UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE

PROGRAMA DE POS-GRADUAÇÃO EM FISIOTERAPIA

ADAPTAÇÕES FISIOLÓGICAS CARDIOVASCULARES E

MUSCULARES AO TREINAMENTO RESISTIDO DE

ALTA INTENSIDADE EM RATOS

ESTUDO I: “Efeitos metabólicos e do controle autonômico da freqüência cardíaca

após treinamento resistido progressivo de alta intensidade em ratos”.

ESTUDO II: “Efeito do treinamento resistido progressivo de alta intensidade na

atividade das metalopeptidases de matriz em ratos”

Aluno: Ana Paula Lima de Deus

São Carlos - SP

2008

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II

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE

PROGRAMA DE POS-GRADUAÇÃO EM FISIOTERAPIA

ADAPTAÇÕES CARDIOVASCULARES E MUSCULARES

AO TREINAMENTO RESISTIDO DE ALTA

INTENSIDADE EM RATOS

ESTUDO I: “Efeitos metabólicos e do controle autonômico da freqüência cardíaca

após treinamento resistido progressivo de alta intensidade em ratos”.

ESTUDO II: “Efeito do treinamento resistido progressivo de alta intensidade na

atividade das metalopeptidases de matriz em ratos”

Aluno: Ana Paula Lima de Deus Dissertação de MESTRADO apresentada ao Programa de Pós-graduação em Fisioterapia, da Universidade Federal de São Carlos – UFSCar, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Fisioterapia, área de concentração: Processos de avaliação e intervenção em Fisioterapia. Orientadora: Audrey Borghi e Silva

São Carlos - SP

2008

Ficha catalográfica elaborada pelo DePT da Biblioteca Comunitária da UFSCar

D486af

Deus, Ana Paula Lima de. Adaptações fisiológicas cardiovasculares e musculares ao treinamento resistido de alta intensidade em ratos / Ana Paula Lima de Deus. -- São Carlos : UFSCar, 2009. 69 f. Dissertação (Mestrado) -- Universidade Federal de São Carlos, 2008. 1. Exercícios – força. 2. Variabilidade da freqüência cardíaca. 3. Lactato. 4. Sensibilidade à insulina. 5. Tolerância à glicose. Título. CDD: 615.82 (20a)

IV

Ana Paula Lima de Deus

ADAPTAÇÕES CARDIOVASCULARES E MUSCULARES

AO TREINAMENTO RESISTIDO DE ALTA

INTENSIDADE EM RATOS

Dissertação de MESTRADO apresentada ao Programa de Pós-graduação em Fisioterapia, da Universidade Federal de São Carlos – UFSCar, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Fisioterapia, área de concentração: Processos de avaliação e intervenção em Fisioterapia. Aprovado em 20 de Dezembro de 2008

BANCA EXAMINADORA

PRESIDENTE: Profa Dra AUDREY BORGHI E SILVA (Orientadora)

10 EXAMINADOR: Profa Dra KARINA MARIA CANCELLIERO UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS – UFSCar

20 EXAMINADOR: Profo Dr JOÃO LUIZ QUAGLIOTTI DURIGAN

UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA – UFPB

V

DEDICATÓRIA

Aos PAIS que Deus me deu...

MARIVANDA E RUBÊNIO, que me amaram de forma infinita desde o dia

em que me conceberam, respeitaram as minhas escolhas muitas vezes

erradas, me acolheram quando todos viraram as costas para mim, me

enxergaram como o ser humano que sou quando todos me viam como

alguém que não sou, enfim... Agradeço e dedico a conclusão desta etapa a

vocês que com suas preces e seu amor compartilharam comigo cada fase

deste trabalho.

A minha irmã,

ANABELA, que vi crescer e se tornar uma mulher, e além de tudo se tornar

minha amiga. E que mesmo longe torce por mim e por minhas conquistas.

Obrigado pelo amor e pelo ombro.

A minha família materna,

Que ajudaram meus pais a suportar a distância, a superar cada dia, e a

entender a importância de eu estar aqui com esta conquista nas mãos.

Que Deus os abençoe e lhes dê o sustento quando necessitarem.

A minha avó,

CARMELITA, que Deus recolheu, mas que durante seus dias nesta terra

me amou docemente e me apoiou com suas palavras e suas orações.

Obrigada e que Deus te acolha em seu Reino.

Ao meu esposo e pai do meu filho (a)

CLÁUDIO ARRIGETO

Que com paciência e amor foi capaz de suportar meu mau humor, meu

cansaço; além disto, me ouviu atentamente quando necessitei, e que me

esperou tanto na frente do laboratório que até dormiu. E principalmente,

me amou e ama de uma forma calma e linda, me fazendo acreditar que o

AMOR pode chegar, e que a PAZ pode acampar em nós.

VI

Amo-te intensamente!!!!

Ao meu filho (a)

Realização do meu sonho!!! Que ainda em meu ventre e tão pequenino

sofreu o meu stress, possibilitando-me conquistar este título. E que além

disto, me proporcionou a calma e o amor necessários para escrever esta

dissertação.

Razão do meu viver... Te amo!!!!

VII

AGRADECIMENTOS

A Deus e ao Meu Mestre Jesus,

Que me carregaram quando minhas pernas já não mais suportavam

caminhar, que me deram forças quando achei que era hora de parar, de

desistir, e que me fizeram acreditar que posso e sou mais, muito mais do

que acredito. Agradeço pelo novo ser que sou, e pela Paz tão idealizada

que hoje sinto.

À Profa. Dra. Audrey Borghi e Silva,

Que como minha amiga-orientadora me recebeu nesta cidade com carinho,

me amou e acreditou em mim e em meu potencial sem me conhecer, me

dando sempre a chance de me mostrar como pessoa e pesquisadora.

Além disto, foi sempre um ombro e um ouvido presente e sempre atento aos

meus sentimentos, nunca deixando faltar um sorriso, um conselho e um

abraço.

Agradeço também por ter confiado a mim a missão de desbravar um novo

caminho experimental em nosso laboratório, pois graças a esta

oportunidade me sinto mais forte e mais pronta.

Aos animais, aos biotérios que gentilmente os cederam

para nós e ao Departamento de Fisioterapia que disponibilizou o biotério

local para a acomodação dos mesmos.

Ao Prof. Dr. Carlos Alberto Silva, pelas idéias,

incentivo, apoio e ajuda sempre pronta.

Ao Prof. Dr. Nivaldo Antonio Parizotto por gentilmente

ceder seu laboratório e os materiais necessários para execução da fase

experimental deste trabalho. Muito obrigada!!!

Ao Prof. Dr. Hugo Celso Dutra de Souza, que me

acolheu em Ribeirão Preto e me tratou como sua aluna, emprestando seu

VIII

laboratório, equipamentos e alunos, e que de forma ilimitada me abriu as

portas ... portas estas que se mantém abertas até hoje.

A Profa. Dra. Tânia Salvini, por ceder seu freezer para

armazenagem do material colhido neste estudo. E aos seus alunos Tiago e

Gabriel que me ajudaram tecnicamente. Meu muito obrigada!!!

A Profa. Dra. Heloísa Sobreiro Selistre de Araújo, por

ceder o seu laboratório para dosagem das MMPs. E a sua doce aluna Rita

que nos ensinou a técnica com amor e paciência.

Ao Prof. Dr. Vilmar Baldissera que cedeu gentilmente

seu laboratório, os equipamentos e materiais necessários para a análise da

lactacidemia. E ao Cacau que com dedicação ensinou-nos todos os

procedimentos metodológicos necessários, resolveu os pepinos (nosso

Magaiver). Brigadão, inclusive pelas risadas!!!

Ao meu amigo Rodrigo Polaquini Simões que foi meu

parceiro, e que, além disso, me ajudou na coleta dos dados, ficando no

laboratório até altas horas juntamente com meu companheiro de trabalho

e agora grande amigo Marco Auad, e ainda os alunos da graduação Cauê

e Sama, que tanto sofreram em nossas mãos (rsrsrsr), foi pro bem de vocês

queridos (Beijos e obrigada!!!). Marco e Rodrigo obrigada também pelo

ombro, onde por sinal chorei bastante, Obrigada pela força e amizade!!!!

E ainda a Dani Bassi que muito dedicada me ajudou na análise das MMPs.

Obrigada!!!

Ao meu amigo Michel Silva Reis que gentilmente cedeu

seu nome para o meu melhor rato. Valeu Miguelito!!!! Além do seu

carinho, espiritualidade, amizade e companheirismo.

Aos colegas do NUPEF que já se foram, e àqueles que

aqui permanecem, muito obrigada pela agradável convivência, pela

paciência, pelas trocas de conhecimento, pela disposição em ajudar, pela

IX

solidariedade, por partilharem comigo momentos de angústia e de alegria.

Além disto, me desculpem por qualquer coisa.

As pessoas que conheci em Piracicaba: Karina

Cancelliero, Thereza Munhoz, Gabriel Delfino. Muito obrigada pela

paciência e doação de seu tempo para me ensinar.

A Gabriela Bombarda, a amiga que Deus me deu e

tirou, que me ajudou no sacrifício dos animais e me acompanhou nas

aventuras e viagens que este trabalho requereu, e que hoje vejo crescer

como pesquisadora!!!!

