341vio 10.doc)iz.sp.gov.br/pdfs/1301594490.pdf · Title (Microsoft Word - Tese fl\341vio 10.doc)...

72
INSTITUTO DE ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO ANIMAL SUSTENTÁVEL AVALIAÇÃO DE RESISTÊNCIA À ALUMÍNIO EM Brachiaria brizantha TRANSFORMADA COM O GENE neMDH. Flávio Rocha Nova Odessa Fevereiro - 2011

Transcript of 341vio 10.doc)iz.sp.gov.br/pdfs/1301594490.pdf · Title (Microsoft Word - Tese fl\341vio 10.doc)...

  • INSTITUTO DE ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO ANIMAL SUSTENTÁVEL

    AVALIAÇÃO DE RESISTÊNCIA À ALUMÍNIO EM Brachiaria brizantha TRANSFORMADA COM O GENE neMDH.

    Flávio Rocha

    Nova Odessa

    Fevereiro - 2011

  • ii

  • iii

    GOVERNO DO ESTADO DE SÃO PAULO

    SECRETARIA DE AGRICULTURA E ABASTECIMENTO

    AGÊNCIA PAULISTA DE TECNOLOGIA DOS AGRONEGÓCIOS INSTITUTO DE ZOOTECNIA

    PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO ANIMAL SUSTENTÁVEL

    AVALIAÇÃO DE RESISTÊNCIA À ALUMÍNIO EM Brachiaria brizantha TRANSFORMADA COM O GENE neMDH.

    Flávio Rocha Keila Maria Roncato Duarte- orientadora

    Luiz Humberto Gomes -Co-orientador

    Nova Odessa Fevereiro, 2011

    Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação do Instituto de Zootecnia, APTA/SAA, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Produção Animal Sustentável.

  • iv

    Ficha elaborada pelo Núcleo de Informação e Documentação do Instituto de Zootecnia

    Bibliotecária responsável – Ana Paula dos Santos Galletta - CRB8/7166

    R672a Rocha, Flavio

    Avaliação de resistência à alumínio em Brachiaria brizantha transformada com o gene neMDH. / Flavio Rocha. Nova Odessa - SP, 2010.

    59p. : il.

    Dissertação (Mestrado) - Instituto de Zootecnia. APTA/SAA. Orientador: Keila Maria Roncato Duarte.

    1. Plantas forrageiras. 2. Bovinocultura de corte. I. Duarte, Keila

    Maria Roncato. II. Título.

    CDD 633.2

  • v

    GOVERNO DO ESTADO DE SÃO PAULO

    SECRETARIA DA AGRICULTURA E ABASTECIMENTO

    AGÊNCIA PAULISTA DE TECNOLOGIA DOS AGRONEGÓCIOS INSTITUTO DE ZOOTECNIA

    PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO ANIMAL SUSTENTÁVEL

    CERTIFICADO DE APROVAÇÃOCERTIFICADO DE APROVAÇÃOCERTIFICADO DE APROVAÇÃOCERTIFICADO DE APROVAÇÃO

    AVALIAÇÃO DE RESISTÊNCIA À ALUMÍNIO EM Brachiaria brizantha TRANSFORMADAS COM O GENE neMDH.

    FLAVIO ROCHAFLAVIO ROCHAFLAVIO ROCHAFLAVIO ROCHA

    Keila Maria Roncato DuarteKeila Maria Roncato DuarteKeila Maria Roncato DuarteKeila Maria Roncato Duarte---- Orientadora Orientadora Orientadora Orientadora

    CoCoCoCo----orientador: Luiz Humberto Gomesorientador: Luiz Humberto Gomesorientador: Luiz Humberto Gomesorientador: Luiz Humberto Gomes

    Aprovado como parte das exigências para obtenção de título de MESTRE em Produção

    Animal Sustentável, pela Comissão Examinadora:

    Dra. Keila Maria Roncato Duarte Instituto de Zootecnia-APTA/SAA

    Dr. Leonardo Costa Fiorini Instituto de Zootecnia-APTA/SAA

    Dr. Gildemberg Amorin Leal Jr.Nome do Membro Universidade de Alagoas

    Data da realização:08 de fevereiro de 2011

    Presidente da Comissão Examinadora Profa. Dra. Keila Maria Roncato Duarte

  • vi

    DEDICATÓRIA

    À todos do Instituto de Zootecnia que acompanharam meu crescimento, desde estagiário, e sempre estiveram ao meu lado. Dedico à aqueles que estão presentes e à aos que já se foram, a estes últimos guardo saudades.

  • vii

    AGRADECIMENTOS

    À minha orientadora Dra. Keila Maria Roncato Duarte e a seu marido, e co-orientador, Dr. Luiz Humberto Gomes, pela amizade e por me ajudarem a tornar essa tese possível.

    Ao Dr. Paulo Bardauil Alcântara e a sua esposa Dra. Valquiria de Bem Gomes

    Alcântara, pela oportunidade e confiança no desenvolvimento desse projeto. Ao Dr. Waldssimiler Teixeira de Matos, pela colaboração no desenvolvimento dos

    testes agronômicos, e por toda ajuda. À Dra. Vera Maria Quecini, pelos passos iniciais de transformação genética, que

    permitiram o desenvolvimento desse projeto. Aos meus amigos Andréa Júdice Piveta, Angela Daniela Pertile Dozzo, Patricia Brás,

    Suleize Rocha Terra e Thiago Perez Granato. Aos professores e colegas da pós-graduação. À minha família, por todo apoio e carinho. Á todos que, de forma direta ou indireta, auxiliaram no desenvolvimento desse

    projeto. À empresa MATSUDA, por todo financiamento do projeto. À Pós-Graduação do Instituto de Zootecnia, pelo curso de mestrado. Ao Instituto de Zootecnia, por permitir a realização desse projeto.

  • viii

    SUMÁRIO Resumo................................................................................................................................. ix Abstract ................................................................................................................................. x LISTA DE FIGURAS...........................................................................................................xi LISTA DE TABELAS .........................................................................................................xii 1 – INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 1 2- REVISÃO DE LITERATURA .......................................................................................... 3

    2.1 Plantas forrageiras ........................................................................................................ 3 2.2 Brachiaria brizantha ..................................................................................................... 4 2.3 Reprodução Apomítica ................................................................................................. 6 2.4 Solos ácidos e o alumínio solúvel ............................................................................... 10 2.5 Toxidez e tolerância ao alumínio em plantas............................................................... 12 2.6 Genes de Tolerância ao Alumínio............................................................................... 14 2.7 Gene MDH................................................................................................................. 15 2.8 Transformação genética em plantas ............................................................................ 16 2.9 Técnicas Moleculares de Detecção de Genes .............................................................. 19 2.10 Extração de DNA Vegetal ........................................................................................ 19 2.11 PCR – “Polymerase Chain Reaction”........................................................................ 22 2.12 Eletroforese em Gel de Agarose ............................................................................... 27

    3- MATERIAL E MÉTODOS............................................................................................. 32 3.1 Material Vegetal......................................................................................................... 32 3.2 Teste com higromicina ............................................................................................... 33 3.3 Extração de DNA vegetal ........................................................................................... 33 3.4 Desenho dos iniciadores (Primers).............................................................................. 34 3.5 Amplificação do gene neMDH ................................................................................... 35 3.6 Teste agronômico de tolerância ao alumínio ............................................................... 36 3.7 Delineamento experimental e análise estatística.......................................................... 38 3.8 Soluções e Tampões ................................................................................................... 39

    4 – RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................................... 41 4.1 Teste com higromicina ............................................................................................... 41 4.2 Extração de DNA Vegetal .......................................................................................... 43 4.3 Amplificação do gene neMDH ................................................................................... 43 4.4 Teste agronômico de tolerância ao alumínio ............................................................... 45

    5-CONCLUSÕES................................................................................................................ 51 6- REFERÊNCIAS .............................................................................................................. 52

  • ix

    Avaliação de Resistência à Alumínio em Brachiaria brizantha Transformada com o Gene neMDH

    Resumo As plantas forrageiras são de grande importância para o Brasil, pois são a base para a bovinocultura de corte e de leite, bem como para ovino e equinocultura. A produção agrícola em solos ácidos, que constituem quase a metade do total da superfície arável da Terra, tem como principal limitação à toxidez por alumínio, que se manifesta na redução do crescimento radicular, diminuindo a absorção de nutrientes e água do solo, pela planta. No Brasil, solos ácidos perfazem mais de 50 % das terras cultiváveis e praticamente duas espécies são cultivadas nessas áreas: Brachiaria. brizantha e Brachiaria. decumbens, sendo que gênero Brachiaria sp é essencialmente caracterizado por cultivares de reprodução assexuada, constituindo, assim, extensos monocultivos clonais, cuja vulnerabilidade coloca em risco todo o sistema produtivo. Portanto, esse trabalho teve como objetivo avaliar a resistência ao alumínio em genótipos de B. brizantha cv. MG4 transformadas com o gene neMDH, através de cultivo em solução nutritiva; confirmar a integração do transgene através de PCR; e testar a resistência dos genótipos ao antibiótico higromicina. Os resultados mostram que os genótipos de B. brizantha transformados, apresentam evidências de integração do transgene neMDH. Pois, o teste de resistência em solução nutritiva contendo diferentes concentrações de alumínio mostrou que 4 genótipos adquiriram tolerância ao alumínio, mas apenas 2 genótipos tiveram peso seco médio, de raiz e parte aérea, superior ao genótipo selvagem. A amplificação por PCR revelou uma possível assimilação de sequências desconhecidas de DNA, talvez por influência de gene MDH endógeno de B. brizantha. O fenótipo de resistência à higromicina não foi confirmado, provavelmente por falha na metodologia de avaliação de plantas adultas. Contudo, os testes iniciais foram positivos para resistência à higromicina como também para expressão do gene GUS, indicando uma transformação bem sucedida.

