Essencial

AutoresM. Sc. Fernanda Raquel SartorM. Sc. Rafael Fonsca Zanotti

Viosa-MG 2012

Mdulo 11. Organizao de um laboratrio de Cultura de Tecidos e Biofbrica1.1 Distribuio e identificao das salas1.2 Armazenamento dos reagentes1.3 Organizao das vidrarias2. Uso e importncia dos principais equipamentos na Cultura de Tecidos 2.1 Autoclave2.2 Destilador2.3 Desionizador2.4 Cmara ou capela de fluxo 2.5 Balana2.6 pHmetro2.7 Capela exausto3. Boas prticas no laboratrio de cultura de tecidos 3.1 Assepsia3.2 EPI3.3 Manipulao do material vegetal no fluxo

Mdulo 2 1. Principais riscos e dificuldades na cultura de tecidos1.1 Declnio de Vigor1.2 Contaminao1.3 Oxidao Fenlica1.4 Variao Somaclonal1.5 Hiperhidricade1.6 Temperatura e Iluminao

Mdulo 3

1. Identificao dos reagentes2. Princpios SI (Sistema internacional de unidades)3. Qumica para cultura de tecidos- Preparo das solues estoque 3.1. Preparo das solues de NaOH e HCl 3.2. Soluo de micronutrientes, macronutrientes, vitaminas, Fe-EDTA, dos meios de cultura JADS, MS e WPM.3.3 Auxina3.4 Citocinina4. Preparo dos meios de cultura MS, WPM e JADS5. Reguladores de crescimento5.1. Importncia das auxinas5.2. Importncia das citocininas

Histrico da Cultura de Tecidos Vegetais

Um histrico sucinto, visando oferecer uma idia das bases e da evoluo da cultura de tecidos vegetais. Em 1838, Schleiden e Schwann levantaram a hiptese de que toda clula tinha capacidade de gerar um indivduo Em 1892, Sachs definiu que as plantas sintetizam substncias capazes deformar rgos e que apresentam distribuio de forma polar Em 1902, Haberdandt tentou demonstrar a totipotencialidade das clulas das plantas, a partir de material maduro, e obteve pouca expanso, porm no conseguiu diviso celular. O desconhecimento dos reguladores de crescimento contribuiu para este insucesso Em 1904, Hanning foi o primeiro a cultivar embries imaturos de crucferas in vitro com sucesso Em 1922, Robbins e Kotte mantiveram, com sucesso, razes de gramneas em meio de cultura Em 1925, Laibach aplicou o cultivo de embries a cruzamentos interespecficos de Linum.Os progressos na cultura de tecidos s foram possveis a partir da dcada de 30. Em 1934, White manteve o crescimento de pices de razes de tomate, em meio lquido, por um perodo ilimitado. Neste mesmo ano, Kogh et al. identificaram o primeiro fitohormnio, a auxina, cido indolilactico Em 1939 Gautheret e Nocourt estabeleceram um protocolo para a manuteno de cultura de calo de cenoura. Neste mesmo ano, White conseguiu manter calo de fumo em meio contendo AIA Outros mritos no avano das tcnicas de cultivo in vitro so devidos s observaes de Van Overbeek et al. (1941) que promoveram a diferenciao e o crescimento de calo a partir de embries de Datura stramonium, pela incluso deleite de coco no meio de cultivo Em 1946, Ball regenerou plantas de Lupinus e Tropaelum, a partir de pices caulinares Em 1948, Skoog e Tsui demonstraram a regulao qumica da formao da parte area e raiz, em calo de fumo Em 1952, Sussex e Steve, trabalhando com primrdio foliar, observaram que este originava uma planta. Neste mesmo ano, a suplementao do meio de cultura com auxina e leite de coco permitiu que Steward e Caplin (1952) obtivessem formao de calo em diversas espcies de plantas Tambm em 1952, Morel e Martin recuperaram plantas de dlia livres de Vrus do Mosaico pela cultura de pices caulinares Em 1953, Tulecke obteve calo haplide a partir do cultivo de plen de Gingko biloba No perodo de 1953 a 1954, Muir observou que clulas colocadas em meio de cultura continuavam se multiplicando Em 1954, Muir et al. obtiveram a primeira planta, a partir de uma clula isolada Com a descoberta da cinetina (primeira citocinina) por Miller et al. (1955), foi possvel demonstrar-se que a diferenciao da parte area, raiz ou ambos, em calo de fumo, era regulada pelo balano hormonal auxina/citocinina. A partir desta descoberta houve grandes avanos no estudo da cultura de tecidos vegetais Em 1958, Wickson e Thimann observaram que quando se aplicava cinetina a uma gema terminal ou lateral dormente, esta saa da dormncia No mesmo ano, Reinert e Steward et al. (1958) obtiveram formao de embries somticos a partir de calo de cenoura, e Maheswari e Rangaswamy estudaram a cultura de ncelos e a regenerao de embries somticos em Citrus Em 1959, Melchers e Bergmann constataram uma variao na ploidia com o avano do tempo em que o explante permanecia no meio de cultura Em 1960, Morel recuperou cultivares de orqudeas livres de vrus, mediante cultura de meristemas, trabalhando com pice caulinar (meristema + primrdio foliar + poro inferior ao primrdio foliar) demonstrando a potencialidade das aplicaes comerciais da micropropagao O mtodo de isolamento de protoplastos de plantas com enzima de degradao da parede celular foi desenvolvido por Cocking (1960) Murashige e Skoog elaboraram, em 1962, o meio de cultura conhecido universalmente, denominado meio MS Tambm em 1962 Kanta et al. Obtiveram sucesso na polinizao in vitro de Papaver somniferum. vulos isolados eram colocados em cultura e, em seguida, gros de plen eram depositados sobre os mesmos, ocorrendo o desenvolvimento do tubo polnico, a fecundao, a formao do embrio e, posteriormente, a obteno de sementes J em 1965, Aghion-Prat induziu a florao in vitro em tecidos de fumo Em 1966, Guha e Maheswari foram os pioneiros na induo de andrognese in vitro em Datura, a partir de gros de plen, mediante cultura de anteras Smith e Murashige obtiveram, em 1970, a formao de plantas pela cultura de meristemas propriamente dito (poro distal ao mais novo primrdio foliar) O mtodo de excluso de viroses e virides em plantas de Citrus foi desenvolvido por Murashige et al. (1972) e consistia na garfagem de pices caulinares (meristemas com dois primrdios foliares) em porta-enxerto in vitro Neste mesmo ano, Carlson et al. (1972) comunicaram a primeira fuso de protoplastos, obtida em Nicotiana Em 1974, Reinhard iniciou estudos sobre a biotransformao de tecidos vegetais e Zaenen et al. descobriram que o plasmdio Ti o princpio indutor de tumores de Agrobacterium, uma bactria de grande importncia na transformao gentica em protoplastos vegetais Em 1978, Melchers et al. conseguiram hbridos somticos entre batata e tomate Em 1982, Krens et al. alcanaram a incorporao de DNA isolado por protoplastos, tornando possvel a transformao de clulas vegetais a partir de um DNA isolado Neste mesmo ano, Zimmermann obteve a fuso de protoplastos, atravs de estmulo eltrico Em 1985, Horsch et al. obtiveram a infeco e a transformao gentica de disco foliar de tabaco com Agrobacterium, bem como a regenerao das plantas transformadas No Brasil, os trabalhos pioneiros com cultura de tecidos foram desenvolvidos no Instituto Biolgico, na dcada de 1950 A primeira equipe de cultura de tecidos foi formada em 1971, na ESALQ, em Piracicaba, SP Entre 1975 e 1980 foram criados os laboratrios da Universidade de Campinas, do Instituto Agronmico de Campinas e da EMBRAPA Atualmente, a maioria das instituies tem laboratrio nesta rea, trabalhando com diferentes metodologias de manipulao de plantas in vitro.

