Análises de Leite.pdf

7/21/2019 Anlises de Leite.pdf

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INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAO, CINCIA ETECNOLOGIA TRINGULO MINEIRO - CAMPUS ITUIUTABA.

PRTICAS DE ANLISE DE LEITE


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Determinao da densidade a 15C

A determinao da densidade uma das operaes que permite saber se o leite em anlise foi ou noadulterado (molhagem). Entretanto, o resultado desta determinao deve ser encarado com reservas,pois podem ocorrer casos em que o leite foi adulterado, mas foi tambm adicionado de substnciascorretoras da densidade.

Material necessrio para a anlise- Termolactodensmetro- Cilindro graduado de 250 ml

ProcedimentoTransfira para um cilindro graduado de 250 ml uma quantidade da amostra que permita mergulhar otermolactodensmetro (Figura 1). A temperatura do leite poder variar de 14 a 20C. Introduza,lentamente, o termolactodensmetro evitando que o mesmo encoste nas paredes do cilindro graduado.Espere que a coluna de mercrio do termmetro e o densmetro estabilizem-se. Preda a leitura dadensidade e da temperatura. Expresse a densidade a 15C, servindo-se da tabela em anexo.


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Determinao de Lipdios

O teor de gordura do leite bovino varia em funo da raa do animal; entretanto, 3,5% podem serconsiderados como um valor mdio. O mtodo mais comumente utilizado para a determinao delipdios no leite o do butirmetro de GERBER.

Material necessrio para anlise

- butirmetro de Gerber- Pipeta de 11 ml- Pipeta de 10 ml- Pipeta de 1 ml

Reagentes

- cido sulfrico (D = 1,820)- lcool amlico

Procedimento

Transfira, com auxlio de uma pipeta adaptada a uma "pera" de borracha, 10 ml de cido sulfrico paraum butirmetro de Gerber (Figura 2). Adicione, lentamente, com uma pipeta, 11 ml da amostra e 1 mlde lcool amlico (estas adies devem ser feitas sem molhar internamente o gargalo do butirmetro).

Arrolhe e agite at completa dissoluo. Coloque o butirmetro em um banho a 75C (rolha para baixo)e espere at que haja completa separao da camada oleosa. A seguir, centrifugue a 3.000 rpm durante5 min em centrfuga de GERBER (Figura 3). Manejando a rolha, coloque a camada amarelo-clara dentroda haste graduada do butirmetro. O nmero de ml ocupado pela camada oleosa dar diretamente aporcentagem de lipdios.


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Determinao do extrato seco

Material necessrio para a determinao

- Disco de Ackermann

Procedimento

Determine o resduo seco fazendo coincidir as graduaes dos crculos internos e mdios do disco deAckermann (Figura 4) correspondentes densidade e gordura, respectivamente. A posio da setaindicar, no crculo externo, o valor do resduo seco em porcentagem (p/v).Obs.: - Esta determinao pode ser feita, tambm, atravs do uso de tabela apropriada.


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Determinao da acidez

A determinao da acidez no leite frequentemente utilizada e, inclusive, considerada como prova derotina nas indstrias de laticnios, pois fornece indcios sobre o estado de conservao do produto. Nocaso de o leite ter sido ordenhado e estocado de forma inadequada, o nmero de microrganismospresentes ser bastante elevado, gerando uma acidez acima dos limites considerados normais.

A acidez do leite pode ser expressa das seguintes maneiras:

1) Acidez em graus Dornic (D)

Material necessrio para a anlise

- Pipeta de 10 ml- Erlenmeyer de 50 ml- Bureta de 25 ml

Reagentes

- Soluo de hidrxido de sdio N/9- Soluo alcolica de fenolftalena 1%

Procedimento

Transfira, com auxlio de uma pipeta, 10 ml da amostra para um erlenmeyer de 50 ml. Adicione 2 gotasde indicador fenolftalena. Titule com soluo de NaOH 1/9 N at o aparecimento de uma coloraorsea.

