Indice

1. INTRODUÇÃO.......................................................................................................................... 3

2. ACTIVIDADES REALIZADAS................................................................................................ 3

2.1 WIDAL............................................................................................................................................ 3

2.2 PCR – Proteina C-Reativa................................................................................................................. 5

2.3 Teste de Falciformação................................................................................................................... 6

2.4 HIV RDT.......................................................................................................................................... 7

2.5 Uni-Gold RDT.................................................................................................................................. 7

2.6 HBSAG RDT..................................................................................................................................... 8

1.1 HCV RDT....................................................................................................................................... 10

2.7 TPHA (Treponema Pallidum Hemoagglutination Assay).................................................................11

2.8 VDRL............................................................................................................................................. 13

2.9 Grupo sanguineo........................................................................................................................... 13

3.0 Conclusão……..15

1. Introdução

O meu primeiro periodo de estágio no laboratório do HDP realizou-se na área de Serologia no periodo compreendido entre 02 a 30 de Agosto do ano em curso.

Serologia ou sorologia é uma área do laboratório, de diagnóstico indirecto que se baseia no estudo do sistema imunológico.

A área de serologia tal como outras de laboratório é importante por fornecer aos médicos uma informação diagnóstico indirecto de doencas e permitir a tomada de decisão de tratamento mais efectiva.

Nesta area são realizados os seguintes exames:1. R. Widal2. PCR3. HBSAG4. HCV5. HIV6. VDRL7. TPHA8. PCR9. DU10. Falsiformação

2. Actividades realizadas

Durante o periodo em análise participei na realização dos exames laboratoriais que abaixo se descrevem de forma resumida. Para cada teste é apresentado o objectivo do teste, o material necessário, os procedimento e a leitura e interpretação dos resultados entre outros aspectos.

2.1 WIDALO serodiagnóstico de Widal baseia-se numa reacção antigéno-anticorpo. Uma quantidade do soro do paciente se adiciona a uma quantidade conhecida de antigéno O (somático) e H (flagelar). A reacção é positiva (reacção de aglutinação) já no início da segunda semana e por alguns meses. Ė uma técnica de aglutinação para a deteção qualitativa e quantitativa de uma infecção por salmonella tiphy (serotipos A,O, AH, BH).

Material necessário Placa com fundo branco Vareta

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Agitador mecánico rotatorio Banho-maria Pipeta Micrométrica de 50µl Ponta

Reagentes

Os reagentes utilizados para este teste são: Salmonella tiphy O (TO) Salmonella tiphy H (TH) Salmonella paratiphy AH (AO) e (AH) Salmonella paratiphy BH (BO) e (BH)

Amostra utilizada Soro Plasma

Procedimento Metódo qualitativo

o Preparar para cada paciente uma placa com 4 cavidadeso Numerar a placa com o número do paciente e identificar em cada

cavidade o tipo de reagente a utilizar.o Pipetar 50 µl de amostra e colocar no círculo da placao Adicionar uma gota do reagenteo Homogeneizar com a vareta o Levar ao agitador durante um (1) minutoo Fazer a Leitura

Leitura e interpretação de resultadoso Pesença de aglutinação: positivo (+)o Ausência de aglutinação: Negativo (-)

Metódo Quantitativo: Usado só para amostras positivas no teste qualitativo. Neste caso usa-se o reagente que agluitinou no teste qualitativo

o Colocar 4 tubos de ensaio no suporteo Numerar os tubos com:

Número da amostra O antigene que aglutinou Percentagen de aglutização

o Fazer a diluiçãoo Pipetar 2000 µl de soro fisiológico e colocar no primeiro tubo

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o Pipetar 1000 µl de soro fisiológico para os restantes três tuboso Tirar 50 µl de soro fisiólogico no primeiro tubo e dispersar, subistituir

com 50 µl de amostrao Tirar 1000 µl de soro fisiólogico no primeiro tubo e colocar no segundo

para o terceiro, do terceiro para o quarto e dispersar 1000 µl do quarto.o Colocar uma gota de reagente em cada um dos 4 tuboso Homogeneizar e incubar por 24 horas a 37 º C.o No dia seguinte retirar os 4 tubos e verificar que houve aglutinação em

todos os tubos Leitura e interpretação de resultados

o Considerando os 4 tubos com leituras de 1/40, 1/80, 1/160 e 1/320 de cada conjunto de tubos em que houve aglutinação escolher-se-a a maior leitura.

2.2 PCR – Proteina C-Reativa

O PCR e uma técnica de aglutinação para a detecção qualitativa e semi quantitativa de PCR em soro humana. As particulas de latex recobertas com anticorpos anti PCR humanas sao agluitinadas por moleculas de PCR presentes na amostra do paciente.

