A utilização de Plasma Rico em Plaquetas na regeneração do ... · em várias situações...

R E V I S T A P O R T U G U E S A

CIÊNCIAS VETERINÁRIASDE

A utilização de Plasma Rico em Plaquetas na regeneração do tecido ósseoalveolar e cortical. Estudos experimentais num modelo de defeito ósseoperiodontal em cão Beagle (Canis familiaris) e num modelo de defeito ósseocortical na ovelha (Ovies aries) #

The Platelet Rich Plasma utilization in regeneration of alveolar and cortical bone tissue. Experimental studies in a periodontal bone defectmodel in Beagle dog (Canis familiaris) and in a cortical bone defect modelin sheep (Ovies aries)

C. A. A. Viegas*1, M. I. R. Dias*1, J. M. T. de Azevedo2, A. J. Ferreira3,F. San Román4, A. M. S. Cabrita5

1Departamento de Ciências Veterinárias, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Apartado 1013, 5001-801 Vila Real, Portugal2Departamento de Zootecnia - CECAV, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Apartado 1013, 5001-801 Vila Real, Portugal

3Departamento de Morfologia e Clínica - CIISA, Faculdade de Medicina Veterinária, TULisbon,Av. da Universidade Técnica, 1300-477 Lisboa, Portugal

4Departamento de Medicina e Cirurgia Animal, Faculdade de Veterinária, Universidade Complutense de Madrid, Av. Puerta de Hierro, S/N, 28040 Madrid, Espanha

5Instituto de Patologia Experimental, Faculdade de Medicina, Universidade de Coimbra, Rua Larga, 3004-504 Coimbra, Portugal

Resumo: A primeira parte deste estudo teve como objectivoavaliar o potencial de regeneração do osso alveolar em respostaao implante cirúrgico de plasma enriquecido em plaquetas(PRP). O interesse do PRP reside no facto deste conter umagrande concentração em factores de crescimento angiogénicos emitogénicos presentes nos grânulos a das plaquetas, e envolvi-dos na indução e/ou aceleração da cicatrização/regeneração delesões dos tecidos moles e duros. Criaram-se defeitos cirúrgicoscom 7 mm na tábua vestibular de PM4 e M1, em ambos osquadrantes mandibulares em cães Beagle. Em todos eles aplicou-se uma esponja de colagénio de origem equina associadoao PRP nos defeitos do quadrante direito, tendo o quadranteesquerdo funcionado como controlo. Os animais forameutanasiados quatro meses após a cirurgia e o material processadopara análises histológicas e histomorfométricas. No quadrantemandibular em que se utilizou o PRP observou-se uma frentecelular rica contígua e a delinear toda a crista óssea com célulasmesenquimatosas e células blásticas, o que pressupôe grandeactividade de síntese. A regeneração no lado controlo foi muitosemelhante mas mais atrasada no tempo. O comprimento daregeneração óssea foi de 3,1±0,7 mm no grupo em que se haviaaplicado o PRP relativamente aos 2,4±0,7 mm do lado controlo(p<0,05) e a área óssea foi de 3,4±1,0 mm2 para o PRP relativa-mente aos 1,5±1,0 mm2 do controlo (p<0,05). Os resultadossugerem que nas condições desta experiência o tratamento dedefeitos periodontais com PRP provou potencial na estimulaçãoda regeneração óssea. A segunda parte deste trabalho visou o estudo da capacidade osteogénica, com recurso a análises

histológicas e de histomorfometria óssea, de um enxerto de ossoesponjoso autólogo isolado e da sua associação ao PRP nummodelo de defeito ósseo cortical circular (→ 6 mm) em ovelhas.Verificou-se que o volume ósseo foi significativamente afectado(p<0,0001) pelo tratamento e tempo. Concluiu-se que não existiu um aumento significativo na formação de tecido ósseoàs 3ª e 6ª semanas pós-operatórias em defeitos não críticos anível de tecido ósseo cortical preenchidos com a associação doenxerto ósseo ao PRP (50:50) relativamente ao uso isolado doprimeiro (p>0,05). No entanto, verificou-se também que estaassociação possibilitou a obtenção de resultados idênticos naformação de tecido ósseo aos dos defeitos ósseos preenchidosapenas com enxerto, reduzindo para metade a quantidade deenxerto ósseo requerido, o que implicaria menor morbilidade dolocal dador.

Palavras-chave: regeneração óssea, tecido ósseo alveolar, tecido ósseo cortical, modelos experimentais, plasma rico emplaquetas

Summary: The purpose of the first study was to verify theeffect of the platelet rich plasma (PRP) in the reconstruction andhealing of hard periodontal tissue after periodontal reconstruc-tive surgery. The interest in PRP hinges on the fact that it contains a large concentration of angiogenic and mitogenicgrowth factors present in the a granules of platelets involved ininducing and/or accelerating the healing of lesions of soft andhard tissues. The procedure was the following: approximately 7 mm large periodontal defects were created in the mandibularvestibular face at the 4th premolar and the 1st molar in Beagledogs. All the defects were filled up with collagen, but on theexperimental side the collagen was saturated with PRP. Thedogs were sacrificed 16 weeks postsurgery. We evaluated thebone regeneration histologicaly and the histometric recordings

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# Prémio Pfizer Ciências Veterinárias 2005*Correspondência: [email protected]: +351 259350634; Fax: +351 259350480 [email protected] Tel: +351 259350605/7

included height and area of alveolar bone regeneration. In thePRP group we could observe a nearly continuous layer ofosteoblasts lined the newly formed bone, and there was a densecellular "front" with mesenchymal stem cells and blastic cells atthe coronal extent of the new bone. In the PRP experimentalcontrol group we could find the same regeneration standard butslowly developed. The regeneration of bone was 3.1±0.7 mm forthe PRP against 2.4±0.7 mm on the control site (p<0.05). The bone area values are 3.4±1.0 mm2 for the PRP against1.5±1.0 mm2 on control (p<0.05). We couldn’t find collagenousvehicles in both the experimental and the control groups. Ourdata suggest that PRP has a great potential for bone regenera-tion. The second work aimed at studying osteogenic capacitywith recourse to histological and bone histomorphometry analysisof an isolated autologous spongy bone graft and its associationto PRP in a model of small sized (→ 6 mm) circular corticalbone defect in sheep. The bone volume was significantly affected(p<0.0001) by the treatment and by time. The conclusion wasreached that there was no significant increase in bone tissue formation on the 3rd and 6th post-operative weeks on non-criticaldefects at a level of cortical bone tissue filled with an associa-tion of autografting spongy bone with PRP (50:50) with respectto the isolated use of the first (p>0.05). Nevertheless, it wasobserved that this association enabled identical results to beachieved in bone tissue formation as in bone defects merelyfilled with grafting by decreasing the volume of autografting ofrequired spongy bone down to half, which would imply lowermorbidity at a local donor level.

Keywords: bone regeneration, alveolar bone tissue, corticalbone tissue, experimental models, platelet rich plasma

Introdução

A engenharia de tecidos e a regeneração do tecidoósseo

A cicatrização/ regeneração do tecido ósseo é umprocesso complexo, no entanto, com capacidade de,em várias situações clínicas, reconstituir a estrutura dotecido ósseo original sem a formação de tecido cica-tricial conhecido como tal. Este facto é o responsávelpela frequente utilização do termo regeneração na caracterização deste processo, ao invés do termo cicatrização, geralmente empregue nas feridascutâneas ou com localização em outros sistemasorgânicos. Assim, o termo regeneração representa odenominado restitutio ad integrum com a reproduçãoe reconstrução dos tecido lesados de forma a que aestrutura anatómica e funções originais sejam comple-tamente restauradas e o termo cicatrização/reparação areconstituição anatómica com a substituição do tecidooriginal lesado ou perdido por tecido conjuntivofibroso sem que exista a restauração íntegra da estru-tura ou da função do tecido original (Anitua e Andia,2000). Vários investigadores pensam que o mecanismoque confere ao tecido ósseo a capacidade de regeneração, praticamente da sua exclusividade, umavez que na grande maioria dos outros tecidos ouórgãos a reparação das lesões ocorre pelo processocaracterístico de cicatrização, é o facto deste reconstituirvários dos fenómenos e funções celulares vitais que

ocorrem durante o desenvolvimento embrionário dosistema esquelético e ao nível da placa de crescimentoepifisária (Vortkamp et al., 1998; Ferguson et al., 1999).

A cicatrização/regeneração do tecido ósseo envolveum vasto número de fenótipos celulares responsáveispela coordenação das funções de proliferação,migração, diferenciação e síntese da matriz extracelular(MEC) óssea, sendo que o seu sucesso depende dodesenrolar destas funções, numa correcta sequênciatemporal, por várias linhas celulares presentes oumobilizadas para o local da lesão em resposta a sinaisou estímulos específicos locais e/ou do meio ambiente.Assim, as vias e a velocidade de desenvolvimento doprocesso de regeneração do tecido ósseo podem serinfluenciadas por numerosos factores locais e sistémicossendo que, no entanto, na maioria das situações clínicasde lesão do tecido ósseo – este cicatriza após a instituiçãode terapêutica adequada e/ou intervenção cirúrgica.

No entanto, existem situações clínicas com perda detecido ósseo, motivadas por diversos processospatológicos ou traumáticos, ou situações de fracturasem que desenvolvem graves complicações, comosejam, processos de atraso de união ou não união emprejuízo do estado geral de saúde e qualidade de vidado doente, que implicam a sujeição a tratamentos prolongados e com elevados custos. Assim, a forma depermitir um cada vez mais rápido pós-operatórioambulatório com qualidade de vida tem impulsionadoa comunidade científica e os clínicos no sentido dodesenvolvimento de novas terapêuticas com vista apromover ou acelerar o processo de cicatrização dotecido ósseo.

Os recentes avanços no conhecimento dos fenó-menos celulares e moleculares que ocorrem durante oprocesso de cicatrização das fracturas tem possibilitadoo desenvolvimento de potenciais novas formas deabordagem terapêutica, nomeadamente a utilização debiomateriais biodegradáveis com propriedades osteo-condutoras e utilizados como veículos de transporte elibertação lenta de moléculas osteoindutoras, o recursoà terapia selectiva com células mesenquimatosaspluripotenciais (MSC) com origem na medula óssea ecom capacidade de diferenciação nas linhas condro - eosteogénica, a utilização de factores de regulação docrescimento e diferenciação das células e da MEC dotecido ósseo em combinação com células osteoproge-nitoras ou isolados e, ainda, o recurso a várias formasde terapia genética, nomeadamente a transferênciagenética de genes de factores de crescimento para olocal da lesão óssea (Goldstein et al., 1999; Scaduto eLieberman, 1999; Bartold et al., 2000; Fleming et al.,2000; Khan et al., 2000; Niyibizi e Kim, 2000; Vacantie Vacanti, 2000; Moore et al., 2001; Bucholtz, 2002).

Assim, hoje em dia existe uma forte necessidade demelhorar a previsibilidade e a eficiência dos tratamentosregeneradores disponíveis, fazendo esta necessidadecom que os investigadores redobrem os seus esforçosno estudo da biologia da área da cicatrização, com a

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identificação das células alvo mais adequadas, osagentes terapêuticos – os modificadores biológicos,como sejam, as MSC e os factores de crescimentoentre outros, os sistemas de administração que permitemcontrolar a libertação dos mesmos a nível local e asrespostas do hospedeiro (McCauley e Somerman, 1998).

No que se refere em particular aos factores decrescimento, estes são peptídeos ou glicoproteínas queorganizam e coordenam os processos de mitose,quimiotaxia, diferenciação e crescimento das MSC,assim como a produção da MEC pelas células (Forelle Straw, 1993). Os factores de crescimento exercem asua acção pela ligação a receptores membranáriosespecíficos, promovendo uma sequência de fenó-menos intracelulares que influenciam a expressão degenes responsáveis pela codificação das funçõesmetabólicas das células, iniciando-se a transmissão desinalização intracelular ao ácido desoxirribonucléico(ADN), transcrição e síntese das proteínas necessáriasà iniciação da divisão e/ou crescimento celular (Lind,1998). Estes factores de crescimento, em associaçãocom o micro-ambiente, influenciam a replicação, adiferenciação e as funções metabólicas das células dotecido ósseo aquando de lesão deste, assim como atranscrição genética para o tipo de matriz a produzirpor estas células (Canalis et al., 1988a; Lynch et al.,1991b; The American Academy of Periodontology,1996; Schliephake, 2002).

Actualmente dão-se os primeiros passos na utilizaçãoclínica de vários modificadores biológicos em áreastão diversas como a cirurgia plástica para a regeneraçãocutânea nos doentes queimados, a cirurgia ortopédicana resolução de defeitos ósseos (Johnson et al., 1988,1992; Riedel e Valentin-Opran, 1999; Boden et al.,2000; Kleeman et al., 2001; Bessho et al., 2002;Boden et al., 2002; Burkus et al., 2002; Poynton eLane, 2002; Lanman e Hopkins, 2004a, 2004b) e acirurgia maxilofacial que busca soluções para aslesões craniofaciais causadas por doenças infecciosas,neoplásicas, traumáticas ou outras destrutivas dosprocessos alveolares ou da própria estrutura damandíbula e maxila com efeitos desfigurantes (Gravese Cochran, 1990; Langer e Vacanti, 1993; Boyne et al.,1997; Howell et al., 1997; Whitman et al., 1997;McCauley e Somerman, 1998; Groeneveld et al.,1999a; 1999b; Cochran et al., 2000; Garg, 2000; vanden Bergh et al., 2000; Boyne, 2001; Jung et al., 2003;Warnke e Coren, 2003; Bianchi et al., 2004). Em particular na Medicina Dentária, a periodôncia, aendodôncia e a implantologia são áreas que sebaseiam nestes conhecimentos com a finalidade deobtenção respectivamente da regeneração periodontal,formação de dentina reparadora ou terciária e umaquantidade suficiente de tecido ósseo de elevada densidade que permita a colocação de implantespassíveis de osteointegração, sobretudo em doentesedêntulos, com osteoporose ou atrofia grave da maxila(Urist, 1965; Graves e Cochran, 1990; Becker et al.,

1992; Langer e Vacanti, 1993; Rutherford et al., 1993;McCauley e Somerman, 1998; Garg, 2000; Kassolis etal., 2000; Meraw et al., 2000).

