59152326-Biotecnologia-fundamentos

Copyright2004 by Maria Antonia Malajovich Texto atualizado em 2009

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MARIA ANTONIA MALAJOVICH

BIOTECNOLOGIA PRIMEIRA PARTE: OS FUNDAMENTOSSUMRIOCAPTULO 1. O QUE BIOTECNOLOGIA?A BIOTECNOLOGIA TRADICIONAL A BIOTECNOLOGIA MODERNA AS DEFINIES DE BIOTECNOLOGIA O IMPACTO DA BIOTECNOLOGIA BIOTECNOLOGIA E DESENVOLVIMENTO CRONOLOGIA DE ALGUNS ACONTECIMENTOS MARCANTES NA HISTRIA DA BIOTECNOLOGIA

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CAPTULO 2. AS CLULAS E OS CROMOSSOMOS

A CLULA COMO UNIDADE DOS SERES VIVOS Unidade estrutural Unidade funcional Relao entre as estruturas celulares e sua funo Tcnicas laboratoriais Toda clula deriva de outra preexistente OS CROMOSSOMOS A TEORIA CROMOSSMICA DA HEREDITARIEDADE AS CLULAS E OS CROMOSSOMOS COMO AGENTES BIOLGICOS

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CAPTULO 3. OS MICRORGANISMOSA DIVERSIDADE MICROBIANA As eubactrias As arqueas Os protistas Os fungos Os vrus, na fronteira do vivo e do no vivo AS TCNICAS MICROBIOLGICAS BIOSSEGURANA E BIOSSEGURIDADE OS MICRORGANISMOS COMO AGENTES BIOLGICOS

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CAPTULO 4. AS ENZIMAS E OS ANTICORPOSAS PROTENAS Estrutura As bases de algumas tcnicas laboratoriais eletroforese, espectrometria de massa) AS ENZIMAS A catlise enzimtica Os diversos tipos de enzimas Importncia econmica OS ANTICORPOS A molcula de anticorpo A produo de anticorpos no organismo A produo de anticorpos no laboratrio A utilizao dos anticorpos (Cromatografia,

Pg. 31

CAPTULO 5. OS CIDOS NUCLEICOS E OS GENESOS CIDOS NUCLEICOS

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A DUPLA HLICEO CDIGO GENTICO A AO GNICA

A REGULAO DA AO GNICA Clulas procariticas Clulas eucariticasA GENMICA O genoma humano A genmica brasileira

CAPTULO 6: OS PROCESSOS FERMENTATIVOSOS PROCESSOS FERMENTATIVOS E A INDSTRIA OS MICRORGANISMOS INDUSTRIAIS Noes sobre o metabolismo As linhagens industriais A ESCOLHA DA MATRIA-PRIMA OS PROCESSOS TRADICIONAIS OS PROCESSOS SUBMERSOS Os fermentadores ou biorreatores A mudana de escala A conduo do processo A recuperao do produto

Pg. 53

OS BIOPROCESSOS NA INDSTRIA DE BIOFERTILIZANTES Pg. 63 CAPTULO 7: A CULTURA DE CLULAS E TECIDOSA MICROPROPAGAO DE PLANTAS As etapas Os meios de cultura As diferentes modalidades Melhoramento econservao da biodiversidade vegetal A difuso da tecnologia A CULTURA DE CLULAS ANIMAIS A manipulao in vitro das clulas animais As aplicaes da cultura in vitro de clulas de mamferos

CAPTULO 8: A TECNOLOGIA DO DNA

AS FERRAMENTAS DISPONVEIS AS NUCLEASES OU ENZIMAS DE RESTRIO A ELETROFORESE DO DNA Hibridizao e sondas gnicas A tcnica de Southern O fingerprint A SNTESE E AMPLIFICAO DE DNA Sntese de oligonucleotdeos Sntese de cDNA A reao em cadeia da polimerase O SEQUENCIAMENTO DO DNA OS ARRAYS

Pg. 73

CAPTULO 9: A ENGENHARIA GENTICAO NASCIMENTO DA BIOTECNOLOGIA MODERNA As primeiras experincias Mitos e realidades As bibliotecas de genes A CONSTRUO DE UM MICRORGANISMO RECOMBINANTE Encontrar o gene Inserir o gene Identificar os microrganismos recombinantes A CONSTRUO DE PLANTAS TRANSGNICAS O transgene A transferncia dos genes a clulas vegetais O problema dos marcadores seletivos Do laboratrio ao campo CLULAS E ANIMAIS TRANSGNICOS

Pg. 83

O supermouse Os animais como modelos para a experimentao Os animais como biofbricasO TAMBO FARMACUTICO ARGENTINO

BIBLIOGRAFIA

Pg. 99

CAPTULO 1. O QUE BIOTECNOLOGIA?A BIOTECNOLOGIA TRADICIONALCultivar vegetais, domesticar animais, transformar os alimentos ou aproveitar as propriedades curativas de algumas plantas so atividades que remontam alvorada da humanidade e se desenvolveram com base no conhecimento emprico, ignorando a existncia dos microrganismos ou das leis da hereditariedade. No incio do sculo XIX, a demanda de mo de obra por uma indstria incipiente estimula a migrao da populao do campo para a cidade. Em condies sanitrias cada vez mais degradadas, as doenas e a fome acompanham o homem. Ao mesmo tempo, o progresso exige processos industriais mais eficientes. A compreenso dos fenmenos naturais torna-se indispensvel para responder s necessidades da sociedade. A partir de 1850 surgem novas reas do conhecimento; nascem a Microbiologia, a Imunologia, a Bioqumica e a Gentica. A Qumica Industrial se desenvolve aceleradamente e, tambm, aumenta a interveno da Engenharia Agrcola e da Pecuria no gerenciamento do campo. Em 1914, Karl Ereky, um engenheiro agrcola hngaro, desenvolve um gigantesco plano de criao de sunos visando substituir as prticas tradicionais por uma indstria agrcola capitalista baseada no conhecimento cientfico. Deve-se a Ereky (1919) a primeira definio de biotecnologia, como a cincia e os mtodos que permitem a obteno de produtos a partir de matria-prima, mediante a interveno de organismos vivos. Para ele, a era bioqumica substituiria a era da pedra e do ferro. O sculo XX assiste a um desenvolvimento extraordinrio da cincia e da tecnologia (eletrnica, informtica). Da convergncia entre ambas resultam logros extraordinrios em vrios setores produtivos, onde os seres vivos constituem a base de itens to diversos como a produo de variedades vegetais mais produtivas, a fabricao de novos alimentos, o tratamento do lixo, a produo de enzimas e os antibiticos.

A BIOTECNOLOGIA MODERNAA proposta de Watson e Crick (1953) de um modelo helicoidal para a molcula de DNA representa, sem dvida, um marco fundamental na histria da Biologia Molecular. Mas a divisria entre a Biotecnologia clssica e a Biotecnologia moderna uma srie de experincias realizadas por H. Boyer e S. Cohen que culmina em 1973 com a transferncia de um gene de sapo a uma bactria. A partir desse momento possvel mudar o programa gentico de um organismo transferindo-lhe genes de outra espcie. A importncia e os riscos inerentes nova tecnologia no passaram despercebidos para as pessoas envolvidas. Fato indito na histria, em 1975 os cientistas reunidos em Asilomar (USA) estabeleceram uma moratria em seus trabalhos at serem definidas as condies de segurana adequadas, o que aconteceu pouco tempo mais tarde. Na passagem de uma biotecnologia de laboratrio a uma biotecnologia industrial, a Engenharia Gentica ocupa um lugar de destaque como tecnologia inovadora. Em alguns casos, como os da insulina e do hormnio do crescimento, a inovao consiste em substituir os mtodos de obteno tradicionais. Em outros casos, como o dos anticorpos monoclonais ou do Golden Rice, um arroz com vitamina A, trata-se de produtos inteiramente novos. Entretanto, a manipulao gnica no a nica ferramenta disponvel. A Biotecnologia abrange hoje uma rea ampla do conhecimento que decorre da cincia bsica (biologia molecular, microbiologia, biologia celular, gentica etc.), da cincia aplicada (tcnicas imunolgicas e bioqumicas, assim como tcnicas decorrentes da fsica e da eletrnica), e de outras tecnologias (fermentaes, separaes, purificaes, informtica, robtica e controle de processos). Trata-se de uma rede complexa de conhecimentos onde cincia e tecnologia se entrelaam e complementam.

Copyright Maria Antonia Malajovich

Autora: Maria Antonia Malajovich

AS DEFINIES DE BIOTECNOLOGIAO impacto causado pelas primeiras experincias de Engenharia Gentica estimulou numerosas tentativas de redefinio do campo da Biotecnologia. Mediante a substituio da expresso interveno de organismos vivos por utilizao de processos celulares e moleculares tratou-se de diferenciar a Biotecnologia clssica da moderna. Porm, devido enorme difuso das tcnicas de manipulao gnica, elas acabam se superpondo, e, fora do contexto histrico, difcil distinguir o limite entre ambas. Por outro lado, como a definio de um setor de atividades depende dos interesses dos grupos envolvidos, muitas vezes reflete a viso dos setores profissionais predominantes. Por isso, se revisitarmos os textos da dcada de 1980, anos em que a expresso biotecnologia se expande, encontraremos mais de uma dzia de definies diferentes do termo. Levantamos, entre as definies encontradas com maior frequncia, as seguintes: OECD - Organisation for Economic Co-Operation and Development: A aplicao dos princpios da cincia e da engenharia no tratamento de matrias por agentes biolgicos na produo de bens e servios (1982). OTA Office of Technology Assessment: Biotecnologia, de uma forma abrangente, inclui qualquer tcnica que utiliza organismos vivos (ou partes deles) para obter ou modificar produtos, melhorar plantas e animais, ou desenvolver microrganismos para usos especficos (1984). EFB - European Federation of Biotechnology: Uso integrado da bioqumica, da microbiologia e da engenharia para conseguir aplicar as capacidades de microrganismos, clulas cultivadas animais ou vegetais ou parte dos mesmos na indstria, na sade e nos processos relativos ao meio ambiente (1988). E.H. Houwink: o uso controlado da informao biolgica (1989). Biotechnology Industry Organization: em sentido amplo, Biotecnologia "bio" + "tecnologia", isto o uso de processos biolgicos para resolver problemas ou fazer produtos teis (2003).

Observa-se que, com o tempo, o conceito ganha uma expresso mais simples. As definies mais recentes no fazem mais referncia aos processos tecnolgicos envolvidos; talvez porque, alm de complexos e diversos, estes evoluam muito rapidamente. Neste texto consideraremos a biotecnologia de uma maneira ampla, definida como uma atividade baseada em conhecimentos multidisciplinares, que utiliza agentes biolgicos para fazer produtos teis ou resolver problemas. Esta definio suficientemente abrangente para englobar atividades to variadas como as de engenheiros, qumicos, agrnomos, veterinrios, microbiologistas, bilogos, mdicos, advogados, empresrios, economistas etc.

Figura 1.1: O campo da Biotecnologia.

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BIOTECNOLOGIA / Captulo 1: O que Biotecnologia?

