A Quantiﬁcação do Amanhã fornece certeza na análise ...certeza na análise complexa de hoje...

A uantificação do Amanhã forneceQcerteza na análise complexa de hoje

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Incorrect (interference)Quantitation peak

Resolution 35 K Resolution 70 K

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Scientia Chromatographica 2018; 10(2):99-110Instituto Internacional de Cromatografiahttp://dx.doi.org/10.5935/sc.2018.006ISSN 1984-4433

SAMPLE PREPARATION

Scientia Chromatographica 2018; 10(2) 99

ResumoA extração líquido-líquido assistida pelo efeito salting out (SALLE, Salting-out assisted liquid–liquid extraction) é baseada na partição do(s) analito(s) entre o solvente orgânico miscível em água e amostras de plasma ou outros fluidos biológicos. O efeito salting-out favorece a separação entre as fases orgânica e aquosa. A SALLE é uma técnica de preparo de amostra que possibilita a extração de substâncias hidrofílicas, incluindo fármacos e seus metabólitos. Esta técnica possibilita que os extratos obtidos sejam injetados diretamente no sistema cromatográfico, ou após simples diluição. Esta revisão apresenta os fundamentos teóricos da técnica SALLE, as principais etapas envolvidas no processo de extração e exemplos de aplicações desta técnica em diversas áreas.Palavras-chave: extração líquido-líquido assistida pelo efeito salting-out; preparo de amostra biológicas.

AbstractSalting-out assisted liquid-liquid extraction (SALLE) extraction is based on the partition of analyte(s) between water-miscible organic solvent and plasma samples or other biological fluids. The salting-out effect induces the separation between the phases, organic and aqueous. SALLE is a sample preparation technique that enables the extraction of drugs and their metabolites, including many hydrophilic compounds. This technique allows the obtained extracts to be directly injected into the chromatographic system or by simple dilution. This review presents the theory fundamentals of SALLE technique, the key steps involved in the extraction process and examples of applications of this technique in several areas.Keywords: Salting-out assisted liquid–liquid extraction; biological sample preparation.

Caroline Fernandes Grecco Luis Felippe Cabral Miranda Jonas Carneiro Cruz Maria Eugênia Costa Queiroz*

Departamento de Química, Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, 14040-901, Ribeirão Preto, SP, Brasil

*[email protected]

Recebido: 25/04/2018 Aceito: 14/05/2018

Extração líquido-líquido assistida pelo efeito salting out para análise de amostras biológicasSalting-out assisted liquid-liquid extracion for biological sample analysis

Grecco CF et al. Extração líquido-líquido assistida pelo efeito salting out para análise de amostras biológicas

100 Scientia Chromatographica 2018; 10(2):99-110

1. IntroduçãoA cromatografia líquida acoplada à espectrometria

de massas em tandem (LC-MS/MS) tem sido considerada

a técnica analítica de referência para a determinação de

compostos de interesse em fluidos biológicos.

O desenvolvimento de métodos bioanalíticos

por LC-MS/MS inclui diferentes etapas, como preparo

da amostra, análise cromatográfica e detecção[1], sendo

a etapa de preparo de amostra a mais dispendiosa

(cerca de 80% do tempo total de análise). Os fluidos

biológicos são amostras complexas constituídas de

vários componentes endógenos. Estes podem adsorver

de forma irreversível junto à fase estacionária da coluna

cromatográfica, diminuindo a eficiência da separação

cromatográfica, ou suprimindo a ionização dos analitos,

reduzindo a resposta analítica. Desse modo, a etapa de

preparo de amostra visa a eliminação de grande parte

dos componentes endógenos das amostras biológicas e

a pré-concentração dos analitos, quase sempre presentes

em níveis de traços.