Clculo

V x 10 = acidez DV = volume de NaOH 1/9 N gasto na titulao

Obs.: - A partir desta titulao (utilizando NaOH 1/9 N) pode-se, tambm, expressar a acidez do leite em% de cido ltico, fazendo-se os seguintes clculos:

100 ml de sol. de NaOH 1/9 N ---------------- 0,44 g de NaOHX ml gastos na titulao ---------------- Z g NaOH

1 mol de NaOH reage com 1 mol de cido ltico

40 g de NaOH --------------------------- 90 g de cido lticoZ g de NaOH ---------------------------- Y g de cido ltico

Para se obter o resultado em porcentagem:

10 ml de leite (quantidade de amostra) -------- Y g de cido ltico100 ml de leite ----------------------------------- W g de cido ltico

W = % de cido ltico


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2) Acidez em soluo normal e porcentagem de cido ltico


- Pipeta de 10 ml- Erlenmeyer de 50 ml- Bureta de 25 ml

Reagentes

- Soluo de hidrxido de sdio 0,1 N- Soluo alcolica de fenolftalena 1%

Procedimento

Transfira, com auxlio de uma pipeta, 10 ml da amostra para um erlenmeyer de 50 ml. Adicione 2 gotasdo indicador fenolftalena. Titule com uma soluo de hidrxido de sdio 0,1 N at o aparecimento deuma colorao rsea.

Clculo

a) em soluo normal

b) em cido ltico

3) Prova do Alizarol

No fornece resultados quantitativos, mas apenas indica se o leite est cido, normal ou alcalino. Este frequentemente utilizado pela indstria no momento de recepo do leite.

Material necessrio para a anlise- Pipeta de 5 ml- Tubos de ensaio de 20 ml

Reagentes- Soluo de Alizarol

ProcedimentoTransfira, com auxlio de uma pipeta, 5 ml de leite para um tubo de ensaio. Adicione 5 gotas da soluode alizarol.


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Resultados possveis- colorao vermelho-tijolo ------------ leite normal

- colorao amarelada ------------------- leite com acidez alta- colorao azulada ---------------------- leite alcalino

Determinao do ndice crioscpico

A gua, que se congela a uma temperatura superior ao ponto de congelamento do leite (-0,55C),adicionada a ele vai forosamente elevar seu ponto de congelamento. Assim, se a molhagem (adio degua) fosse levada ao infinito ter-se-ia gua pura, que congela a 0C, isto , 55 centsimos de grau acimado ponto de congelamento do leite normal. Desta forma, um centsimo de grau de diferena, no pontode congelamento do leite, corresponde a 1,82% de molhagem. A crioscopia , portanto, uma provaimportante para determinar a fraude da molhagem.

Determinao de conservantes

Como j foi dito anteriormente, um leite ordenhado e estocado em condies no adequadas,provavelmente apresentar, aps algumas horas, uma contagem microbiana bastante elevada, gerandono produto uma acidez acima dos limites permitidos pela legislao. Este fato certamente far com queo produto seja rejeitado ao chegar ao laticnio. Numa tentativa de evitar que isto ocorra, o produtorpode fazer a adio de substncias que impedem o desenvolvimento microbiano acentuado. Essassubstncias so conhecidas como conservantes. Dentre elas, temos: cido brico e boratos; cidosaliclico e salicilatos; gua oxigenada; formaldedo e antibiticos. Entretanto, deve-se salientar que aadio de qualquer uma dessas substncias no leite considerada ilegal segundo a legislao vigenteem nosso pas.

1) gua oxigenada

Fundamento: baseado na seguinte reao:

H2O2 + 2 KI 2KOH + I2

O I2liberado na reao produzir uma colorao amarelada na amostra.


- Pipeta de 1 e 5 ml

- Tubo de ensaio de 30 ml

Reagente- Soluo de iodeto de potssio 40%

Procedimento

Transfira 5 ml da amostra para um tubo de ensaio e adicione 2 ou 3 gotas de soluo de KI 40%. Oaparecimento de uma colorao amarelada indicar a presena de H2O2.