    Palavras-chave: braquiaria, alumínio, transgenia, neMDH

  • x

    Aluminium resistance evaluation in Brachiaria brizantha transformed with the neMDH gene

    Abstract Forage crops are of a great importance for Brazil as it is the base for beef cattle and milk production, as well as for sheep and equine. Agricultural production in acid soils, which constitute about half of total arable land on earth, is limited by aluminium toxicity, which is manifested by root reduction growth decreasing nutrients and water absorption from soil by the plant. In Brazil, acid soils means more than 50 % of farmland and only two major Brachiaria species are cultivated: Brachiaria. brizantha and Brachiaria. decumbens, thus constitute extensive clonal monocultures, whose vulnerability endangered the entire production system. Therefore, this study aimed to evaluate the aluminium resistance of transformed genotype of B. brizantha cv. MG4 with the neMDH gene, using PCR, agronomic tests with nutrient solutions and antibiotic resistance, which was used in the transforming protocol. Results showed the B. brizantha cv. MG4 transformed genotypes were confirmed by the neMDH gene integration by PCR, for the antibiotic hygromycin resistance was visible, due to the HPT gene used in the vector construction. Resistance on the agronomic test, using different concentrations of aluminium, 4 genotypes acquired tolerance to aluminum, but only 2 genotypes had average dry weight, of roots and shoots higher than the wild type genotype. PCR amplification revealed a possible assimilation of unknown sequence of DNA, perhaps under the influence of endogenous MDH gene from B. brizantha. The phenotype of hygromycin resistance was not confirmed in adult plants, probably due to the evaluation methodology. However, initial tests were positive for hygromycin resistance as well as for expression of the GUS gene, indicating a successful transformation. Key words: brachiaria, aluminium, transgenic, neMDH

  • xi

    LISTA DE FIGURAS Figura 1 – Esquema da reprodução sexual e apospórica em Brachiaria sp. CMM: célula mãe do megásporo; CMP: célula mãe do grão de pólen........................................................................................8 Figura 2 – Solos ácidos no mundo – áreas de predominância..................................................................12 Figura 3 – Reação em Cadeia de Polimerase (PCR). ...............................................................................24 Figura 4 – Perfilho marcado com fita (seta), para teste com higromicina Perfilho marcado com fita (seta), para teste com higromicina .....................................................................................................33 Figura 5 – Formato FASTA parcial do gene neMDH e a posição de pareamento dos primers, para geração de um produto de 222 pb. Primer forward com inicio na posição 805 e reverse na posição 1026.............................................................................................................................................35 Figura 6 – Teste agronômico para verificar tolerância ao Alumínio: sementes obtidas dos genótipos F0 de braquiária (a) foram semeadas em tubetes plásticos com areia (b, c); os brotos obtidos tiveram a areia removida, foram envoltos em vermiculita e submetidos a três concentrações de alumínio dissolvido (d). ...............................................................................................37 Figura 7 – Delineamento experimental em blocos ao acaso, em esquema fatorial 6 x 3, cinco genótipos transformados (1 à 5) e um testemunha (6) e três concentrações de alumínio (A, B, C ), com cinco repetições.............................................................................................................................39 Figura 8 – Despigmentação causada pelo aplicação do antibiótico higromicina (seta) no genótipo transformado 4, e no genótipo testemunha 6, de B. brizantha ..................................................42 Figura 9 - Despigmentação causada pelo aplicação do antibiótico higromicina (seta) em genótipos transformados (1 à 5) e genótipos testemunhas (6 e 7) de B. brizantha. .................................42 Figura 10 – Eletroforese em gel de agarose 1%. (A) DNA total extraído de folhas de genótipos transformados de B. brizantha (1 à 5) e testemunha (6). (B) PCR com primers para o gene ITS. ..........43 Figura 11 – PCR com primers para o gene neMDH em (C) plasmídeo usado na transformação das plantas de B. brizantha, (1 à 5) genótipos tranformados, (6) genótipo testemunha. (P) marcador de peso molecular 1kb GeneRuler™ DNA Ladder (Fermentas). Eletroforese em gel de agarose 1%. .........................................................................................................................................44 Figura 12 – Geração F1 de genótipos transformados (1-5) e testemunha (TEST) de B. brizantha, expostas a diferentes concentrações de alumínio: 0 umol L-1 (A), 111 umol L-1 (B) e 444 umol L-1 (C).......................................................................................................................................................46 Figura 13 – Média do peso seco e desvio padrão de raiz de genótipos de B. brizantha transformadas (1, 2, 3, 4, 5) e testemunha (6), submetidas aos tratamentos de 0 uM, 111 uM e 444 uM, de alumínio. ...............................................................................................................................49 Figura 14 - Média do peso seco e desvio padrão de parte aérea de genótipos de B. brizantha transformadas (1, 2, 3, 4, 5) e testemunha (6), submetidas aos tratamentos de 0 uM, 111 uM e 444 uM, de alumínio ................................................................................................................................49

  • xii

    LISTA DE TABELAS Tabela 1 – Faixa de tempo e temperatura para cada etapa do ciclo de PCR ........................................... 27 Tabela 2 – Faixa de concentração de cada componente para uma reação de PCR.................................. 27 Tabela 3 – Concentrações de agarose no gel para separação de diferentes tamanhos de fragmentos de DNA................................................................................................................................. 29 Tabela 4 – Concentração de cada componente utilizado na reação de PCR ........................................... 35 Tabela 5 – Tempo e temperatura utilizado para cada etapa do ciclo de PCR.......................................... 36 Tabela 6 – Composição das soluções-estoque e da solução nutritiva empregadas no estudo de tolerância de plantas ao alumínio ............................................................................................................ 38 Tabela 7 – Concentração final de cada nutriente da solução nutritiva .................................................... 38 Tabela 8 – Média e coeficiente de variação (CV) do peso seco da raiz de genótipos de B. brizantha transformados (1, 2, 3, 4, 5) e testemunha (6), submetidos aos tratamentos de 0 uM, 111 uM e 444 uM, de alumínio. E coeficiente de correlação (CC) entre peso seco e concentração de alumínio. ....................................................................................................................... 48 Tabela 9 – Média e coeficiente de variação (CV) do peso seco da parte aérea de genótipos de B. brizantha transformados (1, 2, 3, 4, 5) e testemunha (6), submetidos aos tratamentos de 0 uM, 111 uM e 444 uM, de alumínio. E coeficiente de correlação (CC) entre peso seco e concentração de alumínio. ....................................................................................................................... 48

  • 1

    1 – INTRODUÇÃO A produção pecuária no Brasil se apóia principalmente em áreas de pastagens de

    gramíneas do gênero Brachiaria sp. O uso extensivo de áreas de pastagens tem levado a uma

    uniformização cada vez maior dos pastos que, no Brasil, se concentram em praticamente duas

    espécies, Brachiaria brizantha e Brachiaria decumbens. A busca por biodiversidade genética

    utilizando uma planta apomítica (sem reprodução sexual) para suprir grandes áreas de plantio

    é bastante complicado, porém, de uma importância imensurável, considerando a

    sustentabilidade do sistema produtivo de carne bovina e seus impactos na economia do Brasil.

    O melhoramento clássico de Brachiaria sp é realizado por hibridação ou por seleção massal a

    campo, onde plantas com características desejáveis se destacam visualmente e estas plantas

    são multiplicadas. Contudo, o melhoramento de plantas hoje exige procedimentos cada vez

    mais rápidos e eficientes e de preferência a menores custos.

    A produção agrícola em solos ácidos, que constituem quase a metade do total da

    superfície arável da Terra, tem como principal limitação à toxidez por Alumínio (Al), que se

    manifesta na redução do crescimento radicular, impedindo a absorção de nutrientes e água do

    solo. Estes solos estão localizados principalmente no Sudeste Asiático, na América Latina e

    na região próxima ao Saara na África. Coincidindo com a localização de áreas em que a

    utilização de insumos agrícolas, como a aplicação de calagem para a neutralização do solo e,

    conseqüente insolubilização de Al, é restrita. No Brasil, solos ácidos perfazem mais de 50 %

  • 2

    das terras cultiváveis. O uso de variedades tolerantes ao Al restaura a capacidade produtiva de

    regiões de solos ácidos com altos teores de Al. O objetivo deste trabalho, portanto, foi:

    Avaliar a resistência ao Al em plantas de Brachiaria brizantha transformadas com o gene

    neMDH (Nodule Enhanced Malate Dehydrogenase); Confirmar a integração do transgene

    através de PCR.; Verificar a expressão do gene de resistência ao antibiótico higromicina,

    usado na seleção das plantas transformadas.

  • 3

    2- REVISÃO DE LITERATURA

    2.1 Plantas forrageiras

    As plantas forrageiras são de grande importância para o Brasil, pois são a base para a

    bovinocultura de corte e de leite, bem como para ovino e eqüinocultura, ocupando uma área

    cultivada com mais de 150 milhões de hectares, sendo mais de 85% delas ocupadas com

    capins do gênero Brachiaria sp(MACEDO, 2006).

    Pastagens de Brachiaria sp expandem-se por quase toda a América tropical e parte do

    sudeste asiático. No Brasil, esta forrageira se adaptou muito bem a ambientes de cerrado,

    tendo ocupado aproximadamente 100 milhões de hectares, e praticamente duas espécies são

    cultivadas nessas áreas: B. brizantha e B. decumbens, seguidas pela B. ruziziensis

    (CARNEIRO et al., 2003; MACEDO, 2006). Em São Paulo, forrageiras de Brachiaria sp,

    ocupam mais de 50% da área de pastos plantados e 49% do total das culturas (PAULINO et

    al., 2002).

    A criação de animais em pastos cultivados promoveu um diferencial qualitativo para a

    carne brasileira, em função de barreiras sanitárias, e permitiu que a pecuária se tornasse fonte

    de riqueza para o país (RESENDE et al., 2008). Dados do IBGE (2007) apontam o Brasil

    como o dono do segundo maior rebanho comercial do mundo, perdendo apenas para a Índia.

  • 4

    O cultivo de Brachiaria sp movimenta a indústria brasileira de sementes, colocando o

    Brasil como o maior produtor, consumidor e exportador de sementes de forrageiras tropicais

    (SOUZA et al., 2006)

    Entre 1950 e 1980, investiu-se muito no melhoramento de pastagens nativas pela

    introdução de leguminosas, de adubações em linhas ou na superfície, de manejos estratégicos

    controlando a pressão de pastejo e até a utilização de fogo. Também utilizou-se, e ainda

    continua a ser utilizado, a substituição de pastagem nativa por pastagens de cultivares

    exóticas, solteiras ou consorciadas com cultivares de leguminosas tropicais, oriundas de

    programas de melhoramento de estrangeiros (RESENDE et al., 2008).

    Esse conceito de melhoramento significa um aumento na capacidade de suporte das

    pastagens, geralmente com aumento na qualidade da forragem, o que resultava no aumento de

    ganho em peso por animal e por área. O melhoramento de forrageiras tropicais e temperadas,

    no Brasil e no mundo, é uma atividade realizada por poucas equipes, além de ser

    relativamente recente, com ênfase apenas nos últimos 30 anos (RESENDE et al., 2008).

