i

CRISTIANE BARBOSA LOPES

ANÁLISE DA IMUNOEXPRESSÃO DE MARCADORES VASCULARES E DA PRESENÇA DE

MASTÓCITOS EM GRANULOMAS E CISTOS PERIRRADICULARES INFLAMATÓRIOS E EM

CISTOS RESIDUAIS

2017

Programa de Pós-Graduação em Odontologia Av. Alfredo Baltazar da Silveira, 580, cobertura

22790-710 – Rio de Janeiro, RJ Tel. (0XX21) 2497-8988

ii

CRISTIANE BARBOSA LOPES

ANÁLISE DA IMUNOEXPRESSÃO DE MARCADORES VASCULARES E DA PRESENÇA DE MASTÓCITOS EM

GRANULOMAS E CISTOS PERIRRADICULARES INFLAMATÓRIOS E EM CISTOS RESIDUAIS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Odontologia da Universidade Estácio de Sá, como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Odontologia (Endodontia).

ORIENTADOR: Prof. Dr. Fábio Ramôa Pires

UNIVERSIDADE ESTÁCIO DE SÁ

RIO DE JANEIRO 2017

iii

DEDICATÓRIA

Dedico esta Dissertação ao meu marido Alexandre e à minha mãe,

Amélia.

iv

AGRADECIMENTOS

Agradeço demais ao meu marido Alexandre, que está sempre ao meu

lado, pronto a ajudar. Não mede esforços para realizar meus desejos. Pessoa

maravilhosa, que muito me orgulha. Obrigada!

À minha querida mãe (in memoriam), que está sempre em meus

pensamentos. Amor eterno. Que falta a senhora me faz.

Aos Professores Drs. José Siqueira, Fábio Ramôa, Flávio Alves, Luciana

Armada, Isabela Rôças, Lúcio Gonçalves, Hélio Lopes, Mônica Neves, José

Provenzano, Dennis Carvalho e Fábio Vidal pelos valiosos ensinamentos,

carinho e muita paciência durante o curso. Muito obrigada pelo curso de

excelência que os senhores me proporcionaram.

Às minhas amigas muito queridas, que estiveram comigo em bons e

maus momentos, dentro e fora do PPGO, Kátia Azevedo, Rosana Ribeiro,

Poliana de Jesus, Taís Teixeira, Fernanda Neder, Ana Carolina Saldanha e

Márcia Franzoni. Amo vocês, meninas.

Aos meus estimados colegas e queridos Gaya Carolina, Alejandro

Pérez, Sara Gabriela, Marília Lemos, Pâmela Lotti, Bernardo Matos, Andréa

Campello, Simone Loyola, Mayana Pacheco, Isbelia Gazzaneo, Juan Pacheco,

Gabriel Leite, Natália Freire e Maria Joana. Obrigada pela agradável

companhia de todos vocês. Vocês tornaram esse curso muito especial e

divertido.

Ao meu orientador Professor Dr. Fábio Ramôa Pires, que exerceu seu

papel de forma irretocável. Profissional e mestre de tamanha grandeza, com

v

vasto conhecimento e sempre acessível. Foi uma enorme honra ter sido sua

orientanda. Muito obrigada!

Às minhas queridas Renata Val, Sabrina Brasil e Marília Marceliano-

Alves, que sempre me incentivaram muito. Exemplos a serem seguidos.

À Angélica Pedrosa, meu obrigada pelo apoio durante todo o curso.

À minha família e a todos que, direta ou indiretamente, contribuíram e

torceram para que eu me tornasse uma mestra em endodontia.

A Deus, por tudo.

vi

ÍNDICE

RESUMO vii

ABSTRACT viii

LISTA DE TABELAS ix

1 INTRODUÇÃO 1

2 REVISÃO DE LITERATURA 3

3 JUSTIFICATIVA 19

4 HIPÓTESE 20

5 PROPOSIÇÃO 21

6 MATERIAIS E MÉTODOS 22

7 RESULTADOS 26

8 DISCUSSÃO 34

9 CONCLUSÕES 37

10 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 38

11 ANEXO 43

vii

RESUMO

Objetivo. Comparar a imunoexpressão dos marcadores vasculares CD34,

ICAM-1 e podoplanina e a presença de mastócitos em granulomas e cistos

perirradiculares e em cistos residuais, correlacionando os achados com dados

clínicos, demográficos, radiográficos e histológicos. Materiais e Métodos.

Foram selecionadas 31 lesões (5 granulomas e 15 cistos perirradiculares e 11

cistos residuais). Lâminas silanizadas contendo cortes de parafina foram

utilizadas para a realização das reações imunoistoquímicas. A análise das

imagens foi feita utilizando um microscópio óptico e os dados foram analisados

tendo como significância o valor de p<0.05 (5%). Resultados. Os cistos

apresentaram epitélio atrófico em 11 casos (35,5%) e hiperplásico em 15 casos

(48,8%) (p=0.452). A intensidade do infiltrado inflamatório foi semelhante

quando comparados os 3 grupos (p=0.452). A expressão de CD34 e de

podoplanina e a presença de mastócitos foram semelhantes quando

comparados os 3 grupos, mas a expressão de ICAM-1 foi mais intensa em

granulomas perirradiculares do que nos cistos (p=0.026). Não foram

observadas diferenças relacionadas à expressão dos marcadores de acordo

com a intensidade do infiltrado inflamatório. Conclusões. Não foram

observadas diferenças na expressão de CD34 e de podoplanina e na presença

de mastócitos quando comparados os 3 grupos e a expressão de ICAM-1

diminuiu com a evolução das lesões perirradiculares inflamatórias.

Palavras-chave: CD34; Cisto periapical; Cisto residual; Granuloma periapical;

ICAM-1; Mastócitos; Podoplanina.

viii

ABSTRACT

Aim. To compare the immunoexpression of vascular markers CD34, ICAM-1

and podoplanin and the presence of mast cells in periapical granulomas,

radicular cysts and residual cysts, comparing the findings with clinical,

demographic, radiological and histological features. Materials and Methods.

Thirty-one lesions (5 granulomas, 15 radicular and 11 residual cysts) were

selected. Silanized slides containing paraffin sections were used for the

immunohistochemical reactions. The analysis of the images was performed by

using an optical microscope and data were analyzed with 5% significance (p

<0.05). Results. Cysts presented atrophic and hyperplastic epithelium in 11

(35.5%) and 15 cases (48.8%), respectively (p=0.452). The intensity of the

inflammatory infiltrate was similar when comparing the three groups (p=0.452).

CD34 and podoplanin expression and the presence of mast cells were similar

when comparing the three groups; ICAM-1 expression was more intense in

granulomas than cysts (p=0.026). There were no statistically significant

differences associated with the expression of the evaluated markers according

with the intensity of the inflammatory infiltrate. Conclusions. There were no

differences in the expression of CD34 and podoplanin and in the presence of

mast cells when the 3 groups were compared; ICAM-1 expression decreased

with the evolution of the periapical inflammatory lesions.

Keywords: CD34; Periapical cyst; Residual cyst; Periapical granuloma; ICAM-

1; Mast cells; Podoplanin.

ix

LISTA DE TABELAS

Tabela 1.

Distribuição dos parâmetros clínicos e demográficos por grupo

diagnóstico...................................................................................

27

Tabela 2.

Distribuição dos parâmetros histológicos por grupo

diagnóstico...................................................................................

28

Tabela 3. Distribuição da expressão dos marcadores imunoistoquímicos

por grupo diagnóstico..................................................................

30

Tabela 4.

Distribuição da expressão dos marcadores imunoistoquímicos

de acordo com a intensidade do infiltrado

inflamatório..................................................................................

33

1

1 INTRODUÇÃO

A etiologia das lesões perirradiculares está associada aos processos de

inflamação, necrose e infecção do sistema de canais radiculares e aos

processos de defesa do hospedeiro em resposta a essa agressão, incluindo as

respostas imunes inata e adaptativa (ROÇAS et al., 2015). Os produtos

deletérios derivados da invasão microbiana aos canais radiculares podem

extravasar para o periápice e, associados às defesas do hospedeiro, podem

causar destruição tecidual, gerando as lesões perirradiculares inflamatórias

(NAIR, 2004).

Os granulomas e os cistos perirradiculares e os cistos residuais são

exemplos de lesões perirradiculares inflamatórias crônicas, as quais podem

apresentar diferentes padrões de infiltração inflamatória, assim como de

vascularização. São caracterizados pela presença de um componente

inflamatório predominantemente crônico que é acompanhado por mecanismos

de reparo tecidual, conforme a evolução do quadro. Acredita-se que os

fenômenos vasculares, incluindo a angiogênese, são essenciais para a

iniciação, a progressão e o desenvolvimento das lesões perirradiculares

inflamatórias (ZIZZI et al., 2012).