Mdulo 1

1. Organizao de um laboratrio de Cultura de Tecidos e Biofbrica

Um laboratrio de cultura de tecidos no deve ser localizado em ambientes sujeitos a poeira e a corrente de ar nem prximo a fontes potenciais de microrganismos ou contaminao qumica, j que o cultivo in vitro de clulas, tecidos ou rgos vegetais se caracteriza por se realizar em condies asspticas. O interior do recipiente de cultivo deve estar livre de qualquer organismo capaz de proliferar e afetar o desenvolvimento do material vegetal, da a importncia de se manter o ambiente estril durante o processo.Em um laboratrio de cultura de tecidos, todas as atividades realizadas devem ser realizadas assepticamente, com temperatura e iluminao controladas, esses fatores so essenciais para que se obtenha sucesso em qualquer trabalho ligado a produo in vitro. A padronizao das condies ambientais em um laboratrio proporciona confiabilidade nos resultados e menor porcentagem de perda de material, j que estes fatores podem ser regulados para que se obtenha uma condio tima para o desenvolvimento do material vegetal.Este tipo de laboratrio tem algumas particularidades que o distinguem dos demais. A implantao e organizao dependem de sua finalidade e do nmero de pessoas que nele vo trabalhar; assim, um laboratrio destinado exclusivamente micropropagao com base em protocolos estabelecidos, tende a ser maior, porm mais simples em instalaes e equipamentos que um laboratrio destinado pesquisa com diferentes sistemas ou, ainda, com aspectos bioqumicos, genticos e estruturais, entre outros; pode ser pequeno, porm, mais especializado. Um laboratrio de pesquisa pode, tambm, ter finalidade didtica.

1.1 Distribuio e identificao das salas

Um laboratrio deve ser compartimentado, pois desta forma evita contaminao do ambiente e do material. Atividades que lidam com material contaminado e sujo devem ser separadas das atividades com materiais esterilizados e que necessitam de ambiente assptico. As instalaes no laboratrio devem seguir ruma seqncia natural, de tal forma que procedimentos sucessivos sejam realizados lado a lado. Isso certamente economizar tempo e trabalho, resultado tambm em economia financeira.As atividades dentro de um laboratrio de cultura de tecidos vegetais devem ser distribudas em salas, sempre na ordem em que forem realizadas. Desta forma, sugere-se um laboratrio com as seguintes composies (Figura 1).

Figura 1: exemplo de planta baixa de um laboratrio de cultura de tecidos.Sala de limpeza: o local para descarte de meios de cultura, lavagem de vidraria, utenslios diversos e autoclavagem de gua. Deve conter bancada, armrios e prateleiras para estocagem de material, pias fundas, autoclave, destilador, desionizador, lavador de pipetas, forno de micro-ondas, estufa de secagem de vidrarias, escorredor de vidrarias e eletricidade para 110 e 220 volts. A assepsia desta sala baixa, devido s suas atividades, por isso ela deve ficar distante da sala de transferncia.