As pessoas que conheci em Ribeirão Preto: Bruno

Rossi, João, Geisa e Larissa. Muito obrigado pela acolhida, pelos

momentos agradáveis que vivenciamos juntos e por me agraciarem com

demonstrações de amizade e carinho. E ainda ao Seu Luís que com amor

cuida do biotério e nos ajudou em tudo que necessitamos.

Ao órgão de fomento PIBIQ/CNPq pelo apoio

financeiro.

E ainda gostaria de agradecer a todos aqueles que por

ventura eu tenha deixado de falar nesta dedicatória, mas que com certeza

contribuíram com sua amizade e/ou conhecimento. Amo todos vocês!!!

Meu Muito Obrigada!!!

X

RESUMO

Muitos modelos animais têm sido descritos na literatura usando exercício resistido,

porém poucos conseguiram mimetizar as adaptações fisiológicas que ocorrem em

humanos. Hornberger & Farrar (2004) descreveram um modelo em escada, com

exercício resistido progressivo de alta intensidade (ERPAI), o qual se tem mostrado

bastante reprodutivo quanto às adaptações musculares que ocorrem em humanos.

Entretanto, sabe-se que o exercício pode induzir modificações cardiovasculares, na

lactatacidemia, na variabilidade da freqüência cardíaca (VFC), nas metalopeptidases de

matriz 2 (MMP-2), além de alterar o teste de tolerância à insulina (TTI) e a glicose

(TTG), porém as respostas destas variáveis neste modelo experimental ainda não estão

descritas na literatura. Foram estudados 30 ratos wistar, submetidos a ciclo

fotoperiódico 12/12hs, temperatura: 22º a 24ºC, com água e ração ad libitum. Estes

foram divididos em 3 grupos, G1: controle, G2: sham e G3: treinado. Os animais do G3

escalaram até a exaustão, com cargas progressivas afixadas na base da calda, por 8 sem,

3 x/sem. O TTI, TTG e o teste de esforço (lactacidemia) foram realizados antes e após o

treino, além disto, foram avaliadas as MMP-2 e a VFC ao final do treino em todos os

grupos. Observou-se aumento significativo do lactato no pico (LP) somente no G3,

porém em G2 e G3 houve redução do LP quando corrigido pela carga. G2 e G3 quando

comparados ao G1, apresentaram aumento no TTG e na VFC total, no entanto, somente

o G3 aumentou no TTI e na banda de alta, além de produzir redução na banda de baixa

freqüência. Foi observado ainda aumento na atividade de MMP-2 pró em ambos os

grupos G2 e G3, no entanto, a MMP-2 em seu sítio ativo aumentou somente em G3. Em

conclusão, o modelo de ERPAI produziu modificações metabólicas e cardiovasculares,

além de um intenso remodelamento no músculo tibial anterior podendo ser um modelo

promissor no entendimento dos efeitos do exercício resistido nas doenças crônicas.

XI

ABSTRACT

Many animal models have been described in the literature using resisted exercise,

however few got mimics the physiologic adaptations that happen in humans.

Hornberger & Farrar (2004) described a ladder protocol, with high intensity progressive

resistive exercise (HIPRE), which it has been showing reproductive with relationship to

muscular adaptations that happen in humans. However, it’s known that the exercise can

induce cardiovascular modifications, lactatacidemy, heart rate variability (HRV), matrix

metalloproteinases 2 (MMP-2), besides alters the insulin (ITT) and the glucose

tolerance test (GTT), however the answers of these varied in this experimental model

aren’t still described in the literature. We studied 30 wistar rats, male, submitted to

fotoperiodic cycle 12/12hs, temperature: 22 to 24ºC, with water and ration ad libitum.

These were divided in 3 groups, G1: control, G2: sham and G3: trained. The G3 animals

climbed ate exhaustion, with progressive loads fixed in the tail base, for 8 weeks, 3

times a week. ITT, GTT and test of effort (lactacidemy) were performed before and

after the training, besides, MMP-2 and HRV were evaluated at the end of the training in

all the groups. Significant increase of the peak lactate (PL) was observed only in G3,

however in G2 and G3 there was reduction of PL when corrected by the load. G2 and

G3 when compared to G1, they presented increase in GTT and in total HRV, however,

only G3 increased in ITT and in the band of high, besides producing reduction in the

band of low frequency. It was still observed increase in MMP-2 activity in both groups

G2 and G3, however, MMP-2 in your active site only increased in G3. In conclusion,

the model of HIPRE produced metabolic and cardiovascular modifications, besides an

intense remodeling in the anterior tibial muscle could be a promising model in the

understanding of the effects of the resistive exercise in the chronic diseases.

XII

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

ACSM: American College Sports Medicine

AHA: American Heart Associations

AF: Alta freqüência

bat: Batimento(s)

BF: Baixa freqüência

0C: Grau (s) Celsius

cm: Centímetro (s)

CM: Carga máxima de transporte do animal

CP: Carga no pico

CPE: Cânula de polietileno

DP: Desvio padrão

FC: Freqüência cardíaca

ER: Exercício resistido

g: Grama (s)

G1: Grupo controle

G2: Grupo sham

G3: Grupo treinado

TTG: Teste de tolerância à glicose

h: Hora (s)

HCl: Ácido clorídrico

Hz: Hertz

IC: Isocarga

TTI: Teste de tolerância à insulina

XIII

i.p.: Intraperitonial

Kg: Quilograma (s)

L: Litro (s)

LI: Lactato na isocarga

LI/IC: Relação lactato na isocarga versus isocarga

LP: Lactato no pico

LP/CP: Relação lactato no pico versus carga no pico

LS: Lactato sangüíneo

m: Metro (s)

MBF: Muito baixa freqüência

MEC: Matriz extracelular

min: Minuto (s)

mL: Mililitro (s)

mmol: Milimole (s)

mmol/L: Razão milimole (s) por litro (s)

MMPs: Metalopeptidases de matriz

ms: Milisegundo (s)

n: Tamanho da amostra

NaF: Fluoreto de sódio

p: Nível de significância

PA: Pressão arterial

PAS: Pressão arterial sistólica

PAD: Pressão arterial diastólica

PC: Peso corporal do animal

r: Coeficiente de correlação de Pearson

XIV

RM: Resistência máxima

s: Segundo (s)

SDS: Sulfato dodecil de sódio

sem: Semana (s)

SG: Sensibilidade pancreática à glicose

SI: Sensibilidade tecidual à insulina

SF: Soro fisiológico

T0: Tempo zero

T2,5: Tempo dois e meio minutos

T5: Tempo cinco minutos

T10: Tempo dez minutos

T15: Tempo quinze minutos

T20: Tempo vinte minutos

T30: Tempo trinta minutos

T45: Tempo quarenta e cinco minutos

T60: Tempo sessenta minutos

TA: Tibial anterior

TR: Treinamento resistido

TRM: Teste de resistência máxima

TRPAI: Treinamento resistido progressivo de alta intensidade

UA: Unidade arbitrária (s)

U: Unidade (s)

VFC: Variabilidade da freqüência cardíaca

V: Volts

μl: Microlitro(s)

XV

%: Percentual

≤: Menor ou igual

16

SUMÁRIO

1. DEDICATÓRIAS .................................................................................................. V 2. AGRADECIMENTOS .......................................................................................... VII 3. RESUMO .................................................................................................................. X 4. ABSTRACT .............................................................................................................. XI 5. LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS .................................................... XII 6. CONTEXTUALIZAÇÃO ..................................................................................... 18 7. ESTUDO I: “Efeitos metabólicos e do controle autonômico da freqüência cardíaca após treinamento resistido progressivo de alta intensidade em ratos”............................................................................................................................

22 Resumo ............................................................................................................ 24

Abstract ............................................................................................................ 25 Introdução ....................................................................................................... 26 Materiais e Métodos ...................................................................................... 27 Amostra ....................................................................................................... 27

Protocolo de treinamento resistido progressivo de alta intensidade (TRPAI) – G3 ............................................................................................................................

28

Treinamento sem carga – G2 ....................................................................... 28 Teste de resistência máxima (TRM) ............................................................. 28 Coleta de sangue e dosagem na lactacidemia ............................................. 29 Teste de tolerância à insulina (TTI) e teste de tolerância à glicose (TTG) .. 29 Variabilidade da freqüência cardíaca (VFC) ............................................... 30

Análise estatística dos dados ........................................................................... 31 Resultados ......................................................................................................... 31 Discussão ........................................................................................................... 32 Importância do presente estudo ................................................................... 33 Carga de trabalho ........................................................................................ 33 Adaptações metabólicas ao treinamento físico ............................................ 33 Controle autonômico da FC ........................................................................ 35 Conclusão ......................................................................................................... 36 Referências bibliográficas ............................................................................... 36 Tabela 1 – Efeitos do treinamento resistido e sem carga no peso corporal, carga e lactato obtidos no teste de esforço máximo antes e após 8 semanas de treinamento. ........................................................................................................

43 Figura 1 – Teste de tolerância à insulina – A; Teste de tolerância à glicose ....... 44 Figura 2 – Dados da variabilidade da freqüência cardíaca (VFC). .................... 45

8. ESTUDO II: “Efeito do treinamento resistido progressivo de alta intensidade na

17

atividade das metalopeptidases de matriz em ratos”..............................................................................................................................