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2) Antibiticos


- Pipeta estril de 1 ml

- Placas de petri estreis

- Meio de cultura

- Cultura B. subtilis

Composio do meio de cultura

Peptona de casena ----------------------- 5,0 gExtrato de levedura ----------------------- 2,5 gD (+) glucose ------------------------------ 1,0 gAgar-Agar ----------------------------------- 11,5 g(pH = 6.9 - 7.1)

Procedimento

Colocar 0,5 ml da suspenso de B. subtilis em uma placa de petri estril. Em seguida colocar 15 ml domeio de cultura, esterilizado e resfriado a +/- 40C. Deixar solidificar. Embeber discos de papel(previamente esterilizados) em leite e colocar sobre o meio. Repetir o mesmo procedimento, s queembebendo os discos em leite contendo antibitico. Incubar a 37C/24 horas. Observar a formao dohalo de inibio ao redor dos discos embebidos com leite contendo antibitico.

3) Formol

Fundamento: reao que ocorre entre aldedo e fenol, resultando no aparecimento de uma coloraosalmo.


- Pipetas de 1, 2 e 10 ml.


Reagentes

- Soluo de floroglucina a 1%

- Soluo de hidrxido de sdio a 10%

Procedimento

Transfira 10 ml da amostra para um tubo de ensaio e adicione 1 ml da soluo de floroglucina 1% e 2 mlda soluo de NaOH 10%. Agite. Na presena de formaldedo, aparecer uma colorao salmo.

4) cido Brico e Boratos

Fundamento: chama de colorao verde, caracterstica do boro.


- Pipeta de 1, 10 e 25 ml.

- Cpsula de porcelana

- Erlenmeyer de 100 ml

- Tubo de vidro dobrado em ngulo reto- Banho-maria

Reagentes

- Soluo de hidrxido de sdio a 10%

- cido sulfrico (D = 1,84)

- lcool metlico


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Procedimento

Mea 25 ml da amostra e transfira para uma cpsula de porcelana. Adicione 3 gotas de soluo de NaOH10%. Aquea at carbonizao e transfira o resduo para um erlenmeyer. Adicione 1 ml de H2SO4 (D =1,84). Aquea em banho-maria por 10 minutos. Esfrie e adicione 10 ml de lcool metlico. Adapte, aofrasco, uma rolha atravessada por um tubo de vidro dobrado em ngulo reto. Aquea o frasco e Inflameos vapores observando a colorao da chama. Reao positiva chama com colorao verde.

Determinao de espessantes

Existem substncias que podem ser adicionadas intencionalmente ao leite com a finalidade de mascarara adio de gua, fazendo com que o mesmo tenha a sua densidade corrigida. Essas substncias sochamadas de espessantes. Neste grupo, as substncias mais comumente utilizadas e, portanto,pesquisadas, so: amido, sacarose, urina e gelatina.

1) Amido

Fundamento: esta determinao se baseia no fato de que o amido reage com o iodo produzindo umacolorao azul.


- Pipeta graduada de 10 ml


Reagentes- Soluo saturada de iodo

Procedimento

Mea 10 ml da amostra em uma pipeta, transfira para um tubo de ensaio e aquea at a ebulio embico de Bunsen. Resfrie em gua com gelo. Adicione 2 gotas de uma soluo saturada de iodo. Napresena de amido aparecer uma colorao azul.

2) Sacarose

Fundamento: a determinao de sacarose se baseia no fato de que os acares em presena de cidosconcentrados sofrem desidratao produzindo furfurais, os quais se condensam com fenis. Comoresultado dessa reao aparece uma colorao avermelhada.

Material necessrio para a anlise- Pipeta graduada- Tubo de ensaio de 50 ml- Banho-maria

Reagentes- cido clordrico- Resorcina

Procedimento

Mea 15 ml da amostra com auxlio de uma pipeta e transfira para um tubo de ensaio de 50 ml.Adicione 1 ml de cido clordrico e 0,1 g de resorcina. Agite e aquea em banho-maria por 5 minutos. Napresena de sacarose, aparecer uma colorao avermelhada.


