Amostras nas Análises Toxicológicas

5/10/2018 Amostras nas An lises Toxicol gicas - slidepdf.com

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·M~t()dos de Co leta eAna ,lisei·

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. TeotesdeM erctJrio .

Reinaldo Calixto CAMPOSFatima PWE1TA

6.1 Coleta, A rm azenam ento e T ransporte dasAmost ras

A disponibilidade de urn sofisticado instrumental analltico no

laborat6rio nao e suficiente, por si s6, para garantir a qualidade de

uma analise. A determinacao instrumental, em si, e apenas urn dos

passos de uma analise e hoje, com as facilidades disponfveis, nem

sempre 0mais problematico. Na analise de traces, caso cada vez

mais frequente na analise toxicologica, as maiores fontes de erro

podem estar associadas a coleta, armazenamento ou transporte da

amostra. Estes erros estao, por sua vez, relacionados a perdas,

contaminaeoes ou decompos ieao da amostra durante e ss es e sta g io s,

A contaminacao podera ser causada pelos materiais de coleta e

estocagem (seringas, recipientes, etc...), por reagentes adicionados

a amostra, tais como anti-coagulantes ou estabilizantes, pela pele

ou vestimenta do paciente ou do tecnico e ainda, a partir do

am b ien te o nde e realizada a co leta . 0 transporte ou0annazenamento

inadequados poderao causar perdas do analito ou rnudancas na

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composicao da amostra. Deve-se ter sempre em mente que essas

questoes sao tanto mais crfticas quanta mais baixos os nfveis de

concentracao que se deseja acessar.

Apesar das particu1aridades de cada analise, algumas normas

gerais podem, portanto, ser apontadas.

Quanto 80S Frascos de Coleta: devem ser fomecidos pelo

laborat6rio j~ devidamente lavados e contendo 0anti-coagulante

e/ ou preservante apropiado, nas quantidades adequadas. Deve-se

observar que frascos novos (ie,ainda nao utilizados) nao significam,

necessariamente, frascos nao contaminados. 0 anti-coagulante ejou preservante deve ser periodicamente testado quanta ao branco,

que deve ser tao baixo quanta 0possfvel, a fim de nao comprometer

o limite de deteccao da analise, Os frascos, lavados e fechados,

devem ser utilizados dentro de urn perfodo de 06 (seis) meses.

Q u a n t o 80 Teauco c m e Coleta: as amostras devem ser coletadaspor pessoal habilitado. 0 tecnico deve lavar as maos antes da

tomada de amostra e cuidar para que nao seja, ele mesmo, pela sua

roupa ou cabelo, por exemplo, fonte de contaminacao,

Quanto ao IAcaIe Coleta daAmostra: as amostras nao devem

ser coletadas no local de trabalbo ou enquanto 0individuo estiver

vestindo sua roup a de trabalho. 0 banho de corpo inteiro edesejavel, As amostras devem ser coletadas em horatio apropriado,

determinado, principalmente, pela cinetica do analito no corpo

humane, considerando-se tambem, 0 tipo de informacao que se

quer alcancar, Deve-se ter certeza de que 0 tecido ou fluido

coletado e realmente 0mais adequado a informacao que se busca.

Coleta de Urina: 0 orificio uretral deve ser limpo (da-se

preferencia ao banho completo) antes da coleta da amostra. 0

primeiro jato de urina deve ser desprezado.

Coleta de Sanaue: a pele no local da coleta deve ser limpa (da-

se preferencia ao banho completo) antes da coleta da amostra. 0

paciente deve ficar sentado cerca de 15 minutos antes da puncao

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venosa (em peos pacientes tendem a ter hemoconcentraeao.ja que

a agua e os constituintes difusfveis sao filtrados, ficando os nAo-difusfve~ tais como asprotefnas plasmaticas, mais concentrados).