    A intensificação da pecuária pressupõe o desenvolvimento de cultivares de forrageiras

    com melhor desempenho e eficiência na utilização dos insumos, daí a grande demanda por

    variedades melhoradas e adaptadas aos diversos ecossistemas pastoris do país, principalmente

    no cerrado onde se encontra a maior disponibilidade de áreas de pastagens, cujo solo é de

    baixa fertilidade. As pastagens cultivadas baseiam-se, ainda, no uso de poucas cultivares

    forrageiras, portanto com baixa variabilidade genética. Além disso, são conhecidas várias

    deficiências qualitativas em algumas delas, as quais podem ser corrigidas por

    complementação de caracteres por meio do melhoramento genético, especialmente quanto à

    tolerância ao alumínio tóxico e adaptação a solos pobres. A adoção de cultivares melhoradas

    deve aumentar a produtividade por animal e por área, bem como contribuir para a

    diversificação de pastagens no Brasil tropical (RESENDE et al., 2008).

    2.2 Brachiaria brizantha

    O gênero Brachiaria sp se encontra inserido na divisão Antophyta; subdivisão

    Angiospermae; classe Monocotyledonae; ordem Pales (Glumiflorales); família Poaceae

    (Gramineae); subfamília Panicoideae; e tribo Panicea. Com base em estudos florísticos foi

  • 5

    sugerida uma nova nomenclatura para algumas espécies, antes formalmente inseridas no

    gênero Brachiaria sp, incluindo-as no gênero Urochloa. Sendo nomeadas, por exemplo,

    como: U. brizantha, U. decumbens (GONZÁLEZ e MORTON, 2005). No entanto, a

    nomenclatura como gênero Brachiaria sp, será mantida nesse trabalho para fins de melhor

    compreensão.

    O gênero Brachiaria sp inclui cerca de 100 espécies de ocorrência nas regiões

    tropicais e subtropicais de ambos os hemisférios, mas o centro de origem das principais

    espécies de valor agronômico é a África oriental. A adaptação dessas espécies é ampla,

    abrangendo várzeas inundáveis, margens de florestas ralas e até regiões semidesérticas, mas a

    ocorrência mais comum é em vegetação de savana (RESENDE et al., 2008).

    Sete espécies de Brachiaria sp (B. arrecta, B. brizantha, B. decumbens, B.

    dictyoneura, B. humidicola, B. mutica e B. ruziziensis) têm sido as mais utilizadas como

    plantas forrageiras na América tropical (KELLER-GREIN et al., 1996).

    Algumas forrageiras do gênero Brachiaria sp foram trazidas da África para o Brasil

    no período colonial (PARSONS, 1972). Devido a sua adaptação excepcional a solos ácidos e

    de baixa fertilidade natural, alguns ecótipos de Brachiaria sp, introduzidos entre 1960 e 1975,

    tiveram nas três décadas seguintes uma ampla expansão nos cerrados brasileiros e savanas da

    América tropical (RESENDE et al., 2008).

    Ao longo desse tempo, a tecnificação da produção de sementes para suprir esse grande

    mercado colocou o Brasil como o maior produtor e exportador de sementes de forrageiras

    tropicais do mundo. Assim, cultivares produzidas para os ecossistemas brasileiros acabaram

    por impactar sistemas de produção de ruminantes ao redor do mundo tropical (RESENDE et

    al., 2008).

    Entre 1968 e 1972, com intensa importação de sementes de B. decumbens cv. Basilisk,

    e através de incentivos governamentais formaram-se extensos monocultivos nos cerrados

    brasileiros. A boa adaptabilidade aos solos ácidos e pobres, a fácil multiplicação por

    sementes, associada à agressividade na competição com invasoras, e o bom desempenho

    animal, comparado às pastagens nativas, explicam a rápida expansão dessa braquiária nos

    trópicos. Problemas com as cigarrinhas-das-pastagens, que dizimaram essas pastagens na

  • 6

    Amazônia; a fotossensibilização, especialmente em bezerros desmamados; e as extensas áreas

    de pastagens degradadas, associadas ao manejo indevido (superpastejo, falta de adubações de

    manutenção ou compactação do solo), se generalizaram e estimularam a busca por outras

    variedades (RESENDE et al., 2008).

    A liberação de B. brizantha cv. Marandu em 1984 (NUNES et al., 1984), resistente às

    cigarrinhas, promoveu gradual substituição das áreas com B. decumbens, e, por sua vez,

    constituiu um novo monocultivo a partir de meados da década de 1980 e que perdura até hoje

    (RESENDE et al., 2008).

    O gênero Brachiaria sp é essencialmente caracterizado por cultivares de reprodução

    assexuada (apomítica) constituindo assim, extensos monocultivos clonais, cuja

    vulnerabilidade coloca em risco todo o sistema produtivo (RESENDE et al., 2008).

    2.3 Reprodução Apomítica

    Tanto as plantas superiores como inferiores apresentam um ciclo de vida que alterna,

    entre uma geração esporofítica dominante e outra gametofítica. Na fase reprodutiva o

    esporófito produz esporos (2n) que após divisão meiótica seguida de mitoses, dá origem aos

    gametófitos masculino e feminino. A redução do número de cromossomos pela meiose é

    extremamente importante na reprodução sexual, propiciando recombinação genética no

    momento da fusão dos gametas, masculino e feminino, segregação e a liberação de

    variabilidade genética (RAVEN et al., 1996).

    No entanto, em 15% das famílias das angiospermas ocorre um tipo de reprodução

    denominada apomixia (do grego apo - longe e mixis - mistura), sinônimo de agamospermia,

    ou seja, há formação de sementes sem que ocorra fecundação. Setenta e cinco por cento das

    espécies apomíticas estão nas famílias Poaceae, Asteraceae e Rosaceae (ASKER e JERLING,

    1992; DALL’AGNOL e SCHIFINO-WITTMANN, 2005).

    A apomixia é um modo de reprodução assexual por sementes na qual, as plantas

    geradas são clones da planta-mãe. Na apomixia o desenvolvimento do embrião ocorre sem

    fertilização da oosfera (gameta feminino). Na apomixia pseudogâmica, a fertilização da célula

    central do saco embrionário pelo gameta masculino é essencial para formação do endosperma

  • 7

    das sementes. Já na apomixia autônoma a fertilização não é necessária em absoluta para

    formação da semente (CARNEIRO et al., 2003).

    A apomixia é composta de três elementos básicos, que podem ser subdivididos, todos

    necessários para a produção de semente viável: ausência ou alteração da meiose evitando a

    redução (apomeiose); ativação da oosfera para formar um embrião na ausência da fertilização

    (partenogênese); e iniciação do endosperma, tanto autonomamente ou pseudogamicamente. O

    desenvolvimento apomítico pode ser considerado como um curto-circuito ou desregulação em

    estágios chaves do programa de desenvolvimento sexual (SPILLANE et al., 2001a; 2001b).

    Segundo Asker e Jerling (1992), a reprodução apomítica gametofítica é a mais

    amplamente distribuída em gramíneas forrageiras como as do gênero Brachiaria sp. Nesse

    tipo de apomixia há formação de um saco embrionário não reduzido (diplóide), por dois

    caminhos diferentes: diplosporia (célula mãe de megásporo não entra em meiose, ou esta é

    incompleta, e, por mitoses, dá origem a um saco embrionário não reduzido) ou aposporia

    (células somáticas do óvulo dão origem, por divisões mitóticas, a um saco embrionário não

    reduzido). Nestes sacos embrionários não reduzidos, haverá desenvolvimento do embrião a

    partir da oosfera (partenogênese) ou, mais raramente, a partir das sinérgidas ou antípodas

    (apogametia), também não reduzidas.

    O endosperma pode desenvolver-se também autonomamente, ou seja, somente a partir

    dos núcleos polares, ou pela união de um núcleo masculino (pólen) com os núcleos polares

    (pseudogamia). Em apomíticos pseudogâmicos há, portanto, necessidade de polinização, mas

    apenas para a formação do endosperma (ASKER e JERLING, 1992).

    Em geral, a microsporogênese (formação do pólen) precede a megagametogênese

    (formação do saco embrionário) e se desenvolve de forma normal, tanto em plantas

    apomíticas como nas sexuais: meiose da célula-mãe do micrósporo (2n cromossomos) seguida

    da formação de quatro gametas reduzidos (n cromossomos) (RESENDE et al., 2008).

    A megagametogênese em Brachiaria sp pode seguir duas alternativas (Figura 1). A

    primeira é por via sexual: a meiose regular da célula-mãe do megásporo (CMM) resulta em

    uma tétrade de células reduzidas, na qual apenas uma sofre três mitoses, resultando um saco

    embrionário meiótico do tipo Polygonum. Os oito núcleos se diferenciam em uma célula-ovo;

  • 8

    duas células sinérgicas, de vida efêmera; dois núcleos polares e três células antípodas. A

    célula-ovo, uma vez fecundada, se transforma em embrião, e os núcleos polares, fecundados,

    formam o endosperma da semente (RESENDE et al., 2008).

    A segunda é por via assexual, na qual o saco embrionário apospórico do tipo Panicum

    se desenvolve a partir de uma célula somática (2n) no nucelo (tecido que circunda a CMM). A

    meiose ocorre, mas as quatro células reduzidas resultantes se degeneram e células somáticas

    do nucelo sofrem mitoses sucessivas produzindo sacos embrionários de quatro núcleos: uma

    oosfera, duas sinérgidas e um núcleo polar. Apenas o núcleo polar é fecundado (pseudogamia)

    e a célula-ovo, não reduzida, dará origem ao embrião por partenogênese. Mais de uma célula

    somática pode iniciar o desenvolvimento e isso resulta em sacos múltiplos dentro do ovário.

    Nunca se observou mais do que uma semente por espigueta em Brachiaria sp, portanto,

    supõe-se que algum mecanismo de seleção e eliminação se estabeleça para que apenas um

    embrião sobreviva (RESENDE et al., 2008).

    FIGURA 1 : Esquema da reprodução sexual e apospórica em Brachiaria sp. CMM:

    célula mãe do megásporo; CMP: célula mãe do grão de pólen (CARNEIRO e DUSI, 2004)

    Várias das gramíneas forrageiras tropicais de importância econômica são apomíticas

    (RESENDE et al., 2008). Este modo de reprodução foi verificado em B. brizantha (ALVES,

  • 9

    2000), onde o pólen produzido por estas plantas é reduzido, contém três núcleos e sua

    viabilidade e diâmetro variam ao longo do período de floração. A pseudogamia foi

    evidenciada observando-se a não formação de sementes em plantas com estigmas excisados e

    a fertilização do núcleo polar pelo gameta masculino (ALVES et al., 2001). O embrião

    partenogenético é oriundo da oosfera e o desenvolvimento inicial do endosperma é do tipo

    nuclear-livre e está sempre associado à presença do embrião (CARNEIRO et al., 2003).

