UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE NICARAGUAUNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE NICARAGUAUNAN-MANAGUAUNAN-MANAGUA

MINISTERIO DE SALUDMINISTERIO DE SALUDMINSAMINSA

Aislamiento Viral – Dengue – Influenza.

Autores: Br. Rivas Solano, Abigail JocabedBr. Pichardo Luna, Ruth del SocorroBr. Campos Baca, Kathy FrancellaBr. Garcia Jimenez, Maria ErnestinaBr. Quezada Gutierrez, Darlin MariaBr. Barrios Villanueva, Erick FranciscoBr. Amador, Renaldy José  Carrera: Bioanálisis ClínicoV año

Managua, Octubre 2012

ObjetivosObjetivos

1.1. Destacar Generalidades del aislamiento celular, tipos de celulas y Destacar Generalidades del aislamiento celular, tipos de celulas y su lineaje.su lineaje.

2.2. Mencionar aspectos generales de los agentes causales del Dengue Mencionar aspectos generales de los agentes causales del Dengue e Influenza e Influenza

3.3. Mencionar los métodos tradicionales y actuales de aislamiento Mencionar los métodos tradicionales y actuales de aislamiento viral.viral.

4.4. Describir los procedimientos tradicionales y actuales de Describir los procedimientos tradicionales y actuales de aislamiento e identificación del virus del dengue e influenza.aislamiento e identificación del virus del dengue e influenza.

IntroducciónIntroducciónLos virus, a diferencia de los que sucede con la mayoría de las bacterias, hongos y Los virus, a diferencia de los que sucede con la mayoría de las bacterias, hongos y protozoos, sólo pueden multiplicarse en el interior de células vivas, no pudiendo protozoos, sólo pueden multiplicarse en el interior de células vivas, no pudiendo hacerlo en un medio nutritivo carente de células.hacerlo en un medio nutritivo carente de células.  Los sistemas celulares utilizados para propagar los virus en el laboratorio son:Los sistemas celulares utilizados para propagar los virus en el laboratorio son:1. Animales de experimentación1. Animales de experimentación2. Embriones animales2. Embriones animales3. Cultivos celulares artificiales3. Cultivos celulares artificiales  

Un aislamiento viral es una técnica de alta sensibilidad y especificidad que utiliza cultivos celulares Un aislamiento viral es una técnica de alta sensibilidad y especificidad que utiliza cultivos celulares como biosustratos. Estas líneas celulares son obtenidos de a partir de explantes de órganos o células como biosustratos. Estas líneas celulares son obtenidos de a partir de explantes de órganos o células embrionarias.embrionarias.

Tipos de cultivos celularesCultivos primarios:Cultivos primarios: Se obtienen mediante la dispersión de tejidos tomados Se obtienen mediante la dispersión de tejidos tomados directamente del organismo soportan hasta 3 pases (ej. Células de Riñón embrionario)directamente del organismo soportan hasta 3 pases (ej. Células de Riñón embrionario)  Líneas celulares diploides: Líneas celulares diploides: Células que toleran un número mayor de pases Células que toleran un número mayor de pases (aproximadamente 50) pero presentan un crecimiento normal ya que conservan hasta (aproximadamente 50) pero presentan un crecimiento normal ya que conservan hasta 75% de su cariotipo original.(ej. Fibroblastos de pulmón)75% de su cariotipo original.(ej. Fibroblastos de pulmón)  Líneas celulares continuas: Líneas celulares continuas: son capaces de crecer indefinidamente, presentan un son capaces de crecer indefinidamente, presentan un número alterado de cromosomas ya que son de origen maligno o canceroso. Soportan número alterado de cromosomas ya que son de origen maligno o canceroso. Soportan subcultivos mayores a 75 pases. Algunas de estas son: subcultivos mayores a 75 pases. Algunas de estas son:

HEP-2 HEP-2 LLC-MK2 LLC-MK2 MDCK MDCK MRC5MRC5

Cuando se requiere un aislamiento viral?Cuando se requiere un aislamiento viral?-Ocurren nuevas epidemias-Ocurren nuevas epidemias-Las pruebas serológicas se traslapan-Las pruebas serológicas se traslapan-Confirmación de un diagnostico presuntivo realizado al microscopio -Confirmación de un diagnostico presuntivo realizado al microscopio electrónicoelectrónico-Una misma enfermedad causada por diferentes agentes-Una misma enfermedad causada por diferentes agentes

