Análise da acção do magnésio na respiração mitocondrial e fosforilação

oxidativa por controlo da permeabilidade membranar.

Introdução

Um dos iões mais importantes no organismo humano é o magnésio (Mg2+) devido à sua

actividade reguladora. Encontra-se principalmente no citosol mas certos organitos celulares

possuem-no na sua constituição em menor percentagem.

Entre esses organitos destacamos as mitocôndrias. Estas encontram-se dependentes do

magnésio devido às suas funções no metabolismo mitocondrial, na regulação de actividades

enzimáticas e no transporte de aniões e catiões.

No que toca à regulação de actividades enzimáticas devemos sublinhar que a ATP-

sintetase não funciona na ausência de grandes concentrações de magnésio na matriz

mitocondrial.

Para extrair o magnésio da matriz e poder observar os efeitos na actividade da ATP-

intetase pode-se utilizar o ionóforo de catiões A23187 (A23).

Materiais e Equipamento

Fracção de mitocôndria vegetal (tubérculo de batata) previamente preparada.

Sistema de medição de potencial eléctrico (ΔΨ) mitocondrial com eléctrodo de TPP+.

Meio de reacção com 250 mM de sacarose, 20 mM de KCl, 2 mM de KH2PO4, 0.05%

de BSA, 10 mM de HEPES, (pH 7.0).

Soluções:

1 mM de TPP+

100 mM de ADP

100 mM de ATP

1 mM de A23187

1 M de succinato de K

100 mM e 250 mM de MgCl2

100 mM e 250 mM de MnCl2

100 mM e 250 mM de CaCl2

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Resultados

1º Ensaio

Legenda 1: Registos obtidos por utilização de um eléctrodo de TPP+ e representativos da

actividade da ATP-sintetase num meio constituído por mitocôndrias vegetais na presença de 5

mM de MgCl2. As mitocôndrias (0.5 mg) foram adicionadas a 2 ml de meio de reacção

constituído por sacarose 250 mM, KCl 20 mM, BSA 0.05%, HEPES 10 mM, pH 7.2 com

TPPCl 3 µM, onde já foi anteriormente adicionado 0.2 mM de ATP. Após estabilização foram

adicionados ao meio de reacção com mitocôndrias 10 mM de succinato, 300 nmoles de ADP, 1

µM de A23187 e, novamente, 300 nmoles de ADP.

2

2º Ensaio

Legenda 2: Registos obtidos por utilização de um eléctrodo de TPP+ e representativos da

actividade da ATP-sintetase num meio constituído por mitocôndrias vegetais na ausência de

MgCl2. As mitocôndrias (0.5 mg) foram adicionadas a 2 ml de meio de reacção constituído por

sacarose 250 mM, KCl 20 mM, BSA 0.05%, HEPES 10 mM, pH 7.2 com TPPCl 3 µM, onde

já foi anteriormente adicionado 0.2 mM de ATP. Após estabilização foram adicionados ao

meio de reacção com mitocôndrias 10 mM de succinato, 300 nmoles de ADP, 1 µM de

A23187 e, novamente, 300 nmoles de ADP.

3

3º Ensaio

Legenda 3: Registos obtidos por utilização de um eléctrodo de TPP+ e representativos da

actividade da ATP-sintetase num meio constituído por mitocôndrias vegetais na presença de

0.5 mM de MgCl2. As mitocôndrias (0.5 mg) foram adicionadas a 2 ml de meio de reacção

constituído por sacarose 250 mM, KCl 20 mM, BSA 0.05%, HEPES 10 mM, pH 7.2 com

TPPCl 3 µM, onde já foi anteriormente adicionado 0.2 mM de ATP. Após estabilização foram

adicionados ao meio de reacção com mitocôndrias 10 mM de succinato, 300 nmoles de ADP, 1

µM de A23187 e, novamente, 300 nmoles de ADP.

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4º Ensaio

Legenda 4: Registos obtidos por utilização de um eléctrodo de TPP+ e representativos da

actividade da ATP-sintetase num meio constituído por mitocôndrias vegetais na presença de

0.5 mM de CaCl2 em vez de MgCl2. As mitocôndrias (0.5 mg) foram adicionadas a 2 ml de

meio de reacção constituído por sacarose 250 mM, KCl 20 mM, BSA 0.05%, HEPES 10 mM,

pH 7.2 com TPPCl 3 µM, onde já foi anteriormente adicionado 0.2 mM de ATP. Após

estabilização foram adicionados ao meio de reacção com mitocôndrias 10 mM de succinato,

300 nmoles de ADP, 1 µM de A23187 e, novamente, 300 nmoles de ADP.