O IMPACTO DA BIOTECNOLOGIAJ no se trata de promessas ou de perspectivas futuras; os produtos e processos biotecnolgicos fazem parte de nosso dia a dia, trazendo oportunidades de emprego e investimentos. Trata-se de plantas resistentes a doenas, plsticos biodegradveis, detergentes mais eficientes, biocombustveis, e tambm processos industriais menos poluentes, menor necessidade de pesticidas, biorremediao de poluentes, centenas de testes de diagnstico e de medicamentos novos. Tabela 1.1: Produtos e servios de origem biotecnolgica, em diferentes setores. SETORES ENERGIA INDSTRIA MEIO AMBIENTE AGRICULTURA TIPOS DE PRODUTOS OU SERVIOS Etanol, biogs e outros combustveis (a partir de biomassa). Butanol, acetona, glicerol, cidos, vitaminas etc. Numerosas enzimas para outras indstrias (txtil, de detergentes etc.). Recuperao de petrleo, biorremediao (tratamento de guas servidas e de lixo, eliminao de poluentes). Adubo, silagem, biopesticidas, biofertilizantes, mudas de plantas livres de doenas, mudas de rvores para reflorestamento. Plantas com caractersticas novas incorporadas (transgnicas): maior valor nutritivo, resistncia a pragas e condies de cultivo adversas (seca, salinidade, etc.). Embries, animais com caractersticas novas (transgnicos), vacinas e medicamentos para uso veterinrio e humano. Panificao (pes e biscoitos), laticnios (queijos, iogurtes e outras bebidas lcteas), bebidas (cervejas, vinhos e bebidas destiladas) e aditivos diversos (shoyu, monoglutamato de sdio, adoantes etc.); protena de clula nica (PUC) para raes, alimentos de origem transgnica com propriedades novas. Antibiticos e medicamentos para diversas doenas, hormnios, vacinas, reagentes e testes para diagnstico, tratamentos novos etc.

PECURIA ALIMENTAO

SADE

BIOTECNOLOGIA E DESENVOLVIMENTOPor se tratar de uma coleo de tecnologias diversas, o uso das biotecnologias no se restringe necessariamente aos pases desenvolvidos. Existe um espao que os pases emergentes podem ocupar, em funo de suas riquezas naturais, desde que existam prioridades econmicas e polticas definidas claramente. A condio fundamental contar com instituies competentes que formem uma massa crtica de pesquisadores e pessoal tcnico treinado. A China e a ndia contam hoje com uma indstria biotecnolgica avanada e diversificada. Assim como a Amrica Latina, onde esta se concentra principalmente na Argentina, no Brasil, no Chile, na Colmbia, em Cuba e no Mxico. Pases como Uruguai e Venezuela tambm tm atividade em algumas reas, assim como, em menor escala, Equador, Costa Rica, Paraguai, Peru e Bolvia. Na regio, umas 500 empresas incidem em vrios setores: meio ambiente e indstria, agroalimentos e pecuria, sade animal e humana. No entanto, a Biotecnologia suscita ainda opinies e sentimentos controversos. Enquanto alguns setores a percebem como uma tecnologia baseada em um slido conhecimento cientfico, para outros se trata de uma atividade antinatural e perigosa. O enfrentamento de partidrios e opositores ocorre com menos frequncia no terreno das razes que no das paixes, sejam elas polticas, religiosas ou ideolgicas. Ao discutir se a biotecnologia progressista ou reacionria, boa ou ruim, se esquece que o que caracteriza uma tecnologia o uso que fazemos dela.

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Produtos e processos inimaginveis trinta anos atrs entram em nosso cotidiano antes que os alicerces cientficos e tecnolgicos correspondentes se insiram em nossa cultura, atravs de uma divulgao ampla que atinja tambm o sistema educativo em todos os seus nveis. No existe possibilidade alguma de construir uma sociedade moderna se os seus integrantes ignorarem os aspectos mais gerais de cincia e tecnologia. O desconhecimento aumenta o risco de rejeitar tecnologias promissoras, capazes de abrir perspectivas novas, com vistas a um desenvolvimento sustentvel em reas to crticas como a sade, a produo de alimentos, a energia e o meio ambiente. A proposta deste livro revisar os fundamentos das biotecnologias e mostrar como esses se aplicam em diversos setores produtivos da sociedade, destacando como exemplos alguns empreendimentos latino-americanos bem sucedidos. Esperamos que ele seja de ajuda para todos os que nos preocupamos com os alcances desta fascinante (r)evoluo tecnolgica.

CRONOLOGIA DE ALGUNS ACONTECIMENTOS MARCANTES NA HISTRIA DA BIOTECNOLOGIADATA ACONTECIMENTOS FUNDAMENTAIS

ANTIGUIDADE

Preparao e conservao de alimentos e bebidas por fermentao (po, queijo, cerveja, vinho e vinagre); cultivo de plantas (batata, milho, cevada, trigo etc.); domesticao de animais; tratamento de infeces (com produtos de origem vegetal tais como p de crisntemo e derivados de soja com fungos).

IDADE MDIA Sculo XII IDADE MODERNA Sculo XVI Sculo XVII Sculo XVIII Cronistas registram a colheita de algas para alimentao, nos lagos de Mxico, pelos astecas. Incio da produo comercial de cerveja; extrao de metais por ao microbiana na Espanha; cultivo de fungos na Frana; Hooke descobre a existncia de clulas (1665). Invento da mquina a vapor (1752). Entre 1750 e 1850, aumenta o cultivo de leguminosas na Europa e se difunde a prtica de rotao de cultivos que aumenta a produtividade e melhora o uso da terra. Destilao do lcool.

IDADE CONTEMPORNEA 1797 1809 1835 a 1855 1863 a 1886 Jenner inocula uma criana com um vrus que o protege contra a varola. Appert utiliza o calor para esterilizar e conservar comida, processo que ser utilizado nas campanhas napolenicas. Schleiden, Schwann e Virchow enunciam a teoria celular. Pasteur inventa um processo para conservar alimentos sem alterar suas propriedades organolpticas (Pasteurizao, 1863), derruba a teoria da abiognese (1864), investiga as doenas do bicho-da-seda (1865), identifica a levedura como o agente responsvel pela fermentao alcolica (1876), usa microrganismos atenuados para obter vacinas contra o antraz e a clera (1881), faz os primeiros testes de uma vacina contra a raiva (1881). Paralelamente, Koch inicia o desenvolvimento de tcnicas fundamentais para o estudo dos microrganismos (1876), e enuncia quatro postulados sobre os agentes infecciosos como causa de doenas. Em 1865 Mendel apresenta o seu trabalho Experincias de hibridizao em plantas.

1887

Inaugurao em Paris do Instituto Pasteur.

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1892 1897 1899 1900 1905 1906 1910 1912 a 1914 1915 1916 1918 1919 1927 1928 1933 1936 1938 1940 a 1950 1944 1951 1953 1959 1960 1961 1962 1967 1968 1973

1975

1976

Descoberta do vrus do mosaico do tabaco; introduo do trator na agricultura. Bchner mostra que enzimas extradas da levedura podem transformar acar em lcool. Primeiro transplante de um rgo: o rim de um cachorro a outro cachorro. Redescobrimento das leis da hereditariedade, j enunciadas por Mendel em 1865, porm esquecidas. O primeiro transplante de crnea se realiza com sucesso; isto porque a crnea no tem antgenos. Ehrlich descobre o primeiro agente quimioterpico, chamado Salvarsan, que ser utilizado contra sfilis. Em Manchester, na Inglaterra, comeam a ser introduzidos os sistemas de purificao de esgoto baseados na atividade microbiana. Rhm obtm a patente de uma preparao enzimtica para a lavagem de roupas; Weizmann consegue a produo de acetona e butanol por microrganismos. Morgan publica Mechanism of Mendelian Heredity. Imobilizam-se as enzimas, uma tcnica que facilita sua utilizao em processos industriais. Morrem de gripe espanhola mais de vinte milhes de pessoas, um nmero de vtimas superior ao da Primeira Guerra Mundial. Constroemse biodigestores para a produo de metano (China e ndia). O engenheiro agrcola hngaro Ereky utiliza pela primeira vez a palavra biotecnologia. Muller descobre que os raios X causam mutaes. F. Griffith descobre a transformao, isto a transferncia de informao gentica de uma linhagem bacteriana a outra. Comercializao do milho hbrido, isto de sementes de um milho mais produtivo. Obteno de cido ctrico por fermentao. Na Frana, produo comercial de um biopesticida (Bacillus thuringiensis). Avanos na mecanizao do trabalho agrcola. Produo em grande escala da penicilina (descoberta por Fleming em 1928, desenvolvida por Florey e Chain). Inseminao artificial de gado utilizando smen congelado. Descoberta da presena de genes saltatrios no milho por Brbara Mc Clintock. Watson e Crick propem um modelo da estrutura do ADN Reinart regenera plantas de cenoura a partir de uma cultura de clulas (calo). Aumento da produo de cido lctico, cido ctrico, acetona e butanol por via fermentativa. Descoberta do cdigo gentico. Desenvolvimento de uma protease alcalina para uso em sabes para a lavagem de roupas pela empresa dinamarquesa Novo. Plantio de novas variedades de trigo mais produtivas, no Mxico, dando incio ao que ser chamado de Revoluo Verde. Primeiro transplante de corao, na frica do Sul. O paciente sobrevive 18 dias. Produo industrial de aminocidos utilizando enzimas imobilizadas. Havendo desenvolvido tcnicas de corte e reunio do DNA, Cohen e Boyer transferem um gene a um organismo de outra espcie. Lanado no Brasil o programa de produo de lcool a partir de biomassa (Prlcool) Khler e Milstein desenvolvem a tecnologia de hibridomas e obtm anticorpos monoclonais. A empresa Novo produz xarope com alto contedo de frutose por via enzimtica como adoante alternativo sacarose. A Conferncia de Asilomar pede ao National Institute of Health (NIH) que sejam estabelecidas normas para a regulao dos experimentos com DNA-recombinante, o que acontecer meses mais tarde. Utilizao da tcnica de hibridizao molecular no diagnstico pr-natal da alfa talassemia.

