Aluno : João Paulo Lourenço Franco CairoOrientador: Prof. Dr. Gonçalo A. G. PereiraCo-Orientador: Fábio Marcio Squina

Introdução Bioenergia e Bioetanol de 2º geração Hidrolases glicolíticas Biologia de cupim e de Coptotermes gestroi Hidrolases glicolíticas em cupim

Objetivos Plano de trabalho Resultados preliminares Perspectivas

Introdução - Bioenergia e Bioetanol de 2º geração

A problemática dos combustíveis fósseis

Energias Alternativas Renovável Sustentável

Biomassa O que é Biomasa? 60% Biomassa vegetal 90 % Compostos

lignocelulósicos Parede celular Vegetal

Introdução - Bioenergia e Bioetanol de 2º geração

A problemática dos combustíveis fósseis

Energias Alternativas Renovável Sustentável

Biomassa O que é Biomasa? 60% Biomassa vegetal 90 % Compostos

lignocelulósicos Parede celular Vegetal

Bioetanol 1º Geração

Caldo da cana 2 º Geração

Material lignocelulósico

Métodos de obtenção de 2º Geração Hidrólise Física e

Química Hidrólise Enzimática

Introdução - Bioenergia e Bioetanol de 2º geração

O que fazem?

Classificadas em Famílias Cazy GH1 = B-Glicosidases GH 7 e 9 = Endo-

Beta-Glicosidases GH12 = Endo-beta-

Xilanases

Tipos: Domínio Único Multidomínio

Introdução – Hidrolases Glicolíticas

O que fazem?

Classificadas em Famílias Cazy GH1 = B-Glicosidases GH 7 e 9 = Endo-

Beta-Glicosidases GH12 = Endo-beta-

Xilanases

Tipos: Domínio Único Multidomínio

Introdução – Hidrolases Glicolíticas

Biologia de cupim e de Coptotermes gestroi

Insetos sociais

Ordem Isoptera

7 Famílias Cupins superiores Cupins inferiores 2.700 espécies

Origem no cretáceo Barata altamente

especializada

BIORREATOR NATURAL

OVOS

LARVA

PRÉ – SOLDADO SOLDADONINFA

ALADOS PRÉ – REPRODUTOR NEOTÊNICOREI E RAINHA

LINHAGEM IMAGINAL LINHAGEM NEUTRA

OPERÁRIO

OVOS

LARVA

PRÉ – SOLDADO SOLDADONINFA

ALADOS PRÉ – REPRODUTOR NEOTÊNICOREI E RAINHA

LINHAGEM IMAGINAL LINHAGEM NEUTRA

OPERÁRIO

OVOS

LARVA

PRÉ – SOLDADO SOLDADONINFA

ALADOS PRÉ – REPRODUTOR NEOTÊNICOREI E RAINHA

LINHAGEM IMAGINAL LINHAGEM NEUTRA

OPERÁRIOOPERÁRIO

Castas em Coptotermes gestroi

Coptotermes gestroi Espécie exótica Origem asiática Família Rhinotermitideae Xilófagos Cupim praga

EST´s de C. gestroi (2006) 1200 reads 218 contigs 220 singlets 2 sequências para Celulases

Hidrolases glicolíticas em cupim

Enzimas endógenas Endo-Beta-Glicosidase Beta-Glicosidase

Coptotermes formosanus Neotermes koshunensis

Enzimas simbiônticas (metagenômica) Xilanses Carboxi Estereases Pectinases

Quase nenhum dado de Proteoma e carcterização bioquímica

Identificar as hidrolases glicolíticas das frações do extrato cru protéico de Coptotermes gestroi por FPLC e purificá-las. Caracterizar bioquimicamente essas frações

Identificação e sequenciamento protéico por MS/MS das frações do extrato cru e classificação com base no banco de dados de hidrolases glicolíticas (CAZY)

Identificar possíveis alvos de clonagem para posterior expressão heteróloga e suas respectivas espécies produtoras.

Clonagem das celulases endógenas identificadas na biblioteca de ESTs do cupim Coptotermes gestroi, e expressar heterologamente em modelo procarioto e caracterizar bioquimicamente.

Extração de RNA.

Clonagem das celulases identificada a partir do banco de ESTs de Coptotermes gestroi

Expressão heteróloga em modelo procariótico (Escherichia coli)

Purificação e caracterização enzimática

Extração protéica (Diversos pH)

Purificação por FPLC (troca iônica), identificação das frações com atividade e filtração em gel das mesmas

Liofilização das amostras e seqüenciamento e identificação por MS/MS

Apresentação de alvos para posteriores clonagens

Caracterização das frações purificadas ou parcialmente : pH ótimo, Temp ótima, teste de Inibição e co-fator.

Clonagens dos genes de celulases endógenas Endo-Beta-Glicosidase (resultado Flávia)

Beta-Glicosidase 3´UTR (resultado Flávia)

5´ UTR (RACE)

300 pb100 pb

~280à 300 pb

N.koshunensis

N.koshunensis C.gestroi

C.gestroi

endo-b-1,4-glucanase [Coptotermes formosanus]

endo-b-1,4-glucanase [Coptotermes gestroi] 1299 pb

Score = 645 bits (1665), Expect = 0.0 Identities = 349/389 (89%), Positives = 355/389 (91%), Gaps = 8/389 (2%) Frame = +1

Screening do estrato protéico de Coptotermes gestroi para diversos substratos pH 5.5 pH 10.0

Ensaio enzimático das divisões do cupim (corpo, cabeça e total) em tampão SAB 0,1 M e pH 5.5

Ensaio enzimático das divisões do cupim (corpo, cabeça e total) em tampão Glicina 0,1 M e pH 10,6

Screening do estrato protéico de Coptotermes gestroi para diversos substratos pH 5.5 pH 10.0 Redução de atividades de

Liquenana,CMC,Xilana em pH Básico e aumento da atividade contra Pectinas e Arabinanas

FPLC de troca iônica Resource Q (Aniônica) Fosfato Potássio buffer pH 6.2 Atividade das frações (1,5 ml)

Substrato/U FraçõesXilana/ 1,9 18,19,20

Liquenana/ 5,5 11,12CMC/0,9 3, 13

Manana/3,0 21,22

Frações de atividade para manana já foram enviadas para MS/MS

A geração de informação para o desenvolvimento de um coquetel de enzimas, co-fatores e nutrientes que mimetize o trato intestinal do cupim em escala laboratorial e industrial

OBRIGADO!!!