A precipitação de proteínas (PPT), extração

líquido-líquido (LLE) e extração em fase sólida

(SPE) têm sido as técnicas de preparo de amostra

convencionais utilizadas no desenvolvimento de

métodos bioanalíticos. Recentemente, outras técnicas

de preparo de amostra têm sido desenvolvidas visando

a miniaturização, simplificação e minimização do uso de

solventes orgânicos[1]. Neste contexto, podemos destacar

a técnica de extração líquido-líquido assistida pelo efeito

salting out, (SALLE, Salting-out assisted liquid–liquid

extraction). A técnica SALLE, quando comparada à

PPT, é mais seletiva e resulta em extratos mais limpos. Já

quando comparada à LLE e SPE, a SALLE é mais rápida

e gera menor resíduo solvente orgânico[2]. A SALLE

resulta em extrações mais eficientes para substâncias

hidrofílicas, quando comparada à LLE convencional,

a qual geralmente emprega solventes orgânicos mais

tóxicos. Além disso, a extração por SALLE pode

ser facilmente automatizada utilizando uma placa de

96 poços, a qual pode ser integrada ao sistema LC-MS/MS aumentando assim a frequência analítica.

A SALLE tem sido adaptada com sucesso para bioanálises[3-14] no sistema LC-MS/MS, em razão dos pequenos volumes de amostra biológica, simplicidade e injeção direta do extrato no sistema cromatográfico (Tabela 1).

2. Extração líquido-líquido assistida pelo efeito salting out (SALLE)

As primeiras aplicações da técnica SALLE para determinação de compostos hidrofílicos em amostras biológicas ocorreram na década de 1970[15-17].

Em um procedimento típico SALLE, um solvente orgânico miscível em água e uma solução concentrada de sal são adicionados à matriz biológica contendo o analito de interesse. Quando a concentração salina se torna muito alta, ocorre a diminuição da solubilidade das moléculas do solvente na fase aquosa, levando à formação de um sistema bifásico. Este fenômeno é frequentemente chamado de “separação de fases induzida por sal”[18]. Com a formação desse sistema bifásico, os analitos migram da fase aquosa em direção à fase orgânica. O extrato orgânico obtido pode então ser injetado diretamente no sistema cromatográfico principalmente junto à cromatografia líquida por interação hidrofílica (HILIC), ou na cromatografia líquida em fase reversa por simples diluição com solução aquosa ou solução tampão.

A técnica SALLE tem sido aplicada para a extração de uma ampla gama de substâncias em matrizes biológicas, incluindo substâncias hidrofílicas, as quais apresentam baixas taxas de recuperação quando extraídas por LLE e SPE[3-8,19-24].

A eficiência da técnica SALLE está relacionada ao tipo de sal utilizado e as propriedades físico-químicas dos analitos. O efeito salting-out diminui a solubilidade na fase aquosa de substâncias parcialmente solúveis em solventes orgânicos, assim como induz a precipitação das proteínas, contribuindo para o clean up da amostra[2,3,25].

Extração líquido-líquido assistida pelo efeito salting out para análise de amostras biológicas Grecco CF et al.

Scientia Chromatographica 2018; 10(2):99-110 101

Tabela 1. Aplicações da técnica SALLE na análise de fluidos biológicos por técnicas cromatográficas.

Analito Matriz Solvente orgânico

Sal Método cromatográfico

Coluna Fase móvel Curva linear (ng mL-1)

Refs.

ABT-869A-849529

Plasma (50µL)

200 µL de ACN

50 µL de C

2H

7NO

2 2M

LC-MS/MSSymertry Shield RP-8

(C8) (2,1 mm x 150 mm, 5µm)

ACN: Solução aquosa contendo 0,1%

de ácido fórmico

1,2-5741,21-581

Wu et al. (2008)[4]

LPVRTV

Plasma (50µL)

200 µL de ACN

100 µL de ZnSO

4 3M

LC-MS/MS

Agilent Zobax Extend-C

18 Rapid

resolution HT (1,8 µm, 2,1 mm x

30 mm)

ACN: Solução aquosa contendo 0,1% de

ácido fórmico

19,2-16.0009,73-8.110

Myasein et al.