Existem evidências de que a expressão de marcadores vasculares

possa estar relacionada ao padrão inflamatório e de progressão das lesões

perirradiculares inflamatórias. A proteína CD34 é um marcador celular

endotelial que atua como molécula de adesão em células endoteliais e em

células progenitoras hematopoiéticas e que participa do processo de

2

angiogênese, já tendo sido demonstrada correlação positiva entre a sua

expressão e a intensidade do infiltrado inflamatório em cistos perirradiculares

inflamatórios (ZIZZI et al., 2012). A molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1)

é um receptor de adesão expresso em células endoteliais vasculares e em

células T, que já foi demonstrado em cistos perirradiculares inflamatórios

(BANDO et al., 1993). A podoplanina é uma glicoproteína transmembrana já

descrita em tecidos associados a odontogênese e que tem sido associada a

expansão local e ao desenvolvimento de lesões odontogênicas neoplásicas e

reativas (ZUSTIN et al., 2010). Os mastócitos têm sido descritos como

essenciais para o desenvolvimento, crescimento e expansão das lesões

perirradiculares inflamatórias e são essenciais nas respostas imunes imediata e

tardia, estando presentes no infiltrado inflamatório dos cistos perirradiculares

(BRACKS et al., 2014).

Existem poucos estudos na literatura voltados especificamente para a

avaliação da imunoexpressão de marcadores vasculares em lesões

perirradiculares inflamatórias crônicas. Ainda não foram demonstradas

evidências científicas que relacionem a expressão desses marcadores e da

presença de mastócitos em lesões com diferentes perfis histológicos e

inflamatórios, incluindo granulomas e cistos perirradiculares e cistos residuais,

com os dados clínicos, demográficos e radiográficos de cada uma dessas

entidades.

3

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Lesões perirradiculares Inflamatórias

As lesões perirradiculares inflamatórias, também conhecidas como

lesões periapicais ou periodontites apicais, são condições inflamatórias

associadas à infecção polimicrobiana e consequente necrose do sistema de

canais radiculares e sua extensão aos tecidos perirradiculares. O termo

perirradicular é mais adequado por abranger não somente as lesões mais

comuns, presentes na região periapical, mas também as lesões inflamatórias

que afetam a porção lateral da raiz ou a região de furca (RÔÇAS et al., 2015).

Essas lesões podem ser crônicas (por exemplo, cistos, granulomas e

abscessos crônicos) ou agudas (por exemplo, abscessos ou celulites) e

representam aproximadamente 90% de todas as lesões perirradiculares.

Granulomas e cistos são as lesões perirradiculares inflamatórias mais comuns

(LIN et al., 2010, KOIVISTO et al., 2012). Cabe ressaltar que nem todas as

lesões que surgem em associação com a porção perirradicular tem etiologia

inflamatória (PONTES et al., 2014; PIRES, 2015).

Em alguns casos, a lesão perirradicular pode se desenvolver mesmo

antes que os processos de necrose e infecção tenham atingido o forame apical.

O desenvolvimento das lesões perirradiculares está relacionado com as

respostas imunes inata e adaptativa contra a infecção intrarradicular, na

tentativa de conter a propagação da infecção ao osso e a outros locais do

corpo (RÔÇAS et al., 2015). No processo evolutivo das lesões perirradiculares

crônicas, inicialmente a polpa dentária se torna necrosada e infectada pela

4

comunidade microbiana oriunda desse processo de invasão. Este quadro

inflamatório estende-se à região perirradicular, causando destruição tecidual

que inicia-se no ligamento periodontal. O ambiente endodôntico fornece um

habitat seletivo para o estabelecimento de uma microbiota mista,

predominantemente anaeróbica (RÔÇAS et al., 2015).

Coletivamente, essa comunidade polimicrobiana adaptada ao habitat

residente no canal radicular tem várias propriedades biológicas e patogênicas,

como antigenicidade, atividade mitogênica, quimiotaxia, histólise enzimática e

ativação das células de defesa hospedeiras (NAIR, 2004). Com a invasão

microbiana, os produtos deletérios produzidos podem extravasar para o

periápice e, em resposta, o hospedeiro expressa uma série de mecanismos de

defesa que consistem na ativação de vários tipos celulares, sinalizadores

intercelulares, anticorpos e moléculas efetoras. O balanço entre os fatores de

agressão microbiana e as defesas do hospedeiro causam destruição do tecido

perirradicular e produzem os diversos tipos de lesões perirradiculares.

Apesar da eficiência dos processos de defesa, o organismo não é capaz

de combater completamente a agressão microbiana presente nos canais

radiculares necróticos, determinando o curso crônico da maioria destas lesões

(NAIR, 2004). Dessa forma, as lesões perirradiculares inflamatórias devem ser

tratadas com o controle da infecção dos canais radiculares e com a prevenção

da reinfecção do sistema de canais. O sucesso do tratamento endodôntico

depende da redução da comunidade microbiana presente, entretanto, devido à

complexidade da anatomia do sistema de canais radiculares, a erradicação

completa de todos os microrganismos é pouco provável.

5

O objetivo, na maioria das vezes, é reduzir a população microbiana a um

nível suficiente para que a inflamação periapical seja contida. Se o dente puder

ser preservado, o tratamento endodôntico é a terapia de escolha; dentes sem

possibilidades restauradoras devem ser extraídos junto com a remoção dos

tecidos perirradiculares afetados (SIQUEIRA Jr, 2011; RÔÇAS et al., 2015).

2.2 Granuloma perirradicular

O granuloma perirradicular é a doença perirradicular crônica mais

comum e estima-se que esta entidade represente mais da metade de todas as

lesões perirradiculares inflamatórias (RÔÇAS et al., 2015). Os granulomas

perirradiculares acometem de forma semelhante homens e mulheres e

apresentam predileção por adultos (KOIVISTO et al., 2012). Geralmente, os

granulomas são assintomáticos e estão via de regra associados a dentes com

testes de sensibilidade pulpar negativos, uma vez que a polpa encontra-se

necrosada (exceção pode ocorrer caso existam pequenos canais colaterais que

ainda contenham tecido pulpar vital). Os testes de percussão e palpação

habitualmente são negativos, mas os pacientes podem, em raras ocasiões,

relatarem sensibilidade (RÔÇAS et al., 2015).

O principal elemento de diagnóstico para o granuloma é a radiografia

periapical, na qual verifica-se a presença de uma área radiolúcida associada ao

ápice radicular ou lateralmente à raiz (quando associado a um forame lateral),

em continuidade com o ligamento periodontal, bem circunscrita, com perda da

integridade da lâmina dura do osso alveolar. A radiolucidez perirradicular deve-

se à reabsorção óssea, com consequente perda de densidade do osso e

6

substituição por um tecido de granulação. Os dentes usualmente apresentam

indícios clínicos de comprometimento pulpar, tais como cáries e/ou

restaurações extensas ou mesmo exposição clínica da polpa. O tratamento

indicado é o tratamento endodôntico convencional, eventualmente associado a

cirurgias perirradiculares (RÔÇAS et al., 2015).

Do ponto de vista histológico, o granuloma é constituído, basicamente,

de um tecido conjuntivo fibroso permeado por um infiltrado inflamatório

predominantemente crônico, associado a elementos de reparação, substituindo

o osso reabsorvido. Na periferia, circunscrevendo a lesão, encontra-se uma

cápsula composta basicamente por fibras colágenas. As células inflamatórias

compreendem cerca de 50% dos elementos da lesão, sendo que os

macrófagos predominam, seguidos em ordem decrescente por linfócitos,

plasmócitos, neutrófilos e mastócitos. Fendas negativas de cristais de

colesterol, corpúsculos de Russel e áreas focais de abscesso podem ser

visualizados em algumas lesões (NEVILLE et al., 2014; RÔÇAS et al., 2015).

2.3 Cisto perirradicular

Os cistos perirradiculares são lesões císticas inflamatórias dos maxilares

associadas à porção perirradicular de dentes com polpas necróticas e

infectadas, sendo considerados os cistos odontogênicos mais frequentes

(SANTOS et al., 2011; JOHNSON et al., 2013). O termo cisto é derivado da

palavra grega Kystis, que significa saco ou bexiga. Muito embora acredite-se

que sejam menos comuns que os granulomas perirradiculares, como o

diagnóstico preciso destas duas entidades só pode ser obtido por meio de

7

análise histológica, é possível que estas diferenças reflitam apenas a

frequência com que elas são diagnosticadas em laboratórios de Patologia

Bucal e não necessariamente sua frequência real (TAVARES et al., 2017). Os

cistos perirradiculares, assim como os granulomas, não mostram predileção

por gênero ou têm discreta predileção pelas mulheres e acometem

habitualmente pacientes adultos (BORGES et al., 2012; KOIVISTO et al., 2012;

ALCANTARA et al., 2013).