Otomiquete deveser evitado ou usadopelomenor tempopossfvel,

j'que sua utiliza~o produz hemoconcentraeao. 0 exerclcio FISico,

mesmo pequeno, deve ser evitado no perfodo anterior Acoleta, j'

que produz hemodiluieao. A qualidade e a quantidade do anti-

coagulante devem ser controladas, de acordo com 0indicador, sua

provavel concentracao eo tempo a preservar a amostra: a heparina

possui efeito anti-coagulante de apenas poucos dias; no caso do

citrate; se for necessaria a preservacao da amostra por mais de umasemana, especialmente na temperatura ambiente, pode haver

coagulacao; nocaso do uso do EDTA, pode haver queda no volume

de eritr6citos, com a consequente modificacao da concentracao de

varies componentes plasmaticos, Seringas, agulhas e tubos para

coleta Avacuo devem ser previamente testados quanto ao branco.

Finalmente, deve ser evitada a hem6lise, ja que esta pode interferir

de varies modos na analise.

Coleta de C8belo: 0cabelo deve ser coletado com tesoura dea~ inoxidavel, de urna mesma regiao do escalpo, dada a existencia

de variacoes de sua composieao com a sua localizacao anatOmica.

Coleta-se logo acima da nuca, por ser esta regiao menos afetada

pela calvfcie,nos homens. Cortam-se mechas com pelo menos 100

fios, a ate 1 em do couro cabeludo. Amarrando-se a mecha de

cabelo de modo a preservar-se a posicao longitudinal relativa de

cada fio e marcando-se as extremidades distal e proximal, sera

possfvel obter dados sobre a hist6ria de exposieao, Entretanto, isto

nem sempre sed possfvel, em fun~o do tamanho e tipo de cabelo.

As mechas de cabelo podem ser acondicionadas em envelopes de

papel ou em sacos plasticos transparentes.

Transporte: os frascos contendo sangue e urina devem ser bern

tampados e embalados, sendo acondicionados em caixas termieas,

sob gelo substitufvel, 'emtemperaturas de, no maximo, 4°C. Deve-

se ter cuidado de fixar os recipientes adequadamente, para que

estes nao quebrem ou virem durante0

transporte. 0 cabelo podeser mantido Atemperatura ambiente,

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Armazenamento: as condicoes 6timas de armazenamento sao

determinadas pelas substancias a analisar e pela natureza da

amostra. Os processos que mais frequentemente alteram·· acomposicao do sangue e da urina sao a precipitacao (urina),

coagulacao (sangue) e a(_;aobacteriana, alem dos problemas de

contaminacao por recipientes indevidamente lavados ou de perdas

par adsorcao, 0 cabelo, quando devidamente protegido de

contaminacao, nao altera sua composicao com 0 tempo.

Para cada agente quimico e necessario conhecer a temperatura,

pH e tempo maximo de armazenamento, de modo a manter a

representatividade da amostra. Entretanto, algumas condicoesgerais podem ser apontadas: amostras biol6gicas devem ser

armazenadas sob refrigeracao (4°C) e, quando especificado, sob

congelamento, as vezes na ausencia de luz; os recipientes de

armazenamento devem ser hermeticamente fechados e rotulados

adequadamente (data de coleta, identificacao, periodo aproximado

de estabilidade da amostra, etc. ..); para a analise de compostos

volateis, como solventes organicos (benzeno, tricloroetileno, tolueno,

etc.), os. frascos devem estar completamente preenchidos com a

amostra biologica, nao devendo ser abertos ate 0 momento daanalise.

Cuidados Especiais Durante a Analise: Alem dos cuidados ja

discutidos a serem tornados na coleta, transporte e armazenagem,

outros devem ser adotados durante a analise. Entre eles, podern

ser citados:

a. Lavar toda vidraria de acordo com as normas.

b. Separar a vidraria utilizada para determinacoes, em urn

determinado nfvel de concentracao (mg/kg, p.ex.), daquela

a ser utilizada com amostras em outro nfvel de concentraeao

(ng/g, p.ex.), para evitar contaminacao cruzada.

c. Verificar a pureza dos reagentes e a eficiencia da lavagem

do material correndo-se brancos antes da analise, de modo

a evitar perdas de amostras que poderao ser unicas. Em

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caso de brancos muito altos, investigar a causa e promover

sua eliminacao. Brancos muito altos comprometem 0

limite de deteecao do procedimento analitico, 0 que eextremamente indesejavel em analises toxicol6gicas, dados

os baixos niveis que se deve determinar.

