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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIROCentro de Ciência da SaúdeFaculdade de Odontologia

Departamento de Odontopediatria e Ortodontia

Rio de Janeiro2011

RENATA ALVES OTERO

IDENTIFICAÇÂO DE HERPES VÍRUS HUMANO (TIPOS 1-8)NA CAVIDADE ORAL DE CRIANÇAS INFECTADAS PELO

HIV

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIROCentro de Ciência da SaúdeFaculdade de Odontologia

Departamento de Odontopediatria e Ortodontia

Rio de Janeiro2011

RENATA ALVES OTERO

IDENTIFICAÇÂO DE HERPES VÍRUS HUMANO (TIPOS 1-8)NA CAVIDADE ORAL DE CRIANÇAS INFECTADAS PELO

HIV

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Odontologia (Odontopediatria),

Faculdade de Odontologia, Universidade Federal do Rio

de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à

obtenção do título de Mestre em Odontologia

(Odontopediatria).

Orientadores:

Prof. Dra. Gloria Fernanda Barbosa de Araújo CastroProf. Dra. Norma Suely de Oliveira Santos

F ICHA CATALOGRÁFICA

Otero, Renata Alves

Identificação de herpes vírus humano (tipos 1-8) na cavidade oral decrianças infectadas pelo HIV. / Renata Alves Otero. Rio de Janeiro: UFRJ /Faculdade de Odontologia, 2012.

89 f. ; 31 cm.

Orientadores: Gloria Fernanda Barbosa de Araújo Castro e Norma Suelyde Oliveira Santos.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio de Janeiro,Faculdade de Odontologia, Programa de Pós-Graduação em Odontologia(Odontopediatria), 2012.

Referências bibliográficas: f. 44-48.

1. Herpesvirus Humano (1-8). 2. Boca. 3. HIV. 4. Infecções por HIV. 5.Manifestações Bucais. 6. Manifestações Bucais. 7. Reação em Cadeia daPolimerase. 8. Criança. 9. Estudos Transversais. 10. Estudos de Casos eControles. I. Castro, Gloria Fernanda Barbosa de Araújo. II. Santos, NormaSuely de Oliveira. III. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Faculdade deOdontologia, Pós- Graduação em Odontologia (Odontopediatria). IV. Título.

FOLHA DE APROVAÇÃO

OTERO, RENATA ALVES

"IDENTIFICAÇÃO DE HERPES VíRUS HUMANO (TIPOS 1-8) NA CAVIDADEORAL DE CRIANÇAS INFECTADAS PELO HIV"

Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-Graduação emOdontologia (Odontopediatria), Faculdade de Odontologia, UniversidadeFederal do Rio de Janeiro-UFRJ, como parte dos requisitos necessários àobtenção do título de Mestre em Odontologia (Odontopediatria).

Rio de Janeiro,

P of. Dr. Rogerio GleiserDO-Prof. Adjunto do ept" de Odontopediatria e Ortodontia da UFRJ

Profa. D . Gloria Femanda Barbosa de Araújo CastroDO-Profa. Adjun do Deptº de Odontopediatria e Ortodontia da UFRJ

Profa. Dra. Maria Teresa Villela RomanosDO-Profa. Adjunta da UFRJ

DEDICATÓRIA

A O M E U P A I LUIZ CARLOS , Q U E M E A P O I O U D U R A N T E T O D A A M I N H A

T R A J E T Ó R I A E S C O L A R , S E M N U N C A M E D I R E S F O R Ç O S P A R A M E D A R U M A

E D U C A Ç Ã O D E Q U A L I D A D E , P E R M I T I D O Q U E E U V I E S S E A C A M I N H A R

S O Z I N H A . D E D I C O À C O N Q U I S T A D E S S E S O N H O A V O C Ê , Q U E S E M P R E

A C R E D I T O U E M M I M , I N D E P E N D E N T E D O D E S A F I O A S U P E R A R .

AMO VOCÊ!

v

AGRADECIMENTOS

Á Deus por estar sempre comigo.

Aos meus pais Luiz Carlos e Regina Celi sem os quais minha vida não teria

sentido, pois nenhuma conquista seria possível sem o incentivo de vocês. Obrigada

por acreditarem em mim. Obrigada pelo amor incondicional. Obrigada por TUDO.

Amo Muito Vocês!!!

Aos meus avós Elza e Quilvio (in memorian) por toda a ternura que sempre

demonstraram nos mais simples gestos. Vocês são grandes exemplos para a minha

vida e dizer apenas obrigada não seria suficiente por tudo o que fizeram por mim.

Amo Vocês!

Aos meus irmãos Rodrigo e Rafael pela amizade de uma vida inteira. A

vocês, que fazem parte da minha história, que alegram a minha vida e se alegram

com minhas conquistas, um obrigada muito especial.

As minhas sobrinhas Gabriela, Martina e Julia pela alegria que me

proporcionam a cada gesto de carinho, pela responsabilidade de serem minhas fãs o

que me impulsiona a querer sempre mais. Obrigada por sempre torcerem por mim!

Tia “Tata” Ama Vocês!

Ao meu marido Bruno, meu grande amigo e incentivador nessa trajetória.

Obrigada por sempre acreditar em mim, por sonhar esse sonho junto comigo, pois

sem a sua ajuda, a realização desse sonho não seria possível. Amo Você

Eternamente!!!

A todos os meus tios e tias, em especial minha tia “Maleni”, querida por toda

a minha vida.

A prima Aninha por sempre cuidar com carinho do meu sorriso, pelo exemplo

de dedicação profissional, sendo o meu espelho no momento da escolha pela

odontologia. Muito Obrigada pelo incentivo! Primos e primas obrigada pelo carinho!

vi

Aos meus padrinhos André e Andréia, por estarem comigo nos momentos

mais importantes da minha vida. Vocês são grandes exemplos pra mim!

A minha grande amiga Brena por estar ao meu lado durante toda a minha

caminhada, da infância a vida adulta. Você faz parte das minhas melhores

recordações! Amigas de infância, amigas de profissão, amigas Sempre!!!

As minhas amigas Renata, Thaís, Luciana e Ana Catarina, que permitiram

que aos poucos eu fosse fazendo parte de suas vidas e me tornando suas grandes

amigas. Obrigada por estarem ao meu lado desde a adolescência e se tornarem

grandes exemplos pra mim.

Aos meus grandes amigos da graduação Mariana, Natália, Fernanda, Beth e

Vicente que estiveram comigo durante os anos mais gostosos da minha vida e até

hoje me acompanham, me incentivam e vibram com minhas conquistas.

Ao amigo Dennis Carvalho por me incentivar a dar um passo maior quando

ainda era aluna da especialização. Obrigada pelos ensinamentos de forma

descontraída no laboratório!!!

À Profª. Dr.ª Gloria Fernanda que me orientou nessa caminhada de forma

paciente e carinhosa, tornando-se uma orientadora-mãe. Obrigada por me incentivar

e acreditar em mim. Agradeço também pela disponibilidade de tempo, por todos os

ensinamentos e por me ajudar quando não era capaz, para que na próxima vez

pudesse fazer sozinha. Faço minhas as palavras da Raquel: “Você é a Melhor !!!

Ao Profa. Norma Suely apesar do pouco tempo de convívio pude aprender

muito com você. Obrigada por todos os ensinamentos e por acreditar em mim para

que esse trabalho pudesse ser realizado.

À Profª. Dr.ª Ivete Pomarico Ribeiro de Souza exemplo de profissional

competente, obrigada por todos os ensinamentos, pela disponibilidade e pelo

carinho demonstrado ao longo desses três anos. Obrigada pela oportunidade!

À amiga Flávia Nascimento por toda ajuda durante esses dois anos de

mestrado. Sem você, seria muito mais difícil. Obrigada por tudo!

vii

Aos amigos do LAVIREO, obrigada por me “apresentar” todo o laboratório,

pela paciência de me ensinar muitas coisas, por mais simples que pudessem ser e

pela disponibilidade de tempo na ajuda das análises das amostras. Muito Obrigada!

Aos queridos professores Rogério Gleiser, João Farinhas, Eduardo,

Marcelo Costa, Thomaz, Luciane Maia, Maristela Portela e Laura Primo,

obrigada por sempre me incentivar a crescer e a melhorar! Vocês são grandes

exemplos pra mim e têm um lugar muito especial no meu coração. Muito Obrigada!

As queridas amigas de turma Adílis, Camila e Ticiana, por fazerem

intensamente parte desses dois anos de mestrado. Obrigada por entrarem na minha

vida e compartilharem seus conhecimentos comigo. Aprendi muito com vocês!

Agradeço também pela amizade, carinho, preocupação e por me ajudarem quando

era preciso. Espero que nossa amizade seja eterna. Amo Vocês!