Os cistos perirradiculares originam-se de granulomas pré-existentes que

tornaram-se epiteliados em virtude do estímulo inflamatório e da proliferação

dos restos epiteliais de Malassez quiescentes do ligamento periodontal (NAIR,

1998). Assim, embora nem todo granuloma necessariamente progrida para um

cisto, estes últimos necessariamente evoluem de um granuloma prévio.

Mantida a causa, que é a infecção situada no interior do sistema de canais

radiculares, o quadro inflamatório persiste, as células epiteliais proliferam na

forma de ninhos e há o surgimento de cavidades no interior destas áreas de

proliferação epitelial, dando origem ao lúmen cístico. Tal mecanismo sugere

que este tipo de lesão é resultado de uma infecção endodôntica de longa

duração (NAIR, 2004; LIN et al., 2007).

Em relação ao diagnóstico, os achados dos exames são similares aos

do granuloma, uma vez que o cisto é oriundo deste. Na maioria das vezes, o

cisto perirradicular é assintomático e os testes de sensibilidade pulpar

geralmente apresentam resultados negativos (assim como nos granulomas),

uma vez que a polpa encontra-se necrosada; os testes de percussão e

palpação, são habitualmente negativos. Os achados radiográficos podem ser

8

idênticos aos dos granulomas perirradiculares, fazendo com que essas duas

entidades sejam indistinguíveis radiograficamente. Acredita-se, entretanto que

como os cistos perirradiculares derivam dos granulomas, apresentem tamanho

médio maior que estes últimos (RÔÇAS et al., 2015).

Histologicamente, os cistos perirradiculares consistem em uma cavidade

patológica que contém material fluido ou semissólido, composto principalmente

por células epiteliais degeneradas, células inflamatórias e hemorragia. Esta

cavidade é revestida por epitélio pavimentoso estratificado não queratinizado

de espessura variável (NEVILLE et al., 2014).

O cisto perirradicular pode ser classificado como “verdadeiro” ou “em

bolsa” (ou “baía"), dependendo da relação da loja cística com o canal radicular

via forame apical ou lateral. Se a loja cística está imediatamente contígua ao

canal, ele é conhecido como cisto “em bolsa” ou cisto “baía”. Se a loja cística

não tem qualquer contato com a luz do canal, sendo completamente envolvida

por epitélio, o cisto é conhecido como “verdadeiro” (NAIR, 2004).

Em contato com o epitélio, há um tecido de granulação que, à

semelhança do granuloma, é constituído de macrófagos, linfócitos,

plasmócitos, neutrófilos, fibroblastos, mastócitos e vasos neoformados.

Eventualmente, fendas negativas de cristais de colesterol, corpúsculos de

Russel e corpúsculos de Rushton podem ser observados. Mais externamente,

encontra-se uma cápsula de tecido conjuntivo denso, composta basicamente

de colágeno e que separa a lesão do osso (NEVILLE et al., 2014).

Existe a crença de que os cistos perirradiculares não regridem após a

terapia endodôntica, ao contrário dos granulomas. Contudo, por serem

9

considerados um espectro, evidências científicas atuais não sustentam esta

afirmativa. O tratamento dos cistos incluiu, à semelhança com os granulomas,

o tratamento endodôntico eventualmente associado à cirurgia perirradicular

(SIQUEIRA Jr, 2011; RÔÇAS et al., 2015).

2.4 Cisto residual

Quando um elemento dentário associado a um cisto perirradicular

inflamatório é extraído, mas a lesão cística associada não é removida, este

cisto remanescente é chamado cisto residual (NEVILLE et al., 2014).

Apresenta-se habitualmente como uma área radiolúcida bem delimitada por um

halo de esclerose óssea, de formato circular a oval, tamanho variável, no

interior do processo alveolar em um sítio de extração prévia. Alguns cistos

residuais podem mostrar áreas centrais de calcificação, as quais derivam da

degeneração dos constituintes celulares no lúmen cístico, com ocasional

calcificação distrófica.

Histologicamente os cistos residuais são semelhantes aos cistos

perirradiculares inflamatórios, mas habitualmente apresentam infiltrado

inflamatório menos intenso (MARTINS et al., 2017). Acredita-se que estes

cistos possam involuir, estabilizar ou continuar crescendo mesmo após a

exodontia dos elementos associados à lesão. Como outras lesões do complexo

maxilo-mandibular podem apresentar imagem radiográfica semelhante, o

habitual é indicar sua remoção cirúrgica para confirmação diagnóstica e

exclusão de outras possibilidades de diagnóstico (NEVILLE et al., 2014).

10

2.5 Vascularização das lesões perirradiculares inflamatórias

Nas etapas iniciais do processo inflamatório, após a injúria tecidual e o

reconhecimento de microrganismos por células fagocitárias e pelo sistema

complemento, substâncias indutoras de vasodilatação são liberadas

inicialmente em arteríolas. Posteriormente, há um aumento da pressão

sanguínea nos vasos e ocorre uma hiperemia, com um maior aporte de sangue

no local da lesão. Esse aumento da pressão sanguínea causa um aumento na

transudação de fluidos com baixo conteúdo proteico na vascularização capilar

(SIQUEIRA Jr, 2011).

Em seguida, a resposta inflamatória continua com o aumento da

permeabilidade vascular induzido por mediadores químicos liberados na área

da injúria, permitindo que o exsudato, que é um fluido rico em proteínas, saia

do vaso para o compartimento extravascular. Com isso, há um aumento da

viscosidade sanguínea e uma diminuição do fluxo sanguíneo. O exsudato no

espaço extravascular, chamado de edema, leva a um aumento da pressão

hidrostática tecidual, causando aumento de volume e dor, que são dois dos

cinco sinais cardinais da inflamação (dor, rubor, calor, tumor e perda de

função); esse exsudato permite o acúmulo de proteínas plasmáticas envolvidas

na defesa do hospedeiro (SIQUEIRA Jr, 2011).

Com a diminuição do fluxo sanguíneo, associada a vasodilatação e a

grande perda de fluidos pela exsudação, ocorre a estase vascular e,

consequentemente, o aumento da concentração de elementos figurados do

sangue (hemoconcentração), levando a um aumento da sua viscosidade.

Ocorre, então, a marginação leucocitária, que significa que os neutrófilos

11

polimorfonucleares deixam suas posições centrais nos vasos e tomam uma

posição mais periférica, próxima ao revestimento endotelial (SIQUEIRA Jr &

SABOIA-DANTAS, 2000).

A expressão de moléculas de adesão, que vão mediar a ligação dos

leucócitos circulantes à parede dos vasos nas células endoteliais das vênulas,

é induzida por citocinas como a interleucina-1 (IL-1) e o fator de necrose

tumoral alfa (TNF-α), que são produzidos no local da lesão em resposta ao

reconhecimento de componentes estruturais bacterianos. O fluido sanguíneo

mais lento e a indução de moléculas de adesão permitem aos leucócitos se

ligarem ao endotélio e migrarem para o interior dos tecidos. O processo de

migração leucocitária começa com uma ligação de baixa afinidade leucocitária

e segue ao longo da superfície endotelial. Depois, os leucócitos se tornam

firmemente ligados ao endotélio e ocorre a diapedese, que é a migração

através do endotélio. Através da diapedese, que ocorre predominantemente em

vênulas, assim como o aumento da permeabilidade vascular, os leucócitos

projetam pseudópodes através das junções interendoteliais alargadas e

migram para o espaço extravascular. As células são estimuladas por citocinas

a migrarem através dos espaços interendoteliais em direção à área da injúria.

Este fenômeno é conhecido como quimiotaxia (SIQUEIRA Jr, 2011).

O desenvolvimento de novos vasos sanguíneos, chamado de

angiogênese, exibe padrões característicos em diferentes injúrias. Em

situações patológicas, o fluido sanguíneo e a oxigenação através desses novos

vasos ocorrem de maneira desorganizada, contribuindo para a progressão da

doença (KOUHSOLTANI et al., 2015). A importância da angiogênese na

12

patogênese de doenças perirradiculares inflamatórias crônicas já foi

demonstrada na literatura (DRAZIC et al., 2010). KOUHSOLTANI et al. (2015)

mostraram que cistos perirradiculares apresentaram uma maior média de

números de mastócitos e de microvasos e que as zonas subepiteliais destas

lesões continham mais mastócitos e microvasos quando comparadas com as

zonas mais profundas. De forma contrária, a presença de mastócitos e a

densidade de microvasos não mostraram diferenças estatisticamente

significativas quando foram comparados granulomas e cistos perirradiculares

em outros estudos (LIMA et al., 2011; FONSECA-SILVA et al., 2012).