    A apomixia em Brachiaria sp é geralmente facultativa, isto é, algumas flores exibem

    ocasionalmente sacos meióticos passíveis de serem fecundados e originarem híbridos

    chamados de off-types. No exame microscópico é comum encontrar sacos meióticos entre 30

    e 40 ovários examinados; porém, ao analisar progênies no campo, esses off-types não são

    detectados fenotipicamente. Tal fato poderia ser explicado pela vantagem adaptativa da

    apomixia sobre a sexualidade, que independe de polinização e fecundação, portanto menos

    sujeita a estresses bióticos e abióticos. Além disso, sacos apospóricos desenvolvem-se mais

    rapidamente do que os meióticos (NDIKUMANA, 1985), assim se ambos os sacos coexistem

    no mesmo ovário, o apospórico tende a comprimir o meiótico, que se degenera. Esse fato é

    muito importante na fertilização ou partenogênese, pois determina o comportamento

    reprodutivo da flor em questão (RESENDE et al., 2008).

    O gênero Brachiaria sp também é caracterizado por uma maioria de espécies

    poliplóides. Darlinhton e Wylie (1955) determinaram que os números básicos de

    cromossomos para o gênero são, n=6, n=7 ou n=9. A implicação dessas descobertas reflete-se

    no planejamento do programa, pois restringe os cruzamentos, uma vez que Ferguson e

    Crowder (1974) demonstraram a impossibilidade de realizar cruzamentos interplóidicos

    (RESENDE et al., 2008).

    A apomixia é considerada um entrave ao melhoramento genético uma vez que as

    características paternas não são transmitidas à progênie. No entanto, pela capacidade das

    plantas apomíticas de clonagem através de sementes, este modo de reprodução despertou o

    interesse de pesquisadores, da área de biotecnologia (CARNEIRO et al., 2003).

    Os apomíticos podem ser considerados como potencialmente importantes na história

    evolutiva das plantas e muito importantes para o melhoramento, já que a manipulação da

    apomixia pode ser uma ferramenta importantíssima para melhoristas. A hipótese de que a

  • 10

    apomixia seria um beco sem saída na evolução foi descartada devido à descoberta de que a

    maioria dos taxa apomíticos são facultativos e que populações sexuais, mesmo raras,

    permitem aumentar a diversidade genética (BASHAW et al., 1970).

    2.4 Solos ácidos e o alumínio solúvel

    Solos ácidos representam aproximadamente 30% da superfície terrestre não coberta

    por gelo, 50% das terras potencialmente agricultáveis do mundo, e mais de 64% da superfície

    da América do Sul, constituindo um dos principais obstáculos para a produção vegetal (VON

    UEXHÜLL e MUTERT, 1995; BELLON, 2001; PANDA et al., 2009).

    A baixa fertilidade de solos ácidos se deve, geralmente, pela combinação de: toxidez

    por alumínio, manganês e ferro; deficiência de fósforo, cálcio, magnésio e potássio. A

    produtividade destes solos também é afetada por fatores físicos que incluem baixa capacidade

    de retenção de água, susceptibilidade à erosão, formação de crostas e, especialmente,

    compactação (VON UEXHÜLL e MUTERT, 1995).

    Os solos podem ser ácidos devido à própria pobreza em bases do material de origem,

    ou a processos de formação que favorecem a remoção ou lavagem de elementos básicos como

    K, Ca, Mg, Na e outros. Além disso, os solos podem ter sua acidez aumentada por cultivos e

    adubações. A origem da acidez do solo é causada principalmente por lavagem de Ca e Mg do

    solo pela água da chuva ou irrigação, remoção dos nutrientes pelas colheitas e utilização da

    maioria dos fertilizantes químicos (OLIVEIRA et al., 2005).

    Como conseqüência da acidez do solo, ocorre um aumento da solubilidade de

    alumínio (Al), o terceiro elemento mais abundante na crosta terrestre, solubiliza-se na solução

    do solo em diversas formas iônicas, principalmente Al+3, o íon mais fitotóxico para

    monocotiledôneas (KOCHIAN, 1995; KOCHIAN et al., 2004).

    A toxidez por Al é a principal limitação para a produção em 37,9% das pastagens do

    Sudeste da Ásia, 30,9% da América Latina e aproximadamente 20% da Ásia Oriental, da

    África Sub-Saara e da América do Norte (WOOD et al., 2000).

  • 11

    Comumente, a acidez do solo e os problemas advindos dela, são corrigidos através da

    prática de calagem, que consiste na aplicação e incorporação de calcário no solo. Embora a

    calagem possa eliminar os efeitos tóxicos do Al solúvel, para que isso ocorra com efetividade

    é necessário que o calcário seja aplicado no solo de forma uniforme e posteriormente seja bem

    incorporado (CANÇADO et al., 2001).

    O preço médio da calagem agrícola no ano de 2000 era de US$5;60/tonelada, um valor

    na época correspondente à R$10,64/tonelada. Considerando que no ano de 2000 houve um

    consumo aparente de calcário de 19.812 milhões de toneladas, o valor gasto pelos brasileiros

    apenas na compra de calcário foi de R$210.799.680,00. No ano de 2008, houve um aumento

    no consumo de calcário no Brasil, indo para 21.764 milhões de toneladas (NAHASS,

    SEVERINO, 2003; IPNI, 2009).

    Apesar do custo do calcário ser baixo em relação a outros insumos agrícolas, o custo

    envolvido no seu transporte, aplicação e incorporação é elevado. Além disso, a incorporação

    do calcário em camadas profundas do solo é inviável, o que acaba favorecendo o

    desenvolvimento radicular apenas na camada superficial do solo, tornando as plantas mais

    suscetíveis a oscilações na disponibilidade de água no solo (CANÇADO et al., 2001).

  • 12

    Figura 2 : Solos ácidos no mundo – áreas de predominância (World Soil Resources,

    FAO, 1991)

    2.5 Toxidez e tolerância ao alumínio em plantas

    O primeiro sintoma de toxidez é a inibição da elongação da raiz, que ocorre após

    poucos minutos do início da exposição ao Al (RYAN et al., 1993). Este cátion, quando em

    contato com as raízes, promove rapidamente a paralisação do crescimento radicular, acabando

    por atrofiá-las em função da morte do meristema radicular. As plantas apresentam sintomas

    de deficiência de nutrientes, tais como fósforo, cálcio, magnésio, potássio e molibdênio,

    devido à interferência do Al nos processos de absorção, transporte e uso destes nutrientes, e se

    tornam mais suscetíveis ao estresse hídrico, comprometendo o desenvolvimento global da

    planta (BARCELO e POSCHENRIEDER, 2002). Ao que tudo indica, o ápice radicular é o

    sítio primário da ação do Al (BENNET et al., 1987; RYAN et al., 1993).

    A presença da forma fitotóxica do Al causa a alteração da arquitetura dos lipídios

    constituintes da membrana plasmática e, conseqüentemente, a sua desorganização. Além

    deste, a parede celular, o citoesqueleto e o núcleo celular, também são possíveis alvos para os

  • 13

    efeitos tóxicos do Al (KOCHIAN, 1995; KOCHIAN et al., 2004). Em soluções nutritivas

    simples, concentrações micromolares de Al são responsáveis pelo início da inibição do

    crescimento radicular em 60 minutos (DE LA FUENTE et al., 1997).

    A exsudação de ácidos orgânicos pelas raízes parece ter um importante papel na

    detoxificação do Al. O processo de sinalização de estresse, pela mitocôndria e por

    mecanismos bioquímicos, na presença de Al, demonstra ser uma etapa importante à ser

    compreendida (PANDA et al., 2009). A exsudação de ácidos orgânicos já foi descrito até o

    momento para 17 espécies de plantas cultivadas (MARIANO et al., 2005).

    Em plantas com capacidade de quelar e seqüestrar o Al internamente, compostos tais

    como catecois, compostos fenólicos e mesmo ácidos orgânicos ligam-se ao Al inativando-o.

    Posteriormente, o complexo é armazenado em células especializadas, tais como células da

    epiderme foliar (JENSEN et al., 2002; WATANABE e OSAKI, 2002).

    Em espécies selvagens, muito pouco é conhecido sobre a base genética da tolerância a

    Al (MCNEILLY, 1994). Provavelmente, mecanismos múltiplos de tolerância devem estar

    atuando conjuntamente em uma mesma espécie de planta, podendo o número e a intensidade

    de ação destes mecanismos variar entre as diferentes espécies (KOCHIAN et al, 2004).

    Embora haja uma pequena variabilidade entre ecótipos de Brachiaria brizantha para

    tolerância a Al, é difícil a obtenção de híbridos nos cruzamentos entre plantas apomíticas e

    planta sexuais devido à diferença na ploidia das plantas no modo de reprodução sexual e

    apomítica (DO VALLE, 1990).

    Acredita-se que genes regulados por Al tenham uma função protetora (EZAKI et al..,

    2001). A introdução de genes exógenos ou o aumento na expressão de genes endógenos

    promove aumentos significativos na tolerância à presença de altas concentrações de Al

    solúvel no solo para diversas culturas (DE LA FUENTE et al., 1997; DELHAIZE et al., 2001;

    TESFAYE et al., 2001; ANOOP et al., 2003; DELHAIZE et al., 2004).

  • 14

    2.6 Genes de Tolerância ao Alumínio

    Estudos recentes, empregando perfis de expressão de genomas inteiros de plantas e

    Saccharomyces. cerevisiae, revelaram que genes relacionados a estresse biótico e abiótico são

    induzidos na presença de níveis tóxicos de Al, como genes envolvidos em estresse oxidativo,

    tratamentos com fitormônios, carência de fósforo, toxidez por outros metais, dano mecânico e

    ataque de patógenos (CRUZ-ORTEGA et al., 1997; HAMEL et al., 1998; SIVAGURU et al.,

    2001). Conseqüentemente, a indução de proteínas e enzimas relacionadas a estresses bióticos

    e abióticos foi sugerida como responsável por evitar a ação tóxica do Al em plantas (EZAKI

    et al., 2001; SIVAGURU et al., 2001).

    Entretanto, o mecanismo considerado como o mais eficiente para impedir a toxidez

    por Al é a exudação de ácidos orgânicos tais como malato, oxalato, ou citrato pela raiz. Estes

    ânions orgânicos são responsáveis pela formação de quelatos com o Al na rizosfera

    impedindo sua penetração na raiz (RYAN et al., 1995).