Aos amigos de mestrado Andréia, Daniela, Luciana e Yedda pela amizade e

carinho. Daqui a pouquinho são vocês!!!

Às doutorandas Ana Karla, Viviane Pierro, Patrícia, Lívia, Márcia, Valéria,Viviane pelo carinho e incentivo.

Á doutoranda Carla Martins um obrigada muito especial, por acompanhar a

minha trajetória na odontopediatria desde a especialização, sempre me incentivando

e torcendo por mim.

Ás companheiras do projeto SIDA Cristiana e Raquel, obrigada pela

amizade, ajuda e incentivo, principalmente no momento das coletas. Sem vocês não

seria possível!

Aos amigos Tatiana e Rafael, pela amizade que começou lá atrás, ainda na

graduação e por estarem por perto quando ainda dava os primeiros passos no

mestrado. Obrigada meu M2!

Ao João por toda a tranqüilidade quando a nossa vontade é jogar o

computador pela janela. Obrigada pela ajuda constante!

viii

Às queridas Mary, Andréa, Gina e Kátia pelo companheirismo durante os

atendimentos na clínica e pelos vários momentos de alegrias proporcionados.

Obrigada pela amizade!

Às queridas Isabel, Bruna e Rose pela amizade, carinho e bons momentos

durante o nosso convívio.

Ao Robson, Zezé, Luiza, Ednaldo e Jorge pela amizade e momentos de

descontração.

À Natália e Gabriela, companheiras do projeto SIDA/AIDS em

Odontopediatria, por toda colaboração, paciência e dedicação. Muito obrigada!

À equipe do ambulatório pediátrico SIDA/AIDS – Instituo de Puericultura e

Pediatria Martagão Gesteira (IPPMG), especialmente aos Dr. Ricardo Hugo e Dra.Thalita, pelos ensinamentos e disponibilidade.

Aos pequeninos pacientes do IPPMG que fizeram parte deste trabalho e

seus responsáveis, pela colaboração. Que Deus abençoe vocês!

À Capes e CNPq, que possibilitaram o desenvolvimento desta pesquisa.

ix

“Todos os nossos sonhos podem tornar-se realidadese tivermos a coragem de persegui-los”

Walt Disney

x

RESUMO

OTERO, Renata Alves. Identificação de Herpes Vírus Humano (Tipos 1-8) nacavidade oral de crianças infectadas pelo HIV. Rio de Janeiro, 2011. Dissertação(Mestrado em Odontologia, área de concentração em Odontopediatria) – Faculdadede Odontologia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2011.

O objetivo deste estudo foi identificar a presença de herpes vírus humano

(Tipos 1-8) na cavidade oral de crianças infectadas pelo HIV (HIV+) e controle

correlacionando com a presença de gengivite, imunossupressão (contagem de

células CD4) e uso de anti-retrovirais. O grupo de estudo consistiu de quarenta e oito

crianças infectadas pelo HIV, assim como no grupo controle, com idade variando de

6-12 anos. As amostras de saliva forma coletadas através da estimulação pela

mastigação de um tablete de goma base (Parafilm®) e armazenada em tubos

plásticos estéreis. Os fragmentos de DNA de HHV foram identificados e amplificados

pelo protocolo nested-PCR. Dentre as crianças HIV+ a média de idade foi de 9.58 ±

1.88, dos quais 48,9% eram meninos. O DNA de HHV detectado em 39 indivíduos

(81.3%). No grupo controle, a média de idade foi de 9.04 ± 1.36, dos quais 51.1%

eram meninos, sendo o DNA de HHV detectado em 45 indivíduos (93.8%). Não foi

identificada a presença de nenhum tipo viral em 9 pacientes do grupo HIV e 3 do

grupo controle, enquanto que a presença de apenas um tipo viral, foi verificada em

14 amostras do grupo HIV + e 16 amostras do grupo controle. Já a presença de 2 ou

mais tipos virais, foi detectada em 25 pacientes HIV+ e em 29 pacientes do grupo

controle, não havendo assim, diferença estatisticamente significante entre a

quantidade viral encontrada nos dois grupos (Teste Exato de Fisher; p>0.05). Em

relação à gengivite, 69.2% dos pacientes do grupo HIV, apresentaram a inflamação,

enquanto 30.8% dos pacientes não tinham gengivite (Teste Exato de Fisher;

p=0.22). Também não houve relação entre a presença do vírus e a presença de

xi

gengivite (Teste Exato de Fisher; p>0.05). Nenhuma associação significativa pode

ser observada em relação à imunossupressão e uso de HAART. Baseado nos

resultados desse estudo foi possível detectar uma elevada quantidade de DNA dos

vírus herpes tanto no grupo de pacientes infectados pelo HIV, como no grupo

controle, não havendo, portanto, diferença estaticamente significante entre os

grupos estudados e nem a relação da presença dos vírus com a infecção pelo HIV.

Palavras-chave: Infecção pelo HIV, manifestações orais, herpesviridae, reação emcadeia de polimerase, crianças.

xii

Abstract

OTERO, Renata Alves. Identification of Human Herpes Virus (Types 1-8) in thesaliva of HIV-infected Children. Rio de Janeiro, 2011. Dissertação (Mestrado emOdontologia, área de concentração em Odontopediatria) – Faculdade deOdontologia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2011.

The aim of this study was to identify the presence of human herpes virus (types 1-8)

in saliva of HIV-infected children (HIV +) and control correlated with the presence of

gum disease, immunosuppression (CD4 counts) and use of antiretroviral . The study

group consisted of forty-eight HIV-infected children, as well as in the control group,

aged 6-12 years. The saliva samples had been collected by chewing through the

stimulation of one tablet of gum base (Parafilm ®) and stored in sterile plastic tubes.

The DNA fragments were identified and HHV amplified by nested-PCR protocol.

Among HIV + children the mean age was 9:58 ± 1.88, of which 48.9% were boys.

The DNA of HHV detected in 39 patients (81.3%). In the control group, the mean age

was 04.09 ± 1.36, of which 51.1% were boys and the DNA of HHV detected in 45

individuals (93.8%).Was not identified by the presence of any virus in nine patients in

the HIV group and 3 in the control group, while the presence of only one viral type,

was found in 14 samples of the HIV + and 16 samples from the control group. The

presence of two or more viral types was detected in 25 HIV + patients and 29 control

patients, so there were no statistically significant difference between the amount virus

found in both groups (Fisher's exact test, p> 0.05). In relation to gingivitis, 69.2% of

patients in the HIV group showed inflammation, while 30.8% of patients had no

gingivitis (Fisher's exact test, p = 0.22). There was also no relationship between the

presence of the virus and the presence of gingivitis (Fisher's exact test, p> 0.05). No

significant association could be observed in immunosuppression and HAART. Based

on the results of this study could detect a high amount of DNA of herpes viruses both

xiii

in patients infected with HIV, as in the control group, there is therefore no statistically

significant difference between groups, nor the relationship between the presence of

viruses with HIV infection.

Key words: HIV-infection, oral manifestations, herpesviridae, Polymerase ChainReaction, child.

xiv

L ISTA DE QUADROS , TABELAS E F IGURAS

Table 1: Distribution of viral types in the groups HIV and control …….………… 38

Table 2: Presence and absence of HHV compared with sex and age………. 38

Figure 1: Oral Manifestations of HIV. A- Linear Gingival Erythema; B- Oral Ulcer; C-

Angular Cheilitis ............................................................................. 39

xv

L ISTA DE ABREVIATURAS

AIDS Síndrome da Imunodeficiência Adquirida

CD4 Linfócitos CD4

CDC Centers for Disease Control and Prevention

HAART Highly Active Antiretroviral Therapy

HIV Human Immunodeficiency Vírus

HHV Human Herpesvírus

HHV-1 Human Herpesvírus 1








IPPMG Instituto de Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira

Ml mililitro

Min Minuto

mM miliMolar

n number

PB Pares de base

PCR Polymerase Chain Reaction

pmol Pico mol

RPM Rotação por minuto

UFPE Universidade Federal de Pernambuco

UFRJ Universidade Federal do Rio de Janeiro

µL Microlitro

xvi

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO .............................................................................................. 17

2. PROPOSIÇÃO ...............................................................................................19

3. DELINEAMENTO DA PESQUISA .................................................................20

4. ARTIGO .........................................................................................................23

5. DISCUSSÃO ..................................................................................................40

6. CONCLUSÕES ..............................................................................................44

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .........................................................................45

ANEXOS....................................................................................................... 50

1. INTRODUÇÃO

O controle da contaminação pelo Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV)

continua sendo um desafio para a saúde pública global. Dados epidemiológicos

mostram que o número anual de novas infecções por HIV diminuiu globalmente, e a

prevalência do HIV entre jovens também diminuiu em muitos países (UNAIDS,

2008). Mundialmente, a cobertura de serviços de prevenção da transmissão vertical

do HIV (da mãe para o filho) aumentou de 10% em 2004 para 45% em 2008

(Organização Mundial da Saúde, Fundo das Nações Unidas para a Infância,

UNAIDS, 2008), e a redução de novas infecções por HIV entre crianças em 2008

sugere que estes esforços estejam salvando vidas.