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PADRO PARA AS ANLISES DE LEITE

DETERMINAOMTODO DE

ANLISEINDICAO LIMITES

Densidade LactodensmetroFraude por adio

de gua oudesnatagem

1,028 - 1,032

Acidez DornicEstado de

conservao doleite

1620D

Lipdios Butirmetro

Fraude por adio

de gua oudesnatagem 3% mnimo

Resduo secoDisco de

AckermannFraude por adio

de gua8,5% mnimo

Ponto decongelamento

CrioscopiaFraude por adio

de gua-0,54 - 0,56C

Amido Reao c/ iodoFraude por adio

de guaNo permitido

SacaroseCondensao defurfural + fenol

Fraude por adiode gua

No permitido

Formol Reao de aldedo+ fenol Estado imprpriode conservao No permitido

H2O2 Reao com KIEstado imprpriode conservao

No permitido

cido Brico Anlise da chamaEstado imprpriode conservao

No permitido

AntibiticoCrescimento demicrorganismos

Estado imprpriode conservao

No permitido


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PROVAS ENZIMTICAS

A pesquisa da peroxidase e fosfatase, duas enzimas normalmente presentes no leite, til no sentido defornecer informaes a respeito do processo de pasteurizao, indicando se o mesmo foi ou norealizado adequadamente.A peroxidase uma enzima que tem capacidade de desdobrar a gua oxigenada. destruda quando oleite submetido s temperaturas de 70 a 80C, dependendo do tempo de aquecimento. Portanto, aperoxidase ser inativada, caso a temperatura de pasteurizao tenha sido ultrapassada o que tornar oleite inadequado ao consumo, bem como, produo de queijo.A fosfatase, enzima que inativada nas temperaturas de pasteurizao, no deve ser detectada em leiteadequadamente pasteurizado. Caso contrrio (fosfatase positiva) deve-se suspeitar de uma relaotempo/temperatura insuficiente no processo de pasteurizao, ou ento, de uma mistura de leite

pasteurizado com leite cru. de costume, tambm, se pesquisar em leite, outra enzima: a redutase. A pesquisa da redutase forneceindicaes quanto ao estado de higienizao do leite, sendo, portanto, uma prova bastante utilizada (noBrasil) para se fazer a classificao do leite em tipo "A", "B" e "C", uma vez que tal classificao feitabasicamente em funo da populao microbiana do produto. A prova de redutase fundamentada nacapacidade que apresentam os microrganismos de reduzir o azul de metileno. Deve-se salientar que otempo de reduo inversamente proporcional ao nmero de microrganismos presentes no leite.

1) Prova de Redutase




Reagente

- Soluo de azul de metileno 2,5%

ProcedimentoEm um tubo de ensaio estril, coloque 20 ml de leite e adicione 0,5 ml de soluo aquosa de azul demetileno 2,5%. Feche o tubo, misture e leve a estufa a 37oC, at completa descolorao. Observar otempo decorrido desde a mistura do leite com o corante at o completo descoramento. Qualificar oleite de acordo com a seguinte tabela:

Excelente conserva a cor por mais de 7 horas

Bom conserva a cor por mais de 5 horas

Aceitvel conserva a cor por mais de 4 horasMdio conserva a cor por mais de 2 horas

MauConserva a cor por menos de 2

horas

PssimoPerde a cor em aproximadamente

30 minutos

2) Prova de fosfatase

Esse teste pode ser realizado por meio de kit especfico facilmente encontrado no mercadoespecializado. As recomendaes de uso feitas pelo fabricante devem ser rigorosamente observadas.Leites adequadamente pasteurizados devem apresentar resultados negativos para a fosfatase.


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3) Prova de Peroxidase




Reagente

- Soluo de guaiacol 1%

- gua oxigenada de 10 vol.

Procedimento

Transfira 10 ml da amostra para um tubo de ensaio, adicione 2 ml de soluo de guaiacol e 2 a 3 gotasde gua oxigenada. Agite. O aparecimento de uma colorao salmo indica que o leite no foi aquecidoalm de 75C por mais de 15 minutos.

PADRO PARA PROVAS ENZIMTICAS

TESTE INDICAO RESULTADOS ESPERADOS

PeroxidaseCondies depasteurizao

Positivo

FosfataseCondies depasteurizao

Negativo

Redutase Estado de higienizaoTempo mnimo de 3 horas

e 30 minutos para leitetipo "B"


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Anlises Microbiolgicas

COLHEITA E PREPARO DA AMOSTRA PARA ANLISES MICROBIOLGICAS

Para a colheita de leite cru de lates ou de tanque de resfriamento deve-se proceder a homogeneizaodo leite com equipamentos adequados e em seguida passar o leite para frasco esterilizado.Para leite beneficiado deve-se colher o leite em suas embalagens prprias e ntegras sendo que emqualquer caso, a amostra deve ser mantida sob refrigerao at o momento das anlises que devem serrealizadas o mais rpido possvel. Todo o material a ser utilizado em anlises microbiolgicas deve estarrigorosamente limpo e esterilizado.