PCR serve para determinar o processo inflamatório

Material necessário Agitador mecânico rotatorio de velocidade regulda a 80/100 RPM Uma placa com cavidades pretas Vareta Pipeta Micrometrica de 50µl Ponta

Reagentes

Os reagentes utilizados para esta teste sao: Latex Controlo positivo Controlo negativo

Amostra utilizada Soro

Procedimento Metodo qualitativo

o Numera a placa fazendo cada cavidade para um paciente

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o Colocar o soro do paciente na cavidade correspodenteo Adicionar o reagenteo Homogeneizar com a vareta o Levar ao agitador durante dois (2) minutoso Fazer a Leitura

Leitura e interpretacao de resultadoso Positivo (+): presença de aglutinações que podem ser mais ou menos evidentes.

o Ausência de aglutinação: Negativo (-)

2.3 Teste de Falciformação

Este exame serve para determinar a presença de hemacias em forma de foice.

Material necessárioo Lâmina sem bordoo Lamelao Pipeta de 10µl o Ponta de 10µ

Reagentes Preparação do reagente

o Colocar 10 ml de soro fisiologico num tubo de ensaio e adicionar 1 copinho (1 cc) de metabisufito de sódio em po

o Homogeneizaro Rotular o tubo

Os reagentes utilizados para esta teste são: Metabisufito de sodio em diluição com água destilada 1:10

Amostra utilizada Sangue total

Procedimento

o Colocar duas gotas so sangue do paciente em cada lado da lâminao Colocar a lamella numa das gotaso Pipetar 10 µl de metabisufito e adicionar com a gota de sangue e

homogeneizaro Parafinar

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o Levar ao banho-maria durante 30 minutos ou maiso Observar com objectiva 40xo Dar os resultados

Leitura e interpretação de resultadoso Presença de células falciformes: Positivo (+)o Ausencia de celulas falciformes: Negativo (-)

2.4 HIV RDT

Para a deteção do HIV utilisam – se os seguintes testes:

Determine HIV ½É um imunoensaio qualitativo de leitura visual para a detecção de anticorpos contra o HIV-1 e HIV-2

Uni-gold- usado para reconfirmar os resultados positivos do teste Determine HIV ½

Material necessario Pipeta Micrométrica de 50µl Ponta

Amostra utilizada Soro Sangue total

Procedimentoo Colocar uma gota do soro do paciente no cartão de ensaioo Aguardar por 15 minutoso Fazer a leitura

Leitura e interpretação de resultadoso Presença de dois riscos (paciente e control): positivo (+)o Presença de um risco (control): Negativo (-)

2.5 Uni-Gold RDTO teste Uni-Gold ( Trinity Biotech) e um reagente único de ensaio para a detecção de anti-corpos do virus de immunodeficiência do tipo 1 e 2 no soro, plasma ou sangue total.O virus da imunodeficiência humana (VIH ) tem sido reconhecido como o agente etiologico do sindroma da imonodeficiencia adquirida (SIDA).

[7]

Procedimento

o Retirar a aparelho da capa protectorao Rotular cada teste com a informação apropriada do pacienteo Usando uma pipeta descartavel fornecida com o kit, enche-lo com

soro/plasma/sangue totalo Segurando a pipeta por cima do porta da amostra adicionar 2 gotas de

amostra (aproximadamente 60 µl) cuidadosamenteo Esperar por 10 minutos para que occora a reacção. O resultado deve ser

imediatamente lido depois de 10 minutos depois do tempo de incubacao mas pode ainda estar estavel nos 10 minutos seguintes. Recomenda-se nao ler resultados depois de 20 minutos

Leitura e interpretação de resultadoso Uma linha de qualquer intensidade que se forma na região de teste, mais

uma linha formada na região de controlo indica resultado positivo (+)o Uma linha que se forma so na região de controlo indica resultado

negativo (-) o Se nenhuma linha aparece na região de controlo o teste e inconclusivo.

Deve ser repetido com outro aparelho

o A reacção positiva e visualizada pelo risco rosa/vermelho na região de controlo do aparelho.

o A reacção negativa ocorre na ausencia de anticorpos de imunoglobulina ao VIH no specimen analizado. Em consequência nao sera desenvolvida nenhum risco visualmente detectavele no aparelho

o O aparecimento de um risco rosa/vermelho na região de controlo indica performance apropriada dos reagents no kit.

2.6 HBSAG RDTUtilização do testeĖ um teste rapido (RDT) que permite a detecção qualitativa dos antigen hbs no soro, plasma ou sangue total humano.Hbs e o virus da hepatite B e é responsavel por hepatites agudas e cronicas. O HBS aparece varios dias a varias semanas apos uma exposição ao virus e pode persistir durante varios meses.

