A prokaryotic alternative oxidase present in the bacterium Novosphingobium aromaticivorans Pal...
-
Upload
paula-salvado-gameiro -
Category
Documents
-
view
230 -
download
0
Transcript of A prokaryotic alternative oxidase present in the bacterium Novosphingobium aromaticivorans Pal...
A prokaryotic alternative oxidase present in the bacterium
Novosphingobium aromaticivorans
Pal Stenmark, Par Nordlund
FEBS Letters 552 (2003) 189-192
Introdução
A AOX Ocorrência:
Todas as plantas superiores, alguns fungos, tripanossomas e na bactéria N. Aromaticivorans.
Funções: Transferir diretamente elétrons da ubiquinona reduzida
para o oxigênio; Em algumas plantas volatilizar aminas para atrair
polinizadores; Evitar formação de ROS, pelo acumulo de ubiquinona
reduzida quando a via principal estiver bloqueada, ou quando a carga energética estiver alta;
Plasticidade metabólica, balanceando o metabolismo de carbono e o transporte de elétrons.
Introdução
Introdução
Regulação:
Introdução
Regulação: Em plantas, a enzima é homodimérica e tem sua
atividade aumentada pela redução das pontes dissulfeto entre as sub-unidades;
É também estimulada por α-ceto ácidos, especialmente o piruvato, o qual reage com grupos sulfidrilas da porção N-terminal da proteína;
Em fungos, a enzima é monomérica e não é estimulada por α-ceto ácidos, porém é estimulada por ADP, AMP e GMP.
Introdução
Regulação:
Introdução
Materiais e Métodos
Clonagem e expressão: A AOX de N. aromaticivorans (NaAOX) foi clonada no
plasmídio pUNI-10, originando o vetor pUNI-NaAOX. pUNI-NaAOX foi então recombinado com o vetor de alto
nível de expressão pHB-MALc2X e e ao de baixa expressão pHB-MALc2M, originando os vetores de expressão pNaAOX-C2X e pNaAOX-C2M, ambos com proteína de fusão MPB
Ensaio de complementação: Bactérias E.coli heme-deficientes (SASX41B) foram
transformadas pelos vetores de expressão e induzidas por IPTG.
Materiais e Métodos
Regulação da NaAOX em N. aromaticivorans A expressão da NaAOX foi medida por Western
blot, usando um anticorpo para a AOX de S. guttatum
Foram analisadas culturas de N.aromaticivorans em meios com glicose ou lactose, com e sem agitação para modular diferentes níveis de oxigênio
Resultados e Discussão
Atteia, A et al. 2003
Resultados e Discussão
A NaAOX possui 229 aminoácidos; Possui 58% de similaridade com a AOX de A.
thaliana, não incluindo ~134 aminoácidos na porção N-terminal;
Não possui a cisteína regulatória; Pelo tamanho reduzido, deve possuir os atributos
mínimos para uma AOX funcional.
Resultados e Discussão
Aparentemente a indução da construção de alto nível de expressão por IPTG levou ao estresse das células, impedindo a formação de colônias;
Bactérias portando essa construção expressaram a NaAOX em altos níveis quando induzidas em meio LB líquido.
Resultados e Discussão
Resultados e Discussão
Resultados e Discussão
Durante o ciclo de vida, a bactéria é exposta a condições nas quais as oxidases normais são inibidas;
Juntamente com o o Complexo I, a AOX possibilitaria o bombeamento de prótons quando tais oxidases estivessem inibidas;
O aumento dos níveis da NaAOX em condições de baixa concentração de oxigênio, indica que a proteína não atua simplesmente na eliminação do excesso de oxigênio celular;
Resultado e Discussão
Como N. aromaticivorans utiliza muitos compostos como fonte de carbono e energia e a glicose possui maior energia do que a lactose, a NaAOX deve atuar balanceando o metabolismo de carbono e o transporte de elétrons;
A alta similaridade entre a AOX de N. aromaticivorans e a de plantas é um forte indício que o gene tenha sido adquirido diretamente de plantas por transferência horizontal;
Outro indicio forte de transferência horizontal é a existência de espécies do gênero Novosphingobium que têm plantas como habitat.