Planos de amostragem

Pode-se trabalhar com amostra indicativa ou com amostra representativa, sendo a primeira quelacomposta por um nmero de unidades amostrais inferiores ao estabelecido em plano de amostralconstante na legislao especfica.A amostra representativa aquela constituda por um determinado nmero de unidades amostraisestabelecidos de acordo com o plano de amostragem determinado em legislao. Assim, para amostrasrepresentativas, estabelecida, no caso do leite fludo, a colheita aleatria de 5 (cinco) amostras domesmo lote deve-se utilizar os quadros 1, 2, 3,4 e 5 conforme o microrganismo analisado e quandotratar-se de amostra indicativa utilizar o valor de m constantes nestes mesmos quadros como padromicrobiolgico aceitvel.

Preparo das diluies das amostras

A partir da amostra integral, prepara-se a diluio -1pipetando-se 1ml de leite em 9ml de soluo salina0,85%; a partir da diluio 10 -1(1:10) prepara-se as diluies necessrias, 10 -2(1:100), 10 -3(1:1000), eassim sucessivamente transferindo 1ml da amostra para tubos contendo 9ml de soluo salina a 0,85%,sempre homogeneizando.

Figura: Preparo das diluies (Adaptado de Ferreira, M Aguiar, Dossi Tcnico - Anlises Microbiolgicas para Qualidade do Leite Fludo, disponvel em:

http://www.sbrt.ibict.br).
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CONTAGEM PADRO EM PLACAS (AERBIOS MESFILOS)

Princpio

Determina o nmero de microrganismos viveis presentes no leite sendo que altas contagens no leitecru podem indicar falhas de higiene na obteno e comprometimento da qualidade; no produto finalindica falhas no beneficiamento e comprometimento da vida de prateleira do produto; ainda precisoatentar-se para o fato de que em alimentos, todas as bactrias patognicas em alimentos so mesfilas.

Procedimento

Distribuir 1 ml de cada diluio no centro de placas de Petri estreis e identificadas em duplicatas(Figura 3), e adicionar a cada placa 10 ml de gar Padro para Contagem (PCA), previamente fundido emantido a 45C; homogeneza-se cuidadosamente e, aps a solidificao, incuba-se as placas invertidasa 35 1C / 48 horas (Figuras 4 e 5).Para a contagem escolhe-se o par de diluies que apresentou crescimento de 25 a 250 colnias,multiplicando a mdia do nmero de colnias contadas pelo fator de diluio correspondente eexpressando o nmero de unidades formadoras de colnias (UFC) por ml de leite.

Exemplo: se o par de diluies selecionado para contagem foi o correspondente a diluio 10-2 (1:100)e as placas apresentaram crescimentos de 150 e 148 colnias, deve-se calcular a mdia destas placas=>150 + 148 = 298 / 2 = 149; em seguida deve-se converter o resultado para 1ml, ou seja, retornar ao fatorde diluio: 149 x 100 = 14900 UFC/ml que ser o resultado final da contagem de aerbios mesfilos.

Crescimento de aerbios mesfilos em gar Padro para Contagem (Adaptado de Ferreira, M Aguiar, Dossi Tcnico - Anlises Microbiolgicas paraQualidade do Leite Fludo, disponvel em:http://www.sbrt.ibict.br).
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Esquema representando a semeadura em duplicata de cada diluio (Adaptado de Ferreira, M Aguiar, Dossi Tcnico - Anlises Microbiolgicas paraQualidade do Leite Fludo, disponvel em:http://www.sbrt.ibict.br).

Figura: Esquema de semeadura e crescimento de aerbios mesfilos (Adaptado de Ferreira, M Aguiar, Dossi Tcnico - Anlises Microbiolgicas paraQualidade do Leite Fludo, disponvel em:http://www.sbrt.ibict.br).