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1978

1979 1980

1981 1982

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1986

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1988

1989 1990

1992

Genentech, Inc., a primeira empresa biotecnolgica, fundada um ano antes por Boyer e Swanson, obtm a protena somatostatina (hormnio de crescimento) mediante a tecnologia do DNA-recombinante. Nasce na Inglaterra Louise Brown, o primeiro beb de proveta. Produo do hormnio de crescimento humano, utilizando a tecnologia do DNA-recombinante. A Suprema Corte de Justia dos Estados Unidos aprova o princpio de patentes para as formas de vida de origem recombinante. As primeiras patentes so de Chakrabarty, para um microrganismo para biorremediao de petrleo, e de Cohen e Boyer, pelo processo de 1973. Mullis inventa a tcnica da Reao em Cadeia de Polimerase (PCR) cuja patente ser obtida por Cetus, Inc. em 1985 e vendida em 1991 a Hoffman-LaRoche, Inc. por 300 milhes de dlares. Obteno da primeira planta geneticamente modificada. Obteno da primeira linhagem de clulas-tronco de camundongo. A insulina humana de origem recombinante da Genentech, Inc. comercializada. Uma licena ser obtida mais tarde pela empresa Ely Lilly, que a vender com o nome de Humulina. A primeira vacina de DNA-recombinante para o gado comercializada na Europa. Realizam-se as primeiras experincias de Engenharia Gentica em plantas (petnia). Syntex Corporation recebe a aprovao da Food and Drug Administration (FDA) de um teste para Chlamydia trachomatis baseado na utilizao de anticorpos monoclonais. Isolado o vrus HIV no Instituto Pasteur (Frana) e no NIH (National Institute of Health, Estados Unidos). Jeffrey introduz a tcnica do Fingerprint (impresses digitais), que, um ano depois, ser utilizada pelos tribunais para a identificao de suspeitos. Clonagem e sequenciamento do genoma do HIV pela empresa Chiron Corp. A Environmental Protection Agency (EPA) dos Estados Unidos aprova a liberao de plantas de tabaco transgnicas. Um grupo de especialistas em segurana em Biotecnologia da Organizao para a Cooperao Econmica e o Desenvolvimento (OECD) declara que a previsibilidade das mudanas genticas obtidas por Engenharia Gentica frequentemente maior que a correspondente s tcnicas tradicionais, e que os riscos associados com organismos transgnicos podem ser avaliados do mesmo modo que os riscos associados aos outros organismos. Aprovada a primeira vacina biotecnolgica para uso humano, trata-se de Recombivax-HB, contra a hepatite B. Advanced Genetic Sciences libera em campo bactrias DNArecombinante (Frostban) que inibem a formao de gelo nos cultivos de morango, na Califrnia; a FDA aprova o fator ativador de plasminognio, obtido por engenharia gentica, para o tratamento de ataques cardacos. A Universidade de Harvard obtm a patente de um rato transgnico desenvolvido especialmente para o estudo do cncer; na mesma dcada, os europeus obtero a patente de outro rato transgnico, sensvel a substncias carcinognicas. Genencor International Inc. obtm a patente de um processo que permite obter enzimas (proteases) resistentes a alvejantes (processo bleach) para a fabricao de sabes para a lavagem de roupa. Com a criao do National Center for Human Genome Research se inicia o mapeamento do genoma humano. Primeira experincia de terapia gnica para uma doena rara (ADA) em uma menina de quatro anos. Pfizer comercializa Chy-Max TM, uma enzima de origem recombinante para a preparao de queijos. GenPharm International, Inc. consegue uma vaca transgnica que produz no leite protenas humanas para alimentao infantil. A Universidade da Califrnia (UCSF) e a Universidade de Stanford contabilizam 100 patentes relativas ao DNA-recombinante. Uma tcnica, elaborada por cientistas americanos e britnicos, permite testar anormalidades como a fibrose cstica e a hemofilia em embries in vitro. A FDA declara que os alimentos de origem transgnica no demandam uma regulao especial.

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1993 1994 1995 1996 1997 1998

1999 2000

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2003 2004

2005 2006

2007 2008

2009

Aprovada a utilizao do hormnio de crescimento bovino rBGH/rBST, produzido por Monsanto Co., para aumentar da produo de leite. Lanamento no mercado do tomate FlavSavr, que, devido inativao de um gene, amadurece na planta. Decifrado o primeiro genoma de uma bactria, Haemophilus influenzae. Sequenciado o primeiro genoma de um organismo eucarionte, a levedura Saccharomyces cerevisiae. Desenvolve-se o primeiro GeneChip (Stanford, Affymetrix). Nascem Dolly, uma ovelha clonada, e, meses mais tarde, uma segunda ovelha, Polly, clonada e geneticamente modificada. Os cultivos transgnicos so introduzidos em vrios pases. Contabilizam-se mais de 1.500 empresas de Biotecnologia nos Estados Unidos e mais de 3.000 no mundo. Clulas-tronco embrionrias so utilizadas para regenerar tecidos. Sequenciamento do primeiro genoma animal, o verme Caenorrabditis elegans. Isolada a primeira linhagem de clulas-tronco embrionrias humanas. Sequenciamento do primeiro cromossomo humano. Pesquisadores descobrem que as clulas-tronco podem ser induzidas a se diferenciar em diversos tipos celulares. O rascunho do sequenciamento do genoma humano anunciado simultaneamente por Collins, do Consrcio do Genoma Humano, e Venter, da Celera Inc. Sequenciados tambm o genoma da mosca Drosophila melanogaster, o primeiro genoma de uma planta (Arabidopsis thaliana) e, no Brasil, o de uma bactria que ataca os ctricos (Xylella fastidiosa). O rascunho do sequenciamento do Genoma Humano publicado simultaneamente nas revistas Science e Nature. Sequenciamento do genoma de plantas de interesse agronmico para os pases em desenvolvimento (arroz, banana). Sequenciamento do genoma de bactrias de importncia agronmica. Obteno de clulas sanguneas a partir de clulas-tronco embrionrias. Completados o rascunho do proteoma funcional da levedura e o sequenciamento do genoma do agente e do vetor transmissor da malria. Identificam-se mais de 200 genes envolvidos na diferenciao das clulas-tronco. Descoberta da participao de molculas de RNA na regulao de vrios processos celulares. Em diversos pases inicia-se a utilizao de clulas-tronco adultas para o tratamento experimental de diversas doenas (leucemia, mal de Chagas, diabetes e anemia falciforme). A venda, como mascote, do GloFish, um peixe transgnico que brilha na escurido, originalmente criado para detectar poluentes. Clonagem de vrios tipos de animais e de espcies ameaadas de extino. Sequenciado o genoma do frango. Um grupo de pesquisadores coreanos anuncia a obteno de uma linhagem de clulas-tronco embrionrias pluripotentes, aps uma transferncia nuclear; descobrindo-se mais tarde que este resultado era uma fraude. Novos medicamentos e testes de diagnsticos entram no mercado. A Alemanha aprova os primeiros cultivos de plantas transgnicas. Publicado o genoma da vaca. Obteno de clulas-tronco a partir de clulas da pele. Videiras geneticamente modificadas so testadas na frica do Sul. O grupo de pesquisadores liderado por S. Yamanaka consegue induzir a pluripotencialidade celular introduzindo, mediante um vetor viral, quatro genes em clulas somticas murinas. As autoridades europeias de segurana alimentar concluem que os genes marcadores de resistncia aos antibiticos no apresentam riscos relevantes para a sade humana ou animal nem para o meio ambiente. Pesquisadores japoneses desenvolvem a primeira rosa azul, geneticamente modificada. Cultivam-se plantas transgnicas em 25 pases, includos sete da Unio Europeia. Yamanaka anuncia a obteno de clulas pluripotentes induzidas utilizando um plasmdeo como vetor. Pesquisadores canadenses e britnicos conseguem reprogramar clulas da pele, murinas e humanas, utilizando um transposon como vetor de um pacote de quatro genes.

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CAPTULO 2. AS CLULAS E OS CROMOSSOMOSA CLULA COMO UNIDADE DOS SERES VIVOSUNIDADE ESTRUTURALA clula a unidade estrutural dos seres vivos. Trate-se de bactrias, amebas, espermatozoides ou neurnios, todas as clulas so formadas por gua, ons inorgnicos e molculas orgnicas (protenas, carboidratos, lipdios e cidos nucleicos). E todas elas apresentam uma membrana plasmtica que separa o citoplasma do meio externo e permite o intercmbio de molculas entre ambos. As clulas procariticas se encontram exclusivamente no Reino Monera. Pequenas (0,001 a 0,005 mm) e com requerimentos nutricionais simples, estas clulas se multiplicam rapidamente. A informao gentica se encontra em um cromossomo circular formado por uma molcula de DNA e associado a uma invaginao da membrana plasmtica (mesossomo); pequenas molculas circulares adicionais (plasmdeos) podem tambm estar presentes. Numerosos ribossomos asseguram a sntese proteica (Figura 2.1). Bem mais complexa a estrutura das clulas eucariticas, presentes nos quatro Reinos restantes (Protista, Fungo, Planta e Animal). Com um tamanho variando entre 0,01 e 0,10 mm, estas clulas so dez vezes maiores que as procariticas. A presena de compartimentos diferenciados, ou organelas, que cumprem atividades especficas, resulta em uma subdiviso do trabalho que garante a eficincia do funcionamento celular (Figura 2.2). Figura 2.1: Representao esquemtica de uma clula procaritica.

O citoplasma percorrido por um sistema de membranas, o retculo endoplasmtico, que est associado aos ribossomos e, por conseguinte, sntese de protenas. Processados no aparelho de Golgi, os produtos celulares so secretados ou distribudos em outras estruturas (lisossomos, membrana celular). O metabolismo energtico est associado a organelas citoplasmticas, complexas e rodeadas de membranas (mitocndrias, cloroplastos e peroxissomos). Um citoesqueleto, formado por tbulos e filamentos proteicos, mantm a forma da clula, alm de assegurar o transporte interno das organelas e os movimentos celulares.



A informao gentica est distribuda em cromossomos, cada um deles formado por uma molcula linear de DNA associada a protenas. Os cromossomos e o nuclolo se encontram no ncleo, que funciona como um centro de controle celular. A membrana nuclear, um envoltrio com poros que separa o ncleo do citoplasma, permite o intercmbio de substncias entre ambos. Apesar de ter uma organizao muito parecida, as clulas animais diferem das clulas vegetais em alguns aspectos. Nas clulas vegetais encontramos uma parede celular ao redor da membrana plasmtica; o citoplasma contm cloroplastos, onde ocorre a fotossntese, e grandes vacolos, onde se armazenam substncias e degradam macromolculas. Nenhuma dessas estruturas se observa nas clulas animais; estas tm um centrolo que falta nas clulas vegetais. Figura 2.2: Representaes esquemticas da estrutura celular eucaritica, animal e vegetal.

Clula animal

Clula vegetal

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BIOTECNOLOGIA / Captulo 2: As clulas e os cromossomos

UNIDADE FUNCIONALA clula tambm a unidade funcional de um organismo. O citoplasma uma soluo viscosa onde continuamente ocorrem reaes de sntese e degradao de substncias, consumindo ou liberando energia. Estas reaes constituem o que denominamos metabolismo. As reaes metablicas so facilitadas por protenas com atividade cataltica, denominadas enzimas. Assim como as protenas estruturais, as enzimas se sintetizam nos ribossomos, que so organelas citoplasmticas pequenas no membranosas. A estrutura das protenas depende da informao gentica codificada no cido desoxirribonucleico (DNA) e transcrita no cido ribonucleico (RNA), que a leva do ncleo at o citoplasma. As semelhanas de estrutura e funcionamento celulares decorrem de uma origem evolutiva comum, aproximadamente 3,8 milhes de anos atrs. Os dois tipos celulares que reconhecemos hoje, as clulas procariticas e as eucariticas, apareceram entre um e um milho e meio de anos mais tarde.

RELAO ENTRE AS ESTRUTURAS CELULARES E SUA FUNOTabela 2.1: A funo e a distribuio das estruturas celulares.ESTRUTURA PAREDE CELULAR MEMBRANA PLASMTICA FUNO Manuteno da forma e proteo da clula. Manuteno da estabilidade do meio intracelular; controle das trocas entre a clula e o meio extracelular. Controle do fluxo de substncias entre o ncleo e o citoplasma. Controle da estrutura e do funcionamento celular. Formao de ribossomos. Formao de clios e flagelos; participao na diviso celular. Sntese de protenas. Sntese de protenas. Sntese de lipdios; armazenamento e inativao de substncias. Secreo celular. Digesto intracelular. Equilbrio osmtico e armazenamento. Respirao celular aerbia. Fotossntese. Manuteno da forma celular; contrao; ancoragem de organelas. Ausente Ausente Ausente Presente Ausente Presente Presente Presente Ausente CLULA BACTERIANA Presente ou ausente CLULA ANIMAL Ausente Presente CLULA VEGETAL Presente

CARIOTECA ou MEMBRANA NUCLEAR CROMOSSOMO(S) NUCLOLO(S) CENTROLOS

Presente

nico e circular; apenas DNA. Ausente Ausente

Mltiplos e lineares; ADN e protenas. Presente Presente Ausente

RIBOSSOMOS RETCULO ENDOPLASMTICO RUGOSO RETCULO ENDOPLASMTICO LISO

Presente

Ausente

Presente

COMPLEXO DE GOLGI LISOSSOMOS VACOLO CENTRAL MITOCNDRIAS CLOROPLASTOS CITOESQUELETO

Presente

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TCNICAS LABORATORIAISO estudo das clulas se v facilitado por um conjunto de tcnicas laboratoriais, tais como: Tcnicas microscpicas que permitem uma visualizao detalhada da clula: Microscopia ptica, que se utiliza para observar os cortes de tecidos. Geralmente, estes so fixados (lcool, cido actico, formaldedo) e tingidos com corantes que reagem com as protenas ou com os cidos nucleicos, aumentando o contraste da imagem. Microscopia de contraste de fase, que transforma as diferenas de espessura ou de densidade do fragmento observado em diferenas de contraste. Microscopia fluorescente, que associa anticorpos especficos a um reagente como o PVF (protena verde fluorescente de medusa), de forma a marcar as molculas e visualizar sua distribuio nas clulas. Microscopia confocal, que combina a microscopia fluorescente com a anlise eletrnica da imagem, fornecendo uma imagem tridimensional. Microscopia eletrnica, que permite a observao em um plano de cortes tingidos com sais de metais pesados (microscopia de transmisso) e a observao tridimensional de clulas (microscopia de varredura). Microscopia de tunelamento, com os diversos tipos de microscpios de varredura por sonda (SPM, do ingls scanning probe microscope) que, alm de fornecer uma imagem de molculas e tomos, permitem medies e a manipulao de molculas e tomos.