    A superexpressão da enzima citrato sintase (CS) de Pseudomonas aeruginiosa em

    plantas de tabaco e mamão promoveu a resistência a níveis tóxicos de Al (DE LA FUENTE et

    al., 1997), entretanto os resultados não foram confirmados em estudo posterior (DELHAIZE

    et al., 2001). Os autores sugeriram que a ausência de tolerância observada foi devida à

    estrutura terciária incorreta da proteína de origem procariótica em células vegetais e não

    devida à ineficácia do método de detoxificação. Concordando com esta sugestão, a

    superexpressão da CS de nódulos de Medicago sativa em plantas de alfafa e da CS

    mitocondrial de Arabidopsis thaliana em plantas de Brassica napus e em células de S.

    cerevisiae, conferiu maior tolerância a níveis tóxicos de Al (TESFAYE et al., 2001; ANOOP

    et al., 2003).

    Em Arabidopsis thaliana (Landsberg erecta x Columbia) 95% da tolerância a Al é

    explicada pela presença de dois QTLs (quantitative trait loci) que co-segregam com a

    liberação de malato pelas raízes (HOEKENGA et al., 2003).

    Em geral, as gramíneas forrageiras do gênero Brachiaria sp apresentam tolerância a

    Al, porém desconhecem-se os mecanismos responsáveis, embora haja evidências de que não

    envolva a exudação de ácidos orgânicos para a rizosfera (WENZL et al., 2001).

  • 15

    Semelhantemente, em arroz a exudação de ácidos orgânicos não parece ser o principal

    mecanismo responsável pela tolerância ao Al, pois apenas uma quantidade pequena de citrato

    foi detectada na rizosfera de plantas submetidas a estresse de Al e na análise trancripcional

    mediante toxidez, não foram observadas alterações na regulação de genes envolvidos na

    síntese e exudação de ácidos orgânicos (MAO et al., 2004). O transcriptoma de arroz sob

    estresse de Al revelou o envolvimento de genes de função desconhecida e da proteína

    semelhante á ubiquitina SUMO-1 (small ubiquitin-like modifier-1, OsAR16) que

    aparentemente funciona na proteção e/ou reparo em situações de estresse (MAO et al., 2004).

    Sasaki et al. (2004) clonaram o gene ALMT1 de trigo que co-segrega com a tolerância

    e codifica uma proteína com características de canal aniônico seletivamente permeável a

    malato e induzido por Al. A proteína ALMT1 localiza-se na membrana plasmática, e quando

    expressa ectopicamente em oócitos de Xenopus e em células de arroz e de tabaco (Nicotiana

    tabacum) promove o efluxo de malato em presença de Al (SASAKI et al., 2004). Além disso,

    quando expressa em células de tabaco, a proteína ALMT1 promove a capacidade de

    recuperação do metabolismo celular após a exposição a níveis tóxicos de Al por 18 horas. A

    expressão de ALMT1 dirigida pelo promotor da ubiquitina promoveu a tolerância de plantas

    intactas de cevada a níveis tóxicos de Al em ambos, solução nutritiva e em solos ácidos

    (DELHAIZE et al., 2004).

    2.7 Gene MDH

    A enzima malato dehidrogenase (MDH) catalisa a redução reversível de oxaloacetato à

    malato utilizando o sistema coenzimático NAD/NADH. Esta enzima é importante em várias

    vias metabólicas. Plantas superiores possuem várias isoformas que diferem em especificidade

    de coenzima e localização subcelular: no cloroplasto tem um papel critico na manutenção do

    mecanismo de redução/oxidação entre o citosol e o estroma; na mitocôndria participa no ciclo

    do ácido cítrico; no citosol e peroxissomos está envolvido na facilitação do transporte de

    malato-aspartato; e em glioxissomas participa na beta-oxidação (Minárik et al., 2002).

    Leguminosas têm ainda outro uso para o MDH no processo de fixação de nitrogênio.

    Em nódulos de raiz malato serve como fonte primária de carbono para respiração de bactérias

    microssimbiontes, e consequentemente na fixação de nitrogênio. Portanto, o nodule-enhanced

    MDH (neMDH) pode ter um papel critico na função do nódulo. Vários estudos têm indicado

  • 16

    neMDH como responsável por elevação da concentração de malato em nódulos raiz (Miller et

    al., 1998).

    2.8 Transformação genética em plantas

    A transformação genética é o processo de introdução controlada de ácidos nucléicos

    exógenos em um genoma receptor, sem comprometer a viabilidade das células. Com os

    avanços da tecnologia de DNA recombinante, é possível transferir para plantas genes isolados

    de outras plantas, ou mesmo de animais e microrganismos (PERANI et al., 1986).

    A transformação genética de plantas tem sido empregada com os mais diversos

    objetivos. Por exemplo, plantas geneticamente modificadas têm sido geradas na tentativa de

    identificar a função de genes e gerar linhagens com características agronômicas úteis para os

    programas de melhoramento (ARAGÃO et al., 2002). Através desses programas, diversos

    genes foram introduzidos estavelmente em plantas, conferindo resistência a herbicidas,

    fungos, bactérias, vírus, insetos e resistência a estresses ambientais (SANTARÉM, 2000).

    O objetivo maior de um programa de melhoramento é, portanto, a criação e/ou seleção

    de genótipos que respondam às demandas exigidas e solucionem problemas ou corrijam

    deficiências específicas de cultivares existentes, para uso nos sistemas de produção vigentes

    (RESENDE et al., 2008).

    Melhoramento genético de forrageiras tropicais se trata de uma atividade recente no

    Brasil, em contraste com a Europa e América do Norte que desenvolvem centenas de novas

    cultivares de forrageiras temperadas anualmente (RESENDE et al., 2008). E no caso de

    Brachiaria sp, os programas de melhoramento genético têm buscado encontrar soluções para

    limitações não resolvidas por manejo (VALLE, et al., 2004).

    Os métodos de transferência de genes podem variar em eficiência e aplicabilidade,

    dependendo da espécie e/ou do tecido alvos da transformação (SANTARÉM, 2000).

    Para que o processo de transformação seja efetivo, o DNA deve ser introduzido em

    células ou tecidos vegetais aptos a regenerarem plantas completas. Um dos fatores limitantes

    na transformação genética tem sido a baixa eficiência das técnicas de cultura de tecidos

  • 17

    vegetais in vitro. Aliado a isso, em muitas situações, a esterilidade total ou parcial das plantas

    transgênicas obtidas pode consistir em uma barreira para a finalização desse processo.

    Portanto, para iniciar os trabalhos de transformação, os aspectos relacionados à regeneração

    de plantas, através da cultura de tecidos, devem ser completamente elucidados (SANTARÉM,

    2000).

    A transferência de genes para espécies vegetais tem sido possível utilizando métodos

    diretos ou indiretos de transformação. O método indireto é aquele no qual se utiliza um vetor,

    como Agrobacterium tumefaciens (CHILTON et al., 1977) ou Agrobacterium rhizogenes

    (CHILTON et al., 1982), de forma a intermediar a transferência de genes. Apesar de ser um

    método muito utilizado na obtenção de plantas transgênicas, algumas dicotiledôneas e a

    maioria das monocotiledôneas e gimnospermas não são suscetíveis, ou apresentam pouca

    suscetibilidade, à infecção pela Agrobacterium (POTRIKUS, 1990).

    A importância da Agrobacterium para os estudos de transformação de plantas reside

    na capacidade natural que esses patógenos possuem de introduzir DNA em plantas

    hospedeiras. Esse DNA é integrado e passa a ser expresso como parte do genoma da planta

    (HOHN, 1992). Como conseqüência dessa expressão, o padrão normal de desenvolvimento é

    alterado, no caso de: A. tumefaciens, ocorre a formação de tumores, e a infecção por A.

    rhizogenes resulta na proliferação de raízes (LIPP-NISSINEN, 1993).

    A bactéria A. tumefaciens é a mais usada para estudos de transformação. Durante a

    infecção por A. tumefaciens, uma parte do plasmídeo, denominada T-DNA ou DNA de

    transferência, é transferida para a célula vegetal e integrada no genoma (HOHN, 1992).

    Os métodos de transferência direta de genes utilizam processos físicos ou químicos

    que causam modificações nas paredes e membranas celulares, facilitando a introdução de

    DNA exógeno. Diversos métodos diretos têm sido propostos, variando em sua eficiência e

    praticidade. Entre eles, os métodos que resultam em maior número de espécies transformadas

    são a eletroporação de protoplastos (células sem parede celular), a transformação por

    polietilenoglicol (PEG) e o bombardeamento de partículas (biobalística) (FISK e

    DANDEKAR, 1993).

  • 18

    Os métodos diretos não requerem a utilização de vetores biológicos. A eficiência do

    método de transformação vai depender da espécie em estudo e do tecido usado como alvo da

    transformação e, de maneira geral, os parâmetros devem ser otimizados para cada técnica

    (SANTARÉM, 2000).

    O método de bombardeamento de partículas baseia-se no uso de um equipamento que

    produz uma força propulsora, usando pólvora, gás ou eletricidade, para acelerar

    micropartículas inertes (geralmente ouro ou tungstênio), cobertas com DNA, em direção às

    células alvo. Após o bombardeamento, uma proporção de células atingidas permanece viável;

    o DNA é integrado no genoma vegetal resultando na expressão estável do gene introduzido

    (FINER et al., 1996).

    A princípio, as moléculas de DNA integram-se ao acaso no genoma, embora haja

    indicações de que se integrem em regiões com alta atividade transcricional (BRASILEIRO e

    DUSI, 1999).

    O número de cópias dos transgenes inseridos no genoma varia de acordo com a

    metodologia empregada na transferência de genes. Com os métodos diretos, são detectadas

    múltiplas cópias, como também a fragmentação e recombinação do transgene (HADI et al.,

    1996; SIEMENS e SCHIEDER, 1996). Por sua vez, a transformação por Agrobacterium é

    considerado um processo mais preciso, com integração de uma ou poucas cópias no genoma

    da planta (SANTARÉM, 2000).

    Há uma variação considerável na expressão dos transgenes em plantas transformadas,

    que não decorre necessariamente da diferença no número de cópias. Assim, a atividade do

    gene não é exclusivamente determinada pelos níveis de transcrição (SANTARÉM, 2000).

    Fatores epigenéticos podem influenciar os níveis de expressão, podendo levar à

    inativação do gene por inibição da transcrição ou do acúmulo de RNA mensageiro (RNAm).

    Esse fenômeno, denominado silenciamento de genes, pode ser influenciado pelo local de

    inserção do transgene e está associado à metilação do DNA receptor (VAUCHERET et al.,

    1998).