46 Resumo ............................................................................................................. 53 Abstract ............................................................................................................ 54 Introdução ........................................................................................................ 55 Materiais e Métodos ........................................................................................ 57 Amostra ....................................................................................................... 57

Protocolo de treinamento resistido progressivo de alta intensidade (TRPAI) – G3 ..........................................................................................................................

57

Treinamento sem carga – G2 ...................................................................... 58 Sacrifício dos animais e retirada do tibial anterior .................................... 59 Determinação da atividade das metalopeptidases de matriz por zimografia 59

Análise estatística dos dados ........................................................................... 60 Resultados ......................................................................................................... 61 Discussão ........................................................................................................... 62 62 Efeito do TRPAI sobre a atividade da MMP-2 ........................................... 63 Limitações do estudo ........................................................................................ 65 Conclusão .......................................................................................................... 66 Referências bibliográficas ................................................................................ 66 Tabela 1 – Peso corporal dos animais, MMP-2 em seus domínios pro e ativo no músculo tibial anterior; e carga pico. ..................................................................

72 Figura 1 – Domínios pro e ativo da MMP-2 no músculo tibial anterior nos grupos estudados. ...............................................................................................

74

9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 75 10. ANEXOS 78 ANEXO A – TRABALHOS APRESENTADOS EM EVENTOS 79 ANEXO B – TERMO DE APROVAÇÃO DO PROJETO PELA COMISSÃO DE ÉTICA EM EXPERIMENTAÇÃO ANIMAL DA UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS (CCEA/UFSCar)

81

18

6. CONTEXTUALIZAÇÃO

19

CONTEXTUALIZAÇÃO

Sabe-se que mudanças fisiológicas ocorrem em resposta ao exercício resistido, e que o músculo

esquelético modifica-se quando submetido a sobrecargas tensionais (YAKARESHI, et al., 1990).

O American College of Sports Medicine (ACSM) (2002) recomenda para a realização de um

programa de treinamento resistido com o objetivo de hipertrofia muscular, intensidades acima de

65% da resistência máxima (RM), com freqüência de 2 a 3 vezes por semana, em número de 6 a

12 repetições, e com um intervalo de repouso de 1 a 2 minutos. Em humanos, este tipo de

treinamento resulta em aumento significativo da força muscular como resposta dos seus

componentes neurais, e está associado à melhora da performance, da resistência à fadiga e ao

aumento da área de secção transversa do músculo (ACSM, 2002).

Vários modelos animais envolvendo exercício físico mimetizam as respostas fisiológicas

humanas promovidas pelo treinamento resistido (GORDON, et al., 1967; JAWEED, et al., 1977;

HO, et al., 1980; KLITGAARD, 1988; WONG; BOOTH, 1988; YARASHESKY, et al., 1990;

GARNER, et al., 1991; TAMAKI, et al., 1992; HECK, et al., 1996; ROY, et al., 1997,

DUNCAN, et al., 1998), já que os animais possibilitam uma análise mais detalhada nos aspectos

fisiológico, histológico, bioquímico e molecular (BARAUNA, et al., 2005).

Yarasheski et al. (1990) relataram que a força de contração típica do treinamento de força,

associado a fatores hormonais e a ativação do nervo motor, podem alterar as propriedades

histoquímicas do músculo esquelético de ratos jovens.

Porém, as adaptações cardiovasculares induzidas pelo exercício resistido não estão bem

documentadas, já que as respostas de pressão arterial (PA) e freqüência cardíaca (FC) no

exercício resistido (ER) ainda são controversas na literatura atual. Barauna et al. (2005) avaliaram

as adaptações cardiovasculares (FC, PA e hipertrofia cardíaca) num modelo animal de

treinamento de força (4 sem, 4 séries, 10-12 repetições, 65-75% da 1RM), e encontraram

20

hipertrofia ventricular esquerda, diminuição da PA diastólica e da PA média nos ratos treinados

em relação ao controle.

A análise espectral da variabilidade da freqüência cardíaca (VFC) no domínio da freqüência tem

sido utilizada para avaliar a modulação autonômica do ajuste da freqüência cardíaca

(AKSELROD, et al., 1981; JAPUNDZIC, et al., 1990; MALLIANI, et al., 1991; TASK FORCE

OF THE EUROPEAN OF CARDIOLOGY, 1996). Souza et al. (2001; 2008) avaliaram a VFC

em ratos hipertensos no domínio do tempo e da freqüência num protocolo aeróbio de esteira,

porém pouco se sabe sobre o comportamento da VFC durante um protocolo de exercício resistido

de alta intensidade ou exercício de força.

A dosagem dos níveis plasmáticos de lactato tem sido utilizada para averiguar o efeito do

exercício aeróbio sobre a capacidade física, e sabe-se ainda que estes se apresentam reduzidos

após um período de treino de endurance tanto em animais quanto em humanos (VOLTARELLI,

et al., 2002; SPRIET, et al., 2000; BROOKS, 1998; GLADDEN, 2000), porém pouco se sabe

sobre o comportamento desta variável no exercício resistido de alta intensidade em ratos e em

humanos.

A escolha de um modelo animal adequado de treinamento resistido em ratos, objetivando um

melhor entendimento das adaptações fisiológicas, pode ser de grande importância clínica.

Hornberger & Farrar (2004), num protocolo de indução de hipertrofia muscular, desenvolveram

um modelo animal de exercício resistido progressivo de alta intensidade com escalada, o qual

mimetiza o treinamento de força em humanos com relação ao tempo de hipertrofia (8 sem), a

freqüência fracionária por dia de acréscimo da massa muscular, a manutenção das características

fisiológicas e bioquímicas normais do músculo, além da boa adaptabilidade dos animais ao

protocolo.

21

Sabe-se que o exercício resistido tem sido utilizado tanto na reabilitação, como na promoção de

saúde da população geral. Assim, é importante estudar, por meio de um modelo animal de

exercício físico resistido progressivo de alta intensidade, similar ao de humanos, as possíveis

conseqüências que este produz sob a variabilidade da freqüência cardíaca, lactacidemia,

comportamento da glicemia, e atividade da MMP-2 no músculo.

Desta forma, com base nos resultados obtidos com este estudo, foram elaborados dois

manuscritos:

1) EFEITOS METABÓLICOS E DO CONTROLE AUTONÔMICO DA

FREQÜÊNCIA CARDÍACA APÓS TREINAMENTO RESISTIDO PROGRESSIVO DE

ALTA INTENSIDADE EM RATOS.

2) EFEITO DO TREINAMENTO RESISTIDO PROGRESSIVO DE ALTA

INTENSIDADE NA ATIVIDADE DAS METALOPEPTIDASES DE MATRIZ EM

RATOS.

22

7. ESTUDO I

EFEITOS METABÓLICOS E DO CONTROLE

AUTONÔMICO DA FREQÜÊNCIA CARDÍACA

APÓS TREINAMENTO RESISTIDO

PROGRESSIVO DE ALTA INTENSIDADE EM

RATOS

23

Efeitos metabólicos e do controle autonômico da freqüência cardíaca

após treinamento resistido progressivo de alta intensidade em ratos

A.P. Deus1, M. Auad2, R.P. Simões1, V. Baldissera3, C. A. Silva4, B.R.O. Rossi5, H.C.D. Sousa5,

N.A. Parizotto1, A. Borghi-Silva1.

1 Departamento de Fisioterapia, Universidade Federal de São Carlos - UFSCar, São Carlos, SP,

Brasil.

2 Departamento de Biotecnologia, Universidade Federal de São Carlos - UFSCar, São Carlos, SP,

Brasil.

3 Departamento de Ciências Fisiológicas, Universidade Federal de São Carlos - UFSCar, São

Carlos, SP, Brasil.

4 Departamento de Ciências da Saúde, Universidade Metodista de Piracicaba – UNIMEP,

Piracicaba, SP, Brasil.

5 Departamento de Fisioterapia, Universidade de São Paulo – USP, Faculdade de Medicina de

Ribeirão Preto, Ribeirão Preto, SP, Brasil.

Correspondência para: A. Borghi-Silva. Laboratório de Fisioterapia Cardiorrespiratória, Núcleo

de Pesquisas em Exercício Físico, Departamento de Fisioterapia, Universidade Federal de São

Carlos – UFSCar. Rodovia Washington Luis, KM 235, Monjolinho, CEP: 13565-905, São

Carlos, SP, Brazil. Fone: (+55-16) 3351-8705. FAX: (+55-16) 3361-2081.

E-mail: audrey@ufscar.br

24

RESUMO

O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos de um programa de treinamento resistido

progressivo de alta intensidade (TRPAI) em escada na sensibilidade pancreática à glicose (SG),

sensibilidade tecidual à insulina (SI), lactato sanguíneo (LS) e na variabilidade da freqüência

cardíaca (VFC) em ratos. 30 ratos Wistar (288±22g), albinos, machos, idade 2 meses, divididos

em 3 grupos, n=10/grupo: G1 (controle), G2 (sham) e G3 (treinado). Após 1 sem de adaptação à

escada, os animais do G3 foram submetidos ao TRPAI, com incremento de cargas progressivas

em relação ao peso corporal até sua exaustão. O G2 realizou o mesmo número de subidas que o

G3. A freqüência de treinamento foi 3x/sem, durante 8 sem. Após o período experimental foram

analisados LS, SG, SI e VFC por meio das bandas de alta (AF) e baixa (BF) freqüências, e da

VFC total. Observou-se aumento significativo do LS no pico somente no G3, porém em ambos os

grupos G2 e G3 houve redução do LS no pico quando corrigido pela carga (p<0,05). G2 e G3

quando comparados ao G1, apresentaram aumento na SG, no entanto, somente o G3 aumentou a

SI (p<0,05). A VFC total aumentou no G2 e G3, porém somente o G3 aumentou a banda de AF e

reduziu a banda de BF (p<0,05). Em conclusão, o modelo de TRPAI produziu modificações

metabólicas e cardiovasculares, podendo ser um modelo promissor no entendimento dos efeitos

do exercício físico resistido nas doenças metabólicas e cardiovasculares crônicas.