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Tcnicas fsicas como a centrifugao diferencial (ultracentrifugao, centrifugao em gradiente) para separar os componentes celulares para estudos bioqumicos posteriores. Tcnicas instrumentais que possibilitam a contagem de clulas e a separao de populaes celulares (cell sorter) ou de cromossomos (flow sorter). Tcnicas de cultura de clulas com objetivos diversos.

TODA CLULA DERIVA DE OUTRA PREEXISTENTEAssim como uma planta se forma a partir de outra planta e um animal de outro animal, toda clula deriva de outra preexistente. Este conceito, enunciado por R. Virchow em 1855, no foi plenamente aceito at dez anos mais tarde, quando L. Pasteur mostrou experimentalmente que a proliferao de microrganismos em um meio orgnico estril se deve contaminao deste com os microrganismos presentes no ar, que, ao encontrar um meio propcio, se multiplicam rapidamente. Todo organismo multicelular se forma a partir da multiplicao de uma nica clula-ovo ou zigoto. As contribuies dos genes maternos e paternos para o desenvolvimento do embrio no so idnticas (imprinting). As clulas embrionrias se diferenciam, formando mais de 200 tipos de clulas em animais, e um pouco menos nos vegetais. Os diferentes tipos celulares cumprem funes especficas que, integradas, asseguram a unidade do organismo. Nos vegetais, a persistncia de tecidos embrionrios totipotentes (meristemas) na planta adulta permite o crescimento e a regenerao durante a vida toda do organismo. Em condies apropriadas, clulas especializadas podem reverter a um estado no diferenciado e regenerar um organismo completo e diferenciado. Nessas propriedades se fundamenta a propagao de plantas in vitro. Nos animais superiores, a totipotncia se restringe s clulas do embrio com menos de quatro dias, que so as nicas capazes de regenerar um organismo inteiro. No entanto, no embrio de mais de quatro dias, algumas clulas internas do blastcito (clulas-tronco embrionrias) podem originar todos os tecidos do organismo, sendo consideradas pluripotentes (Figura 2.3).

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Figura 2.3: As clulas-tronco embrionrias.As clulas-tronco podem ser extradas do blastcito com 5 a 7 dias e cultivadas in vitro; colocadas em condies experimentais adequadas, diferenciam-se nos distintos tipos celulares.

Tambm tecidos adultos (medula ssea, sangue, crnea e retina, polpa dentria, fgado, pele, trato digestivo e pncreas) apresentam clulas-tronco. Elas podem permanecer nos tecidos, multiplicando-se durante longos perodos de tempo sem que ocorra a diferenciao. No entanto, em determinadas condies fisiolgicas, estas clulas-tronco adultas originam clulas especializadas de vrios tipos, assegurando a manuteno e o reparo do tecido onde se encontram. Um nico tipo de clula-tronco multipotente da medula ssea, por exemplo, gera todas as clulas sanguneas (hemcias, leuccitos e plaquetas). Clulas-tronco unipotentes se diferenciam em uma nica linhagem celular como, por exemplo, os queratincitos da pele. Por ser mais fceis de conseguir, as clulas-tronco adultas encontraram rapidamente aplicaes teraputicas promissoras. No aconteceu o mesmo com as clulas-tronco embrionrias. Estas podem ser obtidas seja a partir de um embrio, obtido por transferncia de um ncleo a um ovcito anucleado, seja a partir dos embries supernumerrios congelados nas clnicas de fertilizao assistida. Os dois mtodos suscitaram grandes debates ticos em torno de quem forneceria os ovcitos e do status do embrio. A polmica deveria esmorecer com o desenvolvimento de uma tecnologia que permite obter, a partir de clulas somticas, a obteno de clulas iPS (do ingls, induced pluripotent stem cells) com propriedades equivalentes s das clulas-tronco embrionrias. A induo de pluripotencialidade mediante a insero de alguns genes em clulas adultas um passo importante para acabar com a necessidade de dispor de embries congelados. Entender os mecanismos que controlam o crescimento e a diferenciao celular um dos maiores desafios atuais, porque as clulas-tronco possibilitaro novos tratamentos de regenerao celular para doenas cardacas, diabetes e doena de Parkinson. A tecnologia de reprogramao celular se desenvolve rapidamente, aumentando nosso conhecimento sobre o controle gentico da diferenciao e abrindo uma nova senda para a implementao de testes, medicamentos e tratamentos novos.

OS CROMOSSOMOSCada cromossomo est formado por um filamento de DNA enrolado, a espaos regulares, sobre protenas (histonas). Durante a maior parte do ciclo celular, os cromossomos se encontram distendidos, formando uma rede de filamentos finos (cromatina). Na diviso celular, a cromatina se condensa, possibilitando a observao microscpica dos cromossomos. Do ponto de vista morfolgico, estes se caracterizam pelo tamanho e a posio do centrmero, uma constrio que divide o cromossomo em dois braos.

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O nmero de cromossomos n constante em todos os indivduos de uma mesma espcie; n = 4 em Drosophila melanogaster e n = 23 no homem, por exemplo. Como nas clulas somticas os cromossomos se encontram sempre em pares, na espcie humana o nmero de cromossomos (2n) de 46, sendo que um par determina o sexo. Os cromossomos sexuais so idnticos na mulher (46, XX) e diferentes no homem (46, XY). Em outras espcies, a determinao do sexo segue mecanismos diversos. Um pouco antes da diviso de uma clula, os cromossomos se duplicam, de maneira que cada uma das clulas filhas recebe 2n cromossomos. A mitose mantm constante o nmero de cromossomos nas clulas somticas dos indivduos de uma mesma espcie. J nas clulas reprodutivas, a meiose reduz a n o nmero de cromossomos; na fecundao, a fuso dos gametas ir restaurar o nmero n caracterstico da espcie. Durante a meiose, o entrecruzamento dos cromossomos permite a permuta e recombinao dos genes (Figura 2.4). Durante a formao dos gametas, erros na disjuno dos cromossomos podem dar origem a indivduos com frmulas cromossmicas alteradas. Na sndrome de Down, por exemplo, a pessoa apresenta geralmente um cromossomo 21 adicional. (mulheres 47, XX + 21; homens 47, XY + 21). Estima-se que a percentagem de recm-nascidos com alguma anomalia cromossmica estaria em torno de 0,85%, dos quais 0,65% apresentariam algum sintoma. Alteraes cromossmicas tambm podem ser relacionadas com alguns tipos de cncer. Na leucemia mieloide crnica, por exemplo, se observa a translocao recproca de dois pedaos dos cromossomos 9 e 22. De um modo geral, frequente encontrar alteraes no nmero de cromossomos das clulas cancerosas. Figura 2.4: Mitose e meiose.Durante a meiose, a permuta de fragmentos cromossmicos homlogos possibilita a recombinao dos genes.

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A TEORIA CROMOSSMICA DA HEREDITARIEDADEEm 1865, Gregor Mendel apresentou seu trabalho Experincias de hibridizao em plantas; este reunia os resultados experimentais realizados com ervilhas (Pisum sativum), durante sete anos, no jardim do monastrio Agostino de Brno (Morvia). Apesar de passar quase despercebido, o trabalho acabou sendo distribudo por vrias bibliotecas da Europa e Amrica, graas a sua publicao um ano mais tarde nos Anais da Sociedade de Histria Natural. No texto figuram algumas generalizaes. Conhecida como Primeira Lei de Mendel, Lei de Segregao ou Monoibridismo, a primeira delas se refere segregao dos fatores (alelos) de um par (um gene) na formao de gametas. A segunda, que conhecida como Segunda Lei de Mendel, Lei de Segregao Independente ou Diibridismo, se refere segregao dos fatores (alelos) de dois ou mais pares (dois ou mais genes) independentes na formao de gametas. Em 1900, depois de chegar de maneira independente a concluses semelhantes, os pesquisadores K. Correns, E. Von Tschermak e H.de Vries redescobriram nas bibliotecas o trabalho de Mendel. Nesse intervalo de 35 anos tinha sido descrita a diviso celular (mitose, 1875; meiose, 1890); o prximo passo correspondeu a Sutton e Boveri (1902), sugerindo que os fatores hereditrios de Mendel estariam nos cromossomos. A confirmao desta hiptese decorreu dos trabalhos de T.H.Morgan e sua brilhante equipe na Universidade de Columbia (Nova York), com a mosca da fruta, Drosophila melanogaster (Figura 2.5). Figura 2.5: Drosophila melanogaster, a mosca do vinagre.

Em 1910, depois de uma srie de cruzamentos e de anlises estatsticas, Morgan mostrou que a herana da cor branca do olho do mutante white est associada transmisso do cromossomo X, que determina o sexo. Morgan e seus colaboradores identificaram numerosos outros mutantes de Drosophila melanogaster com um padro mendeliano de hereditariedade (Figura 2.4). Alm de moscas com olhos brancos em vez de vermelhos, encontraram outras com asas curtas em vez de longas, com corpo de cor marrom ou preta em vez de amarela etc. Os genes correspondentes se classificam em quatro grupos de ligao, sendo que cada um deles est associado a um dos quatro pares de cromossomos da Drosophila. Como durante a meiose se produzem permutas entre segmentos cromossmicos, nos cruzamentos aparecem indivduos recombinantes, isto , com outras combinaes gnicas diferentes das previstas pelas leis mendelianas. A partir dos dados obtidos em milhares de cruzamentos sobre a recombinao dos genes de um mesmo grupo de ligao chega-se a estabelecer a distncia gentica entre estes. Com a descoberta de clulas com cromossomos gigantes (politnicos) nas glndulas salivares das larvas de Drosophila, comearam os primeiros trabalhos de mapeamento, associando os dados genticos aos dados fsicos. A observao microscpica das bandas nos cromossomos mostrou com enorme riqueza de detalhes uma sucesso consistente de bandas largas e estreitas. Da associao entre os mtodos genticos e os mtodos citolgicos surgiram os primeiros mapas fsicos, associando uma regio cromossmica a cada gene.