(2009)[5]

Droga desconhecida

Plasma (50µL)

200 µL de ACN

50 µL de tampão

NH4HCO

2 5mM

LC-MS/MSSymmetry300 C18

(4,6 x 50 mm, 5 µm)

ACN + formiato de amônio 50 mM:

MeOH : Água (55:25:20, v/v)

-Zhang et al.

(2009)[6]

LPVRTV

Plasma (25µL)

200 µL de ACN

50 µL MgSO

4

LC-MS/MSSynegiTM MAX-RP

(50 x 2,00 mm, 4 µm)

ACN + 0,3% ácido fórmico : Água +

formiato de amônio 4mM (60:40, v/v)

9,8-3104,9-160

Zhang et al.

(2009)[3]

SSSSA

Plasma (100 µL)

200 µL de ACN gelada

(4 °C)

50 µL de tampão

NH4HCO

2 5mM

(pH 4,5)

LC-MS/MSSynergi MAX-RP

(2,5 µm 2.0 mm x 50 mm)

ACN: Água: Tampão acetato de

metilamônio pH 4,5

0,0966-50,10,0938-51,1

Zhang et al.

(2010)[7]

Canabinóides (metabólitos)

Urina (100 µL)

200µL de ACN

50 µL de C

2H

7NO

2 10M

LC-MS/MSChro-HSS T3

(2,1 mm x 100 mm, 1,8 µm) a 40°C

Solução aquosa contendo 0,1% de ácido fórmico: ACN contendo 0,1% de

ácido fórmico

4-400Yanes et al.

(2012)[8]

TMZPlasma (1 mL)

2 mL de ACN

500 µL uma solução de NaCl 1M

500 µL de K

2SO

4 1M

HPLC-PDAODS – Hypersil

(5 µm, 25 cm x 4,6 mm)ACN: Ácido acético

0,1% (v/v)470-20.000

Jain et al. (2014)[37]

BLWL

Plasma (100 µL)

200 µL de ACN

150 µL de (NH

4)

2SO

4

saturadoHPLC-DAD

XB-C18

(4,6 x 250 mm,

5 µm)

ACN: Solução aquosa contendo 0,1% de

ácido fórmico50-NI

Li et al. (2014)[54]

ATo-OATp-OAT

Plasma (100 µL)

400 µL de ACN

100 µL de C

2H

7NO

2 6M

LC-MS/MSKinetex XB C

18

(50 mm x 2.1 mm, 2.6 µm) à 40°C

Solução aquosa contendo 1% de

ácido fórmico: ACN

0,02-15,00,02-15,00,01-2,0

Yang et al. (2015)[9]

TrimetazidinaPlasma (50 µL)

100 µL de ACN

25 µL de NH

4HCO

2

LC-MS/MSAtlantis C18

(150 x 2,1mm, 5 µm) a 35°C

Solução aquosa contendo 0,1% de ácido fórmico: ACN

0,1-100Xiong e Yang

(2015)[10]

PKMK-4MK-7

Plasma (500 µL)

1 mL de ACN

0,3 g MgCl2

HPLC-FLHypersil C

18

(4,6 x 150 mm2, 5 µm) à 40°C

ACN: Solução aquosa contendo

0,1% de TFA

0,3-1000,3-1000,5-100

Ahmed e Mahmoud (2015)[11]

AEAPlasma (100 µL)

200 µL de ACN

50 µL de NH

4HCO

2 5 M

LC-MS/MSSB-C

18 (2,7 µm,

2,1 mm x 50 mm)

ACN: Solução aquosa contendo 0,1%

de ácido fórmico0,1-8,0

Xiong et al. (2015)[55]

AfatinibPlasma (10 µL)

ACN5 µL de

MgCl2 3M

LC-MS/MSBEH C

18

(30 x 2,1 mm, 1,7 µm) a 40°C

Solução aquosa contendo 0,1% de hidróxido de

amônio: ACN

0,5-500Sparidans

et al. (2016)[12]



Analito Matriz Solvente orgânico

Sal Método cromatográfico

Coluna Fase móvel Curva linear (ng mL-1)

Refs.