2.6 Mastócitos

Através dos sistemas imunes inato e adaptativo, vários mediadores

inflamatórios, citocinas pró-inflamatórias e fatores de crescimento são liberados

por células hospedeiras como uma resposta à infecção bacteriana (LIN et al.,

2007). O infiltrado inflamatório nas lesões perirradiculares é formado

principalmente por macrófagos, linfócitos T e B e plasmócitos (KONTIAINEN et

al., 1986; BELMAR et al., 2008); entretanto, outros tipos celulares, como os

mastócitos, têm sido descritos como essenciais para o desenvolvimento,

crescimento e expansão das lesões perirradiculares inflamatórias. Os

mastócitos têm propriedades imunorreguladoras (RODINI et al., 2004; LIMA et

al., 2011) e foram encontrados em todas as lesões perirradiculares do estudo

de KONTIAINEN et al. (1986), representando 2% do total de células.

Os mastócitos são originados de células progenitoras hematopoiéticas

pluripotentes que circulam através dos vasos sanguíneos e subsequentemente

13

migram para os tecidos onde sofrem diferenciação terminal (ANDRADE et al.,

2016). Além de serem fontes de histamina, serotonina e outras aminas

vasoativas, também desempenham um importante papel na imunopatologia de

reações de hipersensibilidade imediata e tardia e na patogênese da inflamação

crônica (TEDLA et al., 1998; VILLA et al., 2001). As principais enzimas

secretadas pelos mastócitos são a triptase e a quimase, proteases séricas

neutras passíveis de causar dano tecidual (CAUGHEY, 2007; SHEETHAL et

al., 2014). Os mastócitos têm outras funções, como a de serem mediadores na

degradação de matriz extracelular através da ativação e produção de

metaloproteinases de matriz (BARAM et al., 2001; ANDRADE et al., 2016). A

síntese e a liberação de outros mediadores pelos mastócitos exercem potentes

efeitos imunorregulatórios sobre outros tipos celulares; por outro lado, várias

citocinas derivadas de linfócitos T influenciam a migração de mastócitos e a

liberação de seus mediadores (WALSH, 2003).

Os mastócitos em tecidos orais contêm TNF-α em seus grânulos e a

liberação desta citocina promove a infiltração de leucócitos durante a evolução

da inflamação em várias condições, incluindo a inflamação periapical, por meio

da indução de moléculas de adesão endotelial (WALSH, 2003). Nas lesões

perirradiculares inflamatórias, os mastócitos parecem modular a patogênese da

periodontite apical e podem ser responsáveis por estimular a formação do

granuloma com a reabsorção do osso periapical (KABASHIMA et al., 2002).

A frequência de mastócitos nas lesões perirradiculares inflamatórias tem

sido relatada de forma variada na literatura, incluindo estudos que

demonstraram maior quantidade destas células em cistos perirradiculares

14

(RODINI et al., 2004; DRAZIC et al., 2010; FONSECA-SILVA et al., 2012;

BRACKS et al., 2014; SHIROMANY et al., 2014; KOUHSOLTANI et al., 2015;

MAHITA et al., 2016) e outros estudos com maior presença de mastócitos em

granulomas perirradiculares (PERRINI & FONZI, 1985; LEDESMA-MONTES et

al., 2004; MARÇAL et al., 2010; ANDRADE et al., 2016).

SHEETHAL et al. (2014) observaram que nas lesões perirradiculares, os

mastócitos, degranulados ou não, foram encontrados em diferentes áreas,

como células isoladas, em grupos isolados no tecido conjuntivo, em localização

subepitelial e em associação com fibroblastos, vasos sanguíneos e linfócitos. A

distribuição dos mastócitos nos tecidos é explicada pela sua estreita relação

com os elementos neurais e a laminina. Como os mastócitos são sensíveis aos

neuropeptídeos, através da sua interação com os elementos neurais, eles

formam uma rede neural imunológica com as células de Langerhans presentes

nas mucosas e isto facilita sua degranulação em resposta aos estímulos

imunológicos e não-imunológicos. As terapias que visam inibir as funções dos

mastócitos podem ter um grande valor no tratamento das desordens

inflamatórias crônicas na cavidade oral, tendo em vista que os mastócitos

desempenham um papel central na inflamação (WALSH, 2003).

Os mastócitos são essenciais nas respostas imunes imediata e tardia,

estão presentes no infiltrado inflamatório dos cistos perirradiculares e

participam da produção de vários mediadores inflamatórios (DE NORONHA

SANTOS NETTO et al., 2002; BRACKS et al., 2014). A degranulação dos

mastócitos tem uma importante função na iniciação da resposta inflamatória,

sendo estas células fontes de heparina e enzimas proteolíticas que degradam

15

tecido conjuntivo. Além disso, os mastócitos têm sido apontados como

estimuladores da produção de prostaglandinas, primordiais na reabsorção

óssea e, têm sido associados a patogênese dos cistos maxilares. Cistos

perirradiculares, por exemplo, apresentam mastócitos localizados tanto nas

regiões intra-epiteliais e sub-epiteliais, quanto nas regiões profundas do tecido

conjuntivo (RAJABI-MOGHADDAM et al., 2015).

2.7 CD34

O CD34 é um marcador celular endotelial que pode funcionar como

molécula de adesão em células endoteliais e em células progenitoras

hematopoiéticas (FINA et al., 1990). A importância da vascularização no

desenvolvimento de um novo tecido e sua manutenção tem sido demonstrada

em muitos processos fisiológicos e patológicos (DVORAK et al., 1995). A

angiogênese é o processo pelo qual novos vasos sanguíneos são produzidos a

partir de vasos pré-existentes (HOEBEN et al., 2004; BYRNE et al., 2005;

TAKAHASHI & SHIBUYA, 2005) e é considerada um processo essencial no

desenvolvimento das doenças crônicas inflamatórias (UNLÜ et al., 2003).

A angiogênese pode ser avaliada pela análise da densidade de

microvasos com quantificação dos vasos imunomarcados por anticorpos

específicos contra marcadores de células endoteliais, tais como o CD34 (FINA

et al., 1990; FREITAS et al., 2005). O estudo da angiogênese pode ser útil para

esclarecer melhor a patogênese das lesões perirradiculares inflamatórias

(GRAZIANI et al., 2006; ZIZZI et al., 2012).

16

De acordo com ZIZZI et al. (2012), houve uma correlação positiva entre

a expressão de CD34 nos vasos sanguíneos e linfócitos T e T-helper e uma

correlação estatisticamente significativa entre a porcentagem de expressão de

CD34 e a intensidade do infiltrado inflamatório em cistos perirradiculares.

2.8 Intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1)

A intercellular adhesion molecule-1 (molécula de adesão intercelular-1,

ICAM-1 ou CD54) é um receptor para adesão de células endoteliais vasculares

expresso em células endoteliais e em células T. Os linfócitos presentes na

inflamação aumentam a permeabilidade dos vasos sanguíneos através da

expressão de moléculas de adesão intercelular, como a ICAM-1, que adere

especificamente a receptores nos linfócitos (KABASHIMA et al., 1998). A

ICAM-1 é uma importante molécula de adesão expressa em linfócitos, sendo

fortemente regulada após a ativação de linfócitos T. A síntese de ICAM-1 é

estimulada por algumas citocinas inflamatórias, tais como IL-1 e TNFα, e por

lipopolissacarídeos (HAN et al., 2003).

IHAN HREN et al. (1999) avaliaram a expressão de ICAM-1 em linfócitos

T de granulomas perirradiculares e demonstraram um aumento na expressão

de ICAM-1 em células T isoladas a partir desta lesões em comparação com

linfócitos do sangue periférico, reforçando o papel de ICAM-1 na promoção do

tráfego de linfócitos ativados a partir do sangue para os tecidos inflamados.

BANDO et al. (1993) demonstraram que todos os cistos perirradiculares

analisados em seu estudo continham um grande número de capilares e

vênulas ICAM-1 positivos, situados principalmente perto da camada epitelial.

17

Além disso, ICAM-1 foi também encontrado nas populações de leucócitos e

nas células epiteliais. Um pequeno número de vasos ICAM-1 positivos foi

encontrado em granulomas perirradiculares, na gengiva normal e na mucosa

bucal, mas a camada epitelial nesses tecidos normais não mostrou positividade

para ICAM-1.

2.9 Podoplanina

Podoplanina é uma glicoproteína transmembrana tipo mucina expressa

em podócitos de rim humano e é homóloga ao T1α-2, um antígeno expresso

sobre a superfície apical das células alveolares tipo I. A podoplanina é utilizada

como um marcador para células endoteliais linfáticas e linfangiogênese, mas

esta proteína também é expressa em outros tipos celulares, incluindo células

do revestimento epitelial e osteócitos. A expressão de podoplanina é

aumentada em várias doenças malignas, incluindo carcinoma de células

escamosas da boca, do pulmão e da pele, tumores de células granulares,

mesoteliomas e condrossarcomas de baixo grau (ZUSTIN et al., 2010).