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Das descobertas de Morgan e sua equipe, nasce a Teoria do Gene, segundo a qual: Os caracteres de um indivduo correspondem a elementos pares, os genes. Os genes esto ligados uns aos outros nos cromossomos, formando um determinado nmero de grupos de ligao. Os genes de cada par se separam durante a gametognese, de acordo com a Primeira Lei de Mendel e, em consequncia, cada gameta fica contendo apenas um conjunto de genes (Figura 2.5). Os genes pertencentes a grupos de ligao diferentes segregam independentemente, de acordo com a Segunda Lei de Mendel (Figura 2.6). Entre os elementos pertencentes a cada grupo de ligao, ocorre uma troca ordenada chamada permuta ou crossing-over, que leva recombinao dos genes (Figura 2.4). A frequncia da permuta fornece a prova da linearidade dos genes em cada grupo de ligao e permite determinar sua posio relativa.

Figura 2.5: Monoibridismo.A cor do corpo da Drosophila depende de um gene, localizado no cromossomo III, com dois alelos (e = corpo preto ou ebony, e+= corpo amarelo). O cruzamento entre duas linhagens puras de moscas que diferem pela cor do corpo (amarelo ou preto) gera, na primeira gerao (F1), moscas de corpo amarelo, mostrando a recessividade do alelo e. Do cruzamento entre indivduos da F1 nasce uma segunda gerao (F2) com uma proporo fenotpica de 3 moscas amarelas: 1 mosca preta. Esta proporo decorre da segregao dos alelos de um gene, na formao de gametas.

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Figura 2.6: Diibridismo.A cor do corpo da Drosophila depende de um gene, localizado no cromossomo III, com dois alelos (e = corpo preto ou ebony; e+= corpo amarelo). A presena ou ausncia de olhos depende de um gene, localizado no cromossomo IV, com dois alelos (ey = sem olhos, ey += com olhos). O cruzamento entre duas linhagens puras de moscas que diferem pela cor do corpo (amarelo ou preto) e a presena ou ausncia de olhos gera, na primeira gerao (F1), moscas com olhos e de corpo amarelo, mostrando a recessividade dos alelos ey e e. Do cruzamento entre moscas da F1 nasce uma segunda gerao (F2) com uma proporo fenotpica de 9 moscas amarelas com olhos: 3 moscas amarelas sem olhos, 3 moscas pretas com olhos: 1 mosca preta sem olhos. Esta proporo decorre da segregao independente dos alelos dos genes localizados em diferentes cromossomos homlogos na formao de gametas.

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Os estudos posteriores mostraram a complexidade dos padres de hereditariedade, que incluem casos de: Alelismo mltiplo, quando um gene admite mltiplos alelos; dominantes, recessivos ou codominantes (Sistema ABO, por exemplo). Pleiotropia, quando um gene determina diversos caracteres (pelagem e sobrevivncia em ratos, por exemplo). Herana polignica, quando um carter est determinado por vrios genes de efeito cumulativo (altura, cor dos olhos). Interao gnica, quando uma caracterstica depende da ao de muitos genes.

Finalmente, deve-se destacar que o fentipo de um indivduo o resultado da interao entre o gentipo e o ambiente em que este se expressa.

CLULAS E CROMOSSOMOS COMO AGENTES BIOLGICOSUm dos testes pioneiros de diagnstico gentico est baseado na observao microscpica dos cromossomos de clulas somticas durante a diviso celular (mitose). A identificao se v facilitada pela presena de regies ou bandas reveladas mediante algumas tcnicas de colorao. O nmero e a estrutura dos cromossomos so analisados e apresentados em um arranjo (caritipo) que segue uma classificao convencional (Figura 2.7). Figura 2.7: Representao dos cromossomos humanos.O arranjo segue uma classificao convencional que leva em conta o tamanho, a posio do centrmero (tracejado no esquema) e o padro das bandas de cada cromossomo. Fonte: http://www.molecularstation.com/molecular-biology-images/data/502/karyotype.png

Os testes de diagnstico gentico envolvendo a anlise de caritipos esto amplamente difundidos na prtica mdica, sendo facilitados atualmente pela utilizao de corantes especficos para cada par cromossmico. Como agentes biolgicos, as clulas encontram outras aplicaes (Tabela 2.2). Clulas vegetais cultivadas in vitro produzem substncias de alto valor agregado, importantes para as indstrias alimentar, cosmtica e farmacutica. Tambm se utilizam para regenerar plantas. A multiplicao de vrus em cultivos de clulas de insetos permite a comercializao de prticas de controle biolgico.

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A sntese de algumas substncias importantes para a indstria farmacutica, como o fator ativador de plasminognio, depende do cultivo in vitro de clulas animais. Estas tambm substituem os animais nos testes toxicolgicos e so utilizadas na multiplicao de vrus para a preparao de vacinas. Tambm possibilitam a produo de anticorpos. Combinando as tcnicas de cultivo celular com o desenvolvimento de materiais biolgicos semelhantes ao colgeno, uma rea nova de engenharia de tecidos visa a reparao ou substituio de tecidos lesionados. Os enxertos de pele artificial, cultivada in vitro, saram ferimentos e/ou queimaduras em seres humanos.

Tabela 2.2: As clulas como agentes biolgicos.

Vegetais CLULAS Animais e/ou humanas

Indstria alimentar e cosmtica (Adoantes, corantes, flavorizantes e aromatizantes) Indstria farmacutica (Alcaloides e esteroides) Estudos toxicolgicos Diagnstico clnico Indstria farmacutica (Produo de anticorpos, soros e vacinas) Medicina regenerativa (Produo de tecidos de substituio)

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CAPTULO 3. OS MICRORGANISMOS

A DIVERSIDADE MICROBIANAO termo microrganismos se aplica a um grupo heterogneo de seres que vivem como clulas independentes ou como agregados celulares: bactrias, arqueas, protozorios, algas e fungos e, tambm, vrus. Salvo estes ltimos, que esto na fronteira entre o vivo e o no vivo, os encontramos dentro dos trs domnios em que se classificam os seres vivos: Bacteria, Archaea e Eukarya (Tabela 3.1). Os microrganismos mostram uma diversidade surpreendente de estrutura e modos de vida. Alguns so procariontes, como as bactrias; outros eucariontes, como os protozorios, as algas e os fungos. Os aerbios crescem se houver oxignio, os anaerbios se no o houver. Formas livres colonizam todos os ambientes terrestres, desde o cume das montanhas at as profundidades dos oceanos. Mas h tambm parasitas que crescem custa de outros seres vivos, onde encontram abrigo e alimento, e os que mostram diversos graus de dependncia de outros seres vivos. Os auttrofos sintetizam seus alimentos a partir de dixido de carbono; os fotossintticos utilizam a luz como fonte de energia e os quimiossintticos, algumas reaes qumicas inorgnicas. Os hetertrofos dependem das molculas orgnicas elaboradas pelos auttrofos, que absorvem ou ingerem. O fato de mant-los agrupados sob a denominao de microrganismos talvez obedea menos a uma questo de semelhana que a razes prticas; j que os mesmos mtodos bsicos de estudo (isolamento, cultura in vitro, identificao) podem ser aplicados, com pequenas variaes, a esses grupos. Tabela 3.1: Os microrganismos dentro do marco da uma classificao biolgica atual.DOMNIO REINO TIPO DE CLULA ESTRUTURA CELULAR BACTERIA EUBACTERIA Procaritica Parede celular com peptidoglicano ARCHAEA ARCHAEBACTERIA Procaritica Parede celular sem peptidoglicano PROTISTA Eucaritica Parede celular de celulose, em alguns; cloroplastos, em alguns Uni ou pluricelular Autotrfica ou Heterotrfica Protozorios e Algas FUNGI Eucaritica Parede celular de quitina EUKARYA PLANTAE Eucaritica Parede celular de celulose; cloroplastos ANIMALIA Eucaritica Sem parede celular nem cloroplastos

ORGANIZAO NUTRIO

Unicelular Autotrfica (*) ou Heterotrfica (**) Eubactrias

Unicelular Autotrfica (*) ou Heterotrfica (**)

Uni ou pluricelular Heterotrfica (absoro)***

Pluricelular Autotrfica

Pluricelular Heterotrfica (ingesto)***

EXEMPLOS

Arqueas

Leveduras, Mofos, Bolores e Cogumelos.

Brifitas (musgos), Pteridfitas (samambaias), Gimnospermas e Angiospermas.

Invertebrados e Cordados

* Nutrio autotrfica: o organismo produz seu prprio alimento a partir de substncias inorgnicas e de uma fonte de energia. Os seres autotrficos podem realizar fotossntese (para a qual a fonte de energia a luz solar) ou quimiossntese (para a qual a fonte de energia uma reao qumica exotrmica). **Nutrio heterotrfica: o organismo se alimenta de molculas orgnicas elaboradas por outros seres vivos por absoro (captao de nutrientes dissolvidos na gua), ou ingesto (entrada de partculas de alimentos no dissolvidas). *** A absoro permite a captao de nutrientes dissolvidos na gua; a ingesto se refere s partculas de alimentos no dissolvidas.



AS EUBACTRIASAs eubactrias ou bactrias so organismos unicelulares procariticos em que uma parede celular pode cumprir uma funo protetora. Alm do DNA cromossmico, podem apresentar molculas circulares extras de DNA denominadas plasmdeos. Em condies favorveis de umidade, acidez e temperatura, as bactrias se multiplicam rapidamente por fisso celular produzindo milhes de clulas em poucas horas (Figura 3.1). Em uma de suas acepes, a palavra clone se aplica s clulas que derivam de uma nica clula Algumas espcies bacterianas tambm mantm formas de reproduo sexuada, possibilitando a recombinao do material gentico.

Figura 3.1: Bactrias e clones. Por diviso binria de uma bactria gera-se um clone de bactrias semelhantes.

As eubactrias formam um grupo com mais de 5.000 espcies conhecidas. Pequenas (0,0005-0,005 mm) e de formas diversas (esfricas, bastonetes, helicoidais), elas podem ser encontradas isoladas ou em pares, cadeias ou agregados. Algumas se locomovem livremente, mediante um ou mais flagelos distribudos na superfcie celular, outras se aderem mediante pelos ou fmbrias a um organismo hospedeiro. O grupo inclui tambm as cianobactrias, que sero comentadas mais adiante junto com as algas. Em condies desfavorveis, algumas bactrias formam esporos que resistem em forma latente at que a situao mude, germinando e retomando sua atividade fisiolgica. Um exemplo interessante, na Europa do sculo XIX, o da existncia de campos malditos, campos em que as ovelhas no deviam transitar, devido ao alto risco de contrair o carbnculo ou antraz. De fato, os bacilos presentes nos animais vitimados pela doena e enterrados nesses campos formavam esporos que, trazidos superfcie pelas minhocas, contaminavam as pastagens. Uma tcnica laboratorial (colorao de Gram) permite diferenciar as bactrias pela estrutura da parede celular. Entre as Gram-positivas, cuja parede celular mais simples, encontramos gneros como Clostridium, Bacillus, Mycobacterium (com algumas espcies que causam a tuberculose e a lepra) e os Actinomicetes, como Streptomyces, produtora de antibiticos como a estreptomicina. Entre as Gram-negativas, encontramos os micoplasmas, Escherichia coli, uma colonizadora do trato digestivo de muitos organismos, Salmonella, um agente de muitas intoxicaes alimentares, as cianobactrias fotossintticas, os espiroquetas (Treponema pallidum e Borrelia burgdorferi, causa da sfilis e da doena de Lyme, respectivamente) e as clamdias (responsveis por tracoma e uretrites). Estima-se que as bactrias sejam responsveis por aproximadamente metade das doenas humanas. As Gram-negativas resultam mais difceis de tratar que as Gram-positivas, devido a uma camada adicional na parede celular que as protege e dificulta a entrada de antibiticos. Assim como o homem, os animais e as plantas tambm so afetados por patgenos bacterianos. O dano decorre da invaso dos tecidos do hospedeiro ou da liberao de substncias txicas (exo e endotoxinas). Mas nem todas so patognicas.