FEBPlasma (100 µL)

1000 µL de ACN

100 µL de C

2H

7NO

2 2M

RP-HPLC-UVPhenomenex Luna-C

18

(250 x 4,60 mm, 5 µm)

Tampão KH2PO

4

25mM ajustado para pH 6,8 com

trietilamina: MeOH

300-20.000Tandel et al.

(2016)[45]

STZSCPSMXSSZ

Plasma (4 mL)

2 mL de ACN

110 µL de [C

4MIM]BF

4

1,0 g de K2HPO

4

70 µL de [C

6MIM]PF

6.

200 µL de ACN ao precipitado

HPLC-UVZorbax Eclipse Plus

C18

(150 mm x 4,6 mm, 3,5 µm)

ACN (2,67 mol L-1

ácido fórmico): Água (2,67 mol L-1

ácido fórmico)

16,3-386,914,5-366,420,5-401,013,1-376,1

Liu et al. (2016)[56]

O-DMCARCAR

5´-HCARPRO

5-HPROMET

O-DMMETα-HMET

Urina (500 µL)

300 µL de ACN

200 mg de (NH

4)

2SO

4

HILIC-UV

ZORBAX RRHD Poroshell 120-HILIC

(100 x 3,0 mm, 2,7 µm) a 25°C

ACN: Solução aquosa contendo acetato de amônio 10mM

(pH 7,5)

100-4000100-4000200-8000100-4000100-4000200-8000200-8000200-8000

Magiera et al.

(2016)[48]

BifentrinaPermetrinaβ-CiflutrinaFenvalerato

Urina (2 mL)

2 mL de ACN

4 mL de NaCl 5 M

CG-MS

Coluna capilar de sílica fundida revestida Zebron TMZB - 5 MS

(30 m x 0,25 mm, 0.25 µm)

Hélio

5-5.00025-5.000200-5.00025-5.000

Niu et al. (2017)[57]

CysHcy

Urina

Derivatização: reação a 1000W

por 5 min em pH 10 +

750W por 7 e utilizando Br-TFB

como agente derivatizante.

CG-MS

Coluna capilar de sílica fundida

(30 m x 0,25 mm, 0,25 µm)

- NITsai et al. (2017)[58]

-ResR3SR4´SR3GR4´G

Plasma (50 µL)

ACN:MeOH (80:20 v/v)

50 µL de tampão

C2H

7NO

2 10 M

LC-MS/MSInertsil ODS‐3

(2,1 × 150 mm, 5 µm) à 30°C

Solução aquosa contendo acetato de amônio 5mM: ACN

2,0-NI2,0-NI2,0-NI10,0-NI4,0-NI

Qiu et al. (2017)[13]

QuizartinibPlasma (10 µL)

ACN5 µL de

MgSO4 3M

LC-MS/MSBEH C

18 (30 x 2,1 mm, 1,7 µm)

MeOH: Água: Hidróxido de amônio

2% (v/v)2-2000

Retmana et al.

(2017)[14]

MetforminaBuforminaFenformina

Plasma (200 µL)

Urina (1 mL)

400 µL ACN500 µL ACN

NaOH HPLC-UVZIC-HILIC column

(150 mm x 2,1 mm x 3,5 µm)

ACN:15mM tampão acetate de amônio

20-20005-2000

Alshishani et al.

