0.0657 241 8 0.0559 205 41 0.0120 44
23 0.0649 238 65 (14) 0.0540 198 64 (14) 0.0109 40
68 0.0641 235 18 0.0466 171 13 0.0106 39
11 0.0523 192 58 0.0316 116 37 0.0087 32
29 0.0466 171 49 0.0297 109 55 0.0071 26
33 0.0420 154 53 0.0292 107 81 0.0041 15
31 0.0327 120 62 (15) 0.0286 105 48 0.0041 15
32 0.0297 109 50 0.0275 101 47 0.0030 11
26 0.0262 96 57 0.0273 100 56 0.0030 11
74 0.0188 69 42 0.0259 95 73 0.0019 7
66 0.0158 58 39 0.0248 91 75 (15) 0.0014 5
34 0.0115 42 45 0.0240 88 82 0.0011 4
25 0.0115 42 72 (15) 0.0234 86 54 0.0003 1
36 0.0079 29 60 (40) 0.0236 87 78 0.0003 1
80 0.0025 9 27 0.0174 64
69 0.0011 4 52 0.0172 63
79
Table 2: Heterozygosity in loci HLA-A and HLA-B
Locus Number of
genotypes
Observed
Heterozygosity
Expected
Heterozygosity
P-value
HLA-A 1834 0.91167 0.89630 0.47330
HLA-B 1834 0.94929 0.94412 0.48330
80
Table 3: HLA-A:HLA-B haplotype frequencies linkage disequilibrium estimates (D’)
and its significance.
AB Haplotype
Absolute Frequence
# copies D´ij p-value* AB Haplotype
Absolute Frequence
# copies D´ij p-value*
2 44 0.037350 137 0.0919 0.0002 1 38 0.002726 10 0.0843 0.0363
2 51 0.032443 119 0.2211 0.0000 31 62 0.002726 10 0.0675 0.0002
1 8 0.029989 110 0.4908 0.0000 2 63 0.002454 9 -0.2327 0.3577
29 44 0.022901 84 0.4246 0.0000 2 41 0.002454 9 -0.1455 0.5860
3 7 0.020447 75 0.1943 0.0000 29 35 0.002454 9 -0.5084 0.0184
2 35 0.019629 72 -0.2385 0.0049 23 41 0.002454 9 0.1494 0.0002
33 65 0.017448 64 0.3844 0.0000 34 8 0.002454 9 0.1678 0.0000
3 35 0.017176 63 0.0901 0.0000 30 72 0.002454 9 0.0474 0.1007
24 35 0.016085 59 0.0886 0.0000 68 60 0.002454 9 0.0581 0.0505
30 42 0.014995 55 0.5495 0.0000 3 27 0.002454 9 0.0542 0.1673
2 7 0.014995 55 -0.1794 0.0798 24 57 0.002454 9 0.0042 0.8894
2 18 0.013359 49 0.0620 0.1386 30 45 0.002454 9 0.0394 0.1572
2 50 0.013359 49 0.3231 0.0000 33 7 0.002454 9 -0.2344 0.3929
11 35 0.012541 46 0.1478 0.0000 68 49 0.002454 9 0.0198 0.4232
23 44 0.011996 44 0.0729 0.0017 31 52 0.002454 9 0.1139 0.0000
2 62 0.009542 35 0.1364 0.0127 11 8 0.002181 8 -0.2545 0.3782
2 39 0.008997 33 0.1621 0.0053 2 42 0.002181 8 -0.6482 0.0003
2 60 0.008724 32 0.2389 0.0002 24 38 0.002181 8 0.0516 0.1891
23 7 0.008451 31 0.0584 0.0012 30 8 0.002181 8 -0.4036 0.1156
1 57 0.008179 30 0.2308 0.0000 36 53 0.002181 8 0.2541 0.0000
30 18 0.007906 29 0.1115 0.0000 23 42 0.002181 8 0.0207 0.4385
2 65 0.007634 28 -0.3711 0.0036 31 60 0.002181 8 0.0750 0.0003