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BIOTECNOLOGIA / Captulo 3: Os microrganismos

A participao das bactrias na reciclagem dos elementos fundamental do ponto de vista ecolgico, possibilitando o tratamento de resduos e de guas servidas e, tambm, a eliminao de compostos recalcitrantes (biorremediao) e a extrao de minrios (biolixvia). Por outro lado, a fixao de nitrognio e a produo de toxinas pesticidas contribuem para melhorar as prticas agrcolas. Devido a suas propriedades metablicas, muitas eubactrias so utilizadas na produo de alimentos (laticnios, vinagre, picles e azeitonas) e de aditivos (vitaminas, aminocidos, gomas emulsificantes e estabilizantes), na indstria qumica (acetona, butanol e plsticos biodegradveis) e na indstria farmacutica (vacinas, toxinas e antibiticos). Tambm se utilizam na produo de enzimas para uso industrial e mdico (Tabela 3.2).

AS ARQUEASAs arqueobactrias, ou arqueas, diferem das eubactrias pela estrutura da parede celular e, tambm, por alguns aspectos metablicos relacionados com a sntese de protenas que as aproximam dos eucariontes. Algumas vivem em habitats inspitos, como as solfataras dos vulces ou giseres, a temperaturas superiores a 60-800C (Islndia, Costa Rica). Outras prosperam em lagos onde a concentrao salina altssima, como o Grande Lago Salgado (Estados Unidos) ou o Mar Morto (Israel). Entre as arqueas existem tambm gneros com vias metablicas peculiares que as tornam dependentes de enxofre ou produtoras de metano. Devido a estas propriedades, nos ltimos anos tem-se acelerado a prospeco de arqueas com propriedades potencialmente interessantes, para serem utilizadas em processos industriais que exijam condies ambientais extremas. No entanto, estudos recentes de ecologia molecular mostram que as arqueas no se limitam a ambientes extremos, sendo sua diversidade bem maior do imaginado previamente. Tabela 3.2: As bactrias (Eubactrias e Arqueas) como agentes biolgicos.

Tratamento de resduos e de guas servidas Produo de energia Ex: Metano Biorremediao, extrao de minrio Indstria qumica Ex: Acetona, butanol, cido lctico, cido actico BACTRIAS Enzimas industriais Agricultura Ex: Rizbios, biopesticidas Alimentos Ex: Laticnios, vinagres, picles, azeitonas, silagem Indstria de alimentos Ex: Vitaminas B12 e -caroteno, aminocidos lisina e cido glutmico; polissacardeos xantana e dextrana* Indstria farmacutica Ex: Enzimas de uso mdico, antibiticos, vacinas e toxinas (*) A dextrana tambm tem usos mdicos

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OS PROTISTASOs Protozorios se classificam no reino Protista, um grupo mal definido de seres eucariticos unicelulares ou pluricelulares, auttrofos ou hetertrofos, de reproduo sexuada ou assexuada. Trata-se de organismos unicelulares heterotrficos, cujo tamanho varia entre 0,002 e 1mm. Alguns vivem livres em ambientes marinhos, de gua doce, ou simplesmente muito midos. Outros parasitam outras espcies, nas quais causam doenas: Girdia, Amoeba, Trichomonas, Plasmodium, Toxoplasma, Leischmania etc. De importncia fundamental para o ser humano do ponto de vista mdico, sua caracterizao molecular pode dar origem a testes diagnsticos e vacinas. Classificadas junto com os protozorios no reino Protista, as algas so organismos uni ou pluricelulares, autotrficos e aquticos. Situadas na base das cadeias alimentcias aquticas, as algas cumprem um papel fundamental na biosfera por serem capazes de fixar gs carbnico e produzir oxignio. Algumas participam na formao de solos e na fixao de nitrognio. Apesar de no ter rgos diferenciados, as macroalgas marinhas (algas pardas, algas vermelhas e parte das algas verdes) formam filamentos e talos que podem chegar a medir mais de trinta metros. So utilizadas na alimentao humana (Porphyra ou nori e Laminaria, como o kombu, no Oriente; cochayuyo no Chile); e, tambm, como adubo. Devido a sua capacidade de formar gis e emulses, os ficocoloides extrados delas (Agar, carragenina, alginato) so empregados em anlises clnicas (preparao de meios de cultivo para cultivo de bactrias e fungos) e em vrias indstrias, tais como a alimentcia (sorvetes, cremes, geleias etc.), a farmacutica (laxantes, cpsulas de remdios) e a cosmtica (cremes, sabonetes, xampus, dentifrcios etc.). As microalgas representam um grupo extremamente diversificado de umas 25.000 espcies das quais s um pequeno grupo est bem estudado. Este compreende aproximadamente cinquenta espcies de microrganismos fotossintticos, tanto eucariontes (diatomceas, dinoflagelados, euglenoides e outras algas verdes) como procariontes (cianobactrias, antigamente algas azul-esverdeadas).

Tabela 3.3: As algas como agentes biolgicos.Tratamento de efluentes, biomonitoramento de poluio, energia Ex: Biomassa para a produo de energia. Agricultura Ex: Adubo. ALGAS Produo de alimentos Ex: Alimentao humana, rao para avicultura e aquicultura. Indstria de alimentos Ex: Aditivos, espessantes e emulsionantes, substitutos proteicos e complementos nutricionais. Indstria de cosmticos Ex: cidos graxos e outras substncias tais como ficocoloides, pigmentos, glicerol, abrasivos finos etc. Indstria farmacutica Ex: Compostos biologicamente ativos, antibiticos, antivirais e antitumorais. tais como toxinas,

Biomassa

Molculas

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A proliferao de microalgas como floraes na natureza (mars vermelhas) ou em reservatrios, geralmente devido eutrofizao das guas, causa a morte de outros organismos, sendo muito perigosa se estiver acompanhada pela liberao de toxinas. Porm, em alguns sistemas de tratamento de efluentes as microalgas so incorporadas nos tanques para remover nutrientes inorgnicos e adicionar oxignio. Tambm so usadas como indicadores de poluio. O metano, um gs combustvel, resulta da degradao de biomassa de algas por microrganismos anaerbios. Por outro lado, a produo de hidrognio por algas representa uma alternativa energtica promissora. As microalgas so aproveitadas na alimentao animal como rao para a avicultura e a aquicultura. Algumas das substncias que elas sintetizam so includas na alimentao humana como complementos nutricionais e substitutos proteicos; trata-se de aminocidos, cidos graxos e vitaminas (B12, -caroteno ou provitamina A). Tambm so utilizadas na formulao de cosmticos e na indstria farmacutica (Tabela 3.3). OS FUNGOS

O Reino Fungi comporta mais de 100.000 espcies. Os fungos so organismos eucariticos, uni ou pluricelulares, com uma parede celular formada por quitina. Todos eles so hetertrofos e podem se reproduzir sexuada ou assexuadamente. As leveduras so fungos unicelulares que se desenvolvem em lugares midos e se reproduzem por brotamento. Pertence a este grupo um dos microrganismos de maior importncia econmica: Saccharomyces cerevisiae, o popular levedo de cerveja (ou, simplesmente, levedura) utilizado tradicionalmente na preparao de alimentos e de bebidas, assim como na produo de etanol, vitaminas e outros metablitos. Transformada mediante tcnicas de engenharia gentica, esta levedura produz uma vacina contra a hepatite B (Tabela 3.4). Entretanto, nem todas as leveduras so benficas; Candida albicans, um microrganismo oportunista da flora normal humana pode, em certas condies, proliferar de maneira anormal, tornando-se patognica.

Tabela 3.4: Os fungos como agentes biolgicos. Agricultura Ex: Controle biolgico de insetos e nematoides, micorrizas. Produtos de fermentao Ex: Etanol, glicerol, cido ctrico. Enzimas industriais Biomassa FUNGOS Ex: Fermento de padaria, micoprotena. Indstria de alimentos Ex: Panificao, queijaria. Indstria de bebidas Ex: Cervejas e vinhos, destilados. Produtos metablicos Ex: Extrato de levedura, hormnios de crescimento vegetal. Indstria farmacutica Ex: Antibiticos, vitaminas, vacinas, esteroides.

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Nos bolores e mofos, as clulas formam um emaranhado de filamentos ou hifas, denominado miclio. Os mofos crescem rapidamente por fragmentao do miclio e se disseminam mediante esporos; como Aspergillus niger, um produtor de cido ctrico; ou como Rhizopus, o fungo preto do po, que se expande sobre a superfcie deste apesar dos conservantes acrescentados; ou ainda como Aspergillus flavus, um bolor que ataca as sementes de leguminosas (amendoim, feijo, soja) e produz uma toxina poderosa, a aflatoxina, causando graves intoxicaes. Neste grupo tambm se encontra o Penicillium, um gnero que conta com diversas espcies, uma das quais utilizada na indstria farmacutica, para a produo de penicilina, e outras na indstria de alimentos, para a maturao de queijos como o Roquefort, o Gorgonzola e o Camembert. Os cogumelos so os corpos reprodutivos de muitos fungos. Alguns so venenosos (Ammanita), outros produzem substncia alucingena, tais como a psilobicina, utilizada por grupos nativos mexicanos em rituais religiosos, ou a ergotamina, sintetizada quimicamente no sculo XX com o nome de LSD (cido lisrgico). Mas tambm os h comestveis como o Agaricus ou champignon, o Shiitake e o Pleurotus, que so cultivados e comercializados pelo homem. Em termos ambientais, um quarto da colheita de frutas e vegetais destrudo pelos fungos; pragas como a ferrugem do caf, o esporo do centeio e a vassoura-de-bruxa afetam gravemente a agricultura. Na Irlanda no sculo XIX, o Phytophtora infestans atacou a batata, destruindo a fonte bsica de alimentao; a praga causou um milho de mortes e a emigrao forada de boa parte da populao. Os liquens resultam da simbiose entre um fungo e uma alga. Alguns so comestveis, supondo-se que a Lecanora esculenta seja o man referido na Bblia. O grupo no tem sido muito explorado economicamente, apesar de ter encontrado aplicaes como corantes (tintura de tornassol, um indicador de pH), no tingimento de tecidos e como fixadores na indstria de perfumes. Tambm so indicadores de poluio (biomonitoramento). Em contrapartida, outra associao, desta vez entre um fungo filamentoso e as razes das plantas vasculares, as micorrizas, ocupam um lugar de destaque na agricultura em solos tropicais por facilitarem a solubilizao dos fosfatos. OS VRUS, NA FRONTEIRA DO VIVO E DO NO VIVO

Os vrus so partculas inertes sem nenhuma atividade metablica, no limite entre o vivo e o no vivo. Os menores medem 20 nanmetros (1nm = 10-4 mm). Podem atravessar filtros extremamente finos e cristalizar. Sua estrutura muito simples: um cido nucleico (ADN ou ARN, como filamento simples ou duplo) dentro de uma capa proteica ou capsdeo. Muitos possuem enzimas que sero liberadas dentro da clula hospedeira (Figura 3.2) Figura 3.2: Alguns tipos de vrus.Os adenovrus e o HIV parasitam clulas humanas; o bacterifago, bactrias.