(2018)[52]

5´-HCAR: 5-hidroxi-carvedilol; 5-HPRO: 5-hidroxi-propranolol; ACN: acetonitrila; AEA: anandamida; AT: Atorvastatina; BL: baicalin; Br-TFB: Brometo de 3,4,5-trifluoro benzilo; CAR: carvedilol; CRZ: carnidazol; Cys: cisteína; DCM: diclorometano; DON: desoxinivalenol; FB

1: fumonisina B

1; FB

2: fumonisina B

2; FEB: Febuxostato; FS-OP: sistema de fluxo com detecção pela sonda óptica; F-X:

fusarenon-X; Hcy: homocisteína; HT-2: IPZ: ipronidazol; LPV: lopinavir; MeOH: metanol; MET: metoprolol; MK-4: menaquinona-4; MK-7: menaquinona-7; MNZ: 1-(2-hidroxietil)-2-metil-5-nitroimidazol; NI: não informado; O-DMCAR: O-desmetil-carvedilol; O-DMMET: O-desmetil-metoprolol;o-OAT: o-hidroxi atorvastatina; ORZ: ornidazol; PK: filoquinona; p-OAT: p-hidroxi atorvastatina; PRO: propanolol; R3G: trans-resveratrol-3-O-β-D-glucoronido; R3S: trans-resveratrol-3-sulfato; R4´G: trans-resveratrol-4´-O-β-D- glucoronido; R4´S: trans-resveratrol-4´-sulfato; Res: trans-resveratrol; RNZ: 1-metil-2-carbamoyloxymetil-5-nitroimidazol; RTV: ritonavir; SCP: sulfacloropiridazina; SCZ: secnidazol; SMX: sulfametoxazol; SS: simvastatin; SSA: ácido simvastatin; SSZ: sulfisoxazol; STZ: sulfatiazol; T-2: micotoxina T-2; TFA: ácido trifluoroacético; THF: tetrahidrofurano; TMZ: temozolomida; TNZ; tinidazole; TRZ: ternidazol; WL: wogonoside; ZEA: zearelona; α-HMET: α-hidroxi-metoprolol;

Tabela 1. Continuação...



(mL), porcentagem de água (m/m) e concentração de cloreto (mol L-1) na fase orgânica também foram avaliados. Os resultados obtidos mostraram que os diferentes solventes geraram diferentes volumes de fase orgânica com diferentes porcentagens de água.

Jain et al.[37] avaliou a extração de termozolomida em amostras de plasma por SALLE utilizando cloreto de sódio como agente salting out e diferentes solventes orgânicos extratores. As recuperações obtidas utilizando metanol, acetato de etila, diclorometano e acetonitrila foram 6,79 ± 5,56%, 52,01 ± 3,13%, 62,69 ± 2,11% e 69,20 ± 1,18%, respectivamente. A eficiência da SALLE depende da solubilidade do analito no solvente extrator, dessa forma, a baixa solubilidade da termozolomida em metanol foi responsável pela pequena fração recuperada.

A utilização de uma mistura de solventes orgânicos é uma alternativa que pode aumentar a eficiência de extração na técnica SALLE. Qiu et al.[13] realizou a extração de trans resveratrol e seus congugados glucurônicos e sulfatos em amostras de plasma de rato por SALLE. Utilizando acetonitrila como solvente extrator, recuperação melhorada foi obtida apenas para trans-resveratrol e sulfatos. Em seguida, os autores avaliaram a eficiência da extração dos analitos com a adição de 20% metanol (v/v) ao solvente extrator. Apesar do volume de fase orgânica ter diminuido após a separação de fases, a recuperação dos conugados glucurônicos foi satisfatória.