Sala de preparo: local para preparo de meios de cultura e de solues. a sala de maior circulao de pessoal. Deve ser equipada com armrios, estante para estocagem de vidraria, pia, geladeira, freezer, balana, pHmetro, agitador magntico e eletricidade para 110 e 220 volts.

Sala de transferncia ou inoculao: local onde se manipula assepticamente o material vegetal, sendo exclusiva para a capela de fluxo e estantes que auxiliam na estocagem temporria dos meios de cultura e outros materiais j autoclavados, destinados ao uso imediato. A circulao de pessoas deve ser restrita; uma pequena janela de vidro na porta interessante para que o seu interior possa ser visualizado; deve-se evitar ao mximo a abertura freqente enquanto o manipulador estiver trabalhando.

Sala de cultura ou de crescimento: local destinado ao crescimento in vitro do material inoculado. Necessita de estantes com prateleiras, cada prateleira deve ser iluminada individualmente com no mnimo 2 fileiras de lmpadas fluorescentes. Um armrio ou um pano preto so teis para as culturas que precisam se desenvolver no escuro.

Instalaes de apoio: a ltima etapa na cultura de tecidos vegetais a aclimatao das plantas, corresponde etapa na qual as plantas tm de se adaptar ao ambiente externo. Para isso, necessria uma rea externa, como cmara de nebulizao ou telado onde as plantas tero um ambiente controlado e que pode ser modificado, para que o material vegetal se adapte vagarosamente ao ambiente natural.

1.2 Armazenamento dos reagentesO armazenamento de substncias qumicas deve ser organizado de forma a se obter uma disposio adequada dos reagentes para no gerar acidentes e evitar compras desnecessrias.O grande nmero de problemas de estocagem em laboratrio qumico deve-se diversidade de reagentes que devem ser armazenados. A estocagem sem as especificaes de produtos qumicos associadas com a falta de planejamento e controle propicia acidentes pessoais e danos materiais (GOBBI, 2006).Diferentemente do estoque de qualquer material, critrios rgidos devem ser seguidos para a armazenagem de produtos qumicos (Figura 2). Este tipo de armazenamento deve-se levar em considerao o tipo de produto a ser armazenado: volteis, corrosivos, txicos inflamveis, explosivos e peroxidveis, assim como a incompatibilidade qumica (OLIVEIRA et al., 2007).

Figura 2: armazenamento de reagentes.

Os reagentes no podem ser guardados de uma forma aleatria ou por ordem alfabtica, pois, nesse caso, estaro sendo desrespeitadas incompatibilidades. Abaixo alguns itens que devem ser tratados com muita ateno: Precisa existir um almoxarifado para o armazenamento de estoques de reagentes. Este ambiente deve ser projetado com interruptores e lmpadas que no provoquem fascas, o piso tambm deve ser adequado antiderrapante. Transportes de reagentes sempre feito por meio de carrinhos. No laboratrio os reagentes so guardados em armrios adequados, com prateleiras ajustveis e quando necessrio revestidas. Os frascos dos reagentes devem estar dispostos de modo a facilitar o acesso queles usado com maior freqncia. Frascos pesado no so guardados em prateleiras altas. Solventes volteis e inflamveis so guardados em armrios refrigerados ou com exausto adequada. Preferencialmente os armrios devem possuir uma altura que dispense o uso de escadas. Os frascos devem sempre ser fechados hermeticamente ao serem guardados. Sempre deve ser retirado o lacre o frasco, para evitar acmulo de umidade. Observar sempre no rtulo da embalagem a temperatura ideal para o armazenamento do reagente. Temperatura ambiente = balco Observar sempre se h necessrio guardar na geladeira ou freezer.DICA: numere os frascos dos reagentes e faa uma lista de consulta, assim muito mais fcil encontr-lo!!

1.3 Organizao das vidrarias

Alm de equipamentos e infra-estrutura, outros utenslios como vidrarias e materiais so muito utilizados dentro de um laboratrio de cultura de tecidos.Os frascos para o cultivo in vitro so essenciais para a manuteno das condies asspticas do ambiente. Esses frascos tm que ser transparentes e autoclavveis, de vidro ou plstico. Podem ser utilizados desde tubos de ensaio e frascos prprios para cultura de tecidos at frascos de alimentos e conserva, reutilizados, de tamanhos e formatos variados. importante que os frascos possuam tampas que permitam trocas gasosas entre o ambiente interno e o externo ao tubo ou frasco. Mas importante verificar que as tampas no permitam a contaminao de meio nutritivo (Figura 3).

Figura 3: frascos para cultivo.

Para o preparo das solues, so utilizados bqueres, erlenmeyers, provetas, pipetas, placas de Petri, bastes de vidro, bales volumtricos entre outros.Aconselha-se dispor de bqueres e erlenmeyers com capacidade variando entre 25 a 2000 mL e provetas de 10 a 2000 mL (Figura 4).

