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Recebido para publicao em 06/12/2005Aceito para publicao em 28/08/2006

Acetogeninas de anonceas bioativas isoladas das sementes deAnnona cornifolia A. St - Hil.

SANTOS, L.A.R.; PIMENTA, L.P.S.; BOAVENTURA, M.A.D.Instituto de Cincias Exatas, Departamento de Qumica, UFMG, Av. Antnio Carlos 6627, Belo Horizonte, MG,CEP.: 31270-901, Brasil, Tel.: 31-34995754, e-mail: dianadb@netuno.lcc.ufmg.br

RESUMO: O estudo fitoqumico biomonitorado do extrato etanlico das sementes de Annonacornifolia A. St. Hil. (Annonaceae) levou ao isolamento de duas acetogeninas, esquamocina-Le esquamocina-M, j descritas na literatura, mas inditas nesta espcie. Testes realizadosmostraram que o extrato etanlico, a frao hexnica e as acetogeninas possuem atividadelarvicida frente ao microcrustceo Artemia salina.

Palavras-chave: acetogeninas, Annona cornifolia, Annonaceae, atividade larvicida.

ABSTRACT: Annonaceous acetogenins from the seeds of Annona cornifolia A. St. - Hil.The bioguided phytochemical study of ethanol extract of Annona cornifolia A. St. -Hil (Annonaceae)led to the isolation of two known acetogenins, squamocin-L and squamocin-M, both isolated forthe first time in this species. The ethanol extract, the hexane fraction, and the two pure acetogeninsshowed brine shrimp larvicidal activity.

Key words: acetogenins, Annona cornifolia, Annonaceae, larvicide activity.

INTRODUOA famlia Annonaceae compreende cerca de

130 gneros e 2300 espcies (Alali et al., 1999),distribudas em pases de climas tropical esubtropical. O gnero Annona, que possui mais de120 espcies catalogadas (Joly, 1998), tem sido muitopesquisado devido ao isolamento e caracterizaode diversas classes de substncias com atividadesqumicas e farmacolgicas (Leboeuf et al., 1982),principalmente no que diz respeito s acetogeninas.Elas so derivadas de cidos graxos (C33-C37) eapresentam um nmero varivel de anistetraidrofurnicos (THF) ou tetraidropirnicos (THP)ao longo da cadeia hidrocarbnica (Alali et al., 1999).Essas substncias naturais bioativas apresentamimportantes atividades biolgicas tais como:citotxica, antitumoral, pesticida, vermicida,antimicrobiana, imunossupressora, antiemtica,inibidora do apetite e antimalrica (Cav et al., 1993;Cav et al., 1997; Alali et al., 1999). Nosso grupo depesquisa tem investigado plantas da famliaAnnonaceae, principalmente os gneros Annona(Santos et al., 1996) e Rollinia (Pimenta et al., 2001).

A espcie Annona cornifolia A. St. Hil umarbusto frutfero encontrado na Bahia, Minas Gerais,So Paulo, Gois e Mato Grosso, conhecidopopularmente como ata-de-cobra (Maas et al., 2001).O arbusto apresenta altura varivel e frutos piriformes,com aurolas globosas, da cor laranja quandomaduros. A polpa do fruto, enquanto verde, utilizadacontra lceras atnicas e depois de maduro torna-sedoce e comestvel (Correa, 1974). O primeiro estudofitoqumico dessa espcie foi feito pelo nosso grupoe uma acetogenina indita foi isolada, conhecida porcornifolina (Santos et al., 2006).

O presente trabalho relata o estudofitoqumico biomonitorado da espcie Annonacornifolia, descrevendo os resultados parciais obtidoscom a purificao da frao hexnica, que levou aoisolamento de duas acetogeninas esquamocina-L (1)(Jolad et al., 1985; Ohsawa et al., 1991; Sahai et al.,1994; Gu et al.,1997; Chang et al., 2003) eesquamocina-M (2) (Sahai et al., 1994; Hisham etal., 1991), as quais j foram isoladas anteriormenteem espcies pertencentes famlia Annonaceae e

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ao gnero Annona. O extrato etanlico, a fraohexnica e as acetogeninas puras mostraramatividade larvicida frente Artemia salina.

MATERIAL E MTODO

Material botnicoAs sementes de Annona cornifolia A. St.

Hil. (Annonaceae) foram coletadas na regio deCurvelo - Minas Gerais, entre janeiro a maro de 1998.A espcie foi identificada pelo botnico Dr. R. Mello-Silva e a exsicata (BHCB 68114) se encontradepositada no Departamento de Botnica do Institutode Cincias Biolgicas da Universidade Federal deMinas Gerais, Belo Horizonte, Minas Gerais, Brasil.