  • 19

    A transformação genética não encerra com a obtenção de plantas transgênicas que

    expressam o fenótipo desejado. São necessárias exaustivas pesquisas para garantir que essas

    plantas não apresentem riscos à saúde e ao ambiente, permitindo que sejam inseridas no

    sistema produtivo (SANTARÉM, 2000).

    Segundo Resende et al. (2008), plantas forrageiras melhoradas devem expressar seu

    mérito em sistemas produtivos ao longo do tempo, em um ambiente complexo de interações

    solo-planta-animal-clima (RESENDE et al., 2008).

    2.9 Técnicas Moleculares de Detecção de Genes

    A técnica mais amplamente utilizada para detecção e análise de genes é Reação em

    Cadeia de Polimerase (PCR), que permite que um único um gene, de uma amostra de DNA,

    seja copiado inúmeras vezes (amplificação), de forma relativamente rápida (GRIFFITHS et

    al., 2000). Para que a PCR seja bem sucedida, antes é necessário que haja uma eficiente

    extração de DNA da amostra em questão, e um método de visualização do gene amplificado,

    geralmente por eletroforese em gel de agarose.

    2.10 Extração de DNA Vegetal

    O isolamento de DNA de material vegetal é uma etapa importante na análise da

    estrutura e organização do genoma de plantas. Preparações de DNA vegetal são, comumente,

    utilizadas como substratos em reações de PCR para estudos filogenéticos ou no

    desenvolvimento de marcadores moleculares. Independente do tipo de estudo molecular, as

    preparações de DNA devem produzir amostras puras suficientes para não inibir os

    tratamentos enzimáticos ou causar interferências nos padrões de migração em gel de

    eletroforese (ROMANO e BRASILEIRO, 2002).

    Em plantas, vários fatores podem influenciar essas características, incluindo desde os

    procedimentos para a coleta e armazenamento do tecido vegetal até o processo de extração de

    DNA e de armazenamento do DNA extraído (BONATO et al., 2002).

    Determinadas espécies de plantas apresentam elevada proporção de compostos

    polifenólicos e de mucilagens foliares. Com o rompimento das células, durante o processo de

    extração de DNA, os polifenóis podem oxidar e reagir de forma irreversível com proteínas e

  • 20

    ácidos nucléicos, o que torna o procedimento de extração e de amplificação de DNA mais

    complexo, necessitando de otimizações que possam facilitar a operacionalização (COUCH e

    FRITZ, 1990; FALEIRO, et al., 2003).

    Diferentes métodos de extração de DNA a partir de tecido foliar, como os baseados no

    CTAB (brometo de cetiltrimetilamônio) e no SDS (sódio dodecil sulfato) têm sido utilizados e

    estão bem estabelecidos para muitas espécies. A maior parte deles é uma variação de

    protocolos básicos desenvolvidos por Doyle e Doyle, 1987. Entretanto, dependendo da

    espécie em estudo e das condições laboratoriais, são necessárias algumas modificações e

    adaptações nos protocolos para a obtenção de padrões nítidos e reprodutíveis de bandas de

    DNA (FERREIRA e GRATTAPAGLIA, 1995).

    Cada etapa do procedimento de extração de DNA pode ser adaptado de forma a

    colaborar na obtenção de DNA de boa qualidade. Para o procedimento de amostragem de

    tecido foliar, Bonato et al. (2002) indicam preferencialmente a coleta de tecido novo, onde

    ocorre a fase ativa de crescimento das plantas. Ele mostrou que para plantas do gênero

    Brachiaria sp, pode-se utilizar material foliar adulto; Sendo o material coletado ideal para

    extração DNA de qualidade tanto a partir de material foliar fresco, processadas logo após a

    coleta, quanto a partir de tecidos armazenados a -20 °C por aproximadamente um mês.

    Quando armazenadas, sempre que possível, as folhas devem estar inteiras para minimizar a

    área de contato com o oxigênio (COUCH e FRITZ, 1990).

    Ao iniciar a extração de DNA, a primeira etapa é romper paredes celulares com o

    objetivo de liberar seus constituintes. Essa etapa é realizada geralmente pelo congelamento do

    tecido vegetal em nitrogênio líquido, e posterior quebra mecânica com o auxílio de um pilão e

    de um almofariz, no caso de extração em larga escala, tendo-se o cuidado para manter as

    folhas sempre congeladas pela adição de nitrogênio líquido. Para extração em pequena escala,

    utiliza-se um pequeno bastão de vidro e um tubo de microcentrífuga. Nesse caso, as

    preparações freqüentemente se destinam a reações de PCR e podem ser realizadas somente na

    presença de tampão de extração, sem a adição de nitrogênio líquido (ROMANO e

    BRASILEIRO, 2002; BONATO et al., 2002).

    A segunda etapa é romper as membranas celulares para liberação do DNA. Essa etapa

    é realizada pela adição do tecido macerado em um tampão de extração, contendo o detergente

  • 21

    CTAB ou SDS. No caso de utilizar CTAB, para sua solubilização e ação é adicionada uma

    concentração de 1,4 M de NaCl e para manutenção do pH e evitar a ação de DNAses é

    utilizado um sistema Tris-HCl pH 8,0. As DNAses degradam o DNA quando a solução está

    com pH próximo de 7,0 (ROGERS e BENDICH, 1985).

    Outro componente empregado é a adição de EDTA (ácido etileno diamono tetracético)

    no tampão de extração. O EDTA é uma substância quelante de cátions divalentes, como Mg+2

    e Ca+2 e, portanto, inibe a ação de DNAses, que usam esses metais como cofatores

    (SAMBROOK et al., 2001, BONATO et al., 2002).

    Em baixa concentração de sais (menor que 0,5 M à temperatura ambiente) o CTAB

    forma complexos insolúveis com os ácidos nucléicos. Os polissacarídeos, compostos

    fenólicos, e enzimas contaminantes não precipitam nesta condição e podem, após

    centrifugação, ser descartados no sobrenadante. O complexo DNA-CTAB é solúvel apenas

    em solução com elevada concentração de sais, portanto, para remoção do CTAB deve haver

    uma solubilização em tampão TE (Tris-EDTA), rico em sais, e posterior precipitação do ácido

    nucléico com etanol. O CTAB é solúvel em etanol 80% sendo, portanto, facilmente removido

    no sobrenadante (ROGERS e BENDICH, 1985).

    O tecido macerado, junto do tampão de extração, precisa ser incubado em banho-maria

    a 65 ºC, por um tempo de 20 à 60 minutos para que haja lise celular. Um tempo maior de

    incubação apresenta um melhor rendimento no processo de extração de DNA (AHMED et al.,

    2009).

    Para proteger o DNA da ação de compostos fenólicos que oxidam o DNA

    irreversivelmente, algo que pode ser evidenciado pela coloração do DNA que tende a ficar

    marrom; deve ser adicionado ao tampão de extração agentes anti-oxidantes, como PVP

    (polivinilpirrolidona), BSA (albumina de soro bovino); ou 2-mercaptoetanol (um agente

    redutor que desnatura proteínas como peroxidases e polifenoloxidases) (ROMANO e

    BRASILEIRO, 2002; BONATO et al., 2002).

    Polisssacarídeos inibem a ação de enzimas de restrição e tornam a amostra de DNA

    excessivamente viscosa, interferindo na migração do DNA em corridas eletroforéticas,

    portanto, devem ser separados dos ácidos nucléicos (SHIODA e MARAKAMI-MUOFUSHI,

  • 22

    1987). O detergente CTAB é utilizado com essa finalidade, já que polissacarídeos e ácidos

    nucléicos possuem solubilidade diferenciada na presença desse detergente. Polissacarídeos

    também podem ser removidos pelo emprego de gradiente de cloreto de césio (CsCl)

    (ROMANO e BRASILEIRO, 2002).

    Extrações com solventes orgânicos são utilizados para separar ácidos nucléicos das

    proteínas. Para tanto, realiza-se de uma a várias extrações com clorofórmio-álcool isoamílico

    (24:1) ou fenol-clorofórmio-álcool isoamílico (25:24:1), que desnaturam as proteínas

    tornando-as insolúveis à fase aquosa, este procedimento é realizado através de inversões tendo

    cuidado para não causar danos físicos ao DNA. Depois por centrifugação ocorre separação da

    fase orgânica da fase aquosa. Na fase orgânica, que fica na parte inferior da solução, são

    retidos e descartados os lipídeos, proteínas e alguns polissacarídeos. Na fase aquosa, ficam o

    DNA e alguns contaminantes como RNA e alguns polissacarídeos (BONATO et al., 2002;

    ROMANO e BRASILEIRO, 2002; AHMED et al., 2009).

    Após separação do DNA dos compostos contaminantes, o CTAB deve ser removido

    através de solubilização em sais e precipitação do DNA por etanol, que é sedimentado por

    centrifugação (como mencionado anteriormente). Depois o DNA deve ser lavado com etanol

    70% e secado à temperatura ambiente. O DNA, então, é suspenso em tampão TE, onde

    permanecerá armazenado na forma concentrada. A diluição para uma solução de trabalho é

    feita com água miliQ (BONATO et al., 2002).

    O DNA pode ser armazenado à -20º C, para um uso futuro. Apesar do ato de congelar

    e descongelar continuamente poder danificar o DNA, dessa forma interferindo na

    reprodutibilidade dos resultados de uma PCR, Ahmed et al. (2009) mostraram que este

    procedimento pode ser realizado por até 2 anos sem comprometimento da qualidade das

    amplificações (AHMED et al., 2009).

    2.11 PCR – “Polymerase Chain Reaction”

    Descoberto em 1983 por Kary Banks Mullis, mas publicado apenas em 1985, consiste

    na amplificação do DNA por um número de ciclos de forma a torná-lo visível, geralmente em

    eletroforese usando gel de agarose. Foi criado originalmente para geração de uma grande

    quantidade de cópias de um único fragmento de DNA genômico (SAIKI et al., 1985;

  • 23

    VANGUILDER et al., 2008). Esse método tem como principio a capacidade natural de

    replicação do DNA, onde uma enzima DNA polimerase catalisa a polimerização (junção de

    várias partes) de nucleotídeos, ao adicionar desoxirribonuclotídeos trifosfatos (dNTPs) à

    extremidade 3’ de uma cadeia de nucleotídeos em crescimento, ou de um iniciador (primer),

    complementar ao molde unifilamentar de DNA (GRIFFTHS et al., 2001).