2.2. Sais utilizadosA técnica SALLE permite a utilização de sais

de natureza orgânica ou inorgânica como agentes de salting out. Em um sistema SALLE, além de atuar como agente salting out, o sal ainda pode ser responsável por precipitar proteínas e outras macromoléculas presentes na matriz biológica, reduzir a solubilidade dos analitos na fase aquosa e separar o solvente orgânico miscível da fase aquosa[35,38-40]. Entretanto, para a escolha do sal a ser utilizado, é importante considerar o tipo de amostra, a natureza dos analitos, o solvente orgânico e a instrumentação analítica utilizada[2]. Entre os sais mais

As extrações LLE realizadas nas décadas de 1980/1990 utilizavam longas etapas manuais e não adequadas para a injeção direta dos extratos obtidos nos sistemas HILIC ou LC-MS/MS[2]. Em 2009, Zhang et al.[3] publicou um método para a determinação de ritonavir e lopinavir em amostras de plasma utilizando o primeiro procedimento SALLE compatível com LC-MS/MS. As extrações foram realizadas utilizando um “liquid handler” com capacidade de processamento de 96 amostras simultaneamente. Os ensaios de validação do método foram realizados em apenas 1 dia (30-45 minutos de preparo de amostra), utilizando 25 µL de plasma, 50 µL de uma solução de sulfato de magnésio, 200 µL de acetonitrila e separação cromatográfica em menos de 1,5 min. Em trabalhos posteriores[4,6,7], o mesmo grupo desenvolveu outros métodos bioanalíticos de alto rendimento utilizando outros sais compatíveis com LC-MS/MS, como acetato e formiato de amônio.

2.1. Solventes extratoresDiferentes solventes como acetonitrila[26-30],

etanol[31], tetrahidrofurano[32] e acetona[33,34] têm sido utilizados na técnica SALLE. A acetonitrila desempenha duas funções no procedimento SALLE, precipita as proteínas e atua como solvente extrator. Além de proporcionar um extrato limpo, acetonitrila é o solvente mais utilizado como um dos constituintes da fase móvel em cromatografia líquida e compatível com a detecção por espectrometria de massas. Estas vantagens resultaram no uso de acetonitrila como solvente extrator na maioria dos procedimentos SALLE/LC-MS/MS[15,16,35,36].

Tabata et al.[35], empregando a SALLE, avaliou a separação de fases de 14 solventes orgânicos miscíveis em água, com a adição de solução de NaCl 4 mol L-1. Os autores observaram a separação de fases (orgânico/aquosa) para os seguintes solventes: acetonitrila, 1,4 dioxano, acetona, THF, 1 propanol e 2 propanol. Já para os solventes metanol, etanol, 1-butanol, formamida, N-metilformamida, carbonato de propileno, N,N-dimetilformamida e N,N-dimetilsulfoxido não foi observado a separação de fases. Parâmetros como volume



influenciar significativamente na eficiência de extração de um método bioanalítico. A maioria dos trabalhos que utilizam a técnica SALLE em amostras biológicas ajustam o pH da amostra duas unidades acima ou abaixo do valor de pK

a de analitos, básicos ou ácidos,

respectivamente. Esta estratégia tem a finalidade de deixar os compostos em sua forma não ionizada, uma vez que moléculas carregadas apresentam baixa solubilidade em solventes orgânicos[2,46].

Devido à polaridade relativamente mais alta dos solventes orgânicos usados, a técnica SALLE permite a extração de uma ampla gama de compostos hidrofílicos e hidrofóbicos. Ainda assim, um pH adequado na solução aquosa ajudará a melhorar a eficiência/recuperação da extração[2].

Rustum et al. desenvolveu métodos bioanalíticos que utiliza carbonato de potássio anidro para determinar ciclofosfamida[19], cadralazina[20] e diltiazem[21] em amostras de sangue. O pH 12 da solução saturada de carbonato de potássio favoreceu a extração dos compostos básicos cadralazina (pKa = 9,0) e diltiazem (pKa = 8,9), mas o mesmo não ocorreu para o ácido fraco ciclofosfamida (pKa = 6,0). Dessa forma, as eficiências de extração para cadralazina e diltiazem foram ≥95%, enquanto que para a ciclofosfamida foi de apenas aproximadamente 60-64%.