No entanto, uma das grandes limitações da utilizaçãotópica de factores de crescimento como promotores daregeneração óssea é a sua limitada vida média nodefeito ósseo, condicionada pela acção das enzimasproteolíticas, endocitose dos receptores, solubilidadedos veículos de distribuição controlada entre outros(McCauley e Somerman, 1998). Outro problema é oda sua difícil produção em larga escala e purificação,o que conduz aos elevados preços que inviabilizam nomomento a sua utilização massiva na clínica (Obarrioet al., 2000). E muitas outras questões se põem com autilização destes agentes, tais como: Qual o factor decrescimento ou a combinação mais adequada? Qual adose mais adequada? Qual o melhor veículo biológicode libertação controlada para cada defeito ósseo?Quando se deve iniciar a libertação dos factores decrescimento na cascata do processo de regeneraçãoóssea e em que sequência? Quais os possíveis efeitoscolaterais locais e sistémicos durante a sua utilização?Poderão os seus efeitos limitar-se ao ambiente local(Vandersall, 1998; Rossa et al., 2000)?

O processo de cicatrização/regeneração do tecidoósseo

Abordando o processo de cicatrização dos tecidosorgânicos lesionados de uma forma geral, a reparaçãodestes inicia-se logo após a agressão tecidular com-preendendo as fases inflamatória, de reparação e deremodelação.

A libertação de factores de crescimento, citocinas eoutras substâncias bio-activas a partir das plaquetas,das células dos tecidos envolventes, da MEC agredidase das células de reacção inflamatória (Rappolee et al.,1988) é parte crítica deste processo (Terranova et al.,1989). Depois de uma agressão tecidular aguda queafecte os tecidos sub-epiteliais, a ruptura dos vasossanguíneos conduz à formação de um coágulo sanguí-neo, composto por uma rede de fibras de fibrina queretêm agregados de plaquetas, leucócitos, eritrócitos eproteínas plasmáticas, como sejam a fibronectina, avitronectina e a trombospondina (Wikesjö et al., 1992;Aukhil, 2000). Entre as funções do coágulo sanguíneosalienta-se: o seu papel no aporte de factores decrescimento e citocinas libertados pelas plaquetasactivadas e o facto de actuar como matriz condutoraprovisória para a migração celular (Aukhil, 2000).Nesta fase, o ambiente do coágulo de fibrina é a de ummeio hipóxico (pO2 5-10 mm Hg) e acídico (pH 4-6),em relação ao tecido íntegro em termos fisiológicos(pO2 45-55 mm Hg, pH 7,42) (Knighton et al., 1981; Davis et al., 1988; Marx et al., 1996), contendoigualmente células estruturais, MSC e capilares seccionados com coágulos e células endoteliaisexpostas (Knighton et al., 1981). Desde os primeiros


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momentos todos estes estímulos promovem o início darevascularização do coágulo, a migração de MSC, asua activação na linha condro- e osteoblástica e amitogénese das células osteo-precursoras no caso particular do tecido ósseo e dos fibroblastos presentesno local da lesão (Anitua e Andia, 2000).

As plaquetas activadas das margens da lesão sofremdesgranulação durante os primeiros cinco dias após alesão, libertando vários factores de crescimento ecitocinas cuja actividade termina ao fim de sete a dezdias (Marx et al., 1998). Entre estes encontram-se ofactor de crescimento de transformação β1 e β2 (TGF-β1 e -β2), factor de crescimento fibroblástico(FGF) -2, factor de crescimento de origem plaquetária(PDGF), factor de crescimento epidérmico (EGF),factor de crescimento do endotélio vascular (VEGF),factor de crescimento das células endoteliais derivadodas plaquetas (PDEGF), esfingosina 1-fosfato, peptido2 activador dos neutrófilos (NAP-2), factor angiogénicoderivado das plaquetas (PDAF), factor de crescimentodos hepatócitos (HGF), péptido III activador do tecidoconjuntivo (CTAP-III), interleucina (IL) -1, substân-cias relacionadas como o factor 4 activador das plaquetas (PAF-4) e a β-tromboglobulina (Assoian etal., 1984; Miyazono e Takaku, 1989). Por outro lado,o exsudado plasmático aporta uma importante fontede factor de crescimento tipo insulina (IGF) –I, sendoque poucas horas após a agressão são libertados nolocal da lesão pelas células adjacentes factores decrescimento como o IGF–I, PDGF, factor de cresci-mento de transformação a (TGF-α) e TGF-β (TheAmerican Academy of Periodontology, 1996;Gemmell e Park, 2000).

A fase inflamatória inicia-se cerca de uma hora apósa agressão com o afluxo de polimorfonucleares neutrófilos que infiltram o coágulo a partir das margens da ferida. Posteriormente acodem osmacrófagos atraídos pela acção do PDGF e pelaexistência de um gradiente de oxigénio superior a 20 mm Hg (Knighton et al., 1981, 1984; Wikesjö etal., 1992). Em cerca de seis horas a superfície da feridaé delineada por neutrófilos que eliminam os tecidoslesados, corpos estranhos e células bacterianas mediante fagocitose e pela libertação de enzimas eprodutos tóxicos formados a partir do oxigénio(Aukhil, 2000). Os monócitos do sangue periféricocontinuam a ser recrutados para o local da ferida convertendo-se em macrófagos após activação(Aukhil, 2000). Os macrófagos, enquanto executamestas acções, libertam moléculas biologicamente activas, como sejam, o PDGF, factor estimulante daformação de colónias de macrófagos (M-CSF), factorestimulante da formação de colónias de granulócitos(G-CSF), factor estimulante da formação de colóniasde macrófagos e granulócitos (GM-CSF), FGF-2,IGF-I, TGF-α, TGF-β1 e citocinas como o IL-1 que,por sua vez, recrutam outras células inflamatórias,para além de fibroblastos e células endoteliais

(Rappolee et al., 1988). Assim os macrófagos repre-sentam um papel muito importante na transição dafase inflamatória para a fase de formação de tecido degranulação (Rappolee et al., 1988; Wikesjö et al.,1992). À medida que a influência do PDGF de origemplaquetária diminui, incrementa-se a acção dos factores de crescimento derivados dos macrófagos,dos factores angiogénicos e do TGF-β produzido pelasMSC pré-existentes ou recrutadas dos tecidos envol-ventes à lesão (Knighton et al., 1981, 1984).

Dois a quatro dias após a agressão, enquanto semantém a diferença de pH do coágulo de fibrina organizada em relação ao tecido são, inicia-se a fasede formação de tecido de granulação paralelamente auma redução gradual da infiltração pelos neutrófilos,permanecendo o fluxo de macrófagos e de fibroblastosque, mediante fagocitose, vão destruindo os neutrófilose os eritrócitos in loco (Aukhil, 2000). Os fibroblastos,sob a influência de factores de crescimento sintetizadospelos macrófagos ou por eles próprios, sintetizamtecido conjuntivo laxo responsável pela união dasmargens da lesão, e que actua como suporte a outrascélulas e à neovascularização necessária ao forneci-mento dos nutrientes e da oxigenação vitais àmanutenção das funções celulares (Wikesjö et al.,1992; Anitua e Andia, 2000; Aukhil, 2000).

Quando no coágulo organizado se equilibra, o gradiente da pressão de O2 e se equilibra o pH,diminui a actividade dos macrófagos, o processo deangiogénese reduz-se e os fibroblastos migram e proliferam na rede de fibrina, depositando MEC.Entre os sete a dez dias após o início da cicatrização,alguns fibroblastos transformam-se em miofibroblastose expressam a actina de músculo liso que lhes permitegerar fortes forças contrácteis responsáveis pela con-tracção da ferida (Wikesjö et al., 1992; Aukhil, 2000).

Gradualmente passa-se da fase de reparação à última fase ou fase de remodelação que se prolongadurante meses ou anos, na qual o tecido neoformado,rico em células sofre um processo de maturação e deremodelação em resposta às suas necessidades funcionais (Wikesjö et al., 1992).

No tecido ósseo, a cicatrização óssea por 1ª intençãoou directa, inicialmente descrita por Danis (1949),caracteriza-se pela ausência de formação de um caloósseo externo e pelo desaparecimento gradual da linhade fractura através da regeneração directa por tecidoósseo formado por sistemas de Havers secundários,sem a formação intermédia de tecido fibroso, carti-lagíneo ou mesmo tecido ósseo trabecular (Bagby eJanes, 1958; Prieur e Sumner-Smith, 1984; Kaderly,1991). A cicatrização óssea por 1ª intenção, ou seja, averdadeira regeneração com restitutio ad integrum dotecido original ocorre apenas nas fracturas estáveis esem deslocamento dos fragmentos ósseos ou naquelaem que é possível uma redução anatómica perfeita,após sujeição a técnica cirúrgica que permita a fixaçãorígida do foco de fractura e em que é possível a


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manutenção de um adequado suprimento sanguíneodesde a fase inicial do processo de regeneração óssea(Ashhurst, 1986; Schenk, 1987).

O processo de cicatrização óssea por 2ª intenção ouindirecto desenvolve-se devido à existência de umaseparação superior a 150 a 200 mm e/ou micromovi-mentos entre os fragmentos ósseos no foco de fractura,denominando-se desta forma pelo facto de, numaprimeira fase, ocorrer a formação de tecido conjuntivointermediário ou fibrocartilagíneo, substituído poste-riormente por tecido ósseo (Schenk, 1987). O processode cicatrização óssea por 2ª intenção é muito mais frequente que o processo por 1ª intenção, caracteri-zando-se por uma combinação de ossificação endo-condral e intramembranosa, sendo que o estímulo queinduz a condrogénese ao invés da ossificaçãointramembranosa não se encontra ainda completa-mente esclarecido pensando-se, no entanto, que estejarelacionado com factores mecânicos e/ou vasculares.

Os processos biológicos e as várias fases fisiológicasdo processo de cicatrização óssea por 2ª intençãoforam estudados por numerosos autores, de entre eles:McKibbin (1978, 1989a, 1989b), Perren (1979),Pauwels (1980), Frost (1983, 1989a, 1989b), Mayer eWolf (1983), Ashhurst (1986), Reddi et al. (1987),Owen e Friedenstein (1988), Aro et al. (1990) eEinhorn (1991, 1998), tendo sido subdivididos segundouma sequência temporal e/ou eventos com localiza-ções específicas ao nível do foco de fractura em seisfases: impacção, indução, inflamação, formação docalo ósseo mole, formação do calo ósseo duro eremodelação (McKibbin, 1978; Heppenstall, 1980).Estas fases ocorrem sucessivamente encontrando-se,no entanto, interrelacionadas e temporariamentesobrepostas, podendo existir áreas no foco de fracturaque progridem mais rapidamente do que outras,sabendo-se actualmente que este processo é compostopor uma continuidade de fases interactivas de formação, reabsorção e substituição de tecidos até àreposição do tecido ósseo lamelar no foco de fractura.

Hoje sabe-se que, no caso particular do processo daregeneração óssea, desde a fase da lesão até à remode-lação final, ocorrem igualmente uma série de fenó-menos – migração, diferenciação, proliferação celulare síntese de MEC óssea, fenómenos estes controladose coordenados pela expressão de genes específicos,esta, por sua vez, induzida nomeadamente por factoresde crescimento e citocinas. Vários estudos têm com-provado a expressão espacial e temporal no caloósseo, ao longo do processo de cicatrização da fractura, de vários factores de crescimento, comosejam, o TGF-β, as proteínas morfogenéticas ósseas(BMP), o FGF, o IGF e o PDGF (Joyce et al., 1990;Andrew et al., 1993a, 1993b; Bourque et al., 1993;Sandberg et al., 1993; Nakase et al., 1994; Andrew etal., 1995; Bostrom et al., 1995; Onishi et al., 1998;Fujii et al., 1999), assim como algumas citocinas,principalmente a IL-1 e -6 (Einhorn, 1995), e proteínas

da MEC óssea, tais como, os colagénio tipos I, II, IXe X, a fostatase alcalina (ALP), a osteocalcina (OC) ea osteonectina (OCN) (Jingushi et al., 1992; Hiltunenet al., 1993; Sandberg et al., 1993; Stafford et al.,1994; Hughes et al., 1995).

O Plasma Enriquecido em Plaquetas (PRP) comomodificador biológico e as razões fundamentaispara o seu uso nos tratamentos que visam a regeneração óssea

Tendo como base os trabalhos desenvolvidos porMartas desde 1972 (Martas, 1982), Tayapongsak et al.introduziram em 1994 o conceito de adesivo autólogode fibrina (AFA). Ao adicionar o adesivo autólogo defibrina a enxertos de osso esponjoso observaram umaconsolidação óssea precoce dos enxertos, o queatribuíram às propriedades adesivas do AFA e à redede fibrina nele desenvolvida que facilitaria a osteocondução às células osteocompetentes do enxertoósseo. Para além do referido o AFA apresenta propriedades hemostáticas, é um bom substrato para amigração de MSC e fibroblastos, facilita a revascula-rização, estimula a proliferação de fibroblastos eosteoblastos e retarda a multiplicação de microrganis-mos (Tayapongsak et al., 1994). Depois dos trabalhospioneiros em cirurgia oral e maxilofacial de Whitmanet al. (1997) e de Marx et al. (1998, 2000), reconhece-seactualmente o papel central dos factores de cresci-mento encontrados no AFA no êxito clínico dos enxertos ósseos aplicados ao nível da maxila emandíbula (Miyazono et al., 1994).