Figura 4: vidrarias

O acondicionamento das vidrarias deve ser feito de modo que facilite o acesso. Sempre guardar vidrarias de maior volume no fundo dos balces, para que na hora de peg-las no esbarre e quebre as da frente. Todas as vidrarias devem ser guardadas com a boca tampada, com plstico PVC ou papel alumnio. Vidrarias de plstico so to teis e eficientes quanto as de vidro. Bales volumtricos, provetas e pipetas no podem ser secas em estufa.

2. Uso e importncia dos principais equipamentos na Cultura de Tecidos

Os equipamentos so utilizados para reunir dados, aferio, calibrao e tambm como ferramenta por fazer parte da metodologia ou ambiente do trabalho. Antes de ligar um equipamento e tentar manuse-lo indispensvel leitura do manual de instrues.

2.1 AutoclavePara que serve? Utilizada para esterilizao de meios de cultura, vidraria, gua e outros materiais. Este aparelho pode produzir calor seco ou calor mido, que mais eficiente para a esterilizao. A temperatura ideal de trabalho fica em 121C. Pode ser horizontal ou vertical (Figura 5).Como funciona? O processo de autoclavagem consiste em manter o material contaminado em contato cm o vapor de gua em temperatura elevada, por um perodo de tempo suficiente para matar todos os microorganismos. A autoclave formada por um cilindro metlico resistente, vertical ou horizontal, onde geralmente fica a resistncia que aquecer a gua. Possui uma tampa que permite fech-la hermeticamente. Em cima da tampa esto as vlvulas ou botes de segurana e de ar. Apresenta tambm uma chave de comando para controlar a temperatura e um registro indicador de temperatura e presso.

Figura 5: Modelos de autoclaves

IMPORTANTE: Todo material deve estar rigorosamente limpo para que depois seja acondicionado em pacotes e levados autoclave. Esses pacotes devem ser feitos de material que permita a passagem do vapor.CUIDADOS!!1. No utilizar recipientes fechados;2. Pode danificar itens de plstico e borracha;3. Pode corroer itens metlicos e no inoxidveis;4. O equipamento requer limpeza, manuteno e testes biolgicos peridicos.

2.2 DestiladorPara que serve? utilizado para eliminao de sais mineiras da gua (Figura 6). Para uma maior pureza da gua, recomenda-se sua utilizao juntamente com o desionizador.Como funciona? Quando a gua atinge a temperatura de 100C, bactrias vrus e outros organismos que possam estar presentes so mortos. A gua fervente se converte em vapor, eliminando todos os slidos dissolvidos, toxinas qumicas, metais pesados e outros contaminantes. O vapor sobe pela serpentina de condensao, aps ser resfriada pelo ventilador de ar, a gua condensa em gotas de pura gua destilada. A gua destilada, depois passa pelo filtro de carvo ativado eliminando assim traos de sabor e odor. A gua pura coletada e acondicionada geralmente em barriletes plsticos. Este processo retira a gua das impurezas e no as impurezas da gua.

Figura 6: destilador de gua e barrilete.

2.3 DesionizadorPara que serve? Deve ser instalado logo aps o destilador. Auxilia na eliminao de ons (Figura 7).Como funciona? Depois de destilada a gua passa por colunas de resinas, uma aninica e outra catinica, as quais removem todos os ons. O Desionizador remove os sais minerais produzindo gua quimicamente pura com condutividade equivalente da gua bi-destilada.

Figura 7: desionizador

2.4 Cmara ou capela de fluxo Para que serve? Utilizada para realizar trabalhos de manipulao assptica.Como funciona? Funciona forando a passagem de ar por meio de um filtro bacteriolgico, de modo que seja criado um ambiente estril no interior da capela. No deve ser colocada em frente a porta, ventilador ou aparelho ar condicionado, para evitar entrada de ar contaminado durante o uso. As capelas possuem lmpadas ultravioleta que, ligadas cerca de 20 minutos antes de se iniciar o trabalho, esterilizam o ambiente (Figura 8).

Figura 8: Cmara ou capela de fluxo.

ATENO!!! Lmpadas ultravioleta causam graves queimaduras! Nunca utilize a capela com a UV ligada! Ao ligar a lmpada, coloque um aviso da porta para que ningum se exponha acidentalmente!

2.5 BalanaImprescindvel para a pesagem de reagentes, no preparo de solues e dos meios de cultura. Para quantidades menores, h a necessidade de uma balana de preciso. Um laboratrio de cultura de tecidos vegetais, mesmo que pequeno, necessita de uma balana de preciso (Figura 9).

Figura 9: Balanas de preciso.

2.6 tro2.6 pHmetroPara que serva? Utiliza-se para medir a quantidade de pH em amostras, substncias ou solues (Figura 10).Como funciona? um eletrodo acoplado a um potencimetro (medido de diferena de potencial). Ao ser submerso na amostra, o eletrodo do pHmetro gera milivolts, que por meio do milivolmetro, so transformados em uma escala de pH.

Figura 10: pHmetro

2.7 Capela exaustoCapela de exausto de gases um gabinete ventilado, que elimina vapores txicos e odores durante a manipulao de reagentes em um laboratrio (Figura 11). A capela de exausto de gases um equipamento de segurana para o operador e tambm para o meio ambiente.