O tratamento da infecção com terapia anti-retroviral múltipla (HAART) nos

estágios iniciais da infecção pelo HIV em crianças tem aumentado a expectativa de

vida (LAMBERT, 1996; DE MARTINO et al., 2000) e diminuído o aparecimento de

lesões bucais (CASTRO et al., 1999; RAMOZ-GOMES, 2002; SOARES et al., 2004).

Entretanto, manifestações associadas à infecção pelo HIV ainda estão presentes

nestas crianças, com freqüência variando de 20% a 80% (RAMOZ-GOMES, 2002;

CHIGURUPATI et al., 1996). Essas manifestações podem ser o primeiro sinal da

infecção pelo HIV e constituem importante fator prognóstico, pois seu aparecimento

pode indicar evolução da doença. (PONGSIRIWET et al., 2003; MELO et al., 2004;

NAIDOO & CHIKTE, 2004; SOARES et al., 2004; CASTRO et al., 2004; PINHEIRO

et al. 2009).

As manifestações bucais mais comumente encontradas são a candidíase

bucal, lesões herpéticas, gengivite, eritema linear gengival (ELG) e hipertrofia de

parótidas (CASTRO et al., 2004; PINHEIRO et al., 2009). Já as infecções virais mais

freqüentemente encontradas, são as causadas pelos vírus da família herpes,

18

principalmente pelos Herpes vírus simples (HHV-1), Varicella Zoster (HHV-3) e

Epstein-Barr (HHV-4), com prevalência de 24%, 21% e 56,43%, respectivamente

(KETCHEM et al., 1990; KATZ et al., 1993; MONIACI et al., 1993).

No que se refere às infecções herpéticas, foram identificados em humanos 8

tipos virais (CONTRERAS & SLOTS, 2000), onde após a infecção primária, esses

vírus entram em estado de latência, com potencial para reativação (KETCHEM et al.,

1990). Sua reativação em pacientes infectados pelo HIV pode resultar em infecção

severa pelo herpes vírus simples (HHV-1) (MILLER, 1996), disseminação de herpes

zoster (HHV-3) (GRIFFITHS, 1996), mononucleose infecciosa pelo vírus Epstein-

Barr (HHV-4) (COHEN, 2000), pneumonia e rinite pelo citomegalovírus (HHV-5)

(DAL MONTE et al., 1996; MOCARSKI, 1996) e associação ao sarcoma de kaposi

pelo herpes vírus humano 8 (HHV-8) (CAVERT, 1997).

Alguns estudos sugerem que crianças infectadas pelo HIV possam estar mais

susceptíveis a infecções orais pelos Herpes Vírus Humanos (HHV1-8), podendo vir a

desenvolver manifestações como: herpes zoster (GRIFFITHS, 1996) e sarcoma de

kaposi (CAVERT, 1997). No entanto, não foram encontrados estudos que verifiquem

a co-infecção por herpes vírus na saliva de crianças infectadas pelo HIV.

Considerando a importância da infecção por esses vírus em crianças

infectadas pelo HIV, no que diz respeito à progressão e prognóstico da doença,

torna-se relevante identificar a presença dos herpes vírus nesses pacientes, sendo,

portanto, este o objetivo deste estudo.

19

2. PROPOSIÇÃO

OBJETIVO GERAL

Identificar a presença do herpes vírus humano (Tipos 1-8) na saliva de

crianças infectadas pelo HIV.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1) Identificar e comparar a presença do herpes vírus (Tipos 1-8) na saliva de

crianças infectadas pelo HIV e comparar com crianças saudáveis (grupo controle).

2) Relacionar a presença dos herpes vírus com a presença de gengivite.

3) Relacionar a presença dos herpes vírus com a presença de imunossupressão e

uso de anti-retrovirais nas crianças infectadas pelo HIV.

3. DELINEAMENTO DA PESQU ISA

O presente estudo foi caracterizado como seccional do tipo caso-controle, ao

propor a identificação da presença do herpes vírus humano (Tipos 1-8) em crianças

infectadas pelo HIV, provenientes de uma COORT de crianças acompanhadas pelo

Instituto de Pediatria e Puericultura Martagão Gesteira (IPPMG), comparando a um

grupo controle, formado por crianças saudáveis, atendidas no Departamento de

Odontopediatria FO/UFRJ.

O estudo teve seu início somente após a aprovação pelo Comitê de Ética

local do IPPMG (Instituto de Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira) da

Universidade Federal do Rio de Janeiro, na cidade do Rio de Janeiro, Brasil (Anexo

1, pág. 51) e após a obtenção do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

devidamente explicado e assinado pelo responsável legal dos sujeitos da amostra

(Anexo 2, pág. 52).

A amostra foi constituída por dois grupos. Um grupo de estudo formado por

crianças com diagnóstico definitivo de HIV, pelos critérios CDC (1994) que fazem

acompanhamento no Serviço de AIDS Pediátrica do IPPMG e acompanhados pelo

Projeto SIDA/AIDS em Odontopediatria (Faculdade de Odontologia – UFRJ). E um

grupo de crianças clinicamente saudáveis atendidas na Clínica de Odontopediatria

da Faculdade de Odontologia-UFRJ.

O universo amostral para o grupo HIV foi composto de aproximadamente 208

pacientes infectados pelo HIV de 6 a 12 anos de idade, atendidos no Ambulatório

AIDS do IPPMG no período de Agosto de 2009 a Julho de 2010. Dentro desse

universo, foram selecionadas 40 crianças por conveniência para iniciarem o estudo.

21

Durante o processamento, foram perdidas 12 amostras por não identificação de DNA

humano, logo, se fez necessária a coleta de um maior número de espécimes para

que pudéssemos realizar a associação entre a presença dos vírus da família herpes

e a criança infectada pelo HIV. Sendo assim, foi realizada a seleção de mais 20

crianças, resultando em um n de 48 amostras. Para o grupo controle, foi selecionado

por conveniência o mesmo número de crianças sem nenhum comprometimento

sistêmico que faziam tratamento dentário na Clínica de Odontopediatria da

Faculdade de Odontologia/UFRJ.

Os dados sobre os exames extra e intraoral foram anotados nas fichas de

cada paciente (Anexo 3, pág. 55). Durante o exame intra oral, primeiro os pacientes

eram classificados visualmente em relação ao biofilme, aonde a ausência do biofilme

indicava o score 0, enquanto que a presença indicava o score 1 (AYNAMO & BAY,

1975). Depois, usando uma sonda periodontal estéril, a criança era examinada para

avaliação do índice gengival. Quando na ausência de sangramento da margem

gengival a sondagem, recebia score 0 e na presença, score 1 (AYNAMO & BAY,

1975). Já a extensão da gengivite, foi classificada segundo os Anais de Periodontia

de 1999, aonde pacientes com envolvimento de menos de 30% dos sítios sondados

possuíam uma gengivite localizada e pacientes com envolvimento de mais de 30%

dos sítios, apresentavam gengivite generalizada.

História médica (classificação clínica e imunológica da doença, tipo de

transmissão, tipo de parto, uso de medicamentos antiretrovirais) e os exames

laboratoriais (carga viral, percentual e contagem de CD4) mais recentes, colhidos até

03 meses antes ou após o exame bucal, foram obtidos dos prontuários médicos de

cada paciente do grupo HIV.

22

Para a coleta da saliva, o paciente não havia feito a ingestão de alimentos

pelo menos 1 hora antes da coleta. A criança foi instruída a mascar um tablete de

goma base por 1 minuto e dispensar a saliva inicial num recipiente plástico

descartável. Em seguida, a criança continuou mascando e dispensando a saliva em

recipientes plásticos estéreis e descartáveis, e, devidamente identificados, por mais

5 minutos. O material coletado foi mantido sob refrigeração em um isopor com gelo e

levado para o Laboratório de Viroses Respiratórias, Entéricas e Oculares (LAVIREO)

do Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes da UFRJ em um prazo máximo de

2 horas. Em seguida as amostras foram acondicionadas para posterior análise

molecular por meio da PCR (Reação em Cadeia de Polimerase) para a identificação

de DNA humano pela presença da proteína marcadora β-globina (AMMATUNA et

al., 2001). Essa identificação se faz necessária, para que sejam evitados resultados

falso-negativos, já que na ausência de DNA humano na amostra, não seria possível

a identificação de DNA viral. Das 60 amostras coletadas no grupo HIV, foi

identificada a presença da β-globina em 48 amostras. Já no grupo controle, foi

possível realizar a identificação da proteína em todas as amostras. Logo, foi feita a

nested-PCR para identificação e amplificação do DNA viral em 48 amostras do grupo

HIV e 48 amostras do grupo controle.