Relativamente ao PRP, este consiste no sequestro econcentração de trombócitos no plasma mediante cen-trifugação por gradientes de densidade, aumentandoassim em cerca de 900% (Marx, 1999) a concentraçãodas plaquetas e dos factores de crescimento (relaçãolinear) (Landesberg et al., 2000) nelas contidos relati-vamente à contagem normal de plaquetas no sangue, oque o torna muito útil na promoção da cicatrização deferidas (Roberts e Sporn, 1993). Marx et al. (1998)demonstraram a presença de vários factores de cresci-mento no PRP, nomeadamente do PDGF, TGF-β1 e -β2 e IGF-I identificados nos grânulos a das plaquetas(Linder et al., 1979; Harrison e Cramer 1993; Reederet al., 1993; Roberts e Sporn, 1993; Miyazono et al.,1994; Greenlagh, 1996), VEGF, PDEGF, IL-1, FGF-2e PAF-4 (Jones et al., 1992; Harrison e Cramer 1993;Miyadera et al., 1995; Mohle et al., 1997).

Relativamente aos principais factores de crescimen-to concentrados no PRP refere-se que o TGF-β temcomo principais acções o efeito mitogénico sobre osfibroblastos, condroblastos e osteoblastos, a quimio-taxia, a síntese de colagénio e a indução da funçãoosteoblástica, a activação da síntese de outros factoresde crescimento e a indução da diferenciação de MSC(Bonewald, 2002). O IGF-I estimula a síntese decolagénio, a proliferação fibroblástica, a síntese de


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proteoglicanos sulfatados, a função osteoblástica,exerce efeito mitogénico sobre as células diferencia-das, incluindo os osteoblastos e inibe a colagenase(Conover e Rosen, 2002). O PDGF promove a quimio-taxia dos macrófagos e fibroblastos, a proliferação dosfibroblastos, o metabolismo do colagénio, a angiogé-nese e o efeito mitogénico sobre as MSC, fibroblastose osteoblastos (Canalis e Rydziel, 2002).

Na continuação dos seus trabalhos Marx et al.(1998) também demonstraram, aquando da utilizaçãoconjunta de PRP com enxerto de osso esponjosoautólogo, a existência de receptores celulares para osfactores de crescimento PDGF e TGF-β nas MSClocalizadas essencialmente a nível perivascularendosteal (Owen, 1985; Caplan, 1987) e para o IGF-Ilocalizados nos osteoblastos endosteais, transplantadoscom o enxerto ósseo e medula, e que constituirão osprováveis alvos de actuação do PRP, para além deestreitamente relacionados com o processo de regene-ração do tecido ósseo (Marx, 1999).

A aplicação do gel autólogo rico em plaquetas(APG) desenvolvido por Marx et al. (1998), como umsubproduto do PRP, promove uma regeneração ósseamais rápida e eficiente, pois proporciona um signi-ficativo aporte de moléculas de fibrina e fibronectina,com propriedades hemostáticas, osteoconductoras eestabilizadoras do coágulo sanguíneo, associado aofacto de possuir uma alta concentração de leucócitoscapazes de actuar como um "antibiótico autólogo",reduzindo os riscos de infecção e amplificando ainfluência dos factores de crescimento formados nasplaquetas e que são libertados aquando da sua desgranulação (Marx et al., 1998; Anitua, 1999;Anitua e Andia, 2000; Garg, 2000; Garg et al., 2000;Camargo et al., 2002). O facto do APG ser umapreparação autóloga evita o perigo de transmissão dedoenças infecto-contagiosas e de reacções imunitárias,para além de ser um produto acessível em termoseconómicos relativamente à utilização dos factores decrescimento obtidos por engenharia genética (Marx etal., 1998; Obarrio et al., 2000; Marx, 2000).

No entanto, e apesar do PRP ter vindo a ser utilizadonos últimos anos de forma isolada ou como um potencialadjunto ao autoenxerto de osso esponjoso ou a materiaissubstitutos ósseos na cirurgia reconstrutiva do tecidoósseo a nível oral e maxilofacial em Medicina Humana(Marx et al., 1998; Sanchez et al., 2003; Hanna et al.,2004; Zhang et al., 2004; Camargo et al., 2005;Sammartino et al., 2005), os estudos experimentais pré-clínicos referentes à utilização do PRP a nível oral oumaxilofacial (Fennis et al., 2002; Velich et al., 2004;Grageda et al., 2005; Swennen et al., 2005) ou do crânio(Aghaloo et al., 2002, 2004, 2005; Schlegel et al., 2003,2004; Wiltfang et al., 2004) são limitados, sendo a litera-tura científica relativa à sua aplicação na reconstrução dotecido ósseo cortical e/ou trabecular ao nível do esque-leto apendicular em modelos animais (Zhang et al.,2003; Fujimori, 2005) muito escassa.

Assim, naturalmente torna-se necessário a realizaçãode outros estudos experimentais em modelos animaisque elucidem acerca da potencial utilização do PRP aonível do tecido ósseo alveolar e cortical. Este trabalhoteve assim como objectivos o estudo e caracterizaçãodas potenciais propriedades osteoindutoras do PRPisolado num modelo experimental de defeito no tecidoósseo alveolar/periodontal no cão Beagle ou da suaassociação a um enxerto de osso esponjoso autólogonum modelo de defeito ósseo cortical de pequenasdimensões na ovelha, com recurso a análises de histologia e histomorfometria óssea.

Material e métodos

Os protocolos anestésico e cirúrgico e a manutençãodos animais foram avaliados e aprovados pelaComissão Consultiva do Bem Estar Animal e deProtecção dos Animais Utilizados Para FinsExperimentais e/ou Outros Científicos, da DirecçãoGeral de Veterinária, respeitaram a Portaria nº 1005/92 de 23 de Outubro, e os regulamentos daLegislação da Comunidade Europeia para o BemEstar e Experimentação Animal.

Modelo experimental de defeito no tecido ósseoalveolar/periodontal

Protocolos anestésico e cirúrgico. Os animais foramsujeitos a medicação pré-anestésica com acepromazina(Calmivet®, Vetóquinol), 5 mg EV. A indução daanestesia realizou-se com pentotal sódico (Pentothal®

Sódico, Abbott) a 2,5%, 20-25 mg/kg EV, e amanutenção com anestesia por inalação utilizandohalotano (Fluothane, Zeneca Produtos Biociência,Lda.) 1-1,5% veiculado numa associação de oxigénioe protóxido de azoto.

O trabalho realizou-se em cinco cães adultosmachos de raça Beagle. Em cada quadrante damandíbula foram realizados dois defeitos experimentaiscorrespondendo ao 4º pré-molar (PM4) e ao primeiromolar (M1), cada um deles com duas raízes. Nosdefeitos criados nas peças situadas no quadrantemandibular direito realizou-se o trabalho experimentalenquanto que nos defeitos criados no quadrantemandibular esquerdo se desenrolaram os trabalhoscorrespondentes ao grupo controlo.

Após a amputação da coroa (aproximadamente 2 mm acima da união cimento – esmalte) e a realizaçãodas endodôncias, elevou-se um "flap" mucoperiostealde ambos os lados vestibular e lingual desde a facemesial de PM4 até à face distal do M1. Retirou-se deseguida, com recurso a uma broca redonda em micro-motor a 430 rpm, a tábua vestibular do osso alveolarrealizando-se um defeito final de 7 mm em cada peçadentária, desde a união cimento – esmalte até ao fundodo defeito sobre as raízes mesial e distal (Figura 1).


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Após se terem criado os defeitos, aplicou-se noquadrante direito uma esponja reabsorvível decolagénio de origem equina (Emovet®) embebida emPRP, cujo protocolo de obtenção se descreve noQuadro 1. No lado contra lateral esquerdo apenas seaplicou a esponja de colagénio. Os "flaps" foram sutu-rados sem tensão, com fio reabsorvível Vicryl® 3-0,com pontos de sutura interdentais ajustando-se a suturaà zona da união cimento-esmalte, tendo o defeito permanecido assim até à eutanásia dos animais quatromeses mais tarde (Figura 2).

Os cuidados pós-operatórios incluíram a administraçãode uma associação antibiótica de amoxicilina/ácidoclavulânico (Synulox®, Pfizer), 8,75 mg/kg p.v. IM de24 em 24 horas, desde o dia anterior à intervençãocirúrgica até aos dez dias posteriores à referida cirurgia. Durante as duas semanas posteriores à cirurgiaos animais foram alimentados com ração humedecida,para minimizar a possibilidade de trauma da zonaintervencionada durante as refeições, sendo que passadoeste período se passou a fornecer uma ração normal.

Exames radiográficos. Realizaram-se radiografiasapicais com parâmetros idênticos (45 kV, 100 mA/0,05segundos, 6 mAs) num aparelho de radiologia oral(Trophy®) e um estudo radiovisiográfico após as inter-venções e antes da eutanásia.

Histologia e histomorfometria óssea. As amostrasforam fixadas numa solução de formaldeído e proces-sadas utilizando técnicas de inclusão em metacrilato(Figura 3) e seccionadas e polidas com recurso aoequipamento EXAKT "Cutting and GrindingSystem"® (EXAKT Technologies), desenvolvidos porDonath (1995), até à obtenção de uma espessuramédia de 5 µm. Realizamos dois cortes por cadadente, um por cada raiz e na porção central das mesmas. As lâminas obtidas foram coradas com a coloração de (Lévai e Laczkó, 1975) e analisadas nummicroscópio óptico Leitz® DM-RBE (Leica, Wetzlar),com objectivas de ampliação ×10, ×40, ×100 paraavaliação da regeneração do osso alveolar.

Cada lâmina, contendo uma secção de uma raiz e dotecido periodontal envolvente, foi avaliada pelomesmo avaliador num estudo cego. As análises histo-morfométricas assistidas por computador realizaram-seem imagens capturadas por vídeo câmara Olympus(modelo DP-10) a partir das imagens das secções histológicas obtidas ao microscópio. As imagensforam analisadas com o programa versão Micro Imagepara a Europa 4,0® (Olympus Optical CO) paraWindows® 95/NT/98© num computador IBM (PCcompatível). O software foi calibrado para a mediçãodos parâmetros analisados em milímetros. Asmedições realizadas para a avaliação da regeneraçãoóssea foram o comprimento (distância entre a extensãoapical do defeito e a extensão coronal da regeneraçãoóssea ao longo da raiz) e a área (medida da área emcorte seccional representada pela regeneração ósseaao longo da raiz).

Análise estatística. Os resultados quantitativos sãoapresentados na forma de médias ± desvio padrão(SD) e foram calculados por raiz, dente (duas raízespor dente) e indivíduo. A análise dos dados incluiu ocálculo das diferenças significativas entre locais come sem utilização de PRP, sendo que as diferenças entre


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Figura 1 - Aspecto final dos defeitos periodontais criados Figura 2 - Aplicação do PRP na esponja de colagénio

Figura 3 - Lâmina realizada segundo o método de Donath (1995) edepois de corada com a coloração de Lévai Laczkó

grupos foram analisadas com o teste paramétrico de t-student com n=5, visto que apesar de amostra serpequena existir normalidade dos dados. Os dadosforam analisados com o programa de software deestatística (Versão 8,2, 1989-2003, SAS Institute,Inc.®, NC, USA). As diferenças foram consideradassignificativas para uma probabilidade superior a 95%(p<0,05).

Modelo experimental de defeito ósseo de pequenasdimensões no tecido ósseo cortical

Protocolos anestésico e cirúrgico. Utilizou-se a técnica de defeito ósseo de pequenas dimensõesdescrita por Schenk e Willenegger (1977) para o estudoda formação do tecido ósseo e posteriormente utilizadapor Hallfeldt et al. (1995) e Stützle et al. (1998) paraestudos de avaliação das propriedades osteogénicas damatriz óssea desmineralizada após diferentes técnicasde esterilização e de incorporação de cerâmicas.

O protocolo anestésico foi idêntico ao anteriormentereferido. Após a indução da anestesia geral, os animaisforam posicionados em decúbito lateral esquerdo deforma a proceder-se ao acesso cirúrgico à face medial datíbia esquerda. Procedeu-se à preparação do campo cirúr-gico por meio da desinfecção e colocação dos panos decampo esterilizados. Realizou-se uma incisão cutânealongitudinal de cerca de 18 cm na face média do mem-bro posterior esquerdo para acesso à diáfise da tíbia,afastou-se anteriormente os músculos tibial cranial e ter-ceiro peroneal e posteriormente o músculo flexor lateral

dos dedos e incidiu-se longitudinalmente o periósteo quese elevou numa extensão de cerca de 12 cm. Os orifíciostranscorticais com 6 mm de diâmetro foram realizadosao nível da face antero-medial da diáfise da tíbia (Figura4), com recurso a uma broca de 6 mm da Synthes®, tendopermanecido vazios, sido preenchidos por autoenxertode osso esponjoso da epífise proximal do úmero, poruma associação (50:50) de enxerto de osso esponjosoautólogo e PRP ou apenas por PRP (Quadro 1). O periósteo que cobria a zona do defeito ósseo e em cercade 2 mm ao seu redor foi removido. O endósteo foi igual-mente removido ao redor da zona interna do defeitoósseo por curetagem, assim como a medula óssea visível,e após a realização do defeito ósseo. A ferida cirúrgica foisuturada, fáscias musculares e tecido subcutâneo comum fio de sutura reabsorvível e a pele com seda.


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Quadro 1 - Técnica de obtenção do plasma enriquecido em plaquetas e da associação deste ao enxerto de osso esponjoso autólogopara aplicação cirúrgica (Marx et al., 1998)

Protocolo de obtenção do plasma rico em plaquetas

1. Obtenção de 5 ml de sangue venoso da veia jugular em tubos de colheita de amostras sanguínea com 1 ml de

fosfato citrato dextrose sódio (anticoagulante).

2. Centrifugação da amostra sanguínea (5600 rpm, 10 minutos).

3. Separação, segundo os diferentes gradientes de densidade, da série vermelha, que se deposita no fundo do tubo, e

do plasma que corresponde ao sobrenadante. Este, por sua vez, pode subdividir-se no plasma rico em plaquetas

(PRP) e no plasma pobre em plaquetas (PPP), sendo que o PRP representa a fracção mais próxima da série

vermelha.