Figura 11: capela de exausto

3 Boas prticas no laboratrio de cultura de tecidos

3.1 AssepsiaPara que se tenha sucesso em qualquer procedimento na cultura de tecidos, se faz necessrio: Manipulao correta do material vegetal Assepsia de todos os materiais e instrumentos utilizados Limpeza da sala de inoculao Limpeza da cmara de fluxo Jaleco limpo Unhas cortadas e limpas Cabelo curto, preso ou uso de toucas

Na limpeza das salas usa-se soluo de hipoclorito de sdio, a assepsia das mos feita com lcool 70%.

Tambm entendido como assepsia ou esterilizao, a limpeza que se faz nos materiais utilizados (vegetal e manipulao). Esta entendida como um conjunto de procedimentos para tornar um explante livre de microrganismos (bactrias, fungos filamentosos, leveduras etc). A respeito de como evitar microrganismos que possam contaminar o explante, inevitvel o uso de antisspticos, sejam estes bacteriostticos ou germicidas. Esses antisspticos podem ser antibiticos ou de outra natureza, como lcoois (lcool etlico); halognios (hipoclorito de sdio); sais de metais pesados (bicloreto de mercrio), fungicidas orgnicos etc.Em relao vidraria e aos meios de cultura, estes devem ser esterilizados para que se destruam todos os microrganismos, por calor seco (forno, ar quente) ou mido (autoclave). Pinas bisturis e demais utenslios metlicos para a manipulao do tecido podem ser esterilizados por flambagem direta, como por exemplo: lamparina com lcool ou bico de Bunsen na cmara de fluxo, ambiente este axnico (livre de germes) portanto, adequado para o trabalho in vitro.

3.2 EPITodo e qualquer trabalho a ser desenvolvido dentro de um laboratrio apresenta riscos, seja por produtos qumicos, chama, eletricidade ou imprudncia do prprio usurio, que pode resultar em danos materiais ou acidentes pessoais, que podem acontece quando menos se espera. Prevenir acidentes dever de cada um, portanto trabalhe com calma, cautela, dedicao e bom senso, seguindo sempre as recomendaes aqui descritas, desta forma prevenindo e/ou minimizando os efeitos nefastos resultantes dos possveis acidentes. Fique atento :

Armazenamento apropriado de reagentes e resduos laboratoriais; Formas adequadas de descarte de resduos laboratoriais; Formas de preveno de acidentes; Utilizao correta de equipamentos, como microscpios e balanas; Utilizao de extintores; Procedimentos gerais recomendados em casos de acidentes.

Regras gerais que nunca devem ser esquecidas:

1. Apenas permitida a entrada de pessoas autorizadas no laboratrio ou salas de preparo;2. Nunca trabalhar sozinho no laboratrio. conveniente faz-lo durante o perodo em que h fluxo de pessoas;3. Usar o jaleco de algodo e preferivelmente com mangas compridas, sempre que estiver dentro de um laboratrio, mesmo que no esteja trabalhando;4. Utilizar os equipamentos de proteo individual (luvas, touca, mscara, etc) de acordo com a necessidade;5. No permitido beber, comer, fumar ou aplicar cosmticos dentro do laboratrio, em decorrncia do alto risco de contaminao;6. Utilizar roupas e calados adequados que proporcionem maior segurana, tais como: calas compridas e sapatos fechados;7. Tomar os devidos cuidados com os cabelos, mantendo-os presos e/ou uso de touca;8. Manter sempre limpo o local de trabalho, evitando obstculos que possam dificultar os procedimentos; 9. No trabalhar com material imperfeito, principalmente vidros que tenham arestas cortantes. Todo material quebrado deve ser desprezado;10. No deixar sobre a bancada, vidros quentes e frascos abertos;11. Quando deixar algum equipamento quente na bancada colocar aviso;12. Utilizar culos de segurana quando se fizer necessrio;13. Usar luvas apropriadas durante a manipulao de objetos quentes e de substncias que possam ser absorvidas pela pele (corrosivas, irritantes, cancergenas, txicas ou nocivas);14. Caso voc tenha alguma ferida exposta, esta deve estar devidamente protegida.

Primeiros socorros em laboratrio muito importante que sejam conhecidos os procedimentos de segurana que devem ser usados quando ocorrem determinados acidentes. Por esse motivo enumeraremos aqui os acidentes que podem ocorrer com maior freqncia em laboratrios e quais as providncias que devem ser tomadas imediatamente. de vital importncia conhecer a localizao das pessoas e equipamentos necessrios quando o acidente exigir assistncia especializada. Nmeros de telefones, como os de ambulncia, bombeiros, posto mdico, hospital e mdico mais prximos, devem estar visveis e facilmente acessveis ao responsvel pelo laboratrio. Queimaduras Pessoas com queimaduras profundas podem correr srio risco de vida. Quanto maior a extenso, maiores os perigos para a vtima. Existem diferentes graus de leso. Leve em conta que uma pessoa pode apresentar, ao mesmo tempo, queimaduras de terceiro, segundo e primeiro graus - e cada tipo de leso pede um socorro especfico. proibido passar gelo, manteiga ou qualquer coisa que no seja gua fria no local, em qualquer caso. Tambm no se deve estourar bolhas ou tentar retirar a roupa colada pele queimada.