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Material necessário Pipeta Micrometrica Ponta

Amostra Soro, plasma e sangue total

Procedimento Com amostras de soro ou plasma

o Retirar o dispositivo da saqueta selada e utilize-lo rapidamenteo Colocar o dispositivo numa superficie plana e limpao Colocar três gotas de amostra aproximadamente 50µl.o Depois de ter introduzido a amostra, esperar que apareca a linha de

control (C ) e eventualmente a linha T (teste). Ler o teste 15 minutos apos ter introduzido a amostra. Nao fornecer um resultado negative antes de 30 minutos

Com amostra de sangue total (punção venosa)o Retirar o dispositivo da saqueta selada e utilize-lo rapidamenteo Colocar o dispositivo numa superficie plana e limpao Transferir tres gotas de sangue total (aprox 50µl) com a pipeta de

transferencia no poco amostra (S) do dispositivoo Colocar uma gota de tampão (aprox 40µl) evitando a formação de bolhas

de ar no poco S.o Ligar o cronómetro o Apos ter introduzido a amostra esperar que apareça a linha de controlo

(C) e eventualmente a linha de teste (T). Ler o teste apos 15 minutos. Não fornecer um resultado negativo antes de 30 minutos

Com amostra desangue total (ponta do dedo)o Retirar o dispositivo da saqueta selada e utilize-lo rapidamenteo Colocar o dispositivo numa superficie plana e limpao Colher aproximadamente 75µl de amostra com o tubo capilaro Dispensar utilizando uma pera na zona de introducao de amostra o Colocar uma gota de tampao (aprox 40µl) evitando a formacao de bolhas

de ar no poco S.o Apos ter introduzido a amostra esperar que apareca a linha de controlo

(C) e eventualmente a linha de teste (T). Ler o teste apos 15 minutos. Nao fornecer um resultado negativo antes de 30 minutos

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Interpretação dos resultadoso Positio (+): Aparecem duas limhas de cor distinta: uma de cor azul na

zona de controlo C evermelha na zona de teste (T), uma linha (T) rosada avermelhada, mesmo muito fina indica um resultado positivo

o Negativo (-): Aparece uma limha azul na zona de controlo C. Nao aparece nenhuma linha na zona de teste

o Inválido: A linha de controlo não aparece ou ausencia de linhas C e T, um volume de amostra insufieciente ou uma execução incorrecta do teste são as causas provaveis.

o Ler de novo as instrucoes e efectuar de novo o teste com u novo dispositivo. Se o problema persistir nao utilizar mais a emabalagem e contactar o seu distribuidor local.

1.1 HCV RDT

Utilização do testeÉ um teste rapido que utilize a tecnologia imunocromatografica e que permite a detecção qualitativa do antgigeno do virus da hepatite C no soro ou plasma.

Reagentes

O teste contém particulas finas de proteina A e antigeno de HCV na membrana

Material necessario Pipeta descartavel Centrifugadora Cronometro

Amostra Soro, plasma

Procedimentoo Retirar o dispositivo da saqueta selada e utilize-lo rapidamenteo Colocar o dispositivo numa superficie plana e limpao Transferir a amostra atraves da pipeta ou conta-gotaso Se usar a pipeta:

Trasnferir 5µl de soro ou plasma para o orificio da amostra (S), do dispositivo de teste depois adicionar 2 gotas de buffer (aprox 80 µl) e iniciar o cronómetro.

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o Se usar frasco conta gotas descartavel: Mantenha o conta gotas na posicao vertical, deixa cair a amostra ate

a linha de enchido, aproximadamete 5 µl. Transferor a amostra para o orificio da amostra do dispositivo de teste, depois acrescentar duas gotas do buffer aproximadamente 80µl e iniciar o cronómetro

Espere que a linha vermelha apareca. Ler dentro de 10 minutos Interpretação dos resultados

o Positio (+): Aparecem duas linhas de cor vermelha bem distinta: uma deve estar na região de controlo (C) e outra na região de teste (T)

o Negativo (-): Aparece uma limha vermelha zona de controlo C. Nao aparece nenhuma linha vermelha ou rosa na regiao de teste.

o Invalido: A linha de controlo nao aparece. Um volume de amostra insufieciente ou uma execução incorrecta do teste sao as causas provaveis.

o Ler de novo as instrucoes e efectuar de novo o teste com u novo dispositivo. Se o problema persistir não utilizar mais a embalagem e contactar o seu distribuidor local.