    A Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) é um procedimento rápido para

    amplificação enzimática in vitro de um específico segmento de DNA. O número de aplicações

    da PCR é bem amplo. Ele inclui: identificação de agentes infecciosos, triagem de desordens

    genéticas, estudo de mínimas quantidades de DNA extraído de fósseis, identificação de um

    suspeito através de materiais contendo DNA na cena do crime, sequênciamento genético,

    engenharia genética, identificação de impressões (semelhanças) genéticas, análise de variação

    em seqüência alélica, análise da estrutura do RNA transcrito (SHAMPO et al., 2002;

    AUSUBEL et al., 2003).

    Os componentes básicos da PCR são: uma dupla-fita de DNA à ser amplificada

    (molde); dois oligonucleotídeos iniciadores complementares ao molde (primers), um para

    cada fita posicionadas inversamente; uma enzima replicadora de DNA (DNA polimerase);

    desoxirribonucleotídeos trifosfatos (dNTPs),; um tampão pH 8,8 e sais (Cloreto de magnésio

    [MgCl2], cloreto de potássio [KCl]) (AUSUBEL et al., 2003). E um aparelho, termociclador,

    capaz de produzir as variações de temperatura necessárias para cada etapa da PCR.

    Para que a reação funcione, é necessário uma grande quantidade de primers e dNTPs

    em comparação ao DNA molde. Por desnaturação as fitas do DNA molde são separadas, e

    uma segunda etapa promove o anelamento dos primers as suas fitas complementares, agora a

    enzima DNA polimerase catalisa a síntese de uma nova fita no sentido 5’ – 3’, usando os

    primers como iniciadores das novas fitas. Pela síntese resultam duas novas fitas-simples de

    DNA de tamanho indeterminado, pareadas as fitas parentais. Cada fita, por ser complementar

    à um dos primers, pode participar como molde nos próximos ciclos. Novos produtos são então

    formados a cada ciclo de desnaturação, anelamento, e síntese (ou extensão) (AUSUBEL et al.,

    2003).

    No entanto, um segundo ciclo produz duas fitas-simples que pareadas formam uma

    fita-dupla e, devido a isso, a partir deste ciclo todas as novas fitas terão exatamente o

  • 24

    comprimento existente entre os primers. A quantidade de produtos dobra a cada subseqüente

    ciclo, acumulando exponencialmente em 30 ciclos, por exemplo, um produto amplificado 270

    milhões de vezes (AUSUBEL et al., 2003).

    Figura 3: Reação em Cadeia de Polimerase (PCR), DNA que será amplificado é

    desnaturado. Na presença de DNA polimerase e excesso de dNTPs, os primers se anelam em

    sua seqüência específica dando inicio a síntese de uma nova fita de DNA. O primeiro ciclo é

    caracterizado pela formação de um produto de tamanho indeterminado; no entanto, um

    segundo ciclo sintetiza um produto do tamanho exato da distância existente entre os primers.

    O ciclo continua até que haja uma amplificação em quantidade adequada do fragmento de

    DNA (AUSUBEL et al., 2003).

    A primeira enzima replicadora de DNA utilizada, E.coli DNA polimerase I, tinha a

    desvantagem de ser inativada durante a etapa de desnaturação, sendo necessário adicionar

    uma nova alíquota a cada ciclo. Para resolver tal incomodo, localizou-se na bactéria Thermus

    aquaticus, existente nos poços ferventes superaquecidos do Parque Yellowstone

    (ASHCROFT et al., 2000), uma DNA polimerase, Taq DNA polimerase, resistente ao

    DNA molde Primer Novo DNA

    DNA + primers + dNTPs + DNA polimerase

    Desnaturação e síntese

    Desnaturação e síntese

    Desnaturação e síntese

  • 25

    aquecimento da etapa de desnaturação (SAIKI et al., 1988). Com isso, a enzima Taq DNA

    polimerase também permitiu uma otimização nas temperaturas de anelamento e síntese,

    gerando produtos de maior especificidade (AUSUBEL et al., 2003).

    Para otimização da PCR muitas modificações de protocolo podem ser realizadas.

    Henegariu et al. (1997), verificaram que a variação do tempo de anelamento, entre 30 s à 120

    s, e o tempo de extensão, entre 30 s à 150 s, não apresentam grande influência na obtenção de

    produtos com até 600 pares de bases (pb). Esses resultados estão de acordo com a regra geral

    de síntese de aproximadamente 1000 pb.minuto-1 (HENEGARIU et al., 1997).

    Já a temperatura de anelamento e a temperatura de extensão apresentam grande

    influência nos resultados, sendo a temperatura de anelamento dependente da constituição dos

    primers, e a temperatura de extensão variável entre 65 ºC à 72 ºC. No entanto, para produtos

    entre 100-300 pb pode haver um melhor rendimento ao diminuir a temperatura de extensão.

    Foi verificado que um número de ciclos de 28 à 30, são suficientes para uma boa reação,

    quando visualizado em gel de agarose marcado com brometo de etídio (HENEGARIU et al.,

    1997).

    Primers com baixa quantidade dos nucleotídeos GC (50%) preferem temperaturas entre 55 °C à 60 ºC. O tamanho dos primers

    geralmente variam de 20 pb à 30 pb, sendo que primers maiores aumentam a especificidade e

    primers menores causam um efeito oposto (AUSUBEL et al., 2003).

    Primers sem complementariedade entre eles são indicados para evitar que se anelem,

    formando os dímeros, esses dímeros podem fazer com que a DNA polimerase os utilize como

    molde para síntese de nova fita, dessa forma interferindo na correta amplificação. Uma

    quantidade inferior de DNA molde também pode estimular a formação de dímeros

    (AUSUBEL et al., 2003).

    A quantidade de primers para uma boa reação depende do número de loci (regiões do

    DNA) a serem amplificados, podendo variar de 0,04 uM à 0,6 uM. A Taq DNA polimerase

    exige magnésio livre para trabalhar, além do magnésio vinculado aos dTNPs e DNA, sendo

  • 26

    esse o provável motivo de o aumento de dTNPS ser capaz de inibir a reação (HENEGARIU et

    al., 1997).

    A concentração de MgCl2 e dNTPs na reação são proporcionais. Usando 3 mM de

    MgCl2 há um melhor resultado com dNTPs na concentração de 200 uM à 400 uM de cada.

    Uma concentração superior de dNTPs age inibindo a amplificação, e concentrações inferiores

    tornam o produto pouco visível. Ao estabelecer uma concentração de 200 uM de cada dNTP,

    verifica-se uma melhora na qualidade do produto de acordo com aumento na concentração de

    MgCl2, de 1,8 mM à 10,8 mM, tornando as bandas mais visíveis e com menos

    inespecificidade, no entanto, concentrações superiores à 20mM de MgCl2 agem inibindo a

    amplificação (HENEGARIU et al., 1997).

    Um tampão contendo 50 mM KCl mostra melhores resultados na proporção de até 2x

    (100 mM KCl). No entanto, primers que amplificam grandes produtos preferem uma menor

    concentração de sais, e primers que amplificam pequenos produtos preferem uma maior

    concentração. Em concentração elevada de sais os maiores produtos podem ser desnaturados

    (HENEGARIU et al., 1997).

    A quantidade de DNA molde deve estar entre 30 ng à 500 ng para 25uL de reação.

    Concentrações inferiores, ao nível de picogramas de DNA, podem gerar uma boa

    amplificação desde que haja uma diminuição da temperatura de anelamento dos primers, às

    vezes até 10 °C – 12 °C a menos. Uma concentração adequada de Taq DNA polimerase se

    encontra entre 0,5 à 2 unidades para 25uL de reação, concentrações maiores podem colocar

    um excesso de glicerol na reação resultando numa amplificação desbalanceada

    (HENEGARIU et al., 1997; SAMBROOK et al., 2001).

    A etapa de desnaturação é onde ocorre a completa separação das fitas complementares,

    geralmente um tempo de 30 s à uma temperatura de 94° C mostra-se suficiente. Se a

    quantidade de GC for muito elevada, uma maior temperatura de desnaturação pode ser

    necessária, mas com isso corre-se o risco de inativar a Taq DNA polimerase. No primeiro

    ciclo é importante que haja uma total desnaturação dos componentes, portanto, é indicado que

    a amostra permaneça aproximadamente 5 min. à 94 ºC. Determinados protocolos encerram a

    reação de PCR com um longo tempo de extensão, na tentativa de sintetizar um produto o mais

    completo possível (AUSUBEL et al., 2003), 3 à 5 min. demonstram ser suficientes.

  • 27

    Tabela 1: Faixa de tempo e temperatura para cada etapa do ciclo de PCR (AUSUBEL

    et al., 2003).

    Número de ciclos: 28-30 Tempo Temperatura

    Desnaturação inicial 5 minutos 94 ºC

    Ciclo Desnaturação 30 segundos 94 ºC

    Anelamento 30-120 segundos 55 ºC-60 ºC

    Extensão 30-150 segundos 65 ºC-72 ºC

    Extensão final 3-5 minutos 65 ºC-72 ºC

    Resfriamento Infinito 4 ºC

    Tabela 2: Faixa de concentração de cada componente para uma reação de PCR

    (HENEGARIU et al., 1997; SAMBROOK et al., 2001; AUSUBEL et al., 2003).

    Reação de 25 uL

    Componente Concentração final

    Tampão para PCR com KCl (50mM) 1x - 2x

    4dNTP mix 0,2 - 0,4 mM

    MgCl2 1,8 – 10,8 mM

    Primer1 0,04 uM-0,6 uM

    Primer2 0,04 uM-0,6 uM

    DNA molde 30 – 500 ng

    Taq DNA polimerase 0,5 -2 unidades

    2.12 Eletroforese em Gel de Agarose

    O termo eletroforese foi criado por Michaelis, em 1909, para descrever a migração de

    colóides sob a influência de um campo elétrico. Eletroforese representa, portanto, a migração

    de íons submetidos à corrente elétrica. Seu princípio é simples: moléculas com carga negativa

  • 28

    migram para pólo positivo (cátodo), e moléculas com carga positiva migram para o pólo

    negativo (ânodo) (ALFENAS, 1998).

    Na biologia molecular a eletroforese visa à separação de moléculas em função de suas

    cargas elétricas, de seus pesos moleculares e de suas conformações, em suportes porosos e

    tampões apropriados, sob a influência de um campo elétrico contínuo (ALFENAS, 1998). Na

    análise de DNA é muito utilizado eletroforese em gel de agarose, por se tratar de um método

    simples e altamente efetivo de separação, identificação, e purificação de fragmentos de DNA

    de aproximadamente 0,5 à 25 kb (AUSUBEL et al., 2003).