Wang et al.[47] investigou a eficiência de extração da varfarina racêmica (ácido fraco com pKa = 5) em função do pH. Foi verificado que em pH 4, houve uma eficiência de extração de 92,7%, enquanto que em pH 7-10 a eficiência de extração caiu abaixo de 60%.

A escolha do pH da amostra deve ser feita considerando a estabilidade dos analitos, dessa forma, o ajuste do pH não deve causar nenhuma instabilidade nos analitos e seus metabólitos. Portanto, uma compreensão completa da via metabólica do analito é essencial para evitar decomposições inesperadas. Em alguns casos, os analitos que apresentam baixa estabilidade não são extraídos em valores extremos de pH[2,46].

utilizados nas bioanálises, podemos citar o sulfato de magnésio, sulfato de zinco, sulfato de amônio e sulfato de cobre. Diversos trabalhos reportados na literatura têm utilizado o sulfato de magnésio como agente salting out[3,9,41-44].

É importante ressaltar que alguns sais podem afetar negativamente o resultado das análises em fluidos biológicos por LC-MS/MS. O uso de sais inorgânicos pode interferir no processo de separação cromatográfica e/ou suprimir a ionização dos analitos[24,43]. Desta maneira, o uso de sais voláteis compatíveis com o sistema LC-MS/MS, como o acetato e formiato de amônio têm sido a primeira linha de escolha para bioanálises[4,9,10,45]. A utilização de solução concentrada destes sais voláteis, ao invés do sal em sua forma sólida, permite a automação da SALLE[4].

Em SALLE por LC-MS/MS, a concentração de sal pode estar próxima da saturação (como 3 mol/L ZnSO

4 ou 2 mol/L MgSO

4) ou a uma concentração alta

o suficiente em que, após a adição de volume adequado, a concentração final de sal na fase aquosa total (amostra mais solução salina) possibilite uma clara separação de fases[2].

Wu et al.[4] sugeriu que a concentração de sal de 1 mol/L em amostras de plasma é suficiente para produzir separação da fase orgânica de forma clara e limpa, enquanto que o uso de sal em alta concentração poderá comprometer a precisão do ensaio na análise por LC-MS.

Jain et al.[37] desenvolveu um método SALLE-HPLC para a extração de termozolomida. A utilização de dois sais para extração (“double SALLE”) aumentou a eficiência do método convencional.

2.3. pHA maioria dos fármacos, metabólitos e compostos

endógenos das matrizes biológicas são ácidos ou bases fracas que contém ao menos um grupo funcional ionizável. Desta forma, o ajuste do pH da amostra pode



2.4. Efeito matriz

As investigações do efeito de matriz usando

LC-MS/MS são principalmente sobre a avaliação da

supressão/aumento da matriz[43,51] ou a variação do efeito

da matriz nas diferentes amostras analisadas[3-5,7].

Na determinação do entecavir em amostras

de plasma humano, Zhao et al. removeu os lipídeos,

utilizando éter dietílico no extrato obtido por SALLE,

o qual foi seco e reconstituído na fase móvel aquosa[43].

Os autores compararam os efeitos da matriz nos extratos

obtidos por SALLE e por SPE, utilizando uma infusão

pós-coluna. A supressão iônica foi semelhante para os

dois métodos.

O efeito matriz também pode estar relacionado ao

sal utilizado. Durante o desenvolvimento de um método

SALLE para a análise de lorcaserin em amostras de

plasma por LC-MS/MS, o efeito da matriz foi investigado

usando cloreto de magnésio, formato de amônio, cloreto

de sódio, acetato de sódio, sulfato de cobre, sulfato de

magnésio e acetato de amônio. Os resultados mostraram

que cloreto de magnésio apresentou o menor efeito de

matriz (9,7%), já o efeito matriz resultante do uso de

sulfato de cobre foi mais alto (28%). Formiato de amônio

e o acetato de amônio geraram efeitos de matriz entre

13 e 15%.