4. Pipetagem dos 2 ml mais superficiais de sobrenadante, correspondentes ao PPP, que se desprezam.

5. Segunda centrifugação da amostra sanguínea (2400 rpm, 15 minutos).

6. Obtenção de 1 a 2 ml de PRP juntamente com a zona mais superficial da série vermelha pois as plaquetas de

síntese mais recente e de maior actividade possuem maiores dimensões e misturam-se com o 1 mm3 mais

superficial da camada dos eritrócitos, pelo que se devem incluir juntamente com a camada de PRP, e sendo que

este facto confere à referida camada uma tonalidade avermelhada (Reeder et al., 1993).

Protocolo de associação do PRP ao enxerto de osso esponjoso autólogo para aplicação cirúrgica

1. Mistura de 10 ml de cloreto de cálcio a 10% com 10.000 unidades de trombina tópica de origem bovina (Gen Trac®,

BioPharma) necessários para o início do processo de coagulação (desgranulação das plaquetas).

2. Associação de 2 ml de PRP com 0,5 ml da mistura de cloreto de cálcio/trombina e 0,5 ml de ar, actuando as bolhas

como meio de mistura, numa seringa de 10 ml.

3. Agitar a seringa durante 6 a 10 segundos para se iniciar o processo de coagulação.

4. O PRP, agora sob a forma de um gel, pode ser utilizado em cirurgia podendo-se moldar com a forma necessária à sua

aplicação cirúrgica.

Figura 4 - Realização de orifício transcortical

Realizaram-se trinta e dois orifícios transcorticaisao nível da face antero-medial da tíbia em oito ovelhas, com idades compreendidas entre os 2 e os 6anos e um peso médio de 45 kg, subdivididas em qua-tro grupos experimentais (n=8): o grupo controlo(grupo 1) em que o defeito ósseo permaneceu vazio eos grupos em que os defeitos ósseos foram preenchidoscom autoenxerto de osso esponjoso (grupo 2), ospreenchidos por uma associação de enxerto de ossoesponjoso autólogo e PRP (grupo 3) e os preenchidosapenas com PRP (grupo 4). Por sua vez, cada grupofoi subdividido em dois períodos pós-operatórios – 3ªe 6ª semanas, pelo que para cada tratamento e períodopós-operatório se obtiveram quatro defeitos ósseos.

Procedeu-se a analgesia pós-operatória pela admi-nistração de flunixina meglumina (Finadyne P.A.®,Schering-Plough II), 1 mg/kg IM de 24 em 24 horas,durante as primeiras 48 horas, a antibioterapia comamoxicilina (Clamoxyl® LA, Pfizer), 15 mg/kg p.v. IMde 48 em 48 horas, e à renovação, todas as 48 horas,dos pensos compressivos e de protecção da suturacutânea durante os primeiros 8 dias de pós-operatório.Os pontos da sutura cutânea foram retirados por voltado 10º dia pós-operatório.

Histologia e histomorfometria óssea. As peças ósseas,contendo a área do defeito ósseo, foram fixadas numasolução de formaldeído, sujeitas a processo de inclusãoem metilmetacrilato (Difford, 1974; Page et al., 1996),seccionadas ao longo do eixo longitudinal da tíbia e polidas até à obtenção de secções com uma espessuramédia de 25 µm com o equipamento EXAKT acimareferido, tendo-se reali-zado duas secções por cada umadas peças ósseas. No que se refere aos métodos de colo-ração, por cada peça óssea submeteu-se uma secção acoloração pelo método do Azul de Toluidina (Schenk etal., 1984) e outra pelo método do Tricrómico de Goldner(Goldner, 1937; Page et al., 1996; Stevens e Wilson,

1996). A avaliação histológica foi realizada com objec-tivas de ampliação ×2, ×4, ×10, ×20 e ×40.

A análise histomorfométrica foi realizada pelaquantificação do volume ósseo à 3ª e 6ª semanas doperíodo pós-operatório nos grupos 1 a 4, com objectivade ampliação ×4, por técnica de leitura manual eautomática com recurso ao programa de software deanálise de imagem SigmaScan® (SPSS Science). Ovolume ósseo corresponde à área trabecular/área totalmedida, em que a área corresponde a X*D2

(X=número de impactos da quadrícula sobre as trabéculas ósseas, D=medida do lado da quadrículaem micrómetros) (Kimmel e Jee, 1983; Parfitt, 1983;Parfitt et al., 1987).

Análise estatística. Todos os dados são apresentadosna forma de média ± SD. Procedeu-se a análise de variância para o estudo da influência do tratamento edo tempo na variação do volume ósseo à 3ª e 6ª semanas do período pós-operatório entre os diferentestratamentos. A análise estatística foi realizada peloprograma de software de estatística JMP (JMP Versão 5,1989-2003, SAS Institute, Inc.®, NC, USA). As diferenças foram consideradas significativas para umaprobabilidade superior a 95% (p<0,05).

Resultados

Modelo experimental de defeito no tecido ósseoalveolar/periodontal

Exames radiográficos. Nesta experiência a regenera-ção óssea foi mais evidente nas amostras em que seaplicou o PRP relativamente às do grupo controlo(Figuras 5 e 6), facto comprovado também pela correspondente representação da percentagem deregene-ração do tecido ósseo alveolar (Gráficos 1 e 2)e pelas imagens histológicas (Figuras 7 e 8).


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Figura 5 - Regeneração óssea no quadrantecontrolo

Gráfico 1 - Neoformação de tecidoósseo no grupo controlo

Gráfico 2 - Neoformação de tecidoósseo no grupo experimental

Figura 6 - Regeneração óssea no quadrantecom PRP

Figura 8 - Crescimento expressivo do ossono grupo experimental (Lévai Laczkó, 4×)

Figura 7 - Crescimento limitado do ossono grupo controlo (Lévai Laczkó, 4×)

Análise histológica. Nas análises histológica dasamostras em que se juntou o PRP, o tecido conjuntivoque rodeou a porção mais coronal do tecido ósseo neoformado apresentou uma frente celular de grandedensidade com a presença de numerosos vasos sanguíneos, células mesenquimatosas indiferenciadase células de tipo blástico delineando as margens dastrabéculas, existindo também nas margens do endósteo,indiciando síntese activa de osteóide (Figuras 9 e 10). Nos canais de Havers foi possível observar pequenoscapilares, células mesenquimatosas, células blásticas eosteóide não completamente mineralizado (Figuras 11à 13). Também se pôde observar tecido ósseo neofor-mado nas superfícies periosteais do tecido ósseo original, este último mais maduro e delineado porcélulas de tipo blástico em continuidade.

Na análise histológica das amostras do grupo controlo, o periodonto apresentava características típicas de um processo normal de reparação. Em geralas amostras controlo demonstravam uma sequênciasemelhante de regeneração do tecido ósseo alveolarapesar de mais atrasado no tempo. Observou-se um

extenso epitélio de união adjacente à superfície radicu-lar e sobre o tecido conjuntivo, tendo havido menornúmero de osteoblastos, assim como da quantidade deosso regenerado.


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Figura 9 - Frente celular rica em células mesenquimatosas indiferen-ciadas, células blásticas e neovascularização na porção coronal dacrista óssea (Lévai Laczkó)

Figura 10 - Osso delineado por um envólucro de osteoblastos.Observa-se também a formação de fibras de Sharpey na sua união aoosso (Lévai Laczkó)

Figura 11 - Deposição de células blásticas (osteoblastos) no interior deum canal de Havers (Lévai Laczkó)

Figura 12 - Observar-se a presença de osteoblastos no interior de umcanal de Havers e a síntese de osteóide não completamente mineraliza-do (Lévai Laczkó)

Figura 13 - Aspecto interior de um canal de Havers delineado porendotélio, células blásticas, células mesenquimatosas indiferenciadas eosteóide (Lévai Laczkó)


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Figura 14 - Fotografia histológica de grupo controlo à 6ª semana pós-operatória evidenciando a neoformação de tecido ósseo a partir dolocal receptor (Tricrómico de Goldner, ×70)

Figura 15 - Fotografia histológica de grupo que recebeu PRP à 6ªsemana do período pós-operatório (Tricrómico de Goldner, ×70)

Análise de histomorfometria óssea. A regeneraçãoóssea (comprimento) foi de 2,4±0,7 mm no grupocontrolo e de 3,1±0,7 mm no grupo onde se juntou oPRP. Observaram-se, assim, diferenças significativas(p=0,04) entre os dois grupos, correspondendo aaproximadamente 36% no grupo controlo e 48% nogrupo experimental relativamente à totalidade dodefeito ósseo em causa.

A área de regeneração óssea foi de 1,5±1,0 mm2 nogrupo controlo e de 3,4±1,0 mm2 no grupo onde seaplicou o PRP, tendo-se observando-se diferenças significativas (p=0,01) entre os dois grupos.

Modelo experimental de defeito ósseo de pequenasdimensões no tecido ósseo cortical

Análise histológica. Todos os grupos demonstraramum aumento da formação de tecido ósseo ao longo dotempo, sendo que a maior formação se observou nosgrupos que receberam o autoenxerto de osso espon-joso isolado (grupo 2) ou a sua associação ao PRP(grupo 3) relativamente ao grupo controlo (grupo 1)ou ao que recebeu apenas o PRP (grupo 4).

No grupo 1 controlo, a neoformação de tecido ósseooriginou-se a partir das margens dos defeitos não seobservando, no entanto, o total preenchimento dodefeito ósseo à 6ª semana do período pós-operatório(Figura 14). O aspecto observado no grupo 4, quehavia recebido o PRP isolado, foi semelhante ao dogrupo 1 (Figura 15).

Nos grupos 2 e 3, em que se aplicou o autoenxertode osso esponjoso isolado ou associado ao PRP, e à 3ªsemana, não se verificou a presença de zonas dehematoma, absorvido provavelmente ao longo das 1ª e 2ª semanas durante a fase de revascularização doenxerto. Em alguns casos observou-se a ocorrência deneoformação de tecido fibroso promovendo a uniãoentre o enxerto e as margens do defeito ósseo. Às 3ª e6ª semanas observou-se uma extensa neoformação dotecido ósseo sobre a maioria das trabéculas ósseas portodo o enxerto, em simultâneo com uma actividade dereabsorção osteoclástica e remodelação simultânea doenxerto com a deposição de tecido ósseo lamelar aonível dos núcleos das trabéculas em necrose (Figuras16 à 21). À 6ª semana, igualmente nos grupos 2 e 3,verificou-se a ocorrência da cicatrização do tecidoósseo ao nível do defeito ósseo pela incorporação doenxerto e pela neoformação de tecido ósseo mediadapelo próprio enxerto, verificando-se a ocorrência nagrande maioria das situações de uma união entre olocal receptor e o enxerto através de tecido ósseo(Figura 22).

Análise de histomorfometria óssea. No que se refereà avaliação histomorfométrica, o Quadro 2 apresentaos valores comprovativos da progressão do volumeósseo em função do tempo para os vários grupos emestudo. A análise de variância do volume ósseo

demonstra que este foi significativamente afectadapelo tratamento (p<0,0001) e pelo tempo (p<0,0001).No que se refere aos contrastes entre grupos e temposverificou-se que nos grupos 2 e 3, às 3ª e 6ª semanas,houveram aumentos significativos (p<0,0001) do volume ósseo relativamente aos grupos 1 e 4. De notarque o grupo 4, em que se utilizou o PRP isolado,demonstrou uma tendência para apresentar menor formação de tecido ósseo relativamente ao grupo 1,

Figura 16 - Fotografia microscópica do grupo que havia recebido enx-erto de osso esponjoso autólogo à 3ª semana pós-operatória onde sepode observar a deposição de osteóide sobre as trabéculas ósseas enx-ertadas (Tricrómico de Goldner, ×35)


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Figura 17 - Pormenor da Figura 16 onde se pode observar a presençade vasos sanguíneos entre as trabéculas enxertadas (Tricrómico deGoldner, ×375)

Figura 18 - Pormenor da Figura 16 evidenciando o osteóide localizadoentre as trabéculas ósseas enxertadas e a camada de osteoblastosresponsáveis pela sua síntese (Tricrómico de Goldner, ×375)

Figura 19 - Fotografia histológica de grupo que havia recebido enxer-to de osso esponjoso autólogo à 3ª semana pós-operatória evidenciandotrabéculas ósseas transplantadas rodeadas por osteoblastos activos(Azul de Toluidina, ×375)

Figura 20 - Fotografia histológica de grupo que havia recebido enxer-to de osso esponjoso autólogo à 6ª semana pós-operatória onde seobserva a presença de trabéculas ósseas transplantadas em processo dereabsorção, concomitante a neoformação de tecido ósseo sobre as mes-mas trabéculas (Azul de Toluidina, ×70)

Figura 21 - Pormenor da Figura 20 evidenciando a deposição de tecidoósseo recém formado sobre as trabéculas ósseas enxertadas (Azul deToluidina, ×180)

Figura 22 - Fotografia histológica de grupo que havia recebido enxer-to de osso esponjoso autólogo à 6ª semana pós-operatória evidenciandoa incorporação do enxerto ósseo e o início da união entre este e o localreceptor e simultaneamente a sua conversão em tecido ósseo lamelar(Azul de Toluidina, ×70)

controlo, em ambos os tempos em estudo, apesar deesta diferença não ter sido estatisticamente significativaquando comparada com o grupo controlo (p>0,05).No grupo 3, em que se utilizou a associação deautoenxerto de osso esponjoso ao PRP, verificou-seuma ligeira tendência de aumento do volume ósseo à6ª semana quando comparado com o grupo 2, em quese aplicou apenas o enxerto ósseo, apesar de estadiferença também não ter sido significativa (p>0,05).