Se obtiene un aislamiento viral cuando:Se obtiene un aislamiento viral cuando:-Se produce el efecto citopático-Se produce el efecto citopático-Aparece una proteína codificada por el virus -Aparece una proteína codificada por el virus -Hemadsorción-Hemadsorción-Interferencia -Interferencia -Transformación -Transformación -Alteración específica o muerte del animal-Alteración específica o muerte del animal-Aparición de placas en el huevo embrionario-Aparición de placas en el huevo embrionario

DengueDengue

El El dengue dengue es una enfermedad viral aguda, es una enfermedad viral aguda, producida por el virus del producida por el virus del denguedengue, transmitida , transmitida por el mosquito por el mosquito Aedes aegyptiAedes aegypti que se crían en el que se crían en el agua acumulada en recipientes y objetos en agua acumulada en recipientes y objetos en desuso. El dengue es causado por cuatro serotipos desuso. El dengue es causado por cuatro serotipos del virus del dengue: DEN-1, DEN-2, DEN-3 ó del virus del dengue: DEN-1, DEN-2, DEN-3 ó DEN-4. Son miembros de la familia DEN-4. Son miembros de la familia flaviviridaeflaviviridae, , genero genero flavivirusflavivirus y presentan una estructura y presentan una estructura genómica común cada uno con antígenos genómica común cada uno con antígenos comunes y específicos propios de cada serotipo. comunes y específicos propios de cada serotipo. Es un ARN de cadena simple de Es un ARN de cadena simple de aproximadamente 11kb y polaridad positiva aproximadamente 11kb y polaridad positiva codifica para 3 proteínas estructurales (Envoltura codifica para 3 proteínas estructurales (Envoltura cápside y membrana) y 7 no estructurales.cápside y membrana) y 7 no estructurales.

InfluenzaInfluenza

Influenza es una enfermedad infecciosa que se propaga Influenza es una enfermedad infecciosa que se propaga por aerosoles y que infecta las vías respiratorias por un por aerosoles y que infecta las vías respiratorias por un tipo devirus de ARNde la familia de los tipo devirus de ARNde la familia de los Orthomyxoviridae. Su tiempo de incubación va entre 1-Orthomyxoviridae. Su tiempo de incubación va entre 1-4 dias.4 dias.  Entre los tipos de virus de la influenza comprenden:Entre los tipos de virus de la influenza comprenden: •Influenza A: Que a su vez se divide en 10 serotipos Influenza A: Que a su vez se divide en 10 serotipos (H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H7N7, H1N2, H9N2, (H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H7N7, H1N2, H9N2, H7N2, H7N3, H10N7)H7N2, H7N3, H10N7)•Influenza BInfluenza B•Influenza CInfluenza C

Técnicas de aislamiento viralTécnicas de aislamiento viral

Las técnicas de aislamiento viral se han venido Las técnicas de aislamiento viral se han venido desarrollando a los largo del tiempo desde su uso. Aún si desarrollando a los largo del tiempo desde su uso. Aún si existen técnicas, relativamente nuevas, siempre se remontan existen técnicas, relativamente nuevas, siempre se remontan a técnicas tradicionales en casos en que las actuales existan a técnicas tradicionales en casos en que las actuales existan un diferimiento o dificultad para su debida detección.un diferimiento o dificultad para su debida detección.  Las técnicas directas para demostración viral se basan en la Las técnicas directas para demostración viral se basan en la visualización de la partícula viral o su efecto celular visualización de la partícula viral o su efecto celular especifico como tinciones de microscopia de luz, electrónica especifico como tinciones de microscopia de luz, electrónica y cultivo o aislamiento viral.y cultivo o aislamiento viral.  Existen técnicas tradicionales y actuales entre las Existen técnicas tradicionales y actuales entre las tradicionales tenemos:tradicionales tenemos:

Técnicas tradicionales de aislamiento viralTécnicas tradicionales de aislamiento viral

Inoculación en animalesInoculación en animalesLa inoculación de animales de laboratorio con material infeccioso puede La inoculación de animales de laboratorio con material infeccioso puede constituir el primer paso en la identificación viral. El animal mas utilizado es el constituir el primer paso en la identificación viral. El animal mas utilizado es el ratón blanco que dependiendo del virus a estudiar se utilizan adultos o recién ratón blanco que dependiendo del virus a estudiar se utilizan adultos o recién nacidos. nacidos. La inoculación es usualmente intracerebral con un inóculo de 0.03 ml o La inoculación es usualmente intracerebral con un inóculo de 0.03 ml o intraperitoneales donde se pueden administrar dosis mayores.intraperitoneales donde se pueden administrar dosis mayores.

Inoculación en huevos embrionariosInoculación en huevos embrionariosPuede ser utilizado para el aislamiento y cultivo del virus como fue Puede ser utilizado para el aislamiento y cultivo del virus como fue demostrado en la década de los treinta por Goodpasteur y Burnet. Inicialmente demostrado en la década de los treinta por Goodpasteur y Burnet. Inicialmente se utilizo para trabajo con influenza y luego con otros virus como rubeola, se utilizo para trabajo con influenza y luego con otros virus como rubeola, herpes simplex.herpes simplex.Estos pueden inocularse en diferentes vías dependiendo del agente a estudiar. Estos pueden inocularse en diferentes vías dependiendo del agente a estudiar. El aislamiento viral será evidenciado por muerte embrionaria y aislamiento del El aislamiento viral será evidenciado por muerte embrionaria y aislamiento del mismo del liquido alantoideo. mismo del liquido alantoideo.

Técnicas tradicionales de aislamiento viralTécnicas tradicionales de aislamiento viral

Otras técnicas semi-tradicionalesOtras técnicas semi-tradicionalesSe utilizan para descubrir anticuerpo contra determinado agente viral, estos Se utilizan para descubrir anticuerpo contra determinado agente viral, estos ensayos se clasifican embace a la cuantificación antígeno-anticuerpoensayos se clasifican embace a la cuantificación antígeno-anticuerpoLos que dependen de la capacidad del anticuerpo que se una al antígeno para Los que dependen de la capacidad del anticuerpo que se una al antígeno para ejercer función no relacionada con el antígeno: ejercer función no relacionada con el antígeno: fijación del complemento y fijación del complemento y hemaglutinación.hemaglutinación.Los que miden la capacidad de los anticuerpo para bloquear la función viral Los que miden la capacidad de los anticuerpo para bloquear la función viral especifica como la especifica como la inhibición de la hemaglutinación inhibición de la hemaglutinación

Cultivo celularCultivo celularEstándar de oro para la detección de un virus.Estándar de oro para la detección de un virus.Un cultivo celular se deriva del crecimiento de células que emigran de un tejido o Un cultivo celular se deriva del crecimiento de células que emigran de un tejido o por células que se obtienen por dispersión enzimática a partir del tejido. por células que se obtienen por dispersión enzimática a partir del tejido.

Técnicas actuales de aislamiento viralTécnicas actuales de aislamiento viralTécnicas directas utilizadas actualmente para la demostración viral.Técnicas directas utilizadas actualmente para la demostración viral.

  

Las pruebas para demostrar antígenos vírales que permiten descubrir y caracterizar un Las pruebas para demostrar antígenos vírales que permiten descubrir y caracterizar un virus en cultivo celular cuando todavía no se produce el efecto citopático o aun no se virus en cultivo celular cuando todavía no se produce el efecto citopático o aun no se evidencia o en los casos en que el virus se debe reconocer por otras propiedades o evidencia o en los casos en que el virus se debe reconocer por otras propiedades o características en cultivo, entre estas tenemos: características en cultivo, entre estas tenemos:

•La hemadsorción, La hemadsorción,

•Inmunofluorescencia directa, Inmunofluorescencia directa,

•Radioinmunoensayo, Radioinmunoensayo,

•ELISA.ELISA.