A presença de podoplanina foi observada em células epiteliais basais de

lesões odontogênicas com componente cístico neoplásico e não neoplásico.

Também foi detectada a expressão de podoplanina em tecidos germinativos

dentários humanos e em tecidos dentários permanentes, sugerindo que esta

proteína possa estar envolvida no processo de expansão local e no

desenvolvimento das lesões odontogênicas neoplásicas e reativas (ZUSTIN et

al., 2010).

18

A expressão da podoplanina tem sido investigada em tumores e cistos

odontogênicos e essa proteína é expressada principalmente na margem

invasiva das lesões, sendo possível que alguns fatores presentes nos tecidos

adjacentes tenham um forte impacto na sua expressão. No entanto, o

mecanismo de regulação da podoplanina e como ela pode ser afetada pelo

estroma ainda não está bem entendido (ALAEDDINI et al., 2016). A

imunoexpressão de podoplanina foi encontrada em todos os 20 cistos

perirradiculares inflamatórios avaliados no estudo de ALAEDDINI et al. (2016).

19

3 JUSTIFICATIVA

Embora a expressão de marcadores vasculares e a presença de

mastócitos em lesões perirradiculares inflamatórias já tenham sido avaliadas na

literatura, não foram identificados estudos que determinassem o padrão da

expressão destes marcadores em um mesmo grupo de lesões, buscando

avaliar comparativamente granulomas perirradiculares, cistos perirradiculares e

cistos residuais com diferentes componentes inflamatórios, correlacionando-os

com dados clínicos, demográficos, radiográficos e histológicos.

20

4 HIPÓTESE

Existem diferenças na expressão de marcadores vasculares e de

angiogênese e a presença de mastócitos em granulomas perirradiculares,

cistos perirradiculares e cistos residuais com diferentes componentes

inflamatórios.

21

5 PROPOSIÇÃO

O objetivo do presente estudo foi analisar de forma comparativa a

imunoexpressão de marcadores vasculares, incluindo CD34, ICAM-1 e

podoplanina e a presença de mastócitos em granulomas perirradiculares, cistos

perirradiculares e cistos residuais com diferentes componentes inflamatórios,

correlacionando os achados com dados clínicos, demográficos, radiográficos e

histológicos.

22

6 MATERIAIS E MÉTODOS

6.1 Parecer ético

Este estudo foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa

da Universidade Estácio de Sá (CAAE -57488316.7.0000.5284) (Anexo).

6.2 Seleção da amostra

A amostra foi composta por 3 grupos, sendo 5 granulomas

perirradiculares, 15 cistos perirradiculares e 11 cistos residuais diagnosticados

e arquivados no Laboratório de Patologia Bucal da Universidade Estácio de Sá

(localizado na Av. Alfredo Baltazar da Silveira, 580 / cobertura, Recreio dos

Bandeirantes, Rio de Janeiro/RJ, Brasil). Trata-se de um estudo retrospectivo e

comparativo, de cunho laboratorial, em que todos os espécimes utilizados

foram provenientes de procedimentos cirúrgicos perirradiculares e/ou

curetagens, tendo sido acondicionados em formol tamponado a 10% em

frascos adequados para submissão ao laboratório. As informações clínicas

(localização da lesão, presença de alterações clínicas e presença de sintomas),

demográficas (idade e sexo dos pacientes) e radiográficas (tamanho da lesão,

delimitação das bordas, relação com dentes e estruturas adjacentes) de todos

os casos foram obtidas a partir das fichas de registro laboratorial vinculadas

aos espécimes.

23

6.3 Análise histológica

A partir dos blocos de parafina foram realizados cortes de 5 µm, os quais

foram corados em hematoxilina e eosina, tendo sido posteriormente realizada a

análise histológica, utilizando um microscópio óptico de luz contendo uma

câmera digital acoplada (Microscópico Leica, modelo DM500, Alemanha). Os

parâmetros de análise histológica utilizados nos cistos perirradiculares e cistos

residuais foram: tipo de epitélio, sendo classificado em atrófico ou hiperplásico;

intensidade do infiltrado inflamatório, dividida em focal/leve ou

moderada/intensa; e presença de fendas de cristais de colesterol. Nos GP os

mesmos critérios acima também foram avaliados, exceto o tipo de epitélio.

6.4 Reações imunoistoquímicas

Para os ensaios imunoistoquímicos foram realizados cortes de 3 µm a

partir dos blocos de parafina. Os cortes foram dispostos em lâminas

previamente silanizadas com 3-aminopropil-trietoxi-silano (Sigma, ST. Louis,

MO, EUA) e a desparafinização foi feita por meio de dois banhos no xilol por 10

minutos cada sob temperatura ambiente, sendo realizada posterior hidratação

em soluções com concentração decrescente de etanol (100%, 90%, 70% e

50%), seguida por lavagem abundante em água corrente. A recuperação

antigênica foi realizada inserindo-se as lâminas em um berço de vidro, que foi

imerso em um recipiente com solução tampão citrato a 10mM (pH 6,0) e levado

ao micro-ondas (Panasonic modelo NN7809BH, 850W) em potência máxima

24

com duração de 12 minutos. Em seguida, as lâminas foram resfriadas em

temperatura ambiente e foi utilizado o peróxido de hidrogênio a 3% para

inativação da peroxidase endógena, com 5 banhos de 5 minutos cada. Após a

inativação da peroxidase, as lâminas foram lavadas em água corrente e

mergulhadas em leite desnatado durante 5 minutos, seguido da imersão em

solução salina tamponada com fosfato (PBS: phosphate-buffered saline).

A técnica seguiu com a incubação dos anticorpos primários anti-mast

cell tryptase (clone AA1, Dako, Dinamarca, diluição 1:10.000), anti-CD34

(monoclonal, Biocare, EUA, diluição 1:500), anti-ICAM-1 (monoclonal, Santa

Cruz Biotechnology, EUA, diluição 1:500) e anti-podoplanina (clone D2-40,

Biocare, EUA, diluição 1:200), os quais foram diluídos em PBS com 1% de

albumina sérica bovina (BSA, Sigma, ST. Louis, MO, EUA), sendo levados

posteriormente à câmara úmida por um período de 16 horas à temperatura de

4°C. Foram realizados controles positivos (tecidos sabidamente reativos

segundo informações dos fabricantes) e negativos (omissão do anticorpo

primário) em todas as reações.

Após o período de 16 horas, as lâminas foram lavadas em 3 banhos de

PBS e posteriormente incubadas com o anticorpo secundário (LSAB, Dako,

Carpinteria, CA, EUA) por 30 minutos à 37°C. Dando sequência, as lâminas

passaram por três banhos de PBS e foram expostas ao sistema estreptavidina-

biotina-peroxidase (LSAB, Dako, Carpinteria, CA, EUA) por um período de 30

minutos a 37oC. Em seguida, após três lavagens com PBS, as reações foram

evidenciadas com solução de tetracloreto de 3,3’ diaminobenzidina (DAB,

Dako, Carpinteria, CA, EUA) por 5 minutos em temperatura ambiente. Para

25

finalizar o preparo, os cortes foram lavados em água corrente, contra corados

com hematoxilina de Carazzi e montados com Entelan e lamínulas.

6.5 Análise das imagens

Todas as lâminas provenientes das reações imunoistoquímicas para

CD34 e mastócitos foram avaliadas sob microscopia óptica e a marcação foi

categorizada, segundo a intensidade da marcação, em focal/fraca e

moderada/intensa. Para ICAM-1 a expressão foi categorizada em

fraco/moderado e intenso. Para a expressão de podoplanina no epitélio cístico,

a expressão foi categorizada em negativa, basal e total, de acordo com a

espessura envolvida do epitélio. Todas as lâminas foram analisadas por dois

avaliadores previamente treinados e os resultados foram obtidos por consenso.

6.6 Análise estatística

As informações clínicas, demográficas, radiográficas, histológicas e

imunoistoquímicas foram tabuladas e analisadas de forma descritiva e

comparativa, avaliando as diferenças de expressão dos marcadores. Os dados

foram analisados estatisticamente por meio do programa SPSS (Statistical

Program for Social Sciences, IBM, versão 20), tendo como nível de

significância o valor de p<0.05 (5%).