Para subsidiar a interpretação, entendimento e discussão dos resultados

obtidos, bem como apresentação dos mesmos e o detalhamento de toda a

metodologia empregada, foi elaborado um artigo científico intitulado: “Identification of

Human Herpes Virus (Types 1-8) in the saliva of HIV-infected children”

4. ARTIGO

Identification of Human Herpes Virus (Types 1-8) in the saliva of

HIV-infected children

Renata Alves Otero1

Flávia Nóbrega Nunes do Nascimento2

Rodrigo da Silva de Lima3

Raquel Cirlene da Silva4

Ivete Pomarico Ribeiro de Souza 5

Norma Suely de Oliveira Santos 6

Gloria Fernanda Barbosa de Araújo Castro7

1Aluna de pós-graduação, Departamento de Odontopediatria e Ortodontia, Faculdade de Odontologia,

Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2Aluna de iniciação científica, Departamento de

Odontopediatria e Ortodontia, Faculdade de Odontologia, Universidade Federal do Rio de Janeiro;3Aluno de iniciação científica, Departamento de Virologia, Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de

Góes, Universidade Federal do Rio de Janeiro; 4 Aluna de Pós- Graduação, Departamento de

Virologia, Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes, Universidade Federal do Rio de Janeiro, . 5

Professora Titular, Departamento de Odontopediatria e Ortodontia, Universidade Federal do Rio de

Janeiro. 6Professora adjunta, Departamento de Virologia, Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de

Góes, Universidade Federal do Rio de Janeiro. 7Professora Adjunta, Departamento de

Odontopediatria e Ortodontia, Faculdade de Odontologia, Universidade Federal do Rio de Janeiro.

24

ABSTRACT

Human herpesviruses are pathogens found in high prevalence among human

immune deficiency virus infected persons. This study aimed to identify the presence

of herpesvirus types 1-8 in saliva of children with HIV infection, comparing with

healthy patients. The sample was composed of 96 individuals from 6 to 12 years

shared into HIV Group and Control Group. Data collection from medical records

(Immunessupression and use of HAART), intraoral examination, visible plaque index,

gingival index, extent of gingivitis and collection of stimulated saliva was realized. For

identify the viral species nested-PCR technique was used. For the HIV group, the

mean age was 9.58 (± 1.88) and 51% were girls, while in control group 49% were

girls aged 9.04 (±1.36) years. Was not identified by the presence of any virus in nine

patients in the HIV group and 3 in the control group, while the presence of only one

viral type, was found in 14 samples of the HIV-positive and 16 samples from the

control group. The presence of two or more viral types was detected in 25 HIV +

patients and 29 control patients, so there were no statistically significant difference

between the amount found in two viral groups (Fisher Exact Test; p> 0.05). Types

HHV-1 (7.7% e 6.7%), HHV-2 (5.1% e 8.9%), HHV-5 (30.8% e 13.3%), HHV-6B

(76.9% e 62.2%) e HHV-7 (53.8% e 86.7%) were identified in HIV and control group

respectively, but HHV-6A was found only in the control patients (2.2%). No difference

was found between the groups. Considering only HIV group, the presence of HHV-5

was associated with male sex (75%) (Fisher Exact Test; p=0.02) but there were not

relationship between the presence and the type of viruses with the use of HAART

and immunosuppression (CD4<25%). The presence or absence of gingivitis, plaque

and gingivitis extension, showed no statistical difference (fisher Exact Test; p>0.05)

when compared to the presence of the herpes virus family, for the both groups. It was

25

concluded that the prevalence of children infected by the herpesvirius was elevated

in both groups, mainly in control group.

KEY WORDS

HIV-infection, oral manifestations, herpesviridae, Polymerase Chain Reaction, child.

26

INTRODUÇÃO

Almost 45 million people worldwide have been infected with the Human

Immunodeficiency Virus (HIV), and prior to highly active antiretroviral therapy

(HAART), more than 75% of all HIV-infected persons developed HHV-related

diseases (FICARRA, 1997). The association between CD4 cell count and the onset

of a variety of opportunistic infections, suggesting that reactivation of these

organisms is associated with a common set of deficits in host defense (GRIFFIN et

al., 2008). After the introduction of HAART some changes could be observed, such

as changes in the prevalence of some oral manifestations associated with HIV

infection and emergence of other lesions in group of individuals (PINHEIRO et al.,

2009). However, children and adults infected with HIV are prone to develop

opportunistic infections in the oral cavity such as candidiasis, herpes zoster,

gingivitis, gingival erythema linear (ELG) and parotid enlagement (CHIGURUPATI et

al., 1996).

Herpesviruses are transmitted from person to person during the period of

primary infection or reactivation, being highly prevalent in the general population

(MORGAN et al., 1979). All these agents are epitheliotropic and most of them are

present in latent form (WEINERT, 1996). The balance between latency and

reactivation involves the regulations of gene expression and reactivation may be

triggered by stress, hormonal changes, infections and immunosuppressive

medication (NAGATA et al., 2004). Salivary glands are reservoirs for herpesviruses,

that are generally transmitted by saliva (WEBSTER-CYRIAQUE et al., 2006) and the

Herpesviridae family members such as the Cytomegalovirus (CMV), the Epstein-Barr

Virus (EBV), and the Herpes Simplex Virus (HSV) can reactive to cause infection

27

when the immune system declines, like in patients with HIV infection (MACPHAIL et

al., 1995).

It is possible to suggest that HIV-infected individuals who were under HAART

may be more susceptible to oral infections by Human Herpes Virus (HHV 1-8) and

could develop as manifestations: herpes zoster (GRIFFITHS et al., 1997) and Kaposi

sarcoma (GREENSPAN, 1997). However, no previous study has co-infection with

herpes virus in saliva of HIV-infected children. Therefore, in order to identify the

presence of herpesviruses in saliva of HIV-infected children, and its correlation to HIV

infection and the oral manifestations, this study was developed.

METHODS

This is cross-sectional type control-case. The protocol was approved by the

Local Ethical Committee and the Informed Consent was obtained from all individuals

and/or their responses.

Subjects and data collection

The sample was composed for 2 groups, of both sexes, selected for

convenience, between August 2009 and July 2010.

The HIV Group (HIV-G), were formed by 48 individuals with definitive

diagnostics from HIV, between 6 and 12 years old, patients of the Institute Pediatrics

and Childcare Martagão Gesteira from Rio de Janeiro, Brazil, and the Healthy Group

(HG), consisted of 48 subjects with the same age, patients of Pediatric Dentistry

Clinic of a public university in Rio de Janeiro, which showed no clinical evidences of

systemic or chronic diseases.

28

Data from the patient's medical history such as: definitive diagnosis of HIV

infection, immunological classification, use of anti-retrovirals, and the latest laboratory

tests (viral load, percentage of CD4 and CD8, CD4/CD8 ratio and WBC) were

collected from their medical records.

During oral examination, first the patients were classified visually in the rate of

biofilm (absence of visible biofilm: score 0; presence of visible biofilme: score 1)

(AINAMO & BAY, 1975). Then, using a sterile periodontal probe, the children were

examined to assess the gingival index. When the absence of bleeding of gingival

margin to the survey, the score was 0, while in the presence was 1 (AINAMO & BAY,

1975). Since the extent of gingivitis, were classified according to the Annals of

Periodontology, 1999, where patients with involvement of less than 30% of sites

surveyed, had a localized gingivitis. When gingivitis assailed over 30% of sites

surveyed, the patient was classified having a generalized gingivitis.

All data were recorded on dental records. For all exams, dental elements were

discarded that showed exfoliation in an advanced stage as well as those who were in

the process of eruption.

For saliva collection, the patient should have eaten food at least 1 hour before

collection. The child was instructed to chew one tablet of gum base for 1 minute and

waive the initial saliva in a plastic container disposable. Then the child was still

chewing and ejecting saliva into sterile plastic containers and disposable, and,

properly identified for a further 5 minutes (TENEVUO, 1986). The material was kept

refrigerated in a ice cooler and taken to the Laboratório de Viroses Respiratórias,

Entéricas e Oculares (LAVIREO) - UFRJ in a maximum of 2 hours.

