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PCR em Tempo Real

Dr Robson Francisco Carvalho

rfcarvalho@ibb.unesp.br

Departamento de

Morfologia

PCR em Tempo Real

PCR em tempo real

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PCR em Tempo Real

* Pobre precisão

* Baixa sensitividade

* Curta extensão dinâmica (< 2 logs)

* Baixa resolução

* Não automatizado

O que há de errado com os géis de agarose?

PCR em tempo real

PCR em Tempo Real

* Resultados não são expressos em números

* Colorações não são muito quantitativas

* Pós-processamento do produto da PCR

* Contaminação (brometo)

* Discriminação baseada apenas no tamanho do fragmento

O que há de errado com os géis de agarose?

PCR em tempo real

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Starting

Template

PCR

Round 1

PCR

Round 2

2X

Template

4XTemplate

30-40 ciclos

Cycle

Fluorescence

Análise Real-time

Constante detecção e

monitoramento dos

produtos de amplificação

durante toda corrida

(emissão de fluorescência)

PCR tradicional

Deteção do produto

no gel de agarose

PCR em Tempo Real

PCR tradicional x PCR tempo real:

PCR em tempo real

Sistemas de detecção

PCR em tempo real:

→ Sistema baseado na detecção e quantificação de um sinal fluorescente

PCR em tempo real

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PCR em Tempo Real

Vantagens do PCR em tempo real:

→ Não é influenciado por amplificação não-específica (sondas)

→ Amplificação pode ser monitorada em tempo real

→ Ciclos mais rápidos

→ Detecção de alteração menor que 2x

Gel de agarose

5x

PCR em tempo real

PCR em Tempo Real

Vantagens do PCR em tempo real:

→ Maior extensão dinâmica (de até 1010 x)

→ Requer 1000x menos DNA que demais ensaios

(3 picogramas = 1 genoma)

→ confirmação da amplificação específica (análise da curva de melting)

→ MAIS ESPECÍFICO, SENSÍVEL e REPRODUZÍVEL

→ Não é muito mais caro que a PCR convencional

(exceção: preço do equipamento)

PCR em tempo real

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PCR em Tempo Real

FASES DA PCR:

→ Exponencial: Dobro do produto é acumulado em cada ciclo (eficiência da reação

~100%). Reação específica e precisa.

→ Linear: Alta variabilidade (consumo dos componentes da reação)

→ Platô: Detecção por gel para os métodos tradicionais. Produtos não são mais

produzidos e começam ser degradados

PCR em tempo real

PCR em Tempo Real

FASES DA PCR:

PCR em tempo real

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PCR em Tempo Real

Desvantagens do PCR em tempo real:

→ Não é ideal para multiplex

→ Utilização requer alta habilidade técnica e suporte

→ Alto custo do equipamento

PCR em tempo real

PCR em Tempo Real

Sistema Tempo Real:

→ Sistema óptico

→ Termociclador

→ Hardware

→ Software

PCR em tempo real

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FQ

…...…...T

1. Polimerase encontra o primer.

2. Laser excita a sonda fluorescente

do primer.

3. Florescência é absorvida

pela molécula inibidora Q.

4. Detector registra “no reaction”.

PCR em Tempo Real

FQ

…...T

….

5. Primer estendido pela Polimerase.

PCR em Tempo Real

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FQ

…...…...T

…...….

6. Extensão continua até a polimerase encontrar a molécula fluorescente.

7. polimerase quebra o primer marcado. A sonda fluorescente e a molécula inibidora são liberadas.

PCR em Tempo Real

FQ

…...

T

…...…...…..

.…

Q

QF

F8. O PCR continua, os primers marcados são degradados e moléculas fluorescentes “livres”são acumuladas.

9. O detector grava a fluorescência como medida do progresso de amplificação.

PCR em Tempo Real

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PCR em Tempo Real

- SNPs

- Patógenos

- Carga viral

- Expressão gênica

- Transgênicos

Endpoint Tempo Real

Análise

PCR em tempo real

PCR em Tempo Real

Análise

Endpoint Tempo Real

PCR em tempo real

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PCR em Tempo Real

Montagem da reação:

PCR em tempo real

PCR em Tempo Real

PCR em tempo real

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PCR em Tempo Real

Terminologia:

→ Baseline: fluorescência do amplicon = fluorescência do meio

(ruído liberado pela reação-background)

- ciclo da PCR com poucas mudanças no sinal de fluorescência

PCR em tempo real

PCR em Tempo Real

Terminologia:

PCR em tempo real

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PCR em Tempo Real

Terminologia:

→ Rn: sinal do alvo normalizado pelo sinal da referência passiva (ex. ROX)

ROX: fluorescência presente no meio (correção do volume)

Normalização: fluorescência total- fluorescência ROX

PCR em tempo real

PCR em Tempo Real

Terminologia:

→ ∆∆∆∆Rn: magnitude do sinal gerado pela PCR (Rn – Baseline)

- Normalização do “reporter” pelo background

PCR em tempo real

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PCR em Tempo Real

Terminologia:

→ Threshold: nível de ∆Rn (determinado automaticamente ou

manualmente), utilizado para a determinação do CT

→ Acima do Baseline e dentro da fase exponencial da curva

PCR em tempo real

PCR em Tempo Real

Terminologia:

PCR em tempo real

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PCR em Tempo Real

Terminologia:

PCR em tempo real

PCR em Tempo Real

Terminologia:

PCR em tempo real

Diluição de uma

mesma amostrathreshold

CT

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PCR em Tempo Real

Terminologia:

CT: cycle threshold: ciclo onde a reação cruza o limiar de detecção (threshold)

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