Palavras chave: treinamento de força, lactato sanguíneo, sensibilidade à glicose, resistência à

insulina, variabilidade da freqüência cardíaca.

25

ABSTRACT

The aim of this study was to evaluate the effects of high-intensity progressive resistive training

(HIPRT) protocol of ladder on glucose pancreatic sensibility (GS), insulin sensibility (IS), blood

lactate (BL) and heart rate variability (HRV) in rats. 30 Wistar rats (288±22g), albins, males, age

2 months, divided in 3 groups, n=10/group: G1 (control), G2 (sham), and G3 (trained). After 1

week of ladder adaptation, the G3 animals were submitted to HIPRT, with increment of

progressive loads with relation to corporal weight, until animal’s exhaustion. G2 performed the

same number of ascents than G3. The training frequency was 3 times a week, during 8 weeks.

After the experimental period were analyzed BL, GS, IS and HRV through the bands high

frequency (HF), low frequency (LF) and total HRV. Were observed significant increases of BL

peak only for G3, however in both groups G2 and G3 there was reduction in BL/workload peak

(p<0.05). G2 and G3 in comparation with G1, show increased in the GS, however, only G3

increased IS (p<0.05). The total HRV increased in G2 and G3, but only G3 increased HF band

and reduced LF (p<0.05). In conclusion, the model of HIPRT produced metabolic and

cardiovascular modifications, could be a promising model in the understanding of the effects of

the physical exercise resisted in the metabolic and cardiovascular chronicles diseases.

Key words: strength exercise; blood lactate; glucose sensibility; insulin resistance; heart rate

variability

26

INTRODUÇÃO

O exercício resistido (ER) é o mais eficiente para aumentar a força muscular, pois a sobrecarga

tensional nos músculos estimula a síntese de proteína contrátil e o remodelamento do tecido

conjuntivo [1]. Além disto, tem sido descrito que o ER é seguro para indivíduos saudáveis, atletas

ou portadores de doenças crônicas [2,3], aumentando a capacidade funcional [4,5,6] e

cardiorrespiratória [7]. Somado ao aumento da força, observa-se um aumento da resistência

muscular, flexibilidade, coordenação [8,9] e desempenho físico nas atividades de resistência e do

cotidiano [10,11].

O ER produz interessantes modificações sobre a avaliação aeróbia determinada pelo limiar

anaeróbio [5] e o lactato no pico [12]. A tolerância à glicose e a sensibilidade tecidual à insulina

são variáveis fisiológicas também modificáveis com o treinamento resistido tanto em humanos

[13] como em estudos com animais [14,15]. Adicionalmente, o ER apresenta uma importante

influência sobre o controle autonômico cardiovascular [16,17,18]. Todas estas modificações

favoráveis ocasionadas pelo ER traduzem-se em redução dos fatores de risco e morbi-

mortalidade em inúmeras doenças crônicas [19-22].

Neste sentido o American College Sports Medicine (ACSM) [23] recomenda que o ER seja

realizado de 2-3 x/sem com intervalos de 1-2 min entre as séries, de 6-12 repetições, e por um

período mínimo de 2-3 meses para o início da hipertrofia muscular. Considerando estes aspectos,

poucos modelos experimentais têm conseguido mimetizar estas recomendações, para permitir

comparação com as respostas em humanos [24].

Neste contexto, Hornberger & Farrar [24] propuseram em 2004 um modelo experimental com

ratos, que mimetiza os parâmetros de treinamento e adaptações musculares observados em

humanos que participam de um programa de exercício resistido progressivo. Porém, estes autores

avaliaram especificamente as adaptações musculares neste modelo experimental. No entanto, não

27

é do nosso conhecimento as alterações provocadas pelo treinamento de força na sensibilidade

tecidual à insulina, função pancreática a sobrecarga de glicose, lactacidemia, e ainda nas

adaptações do controle autonômico da freqüência cardíaca (FC) neste tipo de protocolo. Um

melhor entendimento destes mecanismos permitirá auxiliar na prevenção e tratamento de

distúrbios metabólicos como diabetes, dislipidemia, obesidade, elevação da atividade simpática e

hipertensão [10].

Neste sentido, a proposta deste estudo foi avaliar o efeito de um modelo experimental animal,

baseado no ER progressivo de alta intensidade sobre as variáveis metabólicas e autonômicas da

FC, ressaltando que este modelo mimetiza os parâmetros de treinamento e adaptações observados

em humanos. Nós hipotetizamos que importantes adaptações no controle autonômico da FC, na

sensibilidade tecidual à insulina e na tolerância à glicose, bem como na lactacidemia podem ser

promovidas com este modelo experimental.

MATERIAIS E MÉTODOS

Amostra

Esta pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade

Federal de São Carlos – UFSCar sob n0 021/2006. Foram estudados 30 ratos, Wistar, albinos,

com idade de 2 meses, com peso corporal de 288 ± 22g (média ± DP) (Tabela 1). Os animais

foram mantidos no biotério sob temperatura controlada entre 220 e 240C e submetidos a ciclo

fotoperiódico claro/escuro de 12/12hs. Além disto, foram acondicionados em gaiolas coletivas de

polipropileno, separados em 4 por caixa e alimentados com ração peletizada e água ad libitum.

Foram randomicamente distribuídos para um dos três grupos descritos a seguir: G1 – grupo

controle (n = 10); G2 – grupo sham (n = 10); e G3 – grupo treinado (n = 10).

28

Protocolo de treinamento resistido progressivo de alta intensidade (TRPAI) – G3

O G3 foi submetido a 1 sem de adaptação sem sobrecarga, teste de esforço e ao TRPAI. Foi

utilizada uma escada de madeira (1,1 x 0,18m), com 80º de inclinação e uma área de descanso em

seu topo, onde os animais permaneciam por 2 min entre uma subida e outra [24], sempre no

período vespertino. O treinamento teve duração de 8 sem e freqüência de 3x/sem, totalizando 24

sessões.

Na 1ª sessão, a carga usada na 1ª subida foi relativa a 75% do peso corporal do animal (PC)

daquele dia, e depois foram acrescentados 10% PC à carga anterior até que o animal não mais

conseguisse escalar 3 vezes consecutivas, desta forma obteve-se a carga máxima suportada pelo

animal (CM) naquela sessão.

Nas sessões subseqüentes, a 1ª subida foi realizada com 50% CM da sessão anterior, a 2ª com

75% CM, a 3ª com 90% CM e a 4ª com 100% CM, e a partir da 5ª era acrescentado 10% PC

daquele dia à carga anterior, até que o animal não mais conseguisse subir [24]. O protocolo

utilizado foi o de Hornberger & Farrar [24] modificado, já que estes autores usaram para o

acréscimo de cargas 10g, e neste estudo optou-se por 10% PC, acreditando que assim anularia-se

o fator ganho de peso e sua relação com a carga.

Treinamento sem carga – G2

Os animais do G2 também foram submetidos a 1 sem de adaptação, e o seu treino foi semelhante

ao do G3, porém como carga utilizaram apenas o peso do seu próprio corpo, escalando o mesmo

número de vezes que os do G3 em cada sessão, no mesmo período e freqüência.

Teste de resistência máxima (TRM)

Todos os animais foram submetidos ao teste de resistência máxima (TRM), sendo que G2 e G3 o

realizaram após o período de adaptação e 3 dias depois do final do treinamento, e o G1 apenas

após o final de 8 sem. Inicialmente foi retirada uma amostra de sangue da cauda do animal, e

29

após 2 min de permanência na área de repouso, foi feita uma subida com carga livre, e as

escaladas subseqüentes aconteciam 2 min após a anterior [4] com cargas que aumentavam de 10

em 10% do PC no TRM inicial, e de 30 em 30% do PC no final, até a sua exaustão. Amostras de

sangue foram coletadas sempre 1 min após cada subida.

O critério de interrupção do teste foi determinado pela incapacidade do animal em realizar uma

escalada completa, sendo a anterior denominada carga pico (CP).

Coleta de sangue e dosagem na lactacidemia

Após o descarte da primeira gota de sangue, foi coletado via região distal da cauda do animal 25

μl de sangue em um tubo capilar calibrado, o qual foi armazenado a -10 0C em microtubos Safe-

Lock de 0,5 ml (Eppendorff®, São Paulo, BR) contendo 50 μl de NaF 1%. Para análise da

lactacidemia pelo método eletroenzimático, em mmol/L, foi utilizado um lactímetro portátil (YSI-

1500 Sport®, Ohio, USA).

Teste de tolerância à insulina (TTI) e teste de tolerância à glicose (TTG)

Todos os animais foram submetidos aos TTI e TTG. Estes foram realizados dois e um dias antes

da adaptação, e um e dois dias após a 24a sessão de treinamento, respectivamente.