Ferimentos com materiais perfuro cortantes e fraturas Se a hemorragia decorrente de um ferimento qualquer intensa, deve ser interrompida imediatamente. O estancamento de hemorragia pode ser feito aplicando-se uma compressa ao ferimento com presso direta. Se for possvel, o local afetado deve ser elevado at que se controle a hemorragia. Tratando-se de corte leve, a hemorragia no grande. Nestes casos, deve-se remover todo material estranho que se encontre no ferimento, lavando-se cuidadosamente a regio com sabo e gua corrente e limpa. A seguir, deve ser aplicado anti-sptico em todas as partes do ferimento at aproximadamente 2 cm da pele ao redor do corte. No se deve nunca remover materiais estranhos que estejam muito profundos nos ferimentos. Em casos de ferimentos por perfurao a vtima deve ser enviada a um hospital, pois h perigo da existncia de materiais estranhos no corte e a impossibilidade de se alcanar o fundo do ferimento com anti-spticos. Sintomas como dor, inchao e deformao so tpicos em casos de fraturas. A vtima no deve ser removida do local do acidente a menos que vapores, fumaa ou fogo assim o determinem.

Intoxicao por gases ou vapores O socorrista deve tomar todas as precaues, como o uso dos devidos equipamentos de proteo individual, para entrar na rea do acidente; Remover o acidentado do local do acidente para local arejado e afrouxar as vestes, principalmente prximas ao pescoo; Manter o acidentado deitado e moderadamente aquecido; Praticar respirao artificial boca-a-boca, a no ser que se trate de sustncias do tipo gs cloro, SO2, inalado para os pulmes.

Ingesto oral de agentes qumicos Normalmente, quando certas solues so ingeridas deve-se induzir o vmito. A melhor maneira para provoc-los a excitao mecnica da garganta. Em alguns casos, o vmito no deve ser provocado, como nas intoxicaes em conseqncia da ingesto de substncias custicas e derivados de petrleo.

Produtos de risco A definio inclui: Produtos txicos: por ao txica imediata ou mais lenta sobre o organismo e o meio ambiente; Produtos inflamveis: materiais que podem pegar fogo e manter a combusto; Corrosivos: substncias cidas ou bsicas que provocam queimaduras; Reativos: materiais que explodem ou reagem de forma violenta; Outros materiais, como os gases comprimidos (nitrognio, oxignio, entre outros) e o nitrognio lquido.

3.3 Manipulao do material vegetal no fluxo

A capela deve ser limpa com lcool 70%, sempre com a ventilao ligada; Aps a limpeza, a lmpada germicida deve ser acesa, o tempo indicado para deix-la ligada de 15 a 20 minutos; No perodo em que a lmpada UV estiver ligada, NO ENTRAR NA SALA DE CULTIVO; Desligar a lmpada UV; Ligar a lmpada de iluminao; a ventilao permanece ligada; Novamente limpar a capela com lcool 70%; Utilizar lcool 70% nas mos, toda vez que julgar necessria assepsia; Flambar pinas e bisturis toda vez que julgar necessrio; Nunca utilizar as ferramentas acima citadas enquanto estiverem quentes, elas podem colocar em risco o posterior desenvolvimento da plntula;4 Bibliografia consultada

ANDRADE, S.R.M. Princpios da cultura de tecidos vegetais. Documentos 58, Embrapa. Planaltina DF, 2002.

CARVALHO, J.M.F.C.; ROCHA, R.W.C. Curso de cultivos de tecidos vegetais. Documentos 157, Embrapa. Campina Grande PB, 2006.

CARVALHO, J.M.F.C.; VIDAL, M.F. Noes de cultivo de tecidos vegetais. Documentos 116, Embrapa. Campina Grande PB, 2003.

CARVALHO, J.M.F.C. Procedimentos para implantao de um laboratrio de um cultivo de tecidos. Circular Tcnica, Embrapa. Campina Grande PB, dez. 2002.

GOBBI,M. Estocagem e Manuseio. Manual de Segurana para usurios de produtos qumicos perigosos, 7-18.OLIVEIRA,C.M.A. MANCILHA, J.C. ROCHA, L.M.S. SASSA,L.H. MELLO, M.A. SANVIDO, M.C. BERGAMO, M.E. REY, M.D. OLIVEIRA, P.C.A. LOPES, W.A.C. 2007. Guia de Laboratrio para o Ensino de Qumica: Instalao, montagem e operao. Conselho Regional de Qumica IV Regio, 20-21. 2006.

JUNGHANS, T.G.; SOUZA, A.S. Aspectos prticos da micropropagao de plantas. Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical, Cruz das Almas BA. 385p. 2009.

PAIVA, R.; PAIVA, P.D.O. Cultura de tecidos. UFLA/FAEPE, Lavras MS, 2003.

Mdulo 2

1. Principais riscos e dificuldades na cultura de tecidos

O cultivo in vitro como qualquer outro processo sensvel a alguns problemas de ordem ambiental ou biolgico que afetam diretamente o desenvolvimento das culturas

1.1 Declnio de vigorAs plantas desenvolvem o metabolismo de acordo com os estmulos recebidos, e, portanto, quando ocorrem problemas determinantes refletido diretamente na fisiologia vegetal do explante. A baixa taxa de desenvolvimento chamada de declnio do vigor e est associado com a produo de substncias fenlicas ou a outros fatores como vitrescncia, habituao ou maturidade dos explante.A perda de vigor pode ser tambm afetada por erros no balano nutricional do meio de cultura, utilizao de fitorreguladores inadequados ou falta de repicagem do material vegetal.