Quadro 1. Critrios microbiolgicos para aerbios mesfilos em leite fludo.

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NMERO MAIS PROVVEL DE COLIFORMES 30/35C (NMP)

Princpio

A presena destes microrganismos em contagens acima dos padres estabelecidos indica contaminaoambiental e possvel presena de microrganismos patognicos; quando em leite beneficiado podeindicar falhas no processamento trmico (pasteurizao) e/ou recontaminao.

Procedimento:

Utilizam-se as diluies previamente preparadas; semear 1 ml em trs sries de trs tubos,utilizando asdiluies 100, 10-1 e 10-2 em Caldo Verde Brilhante Bile 2% Lactose (CVBL), contendo tubos defermentao (Durham) obtendo-se ao final, nove tubos semeados; homogeneza-se cuidadosamente eincuba-se a 35C 1 por 24 a 48 horas.

A leitura dos tubos positivos (turvao do meio e presena de gs nos tubos de Durham) em cada umadas trs sries de trs tubos feita em 24 horas e 48 horas (figura 7). Calcula-se o NMP/ml, utilizando-sea tabela conforme Anexo III da Instruo Normativa 62/2003 para verificar se o produto encontra-sedentro dos padres estabelecidos (Quadro2).

Semeadura para coliformes totais em CVLB em triplicata e Resultado positivo para coliformes totais em CVBL com turvao e formao de gs nos tubos deDurham (Adaptado de Ferreira, M Aguiar, Dossi Tcnico - Anlises Microbiolgicas para Qualidade do Leite Fludo, disponvel em:http://www.sbrt.ibict.br).


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Quadro 2. Critrios microbiolgicos para Coliformes totais ou Coliformes a 30/35oC em leite fludo.


NMERO MAIS PROVVEL DE COLIFORMES TERMOTOLERANTES A 45C (NMP)

Princpio

Altas contagens destes microrganismos indicam condies sanitrias inadequadas devido presena dematria fecal e a possvel presena de enteropatgenos, sendo inaceitvel em alimentos e indicadoresde graves falhas de higiene; ainda o consumo de alimentos com altas contagens pode significar riscos detoxinfeo, pois o principal representante a bactria Escherichia coli que pode causar doenas severasnos seres humanos.

Procedimento

A partir de cada um dos tubos positivos no NMP de coliformes totais, semear uma a duas aladas emtubo contendo caldo EC e em tubo contendo caldo Triptona; incubar ambos a 44,5C ( 0,5C), por 24-48

horas em banho-maria com agitao; aps a incubao verificar:

a) Fermentao da lactose com presena de gs nos tubos de Durham.b) Teste da presena do Indol: adiciona-se ao tubo com caldo triptona, 0,3ml de reativo de Kovacs; oaparecimento de colorao vermelho-escura na camada representa uma reao positiva (Figura 8).Considera-se como coliforme a 45C quando ambas as provas apresentarem resultados positivos.Calcular o NMP de coliformes a 45C atravs do nmero de tubos confirmados e verificar se o produtoencontra-se dentro dos padres estabelecidos (Quadro 3).
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Quadro 3. Critrios microbiolgicos para Coliformes termotolerantes ou a 45C em leite fludo.


Resultados positivos para coliformes termotolerantes no caldo EC com formao do anel vermelho (A) e formao de gs em tubo de Durham no caldotriptona (B) (Adaptado de Ferreira, M Aguiar, Dossi Tcnico - Anlises Microbiolgicas para Qualidade do Leite Fludo, disponvel em:

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CONTAGEM DE MICRORGANISMOS PSICROTRFICOS

Princpio

Microrganismos psicrotrficos so aqueles que crescem sob temperaturas de refrigerao,extremamente deteriorantes, pois produzem enzimas denominadas de termoestveis, ou seja, resistemao tratamento trmico da pasteurizao e at ultra alta temperatura permanecendo, portanto no leite e

derivados mesmo aps a destruio dos microrganismos; estas enzimas degradam as gordurasprovocando o sabor e o odor de rano, e degradam tambm as protenas do leite diminuindo o valornutricional e resultando em prejuzos para a indstria e para o consumidor.
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Aspecto de leite com fermentao natural sem contaminao por microrganismos deteriorantes (A) e com fermentao por microrganismos psicrotrficos(B) (Adaptado de Ferreira, M Aguiar, Dossi Tcnico - Anlises Microbiolgicas para Qualidade do Leite Fludo, disponvel em:http://www.sbrt.ibict.br).