  

Las que evidencia o descubren material genético específico viral conservadas y Las que evidencia o descubren material genético específico viral conservadas y replicables ya sea en un fluido, célula o tejido entre estos están(Biología Molecula): replicables ya sea en un fluido, célula o tejido entre estos están(Biología Molecula):

•Reacción en cadena de la polimerasa(PCR)Reacción en cadena de la polimerasa(PCR)

•Reacción en cadena de la ligasa(LCR)Reacción en cadena de la ligasa(LCR)

•Hibridación.Hibridación.

Diagnostico DengueDiagnostico Dengue

Las técnicas más utilizadas para el aislamiento Las técnicas más utilizadas para el aislamiento viral para dengue es el cultivo celular.viral para dengue es el cultivo celular.Procedimiento:Procedimiento:En el diagnostico de rutina se recomienda la En el diagnostico de rutina se recomienda la inoculación de muestras de sueros diluidas 1/30 e inoculación de muestras de sueros diluidas 1/30 e inoculadas en volúmenes de 0.1 ml en monocapas inoculadas en volúmenes de 0.1 ml en monocapas de células C6-36/HT sembradas en tubos.de células C6-36/HT sembradas en tubos.El aislamiento es identificado con IFEl aislamiento es identificado con IF

Otras LineasOtras Lineas

Existen línea celular de mamíferos que se han Existen línea celular de mamíferos que se han usado para el aislamiento de estos virus usado para el aislamiento de estos virus (LLCMK2; y BHK21). Las células de mosquito (LLCMK2; y BHK21). Las células de mosquito que se han utilizados para el aislamiento viral son que se han utilizados para el aislamiento viral son mas sensibles, fáciles de multiplicar y mantener a mas sensibles, fáciles de multiplicar y mantener a temperatura ambiente y pueden estar hasta 14 días temperatura ambiente y pueden estar hasta 14 días sin cambiar desin cambiar de

medio de cultivo, se pueden inocular directamente con el suero del paciente. Entre estas líneas medio de cultivo, se pueden inocular directamente con el suero del paciente. Entre estas líneas celulares del mosquito tenemos: (AP61; C636; Tra284; CLA-1).celulares del mosquito tenemos: (AP61; C636; Tra284; CLA-1).

Diagnostico InfluenzaDiagnostico Influenza

Los procedimientos de diagnostico del virus influenza se pueden clasificar en:Los procedimientos de diagnostico del virus influenza se pueden clasificar en:

1. Diagnostico virológico basados en detección del agente viral por: aislamiento en 1. Diagnostico virológico basados en detección del agente viral por: aislamiento en cultivos celulares o huevos embrionados (Posterior se realiza extracción del liquido cultivos celulares o huevos embrionados (Posterior se realiza extracción del liquido amniótico y alantoideo a prueba de hemaglutinina), detección de antígeno y amniótico y alantoideo a prueba de hemaglutinina), detección de antígeno y amplificación parcial del genoma viral por RT-PCR.amplificación parcial del genoma viral por RT-PCR.

2. Diagnostico serológico basados en la detección y medida de niveles de anticuerpos 2. Diagnostico serológico basados en la detección y medida de niveles de anticuerpos en sueros pareados utilizando las técnicas de inmunodifusión en agar (IDA), ensayo en sueros pareados utilizando las técnicas de inmunodifusión en agar (IDA), ensayo inmunoenzimático (ELISA) o inhibición de la hemaglutinación (IHA).inmunoenzimático (ELISA) o inhibición de la hemaglutinación (IHA).

Cultivo celular en MDCKCultivo celular en MDCK

200 μl de cada espécimen en un frasco de cultivo de células 200 μl de cada espécimen en un frasco de cultivo de células dejando adsorber por 30 minutos a 37°C y luego incubar a dejando adsorber por 30 minutos a 37°C y luego incubar a 33°C en incubadora de CO233°C en incubadora de CO2

Cosechar si ECP 3+ ó 4+ o si no hay ECP en 6-7 y someter a Cosechar si ECP 3+ ó 4+ o si no hay ECP en 6-7 y someter a HA e identificar subtipo por IHA o RT-PCRHA e identificar subtipo por IHA o RT-PCR