Discussão

O PRP tem sido utilizado em cirurgia oral e maxilo-facial com vista à obtenção da regeneração do tecidoósseo com maior rapidez e qualidade, uma vez que osfactores de crescimento nele contidos exercemfunções de indução e/ou aceleração da cicatrizaçãodas lesões dos tecidos moles e duros (Okuda et al.,2003). Tal como anteriormente referido, as plaquetascontêm reservas fisiológicas de factores de cresci-mento angiogénicos e mitogénicos nos seus grânulos a(Banks et al., 1998; Maloney et al., 1998), com possi-bilidade de libertação quando activadas, segregadasou agregadas pelo colagénio ou adrenalina (Banks etal., 1998). Entre eles referem-se o VEGF, com propriedades de estimulação de crescimento doendotélio vascular, o TGF-β1 e -β2 capazes de promover a diminuição da reabsorção óssea e da formação e actividade dos osteoclastos, assim comoestimularem a maturação do colagénio nas feridas(Bonewald e Mundy, 1990; Steenfos, 1994; Banks etal., 1998). Ao referido, acresce o facto de, por acçãodo PDGF, poderem aumentar o número das célulasenvolvidas na cicatrização de feridas e recrutar outrosfactores de crescimento angiogénicos para o local dalesão (Steenfos, 1994) existindo, assim, a possibili-dade de que o aumento da concentração das plaquetasno local da lesão aumente e melhore a cicatrização dostecidos em causa.

As diversas vantagens da utilização clínica do PRPbaseiam-se no facto de constituir uma técnica simples,rápida e económica, com recurso a um separador decélulas que promove a sua repartição segundo o seugradiente de densidade, quando são necessáriosgrandes volumes de PRP, ou apenas a uma centrífuga,quando são necessários reduzidos volumes de PRP. Aobtenção do PRP pode realizar-se em simultâneo coma obtenção do enxerto de osso esponjoso autólogo ou

com outro procedimento cirúrgico necessário,reduzindo-se a quantidade de enxerto necessária aopreenchimento de determinado defeito ósseo e incre-mentando a regeneração do tecido ósseo a esse nível.O facto do PRP constituir uma preparação autóloga,realizada no momento da intervenção cirúrgica, eliminapreocupações referentes à transmissão de possíveisdoenças infecto-contagiosas e de reacções imunológicase possibilita a recuperação dos eritrócitos e do plasmapobre em plaquetas (PPP), após a obtenção do PRP,que podem ser administrados ao doente a partir dossacos de recolha sanguínea através de acesso a umaveia central ou periférica.

No que se refere ao estudo da utilização do PRPassociado a uma esponja de colagénio no modeloexperimental ao nível do tecido ósseo alveolar no cãoBeagle este fundamentou-se na teoria da indução bio-química da regeneração periodontal sugerida porTerranova e Wikesjö (1987) que se baseia na hipótesede que pela estimulação de células competentes nostecidos viáveis que rodeiam a lesão com modifi-cadores da resposta biológica, como os factores decrescimento de origem polipeptídica, podemos induziras células apropriadas a migrar para a lesão, a suamultiplicação e diferenciação e a síntese de MEC, desencadeando a complexa sequência de aconteci-mentos que conduzem à regeneração do tecido ósseo.

Até hoje desenvolveram-se vários estudos pré-clínicoscom o objectivo de avaliar a acção dos factores decrescimento na regeneração do periodonto. Apesar denão existir nenhum trabalho que utilize apenas PRP edas diferenças nas metodologias utilizadas pelosautores, iremos tentar comparar os nossos resultadoscom os resultados obtidos noutros trabalhos.

Devido à natureza complexa dos tecidos conjuntivosenvolvidos no processo regenerativo é pouco provávelque um factor de crescimento isolado seja suficientepara obter a regeneração do periodonto (Terranova eWikesjö, 1987). Tatakis et al. (2000) referiram que otratamento de defeitos periodontais apenas com oTGF-β1 não tem utilidade prática, pois não conduziuà regeneração do tecido ósseo nem do cimento.

No entanto muitos estudos realizados in vitro e invivo demonstraram a capacidade individual e em asso-ciação de vários factores de crescimento na induçãoda regeneração do tecido ósseo. Estudos in vitroutilizando factores de crescimento como o PDGF(Canalis et al., 1988b; Piché e Graves, 1989; Hugheset al., 1992; Hock e Canalis, 1994; Strayhorn et al.,


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Quadro 2 - Avaliação histomorfométrica da neoformação de tecido ósseo nos vários grupos em estudo

Volume ósseo (%)

Tratamento Grupo nº 3ª semana 6ª semana

Controlo 1 28,2±6,1 43,2±3,5

Autoenxerto osso esponjoso 2 59,5±8,5 80,0±4,4

Osso esponjoso autólogo + PRP 3 53,7±6,1 82,5±2,9

PRP 4 26,5±5,2 41,2±4,3

1999) ou IGF-I (Hock et al., 1988) em osteoblastos,TGF-β em células progenitoras dos osteoblastos(Rosen, 1994; McCauley et al., 1995; Strayhorn et al.,1999), IGF-I em células progenitoras dos osteoclastos(Panagakos, 1993) e em osteoclastos (Mochizuki etal., 1992), BMP-2 em combinação com PDGF, IGF-Ie TGF-β na abóbada craniana do rato (Pfeilschifter etal., 1990) ou IGF-I, EGF, PDGF e TGF-β em célulasprogenitoras dos osteoblastos (Piché e Graves, 1989)promoveram a regeneração do osso alveolar.

Estudos pré-clínicos em que se promoveu um aportede factores de crescimento de modo isolado como sejao rhBMP-2 no cão (Sigurdsson et al., 1995; Wikesjöet al., 1999), FGF-2 no cão (Murakami et al., 1999) eem macaco (Takayama et al., 2001), PDGF em macaco(Giannobile et al., 1994) ou TGF-b1 em ovelhas(Mohammed et al., 1998), ou de uma combinação defactores de crescimento, como seja, de PDGF-BB eIGF-I em estudos experimentais no cão (Lynch et al.,1989, 1991a, 1991b), em macaco (Rutherford et al.,1992a; Giannobile et al., 1994, 1996) ou no Homem(Howell et al., 1997) demonstraram a regeneraçãoperiodontal. Nestes últimos estudos provou-se a sinergiaentre o PDGF e o IGF na indução da proliferação decélulas ósseas, na deposição de MEC óssea ecolagénica e na aderência conjuntiva por proliferaçãode fibroblastos do ligamento periodontal em comparaçãocom o obtido na sua utilização individual.

Na nossa experiência a aplicação cirúrgica de PRPnuma esponja de colagénio resulta em evidência radiográfica, histológica e histomorfométrica daexistência de uma aceleração da regeneração óssea nogrupo experimental em que se utilizou o PRP relativa-mente ao grupo controlo. No que respeita ao cresci-mento do osso obtivemos valores superiores no ladoem que aplicou o PRP, com diferenças significativas(p=0,04) entre os dois grupos, o que correspondeu aaproximadamente 48% de regeneração no grupo emque se aplicou o PRP e 36% no grupo controlo empercentagem do defeito induzido. A mesma tendênciasegue-se no caso da área de tecido ósseo regeneradacom diferenças muito significativas entre os dois gruposem estudo (p=0,01).

Lynch et al. (1989) foram os primeiros a demonstrara regeneração periodontal, em termos de tecido ósseoe cimento, utilizando uma combinação de PDGF-BB eIGF-I em dentes de cão Beagle afectados por perio-dontite. Os nossos resultados histológicos vão de acordoaos encontrados com este estudo, onde podemosobservar uma camada contínua de osteoblastos delineando o tecido ósseo neoformado e uma densafrente celular na porção mais coronal da crista ósseaquando se adiciona PRP ao defeito. Lynch et al.(1991b), num modelo de periodontite de surgimentonatural em cão Beagle, demonstraram uma breveexposição dos tecidos periodontais a uma combinaçãode rhPDGF-B e IGF-I, num veículo de gel de carboxi-metilcelulose, exercia um efeito terapêutico prolongado

constituindo um estímulo inicial ao processo da cica-trização das feridas conducentes à sua regeneração.Lynch et al. (1991a) e Becker et al. (1992) referiram aindução da regeneração óssea pela combinação dePDGF-BB e IGF-I ao redor de implantes de titânio enos alvéolos que permanecem após extracção dentária.Rutherford et al. (1992a) alcançam regeneração perio-dontal com a combinação PDGF-BB e IGF-I nummodelo de periodontite induzida com ligaduras elásticasem macaco. Giannobile et al. (1996) estudaram osefeitos regeneradores da combinação de IGF-I ePDGF-BB no macaco (Macaca fascicularis) comresultados positivos às doze semanas com 42,5% deregeneração óssea contra os 48% obtidos na nossaexperiência às dezasseis semanas do defeito induzido.Selvig et al. (1994) estudaram no cão a aplicação deuma combinação de IGF-II, FGF-2 e TGF-β1 com oobjectivo de obter regeneração periodontal, mas semresultados positivos.

Howell et al. (1995) avaliaram pela primeira vez noHomem com êxito os efeitos de uma combinação dePDGF-BB e IGF-I num veículo de metilcelulose. Doisanos depois, Howell et al. (1997) avaliaram os efeitosde uma combinação rhPDGF-BB e rhIGF-I noHomem com resultados prometedores na promoção daregeneração do tecido ósseo e do cimento.

Sigurdsson et al. (1995) verificaram que com a utilização de rhBMP-2, aplicado em partículas sintéticasabsorvíveis se promoveu um aumento significativo dadeposição de tecido ósseo e cimento no cão, mas comevidência de fenómenos de anquilose das raízes. Choiet al. (2002), num estudo com rhBMP-2 em esponjaabsorvível de colagénio, obtiveram regeneração dotecido ósseo em 65% do defeito induzido às oito semanas e de 68% às vinte e quatro semanas. Tambémse desenvolveram estudos com BMP em osteointe-gração de implantes como os levados a cabo porRutherford et al. (1992b), nos quais se utilizou OP-1em humanos e o de Wang et al. (1993), com BMP deorigem bovina no cão, e nos quais se obtiveram incre-mentos na deposição de tecido ósseo. Wikesjö et al.(1999) obtiveram num modelo de defeito ósseo periodontal no cão, com a utilização de rhBMP-2,incremento na regeneração do tecido ósseo alveolar eaderência do periodonto.

A realização de um estudo sobre a utilização de PRPisolado ou em associação com um enxerto de ossoesponjoso autólogo, num modelo de defeito ósseo depequenas dimensões ao nível do tecido ósseo corticalna ovelha, fundamentou-se no facto de existireminúmeros estudos experimentais em modelos animaispublicados comprovando a acção dos factores decrescimento no processo de regeneração óssea emossos longos (compilados e revistos por Bonewald,2002; Canalis e Rydziel, 2002; Conover e Rosen,2002; Hurley et al., 2002; Rosen e Wozney, 2002).

Pela ausência de estudos experimentais com a utilização da associação de autoenxerto de osso


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esponjoso ao PRP ao nível do tecido ósseo cortical,em ossos longos com ossificação endocondral,realizaremos a comparação dos resultados obtidos nonosso estudo com trabalhos em que se utilizou estaassociação ao nível de tecido ósseo dos ossos planosdo crânio ou mandíbula, de ossificação intramembranosa.

Na análise histológica dos defeitos em que se utili-zou o enxerto ósseo isolado ou associado ao PRPpode-se observar o padrão cíclico de reabsorção,revascularização e subsequente formação de tecidoósseo que está descrita para a caracterização da incor-poração do enxerto de osso esponjoso (Hanson eMarkel, 1992). Esta é frequentemente definida como"creeping substitution" – processo regenerativo dereconstrução dinâmica após o transplante de tecidoósseo, em que o tecido viável com origem no localreceptor substitui a estrutura de tecido transplantadoem necrose (Burchardt, 1987) – apesar da incorpo-ração do enxerto de osso esponjoso não corresponderao processo clássico de "creeping substitution", asso-ciado à utilização de aloenxertos corticais, pelo factode com o enxerto de osso esponjoso a neoformação detecido ósseo ocorrer directamente sobre as trabéculasósseas em necrose, com a subsequente reabsorçãodestas após a deposição de tecido ósseo recém formado(Albrektsson, 1980).

A análise histomorfométrica demonstrou a existênciade um aumento significativo no volume ósseo às 3ª e6ª semanas no grupo onde se havia aplicado o enxertoósseo isolado, e no grupo em que se utilizou a associa-ção do enxerto ósseo ao PRP, relativamente ao grupocontrolo e ao grupo em que se aplicou apenas o PRP.Ocorreu uma tendência para uma menor formação detecido ósseo no grupo que recebeu apenas o PRP relativamente ao grupo controlo e um leve aumento dovolume ósseo à 6ª semana no grupo que recebeu oenxerto ósseo associado ao PRP relativamente aogrupo do enxerto ósseo isolado, no entanto, não signi-ficativo estatisticamente. Este último facto não coin-cide com os resultados obtidos no estudo clínico deMarx et al. (1998) que demonstraram um aumento daárea e densidade de tecido ósseo trabecular quando seutilizou a associação de autoenxerto de osso espon-joso ao PRP (74,0±11,0%, p=0,005) e relativamenteao recurso ao enxerto ósseo isolado (55,1±8,0%,p=0,005). No entanto, de referir que este estudo foirealizado no Homem em defeitos ósseos de descon-tinuidade da mandíbula e, por conseguinte, em tecidoósseo com origem embrionária distinta dos ossos doesqueleto apendicular e formado por processo de ossi-ficação intramembranosa, também ele diferente doprocesso de ossificação endocondral pelo qual se formam os ossos do esqueleto apendicular. De referirque, no geral, os resultados obtidos estão de acordocom os apresentados no estudo pré-clínico de Aghalooet al. (2002) realizado no crânio do coelho, tanto noque concerne à maior neoformação de tecido ósseonos grupos em que se aplicou o enxerto ósseo isolado

ou associado ao PRP relativamente aos grupos controloe em que se aplicou apenas o PRP, como na ligeiratendência para uma maior formação de tecido ósseono grupo que recebeu a associação de enxerto ósseo ePRP no final do período pós-operatório de 4 mesespermitido neste estudo.