1.2 ContaminaoEm principio existiriam trs alternativas para contornar a contaminao. A primeira o uso de meristemas. Mas este procedimento laborioso demais e no muito pratico. A segunda, usar compostos qumicos (hipoclorito de sdio, antibitico, fungicida etc) e a terceira simplesmente usar plantas estreis, quando por exemplo, coletamos ramos do campo e depois de uma assepsia externa, os galhos (sem folhas) os fazemos brotar dentro de uma cmara mida, e a partir disso, extramos os explantes: folhas ou gemas, mesmos assim, uma assepsia convencional requerida como j mencionado anteriormente. A contaminao bacteriana tem sido abundantemente relatada em trabalhos de fitopatologia de plantas. Em funo desta constatao que o uso de antibiticos, como estratgia teraputica, na cultura de tecidos de planta e no mbito agronmico ainda persistente, apesar de que, existe um olhar de desconfiana em torno a seu uso pela questo da induo de resistncia plasmidial. Os antibiticos na sua definio clssica so substncias produzidas por microorganismos que inibem ou matam outros microrganismos. A contaminao bacteriana normalmente aparece nas placas como uma mancha redonda, lisa, brilhante de cor branco ou bege, podendo emergir da periferia do explante ou, em qualquer lugar do meio, quando por conseqncia inadequada manipulao na cmara de fluxo laminar (Figura 1).

Figura 1: contaminao por microrganismos.

Em cultura de tecidos o uso de explantes provenientes do campo, creia grandes problemas de contaminao, mesmo, realizando uma assepsia previa inoculao. Razes, sementes, gemas ou folhas de plantas deste origem , normalmente esto pesadamente contaminados por fungos.Um fungicida uma substncia que mata fungos, sendo que, dependendo de sua especificidade o mecanismo de ao alguns matam mais que outros. Deste ponto de vista, os fungicidas esto destinados a proteger s plantas. Esta proteo pode ser realizada de duas maneiras. Uma delas a destruio do inoculo antes que se espalhe e forme miclio pela planta generalizando a doena (preveno). A outra forma, bloquear a doena quando j instalada na planta, seja local ou sistmica (terapia o cura). Em geral, poderamos classificar os fungicidas como no sistmicos e sistmicos. Como j mencionado, em geral os explantes provenientes do campo, j possuem o contaminante no interior do tecido, mesmo que, o explante no apresente sintomas visveis. o que se desprende depois de observar a contaminao do explante no meio nutritivo, a pesar de que, foi realizada a assepsia de praxe (uso de hipoclorito de sdio) (Figura 2).

Figura 2: contaminao por microrganismos.

1.3 Oxidao FenlicaA oxidao a reao do oxignio com ons metlicos (+) dos outros compostos do meio de cultivo. Os explantes ao serem inoculados no meio de cultura podem liberar exsudatos que tornam o meio de cultivo escuro (Figura 3). Este tipo de escurecimento conseqncia da liberao de fenis dos ferimentos ocasionados no processo de extrao dos explantes (Santos, 2001).

Figura 3: oxidao fenlica em meio de cultura.

Compostos como a cistena, o carvo ativado, PVP, cido ascrbico e cido ctrico tm sido adicionados ao meio de cultura com o objetivo de controlar o processo de oxidao. Carvo ativado adicionado ao meio de cultura em concentraes que variam de 0,3 a 2,0%, cuja ao adsorver fenis do meio de cultura, alm de atuar induzindo os processos de morfognese e rizognese. A poliamina PVP possui tambm a capacidade de adsorver os compostos fenlicos evitando que estes oxidem e polimerizem. Esta substncia geralmente adicionada ao meio de cultura em concentraes que variam de 0,01- 4,0 %. Composio dos meios de cultura com variaes na concentrao do meio MS, sacarose, excluso ou diminuio em concentrao de ferro e cobre, uso de reguladores de crescimento (variaes em tipo e concentraes) alm da adio de antioxidantes tambm podem ser eficientes para controle da oxidao. O cido ctrico atua como agente quelante de metais, mas no muito eficiente em retirar ferro da soluo. O cido ascrbico normalmente acrescido ao meio de cultura, possuindo a propriedade de estimular a atividade metablica dos tecidos.A preveno da ocorrncia de oxidao pode ser feita minimizando os danos causados ao explante, removendo os compostos fenlicos produzidos ou atravs da alterao da composio do meio de cultura e a concentrao ou tipo de reguladores de crescimento empregados. A remoo dos compostos pode ser feita ainda pela utilizao de meios lquidos (facilitam a difuso dos compostos), de diferentes agentes de solidificao, alm da adio ao meio de substncias de adsoro.

1.4 Variao SomaclonalO ambiente da cultura in vitro pode induzir variabilidade nas culturas este fenmeno foi denominado de variao somaclonal. Isto ocorre devido aos sucessivos subcultivos do mesmo material vegetal.O mais comum que se pode observar so plantas que param de se desenvolver, cessa a multiplicao e a colorao da planta muda, geralmente ficando mais clara.

1.5 HiperhidricadeA hiperhidricidade definida como o estado fisiolgico que a planta apresenta elevado teor de gua no interior das clulas e tecidos com aspecto translcido (Figura 4). As alteraes na estrutura das plantas cultivadas in vitro so sintomas bastante prematuros de uma complexa sndrome de caractersticas anormais.