26

7 RESULTADOS

7.1 Dados clínicos, demográficos e radiográficos

A amostra foi composta por 31 lesões, sendo 5 granulomas

perirradiculares (16,1%), 15 cistos perirradiculares (48,4%) e 11 cistos

residuais (35,5%). Quinze pacientes (48,4%) eram do gênero feminino e 16

(51,6%) do gênero masculino. A média de idade dos pacientes foi de 47,7

anos, sendo a idade mínima 11 anos e a máxima 72 anos. A média de idade

dos 5 pacientes com diagnóstico de granuloma perirradicular foi de 41 anos, a

dos 15 pacientes diagnosticados com cisto perirradicular foi de 41,2 anos e a

dos 11 pacientes com cisto residual foi de 59,7 anos.

Treze lesões (41,9%) estavam localizadas na maxila anterior, 7 (22,6%)

na maxila posterior e 11 na mandíbula posterior (35,5%). Dois casos (6,5%)

apresentavam sintomatologia e ambos tinham diagnóstico de cisto

perirradicular. Aumento de volume local e presença de secreção purulenta

estavam presentes em 11 casos (35,5%) e 8 casos (25,8%), respectivamente.

Dos 11 casos com aumento de volume, 1 era um granuloma perirradicular, 6

eram cistos perirradiculares e 4 eram cistos residuais. Dos 8 casos com

presença de secreção purulenta, 3 eram granulomas perirradiculares, 2 eram

cistos perirradiculares e 3 eram cistos residuais.

Em relação ao tamanho radiográfico, os 5 granulomas tiveram média de

9,80 mm, a média dos 15 cistos perirradiculares foi de 20,47 mm e a média dos

cistos residuais foi de 20,91 mm (p=0.041).

27

A distribuição do sexo dos pacientes afetados, da presença de aumento

de volume e de secreção purulenta e da região anatômica afetada não mostrou

diferenças estatisticamente significativas quando comparados os 3 grupos

estudados (Tabela 1).

Tabela 1: Distribuição dos parâmetros clínicos e demográficos por grupo diagnóstico.

Parâmetros Diagnóstico

Valor de p GP CP CR

Sexo Feminino 4 (80%) 6 (40%) 5 (46%)

0.292 Masculino 1 (20%) 9 (60%) 6 (54%)

Aumento de

volume

Não 4 (80%) 9 (60%) 7 (64%)

0.719 Sim 1 (20%) 6 (40%) 4 (36%)

Secreção

purulenta

Não 2 (40%) 13 (87%) 8 (73%)

0.117 Sim 3 (60%) 2 (13%) 3 (27%)

Região

afetada

Maxila anterior 1 (20%) 9 (60%) 3 (27%)

0.365 Maxila posterior 2 (40%) 2 (13%) 3 (27%)

Mandíbula posterior 2 (40%) 4 (27%) 5 (46%)

* GP - Granuloma perirradicular; CP - Cisto perirradicular; CR - Cisto residual

28

7.2 Análise histológica

A análise do tipo de epitélio das lesões císticas mostrou que 11 (35,5%)

apresentaram epitélio atrófico e 15 (48,8%) apresentaram epitélio hiperplásico.

A distribuição do tipo de epitélio entre cistos perirradiculares e residuais não

mostrou diferença estatisticamente significativa (p=0.452) (Tabela 2). A

intensidade do infiltrado inflamatório nas lesões foi classificada como focal/leve

em 16 casos (51,6%) e moderada/intensa em 15 casos (48,4%). A distribuição

da intensidade do infiltrado inflamatório entre granulomas e cistos

perirradiculares e residuais não mostrou diferença estatisticamente significativa

(p=0.452) (Tabela 2).

Tabela 2: Distribuição dos parâmetros histológicos por grupo diagnóstico.

Parâmetros Diagnóstico *

Valor de p GP CP CR

Tipo de

epitélio

Atrófico NA ** 7 (47%) 4 (36%) 0.452

Hiperplásico NA ** 8 (53%) 7 (64%)

Infiltrado

inflamatório

Focal/Leve 3 (60%) 9 (60%) 4 (36%) 0.452

Moderado/Intenso 2 (40%) 6 (40%) 7 (64%)

* GP - Granuloma perirradicular; CP - Cisto perirradicular; CR - Cisto residual; ** Não se aplica

29

7.3 Análise imunoistoquímica

A expressão de CD34 foi considerada focal/fraca em 18 casos (58% da

amostra) e moderada/intensa em 13 casos (42%). A expressão de CD34 foi

considerada moderada/intensa com maior frequência em granulomas

perirradiculares e em cistos residuais, mas sem diferença estatística em

relação aos cistos perirradiculares (Tabela 3 e Figura 1 A e B).

A expressão de podoplanina no epitélio cístico foi negativa em 8 casos e

mostrou positividade basal e total em 10 (32%) e 8 (26%) casos,

respectivamente. Não houve diferenças estatisticamente significativas quando

comparados os 3 grupos estudados (Tabela 3 e Figura 1 C e D). A expressão

de podoplanina foi adicionalmente encontrada no tecido conjuntivo, focalmente

em vasos linfáticos, em fibroblastos e em áreas próximas a fendas negativas

de cristais de colesterol (em 3 cisto perirradiculares e 1 cisto residual).

A expressão de ICAM-1 foi considerada fraca/moderada em 15 casos

(48%) e intensa em 16 casos (52%). A expressão de ICAM-1 foi mais intensa

em granulomas e cistos perirradiculares do que em cistos residuais e esta

diferença foi estatisticamente significativa (p=0.026) (Tabela 3 e Figura 1 E e

F).

A presença de mastócitos foi considerada focal/fraca em 21 casos (68%

da amostra) e moderada/intensa em 10 casos (32%). A presença dos

mastócitos foi mais evidente em granulomas e cistos perirradiculares, mas a

diferença para os cistos residuais não foi estatisticamente significativa (Tabela

3 e Figura 1 G e H).

30

Tabela 3: Distribuição da expressão dos marcadores imunoistoquímicos por grupo diagnóstico.

Expressão imunoistoquímica Diagnóstico *

Valor de p GP CP CR

CD34 Focal / Fraco 2 (40%) 12 (80%) 4 (36%)

0.056 Moderado / Intenso 3 (60%) 3 (20%) 7 (64%)

Podoplanina

Negativo NA ** 6 (40%) 2 (18%)

0.492 Basal NA 5 (33%) 5 (46%)

Total NA 4 (27%) 4 (36%)

ICAM-1 Fraco / Moderado 0 (0%) 7 (47%) 8 (73%)

0.026 Intenso 5 (100%) 8 (53%) 3 (27%)

Mastócitos Focal / Fraco 3 (60%) 10 (67%) 8 (73%)

0.874

Moderado / Intenso 2 (40%) 5 (33%) 3 (27%)

* GP - Granuloma perirradicular; CP - Cisto perirradicular; CR - Cisto residual; ** Não se aplica

A Figura 1 mostra imagens da expressão imunoistoquímica dos

marcadores avaliados em granulomas e cistos perirradiculares e em cistos

residuais. A Figura 2 mostra imagens dos 4 marcadores avaliados no mesmo

caso de Cisto perirradicular.

31

Figura 1. Expressão imunoistoquímica dos marcadores avaliados. CD34 em área subepitelial (A, 40x) e profunda do tecido conjuntivo (B, 40x); Podoplanina mostrando expressão basal (C, 40x) e total (D, 40x) no epitélio; ICAM-1 mostrando expressão epitelial, endotelial e nas células inflamatórias (E e F, 40x); Triptase dos mastócitos (G e H, 40x) (Todos imunoperoxidase).

32

Figura 2. Expressão imunoistoquímica de CD34 (A), Podoplanina (B), ICAM-1 (C) e Triptase dos mastócitos (D) em um Cisto perirradicular (Todos imunoperoxidase, 10x).

Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas com

relação a expressão imunoistoquímica dos marcadores avaliados de acordo

com a intensidade do infiltrado inflamatório presente nas lesões estudadas

(Tabela 4).

33

Tabela 4: Distribuição da expressão dos marcadores imunoistoquímicos de acordo com a intensidade do infiltrado inflamatório.

Expressão imunoistoquímica

Intensidade do infiltrado

inflamatório Valor de p

Focal / Leve Moderado / Intenso

CD34 Focal / Fraco 10 (62%) 8 (53%)

0.605 Moderado / Intenso 6 (38%) 7 (47%)

Podoplanina

Negativo 5 (38%) 3 (24%)

0.607 Basal 5 (38%) 5 (38%)

Total 3 (24%) 5 (38%)

ICAM-1 Fraco / Moderado 9 (56%) 6 (40%)

0.366 Intenso 7 (44%) 9 (60%)

Mastócitos Focal / Fraco 10 (62%) 11 (73%)

0.519 Moderado / Intenso 6 (38%) 4 (27%)

34

8 DISCUSSÃO

Os resultados do presente estudo com relação às informações

demográficas e clínicas da amostra mostraram que as 3 lesões que

compuseram os grupos avaliados foram mais comuns em pacientes adultos,

sem predileção marcante por sexo (LIN et al., 2010; BORGES et al., 2012;

KOIVISTO et al., 2012; ALCANTARA et al., 2013). Nossos resultados

demonstraram adicionalmente que, como esperado, a média de idade dos

pacientes portadores de cistos residuais foi superior à média de idade dos

pacientes que apresentavam granulomas e cistos perirradiculares (LIN et al.,

2010; BORGES et al., 2012; ALCANTARA et al., 2013).