5

5º Ensaio

Legenda 5: Registos obtidos por utilização de um eléctrodo de TPP+ e representativos da

actividade da ATP – sintetase num meio constituído por mitocôndrias vegetais na presença de

2 mM de MnCl2 em vez de MgCl2. As mitocôndrias (0.5 mg) foram adicionadas a 2 ml de meio

de reacção constituído por sacarose 250 mM, KCl 20 mM, BSA 0.05%, HEPES 10 mM, pH

7.2 com TPPCl 3 µM, onde já foi anteriormente adicionado 0.2 mM de ATP. Após

estabilização foram adicionados ao meio de reacção com mitocôndrias 10 mM de succinato,

300 nmoles de ADP, 1 µM de A23187 e, novamente, 300 nmoles de ADP.

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Unidade de Tempo

2 min

4 min

Discussão

1º Ensaio

Analisando os resultados obtidos podemos assumir que ao serem adicionados os 300

nmoles de ADP ocorreu uma fosforilação oxidativa na matriz mitocondrial relativamente

rápida. De seguida foi adicionado 1µM de A23 cuja função é retirar o magnésio que existe na

matriz mitocondrial para o meio. Para comprovar que a actividade foi realizada com sucesso

adicionou-se novamente 300 nmoles de ADP. Nesse momento verifica-se uma nova

fosforilação oxidativa, com uma velocidade semelhante à primeira. Assume-se então que a

actividade do A23 foi exercida mas sem resultados evidentes, isto porque a concentração de

magnésio no meio apresentava um valor apreciável relativamente à concentração de magnésio

na matriz mitocondrial, não permitindo uma movimentação (significativa) do magnésio para o

exterior.

Portanto, a 5 mM de magnésio a taxa de fosforilação é de 150 nmol ADP foforilado . mg -

1 proteína . minuto-1, como se pode comprovar com os cálculos seguintes:

Taxa de fosforilação = Concentração de ADP

TF = 300 nM = 150 nmol ADP foforilado . mg-1 proteína . minuto-1

2º Ensaio

Analisando os resultados obtidos podemos assumir que ao serem adicionados os 300

nmoles de ADP ocorreu uma fosforilação oxidativa na matriz mitocondrial, lenta. De seguida

foi adicionado 1µM de A23 cuja função é retirar o magnésio que existe na matriz mitocondrial

para o meio. Para comprovar que a actividade foi realizada com sucesso adicionou-se

novamente 300 nmoles de ADP. Nesse momento a única alteração registada é a da própria

adição do ADP sem ocorrência de fosforilação oxidativa. Assume-se então que a actividade do

A23 foi exercida com sucesso, pois uma grande quantidade de magnésio existente na matriz

mitocondrial foi removida para o exterior, impedindo assim a actuação da ATP - sintetase.

Portanto, na ausência de magnésio a taxa de fosforilação é de 75 nmol ADP foforilado .

mg-1 proteína . minuto-1, como se pode comprovar com os cálculos seguintes:

TF = 300 nM = 75 nmol ADP foforilado . mg-1 proteína . minuto-1

7

3.3 min

1.5 min

3º Ensaio

Analisando os resultados obtidos podemos assumir que ao serem adicionados os 300

nmoles de ADP ocorreu uma fosforilação oxidativa na matriz mitocondrial, ligeiramente mais

rápida que a que foi verificada no ensaio anterior. De seguida foi adicionado 1µM de A23 cuja

função é retirar o magnésio que existe na matriz mitocondrial para o meio. Para comprovar que

a actividade foi realizada com sucesso adicionou-se novamente 300 nmoles de ADP. Nesse

momento verifica-se uma nova fosforilação oxidativa, com uma velocidade significativamente

mais lenta que a primeira. Assume-se então que a actividade do A23 foi exercida com algum

sucesso visto que uma quantidade relativamente notória de magnésio foi removida para o

exterior, apesar de que ainda se manteve bastante na matriz para que a ATP – sintetase pudesse

actuar com algum resultado.