d. Bancadas, chao e superficies em geral devem ser mantidos

constantemente limpos. A poeira e uma grande fonte de

contaminacao para varies elementos. Deve-se evitar 0

contato direto con a superficie da bancada das tampas dos

recipientes, ponteiras ou qualquer parte do material que

venha a entrar em contato com as solucoes. Deve-se evitarque 0analista, ou sua roupa, sejam causa de contaminacao,

assim como deve-se manter os frascos oontendo as amostras

abertos 0menor tempo possfvel e retorna-los a s condicoes

de armazenagem imediatamente ap6s 0uso.

e. A secagem ao ar pode ser uma grande fonte de contaminacao,

Caso seja necessaria, garantir que nao haja deposicao de

partfculas contaminadas sobre a amostra.

f. Correr as amostras no mfnimo em duplicata, com pelo

menos urn branco para cada 5 amostras. Na leitura

instrumental, repetir urn padrao a cada 10amostras, p.ex.,

de modo a checar variacao na sensibilidade durante as

leituras. Checar a acuracidade periodicamente, correndo

materiais certificados de referencia paralelamente as

amostras, sem conhecimento previo do analista.

LaV8&em do Material de Liborat6rio: lava-se 0 material

inicialmente com detergente, enxaguando-se copiosamente com

agua de torneira e rinsando-se pelo menos 3 vezes com agua

deionizada. Deixa-se, entao, 0material submerso em solucao 5%

de acido nitrico por pelo menos 24h. Antes do uso, lava-se

ropiosamente com agua deionizada. Este procedimento e adequado

quando da deterrninacao de varies elementos ao nfvel de traces,

inclusive para 0Hg nos nfveis usuais no sangue, urina e cabelo.

Outros procedimentos podem ser mais adequados em outras

situacoes,

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Apresentado dos Resultados: os resultados da analise decabelo podem ser expressos em )Lgfg ou mgfkg. Para 0sangue, ~

usual trabaIhar-se em p.gfL No caso da urina, como sua ~muda significativamente ao longo do dia, a analise deve ser

acompanhada da determinacao de creatinina, quando esta ~usada

como parametro de normalidade.

6.2 Analise de Urina

6.2.1 Caracteristicas Gerais

Eusada para estimar a exposi~o de populaeoes ou grupos ao

vapor de mercuric (Hg"), principalmente. A excreeao urinaria do

mercario ~ bastante variavel ao longo do dia, 0que limita 0uso

deste indicador em casos individuais. No entanto, mesmo em

termos da avaliacao de grupos, ~ irnportante ressaltar que somente

ap6s urn ano de exposi~o continua 0mercuric atingira 0equilibrio

neste fluido biol6gico.

6.2.2 Determmapjo: MercUrio Total

6.2.3 Coleta

Quantidade: 50 mI.

Material Utilizado:---

Horario/Epoca: Trabalhadores: la. urinada manha C a ) ao final da

semana de trabalho;

Populacoes nao expostas

ocupacionalmente: la.

urina da manha,

Embalagem: Frasco de Polipropileno de boca larga (b).

Conservante: Nao (e).

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6.2.4 A rm azenam ento e Estocagem (c):

Condieoes: Congelada em freezer (-20 "C) ,

Perfodo Maximo de Estocagem: Algumas

semanas.

Transporte: Manter congelada.

6.2.5 Metodo de An6lise

Pipete 1ml de urina para 0ubo de digestao; resfrie a amostra

em banho de gelo e adicione 0,2 ml. de H1SO"cone , misturando 0

conteudo suaverriente, girando 0tubo de ensaio. Retorne 0tubo

de ensaio para 0 banho de gelo por alguns minutos. Adicione,

entao, 1,5ml de KMnO" 6% PIV, agite cuidadosamente e deixe os

tubos frouxamente tampados A temperatura ambiente por 12 hs

Imediatamente antes da analise, adicione 0,3 ml de solucao de

hidrocloreto de hidroxilamina 20% para reduzir 0 excesso deKMn04 e proceda a determinaeao do mercuric por es-

pectrofotometria de absorcao atomica pela tecnica do vapor frio,

nos parametres recomendados pelo fabricante do equipamento

utilizado'", A calibracao pode ser feita com padroes aquosos,

desde que utilizando, no frasco de reacao, 0mesmo volume final

que as amostras (e). °limite de determinacao na urina esta em

tomo de 2.10"mg.L', dependendo da sensibilidade do equipamento

e do valor do branco « ( ) . Este limite de determinacao e suficiente

para 0controle do pessoal exposto.