Como parasitas obrigatrios de bactrias, plantas ou animais, ao infetar uma clula viva passam a utiliz-la para sua prpria reproduo. Alguns se integram no genoma da clula infetada (bacterifagos, retrovrus). Devido a esta propriedade, os vrus tm sido utilizados como vetores para introduzir genes em uma clula hospedeira (Figura 3.3).

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Figura 3.3: A multiplicao de um bacterifago.A infeco da bactria pelo bacterifago destri a clula (ciclo ltico). Em alguns casos, o DNA viral se integra no cromossomo sendo transmitido s clulas filhas; em determinadas condies o vrus retoma sua atividade, reiniciando o ciclo ltico.

Vrias doenas humanas so causadas por vrus, tais como o poliovirus, o HIV, o coronavirus responsvel pela SAR (sndrome aguda respiratria) etc. Ao infectar as clulas animais normais, alguns vrus as transformam em clulas cancerosas. Os vrus que infectam insetos podem ser utilizados no controle de pragas. Na luta contra a lagarta da soja, o Baculovrus evita a aplicao de 1,2 milho de litros de inseticidas por ano nas lavouras brasileiras.

AS TCNICAS MICROBIOLGICASDiversos tipos de tcnicas, muitas das quais datam do sculo XIX, facilitam o trabalho laboratorial. A identificao de um microrganismo demanda a observao microscpica e a utilizao de alguns mtodos especficos de colorao, complementados por testes bioqumicos e eventualmente genticos e imunolgicos. Encontrar e manter um microrganismo no laboratrio demanda a aplicao de tcnicas bacteriolgicas aplicveis tambm, com algumas variaes, a fungos e algas. Cultivar microrganismos exige, alm do desenho de um meio nutriente que satisfaa suas necessidades metablicas, um cuidado especial com as condies de temperatura e iluminao em que este ser incubado. Os meios nutrientes se empregam lquidos ou solidificados com agar, uma substncia que lhes confere uma consistncia gelatinosa. Os recipientes mais comuns so tubos de ensaio e placas circulares de vidro com tampa (Placas de Petri); e, para inocular os meios, se utilizam alas de platina e pipetas de diferentes tipos (Figura 3.4). Figura 3.4: Material clssico de Microbiologia

A grande dificuldade do laboratrio microbiolgico est em conseguir a multiplicao do

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microrganismo desejado evitando as contaminaes, isto a multiplicao de outros microrganismos. Trabalha-se em condies asspticas, o que demanda a esterilizao prvia do material de vidro, dos meios nutrientes e dos instrumentos (alas, pipetas) que sero utilizados. E na transferncia do material biolgico, evita-se cuidadosamente toda contaminao com os microrganismos do ar. Equipamentos especialmente desenhados para trabalhar sob um fluxo de ar esterilizado ajudam o profissional. Tambm se evitam as contaminaes na hora de eliminar o material utilizado, a fim de no liberar microrganismos prejudiciais no ambiente. Os microrganismos so isolados a partir de amostras de solo, gua, ar ou fluidos corporais. As linhagens obtidas se conservam como culturas puras. Microrganismos com caractersticas diferentes so obtidos induzindo mutaes e selecionando as linhagens mutantes. Cada laboratrio mantm os estoques microbianos necessrios, que tambm podem ser solicitados a centros especializados (Colees de cultura). O nmero de microrganismos em uma amostra pode ser estimado por diversos mtodos: contagem microscpica, contagem eletrnica, contagem em placa, turvao do meio, massa seca, contedo de nitrognio ou medidas indiretas da atividade microbiolgica. Em geral, as tcnicas clssicas so trabalhosas e muito demoradas para o diagnstico clnico, por isso esto sendo substitudas por tcnicas miniaturizadas mais rpidas que identificam os microrganismos com base em algumas reaes bioqumicas em kits padronizados. A tendncia geral de automatizao do laboratrio microbiolgico. Em outra linha de ao, a partir do incio do sculo XX surge a Microbiologia Ambiental, trazendo uma nova viso em relao s populaes microbianas presentes na natureza. No entanto, nossa ignorncia em relao aos microrganismos ainda enorme. O nmero de espcies que conseguimos cultivar no laboratrio no representa ainda mais do que 1 a 5 % da totalidade existente; dependemos dos avanos na rea da genmica para ampliar nosso conhecimento das comunidades microbianas do ambiente.

BIOSSEGURANA E BIOSSEGURIDADEOs microrganismos so classificados segundo o risco de causarem danos aos profissionais que trabalham com eles e coletividade. Os critrios so: a patogenicidade para o homem, a virulncia, o modo de transmisso, a endemicidade e a existncia ou no de uma teraputica eficaz. Definem-se assim quatro grupos de risco: Grupo 1: Baixo risco individual e coletivo. Microrganismos que nunca foram descritos como agente causador de doenas para o homem e que no constituem risco para o meio ambiente. Exemplos: Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Escherichia coli (algumas linhagens). Grupo 2: Risco individual moderado, risco coletivo limitado. Microrganismos que podem causar doenas no homem, com pouca probabilidade de alto risco para os profissionais do laboratrio. Exemplos: Salmonella, Toxoplasma, Schistosoma mansoni, vrus do sarampo, vrus da hepatite B. Grupo 3: Risco individual elevado, risco coletivo baixo. Microrganismos que podem causar doenas graves aos profissionais do laboratrio. Exemplos: Mycobacterium tuberculosis e HIV. Grupo 4: Srio risco para os profissionais do laboratrio e para a coletividade. Microrganismos que causam doenas graves para o homem. Exemplos: vrus Ebola, vrus Marburg. A cada grupo de microrganismos correspondem normas estritas de trabalho, que abrangem desde a arquitetura do laboratrio e as caractersticas dos equipamentos at as precaues que devem ser tomadas pelos profissionais e a forma em que o lixo ser descartado. O conceito de biossegurana se complementa com o de biosseguridade, isto , o conjunto de medidas necessrias para evitar a remoo intencional de material biolgico valioso como, por exemplo, em caso de bioterrorismo.

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OS MICRORGANISMOS COMO AGENTES BIOLGICOSTabela 3.5: Principais destaques entre os agentes biolgicos microbianos.

EUBACTRIAS Bactrias lcticas

UTILIZAOOs gneros Lactobacillus e Streptococcus so responsveis por vrios processos, tais como a elaborao de queijos e de iogurtes, o envelhecimento dos vinhos, a conservao de alimentos (sauerkraut ou repolho fermentado, silagem para o gado); a produo de cido lctico, um aditivo utilizado na indstria de alimentos como acidulante e estabilizante. Este microrganismo prolifera no solo e na superfcie das plantas, sintetizando uma toxina fatal para as larvas de insetos. Esta produzida comercialmente h mais de 40 anos, representando 90% das vendas de inseticidas biolgicos e reduzindo a necessidade de aplicao de pesticidas qumicos nas lavouras. Nos ltimos anos, o gene codificador da toxina tem sido transferido a plantas (algodo, milho) para que estas sintetizem diretamente o inseticida. Alm do cheiro caracterstico da terra removida, este gnero de bactrias do solo produz substncias antibiticas (estreptomicina, tetraciclina, eritromicina), antifngicas (nistatina), herbicidas, antitumorais e supressoras de rejeio a transplantes . Vrias linhagens se utilizam na eliminao de poluentes. Algumas quebram molculas de hidrocarbonetos, como os existentes nos acidentes de derramamento de petrleo; outras podem remover o mercrio aqutico. Agente patognico para as plantas dicotiledneas que desenvolvem um tumor ou galha quando infetadas. Com a remoo de um gene, perde a capacidade de provocar tumores, conservando a capacidade infecciosa, utilizada na engenharia gentica de vegetais . Na indstria txtil, Clostridium butiricum libera as fibras vegetais durante a macerao do cnhamo e do linho. Clostridium acetobutyricum utilizado na produo industrial de acetona e butanol. Clostridium botulinum produz uma toxina poderosssima; calcula-se que um grama desta bastaria para matar um milho de pessoas. A ingesto de conservas contaminadas e mal esterilizadas resulta quase sempre em um desfecho fatal. Devido a sua ao inibitria da contrao muscular, a toxina botulnica utilizada em concentraes muito pequenas, para reduzir as rugas e marcas de expresso durante certo tempo (efeito cosmtico).

Bacillus thuringiensis

Streptomyces

Pseudomonas

Agrobacterium tumefaciens

Bactrias butricas

Escherichia coli

Descoberta em 1855, esta bactria Gram-negativa vive no

trato digestivo do homem e de outros animais. Tm forma de bastonete (0,002 mm de comprimento, 0,0008 mm de dimetro), 1 a 4 molculas de DNA e 15.000 a 30.000 ribossomos. Flagelos e pelos lhe permitem movimentar-se rapidamente. Algumas linhagens so patognicas, podendo contaminar os alimentos (carne, leite, vegetais) que devem ser cozidos adequadamente. Os seus requerimentos nutricionais bsicos so simples: gua, sais minerais, uma fonte de nitrognio e uma fonte de energia. Em condies adequadas, se divide a cada 20-40 minutos; tambm pode se reproduzir de maneira sexuada (conjugao). Devido facilidade com que ela pode ser cultivada no laboratrio, Escherichia coli tem se tornado uma ferramenta indispensvel para estudos bioqumicos e genticos, incluindo a Engenharia Gentica. O seu genoma compreende 4,6 milhes de pares de bases que codificam em torno de 4.000 protenas diferentes. A introduo de transgenes em Escherichia coli K12, uma linhagem inofensiva de laboratrio, possibilitou os primeiros processos de produo de insulina, de interferon e de hormnio de crescimento. Entretanto, por se tratar de uma clula procaritica, nem sempre a melhor opo de "fbrica" para a sntese de produtos de origem animal ou vegetal, tendo sido aos poucos substituda por outras clulas eucariticas, como a levedura.

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ARQUEOBACTRIAS Thermus aquaticus

UTILIZAOIsolada em uma poa do parque nacional de Yellowstone (Estados Unidos), esta bactria produz uma enzima que copia o DNA a uma temperatura alta. Esta enzima permite obter milhes de cpias de um fragmento de DNA em um processo automatizado que revolucionou a Biotecnologia, chamado PCR (Polymerase Chain Reaction ou Reao em cadeia da polimerase). Vivem em lugares onde h ausncia de oxignio, seja no tubo digestivo de alguns animais (gado, cupins) ou nos pntanos. Estas bactrias transformam o acetato resultante da degradao de celulose por outras bactrias em metano, um gs combustvel.

Bactrias metanognicas

ALGAS Spirulina

UTILIZAOO seu alto teor proteico, que corresponde a 60% do peso seco, lhe confere um elevado valor nutritivo; as protenas representam aproximadamente 2% do peso seco da batata e 6-10% do trigo. Quando da chegada dos espanhis, os astecas j preparavam umas bolachas (tecuitlatl) com a Spirulina coletada no lago Texcoco. Na frica, no lago Tchad, ainda hoje ela coletada e consumida como alimento. Spirulina, assim como Chlorella, so vendidas em tabletes como complemento nutritivo. Acumula glicerol em condies de alta salinidade, com o qual consegue evitar a desidratao. Pode crescer no Mar Morto, sendo tambm cultivada em tanques ou lagoas, perto do Mar Vermelho, para extrao do glicerol e de -caroteno, outro produto metablico.