Uma possível explicação para que o volume ósseono grupo em que se aplicou apenas o PRP, às 3ª e 6ªsemanas do período pós-operatório, ter sido idênticoao do grupo controlo no estudo experimental ao níveldo tecido ósseo cortical poderá ser justificado pelofacto dos principais factores de crescimento presentesno PRP actuarem essencialmente nos receptores dasMSC presentes na medula óssea e nos pré-osteoblastose osteoblastos existentes no tecido ósseo trabecular, econsequentemente também no enxerto de osso espon-joso mas não, ou em percentagem muito inferior, apenas no local receptor do tecido ósseo cortical.

Apesar de não se ter verificado a existência de diferenças significativas entre o grupo em que se utilizou a associação do enxerto ósseo ao PRP e ogrupo em que se aplicou o enxerto ósseo isolado, onúmero de defeitos ósseos de pequenas dimensões aonível do tecido ósseo cortical realizados para cadatratamento e tempo pós-operatório foi pequeno, o quepode ter contribuído para a falta de significado estatís-tico nas diferenças observadas entre os vários gruposem estudo. Outro aspecto que pode ter influenciado osresultados obtidos é o facto de grande parte dos fenó-menos da cicatrização óssea ocorrerem nas fases iniciais, após a indução da lesão no tecido ósseo, peloque possíveis diferenças significativas entre os gruposem estudo podem ter ocorrido antes da 3ª semana pelaacção dos factores de crescimento veiculados peloPRP.

Em conclusão:

1. No modelo de defeito do tecido ósseo alveo-lar/periodontal verificou-se que o comprimento e áreaóssea foram significativamente afectadas, com valoressuperiores no lado em que aplicou o PRP relativa-mente ao controlo, o que ratifica que o PRP apresentaum forte potencial na estimulação da rege-neração dotecido ósseo alveolar.

2. Apesar de se ter verificado que a associação deenxerto de osso esponjoso autólogo ao PRP (50:50)não promovia um efeito osteogénico superior à da uti-lização isolada do autoenxerto de osso esponjoso emdefeitos não críticos a nível de tecido ósseo corticalconclui-se que esta associação induzia uma formaçãode tecido ósseo equivalente à obtida pela aplicaçãoisolada do enxerto, permitindo assim a redução daquantidade necessária do referido enxerto ósseo o quediminui a morbalidade ao nível do seu local deobtenção.


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Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelo programaPRODEP III (Concurso n.º 4/5.3/PRODEP/2000),pela Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro epelo Laboratório de Medicina Nuclear, Unidade deEstudo do Metabolismo Ósseo e Instituto de PatologiaExperimental da Faculdade de Medicina daUniversidade de Coimbra.

Bibliografia

Aghaloo TL, Moy PK, Freymiller EG (2002). Investigation of platelet-rich plasma in rabbit cranial defects: A pilot study. J Oral Maxil Surg, 60, 1176-1181.

Aghaloo TL, Moy PK, Freymiller EG (2004). Evaluation of platelet-rich plasma in combination with anorganic bovine bone in the rabbit cranium: a pilot study. Int J Oral Maxillofac Implants, 19, 59-65.

Aghaloo TL, Moy PK, Freymiller EG (2005). Evaluation of platelet-rich plasma in combination with freeze-dried bone in rabbit cranium. Clin Oral Implants Res, 16, 250-257.

Albrektsson T (1980). Repair of bone grafts: A vital micro-scopic and histological investigation in the rabbit. Scand J Plast Reconstr Surg Hand Surg, 14, 1-12.

Andrew JG, Hoyland J, Andrew SM, Freemont AJ, Marsh D (1993a). Demonstration of TGF-beta 1 mRNA by in situ hibridization in normal human fracture healing. Calcif Tissue Int, 52, 74-78.

Andrew JG, Hoyland JA, Freemont AJ, Marsh DR (1993b). Insulin-like growth factor gene expression in human fracture callus. Calcif Tissue Int, 53, 97-102.

Andrew JG, Hoyland JA, Freemont AJ, Marsh DR (1995). Platelet-derived growth factor expression in normally healing human fractures. Bone, 16, 455-460.

Anitua E (1999). Plasma rich in growth factors: preliminary results of use in the preparation of future sites for implants. Int J Oral Maxillofac Implants, 14, 529-535.

Anitua EA, Andia IO (2000). Un nuevo enfoque en la regene--ração ósea. Plasma rico en factores de crecimiento (P.R.G.F). Puesta al Día Publicaciones, S.L. (Vitória).

Aro HT, Wippermann BW, Hodgson SF, Chao EY (1990). Internal remodeling of periosteal new bone during frac-ture healing. J Orthop Res, 8, 238-246.

Ashhurst DE (1986). The influence of mechanical cond-tions on the healing of experimental fractures in the rabbit: A microscopical study. Phil. Trans. R. Soc. Lond., 313, 271-302.

Assoian RK, Grotendorst GR, Miller DM, Sporn MB (1984). Cellular transformation by coordinated action of three peptide growth factors from human platelets. Nature, 309, 804-806.

Aukhil I (2000). Biology of wound healing. Periodontol 2000, 22, 44-50.

Bagby GW, Janes JM (1958). The effect of compression onthe rate of fracture healing using a special plate. Am J Surg, 95, 761-767.

Banks RE, Forbes MA, Kinsey SE, Stanley A, Ingham E, Walters C, Selby PJ (1998). Release of the angiogenic cytokine vascular endothelial growth factor (VEGF) from

platelets: Significance for VEGF measurements and cancer biology. Br J Cancer, 77, 956-964.

Bartold PM, McCulloch CA, Narayanan AS, Pitaru S (2000). Tissue engineering: a new paradigm for periodontalregeneration based on molecular and cell biology. Periodontol 2000, 24, 253-269.

Becker W, Lynch SE, Lekholm U, Becker BE, Caffesse R, Donath K, Sanchez R (1992). A comparison of ePTFE membranes alone or in combination with platelet-derived growth factors and insulin-like growth factor-I or demi-neralized freeze-dried bone in promoting bone formation around immediate extraction socket implants. J Periodontol, 63, 929-940.

Bessho K, Carnes DL, Cavin R, Ong JL (2002). Experimental studies on bone induction using low-molecu-lar-weight poly(lactide-co-glycolide) as a carrier for recombinant human bone morphogenetic protein-2. J Biomed Mater Res, 61, 61-65.

Bianchi J, Fiorellini JP, Howell TH, Seckler J, Curtin H, Nevins ML, Friedland B (2004). Measuring the efficacy of rhBMP-2 to regenerate bone: a radiographic study using a commercially available software program. Int J Periodontics Restorative Dent, 24, 579-587.

Boden SD, Kang J, Sandhu H, Heller JG (2002). Use of recombinant human bone morphogenetic protein-2 to achieve posterolateral lumbar spine fusion in humans: a prospective, ramdomized clinical pilot trial: 2002 Volvo Award in clinical studies. Spine, 27, 2662-2673.

Boden SD, Zdeblick TA, Sandhu HS, Heim SE (2000). The use of rhBMP-2 in interbody fusion cages. Definitive evidence of osteoinduction in humans: A preliminary report. Spine, 25, 376-381.

Bonewald LF (2002). Transforming growth factor-b. In: Principles of Bone Biology. Vol. II, 2ª edição. Editores: J.P. Bilezikian, L.G. Raisz, G.A. Rodan. Academic Press (San Diego), 903-918.

Bonewald LF, Mundy GF (1990). Role of transforming growth factor-beta in bone remodelling. Clin Orthop, 250, 261-276.

Bostrom MP, Lane JM, Berberian WS, Missri AA, Tomin E, Weiland A, Doty SB, Glaser D, Rosen VM (1995). Immunolocalization of expression of bone morphogeneticproteins 2 and 4 in fracture healing. J Orthop Res, 13, 357-367.

Bourque WT, Gross M, Hall BK (1993). Expression of four growth factors during fracture repair. Int J Dev Biol, 37, 573-579.

Boyne PJ (2001). Application of bone morphogenetic proteins in the treatment of clinical and maxillofacial osseous defects. J Bone Joint Surg Am, 83-A (Suppl), S146-S150.

Boyne PJ, Marx RE, Nevins M, Triplett G, Lazaro E, Lilly LC, Alder M, Nummikoski P (1997). A feasibility study evaluating rhBMP-2/absorbable collagen sponge for maxillary sinus floor augmentation. Int J Periodont Rest, 17, 11-25.

Bucholtz RW (2002). Nonallograft osteoconductive bone graft substitutes. Clin Orthop, 395, 44-52.

Burchardt H (1987). Biology of bone transplantation. Clin Orthop, 18, 187-196.

Burkus JK, Gornet MF, Dickman CA, Zdeblick TA (2002). Anterior lumbar interbody fusion using rhBMP-2 with tapered interbody cages. J Spinal Disord Tech, 15, 337-349.


208

Camargo PM, Lekovic V, Weinlaender M, Vasilic N, Madzarevic M, Kenney EB (2002). Platelet-rich plasma and bovine porous bone mineral combined with guided tissue regeneration in the treatment of intrabony defects in humans. J Periodontal Res, 37, 300-306.

Camargo PM, Lekovic V, Weinlaender M, Vasilic N, Madzarevic M, Kenney EB (2005). A reentry on the use of bovine porous bone mineral, GTR, and platelet-rich plasma in the regenerative treatment of intrabony defects in humans. Int. J Periodontics Restorative Dent, 25, 49-59.

Canalis E, McCarthy T, Centrella M (1988a). Growth factors and the regulation of bone remodelling. J Clin Invest, 81, 277-281.

Canalis E, Centrella M, McCarthy T (1988b). Effects of basic fibroblast growth factor on bone formation in vitro. J Clin Invest, 81, 1572-1577.

Canalis E, Rydziel S (2002). Platelet-Derived Growth Factor and the Skeleton. In: Principles of Bone Biology. Vol. II, 2ª edição. Editores: J.P. Bilezikian, LG. Raisz, G.A. Rodan. Academic Press (San Diego), 817-824.

Caplan AI (1987). Bone development and repair. Bioessays, 6, 171-175.

Choi SH, Kim CK, Cho KS, Huh JS, Sorensen RG, Wozney JM, Wikesjo UM (2002). Effect of recombinant human bone morphogenetic protein-2/absorbable collagen sponge (rhBMP-2/ACS) on healing in 3-wall intrabony defects in dogs. J Periodontol, 73, 63-72.

Cochran DL, Jones AA, Lilly LC, Fiorellini JP, Howell H (2000). Evaluation of recombinant human bone morpho-genetic protein-2 in oral applications including the use of endosseous implants: 3-years results of study in humans. J Periodontol, 71, 1241-1257.

Conover CA, Rosen C (2002). The role of insulin-like growth factors and binding proteins in bone cell biology. In: Principles of Bone Biology, Vol. II, 2ª edição, Editores: J.P. Bilezikian, LG. Raisz, G.A. Rodan. Academic Press (San Diego), 801-815.

Danis R (1949). Theorie et pratique de l’osteosynthese, Masson et Cie (Paris).

Davis JC, Buckley CJ, Per-Olof BA (1988). Compromised soft tissue wounds: correction of wound hypoxia. In: Problem Wounds: The Role of Oxygen, Editores: J.C. Davis, T.K. Hunt. Elsevier (Nova Iorque), 143-152.

Difford J (1974). A simplified method for the preparation of methyl metacrylate embedding medium for undecalcified bone. Medical Laboratory Technology, 31, 79.

Donath K (1995). Preparation of histologic sections by the cutting-grinding technique for hard tissue and other materialnot suitable to be sectioned by routine methods. Equipment and methodical performance. Exakt-Kulzer-Publication.

Einhorn TA (1991). Mechanisms of fracture healing. Hosp Pract, 26, 41-45.

Einhorn TA (1995). Current concepts review: Enhancement of fracture healing. J Bone Joint Surg Am, 77A, 940-956.

Einhorn TA (1998). The cell and molecular biology of fracture healing. Clin Orthop, 355S, S7-S21.

Fennis JP, Stoelinga PJ, Jansen JA (2002). Mandibular reconstruction: a clinical and radiographic animal study on the use of autogenous scaffolds and platelet-rich plasma. Int J Maxillofac Surg, 31, 281-286.

Ferguson C, Alpern E, Miclau T, Helms JA (1999). Does

adult fracture repair recapitulate embryonic skeletal formation? Mech Develop, 87, 57-66.

Fleming JE, Cornell CN, Muschler GF (2000). Bone cells and matrices in orthopedic tissue engineering. Orthop Clin North Am, 31, 357-374.

Forell EB, Straw RC (1993). Bone morphogenetic proteins and bone derived growth factors. Vet Comp Orthop Traumatol, 6, 166.

Frost HM (1983). The regional acceleratory phenomenon: a review. Henry Ford Hosp Med J, 31, 3-9.

Frost HM (1989a). The biology of fracture healing. An overview for clinicians. Part I. Clin Orthop, 248, 283-293.

Frost HM (1989b). The biology of fracture healing. An overview for clinicians. Part II. Clin. Orthop., 248, 294-309.

Fujii H, Kitazawa R, Maeda S, Mizuno K, Kitazawa S (1999). Expression of platelet-derived growth factor proteinsand their receptor alpha and beta mRNAs during fracture healing in the normal mouse. Histochem Cell Biol, 112, 131-138.

Fujimori T (2005). The effect of platelet-rich plasma combined with autogenous bone graft for bone regeneration in bone defects. Kokubyo Gakkai Zasshi, 72, 90-97.

Garg AK (2000). The use of platelet-rich plasma to enhance the success of bone grafts around dental implants. Dental Implantology update. The International Forum for Continuing Education, 11, 17-20.

Garg AK, Gargenese D, Peace I (2000). Using platelet-rich plasma to develop an autologous membrane for growth factor delivery in dental implant therapy. Dental Implantology Update. The International Forum for Continuing Education, 11, 41-44.

Gemmell CH, Park JY (2000). Initial blood interactions with endosseous implant materials. In: Bone Engineering. Editor: J.E. Davies, Squared Incorporated (Toronto).

Giannobile WV, Finkelman RD, Lynch SE (1994). Comparison of canine and nonhuman primate animal models for periodontal regenerative therapy: Results following a single administration of PDGF/IGF-I. J Periodontol, 65, 1158-1168.