Procedimento

As trs diluies selecionadas devem ser semeadas em gar padro para contagem (PCA) previamentedistribudo nas placas (aproximadamente 15 ml), utilizando o plaqueamento em superfcie com auxliode ala de Drigalsky espalhando todo o inculo por toda a superfcie do meio at que todo o excesso delquido seja absorvido. O volume a ser semeado de cada diluio de 0,1ml, tambm em duplicata e aincubao deve ser em temperatura baixa que pode ser de 7C/10dias, de 18C/45 horas ou de21C/25horas com as placas invertidas. Para a contagem, deve-se seguir o mesmo procedimentoutilizado para aerbios mesfilos, porm multiplicar o resultado por 10 (dez) para levar em conta ovolume dez vezes menor inoculado no plaqueamento em superfcie. O nmero de psicrotrficos nodeve exceder a 10% do total de aerbios mesfilos.

CONTAGEM DE Staphylococcus COAGULASE POSITIVA (*)

Princpio

A contagem de estafilococos coagulase positiva pode ser feita com dois objetivos, sendo um relacionado sade pblica para confirmar o envolvimento desta bactria em surtos de intoxicao alimentar, eoutro com o controle da qualidade higinico sanitria do processo de produo do leite e derivados, eneste caso da bactria serve como indicador de manipulao inadequada e falhas na higienizao deequipamentos.

Procedimento

Utiliza-se o meio gar Baird-Parker (IN 62/2003). Antes de o uso fundir e resfriar a 50C; adicionar paracada litro do meio base 50 ml de emulso de gema de ovo a 50% e 3 ml de soluo aquosa de telurito de

potssio a 3,5% esterilizada por filtrao; homogeneizar bem e distribuir em placas, submetendo testede esterilidade (incubar a 35C/24h); o plaqueamento deve ser por superfcie inoculando-se 0,1ml decada diluio selecionada, inclusive 0,1ml da amostra integral (sem diluio); incubar as placasinvertidas a 36C 1 por 30-48 horas; selecionar placas que contenham entre 10-150 colnias; contar as


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colnias tpicas, negras brilhantes com anel opaco, rodeado por um halo claro transparente,destacando-se sobre a opacidade do meio; contar tambm as colnias atpicas, acinzentadas ou negrasbrilhantes sem halo ou com apenas um dos halos.

Crescimento de colnias tpicas de estafilococos em gar Baird-Parker (Adaptado de Ferreira, M Aguiar, Dossi Tcnico - Anlises Microbiolgicas paraQualidade do Leite Fludo, disponvel em:http://www.sbrt.ibict.br).

Aps a seleo de 3-5 colnias tpicas e atpicas de cada placa, semear em tubos contendo caldocrebro-corao (BHI), incubados a 35C por 24 horas; a partir deste caldo deve-se efetuar a prova parapesquisa da presena de coagulase.Para a pesquisa da presena de coagulase deve-se transferir 0,2 ml de cultivo para tubos contendo

0,5ml de plasma de coelho oxalatado; incubar a 35C por 6 horas e verificar a presena de coagulao(reao positiva); quando negativa reincubar at 12 horas.

Prova da coagulase para estafilococos sendo A um resultado positivo (coagulao) e B negativo. (Adaptado de Ferreira, M Aguiar, Dossi Tcnico - AnlisesMicrobiolgicas para Qualidade do Leite Fludo, disponvel em:http://www.sbrt.ibict.br).

(*) a IN 51/2002 no prev a contagem de estafilococos coagulase positiva em leite fludo, mas sim, nos derivados do leite.

DETECA DE PRESENA/AUSNCIA DE SALMONELLA SPP.