GeralPara os procedimentos cromatogrficos foi

utilizada slica gel 60 (70-230 mesh, Merck, D-6100Darmstadt, Germany). Nas anlises por cromatografiaem camada delgada (CCD) foram utilizadas placasde slica gel 60 F254 (Merck, Germany), com 0,25 mmde espessura. A deteco das placas de cromatografiaem camada delgada analtica foram feitas porborrifamento com os reagentes de Dragendorff e deKedde (Wagner et al., 1984). As anlises das fraespor Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE),foram feitas em cromatgrafo Shimadzu LC-10AD,com detector UV-VIS SPD-10AV e integrador IC-10AV.Os espectros de absoro na regio do infravermelhoforam obtidos em espectrmetro Shimadzu/IR-400,em partilhas de KBr. As freqncias de absoro forammedidas em unidades de nmero de onda (cm-1). Osespectros de RMN de 1H a 400 e 200 MHz e de 13C a100 e 50 MHz (1D e 2D), em CDCl3, foram obtidosem espectrmetro Bruker Advance DRX-400 e DPX-200. Os deslocamentos qumicos foram registradostendo o TMS como padro interno. Os espectros demassas EMIE (Espectro de Massas por Ionizaode Eltrons) foram registrados em espectrmetromarca Shimadzu, modelo CGMS QP 5050 eESIMS-Q/TOF (Eletrospray Ionization Mass Spectrum- Quadrupole Ion Trap/ Time of Flight) emespectrmetro marca Micromass, modelo Micro TMQ-TOF, equipado com fonte de ionizao eletrosprayoperando com on no modo positivo. A rotao ticadas substncias foi medida em um polarmetro Perkin-Elmer modelo 341, usando-se CHCl3 como solvente.Os pontos de fuso foram determinados em aparelhoMettler FP5 e no foram corrigidos.

Fracionamento do extrato etanlico brutoAs sementes de Annona cornifolia (150 g)

aps secagem temperatura ambiente, foramtrituradas e extradas exaustivamente em extrator tipoSoxhlet, sob refluxo, durante 48 horas com etanol. A

destilao do etanol feita sob presso reduzida,forneceu 10 g de resduo. Este material foi submetido partio com hexano/acetato de etila, obtendo-seuma frao em acetato de etila (3,5 g) e outra hexnica(6,0 g). A frao hexnica foi submetida cromatografiaem coluna de slica gel, utilizando-se como eluenteshexano/diclorometano/acetato de etila/metanol comgradiente de polaridade crescente, sendo obtidas 166fraes que foram reunidas em 15 grupos com baseem seu perfil por cromatografia em camada delgadade slica. O grupo 9 (fraes 30-44; 596 mg) indicou,aps revelao com reagentes de Dragendorff e Keddee anlise do espectro no IV, a presena de acetogeninas;este foi ento submetido a CLAE preparativa (colunaShim-pack PREP-ODS, 5 mm, 250 x 20 mm), eludacom acetonitrila/gua (isocrtico, 80:20 v/v, fluxo de18 mL min-1), fornecendo as acetogeninas esquamocina-L (1, 38 mg) e esquamocina-M (2, 54 mg) impura. Asubstncia 2 foi recristalizada em acetato de etila,obtendo-se um slido branco (35 mg).

A caracterizao das substncias isoladas(Figura 1) foi possvel pela anlise dos dadosespectromtricos de EM, IV, RMN de 1H e 13C, COSYe HMQC, e por comparao com aqueles encontradosna literatura (Jolad et al., 1985; Ohsawa et al., 1991;Hisham et al., 1991; Sahai et al., 1994; Gu et al.,1997;Chang et al., 2003).

Atividade larvicida sobre o microcrustceoA. salina

O teste larvicida sobre o microcrustceo A.salina foi padronizado utilizando-se lapachol, cuja DL50 70 g mL-1 (61< DL50< 81) e foi feito de acordo coma metodologia descrita por Meyer et al. (1982).Resumidamente, ovos encistados de A. salina(Maramar) foram incubados em gua marinha artificial.A cultura foi mantida a 28oC, sob luz e aeraoconstantes. As solues de lapachol e amostras-testes (extrato etanlico, frao hexnica eacetogeninas puras) foram dissolvidas em 1,0 mL dedimetilsulfxido (DMSO), diludas com soluo salinae testadas em cinco concentraes diferentes, emtriplicata. Larvas em estgio metanauplii(aproximadamente 10 unidades) foram adicionadasa cada tubo contendo as diluies e as culturas foramincubadas por 24 horas. Um grupo controle utilizando-se soluo marinha (com 1% de DMSO v/v) foi includono teste. Os valores de DL50 com intervalo deconfiana de 95% foram determinados em mg mL-1,utilizando o mtodo probitos de anlise (Finney, 1974).