A localização das lesões mostrou que para os 3 grupos a maxila anterior

foi o sítio de predileção, em concordância com a literatura (LIN et al., 2010;

KOIVISTO et al., 2012; ALCANTARA et al., 2013; TAVARES et al., 2017). Com

relação aos aspectos radiográficos, a média de tamanho das lesões císticas

(cistos perirradiculares e cistos residuais) foi maior que a média dos

granulomas perirradiculares, achado também em concordância com a literatura

(ALCANTARA et al., 2013).

Nossos resultados mostraram que não houve diferença com relação ao

padrão predominante de tipo de epitélio de revestimento (atrófico ou

hiperplásico) quando comparados cistos perirradiculares e cistos residuais,

achados semelhantes aos encontrados por SANTOS et al. (2011) estudando

cistos perirradiculares. Estes mesmos autores relataram que o infiltrado

inflamatório encontrado nos cistos perirradiculares avaliados em seu estudo era

35

principalmente intenso, em contraste com nossos resultados. Adicionalmente,

ALCANTARA et al. (2013) relataram que a maioria dos cistos perirradiculares

avaliados em seu estudo eram revestidos por epitélio atrófico e estavam

associados a um infiltrado inflamatório moderado na cápsula cística, em

contraste com nossos resultados.

Quanto à distribuição da expressão dos marcadores imunoistoquímicos

por grupo diagnóstico, o presente estudo encontrou diferença estatisticamente

significativa apenas em relação à expressão de ICAM-1, sendo esta mais

encontrada em granulomas perirradiculares quando comparados com as lesões

císticas. BANDO et al. (1993) encontraram expresso de ICAM-1 nas paredes

vasculares e nas células inflamatórias em todos os cistos perirradiculares

analisados em seu estudo, mas a intensidade de expressão não foi

quantificada. Os resultados do nosso estudo sugerem que a estimulação

inflamatória que determina a expressão de ICAM-1 decresce com a evolução

das lesões perirradiculares inflamatórias, embora tenhamos observado que não

houve diferença estatisticamente significativa entre a expressão da ICAM-1 e a

intensidade do infiltrado inflamatório nos 3 grupos.

Nossos resultados não mostraram diferenças significativas em relação à

expressão de CD34 nos 3 grupos, embora seja possível que a significância

pudesse ter sido atingida se o número de casos em cada grupo fosse maior.

Também não foi observada diferença significativa entre a expressão de CD34 e

a intensidade do infiltrado inflamatório nas lesões estudadas, em contraste com

os resultados de ZIZZI et al. (2012) que encontraram diferença estatisticamente

significativa entre o grau do infiltrado inflamatório e a porcentagem de vasos

36

CD34 positivos em cistos perirradiculares. Nossos resultados sugerem que

algum fator adicional possa estimular a manutenção da expressão de CD34 em

células endoteliais mesmo em áreas com infiltração inflamatória discreta.

A expressão de podoplanina foi frequente na presente amostra,

semelhante aos resultados de ALAEDDINI et al. (2016). Não foi observada

diferença estatisticamente significativa entre a expressão desta proteína no

epitélio de cistos perirradiculares e cistos residuais, sugerindo que a

manutenção de sua expressão ao longo da evolução das lesões císticas

inflamatórias perirradiculares seja constante, independente da persistência do

estímulo inflamatório associado a permanência do dente associado a lesão.

Mastócitos foram encontrados em todas as lesões incluídas em nossa

amostra, porém não houve diferença significativa em relação a sua presença

nos 3 grupos. Além disso, não houve diferença estatisticamente significativa

entre a presença de mastócitos e a intensidade do infiltrado inflamatório nas

lesões perirradiculares e nos cistos residuais analisados, em contraste com os

achados de DE NORONHA SANTOS NETTO et al. (2002), RODINI et al.

(2004) e DRAZIC et al. (2010), os quais observaram maior presença de

mastócitos em áreas mais inflamadas. Outros mecanismos, além da

estimulação inflamatória primária, parecem modular a presença destas células

nas lesões perirradiculares.

37

9 CONCLUSÕES

Os resultados do presente estudo mostraram que não houve diferença

na imunoexpressão de CD34 e podoplanina e com relação à presença de

mastócitos quando comparados granulomas e cistos perirradiculares e cistos

residuais e suas respectivas características clínicas, radiográficas e

histológicas. Em contraste, a expressão de ICAM-1 foi encontrada com maior

frequência em granulomas perirradiculares do que em cistos perirradiculares e

cistos residuais.

38

10 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Alaeddini M, Eshghyar N, Etemad-Moghadam S (2016). Expression of podoplanin and TGF-beta in glandular odontogenic cyst and its comparison with developmental and inflammatory odontogenic cystic lesions. J Oral Pathol Med 46:76-80.

Alcantara BAR, Carli ML, Beijo LA, Pereira AAC, Hanemann JAC (2013). Correlation between inflammatory infiltrate and epithelial lining in 214 cases of periapical cysts. Braz Oral Res 27: 490-495.

Andrade ALDL, Santos EM, Carmo AF, Freitas RA, Galvão HC (2016). Analysis of tryptase-positive mast cells and immunoexpression of MMP-9 and MMP-13 in periapical lesions. Int Endod J 50:446-454.

Bando Y, Henderson B, Meghji S, Poole S, Harris M (1993). Immunohistochemical localization of inflammatory cytokines and vascular adhesion receptors in radicular cysts. J Oral Pathol Med 22: 221-227.

Baram D, Vaday GG, Salamon P, Drucker I, Hershkoviz R, Mekori YA (2001). Human mast cells release metalloproteinase-9 on contact with activated T cells: juxtacrine regulation by TNF-alpha. J Immunol 167: 4008-4016.

Belmar MJ, Pabst C, Martínez B, Hernández M (2008). Gelatinolytic activity in gingival crevicular fluid from teeth with periapical lesions. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 105: 801-806.

Borges LB, Fechine FV, Mota MRL, Sousa FB, Alves APNN (2012). Odontogenic lesions of the jaw: a clinical-pathological study of 461 casos. Rev Gaúcha Odontol 60: 71-78.

Bracks IV, Armada L, Gonçalves LS, Pires FR (2014). Distribution of mast cells and macrophages and expression of interleukin-6 in periapical cysts. J Endod 40: 63-68.

Byrne AM, Bouchier-Hayes DJ, Harmey JH (2005). Angiogenic and cell survival functions of vascular endothelial growth factor (VEGF). J Cell Mol Med 9: 777-794.

Caughey GH (2007). Mast cell tryptases and chymases in inflammation and host defense. Immunol Rev 217: 141-154.

De Noronha Santos Netto J, Pires FR, da Fonseca EC, Silva LE, de Queiróz Chaves Lourenço S (2002). Evaluation of mast cells in periapical cysts, dentigerous cysts, and keratocystic odontogenic tumors. J Oral Pathol Med 41: 630-636.

39

Drazic R, Sopta J, Minic AJ (2010). Mast cells in periapical lesions: potential role in their pathogenesis. J Oral Pathol Med 39: 257-262.

Dvorak HF, Detmar M, Claffey KP, Nagy JA, van de Water L, Senger DR (1995). Vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor: an important mediator of angiogenesis in malignancy and inflammation. Int Arch Allergy Immunol 107: 233-235.

Fina L, Molgaard HV, Robertson D, Bradley NJ, Monaghan P, Delia D, Sutherland DR, Baker MA, Greaves MF (1990). Expression of the CD34 gene in vascular endothelial cells. Blood 75: 2417-2426.

Fonseca-Silva T, Santos CCO, Alves LR, Dias LC, Brito-Júnior M, De Paula AMB, Guimarães ALS (2012). Detection and quantification of mast cells, vascular endothelial growth factor, and microvessel density in human inflammatory periapical cysts and granulomas. Int Endod J 45: 859-864.

Freitas TMC, Miguel MCC, Silveira EJD, Freitas RA, Galvao HC (2005). Assessment of angiogenic markers in oral hemangiomas and pyogenic granulomas. Exp Mol Pathol 79: 79-85.