Laboratorial Analysis

29

Initially for the molecular analysis there were used 200μL of the clinical sample

for DNA extraction with the Wizard® Purification Kit (Promega, Madson, USA)

according to the manufacturer's instructions. The final pellet was suspended in 65μL

of rehydration solution of DNA, incubated at 65°C for 1 hour and the tubes stored at -

20°C until use. As positive controls of PCR amplifications were used clinical samples

previously tested belonging to the Laboratory of Respiratory, Enteric and Ocular

viruses, Institute of Microbiology Professor Paulo de Góes, UFRJ.

For detection and identification of herpes virus types in clinical specimens was

used to multiplex PCR with a pool of oligonucleotides (HHV-F1 / HHV-R1 and VZV-

F1 / VZV-R1) for a selected region of consensus DNA polymerase of the types:

Herpes simplex virus 1 and 2 (HSV-1 and HSV-2), cytomegalovirus (CMV), Epstein

Barr virus (EBV) and Varicella-zoster virus (VZV) (TAFRESHI, 2005).

The resulting amplicons were 742bp for HSV-1 and HSV-2, 817bp for CMV,

748bp for EBV and 650bp fragment for VZV. For the nested-PCR, we used a second

pool of oligonucleotides (HHV-F2 / HHV-R2 and VZV-F2 / VZV-R2) also described

by14. With amplicons resulting from 493bp for HSV-1 and HSV-2, 565bp for CMV,

499bp for EBV and 356pb fragment for VZV (TAFRESHI, 2005). The amplifications

were realized in GeneAmp PCR System model 2400 (Applied Biosystems, Foster

City, CA), in eppendorfs tubes of 0,2 ml they had been mixed 5 μL of DNA and 20μL

of Master Mix with enzyme containing 15,25μL of distilled water, 0,5 μL of mixing

dideoxynucleotide triphosphate, 2,5 μL of buffer for enzyme 10x concentrate, 0,7 μL

of primer solution (HHV-F1/HHV-R1), 0,2 μL of other primer solution (VZV-F1/VZV-

R1) (20mM each), 0,75 μL MgCl2 solution (25mM) and 0,2 μL Taq polymerase.

After denaturation of the DNA template at 94°C/ 3 min, the PCR cycling

conditions, included 35 cycles of denaturation at 94°C/ 45 s, annealing at 65°C/ 1min,

30

and extension at 72°C/ 1 min, following 1 cycle of final extension at 72°/ 7 min.

(TAFRESHI, 2005).

The PCR amplicons were revealed on 1,2% agarose gel, followed by ethidium

bromide staining (0.5 mg/ml), and visualization under UV light and photographed with

digital camera. Later, 5 μL of the amplified product in the PCR had been mixed with

20μL of the Master Mix as it was described previously, changing only in the primers

set (HHV-F2/HHV-R2 and VZV-F2/VZV-R2). For nested-PCR: after denaturation of

the template DNA at 94°C/ 3 min, the nested-PCR was performed for 35 cycles of

denaturation at 94°C/ 45s, annealing at 63°C/ 1 min, and extension at 72°C/ 1min,

following a final extension of 1 cycle at 72°C/ 7 min. (TAFRESHI, 2005).

Aliquots of the amplicons (10 μl) were checked by electrophoresis on a 1,2%

agarose gel, similar have been described previously.

For the amplification of the other viral types had been used the protocols

described to HHV-6 by Wang et al. (1996), to HHV-7 by Oña et al. (2002) and to

HHV-8 by Jang et al. (2000) for PCR cycling conditions showed in the Figure 1. To

detect this viral types was conducted nested-PCR, resulting in amplicons of 195bp for

HHV-6A and 423bp for HHV-6B (WANG, 1996), 126bp for HHV-7 (OÑA et al., 2002)

and 160bp fragment for HHV-8 (JANG et al., 2000). All the PCR and nested-PCR

amplicons were revealed on 1.2% agarose gel.

To the purpose of differentiate the viral types found which had a similar

molecular weights and to confirm the positivity of some samples by PCR was

employed the sequencing using the amplified DNAs of positive samples. They were

purified witch the Wizard SV gel and PCR Clean-Up system kit (Promega), and the

sequences established using the PCR primers, the BigDye® Terminator Cycle

Sequencing Kit and the ABI PRISM® 3100 automated DNA sequencer (Applied

31

Biosystems, Foster City, CA, USA). The DNA sequences were analyzed making use

of the program SeqMan in the Lasegene software package (DNASTAR, Madison, WI,

USA).

Statistical analysis

The obtained data were stored and processed in the statistical program Epi-

Info for statistical analysis. For the comparisons between the two groups (HIV and

Healthy), we used the 2 tests and Fischer's exact for categorical variables (sex,

presence of oral manifestations, presence of herpes virus type, immunessupression

and use of HAART) and Mann-Whitney for comparison between ages, with

significance level of 5%. .

RESULTS

In HIV group, 23 subjects were male, while 25 in the control group, which

corresponds to 51% and 49%, respectively. The average age of the HIV group was

9.58±1.88 and in control group 9.04±1.36 (Mann-Whitney; p=0.07).

The presence of HHV in HIV group is 81.3%, whereas in control group is

93.8%. There was no statistically significant difference between the amount of herpes

virus types of family found in both groups (ϰ2; p>0.05). The distribution of each viral

type in the groups can be seen in Table 1 and being observed that the HHV-3, HHV-

4 and HHV-8, were not found in either group. No correlations with age and sex were

found between the two groups.

Changes assessed as plaque index, presence or absence of gingivitis, and

gingivitis extension, showed no statistical difference (Fisher Exact Test; p>0.05),

32

when compared to the presence of the herpes virus family, both the HIV group, as in

the control group.

Considering only the group of HIV patients, we observed a statistically

significant result (Fisher Exact Test; p=0.02) when comparing the presence of HHV-5

with sex, thereby highlighting that 75% (n=9) of subjects infected by HHV-5 were

men. When comparing the presence of viral types with the average age, subjects

with HHV-5 were younger (8.6±1.2) (Fisher Exact Test; p=0.05). A similar tendency

was found for children with HHV-6B (Fisher Exact Test; p=0.06) whereas subjects

with HHV-1 tend to be older (Fisher Exact Test; p=0.07) (Table 2).

Regarding the manifestations of HIV, only one patient had erythematous

candidiasis, angular cheilitis with a mouth ulcer and also just one. Three patients had

a history of herpes zoster and the same number also had pseudomembranous

candidiasis. The linear gingival erythema was identified only in five patients, while 10

children were in infarcted lymph nodes (Figure 1). There was no correlation between

the presence of viruses, the use of HAART and immunosuppression (CD4<25%).

DISCUSSION

Our study reported a prevalence of 81.3% of the herpes virus in HIV patients

in the group, while in the control group showed a prevalence of herpes virus of

93.8%. Our results differ from other studies that found an increased prevalence of

herpes group of HIV-positive patients compared to healthy control group

(MARDIROSSIAN et al., 2000; GRANDO et al., 2005, MILLER et al., 2006). For not

having data in the literature to support our findings, we believe that this difference

has occurred because the children of the group to be HIV + being followed up

33

regularly and making routine use of HAART, which would increase your immunity and

reduce the coinfection by the herpes virus family.

The main limitation of this study was the small sample size, a fact that

occurred during laboratory analysis. Before a sample can be processed for viral

identification, should be performed to identify a protein called β-globin, in order to

detect the existence of human DNA in the sample and avoid a false negative for the

herpes virus (AMMATUNA et al., 2001). In our study, 12 samples were lost due to

failure to identify the β-globin protein, a fact that can be explained by failures during

the saliva collection or during laboratory analysis.

Regarding the presence of each studied herpes viruses, types HHV-6 and

HHV-7 were the most prevalent, identified in 76.9% and 53.3% respectively in HIV +

and 62.2% and 86.7 % in the control group. As a result statistically significant (Fisher

Exact Test; p = 0.000), HHV-7 was most prevalent in the control group. This finding

may be explained by the fact that the vast majority of people being infected with

HHV-6 and HHV-7 during childhood (WYATT et al., 1991; YAMANISHI, 1992) and

persists as a latent infection for life (SADA et al., 1996). The frequent isolation of

HHV-6 and HHV-7 in saliva suggests that salivary glands are the main sites under

these viral types (FOX et al., 1990; HARNETT et al., 1990).

Considering the total sample and the groups separately, there was no sex

predilection for the presence of herpes virus, with the exception of HHV-5, which was

identified in 9 men (75%) and 3 women (25%), with significant results statistically

(Fisher Exact Test; p = 0.02). These data suggest that HHV-5 presents a

predominance of males, a fact that corroborates a study by Watanabe et al. (2007),

where men have more periodontal sites positive for HHV-4 and HHV-5 than women.

The author suggests that this is possible, usually the boys begin sexual life earlier

34

than girls, what would be favoring a greater prevalence of male patients associated

with viral types. Moreover, the size of the study population and ethnic differences

could also be causing this variation. As in our sample consists of children aged 6 to

12 years, we believe that the population size and ethnic differences may be the main

factors that would be interfering with our results.