6.2.6 Sistema de Controle de Qualidade

Existem, no mercado, varies materials de referencia para

mercario em urina, entre os quais "Lanonorm" (B1-CBM I, 2 e 3),

Behring Institute; "Contox" (KL 140-1ell), Kaulson Laboratories;

"Freeze Dried Urine" (SRM 2670). National Institute of Standards

and Technology e "Seronorm", (NYE 108), Nyegaard.

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OBSERVAC;OES

(a) Caso nao seja posslvel coletar a primeira urina da martha, pelo

menos coletar todas as amostras numa mesma hora, tal comoao final do dia de trabalho, p. ex.

(b) Frascos de polipropileno sao sugeridos por nao quebrarem

durante 0 transporte au congelamento da amostra. Na sua

indisponibilidade, frascos de vidro, devidamente lavados,

podem ser tambem utilizados. ° periodo permitido deestocagem deve, no entanto, ser checado.

(e) Algumas amostras poderao apresentar sedimentacao ao seremdescongeladas. Neste caso, basta hornogeneiza-las fortemen-

te antes de tomar-se a aliquota para a analise. Caso nao seja

possfvelcongela-las, pode-seadicionar K2S

20a (1 mgpor ml de

amostra), estocando-se a 4°C. Neste caso a amostra pod era

ser guardada por semanas.°congelamento e preferido porque,

ao prescindir do conservante, leva a menores brancos, 0 que

e importante, especialmente no caso de analise de amostras

com baixos teores (niveis normais). Amostras mantidas a 4°C,

sem conservante, em frascos de polipropileno, devem seranalisadas em 3 dias.

(d) Em alguns sistemas pode haver formacao de espuma durante

a determinacao instrumental. Neste caso, pode-se adicionar

urn anti-espumante, como 0 n-octanol. Preparados far-

maceuticos, como luftal ou congeneres, podem tarnbem dar

bons resultados.

(e) Caso 0 equipamento utilizado disponha de sistema dearnalgamacao em rede de ouro, a calibracao pode ser feita em

funcao da massa de mercuric, independentemente do volume

de dissolucao, Em equipamentos que utilizam sistemas de

injecao de fluxo, deve-se assegurar uma digestao completa,

sem residuos, uma vez que estes interferem na separacao gas-

liquido.

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(r) Limites de determinacao bern menores podem ser alcancados

se0equipamento dispee de sistema de amalgamacao em rede

de ouro.

6.3 Analise de Sangue

63.1 Caracteristicas Gerais

o eonteudo de mercuric no sangue reJaciona-secom a exposicao

aovapor de mercuric, com a ingestao de mercario ou seus cornpostose com 0aparecirnento de sintomas, ap6s urn determinado limiar.

Entretanto, deve-se ter em mente que, retirada a fonte de conta-

minacao, ha urna queda pronunciada do conteudo de mercuric no

sangue: a meia vida do mercuric no sangue (rnetil-rnercurio) est a

em torno de 3dias. Como ha uma relacao razoavelrnente constante

entre 0 teor de mercuric no sangue e no cabelo e destes com 0

"conteudo no corpo", cabelo tern sido preferido nos estudos de

exposicao a ingestao de metil-mercurio contido em alimentos,

especialmente peixe. No caso da exposicao aovapor de mercuric,a analise da urina tern sido preferida.

63.2 Determina~io: Mercurio Total

633 Coleta

Quantidade: 10 ml.

Material Utilizado: Seringa (e agulha)

descartavel, heparinizada.

Horario jEpoca: Final da semana de

trabalho.

Embalagem: Frasco de polipropilenow.

Conservante: Heparina.

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6.3.4 Armazenamento e Estocagem

Condicoes: Congelada em freezer, a -20°C. (b).

Perfodo Maximo de Estocagem: 1mes ,

Transporte: Manter congelado.