Os animais foram anestesiados com pentobarbital sódico 1% (1ml/Kg de PC – i.p.), e após 20

min realizou-se uma incisão na ponta da cauda e coletado o sangue necessário para a dosagem da

glicemia [26] por meio de um glicosímetro (Accu-Chek® Advantage, Mannheim, Germany).

Denominamos a 1ª coleta tempo zero (T0), e após este período foi administrada uma solução de

insulina e soro fisiológico (SF) – 1U/Kg de PC – i.p., para o TTI. No TTG, uma solução

composta de glicose e SF – 1g/kg de PC – i.p.. Em seguida, foram realizadas as dosagens da

glicemia nos tempos 2,5 (T2,5), 5 (T5), 10 (T10), 15 (T15) e 20 (T20) minutos no TTI; e 5 (T5), 10

30

(T10), 15 (T15), 20 (T20), 30 (T30), 45 (T45) e 60 (T60) minutos no TTG, de acordo com o

Guidelines of the department comparative medicine at the University of Toronto.

Variabilidade da freqüência cardíaca (VFC)

No 5º dia após o final do treinamento, os animais foram anestesiados com injeção de

tribromoetanol (250mg/Kg de PC, i.p.) e submetidos à dissecação da artéria femoral para

implante de uma cânula de polietileno (CPE) 10 soldada a uma CPE 50 (±30cm) preenchidas

com solução salina heparinizada (500 U/ml) e exteriorizadas no dorso do animal, para registro da

FC.

Após 24 horas do procedimento cirúrgico, os dados foram registrados por meio de um transdutor

de pressão (ADInstruments — MLT0380) e o sinal amplificado (ADInstruments — ML110) foi

enviados para um equipamento de aquisição de dados (ADInstruments—PowerLab 8/30). A FC

foi calculada a partir do pulso de pressão arterial (PA).

Os animais foram mantidos em caixas individuais durante o experimento, em uma sala silenciosa

e foi permitida a aclimatização por no mínimo 30 min. A linha de base da FC e da PA foi

registrada durante os próximos 30 min e foi processada por um software que aplica um algoritmo

para detectar os pontos de inflexão ciclo a ciclo do sinal pulsátil da PA, enquanto determina os

valores da pressão sistólica (PAS) e diastólica (PAD) batimento (bat) a bat. Destes 30 min de

registro, a série temporal do intervalo de pulso e a PAS foram divididas em segmentos contíguos

de 300 bat, sobrepostos pela metade (150 bat).

Depois do cálculo dos valores médios e da variância de cada segmento, eles foram submetidos a

um modelo autoregressivo da análise espectral já descrito anteriormente por outros autores

[27,28,29]. Um modelo de componentes oscilatórios apresentado por segmentos estacionários da

série temporal bat a bat da PAS e do intervalo de pulso foi usado para o cálculo, o qual se baseia

31

na recursão de Levinson-Durbin, com a ordem do modelo escolhida de acordo com o critério de

Akaike [27]. Este procedimento permitiu a quantificação automática da freqüência central e da

potência de cada componente oscilatório presente na série temporal. Os componentes oscilatórios

foram demarcados como de muito baixa freqüência (MBF: 0,01–0,20 Hz), baixa freqüência (BF:

0,20–0,75 Hz) ou alta freqüência (AF: 0,75–2,50 Hz) em unidades absolutas (ms2/Hz), e

representadas a predominância da modulação simpática e parassimpática, respectivamente. Os

componentes da BF e AF da VFC foram também expressos em unidades normalizadas, obtidos

pelo cálculo da % da AF e BF com sua respectiva potência total, depois de subtrair o componente

da MBF [27,28,29].

ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS DADOS

Os resultados foram expressos em média ± desvio padrão (DP). Após o teste de normalidade de

Kolmogorov-Smirnov, utilizou-se os testes t pareado (intra-grupos) e não-pareado (intergrupos

treinados), além de ANOVA para medidas repetidas (intergrupos) seguido de pós-hoc de Tukey.

Em todos os cálculos foi fixado um nível crítico de 5% (p<0,05) e os softwares utilizados foram o

Origin 6.0® e o programa Statistical Package for the Social SciencesTM (SPSS – IBM, version

10.0.1, 1999).

RESULTADOS

Todos os animais do G2 e G3 completaram com sucesso as 8 sem de treinamento. Durante o

período do experimento os animais do G1, G2 e G3 apresentaram um aumento do peso corporal

de 70,2g ± 38; 120,5g ± 28; 95,2g ± 32, respectivamente (Tabela 1). Além disto, G2 e G3

32

aumentaram a habilidade de carregar pesos durante a escalada de 104% para 202% PC; e de 92%

para 263% PC, p≤0,0001, respectivamente (Tabela 1).

Na Tabela 1 observa-se que somente o treinamento resistido promoveu aumento significativo das

concentrações de lactato sangüíneo na CP bem como na isocarga (IC) ou máxima carga atingida

por todos os animais de um mesmo grupo (p<0,05). Corrigindo o lactato pela carga, no pico

observamos redução significativa dos valores de lactato em G2 e G3. Adicionalmente, quando

comparados os valores de lactato sanguíneo corrigidos pela isocarga, observamos significativa

redução (p<0,05) dos valores para o G3.

A Figura 1 mostra a curva de glicemia durante o TTI e o TTG. O exercício resistido promoveu

aumento significativo da porcentagem de decaimento da curva no TTI após o programa de

treinamento (p<0,05). Ainda, em ambos os grupos que escalaram (com e sem peso) o exercício

promoveu diminuição da área sob a curva no TTG (p<0,001).

A Figura 2 mostra os resultados da VFC nos grupos estudados. O programa de treinamento (com

e sem carga) produziu aumento significativo da VFC total (Figura 3-A, p<0,05). No entanto,

somente o treinamento resistido de alta intensidade produziu aumento significativo da atividade

parassimpática (Figuras 3-C; 3-D) e redução da atividade simpática (Figura 3-B, p<0,05).

DISCUSSÃO

Os principais achados deste estudo em relação às adaptações ocasionadas por 8 semanas de

treinamento foram: 1) o treinamento de força realizado pelo G3 promoveu aumento das

concentrações do lactato sérico no pico. Porém, quando estas concentrações foram corrigidas pela

carga no pico, ambos os grupos G2 e G3 apresentaram uma redução do lactato; 2) ambos os

grupos que escalaram apresentaram modificações benéficas na resposta pancreática a sobrecarga

33

de glicose, porém somente o treino de força modificou a sensibilidade tecidual à insulina; 3) a

VFC total aumentou em ambos os grupos que escalaram, porém a atividade vagal aumentou e a

atividade simpática reduziu no grupo treinado (G3). Desta forma, nossos resultados mostram que

as adaptações glicêmicas benéficas foram mais consistentes após treinamento de força.

Importância do presente estudo

Para o nosso conhecimento, este foi o primeiro estudo que objetivou avaliar as adaptações

metabólicas e o controle autonômico da FC ocasionadas por 8 sem de treinamento resistido

progressivo de alta intensidade em ratos utilizando um protocolo experimental de escalada, o qual

baseIa-se nos princípios da sobrecarga utilizados nos programas de treinamento de humanos

[23,24].

Carga de trabalho

Assim como no protocolo proposto por Hornberger & Farrar [24] os animais apresentaram um

aumento da capacidade de suportar cargas progressivas, estes relataram uma melhora de 287%, e

no presente estudo de 382%, o que corrobora com a reprodutibilidade do protocolo em termos de

ganho de força. Adicionalmente, os autores [24] mostraram que a média de escaladas por sessão

de treinamento foi de 6,02 ± 0,23, enquanto que em nosso estudo variou de 7,8 ± 0,19.

Adaptações metabólicas ao treinamento resistido

Glicemia

A relação entre a inatividade física e a resistência à insulina foi sugerida pela primeira vez em

1945 [35]. Em nosso estudo, somente o exercício resistido promoveu um aumento da

sensibilidade tecidual à insulina [36,37], porém o pâncreas tornou-se mais sensível à glicose em

ambos os grupos que escalaram. Desta forma, nossos resultados estão de acordo com AHA [32],

uma vez que a atividade física “per si” pode promover adaptações benéficas, particularmente nas

doenças metabólicas crônicas.

34

Diabetes mellitus, intolerância a glicose e resistência à insulina aumentam o risco de doenças

cardiovasculares [38]. O controle da glicemia depende da disponibilidade da insulina e da

superação da resistência à insulina, e a contração muscular depende da disponibilidade de glicose

no músculo esquelético. Desta forma, indivíduos que apresentam intolerância a glicose e/ou alta

resistência à insulina apresentam prejuízos adicionais a prática de exercício físico [39]. Tanto o

exercício aeróbio como o exercício resistido [20,21,40] podem promover aumento da

sensibilidade dos tecidos periféricos à insulina.