In this study, when the relationship between the presence of viral types with

immunosuppression in patients with HIV, we found that there was no statistically

significant difference (Fisher Exact Test; p = 0.6). However, for type viral HHV-5,

75% of patients were not immunosuppressed, with a tendency to a statistically

significant result (Fisher Exact Test; p = 0.08). As for the viral type HHV-7, 42.9% of

the patients were immunosuppressed, featuring the same way, a tendency toward

significance of the results (ϰ2; p=0.09). While conducting an extensive review of the

literature, there are no published data that could justify the results.

35

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38

TABLES

Table 1- Distribution of viral types in the groups HIV and control.

Viral Types(n)

Groups(n)

HHV-1(6)

HHV-2(6)

HHV-5(18)

HHV-6A(1)

HHV-6B(58)

HHV-7(60)

HIV

(68)6.7% a 5.1% a 30.8% b 0% a 76.9% c 53.8% d

Control

(81)6.7% a 8.9% a 13.3% b 2.2% a 62.2% c 86.7% d

ap>0.05, Fisher Exact Test; bp=0.05, ϰ2; cp>0.05, ϰ2; dp<0.05, Fisher Exact Test

39

FIGURE

Figure 1- Oral Manifestations of HIV. A- Linear Gingival Erythema; B- Oral Ulcer;

C- Angular Cheilitis.

A

C

B

40

5. D ISCUSSÃO

Os herpesvirus humano (HHV) pertencem à família Herpesviridae, estando

subdivididos nas subfamílias Alphaherpesvirinae (HHV-1, HHV-2 e HHV-4),

Gammaherpesvirinae (HHV-3 e HHV-8) e Betaherpesvirinae (HHV-5, HHV-6 e HHV-

7). Seu genoma é composto por uma única molécula de DNA, variando em tamanho

de 120-250 Kbp. Recentemente, o trauma físico, estresse, imunossupressão,

disfunção imune e a radioterapia têm sido associados a reativação de infecções

latentes pelos herpesvírus, podendo causar infecções sintomáticas ou

assintomáticas. Na cavidade oral 6 tipos são associados com a presença de lesões,

sendo eles: HHV-1, HHV-2, HHV-3, HHV-4, HHV-5, HHV-8 (CONTRERAS &

SLOTS, 2000).

A transmissão do HHV se dá pelo contato direto com a mucosa e pele

lesionadas (REGEZI et al., 1996), no entanto, há participação dos portadores

assintomáticos na disseminação, através principalmente de secreções sanguíneas e

orais (COHEN et al., 2000). A contaminação pela secreção oral acontece com maior

freqüência nos pacientes imunocomprometidos, como é o caso dos pacientes HIV

positivo. Isso ocorre pois as glândulas salivares apresentam-se como um

reservatório para os herpesvírus, em que a saliva possui uma grande quantidade do

DNA viral, gerando a sua transmissão pela troca de saliva contaminada (SALIMI,

2002). Um estudo realizado com 40 pacientes identificou a presença de HHV-4 em

13 amostras e HHV-5 em 30 amostras de saliva estimulada (IMBRONITO, 2008).

Por isso, em nosso estudo, optamos pela coleta de saliva para identificação dos

vírus da família herpes.

Porém, após a introdução do HAART, estudos tem relatado uma baixa

prevalência de herpesvírus humano na saliva de indivíduos infectados pelo HIV.

41

(DUKERS et al., 2000; DUUS et al., 2006; MILLER et al., 2006). Isso se dá pelo fato

do advento do HAART ter diminuído a incidência de doenças oportunistas e

melhorado a sobrevida dos pacientes HIV+ que recebiam a terapia (FONS et al.,

1994; ANTINORE et al., 2003) contudo ainda não é conhecido se o HAART alterou a

taxa de HHV pelo ressurgimento da latência ou se a capacidade dos HHVs para

produzir manifestações clínicas ainda não é bem conhecida (MILLER et al., 2006).

Em crianças, um estudo com 135 crianças HIV positivas de Zambia, relatou

uma prevalência desta infecção de 38%, porém, este trabalho não relacionou dados

como idade, imunossupressão e uso de HAART (BRAYFIELD et al., 2003). No

nosso estudo, houve uma alta prevalência de HHV nos dois grupos estudados,

porém, a prevalência de HHV no grupo de crianças não infectadas foi maior do que

no grupo de crianças HIV +, com 93,8% e 81,3% respectivamente, o que apresentou

um resultado com tendência a significancia estatística (Fisher Exact Test; p=0.06).

Destaca-se que dentre os pacientes infectados, a maioria (71%) estavam sob uso de

HAART e apresentava ausência de imunossupressão (53,8%).

A principal limitação do nosso estudo inclui o tamanho pequeno da amostra, a

qual occorreu devido as perdas pela ausência de DNA humano, verificadas durante

a análise laboratorial das amostras. Após as perdas, foram realizadas novas coletas

para que chegássemos a uma amostra de 48 pacientes para cada grupo, já que não

havia tempo hábil para mais coletas. Portanto, qualquer comparação com estes

resultados deve ser feito com cautela e deve ser avaliado de acordo com a

população estudada.

Em nosso estudo, observamos a alta frequência de HHV-6 e HHV-7 em

ambos os grupos, sendo o HHV-6 mais prevalênte no grupo HIV quando comparado

ao grupo controle, com frequências de 76,9% e 62,2%, respectivamente. Já o HHV-

42

7, foi identificado em 21 amostras (53,8%) do grupo HIV+ e em 39 amostras (86,7%)

do grupo controle, apresentando um resultado estatisticamente significante (Fisher

Exact Test; p=0.000). Esse achado pode ser explicado pelo fato de a grande maioria

das pessoas serem infectadas com HHV-6 e HHV-7 durante a infância (WYATT et

al., 1991; YAMANISHI, 1992) e persistir como infecção latente durante toda a vida

(SADA et al., 1996). O isolamento freqüente do HHV-6 e HHV-7 na saliva sugerem

que as glândulas salivares sejam os principais locais de abrigo desses tipos virais

(FOX et al., 1990; HARNETT ET al., 1990).

Considerando a amostra total e os grupos separadamente, não houve

predileção por sexo em relação à presença dos vírus, com exceção do HHV-5, no

qual nossos dados corroboram com o estudo de Watanabe e col. (2007), aonde os

homens apresentam mais sítios periodontais positivos para HHV-4 e HHV-5 do que

as mulheres. O autor sugere que isso seja possível, por geralmente os meninos

iniciarem vida sexual mais cedo que as meninas, o que estaria favorecendo a maior

prevalência de pacientes masculinos associados aos tipos virais. Além disso, o

tamanho da população de estudo e as diferenças étnicas, também poderiam estar

gerando essa variação. Em nosso estudo, para o HHV-5, 75% dos pacientes eram

do sexo masculino, enquanto que apenas 25% do sexo feminino, sendo esse

resultado significante estatisticamente (ϰ2; p=0.02). Porém, como nosso universo

amostral é composto por crianças de 6 a 12 anos, acreditamos que o tamanho da

população de estudo e as diferenças étnicas estejam relacionadas ao resultado por

nós encontrado.

No presente estudo, quando na relação da presença dos tipos virais com a

imunossupressão, no grupo de pacientes com HIV, verificamos que não houve

diferença estatísticamente significante (Fisher Exact Test; p=0.6). Apesar da

43

realização de uma extensa revisão da literatura, não foram encontrados dados

publicados que pudessem justificar os resultados apresentados.

Quando relacionamos a presença da gengivite com os tipos virais, verificamos

que dos 39 pacientes com gengivite, 27 (69,2%) também apresentavam algum tipo

de vírus herpes. Esses dados estão em conformidade com diversos estudos

realizados por Contreras et al. (1997; 1998; 1999a; 1999b; 2000) nos quais ocorre

uma relação positiva entre as doenças que atingem os tecidos de suporte, como

gengivite e periodontite, com a presença dos vírus da família herpes.

44

6. CONCLUSÕES

A partir dos resultados obtidos no presente estudo, pode-se concluir que:

1) Encontraram-se presentes na cavidade bucal das crianças infectadas pelo

HIV os tipos HHV-1, HHV-2, HHV-5, HHV-6B e HHV-7, sendo da mesma

forma, identificado nas crianças saudáveis, somando ainda o tipo HHV-6A.

Ao comparamos os dois grupos, foi possível observar a presença de

81.3% dos vírus da família herpes no grupo de pacientes HIV, enquanto

que 93.8% de vírus no grupo controle.

2) Não houve correlação estatística entre a presença dos vírus da família

herpes (Tipos 1-8) com a gengivite.