6.3.5 Metodo de Analise

Em erlenmeyer de 50 ml contendo 1 ml de agua , adicione200 ~ de sangue=. Adicione 2 m l de RNO] concentrado e deixe a

mistura descancar por 4 h. Adicione, entao, 10 ml de KMnO. 6%

P IV , homogeneizando suavemente. Deixe a mistura a 20°C por

16 h. Imediatamente antes da determinacao instrumental do

mercuric, adicione gotas de solu~o hidroxilamina 20% ate que a

cor violeta (excesso KMnO.) tenha desaparecido'". Proceda entao

a determinacao do mercurio por espectrofotometria de absorcao

atomica pela teenica do vapor frio, nos para metros recomendados

pelo fabricante do equipamento utilizado. A curva analitica deveser preparada peJa adicao de pequenos volumes de padroes de

mercuric, com concentracoes convenientes a aliquotas de 200 ~ de

uma amostra de sangue com baixo teor de mercuric (adi~o

padrao), submetidas ao mesmo tratamento que a amostra=',

6.3.6 Sistema de Controle de QuaUdade

Existem, no mercado, alguns materiais de referenda para

mercuric em sangue, entre os quais "Control Blood", BI-CBM-l,

2 (Behring Institute); "Control", KL 141,I e II, Kaulson Laboratories

e "Seronorm", (NYE 105 e 164). Nyegaard.

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OBSERVA(;OES

(.) Vide observacao "bM de item 6,2

(b) A amostra deve ser refrigerada a 4°C. caso deseje-se medir,

separadamente, mercuric no plasma e nas celulas vermelhas.

Entretanto, nestas condi~es, amostras contaminadas por

microorganismos podem levar a resultados erroneos, pela

quebra das l iga¢es Hg-C no metil mercWioou outros compostos

otgano-mercuriais. Amostras conservadas em frascos de

polipropileno, devem ser analisadas em ate 10 dias.

(c) Com este volume, 0 limite de determinacao no sangue deve

ficar em torno de 20.10-3 mg.L:', dependendo da sensibilidade

do equipamento e do branco. Este limite e suficiente para 0

controle de pessoal exposto e pode ser melhorado pelo uso de

um sistema de amalgamacao em rede de ouro.

(d) 0 volume da solucao de hidroxilamina deve ser 0mesmo em

cada batelada, para controle do branco.

(e) Vide observacao "dft

do item 6.2.

6:4 Analise de Cabelo

6.4.1 Caracteristicas Gerais

o cabelo tem sido considerado um born indicador para a

exposi~o de populacoes ao metil-mercario contido em alimentos.

Tern a vantagem de ser de facil coleta e preservacao e apresenta

nfveis de concentracao mais altos do que a urina e 0sangue, 0que

facilita a analise, Em term os individuais, somente casos extremos

de exposi~o podem ser caracterizados com seguranca, Nao existe

urn procedimento definitivo de lavagem do cabelo, que tern como

objetivo eliminar 0mercuric nao endogene. Deve-se ter em mente,

no planejarnento experimental, que a composicao do cabelo mudacom sua posicao anatomica no escalpo e, tambem, ao longo do fio,

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o que, neste ultimo easo, possibilita 0levantamento da hist6ria de

exposicao, tendo em vistaser a velocidade de erescimento docabelo razoavelmente eonstante. Verifica-se uma razao em torno

de 250 entre a concentracao de mercuric no eabelo e no sangue.

6.4.2 Determina~: MercUrio Total

6.4.3 Coleta

Quantidade: 0.3 g. ou mais, se foro easo da divisao da

mecha em segrnentos.

Material Utilizado: Tesoura de a~oinoxidavel,

Regiao Anatomica: Logo aeima da nuea.

Embalagem: Envelopes de papelbranco ou de plastico

transparente.

Conservante: ---

6.4.4 Armazenamento e Estocagem

Condicoes: Temperatura ambiente,

protegido de poeira.

Perfodo Maximo de Estoeagem: Anos.