Graziani F, Vano M, Viacava P, Itro A, Tartaro G, Gabriele M (2006). Microvessel density and vascular endothelial growth factor (VEGF) expression in human radicular cysts. Am J Dent 19: 11-14.

Han DC, Huang GT-J, Lin LM, Warner NA, Gim JS, Jewett A (2003). Expression of MHC class II, CD70, CD80, CD86 and pro-inflammatory cytokines is differentially regulated in oral epithelial cells following bacterial challenge. Oral Microbiol Immunol 18: 350-358.

Hoeben A, Landuyt B, Highley MS, Wildiers H, Van Oosterom AT, De Bruijn EA (2004). Vascular endothelial growth factor and angiogenesis. Pharmacol Rev 56: 549-580.

Ihan Hren N, Gubina M, Ihan A (1999). Cytotoxic T lymphocytes versus streptococcal colonization in periapical granulomas. J Endod 25: 239-242.

Johnson NR, Gannon OM, Savage NW, Batstone MD (2013). Frequency of odontogenic cysts and tumors: a systematic review. J Invest Clin Dent 4: 1-7.

Kabashima H, Negata K, Maeda K, Iijima T (1998). Interferon-g-producing cells and inducible nitric oxide synthase-producing cells in periapical granulomas. J Oral Pathol Med 27: 95-100.

Kabashima H, Negata K, Maeda K, Iijima T (2002). Involvement of substance P, mast cells, TNF-a and ICAM-1 in the infiltration of inflammatory cells in human periapical granulomas. J Oral Pathol Med 31: 175-180.

40

Koivisto T, Bowles WR, Rohrer M (2012). Frequency and distribution of radiolucent jaw lesions: a retrospective analysis of 9723 cases. J Endod 38: 729-732.

Kontiainen S, Ranta H, Lautenschlager I (1986). Cells infiltrating human periapical inflammatory lesions. J Oral Pathol 15: 544-546.

Kouhsoltani M, Khiavi MM, Jamali G, Farnia S (2015). Immunohistochemical assessment of mast cells and small blood vessels in dentigerous cyst, odontogenic keratocyst, and periapical cyst. Adv Pharm Bull 5 (Suppl): 637-641.

Ledesma-Montes C, Garcés-Ortíz M, Rosales-García G, Hernández-Guerrero JC (2004). Importance of mast cells in human periapical inflammatory lesions. J Endod 30: 855-859.

Lima SC, Rizo VH, Silva-Sousa YT, Almeida LY, Almeida OP, Léon JE (2011). Immunohistochemical evaluation of angiogenesis and tryptase-positive mast cell infiltration in periapical lesions. J Endod 12: 1642-1646.

Lin LM, Huang GT-J, Rosenberg PA (2007). Proliferation of epithelial cell rests, formation of apical cysts, and regression of apical cysts after periapical wound healing. J Endod 33: 908-916.

Lin HP, Chen HM, Yu CH, Kuo RC, Kuo YS, WANG, YP (2010). Clinicopathological study of 252 jaw bone periapical lesions from a private pathology laboratory. J Formos Med Assoc 11: 810-818.

Mahita VN, Manjunatha BS, Shah R, Astekar M, Purohit S, Kovvuru S (2016). Quantification and localization of mast cells in periapical lesions. Ann Med Health Sci Res 5: 115-118.

Marçal JRB, Samuel RO, Fernandes D, Araujo MS, Napimoga MH, Pereira SAL, Clemente-Napimoga JT, Alves PM, Mattar R, Rodrigues Jr V, Rodrigues DBR (2010). T-helper cell type 17/regulatory T-cell immunoregulatory balance in human radicular cysts and periapical granulomas. J Endod 36: 995-999.

Martins R, Armada L, dos Santos TC, Pires FR (2017). Comparative immunoexpression of ICAM-1, TGF-β1 and ki-67 in periapical and residual cysts. Med Oral Patol Oral Cir Bucal 22: e24-e30.

Nair PNR (1998). New perspectives on radicular cysts: do they heal? Int Endod J 31: 155-160.

Nair PNR (2004). Pathogenesis of apical periodontitis and the causes of endodontic failures. Crit Rev Oral Biol Med 15: 348-381.

Neville BW, Damm DD, Allen CM, Bouquot JE (2014). Pulpal and periapical disease. In: Neville BW, Damm DD, Allen CM, Bouquot JE. Patologia Oral e Maxilofacial. 4.ed. Rio de Janeiro, RJ: Elsevier, 111-139.

41

Perrini N & Fonzi L (1985). Mast cells in human periapical lesions: ultrastructural aspects and their possible physiopathological implications. J Endod 11: 197-202.

Pires FR (2015). Diagnóstico diferencial das lesões perirradiculares inflamatórias. In: Lopes HP, Siqueira Jr JF. Endodontia: biologia e técnica. 4.ed. Rio de Janeiro, RJ: Elsevier, 47-61.

Pontes FSC, Fonseca FP, Jesus AS, Alves ACG, Araújo LM, Nascimento LS, Pontes HAR (2014). Nonendodontic lesions misdiagnosed as apical periodontitis lesions: series of case reports and review of literature. J Endod 40: 16-27.

Rajabi-Moghaddam M, Abbaszadeh-Bidokhty H, Bijani A (2015). Comparison of mast cells count in odontogenic cysts using histochemical staining. Iran J Pathol 10: 105-110.

Rôças IN, Siqueira Jr JF, Lopes HP, Pires FR (2015). Patologia pulpar e perirradicular. In: Lopes HP, Siqueira Jr JF. Endodontia: biologia e técnica. 4.ed. Rio de Janeiro, RJ: Elsevier, 15-46.

Rodini CO, Batista AC, Lara VS (2004) Comparative immunohistochemical study of the presence of mast cells in apical granulomas and periapical cysts: possible role of mast cells in the course of human periapical lesions. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 97: 59-63.

Santos LCS, Bôas DSV, Oliveira GQV, Ramos EAG, Gurgel CAS, Santos JN (2011). Histopathological study of radicular cysts diagnosed in a Brazilian population. Braz Dent J 22: 449-454.

Sheethal HS, Uma K, Rao K, Priya NS, Umadevi HS, Smitha T (2014). A quantitative analysis of mast cells in inflammatory periapical and gingival lesions. J Contemp Dent Pract 15: 300-305.

Shiromany A, Sood R, Akifuddin S, Sidhu GK, Khan N, Singla K (2014). Comparison of mast cells and imflammatory cells within periapical lesions and comparison of degranulated mast cells between fibrous and inflamed area in radicular cysts: an immunohistochemical study. J Clin Diagn Res 8: ZC61-ZC64.

Siqueira Jr JF & Saboia-Dantas (2000). Mecanismos celulares e moleculares da inflamação. Rio de Janeiro, RJ: Medsi, 75-76.

Siqueira Jr JF (2011). Treatment of endodontic infections. Berlin, Germany. Quintessence, 46-47.

Takahashi H & Shibuya M (2005). The vascular endothelial growth factor (VEGF)/VEGF receptor system and its role under physiological and pathological conditions. Clin Sci (Lond) 109: 227-241.

42

Tavares DP, Rodrigues JT, dos Santos TC, Armada L, Pires FR (2017). Clinical and radiological analysis of a series of periapical cysts and periapical granulomas diagnosed in a Brazilian population. J Clin Exp Dent 9: e129-e135.

Tedla N, Wang HW, McNeil P, Di Girolamo N, Hampartzoumian T, Wakefield D, Lloyd A (1998). Regulation of T lymphocyte trafficking into lymph nodes during an immune response by the chemokines macrophage inflammatory protein (MIP)-1 alpha and MIP-1 beta. J Immunol 161: 5663-5672.

Unlü F, Güneri PG, Hekimgil M, Yeşilbek B, Boyacioğlu H (2003). Expression of vascular endothelial growth factor in human periodontal tissues: comparison of healthy and diabetic patients. J Periodontol 74: 181-187.

Villa I, Skokos D, Tkaczyk C, Peronet R, David B, Huerre M, Mécheri S (2001) Capacity of mouse mast cells to prime T cells and to induce specific antibody responses in vivo. Immunology 102: 165-172

Walsh, LJ (2003). Mast cells and oral inflammation. Crit Rev Oral Biol Med 14: 188-198.

Zizzi A, Aspriello SD, Ferrante L, Stramazzotti D, Colella G, Balercia P, Muzio L Lo, Piemontese M, Goteri G, Rubini C (2012). Immunohistochemical correlation between microvessel density and lymphoid infiltrate in radicular cysts. Oral Dis 19: 92-99.

Zustin J, Scheuer HA, Friedrich RE (2010). Podoplanin expression in human tooth germ tissues and cystic odontogenic lesions: an immunohistochemical study. J Oral Pathol Med 39: 115-120.

43

11 ANEXO

44

45