Aluna: Marcela ArnaldoMestrado em Ciências (PPG CENA/USP)Área de concentração: Biologia na Agricultura e no Ambiente

Universidade de São PauloCentro de Energia Nuclear na Agricultura

CEN5749-2 Biogeoquímica do Nitrogênio em Ecossistemas tropicais

IntroduçãoMicrorganismos do solo: mineralização da matéria orgânica.

o Influência sobre a produtividade em sistemas agrícolas: degradam os resíduos e disponibilizam nutrientes essenciais para as plantas (ex: Nitrogênio).

Resíduos de culturas: diferem quanto a decomposição (relação C/N, tipos de compostos etc.).

Processos pouco compreendidos em agro-ecossistemas tropicaiso Identificação dos microrganismos envolvidos: possibilita manejo com o

objetivo de preservar a produtividade

IntroduçãoSIP (Stable Isotope Probing)

o Permite determinar os microrganismos envolvidos num processo

IntroduçãoGene RNAr 16S: espécies ≠ sequências ≠DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)

o Separa sequências diferentes, de acordo com a composição de bases (A, T, C e G)

Aum

ento

na

conc

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ação

de

reag

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s de

snat

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tes

DGGE

Espécie 1 Espécie 2 Espécie 3FraçãoLeve

SEQUENCIAMENTO DAS BANDAS

Identificação das espécies microbianas

Fração Pesada

ObjetivoIdentificar as bactérias envolvidas na degradação de

resíduos de milho e soja, os quais apresentam características bioquímicas contrastantes.

Materiais e MétodosPreparo de materiais e obtenção de amostras

Resíduos vegetais de milho e soja Preparo: solução com 15NH4

15NO3 (99 átomos %) ou 14NH414NO3 por 75

dias – espectrômetro (NOI-6EPC) marcados: 90 átomos %

SoloTipo de solo: Vertissolo 0-20 cm de área experimental

(estado de Aragua, Venezuela).Características: 15,2 g kg−1 de Corgânico, 1.4 gN kg−1, pH (H2O) 6.7

e textura argilosa (7% areia, 35% silte e 58% argila).

Resíduo Ntotal C:Ntotal Lignina : Ntotal Celulose

Milho 1,21% 32 2,2 24,9%

Soja 2,71% 15 1,1 15,5%

Materiais e MétodosMontagem do experimento de incubação

Tratamentos (em triplicata)100g de solo + 1 g de resíduo de soja marcado (15N)100g de solo + 1 g de resíduo de soja não-marcado100g de solo + 1 g de resíduo de milho marcado (15N)100g de solo + 1 g de resíduo de milho não-marcado100 g de solo sem adição de resíduo

Incubação15 dias a 25°CUmidade controlada (40% C. C.)

Materiais e MétodosSIP

Extração de DNA0,3g de solo “FastDNA Spin Kit” (MP Biomedicals)

UltracentrifugaçãoDNA em tubos com solução de CsCl 140.000 g por 69 horas

Separação das fraçõesParte do gradiente contendo DNA 6 frações Para cada fração: concentração de DNA e enriquecimento

em 15N (analisador elementar Euro EA 3000 acoplado a espectrômetro de massas de razão isotópica DeltaPlus XP)

Materiais e MétodosDGGE

Amplificação do gene RNAr 16SReação de PCR, utilizando DNA de cada fração

GelPoliacrilamida (6%) com gradiente variando entre 40 e 70%Bandas que apresentaram padrões diferentes entre os

tratamentos sequenciamentoComparação das sequências com as de bancos de dados

identificação da espécie

ResultadosSIP

Separação do DNA de acordo com a densidade

Fig 1. Gradientes de densidade em CsCl do DNA do solo não marcado e marcado com 15N quinze dias após a aplicação dos resíduos (A - milho; B - soja), mostrando as concentrações de DNA (ng µL-1) como medida das três replicatas para todas as frações analisadas (#1 ‘pesada’ a #6 ‘leve’) assim como o enriquecimento em 15N (atom%) nas frações.

Fig 1. Gradientes de densidade em CsCl do DNA do solo não marcado e marcado com 15N quinze dias após a aplicação dos resíduos (A - milho; B - soja), mostrando as concentrações de DNA (ng µL-1) como medida das três replicatas para todas as frações analisadas (#1 ‘pesada’ a #6 ‘leve’) assim como o enriquecimento em 15N (atom%) nas frações.

ResultadosDGGE

Fig 2. Padrões de DGGE do gene RNAr 16S obtido das frações de DNA ao longo do gradiente de densidade em CsCl (#1 ‘pesada’ a #6 ‘leve’) dos controles não marcados e dos tratamentos com resíduos marcados com 15N de milho (A) e soja (B). C- controle sem nenhuma aplicação de resíduo; M- solo tratado com resíduo de milho sem passar pela centrifugação; S- solo tratado com resíduo de soja sem passar pela centrifugação. Flechas indicam bandas selecionadas para o sequenciamento.

ResultadosSequenciamento de bandas

Tabela 1. Atribuição filogenética das sequências do gene RNAr 16S obtidas de quatro bandas de DGGE selecionadas (M1-M4; S1-S4) na fração ‘pesada’ #1, do experimento com resíduo enriquecido em 15N

DiscussãoConclusões

Metodologia permitiu detectar as espécies bacterianas envolvidas na decomposição dos resíduos orgânicos

Características bioquímicas dos resíduos induzem resposta de membros específicos da comunidade microbiana

DificuldadesDeterminar quantidade de resíduo a ser adicionadaTempo de incubaçãoNecessidade de material altamente enriquecido

Análise do artigoPontos positivos

Metodologia adequada (uso de 15N)Reconhecimento das limitaçõesDiscussão cuidadosa

Pontos negativosFalta de alguns detalhes da montagem do experimentoTeste de uma única condição de incubaçãoNão discute sobre as possíveis aplicações do

conhecimento gerado