RESULTADO E DISCUSSO

Estudo qumicoO ESIMS das duas substncias mostrou o

pico do aduto com sdio [M + Na]+ de m/z 629,

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indicando M+ de m/z 606 (cal. 606,92), consistentecom a frmula C37H66O6. A anlise dos espectros deRMN de 1H, de RMN de 13C e de Massas de 1conduziram mesma estrutura plana daesquamocina-L (Sahai et al., 1994). A estereoqumicarelativa dos anis tetraidrofurnicos foi determinadapor comparao com dados de deslocamentosqumicos nos espectros de RMN de 1H e de 13C deacetogeninas conhecidas (Rupprecht et al., 1986;Fujimoto et al., 1988; Cav et al., 1993). Assim, aestereoqumica relativa para a substncia 1 foideterminada como sendo treo-trans-treo-trans-eritro,mas no se pode afirmar quanto ao sentido em quefoi determinada: se do carbono 15 para o carbono 24ou do carbono 24 para o carbono 15.

A acetogenina esquamocina-M (2) foi isoladacomo um slido ceroso branco. O EMIE dasubstncia 2 apresentou o mesmo padro defragmentao de 1, sugerindo a mesma estruturaplana para 1 e 2. Comparao dos dados dosespectros de RMN de 1H e de 13C de 1 e 2 revelaramque, em 2, a estereoqumica relativa entre C-15 e C-24 treo-trans-treo-trans-treo. Assim, a nicadiferena entre as duas substncias aestereoqumica relativa entre os carbonos C-23/C-24,que para 1 eritro e para 2 treo.

Atividade larvicidaNo teste larvicida frente Artemia salina

(TAS), as substncias so consideradas ativasquando apresentam DL50 < 1000 g mL-1 (Meyer et

FIGURA 1: Estruturas das acetogeninas esquamocina-L (1) e esquamocina-M (2) isoladas das sementes deAnnona cornifolia.

al., 1982). Mais recentemente, Dollabela (1997)demonstrou que substncias com DL50 entre 80 e250 g mL-1 no bioensaio frente Artemia salinapodem apresentar atividade anti-Tripanosoma cruzi;por outro lado, substncias com DL50 < 145 g mL-1,podem apresentar atividade

antitumoral. Com basenos experimentos realizados, foi observado que afrao hexnica apresentou atividade larvicidamoderada (DL50 = 10,000 g mL-1), quando comparadaaos resultados obtidos para o extrato etanlico, ogrupo 9 e as acetogeninas esquamocina-L eesquamocina-M (DL50 = 0,200 g mL-1, DL50 = 0,772g mL-1, DL50 = 0,121 g mL-1 e DL50 = 0,011,respectivamente) (Tabela 1). O extrato etanlico,frao hexnica, grupo 9 e as acetogeninasapresentaram uma atividade larvicida mais elevadaque o lapachol, controle positivo. Com base nosresultados obtidos no teste larvicida sobre Artemiasalina, as acetogeninas sero posteriormentetestadas quanto a atividade antitumoral, sendo estauma das atividades biolgicas mais pesquisadasatualmente para essa classe de substncias.

CONCLUSOO estudo fitoqumico biomonitorado do

extrato etanlico das sementes de Annona cornifolialevou ao rpido isolamento de duas acetogeninas,esquamocina-L e esquamocina-M, que emboradescritas em outras espcies, foram isoladas pela

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TABELA 1. Atividade larvicida do extrato etanlico, frao hexnica, grupo 9 e acetogeninas puras obtidos dassementes de Annona cornifolia

a Rendimento em % de material vegetal seco; b Dose que mata 50% dos indivduos de uma populao; c Intervalo de confiana (95%);d Controle.

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primeira vez nesta espcie. O extrato etanlico bruto,frao hexnica, o grupo 9 e acetogeninas puras, emuma triagem preliminar, apresentaram atividadelarvicida significativa nas doses investigadas e seroposteriormente testadas quanto a uma possvelatividade antitumoral.

AGRADECIMENTOEste trabalho foi financiado pelo Conselho

Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico(CNPq).