Dunaliella

FUNGOS Saccharomyces cerevisiae

UTILIZAOConhecido como levedo de cerveja ou levedura, utilizado na preparao de alimentos (po, biscoitos, fermento de padaria) e de bebidas (cerveja, vinho e destilados), assim como na produo de outras substncias de importncia industrial (etanol, vitaminas e outros metablitos). A levedura cresce facilmente em laboratrio. Tambm pode ser manipulada geneticamente. Nos fermentadores ou biorreatores industriais onde se multiplica rapidamente a partir de matrias-primas de baixo custo, ela permanece ativa durante perodos longos e, ao concluir o processo, pode ser separada por filtrao ou centrifugao. Com 12.000.000 de pares de bases e 6.000 genes em 16 cromossomos, Saccharomyces cerevisiae foi, em 1997, o primeiro organismo eucaritico a ter o seu genoma sequenciado. Algumas espcies alcanam grande importncia industrial, como A.niger, utilizada para a produo de cido ctrico ou de enzimas (em linhagens modificadas geneticamente). Algumas espcies so utilizadas na indstria farmacutica (penicilina) ou indstria de alimentos (queijos azuis, como o Roquefort e o Gorgonzola; queijo Camembert).

Aspergillus Penicillium

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CAPTULO 4. AS ENZIMAS E OS ANTICORPOS

AS PROTENASTodos os organismos esto formados por gua e molculas de diversos tipos, inorgnicas e orgnicas (Figura 4.1). Entre estas ltimas, se encontra um grupo de macromolculas, as protenas, que participam em numerosas atividades, cumprindo um papel fundamental para os seres vivos. Pertencem a este grupo as enzimas, molculas de ao cataltica, e os anticorpos, molculas que participam na defesa do organismo.

Tabela 4.1: As funes das protenas no organismo.FUNO Componentes estruturais Substncias de reserva Ao cataltica Outras EXEMPLOS Queratina do cabelo, colgeno da derme, actina e miosina das fibras musculares. Albumina do ovo, casena do leite. Enzimas que controlam as reaes qumicas celulares. Transmisso de informao (hormnios proteicos), participao nos mecanismos de defesa (anticorpos, citocinas), transporte e armazenamento de pequenas molculas (hemoglobina).

Figura 4.1: A composio qumica de uma bactria.Apesar de algumas diferenas nas propores de alguns componentes, a composio qumica de outros microrganismos ou das clulas eucariontes comparvel de uma bactria.

ESTRUTURA As protenas so macromolculas formadas por 20 aminocidos diferentes. Estes se caracterizam por ter, unidos ao tomo de carbono, um grupo amino (bsico), um grupo carboxila (cido) e um radical varivel (Figura 4.2 A). A presena de um carbono assimtrico resulta em duas formas moleculares (L) e (D) que diferem por suas propriedades pticas. Os aminocidos que compem as protenas correspondem forma (L).



A reao de condensao entre o grupo carboxila de um aminocido e o grupo amina de outro cria uma ligao peptdica (Fig.4.2 B). A unio de vrios aminocidos forma uma cadeia peptdica que se caracteriza no s pelo nmero e tipo de aminocidos que a compem, como pela sequncia em que estes se encontram, denominada estrutura primria. Ao se estabelecerem ligaes entre os grupos que formam os enlaces peptdicos, a cadeia adota uma estrutura regular ou estrutura secundria, geralmente em forma de hlice ou de folha. As interaes entre as cadeias laterais dos aminocidos causam o dobramento da protena, resultando uma configurao espacial que chamada de estrutura terciria. A forma final de uma protena depender ainda da associao entre vrios polipeptdios, no que se denomina de estrutura quaternria (Figura 4.2 C). Quando sintetizada dentro da clula, uma protena adotar espontaneamente a configurao espacial que decorre de sua estrutura primria. Entretanto, fatores ambientais como o pH, a concentrao salina ou a temperatura podem causar alteraes momentneas ou definitivas na forma da molcula.

Figura 4.2: Aminocidos e protenas

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BIOTECNOLOGIA / Captulo 4: As protenas e os anticorpos

AS BASES DE ALGUMAS TCNICAS LABORATORIAIS Cromatografia

Esta tcnica permite separar as substncias de uma mistura com fins analticos e preparativos. Est baseada na migrao diferencial das molculas de uma mistura, colocada em uma fase mvel, sobre um suporte estacionrio ou matriz. Em funo das caractersticas da fase estacionria, distinguem-se diferentes modalidades: cromatografia em papel, em camada delgada, cromatografia em gs, cromatografia lquida etc. Na cromatografia em coluna, por exemplo, a separao das protenas de uma mistura depende da estrutura da matriz, slida e permevel, que se encontra imersa em um solvente (Figura 4.3). A separao obedece a trs tipos de mecanismos: Troca inica. A matriz est formada por pequenas partculas carregadas que retm as molculas de carga contrria. Como a associao depende de fatores como o pH e a fora inica da soluo, a modificao destes fatores permite controlar a separao. Filtrao em gel. A matriz consiste em partculas porosas que separam as protenas em funo de seu tamanho, como uma peneira molecular. Afinidade. As partculas da matriz esto unidas por ligaes covalentes a molculas (enzimas, anticorpos) que interagem com a protena de interesse. Para liberar a protena retida na coluna, muda-se o pH ou a concentrao salina. Desse modo se consegue a protena purificada.

Figura 4.3: Cromatografia em colunaO processo est baseado na velocidade de migrao diferencial das molculas proteicas em uma matriz imersa em um solvente.

Eletroforese Molculas ionizadas colocadas em um campo eltrico migram de acordo com suas cargas e pesos moleculares. Se a carga for positiva, elas migraro para o plo negativo ou ctodo e, inversamente, se ela for negativa, a migrao ocorrer na direo do plo positivo ou nodo. Este o fundamento de outra tcnica analtica, a eletroforese. Se uma mistura de peptdeos for colocada em um campo eltrico, eles migraro de acordo com sua carga, forma e tamanho, formando cada um deles uma banda caracterstica que ser visualizada mediante um corante ou uma reao qumica especfica (Figura 4.4). Observe-se que a carga de um peptdeo resulta da soma das cargas correspondentes aos grupos amina e carboxila terminais e dos radicais dos aminocidos que o compem, e que essa carga varia com o pH do meio.

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A eletroforese permite separar os componentes de uma mistura. Existem numerosas variaes desta tcnica em funo do suporte (papel de filtro, slica-gel, membranas de acetato de celulose, gel de agarose, amido ou poliacrilamida), da disposio da cuba (horizontal ou vertical), da direo da migrao (unidirecional ou bidirecional) etc.

Figura 4.4: EletroforeseSeparao dos peptdeos de uma mistura, por migrao diferencial em um campo eltrico.

Espectrometria de massa

Esta tcnica analtica mede a massa molecular a partir da razo entre a massa e a carga de molculas ionizadas, medida que permite a identificao de uma substncia. Com a descoberta de mtodos de ionizao adaptados s molculas biolgicas como o MALDI (do ingls Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization), a espectrometria de massa se tornou nos ltimos anos uma ferramenta indispensvel na identificao de protenas, acares, cidos nucleicos, lipdios e outros compostos orgnicos. Aplicada s protenas, a espectrometria de massa identifica a molcula por comparao com outras de um banco de dados. Tambm fornece uma anlise estrutural da molcula indicando a sequncia de aminocidos. Com esta tcnica possvel estudar o conjunto de protenas de um organismo (proteoma) e dissecar as interaes das protenas com outras molculas. Por ser um mtodo automatizado e rpido, tem alcanado mltiplas aplicaes em farmacologia e diagnstico.

AS ENZIMASA CATLISE ENZIMTICAAs reaes qumicas que ocorrem nos seres vivos dependem da atividade cataltica das enzimas. Estas molculas agem diminuindo a energia de ativao necessria de uma reao qumica, sendo capazes de promov-las e aceler-las, sem ser alteradas ou destrudas. A molcula de enzima reconhece um substrato especfico, formando com ele um complexo molecular ou estado de transio. O encaixe no stio ativo da molcula facilita a transformao do substrato no(s) produto(s) da reao. A enzima recuperada no fim da reao, podendo atuar inmeras vezes. O processo pode ser representado como a seguir:

S+E

SE

P+E

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BIOTECNOLOGIA / Captulo 4: As protenas e os anticorpos

A primeira caracterstica das enzimas a especificidade; uma enzima como a lactase, que opera sobre a lactose, no agir sobre a sacarose; duas enzimas que hidrolisem o amido podero faz-lo cortando a molcula de maneira diferente, como a -amilase e a -amilase. A segunda que, em funo de sua origem biolgica, as enzimas so biodegradveis e agem em condies brandas de temperatura e pH. A ao enzimtica depende do pH, da temperatura, da presena de cofatores inorgnicos (zinco, ferro, cobre) e/ou orgnicos (coenzimas, muitas das quais so vitaminas). Os metais pesados alteram a estrutura molecular da enzima de maneira irreversvel impedindo sua ao cataltica (desnaturao). Uma inibio da atividade enzimtica ocorre quando molculas muito parecidas com o substrato competem com este para ocupar o stio ativo da enzima (inibio competitiva). Ou quando outras molculas se ligam a determinadas partes da enzima, alterando a estrutura espacial e dificultando o encaixe com o substrato (inibio no competitiva). Figura 4.5: O mecanismo da atividade enzimtica.A atividade enzimtica no modifica o equilbrio da reao.

OS DIVERSOS TIPOS DE ENZIMAS Uma forma de classificar as enzimas pelo tipo de reao que catalisam, acrescentando o sufixo ase ao nome do substrato que transformado: protease, lactase, amilase, lipase, celulase. Tambm se pode adicionar ase ao nome da reao catalisada: hidrolase, oxirredutase. Quando combinadas as duas regras anteriores, se mencionam o nome do substrato e da reao catalisada adicionando ase como, por exemplo, em DNA-polimerase. Porm, algumas enzimas, como a renina ou a trombina, conservam seus nomes tradicionais.

Tabela 4.2: A classificao internacional das enzimasCLASSE Oxirredutases Transferases Hidrolases Liases Isomerases Ligases TIPO DE REAO CATALISADA Reaes onde se transferem eltrons. Reaes onde se transferem grupos qumicos. EXEMPLOS Desidrogenases, oxidases. Transaminases, fosforilases.

Reaes de hidrlise, isto , de transferncia de grupos Proteases, carboidrases, funcionais para a gua. peptidases, lipases. Adio de grupos a duplas ligaes ou formao de Decarboxilases (renina, duplas ligaes por eliminao de grupos. trombina). Produo de ismeros por transferncia de grupos Isomerases, mutases. dentro de molculas. Formao de ligaes C-C, C-S, C-O e C-N por reaes Sintetases. de condensao.

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IMPORTNCIA ECONMICAAs enzimas apresentam numerosas vantagens quando utilizadas como agentes biolgicos em processos tecnolgicos: especificidade, operao em condies facilmente controlveis e biodegradabilidade. De um modo geral, os tratamentos enzimticos diminuem a carga poluidora dos efluentes industriais. Das 25.000 enzimas que, segundo as estimativas, existiriam na natureza, at o momento s foram classificadas umas 2.800, sendo comercializadas 400. O mercado se distribui fundamentalmente entre as proteases (59%), as carboidrases (28%) e as lipases (3%), trs grandes conjuntos de enzimas que so utilizadas por diversas indstrias; os 10% restantes do mercado correspondem s enzimas analticas e farmacuticas (Tabela 4.3).

Tabela 4.3: As enzimas como agente biolgicoIndstria de alimentos e bebidas Ex: clarificao de vinhos e sucos de frutas, substituio da maltagem pelo tratamento do amido na elaborao de cervejas, fabricao de po, biscoitos e bolachas, produo de adoantes, fabricao de laticnios, suplementao de raes animais. Produtos de limpeza Ex: detergentes e lava-roupas para a remoo de manchas difceis, produtos para limpar dentaduras e lentes de contato. ENZIM

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