Giannobile WV, Hernandez RA, Finkelman RD, Ryan S, Kiritsy CP, D’Andrea M, Lynch SE (1996). Comparative effects of platelet-derived growth factor-BB and insulin-like growth factor-I, individually and in combination, on periodontal regeneration on Macaca fascicularis. J Periodontal Res, 31, 301-312.

Goldner J (1937). A modification of the Masson trichrome technique for routine laboratory purposes. Am J Clin Pathol, 20, 237-243.

Goldstein AS, Patil PV, Moalli MR (1999). Perspectives on tissue engineering of bone. Clin Orthop, 367S, S419-S423.

Grageda E, Lozada JL, Boyne PJ, Caplanis N, McMillan PJ (2005). Bone formation in the maxillary sinus by using platelet-rich plasma: an experimental study in sheep. J Oral Implantol, 31, 2-17.

Graves DT, Cochran DL (1990). Mesenchymal cell growth factors. Critical Reviews in Oral Biology and Medicine, 1,17-36.

Greenlagh DG (1996). The role of growth factors in wound healing. J Trauma, 41, 159-167.

Groeneveld EH, van den Bergh JP, Holzmann P, ten Bruggenkate CM, Tuinzing DB, Burger EH (1999a). Histomorphometrical analysis of bone formed in human


209

maxillary sinus floor elevations grafted with OP-1 device, demineralized bone matrix or autogenous bone: Comparison with non-grafted sites in a series of cases reports. Clin Oral Implants Res, 10, 499-509.

Groeneveld EH, van den Bergh JP, Holzmann P, ten Bruggenkate CM, Tuinzing DB, Burger EH (1999b). Histological observations of a bilateral maxillary sinus floor elevation 6 and 12 months after grafting with osteogenic protein-1 device. J Clin Periodontol, 26, 841-846.

Hallfeldt KK, Stützle H, Puhlmann M, Kessler S, Schweiberer L (1995). Sterilization of partially demine-ralized bone matrix: The effects of different sterilization techniques on osteogenetic properties. J Surg Res, 59, 614-620.

Hanna R, Trejo PM, Weltman RL (2004). Treatment of intrabony defects with bovine-derived xenograft alone and in combination with platelet-rich plasma: a randomised clinical trial. J Periodontol, 75, 1668-1677.

Hanson PD, Markel MD (1992). Bone and cartilage transplantation. Vet Comp Orthop Traumatol, 5, 163-169.

Harrison P, Cramer EM (1993). Platelet alpha granules. Blood Rev, 7, 52-62.

Heppenstall RB (1980). Fracture Treatment and Healing. WB Saunders (Filadélfia).

Hiltunen A, Aro HT, Vuorio E (1993). Regulation of extracellular matrix genes during fracture healing in mice. Clin Orthop, 297, 23-27.

Hock JM, Canalis E (1994). Platelet-derived growth factor enhances bone cell replication, but not differentiaded function of osteoblasts. Endocrinology, 134, 1423-1428.

Hock JM, Centrella M, Canalis E (1988). Insulin-like growth factor I has independent effects on bone matrix formation and cell replication. Endocrinology, 122, 254-260.

Howell TH, Fiorellini J, Jones A, Alder M, Nummikoshi P, Lazaro H, Lilly L, Cochrun D (1997). A feasibility study evaluation rhBMP-2/absorbable collagen sponge device for local alveolar ridge preservation or augmentation. Int J Periodont Rest Dent, 17, 124-139.

Howell TH, Fiorellini JP, Paquette DW (1995). Evaluation of platelet-derived growth factor BB/purified insuline-like growth factor-1 in patients with periodontal disease. J Dent Res, 74(Special issue), 253(Abstract 1039).

Howell TH, Fiorellini JP, Paquette DW, Offenbacker S, Giannobile WV, Lynch SE (1997). A phase I/II clinical trial to evaluate a combination of recombinant human-platelet-derived growth factor BB and recombinant human insulin like growth factor-I in patients with perio-dontal disease. J Periodontal Res, 68, 1186-1193.

Hughes FJ, Aubin JE, Heersche JN (1992). Differential chemotactic responses of different populations of fetal rat calvaria cells to platelet-derived growth factor and trans-forming growth factor β. J Bone Miner Res, 19, 63-74.

Hughes SS, Hicks DG, O’Keefe RJ, Hurwitz SR, Crabb ID, Krasinskas AM, Loveys L, Puzas JE, Rosier RN (1995). Shared phenotypic expression of osteoblasts and chondro-cytes in fracture callus. J. Bone Miner. Res., 10, 533-544.

Hurley MM, Marie PJ, Florkiewicz RZ (2002). Fibroblast growth factor (FGF) and FGF receptor families in bone. In: Principles of Bone Biology. Vol. II, 2ª edição. Editores: J.P. Bilezikian LG. Raisz, G.A. Rodan. Academic Press (San Diego), 825-851.

Jingushi S, Joyce ME, Bolander ME (1992). Genetic expressionof extracellular matrix proteins correlates with histologic changes during fracture repair. J Bone Miner Res, 7, 1045-1055.

Johnson EE, Urist MR, Finerman GA (1988). Repair of segmental defects of the tibia with cancellous bone grafts augmented with human bone morphogenetic protein: A preliminary report. Clin Orthop, 236, 249-257.

Jonhson EE, Urist MR, Finerman GA (1992). Resistant non-unions and partial or complete segmental defects of long bones: Treatment with implants of a composite of human bone morphogenetic protein (BMP) and autolyzed, antigen-extracted, allogeneic (AAA) bone. Clin Orthop, 227, 229-237.

Jones CL, Witte DP, Feller MJ, Fugman DA, Dom GW 2nd, Lieberman HA (1992). Response of human megakary-ocytic cell line to thrombin: Increase in intracellular free calcium and mitogen release. Biochim Biophys Acta, 1136, 272-282.

Joyce ME, Roberts AB, Sporn MB, Bolander ME (1990). Transforming growth factor beta and the initiation of chondrogenesis and osteogenesis in the rat femur. J Cell Biol, 110, 2195-2207.

Jung RE, Glauser R, Scharer P, Hammerle CH, Sailer HF, Weber FE (2003). Effect of rhBMP-2 on guided bone regeneration in humans. Clin Oral Implants Res, 14, 556-568.

Kaderly RE (1991). Primary bone healing. Semin. Vet Med Surg (Small Anim.), 6, 21-25.

Kassolis JD, Rosen PS, Reynolds MA (2000). Alveolar ridge and sinus augmentation utilizing platelet-rich plasma in combination with freeze-dried bone allograft: case series. J Periodontol, 71, 1654-1661.

Khan SN, Tomin E, Lane JM (2000). Clinical applications of bone graft substitutes. Orthop Clin North Am, 31, 389-398.

Kimmel DB, Jee WS (1983). Measurements of area, perimeter,and distance: Details of data collection in bone histomor-phometry. In: Bone Histomorphometry: Techniques and Interpretation. Editores: R.R. Recker. CRC Press, Inc. (Boca Raton), 89-108.

Kleeman TJ, Ahn UM, Talbot-Kleeman A (2001). Laparoscopic anterior lumbar interbody fusion with rhBMP-2: A prospective study of clinical and radiographicoutcomes. Spine, 26, 2751-2756.

Knighton D, Oredsson S, Banda M, Hunt TK (1984) Regulation of repair: Hypoxic control of macrophage mediated angiogenesis In: Soft and Hard Tissue Repair, Editores: T.K. Hunt, R.B. Heppenstahl, E. Pines, Praeger (Nova Iorque), 41-46.

Knighton D, Silver I, Hunt TK (1981). Regulation of wound healing angiogenesis: effect of oxygen gradients and inspired oxygen concentration. Surgery, 90, 262-270.

Landesberg R, Roy M, Glickman RS (2000). Quantification of growth factor levels using simplified method of platelet-rich plasma gel preparation. J Oral Maxil Surg, 58, 297-300.

Langer R, Vacanti JP (1993). Tissue engineering. Science, 260, 920-926.

Lanman TH, Hopkins TJ (2004a). Early findings in a pilot study of anterior cervical interbody fusion in which recombinant human bone morphogenetic protein-2 was used with poly(L-lactide-co-D,L-lactide) bioabsorbable


210

implants. Neurosurg Focus, 16, E6.Lanman TH, Hopkins TJ (2004b). Lumbar interbody fusion

after treatment with recombinant human bone morphogenetic protein-2 added to poly(L-lactide-co-D,L-lactide) bioabsorbable implants. Neurosurg Focus, 16, E9.

Lévai G, Laczkó J (1975). A simple differential staining method for semi-thin sections of ossifying cartilage and bone tissues embedded in epoxin resin. Mikroskopie, 31, 1-4.

Lind M (1998). Growth factor stimulation of bone healing: Effects on osteoblasts, osteotomies and implants fixation. Acta Orthop Scand, 69(Suppl 283), 5-37.

Linder BL, Chernoff A, Kaplan KL, Goodman DS (1979). Release of PDGF from human platelets by arachidonic acid. Proc Natl Acad Sci USA, 76, 4107-4111.

Lynch SE, Buser D, Hernandez RA, Weber HP, Stich H, Fox CH, Williams RC (1991a). Effects of the platelet-derived growth factors/insulin-like growth factor on bone regene-ration around titanium dental implants. J Periodontol, 62, 710-716.

Lynch SE, de Castilla GR, Williams RC, Kiritsy CP, Howell TH, Reddy MS, Antoniades HN (1991b). The effects of short-term application of a combination of platelet-derived and insulin-like growth factors on periodontal wound healing. J Periodontol, 62, 458-467.

Lynch SE, Williams RC, Polson AM, Howell TH, Reddy MS, Zappa UE, Antoniades HN (1989). A combination of platelet-derived growth factor and insulin-like growth factorsenhances periodontal regeneration. J Clin Periodontol, 16, 545-548.

Maloney JP, Silliman CC, Ambruso DR, Wang J, Tuder RM, Voelkel NF (1998). In vitro release of vascular endothelial growth factor during platelet aggregation. Am. J Physiol, 275, H1054-1061.

Martas H (1982). The use of fibrin glue in oral and maxilo-facial surgery. J Oral Maxil Surg, 40, 617.

Marx RE (1999). Platelet-rich plasma: A source of multiple autologous growth factors for bone grafts. In: Tissue Engineering. Applications in Maxillofacial Surgery and Periodontics. Editores: S.E. Lynch, R.J. Genco, R.E. Marx. Quintessence publishing Co, Inc. (Chicago), 71-82.

Marx RE (2000). Platelet concentrate: A strategy for accele-rating and improving bone regeneration. In: Bone Engineering. Editor: J.E. Davies, Squared Incorporated (Toronto).

Marx RE, Carlson ER, Eichstaedt RM, Schimmele SR, Strauss JE, Georgeff KR (1998). Platelet-rich plasma. Growth factor enhancement for bone grafts. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endodontics, 85, 638-646.

Marx RE, Ehler WJ, Peleg M (1996). Mandibular and facial reconstruction: rehabilitation of the head and neck cancer patient. Bone, 19(Suppl), 595-625.

Mayer G, Wolf E (1983). Animal experiments to examine the histology of fracture healing in osteosynthesis with external fixation and compression. Arch Orthop Trauma Surg, 101, 111-120.

McCauley LK, Koh AJ, Beecher CA, Cui Y, Decker JD, Franceschi RT (1995). Effects of differentiation and transforming growth factor beta1 on PTH/PTHrP receptor mRNA levels in MC3T3-E1 cells. J Bone Miner Res, 10, 1243-1255.

McCauley LK, Somerman MJ (1998). Modificadores

biológicos en la regeneração periodontal. Clínicas Odontológicas de Norte América, 2, 377-404.

McKibbin B (1978). The biology of fracture healing in long bones. J Bone Joint Surg Br, 60B, 150-162.

McKibbin B (1989a). Callus formation. In: External fixationand functional bracing. Editores: R. Coombs, S.A. Green, A. Sarmiento. Orthotext (Londres).

McKibbin B (1989b). Biological considerations in osteosynthesis. Chirurg, 115, 683-686.

Meraw SJ, Reeve CM, Lohse CM, Sioussat TM (2000). Treatament of peri-implant defects with combination growth factor cement. J Periodontol, 71, 81-83.

Miyadera KT, Sumizawa T, Haraguchi M, Yoshida H, Konstanty W, Yamada Y, Akiyama S (1995). Role of thymidine phosphorylase activity in the angiogenic effect of PDEGF/thymidine phosphorylase. Cancer Res, 55, 1687-1690.

Miyazono K, Takaku F (1989). Platelet-derived growth factors.Blood Rev, 3, 269-276.

Miyazono K, Ten Dijke P, Ichijo H, Heldin CH (1994). Receptors for transforming growth factor-β. Adv Immunol, 55, 181-220.

Mochizuki H, Hakeda Y, Wakatsuki N, Usui N, Akashi S, Sato T, Tanaka K, Kumegawa M (1992). Insulin-like growth factor-I supports formation and activation of osteoclasts. Endocrinology, 131, 1075-1080.

Mohammed S, Pack AR, Kardos TB (1998). The effect of transforming growth factor beta one (TGF-β1) on wound healing, with or without barrier membranes, in a class II furcation defect in sheep. J Periodontal Res, 33, 335-344.

Mohle R, Green D, Moore MA, Nachman RL, Rafii S (1997). Constitutive production and thrombin-induced release of VEGF by human megakaryocites and platelets. Proc Natl Acad Sci USA, 94, 663-668.

Moore WR, Graves SE, Bain GI (2001). Synthetic bone graft substitutes. ANZ J Surg, 71, 354-361.

Murakami S, Takayama S, Ikezawa K, Shimabukuro Y, Kitamura M, Nozaki T, Terashima H, Asano T, Okada H (1999). Regeneration of periodontal tisúes by basic fibroblast growth factor. J Periodontal Res, 345, 425-430.