Teste de carga máxima e Lactacidemia

Observamos que ambos os grupos treinados apresentaram melhora em termos de carga máxima,

porém o grupo que treinou com carga apresentou valores maiores de lactato na máxima carga

atingida por todos os animais. Assim, podemos inferir que o TR, uma atividade anaeróbia, levou

a aumentos significativos da razão entre a lactacidemia e a maior carga transportada por estes

animais em comparação ao grupo controle ou treinado sem peso. Assim, acreditamos que o

exercício resistido, realizado durante 2 meses, 3x/sem, foi capaz de melhorar o condicionamento

físico e a capacidade de suportar cargas. Outros autores observaram melhora no desempenho

físico em atividades de endurance [11] e ainda no treinamento de força [24,41], pois o ER

converte fibras do tipo IIb em IIa [7], o que diminui o trabalho para se realizar uma mesma tarefa

[3].

Em relação ao estudo do lactato durante o TRM ambos os grupos apresentaram um aumento no

pico do teste, porém quando observamos os resultados na máxima carga em que todos atingiram,

somente o G3 conseguiu altos valores. De acordo com nossos resultados, Tanimoto & Ishii [43]

também observaram aumento do lactato no pico após TR apesar de utilizar um protocolo resistido

de baixa intensidade.

35

Myers et al. [44] relataram que o aumento na concentração de lactato está relacionado ao número

de unidades motoras e ao tipo de fibras recrutadas durante o exercício. Com o aumento da carga,

há inicialmente um maior recrutamento de fibras oxidativas, e devido à exaustão do metabolismo

aeróbio, mais fibras tipo IIx (glicolíticas) são recrutadas, resultando num aumento da

glicogenólise, uma maior utilização das fibras rápidas e da produção de lactato.

Controle autonômico da FC

A análise da VFC permite quantificar a modulação do sistema nervoso autônomo na freqüência

de disparo do nodo sinoatrial [45]. Estudos recentes têm demonstrado que o exercício resistido

desempenha um importante papel nos programas de treinamento físico [23,46] e também na

reabilitação cardiovascular [47,48]. No presente estudo, o exercício resistido foi capaz de

aumentar a VFC, esta resposta foi previamente documentada em estudos com humanos usando

protocolos diferentes [49], diferentemente do resultado encontrado por vários outros autores, o

qual encontraram uma diminuição da VFC [50,51,52].

Takahashi et al. [53] não observaram modificações da VFC no domínio do tempo decorrentes do

exercício resistido, porém o protocolo utilizado foi isométrico submáximo, e os próprios autores

relatam que manutenção desta variável pode ser devido ao tipo de protocolo utilizado.

Nós temos demonstrado que o treinamento de força (alta intensidade) levou a uma diminuição da

atividade simpática bem como aumentou a atividade do nervo vago. Estudos têm sido realizados

com o objetivo de avaliar as diferenças entre respostas da VFC em protocolos de alta versus

baixa intensidade [54], e observaram que tanto o TR de alta como o de baixa intensidade

promoveu importantes alterações hemodinâmicas e no controle autonômico da FC, porém o de

baixa intensidade levou a um maior aumento da atividade simpática logo após a interrupção do

exercício. Adicionalmente, um estudo em humanos realizando treinamento de força excêntrica de

36

alta intensidade observaram um desequilíbrio autonômico com predominância da modulação

simpática em idosos saudáveis [55].

CONCLUSÃO

Em conclusão, nosso estudo mostrou que o modelo de Honberger & Farrar [24] modificado ou de

treinamento resistido progressivo de alta intensidade produziu importantes modificações

metabólicas e cardiovasculares, podendo ser um modelo promissor no entendimento dos efeitos

do exercício resistido nas patologias metabólicas e cardiovasculares crônicas.

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43Tabela 1 – Efeitos do treinamento resistido e sem carga no peso corporal, carga e lactato obtidos no teste de esforço máximo antes e

após 8 semanas de treinamento.

G1

n = 10

G2

n = 10

G3

n = 10

Pré Pós Pré Pós Pré Pós

Peso corpóreo (g) 292 ± 27 363 ± 32* 292 ± 27 413 ± 39* † 286 ± 19 381 ± 33* † ‡

Lactato no repouso (mmol/L) - 2,0 ± 0,8 2,6 ± 1,0 2,4 ± 0,5 3,2 ± 2,3 3,2 ± 1,5†

Carga pico (g) - 205 ± 84 303 ± 66 834 ± 156* † 262 ± 83 1001 ± 231* †

Lactato no pico (mmol/L) - 4,3 ± 1,0 5,4 ± 1,9 6,2 ± 1,8† 4,4 ± 0.9 7,0 ± 1,6*†

LP / CP (mmol/L x g-1) - 0,02 ± 0,01 0,02± 0,008 0,008 ± 0,002* 0,02 ± 0,005 0,007 ± 0,002*

Isocarga (g) - 109 ± 9 175 ± 16 619 ± 57* † 200 ± 13 800 ± 70* † ‡

Lactato na isocarga (mmol/L) -

4,2 ± 1,2

30% PC

4,6 ± 2,5

60% PC

5,6 ± 1,4

150% PC

4,0 ± 1,5

70% PC

6,7 ± 1,6*

210% PC

LI / IC (mmol/L x g-1) - 0,04 ± 0,01 0,03 ± 0,01 0,009±0,003* † 0,02 ± 0,008 0,008 ± 0,002* †

G1: grupo controle; G2: grupo sham; G3: grupo treinado; Pré: teste de esforço máximo pré-treinamento; Pós: teste de esforço máximo pós-treinamento; PC: peso corpóreo do animal; n: tamanho da amostra; CM: máxima carga alcançada no teste; LP: Lactato no pico do esforço; LP/CP: lactato no pico corrigido pela carga máxima; Isocarga: carga máxima que todos os animais de um mesmo grupo alcançaram; Lactato na isocarga: lactato na máxima carga que todos os animais escalaram; LI/IC: relação entre o lactato e a carga na máxima carga que todos os animais escalaram; † - diferença significativa (p<0,05) em relação ao G1 (ANOVA com pós hoc de Tukey); ‡ - diferença significativa (p<0,05) em relação ao G2 (ANOVA com pós hoc de Tukey); * - diferença significativa (p<0,05) entre pré e pós, usando teste t de Student pareado.

Figura 1 – Teste de tolerância à insulina – A; Teste de tolerância à glicose – B; G1:

grupo controle; G2: grupo sham; G3: grupo treinado; T: tempo de coleta de glicemia;

%D: porcentagem de decaimento da curva; Ac: área sob a curva. † - diferença

significativa (p≤0,05) em relação ao G1 (ANOVA com pós-hoc de Tukey).

†

%D2 = 2,6 %D1 = 1,9

%D3 = 3,5

Ac1 = 8862 Ac3 = 6572

Ac2 = 6447

T 0 T 5 T 10 T 1 5 T 20 T 3 0 T 4 5 T 6 0 --

1 0 0

1 1 0

1 2 0

1 3 0

1 4 0

1 5 0

1 6 0

GLI

CO

SE

(%)

T E M P O S

T0 T2,5 T5 T10 T15 T2045

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

105

GLI

CO

SE (%

)

TEMPOS

G1 G2 G3

†

†

45

Figura 2 – Dados da variabilidade da freqüência cardíaca (VFC). A - VFC total; B -

BF%: banda de baixa freqüência em unidades relativas; C – AF: banda de baixa

freqüência em unidades absolutas; D - AF%: banda de baixa freqüência em unidades

relativas;

= G1: grupo controle; = G2: grupo sham; = G3: grupo treinado; * -

Diferença significativa (p<0,05) usando ANOVA para medidas repetidas com post hoc

de Tukey.

46

8. ESTUDO II

EFEITO DO TREINAMENTO RESISTIDO

PROGRESSIVO DE ALTA INTENSIDADE NA

ATIVIDADE DAS METALOPEPTIDASES DE

MATRIZ EM RATOS

47

Efeito do treinamento resistido progressivo de alta

intensidade na atividade das metalopeptidases de matriz em

ratos

A.P. Deus1, M. Auad2, R.P. Simões1, V. Baldissera3, R.C. Marqueti4, D. Bassi1, H.S.

Selistre de Araújo4, A. Borghi-Silva1.

1 Laboratório de Fisioterapia Cardiopulmonar, Departamento de Fisioterapia,

Universidade Federal de São Carlos - UFSCar, São Carlos, SP, Brasil.

2 Departamento de Biotecnologia, Universidade Federal de São Carlos - UFSCar, São

Carlos, SP, Brasil.

3 Laboratório de Fisiologia do Exercício, Departamento de Ciências Fisiológicas,

Universidade Federal de São Carlos - UFSCar, São Carlos, SP, Brasil.

4 Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular, Departamento de Ciências

Fisiológicas, Universidade Federal de São Carlos - UFSCar, São Carlos, SP, Brasil.

Correspondência para: A. Borghi-Silva. Laboratório de Fisioterapia Cardiopulmonar,

Núcleo de Pesquisas em Exercício Físico (NUPEF), Departamento de Fisioterapia,

Universidade Federal de São Carlos – UFSCar. Rodovia Washington Luis, KM 235,

Monjolinho, CEP: 13565-905, São Carlos, SP, Brazil. Fone: (+55-16) 3351-8705. FAX:

(+55-16) 3361-2081. E-mail: audrey@ufscar.br

48

RESUMO

A atividade física intensa está associada a lesões musculares ultraestruturais,

seguida pelos processos de inflamação e de regeneração. As metolopeptidases

de matriz (MMPs) possuem importantes funções na homeostase da matriz

extracelular e estão relacionadas à formação de novas miofibrilas. Os objetivos

deste estudo foram investigar a atividade da MMP-2 no músculo tibial anterior

(TA) após um programa de treinamento resistido progressivo de alta

intensidade (TRPAI). Trinta ratos foram divididos em 3 grupos: G1–controle,

G2–sham, G3–treinado. Após 1 sem de adaptação à escada, o G3 foi submetido

ao TRPAI. G2 realizou o mesmo número de subidas que o G3, com freqüência

de 3x/sem durante 8 sem consecutivas. A MMP-2 do músculo TA foi analisada

pela técnica de zimografia. Foi observado aumento na atividade de MMP-2- pró

em ambos os grupos treinados (G2 e G3), no entanto, a MMP-2 ativa aumentou

somente em G3. Conclui-se que o TRPAI produziu intenso remodelamento no

músculo TA.