3) Não houve correlação estatística com a presença dos vírus da família

herpes (Tipos 1-8) com a presença de imunossupressão e o uso de anti-

retrovirais no grupo HIV+.

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50

ANEXOS

51

ANEXO 1

52

ANEXO 2

FACULDADE DE ODONTOLOGIADEPARTAMENTO DE ODONTOPEDIATRIA E ORTODONTIADISCIPLINA DE ODONTOPEDIATRIA

Consentimento Livre e Esclarecido

IDENTIFICAÇÃO DE HERPES VÍRUS HUMANO (TIPOS 1 – 8) NA CAVIDADEORAL DE CRIANÇAS INFECTADAS PELO HIV

- TERMO DE ESCLARECIMENTO:Sabemos que pacientes em tratamento médico podem estar com o sistema

de defesa alterado, o que aumenta as chances dele apresentar vírus na boca quepossam causar alguma doença, como o Herpes, justificando assim a importânciadessa pesquisa. Logo, a Disciplina de Odontopediatria da Faculdade de Odontologiada Universidade Federal do Rio de Janeiro (FO/UFRJ) possui o objetivo de estudara presença do vírus da herpes na boca de crianças infectadas pelo HIV que sãoatendidas no Ambulatório AIDS no IPPMG (Instituto de Puericultura e PediatriaMartagão Gesteira).

Para tanto, o procedimento utilizado começará com uma entrevista com vocêpara preenchimento de uma ficha com o nome, telefone, idade e sexo, entre outrasinformações sobre a criança. As crianças serão beneficiadas ao receberem dapesquisadora responsável uma escova de dente, pasta de dente e orientaçõespráticas sobre como fazer a limpeza da boca corretamente, realizando então aescovação dental. Após a escovação, irei verificar se a gengiva está saudável ounão, através de uma sondagem realizada com um instrumento arredondado quecontorna a margem da gengiva de forma suave, sem força, não causando assimdesconforto a criança. Para a coleta da saliva, a criança irá mascar um pequenotablete de goma e cuspir a saliva em um “copinho” descartável. O material seráanalisado em um laboratório para saber se existe a presença ou a ausência dealgum vírus da herpes na boca. Os exames não trarão qualquer problema para asaúde dos participantes. Esses procedimentos serão realizados no AmbulatórioAIDS do IPPMG e no Departamento de Odontopediatria FO/UFRJ, onde as criançassão atendidas rotineiramente, realizando exame da boca, escovação e aplicação deflúor com a escova. Os pacientes que durante o exame da boca, apresentaremcáries ou outras necessidades dentárias, receberão tratamento odontológicona Clínica de Odontopediatria da FO/UFRJ, sendo atendidos pela própriapesquisadora, sem nenhum custo sobre o tratamento.

Em qualquer etapa do estudo, você terá acesso à pesquisadora responsávelatravés do(s) telefone(s) (21) 2241-3739 e (21) 9242-7332. Informações tambémpoderão ser dadas pelo serviço da Clínica de Odontopediatria da Faculdade deOdontologia, UFRJ no telefone (21) 2562-2101. Se você tiver alguma consideraçãoou dúvida sobre a ética da pesquisa, entre em contato com o Comitê de Éitica emPesquisa do IPPMG (2o andar).

Será entregue uma cópia do termo de consentimento livre e esclarecido acada participante da pesquisa. É garantida a liberdade de querer não participardo projeto de pesquisa ou de retirar o consentimento a qualquer momento, no

53

caso da aceitação, sem qualquer prejuízo à continuidade de seu tratamento nainstituição.

As informações obtidas serão analisadas em conjunto com as informaçõesobtidas de outros pacientes, não sendo divulgada a identificação de nenhumpaciente.

Os resultados dos exames serão de competência apenas dos pesquisadoresenvolvidos no projeto e dos profissionais que possam vir a ter relacionamento deatendimento e ou cuidados com a criança ou jovem e não será permitido acesso aterceiros (seguidores, empregadores, superiores hierárquicos), garantindoproteção contra qualquer tipo de discriminação e ou estigmatização.

Os resultados da pesquisa serão entregues individualmente a cadaparticipante tão logo a pesquisa seja concluída. Além disso, estes ficarãodisponíveis no Ambulatório AIDS do IPPMG (1o andar), na biblioteca do Centro deCiências da Saúde (CCS), e no Departamento de Odontopediatria da Faculdade deOdontologia da UFRJ localizado na Cidade Universitária, Ilha do Fundão – Rio deJaneiro, RJ.

Não há despesas pessoais para o participante em qualquer fase do estudo,incluindo exames e consultas. Também não há compensação financeira relacionadaà sua participação. Se existir qualquer despesa adicional, ela será absorvida peloorçamento da pesquisa.

Eu, pesquisadora responsável, me comprometo a utilizar os dados e omaterial coletado somente para esta pesquisa.

- TERMO DE CONSENTIMENTO:Acredito ter sido suficientemente informado a respeito das informações sobre

o estudo acima citado que li ou que foram lidas para mim.Eu discuti com o Dr.

____________________________________________________,Sobre a minha decisão em permitir a participação de meu representado legal nesseestudo. Ficaram claros para mim quais são os propósitos do estudo, osprocedimentos a serem realizados, seus desconfortos e riscos, as garantias deconfidencialidade e de esclarecimentos permanentes. Ficou claro também queminha participação é isenta de despesas e que tenho garantia do acesso atratamento odontológico quando necessário. Concordo voluntariamente emparticipar deste estudo e poderei retirar o meu consentimento a qualquer momento,antes ou durante o mesmo, sem penalidades ou prejuízo ou perda de qualquerbenefício que eu possa ter adquirido, ou no meu atendimento nesta instituição.

________________________________ Data: ___/___/____Nome do Sujeito da Pesquisa

________________________________ Data: ___/___/____

Nome do Representante LegalAssinatura do Representante Legal

_________________________________Nome da Pesquisadora Data: ___/___/____

Assinatura da Pesquisadora

54

- TERMO DE ASSENTIMENTO:

Nome da criança/adolescente ______________________________________________

Este formulário de assentimento informado é para crianças entre as idades de 6 a 12 anos que

comparecerão ao ambulatório AIDS do Instituto de Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira

(IPPMG) e que estou convidando a participar da pesquisa intitulada: “Identificação de Herpes Vírus

Humano (Tipos 1-8) na Cavidade Bucal de Crianças Infectadas pelo HIV”.

IntroduçãoMeu nome é Renata Alves Otero, sou dentista de criança e meu trabalho é ver se as crianças

que fazem tratamento no ambulatório AIDS possuem muitos e/ou vários tipos de bichinhos na boca,que nós chamamos de herpes. Eu vou informar você e convidá-lo a participar dessa pesquisa. Vocêpode escolher se quer ou não. Discuti essa pesquisa com seus pais ou responsáveis e eles sabemque também estamos pedindo o seu acordo. Se você vai participar na pesquisa, seus pais ouresponsáveis também terão que concordar. Mas se você não desejar fazer parte na pesquisa, não éobrigado, até mesmo se seus pais concordarem. Antes de decidir se quer participar ou não dapesquisa, você poderá falar com qualquer pessoa que você quiser para conversar sobre o assunto etomar a sua decisão. Você pode decidir se quer participar ou não depois de ter conversado sobre apesquisa e não é preciso decidir imediatamente. Pode haver algumas palavras que não entenda oucoisas que você quer que eu explique mais detalhadamente porque você ficou mais interessado oupreocupado. Por favor, peça a qualquer momento e eu explicarei.

ObjetivosQuero identificar a presença do herpes em diferentes regiões da boca e verificar se o

problema de saúde que você possui, está relacionado com uma maior ou menor quantidade dessevírus na boca.

Escolha dos participantesEstou fazendo esses exames em crianças entre 6 a 12 anos de idade que fazem tratamento

na DIP. Nesta pesquisa estou tentando identificar um maior número de herpes somente em criançasque fazem tratamento na DIP.

Voluntariedade de ParticipaçãoVocê não precisa participar desta pesquisa se não quiser. É você quem decide. Se decidir

não participar da pesquisa, é seu direito e nada mudará no seu tratamento de saúde. Mesmo assim,este serviço de saúde estará disponível para você. Até mesmo se disser "sim" agora, poderá mudarde idéia depois, sem nenhum problema.

ProcedimentosSe você decidir fazer parte da pesquisa, deverá fazer os seguintes procedimentos:

1) Você participará de uma entrevista para preenchermos uma ficha com seu nome, telefone, idadee sexo, entre outras informações.

2) Depois, eu irei examinar visualmente a sua boca para verificar a presença de acúmulo de“sujeira” (Biofilme bacteriano) visível a qual será removida do dente para coleta através dapassagem de um instrumento semelhante a uma pequena colher (Cureta Dentinária).