Mais recentemente, Alshishani et al.[52] realizou

a determinação de biguanidas em amostras de plasma,

urina e água de rio por HILIC. Não foi observado

efeito de matriz significativo. Isso pode ser explicado

pelo fato de a técnica SALLE remover grande parte

dos componentes polares da matriz, e os componentes

remanescentes não ficarem retidos na fase estacionaria

HILIC. Deste modo, a utilização de colunas HILIC com

extração por SALLE geram cromatogramas limpos e

com alta sensibilidade para fármacos polares[52,53].

Zhang et al.[7] realizou determinações quantitativas

de sinvastina e seu metabólito ácido em amostras de

plasma, controlando o pH da solução aquosa em 4,5.

Apesar das espécies estarem parcialmente ionizadas

neste pH, este valor foi utilizado para que não houvesse

a biotransforamação da sinvastatina em seu metabólito

ácido.

Magiera et al.[48] estudou os efeitos do pH na

extração por SALLE dos beta bloqueadores: metoprolol,

propranolol e carvedilol em amostras de urina. Os autores

variaram o pH de 3 a 12, utilizando ácido clorídrico e

hidróxido de amônio. Os resultados mostraram melhor

recuperação em pH 12, o que pode ser atribuído aos

valores de pKa dos analitos, que variaram de 8.74 a 9.7.

Nestas condições, os analitos estariam em sua forma não

ionizada, favorecendo sua partição junto à fase orgânica

e aumentando a recuperação.

O efeito da influência do pH também foi

demonstrado no trabalho de Fan et al. que desenvolveu

um método SALLE para determinação de clorofenóis

(pka entre 4.74-7.00) em amostras vinho. Inicialmente,

os autores realizaram as extrações em pH 4,5, logo

após diluição e adição do sal à amostra. A otimização

do método demonstrou maior eficiência de extração

utilizando pH 2, uma vez que o analito mais ácido

apresentava pKa de 4,74, aumentando a taxa de

recuperação em 1-5%[49].

Atlabachew et al.[50] também investigou a

influência do pH em suas análises. Entretanto, os

autores avaliaram apenas três diferentes valores de pH

na extração de alcalóides de plantas de origem leste

africana. Como condições ácidas protonariam o sítio

básico contendo grupos funcionais característicos dessa

classe de compostos, os autores optaram por utilizar

valores alcalinos de pH (8, 10 e 12). Por conclusão o

pH 10 demonstrou maiores valores de recuperação e

eficiente extração.



depende do solvente orgânico e do sal utilizado na

extração. Solventes mais hidrofílicos geram maior

volume de fase orgânica com alta concentração de água

e de analitos polares, quando comparados aos solventes

menos hidrofílicos[44,45,56-58]. Além disso, a taxa de

recuperação é diretamente proporcional à solubilidade

dos analitos na fase orgânica. Uma das vantagens da

técnica SALLE é a possibilidade de extração simultânea

de vários compostos de diferentes polaridades,

hidrofílicos e hidrofóbicos. No entanto, interferentes

das amostras biológicas podem ser extraídos de forma

conjunta, aumentando os efeitos de matriz do método.

3. Considerações FinaisA SALLE tem sido utilizada com sucesso na

determinação de diversas substâncias em amostras

biológicas, pois permite extrações mais eficientes e mais

seletivas de analitos hidrofílicos, quando comparada à

LLE clássica[4,21,22]. As características físico-químicas

dos analitos e a instrumentação analítica deverão ser

considerados na escolha do solvente orgânico, agente

salting out e pH do meio. A separação de fases (orgânica/

aquosa) não permite a recuperação total do volume de

solvente orgânico utilizado e não gera frações orgânicas

isentas de água. O volume da fração orgânica recuperada

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A Quantiﬁcação do Amanhã fornece certeza na análise ...certeza na análise complexa de hoje...

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