    Em eletroforese é importante manter o pH do meio estável, mediante o uso de

    soluções–tampão, que também devem permitir o fluxo de corrente elétrica. O sistema-tampão

    consiste de duas partes: o tampão do gel, usado no preparo do gel, e o tampão dos eletrodos

    (cátodo/ânodo) (ALFENAS, 1998).

    Devido a passagem de corrente elétrica, no cátodo haverá produção de H2 e OH-

    basificando a solução, e no ânodo haverá produção de O2 e H+, acidificando a solução, dessa

    forma havendo neutralização. Portanto, em ambos os eletrodos, haverá: produção de gases;

    perda de água e conseqüente aumento da concentração de eletrólitos; e aquecimento devido

    atrito dos íons do eletrólito com o meio (ALFENAS, 1998).

    Os ácidos nucléicos, devido aos fosfatos ao longo da cadeia, são uniformemente

    carregados negativamente. Uma grande diversidade de variáveis afetam a migração de ácidos

    nucléicos em géis, isso inclui: sua conformação, o tamanho dos poros do gel, o gradiente de

    voltagem aplicado, e a concentração de sais no tampão. A principal variável é o tamanho dos

    poros do gel, que determina o tamanho dos fragmentos que podem ser separados (AUSUBEL

    et al., 2003).

    A eletroforese pode ser dividida em três estágios: um gel é preparado com uma

    concentração apropriada de agarose para o tamanho dos fragmentos de DNA à serem

    separados (Tabela 3); as amostras de DNA são colocadas dentro de poços no gel e é aplicada

    uma voltagem por um determinado tempo até a completa separação dos fragmentos; e o gel é

    corado ou caso tenha sido incorporado brometo de etídio (0,5 ug/mL) no gel e/ou tampão de

    eletroforese, visualizado diretamente em luz Ultravioleta (UV). O uso de brometo de etídio

  • 29

    exige cuidado, por se tratar de um composto mutagênico e potencialmente carcinogênico

    (AUSUBEL et al., 2003).

    A velocidade de migração, dos fragmentos de DNA, é limitada pela força de atrito

    imposta pela matriz do gel. A carga e o tamanho podem afetar a taxa na qual macromoléculas

    passam pelo gel, no entanto, a proporção carga-massa é o mesmo para fragmentos de DNA de

    diferentes comprimentos. É o tamanho do DNA, portanto, que determina a taxa na qual ele

    passa através do gel, permitindo assim uma efetiva separação de fragmentos de DNA de

    diferentes tamanhos por eletroforese (AUSUBEL et al., 2003).

    A voltagem aplicada para separar as moléculas de DNA deve estar entre 1 à 10 V / cm

    de gel de agarose (AUSUBEL et al., 2003), a passagem de corrente elétrica pode ser

    evidenciada pela formação de bolhas em ambos os eletrodos, devido eletrólise.

    Tabela 3 – Concentrações de agarose no gel para separação de diferentes tamanhos de

    fragmentos de DNA (SAMBROOK et al., 2001).

    Concentração de

    agarose no gel (%)

    Limite de separação de fragmentos

    lineares de DNA (kb)

    0,3 5-60

    0,6 1-20

    0,7 0,8-10

    0,9 0,5-70

    1,2 0,4-6

    1,5 0,2-3

    2,0 0,1-2

    Para preparar o gel, a agarose deve ser adicionada em tampão de eletroforese e

    aquecida até derreter, geralmente em forno de microondas. A agarose derretida precisa ser

    resfriada a uma temperatura de aproximadamente 55° C, antes de ser derramada sobre a

    plataforma de gel, isso evita deformações do aparelho. Géis são tipicamente derramados na

    plataforma de forma a adquirir entre 0,5 e 1 cm de espessura. O volume dos poços, onde serão

    adicionadas as amostras de DNA, são determinados por dois fatores: a espessura do gel e o

    tamanho do pente. Depois de adicionado o pente, o gel de agarose tem de repousar tempo

  • 30

    suficiente até que endureça (30 à 45 minutos em temperatura ambiente) (SAMBROOK et al.,

    2001; AUSUBEL et al., 2003).

    A quantidade de DNA a ser colocada nos poços, deve obedecer o volume imposto pela

    relação largura x profundidade dos poços formados pelo pente no gel e, o número e tamanho

    dos fragmentos de DNA. Em um poço de 0,2 cm de profundidade × 0,5 cm de largura, podem

    ser adicionados de 2 à 200 ng, de uma amostra contendo um único tamanho de fragmento de

    DNA. Sendo que 2 ng se aproxima da quantidade mínima de detecção, de amostra com um

    único tamanho de fragmento de DNA, por brometo de etídio, e 200 ng se aproxima da

    quantidade máxima que pode ser detectado antes de haver sobrecarga (SAMBROOK et al.,

    2001; AUSUBEL et al., 2003).

    Para amostras que contenham fragmentos de DNA de vários tamanhos, uma

    quantidade entre 100 e 500 ng de DNA é normalmente utilizada. Até 10 ug de DNA podem

    ser separados adequadamente de amostras que contenham numerosos fragmentos de tamanhos

    diferentes (SAMBROOK et al., 2001; AUSUBEL et al., 2003).

    A adição de tampão de eletroforese tem de ser suficiente para cobrir o gel a uma

    profundidade de cerca de 1 milímetro, tomando cuidado para não formar bolhas de ar dentro

    dos poços. Os tampões de eletroforese mais utilizados são Tris/Acetato (TAE) e Tris/Borato

    (TBE). Tris/acetato é o tampão mais utilizado, apesar do fato de ser facilmente esgotado

    durante uma eletroforese de elevado tempo ou de alta tensão. Tris/Borato tem uma capacidade

    de tamponamento significativamente maior, mas deve ser evitado para procedimentos de

    purificação do DNA do gel (SAMBROOK et al., 2001; AUSUBEL et al., 2003).

    O meio mais comum de monitorar o progresso de uma separação eletroforética é

    seguindo a migração dos corantes que são incorporados ao tampão de carregamento. Dois

    corantes são muito utilizados, e exibem diferentes mobilidades eletroforéticas, são eles o

    xileno cianol e azul de bromofenol. Xileno cianol normalmente migra como fragmentos de

    DNA de cerca de 5 kb, e azul de bromofenol normalmente migra como fragmentos de DNA

    de cerca de 0,5 kb. Azul de bromofenol, portanto, fornece um índice de mobilidade dos

    fragmentos mais rápidos e é particularmente valioso na determinação do comprimento do gel

    sobre a qual a separação do DNA ocorreu. Xileno cianol é útil para monitorar o progresso de

    fragmentos maiores (SAMBROOK et al., 2001; AUSUBEL et al., 2003).

  • 31

    A forma mais conveniente e normalmente utilizada para visualizar DNA em gel de

    agarose é através da incorporação, no gel, do corante fluorescente brometo de etídio

    (SAMBROOK et al., 2001). O brometo de etídio se intercala entre as bases de ácidos

    nucléicos e fluoresce na cor laranja-vermelho (560 nm) quando iluminado com luz

    ultravioleta (260-360 nm). Isso permite que pequenas quantidades de DNA possam ser

    detectadas (SHARP et al., 1973).

    O brometo de etídio pode ser utilizado para detectar ácidos nucléicos de simples e

    dupla-fita (DNA e RNA). No entanto, a afinidade do corante para ácido nucléico de simples-

    fita é relativamente baixa e a fluorescência é comparativamente menor (SAMBROOK et al.,

    2001). Embora tenha um efeito leve sobre a mobilidade do DNA, elimina a necessidade de

    corar o gel após a conclusão da separação. Uma outra vantagem de executar o gel com

    brometo de etídio é que a mobilidade do DNA pode ser monitorada durante toda a execução,

    até que a separação desejada seja atingida (AUSUBEL et al., 2003).

    Entre as amostras aplicadas no gel, um dos poços, pelo menos, deve conter uma série

    de fragmentos de DNA de tamanhos conhecidos, para que uma curva padrão possa ser

    construída de forma a permitir o cálculo dos tamanhos dos fragmentos de DNA

    desconhecidos. O gel de agarose marcado com brometo de etídio pode ser fotografado,

    através de filtro laranja, quando iluminado com luz UV, normalmente com auxilio de

    fotodocumentador. Nesse procedimento deve-se ter cuidado em não se expor a luz UV, pois é

    prejudicial aos olhos e a pele (AUSUBEL et al., 2003).

  • 32

    3- MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Material Vegetal

    Cinco genótipos de Brachiaria brizantha cv. MG-4, apomíticas, transformadas no

    Instituto Agronômico de Campinas (IAC), cultivadas em casa de vegetação no Instituto de

    Zootecnia, identificadas pelos números: 1, 2, 3, 4 e 5. E um genótipo de B. brizantha cv. MG-

    4, selvagem, usada como testemunha.

    A introdução do transgene foi realizada no IAC pela Dra. Quecini (QUECINI, 2007;

    QUECINI, 2008), através de Agrobacterium. tumefaciens e aceleração de micropartículas

    (biobalística).

    Segundo Quecini (2007, 2008) para a transformação utilizou-se o vetor pCambia1301

    contendo: gene HPT, que confere resistência ao antibiótico higromicina sendo usado como

    agente de seleção das plantas transformadas; o gene repórter GUS, para verificar o nível de

    expressão genética; o promotor Ubi1 da ubiquitina de Zea mays, que permite altos níveis de

    expressão em monocotiledôneas; e o gene de interesse neMDH (“nodule-enhanced malate

    dehydrogenase precursor”), clonado da alfafa (Medicago sativa), cDNA 1645 pb; Miller et al.

    (1998); Tesfaye et al. (2001), acesso AF020273.1, para tolerância a Al.

  • 33

    Após a transformação os tecidos foram cultivados em meio contendo higromicina e

    submetidas ao teste GUS histoquímico, para avaliar a eficiência da transformação (QUECINI,

    2007; QUECINI, 2008).

    3.2 Teste com higromicina

    Os cinco genótipos transformados (F0) e dois genótipos testemunhas, de B. brizantha,

    foram testados quanto a presença do fenótipo de resistência ao antibiótico higromicina. Para

    isso, um perfilho de cada planta foi identificado com fita e em sua folha mais jovem, de

    lâmina aberta, foi aplicado e espalhado 20 uL de higromicina (Figura 4). Após 24 horas foi

    observado se houve, ou não, perda de pigmentação por clorose.

    Figura 4 - Perfilho marcado com fita (seta), para teste com higromicina. 3.3 Extração de DNA vegetal

    Para extração de DNA dos genótipos transformados (1,2,3,4,5) e genótipo selvagem

    (6) foi utilizado o protocolo descrito por Bonato et al. (2002), adaptado para Brachiar