3) Em seguida, você receberá de mim uma escova de dente, pasta de dente e orientações práticassobre como fazer a limpeza da boca corretamente, realizando então a escovação dental.

4) Após a escovação, irei verificar se a gengiva está saudável ou não, através de uma sondagemrealizada com um instrumento arredondado que contorna a margem da gengiva de forma suave,sem força, não causando nenhum desconforto a você.

5) Para a coleta da saliva, você irá mascar um pequeno tablete de goma e cuspir a saliva em um“copinho” descartável.

6) Logo após, serão colocados 3 bolinhas de papel levemente na margem da sua gengiva eremovidas logo em seguida. Por fim, passarei um cotonete, sob a margem da gengiva sem tecausar nenhuma dor ou desconforto.

7) Todo o material será analisado em um laboratório para saber se existe a presença ou a ausênciade algum vírus do herpes na boca.

55

8) Você pode me pedir que eu explique a qualquer momento mais informações sobre o processo.

RiscosEsses exames são considerados seguros. Já foram feitos em adultos e em outras crianças.

Não houve nada que nos preocupasse. Porém, se qualquer coisa incomum acontecer a você,precisarei saber e você deverá se sentir à vontade de me chamar a qualquer momento para falarsobre suas preocupações ou perguntas.

DesconfortosHá algumas outras coisas que eu gostaria que você soubesse. Esses exames não lhe

causarão nenhuma dor ou desconforto. Também não será necessário que você perca o horário daescola, porque você já estará aqui na DIP para realizar o seu exame com o seu médico.

Você entendeu que nessa pesquisa não há risco e nem desconforto? ____ sim____ não.

BenefíciosVocê será beneficiado ao receber de mim uma escova de dente, pasta de dente e orientações

práticas sobre como fazer a limpeza da boca corretamente, realizando então a escovação dental.Você também receberá tratamento dos dentes na Clínica de Odontopediatria FO/UFRJ se durante oseu exame, eu verificar que você está com cáries ou outras necessidades dentárias, sendo atendidopor mim, sem ter que pagar nada pelo tratamento.

ConfidencialidadeNão falarei para outras pessoas que você está nesta pesquisa e também não compartilharei

informação sobre você para qualquer um que não trabalha na pesquisa. Depois que a pesquisaacabar, os resultados serão informados para você e para seus pais. As informações sobre você serãocoletadas na pesquisa e ninguém, exceto os investigadores poderão ter acesso a elas. Qualquerinformação sobre você terá um número ao invés de seu nome. Só os investigadores saberão qual é oseu número e manteremos em sigilo. Ela não será compartilhada com quem quer que seja exceto,alguém que tenha permissão de acesso à informação, tais como: patrocinadores de pesquisa, órgãosgovernamentais, o seu médico, etc.

Divulgação dos resultadosQuando terminarmos a pesquisa, eu entregarei a você e a seus pais o resultado. Além disso,

estes ficarão disponíveis no Ambulatório AIDS do IPPMG (1o andar), na biblioteca do Centro deCiências da Saúde (CCS), e no Departamento de Odontopediatria da Faculdade de Odontologia daUFRJ localizado na Cidade Universitária, Ilha do Fundão – Rio de Janeiro, RJ, através de um númeroque apenas eu e você saberemos..Direito de recusa ou retirada do assentimento informado

Você não tem que estar nesta pesquisa. Ninguém estará furioso ou desapontado com vocêse você disser não, a escolha é sua. Você pode pensar nisto e falar depois se você quiser. Você podedizer "sim" agora e mudar de idéia depois e tudo continuará bem.

ContatoVocê pode me perguntar agora ou depois ligar pra mim. Eu escrevi um número de telefone e

endereço onde você pode nos localizar ou, se você estiver por perto, você poderá vir e me ver. Sevocê quiser falar com outra pessoa tal como o seu professor ou doutor ou tia, não tem problema.

Certificado do AssentimentoEu entendi que a pesquisa é sobre um vírus que estão querendo identificar na minha boca,

chamado herpes. Eu entendi que serão feitos exames para verificar a quantidade e a presença ounão desses vírus.

Assinatura da criança/adolescente:__________________________________________Assinatura dos pais/responsáveis:__________________________________________Ass. Pesquisador:________________________________________________________Dia/mês/ano:____________________________________________________________

56

ANEXO 3

N°____________ Data do Exame: ________IDENTIFICAÇÃONome: ______________________________________________________

Prontuário (IPPMG): _____________

DN: ___ /___ /___ sexo:___ cor:___ natural idade: ________________

Mãe: __________________________________________ HIV (+) ( -)

Pai: ___________________________________________ HIV (+) ( -)

End. ________________________________________________________

Telefone: _____________________

Responsável: _________________________________ Parentesco:_____

Profissão do Responsável: _________________________

1) EXAME ORALHistória prévia de manifestação oral: ( ) S ( ) N

Qual: ______________________________________________________

Tecidos Moles:

Extra Oral:

Linfonodos submandibulares: ( ) D ( ) E ( ) Não

Linfonodos cervicais: ( ) D ( ) E ( ) Não

Linfonodos submentonianos: ( ) S ( ) N

Hipertrof ia de Parótidas: ( ) D ( ) E ( ) Não

Intra Oral:

Candidíase Pseudomembranosa: ( ) S ( ) N

local:___________________________

Candidíase Eritematosa: ( ) S ( ) N

local: ___________________________________

Eritema Linear Gengival: ( ) S ( ) N

local:___________________________________

Queil ite angular: ( ) S ( ) N

Gengivite: ( ) S ( ) N

dentes: _________________________________

57

Retração gengival: ( ) S ( )N

dentes:________________________________________

Abscesso gengival: ( ) S ( )N

dentes:________________________________________

Fístula: ( ) S ( ) N

dentes: _______________________________________

Periodontite: ( ) S ( ) N

Estomatite herpética: ( ) S ( ) N

Herpes labial: ( ) S ( ) N

Leucoplasia Pilosa: ( ) S ( ) N

Sarcoma de Kapposi: ( ) S ( ) N

Úlcera aftosa: ( ) S ( ) N

Outros: _______________________________________

Exame dentário

CPOD / ceo e CPOS /ceos:

CPOD:___________ ceo: ____________CPOS: __________ ceos: ___________

Nº. de lesões cavitadas ativas em dentina: _____________________

Dente dist vest mes ling oclus Dente dist vest mes ling oclus1 12 23 34 45 5

16 2617 2718 28

Dente dist vest mes ling oclus Dente dist vest mes ling oclus1 12 23 34 55 5

46 3647 3748 38

58

0 - sadia1 - cárie at iva em esmalte, sem cavitação.2 – cárie inat iva em esmalte3 - cavitação ativa em esmalte4 - cavitação inat iva em esmalte5 - cavitação ativa em esmalte / dentina6 - cavitação inat iva em esmalte / dentina7 - dente com possível comprometimento pulpar8 - restaurado9 - extraído10 - exodontia indicada

2) EXAMES LABORATORIAIS

3) HIGIENE ORAL

Quantas vezes escova os dentes/dia?( ) pelo menos 1 vez/dia ( ) 2 a 3x/dia ( ) + 3x/dia

Quem escova?( ) o próprio paciente ( ) o responsável ( ) outro menor ( irmãos)

Usa f io dental?( )S ( )N Freqüência: ____ vezes/dia

Uso de f luoreto:( ) bochecho ( ) creme dental

Informações sobre a dieta:( ) realiza as 3 refeições diárias ( ) costuma “beliscar”entre refeições

Consumo de sacarose entre as refeições:( ) pelo menos 1 vez/dia ( ) 2 a 3x/dia ( ) + 3x/dia

Data DataCD4 Ht/HbCD8 LeucócitosT4/T8 Plaquetas

59

Toma a medicação associada a al imentos?( )S ( )N

Qual(s)?( ) água ( ) alimentos açucarados ( ) al imentos s / açúcar ( ) leite puro( ) outros ___________________________________

4) CLASSIFICAÇÂO

A) ÍNDICE DE BIOFILME (AINAMO & BAY, 1975)0 – Ausência de biofilme visível ( )1 – Presença de biof ilme visível ( )

B) ÍNDICE GENGIVAL (AINAMO & BAY, 1975)0 – Ausência de sangramento da margem gengival a sondagem ( )

1 – Presença de sangramento da margem gengival a sondagem ( )

C) EXTENSÃO DA GENGIVITE (Annals of Peridontology, 1999)Gengivite Localizada Acometimento de menos de 30% dos sítios sondados ( )

Gengivite Generalizada Acometimento de mais de 30% dos sítios sondado ( )

5) FICHA DE PROCEDIMENTOS

Data Procedimento realizado

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