Portanto, a 0.5 mM de magnésio a taxa de fosforilação é de 90.9 nmol ADP foforilado .

mg-1 proteína . minuto-1, como se pode comprovar com os cálculos seguintes:

TF = 300 nM = 90.9 nmol ADP foforilado . mg-1 proteína . minuto-1

4º Ensaio

Analisando os resultados obtidos podemos assumir que ao serem adicionados os 300

nmoles de ADP ocorreu uma fosforilação oxidativa na matriz mitocondrial, relativamente

rápida. De seguida foi adicionado 1µM de A23 cuja função é retirar o magnésio que existe na

matriz mitocondrial para o meio. Para comprovar que a actividade foi realizada com sucesso

adicionou-se novamente 300 nmoles de ADP. Nesse momento a única alteração registada é a

da própria adição de ADP sem ocorrência de fosforilação oxidativa. Assume-se então que a

actividade do A23 foi exercida com sucesso, pois uma grande quantidade de magnésio

existente na matriz mitocondrial foi removida para o exterior, impedindo assim a actuação da

ATP-sintetase.

Portanto, a 0.5 mM de cálcio a taxa de fosforilação é de 200 nmol ADP foforilado . mg-1

proteína . minuto-1, como se pode comprovar com os cálculos seguintes:

TF = 300 nM = 200 nmol ADP foforilado . mg-1 proteína . minuto-1

5º Ensaio

Analisando os resultados obtidos podemos assumir que ao serem adicionados os 300

nmoles de ADP ocorreu uma fosforilação oxidativa na matriz mitocondrial, relativamente

rápida. De seguida foi adicionado 1µM de A23 cuja função é retirar o magnésio que existe na

matriz mitocondrial para o meio. Para comprovar que a actividade foi realizada com sucesso

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2.4 min

adicionou-se novamente 300 nmoles de ADP. Nesse momento verifica-se uma nova

fosforilação oxidativa, com uma velocidade semelhante à da primeira. Assume-se então que a

actividade do A23 foi exercida mas sem sucesso, isto porque a concentração de manganésio no

meio apresenta um valor apreciável relativamente à concentração de magnésio na matriz

mitocondrial, não permitindo uma movimentação (significativa) de magnésio para o exterior.

Portanto, a 2 mM de manganésio a taxa de fosforilação é de 125 nmol ADP foforilado .

mg-1 proteína . minuto-1, como se pode comprovar com os cálculos seguintes:

TF = 300 nM = 125 nmol ADP foforilado . mg-1 proteína . minuto-1

Tendo em conta toda a anterior análise e a seguinte tabela:

Actividade em nmol ADP foforilado . mg-1 proteína . minuto-1

Mg2+ (mM) Succinato

0 75

0,5 90,9

5 150

Ca2+ (mM) Succinato

0,5 200

Mn2+ (mM) Succinato

2 125

(A taxa de fosforilação na ausência de magnésio será menor que a taxa de fosforilação

referente à sua presença ou de manganésio. Na presença de magnésio a taxa aumenta consoante

a concentração de magnésio adicionada).

A conclusão desta experiência é:

O magnésio presente na matriz mitocondrial tem um papel muito importante

relativamente à fosforilação oxidativa como se pode verificar nos ensaios realizados.

No primeiro e terceiro ensaios, devido às quantidades de magnésio presentes no meio a

actividade do A23 não surtirá muitos efeitos. O magnésio existente na matriz mitocondrial não

será transportado para o meio já que as concentrações de magnésio aí existentes são

relativamente elevadas. Assim sendo, o magnésio existente na mitocôndria apresenta uma

concentração apreciável para que a ATP-sintetase exerça a sua função, o que se observa na

fosforilação oxidativa registada.

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No segundo ensaio, não existe magnésio no meio. Desta forma o A23 exerce

plenamente a sua função extraindo o magnésio presente na mitocôndria, não ficando magnésio

suficiente para a ATP-sintetase actuar, impedindo a ocorrência de uma nova fosforilação

oxidativa. O mesmo se verifica no quarto ensaio, neste caso a diferença foi que em vez de ser

adicionado magnésio ao meio, foi adicionado cálcio. Verifica-se então que o cálcio não pode

substituir o magnésio, porque quando se adiciona A23 o magnésio presente na matriz sofre

transporte para o meio em grande quantidade. Este processo é igual ao que ocorre na ausência

de magnésio no meio.

Contrariamente a este último resultado, no quinto ensaio observa-se que quando se

adiciona manganésio ao meio vai ocorrer uma segunda fosforilação oxidativa, tal como no caso

em que existe magnésio no meio (1º e 3º ensaios). Assume-se então que o manganésio pode

substituir o magnésio no processo de respiração mitocondrial.

Relatório realizado por:

Ana Carina Estrela Maia

Ana Rita Gonçalves Graça

Turma P4

1º Turno

10