Palavras-chave: Treinamento de força, metalopeptidases de matriz, MMP-2,

ratos.

49

ABSTRACT

The intense physical activity is associated to ultraestruturais muscular lesions, followed

for inflammation and regeneration processes. The matriz metalloproteinases (MMPs)

have important functions in the homeostasis of the extracellular matriz and they are

related to formation of new myofibrils. The aim of this study was to investigate the

MMP-2 activity in the anterior tibial muscle after a program of high intensity

progressive resistive training (HIPRT). Thirty rats were divided in 3 groups: G1-control,

G2-sham, G3-trained. 1 week after of adaptation to the ladder, G3 was submitted to

HIPRT. G2 realized the same number of ascents that G3, often 3x/week, during 8

consecutive weeks. The anterior tibial muscle MMP-2 was analyzed by the zymography

technique. It was observed increase in the MMP-2 pro activity in both trained groups

(G2 and G3), however, MMP-2 active only increased in G3. It is concluded that HIPRT

produced intense remodeling in the anterior tibial muscle.

Keywords: Strength training, matiz metalloproteinases, MMP-2, rats.

50

INTRODUÇÃO

Sabe-se que o treinamento resistido de alta intensidade ou também chamado

treinamento de força, pode produzir um aumento da massa muscular esquelética, ou

seja, hipertrofia muscular [1]. Esta hipertrofia ocorre pelo aumento da área de secção

transversa do músculo a partir da biossíntese de novas estruturas envolvidas na

contração [2,3]. O músculo responde a estímulos fisiológicos como o exercício físico

(aumento ou diminuição da atividade contrátil) remodelando da matriz extracelular

(MEC) para se adaptar as novas demandas impostas [4]. Estímulos extracelulares

chegam à membrana celular e interagem com receptores ativando vias de sinalização

intracelular, e conseqüentemente promovendo o remodelamento da musculatura [5].

A matriz das metalopeptidases (MMPs) são de grande importância para o

desenvolvimento e manutenção da homeostase tecidual e são os principais agentes

envolvidos no remodelamento de tecidos ricos em colágeno [6] como a MEC do

músculo esquelético. As MMPs são uma família de proteinases que regulam eventos

fisiológicos relacionados ao desenvolvimento tecidual, morfogênese, angiogênese e

degradação da mesma [7].

As MMPs são enzimas proteolíticas dependentes do zinco nas quais a MMP-2

(gelatinase A) e a MMP-9 (gelatinase B) são as principais envolvidas no

remodelamento da MEC do músculo esquelético [4,8,9].

Neste contexto, seria licito supor que a hipertrofia muscular provocada pelo estímulo de

um protocolo de exercício resistido progressivo de alta intensidade poderia ser capaz de

elevar os níveis intersticiais de MMP-2. Neste sentido, o objetivo deste estudo foi

verificar os efeitos do TRPAI [10] sobre a atividade da MMP-2 em seus domínios pró e

ativo.

51

MATERIAIS E MÉTODOS

Amostra

Esta pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da

Universidade Federal de São Carlos – UFSCar sob n0 021/2006. Foram estudados 30

ratos, Wistar, albinos, com idade de 2 meses, com peso corporal inicial de 288 ± 22g

(média ± DP) (Tabela 1). Os animais foram mantidos no biotério sob temperatura

controlada entre 220 e 240C e submetidos a ciclo fotoperiódico claro/escuro de 12/12hs.

Além disto, foram acondicionados em gaiolas coletivas de polipropileno, separados em

4 por caixa e alimentados com ração peletizada e água ad libitum.

Foram randomicamente distribuídos para um dos três grupos descritos a seguir: G1 –

grupo controle (n = 10); G2 – grupo sham (n = 10); e G3 – grupo treinado (n = 10).

Protocolo de treinamento resistido progressivo de alta intensidade – G3

O G3 foi submetido a 1 sem de adaptação sem sobrecarga, teste de esforço e ao TRPAI.

Foi utilizada uma escada de madeira (1,1 x 0,18m), com 80º de inclinação e uma área de

descanso em seu topo, onde os animais permaneciam por 2 min entre uma subida e

outra [10], sempre no período vespertino. O treinamento teve duração de 8 sem e

freqüência de 3x/sem, totalizando 24 sessões.

Na 1ª sessão, a carga usada na 1ª subida foi relativa a 75% do peso corporal do animal

(PC) daquele dia, e depois foram acrescentados 10% PC à carga anterior até que o

animal não mais conseguisse escalar 3 vezes consecutivas, desta forma obteve-se a

carga máxima suportada pelo animal (CM) naquela sessão.

Nas sessões subseqüentes, a 1ª subida foi realizada com 50% CM da sessão anterior, a

2ª com 75% CM, a 3ª com 90% CM e a 4ª com 100% CM, e a partir da 5ª era

acrescentado 10% PC daquele dia à carga anterior, até que o animal não mais

conseguisse subir [10]. O protocolo utilizado foi o de Hornberger & Farrar [10]

52

modificado, já que estes autores usaram para o acréscimo de cargas 10g, e neste estudo

optou-se por 10% PC, acreditando que assim anularia-se o fator ganho de peso e sua

relação com a carga.

Treinamento sem carga – G2

Os animais do G2 também foram submetidos a 1 sem de adaptação, e o seu treino foi

semelhante ao do G3, porém como cargas utilizaram apenas o peso do seu próprio

corpo, escalando o mesmo número de vezes que os do G3 em cada sessão, no mesmo

período e freqüência.

Sacrifício dos animais e retirada do tibial anterior

Após realização dos últimos testes os animais foram sacrificados pelo método de

decapitação. O intervalo de tempo entre o último dia de treino e o sacrifício foi adotado

como forma de garantir que eventuais modificações observadas entre os grupos

investigados, fossem decorrentes do tratamento proposto e não de um possível efeito

agudo da última sessão de treinamento [11]. Foi realizada a extração do músculo tibial

anterior (que é um músculo esquelético de contração rápida, predominantemente de

fibras brancas, e assim de baixa taxa respiratória e alta taxa glicolítica) da pata direita,

desde a sua origem até sua inserção, e este foi armazenado em nitrogênio líquido e

estocado em freezer a -900C.

Determinação da atividade das Metalopepdidases de matriz por zimografia

A extração tecidual e a zimografia foi realizada de acordo com metodologia já descrita

na literatura [12,13]. As amostras do músculo tibial anterior foram incubadas com 2mL

de tampão de extração (ácido cacodílico - 10mM (pH 5,0), NaNO3 - 0,15 mM e Triton

X-100 – 0,01%) a 40C, em agitação contínua, por um período de 24h. Após este tempo

o tampão de extração foi coletado por centrifugação (10min, 40C em 13.000rpm). As

amostras foram concentradas de maneira que cada poço do gel de zimografia continha

53

20μg de proteína e 10μL de tampão de amostra sem β-mercapto (agente redutor),

totalizando 30μL de solução por poço. As amostras foram resolvidas por eletroferese

em gel de policriamida contendo SDS 10% e gelatina na concentração de 1mg/mL.

Após a corrida o gel foi lavado duas vezes durante 20min em solução de Triton X-100

2,5% para remoção do SDS 10%. O gel foi incubado no tampão de substrato (Tris-HCl

50mM, pH 8,0, CaCL2 mM e NaN3 0,02%), a 370C, durante aproximadamente 20h.

Após este tempo o gel foi corado com Comassie Blue Brilliant R-250 (Bio-Rad) por

20min, descorado com ácido acético: metanol: água (1: 4: 5) para visualização das áreas

de atividade. Foi utilizado o software “Kodak Digital Science 1D” para fotografar o gel

e visualizar a atividade proteolítica das bandas. Um cuidado importante foi tomado para

minimizar possíveis variáveis que poderiam repercutir em erros quanto a preparação,

corrida do gel e documentação das imagens. Os géis foram preparados em uma mesma

remessa, corridos ao mesmo tempo, fotografados e revelados nas mesmas condições.

Foram identificadas bandas de atividade previamente descritas de acordo com seus

pesos moleculares (72 kDa: pro-MMP-2; 66 kDa: intermediária-MMP-2; 64 kDa: ativo-

MMP-2) [22].

ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS DADOS

Os resultados foram expressos em média ± desvio padrão (DP). Após o teste de

normalidade de Komogorov-Smirnov, utilizou-se ANOVA para medidas repetidas com

pós-hoc de Tukey (intergrupos: G1, G2 e G3). Em todos os cálculos foi fixado um nível

crítico de 5% (p<0,05) e os softwares utilizados foram o STATISTICA for windows

(Statsoft, Inc, 2000) e o Statistical Package for the Social SciencesTM (SPSS – IBM,

version 10.0.1, 1999).