2 58 0.007361 27 -0.0276 0.8654 32 27 0.002181 8 0.0982 0.0000
2 53 0.007361 27 0.0171 0.7497 32 51 0.002181 8 -0.0780 0.8078
26 38 0.007088 26 0.4184 0.0000 23 50 0.002181 8 0.0153 0.5535
24 44 0.006816 25 -0.3449 0.0174 11 52 0.001908 7 0.0620 0.0346
31 35 0.006543 24 0.1035 0.0009 26 44 0.001908 7 -0.3834 0.1628
68 44 0.006543 24 -0.1544 0.3646 74 7 0.001908 7 0.0272 0.4277
3 65 0.006270 23 0.0356 0.1163 32 61 0.001908 7 0.0876 0.0001
24 62 0.005998 22 0.1417 0.0000 68 45 0.001908 7 0.0165 0.5484
23 49 0.005998 22 0.1465 0.0000 3 57 0.001908 7 -0.2336 0.4528
74 72 0.005998 22 0.3033 0.0000 2 57 0.001908 7 -0.7076 0.0001
11 51 0.005725 21 0.0323 0.1175 68 57 0.001908 7 0.0063 0.8060
24 7 0.005725 21 -0.1294 0.4890 29 45 0.001908 7 0.0348 0.1338
3 44 0.005725 21 -0.4810 0.0006 23 65 0.001908 7 -0.4200 0.1215
25 18 0.005725 21 0.4756 0.0000 68 58 0.001908 7 -0.0581 0.8678
2 45 0.005725 21 -0.0031 0.9870 2 71 0.001908 7 -0.4683 0.0496
31 39 0.005725 21 0.2048 0.0000 30 57 0.001908 7 0.0049 0.8514
2 27 0.005725 21 0.1167 0.0932 32 60 0.001908 7 0.0643 0.0012
24 18 0.005453 20 0.0337 0.1414 1 62 0.001908 7 -0.2372 0.4449
2 8 0.005453 20 -0.5924 0.0000 26 35 0.001908 7 -0.3085 0.2925
68 35 0.005453 20 -0.2097 0.2484 74 53 0.001908 7 0.0744 0.0003
1 44 0.005453 20 -0.4982 0.0004 68 65 0.001908 7 -0.4126 0.1308
24 51 0.005453 20 -0.2050 0.2623 23 53 0.001908 7 0.0006 0.9818
23 45 0.005453 20 0.1737 0.0000 24 52 0.001908 7 0.0273 0.4763
2 49 0.005453 20 -0.2335 0.1651 74 18 0.001908 7 0.0575 0.0292
3 18 0.005453 20 0.0282 0.2335 2 38 0.001908 7 -0.5126 0.0247
1 35 0.005180 19 -0.4653 0.0021 74 35 0.001908 7 -0.0579 0.8660
3 51 0.004907 18 -0.3250 0.0664 68 42 0.001636 6 -0.0142 0.9707
68 53 0.004907 18 0.1113 0.0000 2 64 0.001636 6 -0.3733 0.1829
81
68 7 0.004907 18 0.0003 0.9876 3 58 0.001636 6 -0.4337 0.1324
1 37 0.004907 18 0.5192 0.0000 31 44 0.001636 6 -0.5860 0.0156
24 39 0.004635 17 0.1102 0.0005 30 44 0.001636 6 -0.7930 0.0000
1 51 0.004635 17 -0.3529 0.0481 25 51 0.001636 6 0.0687 0.1277
68 51 0.004635 17 -0.0913 0.6705 36 35 0.001636 6 0.1112 0.0836
3 49 0.004635 17 0.0711 0.0174 33 42 0.001636 6 0.0221 0.2971
23 58 0.004635 17 0.0873 0.0003 29 49 0.001636 6 0.0091 0.6610
32 35 0.004635 17 0.0541 0.0988 29 65 0.001636 6 -0.3040 0.3482
2 72 0.004635 17 -0.1339 0.4915 29 7 0.001636 6 -0.5376 0.0391
1 7 0.004362 16 -0.3648 0.0458 68 39 0.001636 6 0.0020 0.9413
23 72 0.004362 16 0.1393 0.0000 68 8 0.001636 6 -0.5432 0.0363