2.7 TPHA (Treponema Pallidum Hemoagglutination Assay)

o E teste confirmatório que se faz quando o VDRL for positivoo E uma reaçcão serológica que procura antigenios do agente etiológico

causador da sifilis.o E uma hemoaglutinação

Material necessário

Uma placa com multiescavações Pipeta de 25 µl Pipeta de 75 µl Pipeta de 100 µl

Reagentes

Célula teste Celula controlo Controlo positivo Controlo negativo

Procedimento:

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Numa placa de multiescavações devidamente assinalada colocamos:

Primeira coluna coloca-se a celula testeo Nas duas primeiras escavações coloca-se 75 µl de celula testeo Adiciona-se 25 µl de controlo positivo (+)o Na segunda escavacao coloca-se 25 µl de controlo negativo (-)o Nas outras 6 escavacoes coloca-se 75 µl de celula teste

Na segunda coluna coloca-se o diluenteo Na primeira escavação coloca-se 200 µl de diluenteo Da segunda a sexta escavação coloca 100 µl de diluenteo Retirar 10 µl de diluente da primeira escavacao e despresa-se. De

seguida adicionar 10 µl de soro do paciente. o Homogeneisamos com uma pipeta de 100 µl e retira-se 100 µl da

mistura da primeira escavacao e coloca-se na segunda escavacao.o Homogeneizar e passar para a terceira escavacao e assim

sucessivamente ate a sexta escavao.o H omogeneizar e deprezar 100 µl da 6 escavacao.

Com uma micropipeta de 25 µl:o Retira-se 25 µl da mistura e coloca-se na coluna da celula teste da

primeira a sexta escavação.o Repetir o mesmo processo (usando 25 µl) da mistura na coluna da

celula controlo da primeira a sexta escavação.o Parafina-se para impeder o vapor proteger contra a luz e poe-se

numa gaveta escura durante 45-50 minutos

Leitura e interpretação de resultadosA leitura é feita macroscopicamente:Positivo (+): Presença de aglutinações na diluição do paciente. A quantificação da positividade é em relação á aglutinação de cada escavação da coluna de diluição do paciente. O titulo é fornecido a partir de 1/80 até 1/2560.Negativo (-): Não se apresentam aglutinações na diluição do paciente.

2.8 VDRL

É um exame de tipo antigenio-anticorpo para dectectar a doença de Syphilis.

Material Placa com fundo branco

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Vareta Agitador mecanico rotatorio Pipeta Micrometrica de 50µl Ponta

ReagentesRPR- carbon ou VDRL .

Amostra Soro Plasma

Procedimento Pipetar 50µl de soro do paciente e colocar na placa Adicionar o reagente Homogeneizar Levar ao agitador durante 8 minutos Fazer a leitura

Interpretação de resultados É feito macroscopicamente. Positivo (+): presença de aglutinações que podem ser mais ou menos evidentes.

Daí que o resultado é dado por cruzes: Uma a três cruzes.

2.9 Grupo sanguineo

Determinação do Du

É um teste que faz quando o antigenio anti-D Monoclonal IgG/IgM durante a determinação do grupo sanguíneo em placa não aglutinar.

Material Dois tubos de ensaio Uma pipeta de 50 µl Uma pipeta de 100 µl Ponta Banho-maria Centrifugadora

Amostras Sangue total

Reagentes

Anti-D

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Reagente de Coombs

Procedimento Pipetar 100 µl de soro fisiologico Colocar no primeiro tubo de ensaio Adicionar 100 µl de sangue total do paciente Homogeneizar Retira-se 100 µl da mistura do primeiro tubo Colocar no segundo tubo Adicionar duas gotas do reagent anti D no Segundo tubo Leva-se ao banho-maria durante 18-20 minutos Faz-se a leitura macroscopica e se não houver aglutinações:

o Faz-se a lavagem dos globulos vermelhos com soro fisiologicoo Levamos na centrífuga por 15 minutos o Decanta-se e volta-se a lavar os globulos vermelhos por três vezeso Na última decantação acrescenta-se o reagente de Cumbso Retira-se uma gota da amostra o Coloca-se na lamina e cobre com a lamella e leva-se ao microscopio para

observar com objectiva 10x ou 40x.

Interpretação dos resultados

Positivo (+): Observa-se as hemácias agrupadas

Negativo (-): Observa-se as hemácias separadas umas das outras

3. Conclusão

A minha experiência nesta sessão permitiu-me alicerçar os meus conhecimentos

e habilidades no uso das técnicas de diagnóstico terapéutico realizadas na mesma. Foi

também um momento que permitiu o aumentar da consciencialização da problematica

real do HIV-SIDA graças ao contacto diário com casos dessa doença

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De agradecer os técnicos que nos acompanharam pelo empenho e boa vontade

em partilhar a sua experiencia connosco bem como o espirito de equipa verificado

durante esta fase do estágio.

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