54

RESULTADOS

Todos os animais do G2 e G3 completaram com sucesso as 8 sem de treinamento. Em

todos os grupos observou-se aumento do PC, sendo que G1 apresentou um delta de

variação de 70 ± 38g; G2 - 121 ± 28g; e G3 - 95 ± 32g , e ambos os grupos G2 e G3

foram significativamente maiores que G1, e o G2 maior que G3 (Tabela 1). Além disto,

G2 e G3 melhoraram sua capacidade de escalar com carga na intensidade de 104% PC

(303g ± 66) para 202% PC (834g ± 155), e de 92% PC (262g ± 83) para 263% PC

(1001g ± 231), p≤0,0001, respectivamente (Tabela 1).

Este estudo mostrou ainda que o protocolo de treinamento resistido progressivo de alta

intensidade em ratos foi capaz de aumentar significamente a ativação dos domínios pro

e ativo das metalopeptidases, enquanto que o grupo sham aumentou somente a ativação

do domínio pro (Figura 1).

DISCUSSÃO

Os principais achados deste estudo mostram que: 01) O TRPAI promoveu um aumento

da atividade da MMP-2 em seus domínios pro e ativo; 02) Tanto os domínios pro

quanto ativo da MMP-2 apresentaram uma correlação positiva com a carga pico dos

animais obtidos do TRM final.

Até onde sabemos, esta é a primeira demonstração do possível papel da MMP-2 no

músculo tibial anterior em resposta a um protocolo de exercício resistido progressivo de

alta intensidade em ratos que mimetiza o treinamento em humanos em relação à

freqüência semanal, o número de séries e o intervalo entre elas.

Peso corpóreo e Carga de trabalho

Assim como no protocolo proposto por Hornberger & Farrar [10] todos os animais

completaram com sucesso as 8 sem de treinamento, além disto, de maneira semelhante

55

ao descrito pelos mesmos autores observamos um aumento da capacidade de transportar

cargas progressivas decorrentes do TRPAI.

Hornberger & Farrar [10] relatam uma melhora na capacidade máxima de transporte dos

animais de 287%, neste estudo encontramos uma melhora de 382% o que comprova a

reprodutibilidade do protocolo em termos de ganho de força. Adicionalmente, os

autores mostraram que a média de escaladas por sessão de treinamento foi de 6,02 ±

0,23, enquanto que em nosso estudo variou de 5 a 7,8 em média. Todos os animais

apresentaram um aumento do peso corporal após 8 sem de experimento [10], porém o

G3 (treinado) apresentou um ganho de peso menor que o G2 (sham).

Efeito do TRPAI sobre a atividade da MMP-2

O aumento na expressão de MMP-2 no músculo TA em ambos os grupos

submetidos ao exercício físico pode indicar que este apresenta uma fase de

remodelamento prolongada e com formação de novas miofibrilas, pois o aumento da

atividade proteolítica local é fundamental para o crescimento tecidual.

Tanto no grupo sham quanto no grupo treinado (G3), encontramos um aumento

da atividade da MMP-2 em sua forma inativa. Sabemos que o exercício físico por si

aumenta os níveis intersticiais de MMP-2 e MMP-9 nos tecidos peritendíneos, e que o

aumento da MMP-2 é fundamental para formação de novos capilares durante estímulos

mecânicos [14]. Além disto, Suominen et al. [15] mostraram que o treinamento físico

pode acelerar o metabolismo do colágeno, estudos recentes tem evidenciado que o

turnover do tecido conjuntivo aumenta em resposta ao exercício resistido em maior

proporção que o acúmulo deste, ocorrendo uma reorganização e assim, aprimorando sua

força e resistência ao estresse provocado pelo músculo [14].

Porém, encontramos aumento significativo na atividade da MMP-2 em sua

forma ativa somente no G3. Carmelli et al. [16] mostraram que a ativação da MMP-2 e

56

da MMP-9 em resposta as demandas impostas ao músculo são dependentes da

intensidade do exercício e do tipo de músculo avaliado. Hornberger & Farrar [10]

demonstraram que o TRPAI reproduzido neste estudo foi capaz de induzir hipertrofia de

maneira similar a apresentada em humanos. Sabemos que o exercício de hipertrofia

muscular tem como resposta crônica o aumento na área de secção transversa das fibras

musculares decorrentes da elevação do conteúdo protéico intracelular [17], e que as

fibras do tipo II ou glicolíticas, são adequadas para tarefas que necessitam de força e

potência, e em ambiente de baixa oxigenação tecidual [18].

Carmelli et al. [16] suportam a hipótese de que o exercício de alta intensidade

promove a expressão da MMP-2 no músculo esquelético e que a influência do exercício

na expressão da MMP-2 é predominante em músculos com grande percentual de fibras

rápidas (ou tipo II). Em complemento, Petrofsky et al. [19] reportaram que o aumento

da pressão intramuscular decorrente do aumento da tensão ocasionada pelo aumento da

intensidade do exercício físico, leva a um colapso dos capilares reduzindo assim a

oxigenação tissular, com recrutamento de fibras rápidas [20] e aumento do acúmulo de

lactato.

CONCLUSÃO

Concluímos que o treinamento resistido progressivo de alta intensidade aplicado neste

estudo foi capaz de aumentar a expressão da MMP-2, auxiliando assim no

remodelamento muscular.

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59

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p. 764-771, 2000.

60

Tabela 1. Peso corporal dos animais, MMP-2 em seus domínios pro e ativo no músculo tibial anterior; e carga pico e lactato no pico no teste de

esforço máximo final.

G1

n = 10

G2

n = 10

G3

n = 10

Pré Pós Pré Pós Pré Pós

Peso corpóreo (g) 292 ± 27 363 ± 32* 292 ± 27 413 ± 39* † 286 ± 19 381.0 ± 33* † ‡

Carga pico (g) - 205 ± 84 303 ± 66 834 ± 156* † 262 ± 83 1001 ± 231* †

G1: grupo controle; G2: grupo sham; G3: grupo treinado; Pré: teste de esforço máximo pré-treinamento; Pós: teste de esforço máximo pós-

treinamento; † - diferença significativa (p<0,05) em relação ao G1 (ANOVA com pós hoc de Tukey); ‡ - diferença significativa (p<0,05) em

relação ao G2 (ANOVA com pós hoc de Tukey); * - diferença significativa (p<0,05) entre pré e pós, usando teste t de Student pareado.

61

Figura 2. Domínios pro e ativo da MMP-2 no músculo tibial anterior nos grupos

estudados. G1: grupo controle; G2: grupo sham; G3: grupo treinado; UA: unidades

arbitrárias; # - diferença estatística em relação ao grupo controle (teste t de Student não

pareado).

#

G1 G2 G3

6,7

6,8

6,9

7

7,1

7,2

7,3

7,4

7,5

7,6

7,7

G1 G2 G3

Dom

ínio

ativ

o M

MP-

2 (U

A)

0

1

2

3

4

5

6

G1 G2 G3

Pro-

MM

P-2

(UA

)

G1 G2 G3

##

#

62

9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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65

10. ANEXOS

66

ANEXO A – TRABALHOS APRESENTADOS EM

EVENTOS

67

A.P.D. PARIZOTTO; R.P. SIMÕES; M.A. AUAD; S. ROUHANI; C. PADOVANI;

N.A. PARIZOTTO; V. BALDISSERA; A. BORGHI-SILVA. Determinação do limiar

de anaerobiose em ratos durante o protocolo de exercício físico resistido em

escada. V Workshop em Fisiologia do Exercício Físico da UFSCar e II Congresso

Paulista da Sociedade Brasileira de Fisiologia do Exercício, 2006.

A.P.D. PARIZOTTO; R.P. SIMÕES; M.A. AUAD; S. ROUHANI; C. PADOVANI;

C.A. SILVA; N.A. PARIZOTTO; V. BALDISSERA; A. BORGHI-SILVA.

Determinação do limiar de anaerobiose em protocolo de exercício físico resistido

em escada em ratos wistar. Revista da Sociedade Brasileira de Cardiologia do Estado

de São Paulo, v. 17, n. 2, suplemento especial, 2007.

A.P. DEUS; C. PADOVANI; G.B. DELFINO; R.P. SIMÕES; C.A. SILVA; N.A.

PARIZOTTO; A. BORGHI-SILVA. Effects of resistance exercise on tissue

sensitivity to insulin and pancreatic function in rats. CIFARP 2007, 6th International

Congress of Pharmaceutical Sciences, 2007.

C. PADOVANI; A. BORGHI-SILVA; A.P.L. DEUS; S. ROUHANI; M.A. AUAD;

G.B. DELFINO; N.A. PARIZOTTO; C.A. SILVA; K.M. CANCELLIERO; R.P.

SIMÕES. Efeitos do exercício resistido em escada sobre a função pancreática e a

sensibilidade tecidual à insulina em ratos. Jornada de Iniciação Científica e

Tecnológica da UFSCar e XVI Congresso de Iniciação Científica, 2008.

68

ANEXO B – TERMO DE APROVAÇÃO DO PROJETO

PELA COMISSÃO DE ÉTICA EM EXPERIMENTAÇÃO

ANIMAL DA UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO

CARLOS (CCEA/UFSCAR)

69

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