11 44 0.004362 16 -0.3100 0.1020 11 18 0.001636 6 -0.3297 0.2994
30 65 0.004362 16 0.0220 0.2438 66 57 0.001636 6 0.0783 0.0003
68 71 0.004362 16 0.2424 0.0000 66 41 0.001636 6 0.1225 0.0000
33 44 0.004089 15 -0.1935 0.3632 11 65 0.001636 6 -0.3837 0.2068
30 53 0.004089 15 0.0800 0.0015 25 62 0.001636 6 0.1183 0.0000
30 35 0.004089 15 -0.4196 0.0195 68 52 0.001636 6 0.0333 0.3081
24 50 0.003817 14 0.0574 0.0567 33 51 0.001636 6 -0.5106 0.0569
66 58 0.003817 14 0.2166 0.0000 26 55 0.001636 6 0.2105 0.0000
2 61 0.003817 14 -0.0412 0.8556 66 44 0.001636 6 -0.1435 0.6832
26 51 0.003817 14 0.0753 0.0119 66 35 0.001363 5 -0.1995 0.5947
31 51 0.003817 14 0.0403 0.1273 3 50 0.001363 5 -0.4580 0.1390
30 13 0.003817 14 0.3141 0.0000 11 60 0.001363 5 0.0142 0.5949
34 44 0.003544 13 0.2147 0.0002 23 8 0.001363 5 -0.6241 0.0154
11 49 0.003544 13 0.0706 0.0014 11 64 0.001363 5 0.0767 0.0380
32 44 0.003544 13 -0.0125 0.9609 33 50 0.001363 5 0.0078 0.7024
2 52 0.003544 13 -0.1379 0.5356 1 41 0.001363 5 0.0260 0.5809
30 58 0.003544 13 0.0499 0.0390 30 71 0.001363 5 0.0273 0.4414
1 58 0.003272 12 0.0148 0.6061 1 50 0.001363 5 -0.4497 0.1495
2 48 0.003272 12 0.7371 0.0000 32 64 0.001363 5 0.0982 0.0004
24 61 0.003272 12 0.1210 0.0019 68 62 0.001363 5 -0.2349 0.5291
11 57 0.003272 12 0.0714 0.0021 1 65 0.001363 5 -0.7012 0.0020
33 35 0.003272 12 -0.2764 0.2234 24 13 0.001363 5 0.0460 0.3467
23 51 0.003272 12 -0.3666 0.0854 74 41 0.001363 5 0.0966 0.0000
30 7 0.003272 12 -0.3450 0.1120 1 49 0.001363 5 -0.4901 0.1024
24 8 0.003272 12 -0.3205 0.1470 30 52 0.001363 5 0.0149 0.6519
24 65 0.002999 11 -0.3135 0.1778 1 52 0.001363 5 -0.1178 0.7667
24 45 0.002999 11 0.0425 0.1886 2 13 0.001363 5 -0.4644 0.1019
3 8 0.002999 11 -0.4125 0.0540 31 61 0.001363 5 0.0509 0.0292
1 63 0.002999 11 0.1478 0.0009 32 65 0.001363 5 -0.0954 0.8152
29 51 0.002999 11 -0.1872 0.4623 3 62 0.001363 5 -0.4633 0.1325
68 61 0.002726 10 0.1067 0.0013 3 13 0.001363 5 0.0406 0.4216
33 53 0.002726 10 0.0537 0.0071 24 64 0.001363 5 0.0425 0.3786
11 7 0.002726 10 -0.3177 0.1936 29 58 0.001363 5 -0.0700 0.8659
68 63 0.002726 10 0.1496 0.0001 24 27 0.001363 5 -0.0932 0.8174
3 71 0.002726 10 0.0996 0.0189 30 51 0.001363 5 -0.7383 0.0005
23 35 0.002726 10 -0.6098 0.0007 23 81 0.001363 5 0.2871 0.0000
*Significative level = 0.05. In bold are the statistical significant p-values.
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