Transporte:---

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6.4.5 M~todo de An4lise

A amostra deve ser lavada com porcoes sucessivas de 25 mlde acetona, agua, agua, agua e acetona, em bechers de 50 ml. Se

for 0caso, corte a mecha amostrada em pedacos de 1 em e lave

cada segmento da mecha separadamente. Deixe decantar, descarte

a solu\'3ode lavagem e deixe evaporar a acetona residual, garantindo

que nao haja contaminacao pela atmosfera do laborat6rio durante

a secagem. Pesecerca de 0.15gde amostra (a), transfira para tubas

longos (20 em). Adicione 10 ml. de mistura digestora (H2S0

4:

HN03• 1:1 + V

20

S' 0,5% P/V), cubra a boca do tubo com urn

pequeno vidro de rel6gio e deixe digerir por 30 minutos a 95°C,

em bloco digestor. Ap6s a digestao completa da amostra,retire os

tubos do bloco digestor, deixe resfriar A temperatura ambiente,

adicionando entao 3 gotas de perydrol (H20

230%). Transfira a

solucao para urn balao volumetrico de 50 ou 100 ml e adicione

KMn04 6% P/V (5 a 10 ml) ate fixa~ao da cor violeta e 1 ml de

K2Cr

20

71% PI V . Imediatamente antes da digestao, reduza 0

excesso de oxidante com hidrocloreto de hidroxilamina 20% P I

V(b), afira 0volume com agua deionizada, homogenize e proceda

a determinacao de mercuric par absorcao atomica, pela tecnica

do vapor frio, obedecendo aos parametres instrumentais indicados

pelo fabricante do equiparnento. A calibracao pode ser feita compadroes aquosos (C).

6.4.6 Sistema de Controle de Qualidade

Materiais de referencia de cabelo nao sao disponfveis dos

fomecedores usuais. Existem algumas amostras preparadas para

exercfciosinter-laboratoriais. E passive!preparar materiais pr6prios

de referencia, pela pulverizacao de uma quantidade grande de

cabelo e submetendo-o a analise em laborat6rios de referencia.

OBSERVA(;OES

(a) Para esta massa, 0limite de determinacao esta em tome de

0.070mg/kg no cabelo. Este limite de detamina~o e suficiente

para a maior parte dos casos, mas pode ser melhorado

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aumentando-se a massa digerida. °uso de menores massaspodera vir a ser necessario no caso de analise dos seguirnentos.

(b) Os volumes das solucoes de hidroxilamina e KMnO ..devem

ser, respectivamente, os mesmos a cada batelada, para

oontrole do branco.

(c) Uma imensa variedade de marchas analiticas e encontrada na

literatura. As aqui indicadas para os tres tipos de amostra em

questao foram escolhidas por serem consideradas simples,

acessfveis e usuais ao analista (digestao acida) levando, pela

experiencia dos autores, a bons resultados. Observe-se quenenhuma faz uso de refluxo ou sistema fechado. Temos

verificado que os problemas de eontaminaeao tern semostrado

mais serios que os de perda. Isto nao implica que os riscos de

perda devam ser desconsiderados mas, mantendo-se sempre.

o meio suficientemente acido e oxidante, e evitando-se a

ebulicao, pode-se evitar perdas por volatilizacao, nos nfveis

considerados.

Os teores de mercUriototal considerados como normais (pessoasnao expostas) pelo OMS sao 5-10 II-g.L-l(sangue), ate 4 II-g.L-l

(urina) e 1 a 2 II-g.g1(cabelo). Os limites de tolerancia biol6gica,

ainda pela OMS, sao 30 II-g.L-l(sangue, exposicao ao vapor de

mercuric), 100 II-g.L-l(sangue, exposicao a metil-mercurio), 50

ug.g' de creatinina luxina) e 611-g.L-lcabelo). Assim, a interpretacao

dos resultados obtidos pode ser feita a luz desses valores,

considerando-se tameem 0desenho da amostragem, a fonte provavel

de contaminacao, a estatfstica do tratamento de dados e tendo-se

sempre em mente que as relacoes dose-concentracao-sintomas saofortemente dependentes das caraeterfsticas do individuo. Erecomendado, pais , que os estudos sejam feitos em base populacional,

com cuidadoso planejamento da amostragem e levantamento dos

fatores que possam tambem correlacionar-se com as respostas

buscadas.

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Bibliografia Consultada

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PUblica 1986;2(3):359-372.

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Autores:

Dr. Reinaldo C. CAMPOS

Pontificia Universidade Cat6lica

do Rio de Janeiro e Universidade Federal

Fluminense.

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Quimica

G'vea, Rio de Janeiro, RJ 22453

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