Nakase T, Nomura S, Yoshikawa H, Hashimoto J, Hirota S, Kitamura Y, Oikawa S, Ono K, Takaoka K (1994). Transient and local expression of bone morphogenetic protein 4 messenger RNA during fracture healing. J Bone Miner Res, 9, 651-659.

Niyibizi C, Kim M (2000). Novel approaches to fracture healing. Exp Opin Invest Drugs, 9, 1573-1580.

Obarrio JJ, Araúz-Dutari JI, Chamberlain TM, Croston A (2000). The use of autologous growth factors in periodontalsurgical therapy. Platelet gel biotechnology – case reports. Int J Periodont Rest Dent, 20, 487-497.

Okuda K, Kawase T, Momose M, Murata M, Saito Y, Suzuki H, Wolff LF, Yoshie H (2003). Platelet-rich plasma con-tains high levels of platelet-derived growth factor and transforming growth factor-β and modulates the prolifera-tion of periodontally related cells in vitro. J Periodontol, 74, 849-857.

Onishi T, Ishidou Y, Nagamine T, Yoke K, Imamura T, Kato M, Sampath TK, ten Dijke P, Sakou T (1998). Distinct and overlapping patterns of localization of bone morpho-genetic protein (BMP) family members and a BMP type II receptor during fracture healing in rats. Bone, 22, 605-612.

Owen M (1985). Lineage of osteogenic cells and their


211

relationship to the stromal system. J Bone Miner Res, 3, 1-5.Owen M, Friedenstein AJ (1988). Stromal stem cells:

marrow-derived osteogenic precursors. Ciba Found Symp, 136, 42-60.

Page K, Stevens A, Lowe J, Bancroft JD (1996). Bone. In: Theory and Practice of Histological Techniques. 4ª edição. Editores: J.D. Bancroft, A. Stevens, D.R. Turner. Churchill Livingstone (Edimburgo), 309-340.

Panagakos FS (1993). Insulin-like growth factors-I and II stimulate chemotaxis of osteoblasts isolated from fetal rat calvaria. Biochimie, 75, 991-994.

Parfitt AM (1983). Stereologic basis of bone histomor-phometry: Theory of quantitative microscopy and recons-truction of the third dimension. In: Bone Histomorpho-metry: Techniques and Interpretation. Editores: R.R. Recker. CRC Press, Inc. (Boca Raton), 53-87.

Parfitt AM, Drezner MK, Glorieux FH, Kanis JA, Malluche H, Meunier PJ, Ott SM, Recker RR (1987). Bone histo-morphometry: Standardization of nomenclature, symbols, and units. J Bone Miner Res 2, 595-610.

Pauwels F (1980). Biomechanics of the Locomotor Apparatus. Tradutores: P. Maquet, R. Furlong. Springer-Verlag (Berlim).

Perren SM (1979). Physical and biological aspects of fracture healing with special reference to internal fixation. Clin Orthop, 138, 175-196.

Pfeilschifter J, Oeschsner M, Naumann A, Gronwald RG, Minne HW, Ziegler R (1990). Stimulation of bone matrix apposition in vitro by local growth factors: A comparison between insulin-like growth factor I, platelet derived growth factor, and transforming growth factor β. Endocrinology, 127, 69-75.

Piché JE, Graves DT (1989). Study of the growth factor requirements of human bone-derived cells: A comparison with human fibroblasts. Bone, 10, 131-138.

Poynton AR, Lane JM (2002). Safety profile for the clinical use of bone morphogenetic proteins in the spine. Spine, 27(Suppl), S40-S48.

Prieur WD, Sumner-Smith G (1984). General considerations. In: Manual of Internal Fixation in Small Animals, Editores: W.O. Brinker, R.B. Hohn, W.D. Prieur, Springer-Verlag (Berlim).

Rappolee DA, Mark D, Banda MJ, Werb Z (1988). Wound macrophages express TGF-β and other growth factors in vivo: Analysis of mRNA phenotyping. Science, 241, 708-712.

Reddi AH Wientroub, S Muthukumaran, N (1987). Biologic principles of bone induction. Orthop. Clin North Am, 18, 207-212.

Reeder GD, Hood AG, Hill AG (1993). Perioperative auto-logous sequestration, 1: Physiology, phenomena, and art. Proceedings of the American Academy of Cardiovascular Surgeons, 14, 118-125.

Riedel GE, Valentin-Opran A (1999). Clinical evaluation of rhBMP-2/ACS in orthopedic trauma: A progress report. Orthopedics, 22, 663-665.

Roberts AB, Sporn MB (1993). Physiological actions and clinical applications of transforming growth factor-β(TGF-β). Growth Factors, 8, 1-9.

Rosen DM (1994). Transforming growth factor-betas: Biological activities related to bone metabolism. In: Bone and Mineral Research. Editores: J.N. Heersche, J.A. Kanis. Elsevier Science Publishing (Amesterdão), 143.

Rosen V, Wozney JM (2002). Bone morphogenetic proteins. In: Principles of Bone Biology. Vol. II, 2ª edição. Editores: J.P. Bilezikian, L.G. Raisz, G.A. Rodan. Academic Press (San Diego), 919-928.

Rossa CJr., Marcantonio EJr., Cirelli JA, Marcantonio RA, Spolidorio LC, Fogo JC (2000). Regeneration of class III furcation defects with basic fibroblast growth factor (b-FGF) associated with GTR. A descriptive and histo-metric study in dogs. J Periodontol, 71, 775-784.

Rutherford RB, Niekrash CE, Kennedy JE, Charette MF (1992a). Platelet-derived and insulin-like growth factors stimulate regeneration of periodontal attachment in monkeys. J Periodontal Res, 27, 285-290.

Rutherford RB, Sampath TK, Rueger DC, Taylor TD (1992b). The use of bovine osteogenic protein to promote rapid osseointegration of endosseous dental implants. Int J Oral Maxil Implants, 7, 297-301.

Rutherford RB, Wahle J, Tucker M, Ruegger D, Charette M (1993). Induction of reparative dentine formation in monkeys by recombinant human osteogenic protein-1. Arch Oral Biol, 38, 571-576.

Sammartino G, Tia M, Marenzi G, di Lauro AE, D’Agostino E, Claudio PP (2005). Use of autologous platelet-rich plasma (PRP) in periodontal defect treatment after extractionof impacted mandibular third molars. J Oral Maxillofac Surg, 63, 766-770.

Sanchez AR, Sheridan PJ, Kupp LI (2003). Is platelet-rich plasma the perfect enhancement factor? A current review. Int. J Oral Maxillofac Implants, 18, 93-103.

Sandberg MM, Aro HT, Vuorio EI (1993). Gene expression during fracture repair. Clin Orthop, 289, 292-312.

Scaduto AA, Lieberman JR (1999). Gene theraphy for osteoinduction. Orthop Clin North Am, 30, 625-633.

Schenk RK (1987). Cytodynamics and histodynamics of primary bone repair. In: Bristol-Myers/Zimmer Orthopaedic Symposium. Fracture Healing. Editor: J.M. Land. Churchill Livingstone Inc. (Nova Iorque), 23-32.

Schenk RK, Olah AJ, Herrmann W (1984). Methods of Calcified Tissue Preparation. Editor: G.R. Dickson. Elsevier (Amesterdão).

Schenk RK, Willenegger H (1977). Zur histologie der primären knochenbruchheilung. Unfallheilkunde. 80, 155-160.

Schlegel KA, Donath K, Rupprecht S, Falk S, Zimmermann R, Felszeghy E, Wiltfang J (2004). De novo bone formationusing bovine collagen and platelet-rich plasma. Biomate-rials, 25, 5387-5393.

Schlegel KA, Kloss FR, Schultze-Mosgau S, Neukan FW, Wiltfang J (2003). Osseous defect regeneration using autogenous bone alone or combined with Biogran or Algipore with and without added thrombocytes. A micro-radiologic evaluation. Mund Kiefer Gesichtschir, 7, 112-118.

Schliephake H (2002). Bone growth factors in maxillofacial skeletal reconstruction. Int. J Oral Maxil Surg, 31, 469-484.

Selvig KA, Wikesjö UM, Bogle GC, Finkelmann RD (1994). Impaired early bone formation in periodontal fenestration defects in dogs following application of insulin-like growth factor (II), Basic fibroblast growth factor and transforming growth factor β1. J Clin Periodontol, 21, 380-385.

Sigurdsson TJ, Lee MB, Kubota K, Turek TJ, Wozney JM, Wikesjö UM (1995). Periodontal repair in dogs: Recombinant human bone morphogenetic protein-2


212

significantly enhances periodontal regeneration. J Periodontol, 66, 131-138.

Stafford HJ, Roberts MT, Oni OO, Hay J, Gregg P (1994). Localisation of bone-forming cells during fracture healing by osteocalcin immunohistochemistry: An experimental study of the rabbit tibia. J Orthop Res, 12, 29-39.

Steenfos HH (1994). Growth factors and wound healing. Scand J Plast Reconstr Hand Surg, 28, 95-105.

Stevens A, Wilson IG (1996). The haematoxylins and eosin. In: Theory and Practice of Histological Techniques. 4ª edição. Editores: J.D. Bancroft, A. Stevens, D.R. Turner. Churchill Livingstone (Edimburgo), 99-112.

Strayhorn CL, Garret JS, Dunn RL, Benedict JJ, Somerman MJ (1999). Growth factors regulate expression of osteoblast-associated genes. J Periodontol, 70, 1345-1354.

Stützle H, Hallfeldt K, Mandelkow H, Kessler S, Schweiberer L (1998). Knochenneubildung durch knoch-enersatzmaterialien. Orthopäde, 27, 118-125.

Swennen GR, Schutyser F, Mueller MC, Kramer FJ, Eulzer C, Schliephake H (2005). Effect of platelet-rich-plasma on cranial distraction osteogenesis in sheep: preliminary clinical and radiographic results. Int J Oral Maxillofac Surg, 34, 294-304.

Takayama S, Murakami S, Shimabukuro Y Kitamura, M Okada, H (2001). Periodontal regeneration by FGF-2 (bFGF) in primate models. J Dent Res, 80, 2075-2079.

Tatakis DN, Wikesjö UM, Razi SS, Sigurdsson TJ, Lee MB, Nguyen T, Ongpipattanakul B, Hardwick R (2000). Periodontal repair in dogs: effect of transforming growth factor-β1 on alveolar bone and cementum regeneration. J Clin Periodontol, 27, 698-704.

Tayapongsak P, O´Brien DA, Monteiro CB, Arceo-Diaz LL (1994). Autologous fibrin adhesive in mandibular recon-struction with particulate cancellous bone and marrow. J Oral Maxil Surg, 52, 161-166.

Terranova VP, Odziemiec C, Tweden KS, Spadone DP (1989). Repopulation of dentin surfaces by periodontal ligament cells and endothelial cells: Effects of basic fibroblast growth factor. J Periodontol, 60, 293-301.

Terranova VP, Wikesjö UM (1987). Extracellular matrices and polypeptide growth factors as mediators of functions of cells of the periodontium. A review. J Periodontol, 58, 371-380.

The American Academy of Periodontology (1996). The potential role of growth and differentation factors in periodontal regeneration. (Position paper). J Periodontol, 67, 545-553.

Urist MR (1965). Bone: formation by autoinduction. Science, 150, 893-899.

Vacanti CA, Vacanti JP (2000). The science of tissue engi-

neering. Orthop. Clin. North Am., 31, 351-355.van den Bergh JP, ten Bruggenkate CM, Groeneveld HH,

Burger EH, Tuinzing TB (2000). Recombinant human bone morphogenetic protein-7 in maxillary sinus floor elevation surgery in 3 patients compared to autologous bone grafts. A clinical pilot study. J Clin Periodontol, 27, 627-636.

Vandersall DC (1998). La Periodôncia en el próximo milenio.Clínicas Odontológicas de Norte América, 3, 563-580.

Velich N, Kovacs K, Huszar T, Semjen G, Reiczigel J, Szabo G, Suba Z (2004). The effect of platelet-rich plasma on new bone formation by augmentation with osseoconductivebone substitute material in beagle dogs. Fogorv Sz, 97, 23-27.

Vortkamp A, Pathi S, Peretti GM (1998). Recapitulation of signals regulating embryonic bone formation during post-natal growth and in fracture repair. Mech Develop, 71, 65-76.

Wang X, Liu B, Jin Y, Xi Y (1993). The effect of bone mor-phogenetic protein on osseointegration of titanium implants. J Oral Maxil Surg, 51, 647-651.

Warnke PH, Coren AJ (2003). First experiences with recombinant human bone morphogenetic protein 7 (osteogenic protein 1) in a human case in maxillofacial surgery. Plast Reconstr Surg, 111, 2471-2472.

Whitman DH, Berry RL, Green DM (1997). Platelet gel: an autologous alternative to fibrin glue with applications in oral and maxilofacial surgery. J Oral Maxil Surg, 55, 1294-1299.

Wikesjö UM, Guglielmoni P, Promsudthi A, Cho KS, Trombelli L, Selvig KA, Jin L, Wozney JM (1999). Periodontal repair in dogs: Effect of rhBMP-2 concentra-tion on regeneration of alveolar bone and periodontal attachment. J Clin Periodontol, 26, 392-400.

Wikesjö UM, Nilvéus RE, Selvig KA (1992). Significance of early healing events on periodontal repair: a review. J Periodontol, 63, 158-165.

Wiltfang J, Kloss FR, Kessler P, Nkenke N, Schultze-Mosgau S, Zimmermann R, Schlegel KA (2004). Effects of platelet-rich plasma on bone healing in combination with autogenous bone and bone substitutes in critical-size defects. An animal experiment. Clin Oral Implants Res, 15, 187-193.

Zhang CQ, Yuan T, Zeng BF (2003). Experimental study on effect of platelet-rich plasma in repair of bone defect. Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi, 17, 355-358.

Zhang Y, Lin Y, Qiu LX, Wang X (2004). Using platelet-rich plasma (PRP) to improve bone regeneration in implant bone defect. Zhonghua Kou Qiang Yi Xue Za Zhi, 39, 269-72.


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A utilização de Plasma Rico em Plaquetas na regeneração do ... · em várias situações...

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