Princpio

obrigatria a anlise para deteco de salmonella spp. no leite j que a mesma responsvel pordiversos surtos de doenas de origem alimentar; a bactria S. Typhi e a paratifoide so, normalmente,septicmicas e produzem febre tifoide ou doenas semelhantes em seres humanos; outras formas desalmoneloses produzem sintomas mais brandos; os sintomas caractersticos de doenas alimentarescausadas por Salmonella incluem diarreia, nusea, dor abdominal, febre e at vmitos, dores de cabeae fraqueza; a infeco geralmente dura de 2 a 7dias.
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Procedimento

Adicionar 25 ml da amostra em 225 ml de caldo lactosado (pr-enriquecimento) e manter emtemperatura de 35C/18-24h; aps esta fase de pr-enriquecimento, transferir 1,0mL para 10,0mL decaldo tetrationato (TT) e 1,0mL para 10,0mL de caldo selenito cistina (SC) incubando ambos a35C/24h0, que corresponder fase de enriquecimento seletivo; aps esta fase deve-se proceder aoplaqueamento diferencial em meios de cultura especficos e para isso deve-se inocular uma alada docaldo TT em placas contendo gar entrico de Hektoen (HE), gar bismuto sulfito (BS) e gar xilose lisinadesoxiciolato (XLD); repetir esse procedimento com o caldo SC e incubar todas as placas invertidas a35C/24he verificar se h desenvolvimento de colnias tpicas de Salmonella.Para identificar as colnias tpicas devem-se observar as morfologias desenvolvidas nos meios decrescimento:

- gar HE: colnias transparentes verde-azuladas com ou sem centro preto;- gar BS: colnias marrons ou pretas com ou sem brilho metlico;- gar XLD: colnias transparentes, cor de rosa escuro, com ou sem centro preto.

Meios de cultura utilizados no plaqueamento diferencial e crescimento de Salmonella. (Adaptado de Ferreira, M Aguiar, Dossi Tcnico - AnlisesMicrobiolgicas para Qualidade do Leite Fludo, disponvel em:http://www.sbrt.ibict.br).

Quando presentes, pelo menos duas colnias tpicas devero ser semeadas em gar Lisina Ferro (LIA) e

gar Trplice Acar Ferro (TSI), incubados a 35 C/ 24h, e verificando-se reao tpica para Salmonella(Figura 14). Para a identificao das culturas positivas podem ser submetidas ao kit API 20E para deSalmonella ou realizarem-se as provas bioqumicas tradicionais. Deve-se ter de Salmonella spp. em leitefludo.


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Confirmao preliminar de colnias tpicas de Salmonella em LIA e TSI. (Adaptado de Ferreira, M Aguiar, Dossi Tcnico - Anlises Microbiolgicas paraQualidade do Leite Fludo, disponvel em:http://www.sbrt.ibict.br).


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BIBLIOGRAFIA

INSTITUTO ADOLFO LUTZ, So Paulo. Normas analticas do Instituto Adolfo Lutz. So Paulo, 2005, 371p.

ROSSI, ELIZEU ANTONIO, Prticas de anlise e processamento de leite: material didtico destinado saulas prticas da disciplina de tecnologia de laticnios -1 edio. - Araraquara: [s.n.], c2010. 1 CD-ROM; 4 3/4pol.

Instruo Normativa No. 62/2004. Oficializa os Mtodos Analticos Oficiais para Anlises Microbiolgicaspara Controle de Produtos de Origem Animal e gua. Disponvel em:http://extranet.agricultura.gov.br/sislegisconsulta/consultarLegislacao.do?operacao=visualizar&id=28

Ferreira, M Aguiar, Dossi Tcnico - Anlises Microbiolgicas para Qualidade do Leite Fludo, Centro de

Apoio ao Desenvolvimento Tecnolgico da Universidade de Braslia CDT/UnB, 2007, disponvel em:http://www.respostatecnica.org.br/dossie-tecnico/downloadsDT/NjM=
http://extranet.agricultura.gov.br/sislegisconsulta/consultarLegislacao.do?operacao=visualizar&id=28http://www.respostatecnica.org.br/dossie-tecnico/downloadsDT/NjM=http://www.respostatecnica.org.br/dossie-tecnico/downloadsDT/NjM=http://www.respostatecnica.org.br/dossie-tecnico/downloadsDT/NjM=http://extranet.agricultura.gov.br/sislegisconsulta/consultarLegislacao.do?operacao=visualizar&id=28

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