Figura 4: Hiperhidricidade

O fenmeno pode ser revertido, desde que seja realizada a transferncia de meio de cultivo e adequar o ambiente, dando ateno especial para a temperatura, irradincia, fotoperodo e concentraes dos elementos do meio de cultivo.

OcorrnciaA hiperhidricidade pode ocorrer em culturas de brotos e ns, em regenerao de brotos a partir de calos, em todas as espcies. mais freqente em massa de calos de plantas lenhosas, mas tambm ocorre emplantas herbceas, pode ser conseqncia da difuso passiva da gua dentro dos tecidos ou um fenmeno ativo relacionado a um distrbio no processo metablico da planta.

Fatores que influenciam a hiperhidricidade Culturas que desenvolvem-se rapidamente so menos propensas. Quando se busca melhores condies de cultivo para cada espcie, diminui-se expressivamente o risco de ocorrer a hiperhidricidade. A hiperhidricidade tende a ser promovida por altas temperaturas, baixa irradincia luminosa ou em culturas mantidas no escuro. Brotos que se desenvolvem em condies contnuas de alta umidade relativa apresentam maior suscetibilidade hiperhidricidade, pois este provavelmente o ambiente mais favorvel para ocasion-la. Culturas mantidas em meio lquido, incluindo aquelas realizadas com suportes (ponte de papel) geralmente desenvolvem mais facilmente do que aquelas que so cultivadas em meio slido. Em algumas plantas, brotaes normais cultivadas em meio slido ficam totalmente vitrificadas quando so transferidas para um meio de cultivo lquido. Os brotos apresentam sintomas mais freqentes quando se utiliza concentraes de BAP acima de 2,0 mg.L-1, suplementado com sacarose e baixas concentraes de sorbitol. Culturas em meios com altas concentraes de BAP sofrem imensamente a induo de hiperidricidade. Isto pode ser evitado transferindo a cultura para um meio que no possua BAP. As auxinas podem s vezes induzir a hiperhidricidade entretanto, a adio de auxinas no meio contendo citocininas, freqentemente aumenta a proporo de vitrificao. O cido giberlico pode ser utilizado no controle deste problema.

Diminuindo a hiperhidricidadeExistem vrios fatores que podem auxiliar na preveno da vitrificao, dentre estes pode-se destacar: Utilizao da tcnica de duas fases (meio lquido e slido) no meio de cultura; Aumento da concentrao de geleificante no meio semi-slido; Controle da concentrao de sacarose; Reduo da umidade relativa no ambiente in vitro; Em meio lquido, utilizar suportes porosos para sustentao dos explantes (ponte de papel); Adio ao meio de cultivo um ou mais cidos orgnicos como o citrato, succinato ou malato para auxiliara assimilao do NH4+; Reduo da concentrao de ons de amnio no meio de cultivo; Utilizao de alta de luminosidade; Em meio lquido pode adotar a tcnica de submerso temporria; Utilizao de um balano mais adequado entre auxina / citocinina para a espcie estudada; Reduo da concentrao de micronutriente no meio de cultivo; Transferncia da cultura para um meio de cultivo ausente de fitorreguladores; Diminuio do uso de citocininas ou restrio do uso do BAP. Pode-se tambm aumentar o nmero de subcultivos; Substituio da sacarose por frutose ou galactose; Ajuste correio do pH do meio de cultivo.

1.6 Temperatura e luminosidadeO sucesso da cultura de tecidos em grande parte dependente desses dois fatores. Cada cultura tem necessidades especiais de temperatura e perodos de luz, por isso se faz necessrio que antes do cultivo in vitro faa-se buscas de informaes sobre a espcie que ser trabalhada.A maioria das espcies se adaptam em temperaturas de 25C com variao de 2C para mais ou para menos e fotoperodo de 16 horas de luz.

2. Bibliografia consultadaANDRADE, S.R.M. Princpios da cultura de tecidos vegetais. Documentos 58, Embrapa. Planaltina DF, 2002.

CARVALHO, J.M.F.C.; ROCHA, R.W.C. Curso de cultivos de tecidos vegetais. Documentos 157, Embrapa. Campina Grande PB, 2006.

CARVALHO, J.M.F.C.; VIDAL, M.F. Noes de cultivo de tecidos vegetais. Documentos 116, Embrapa. Campina Grande PB, 2003.

CARVALHO, J.M.F.C. Procedimentos para implantao de um laboratrio de um cultivo de tecidos. Circular Tcnica, Embrapa. Campina Grande PB, dez. 2002.

Mdulo 3

1. Identificao dos reagentes

Para otimizar os procedimentos no laboratrio necessrio que todos os reagentes estejam enumerados e identificados em uma planilha. Alm disso, os reagentes enumerados devem ficar dispostos em ordem para facilitar sua localizao. Os reagentes podem ficar na bancada ou em armrios, na geladeira (4-8 oC) ou no freezer (-10 oC), sendo que estas informaes esto nos rtulos dos reagentes. Para facilitar a compra dos mesmos reagentes necessrio anotar alm do nome o cdigo que o produto tambm apresenta isto evitar comprar produtos que no so especficos para cultura de tecidos vegetais.

2. Princpios SI (Sistema internacional de unidades)

No SI distinguem-se duas classes de unidades:- Unidades de base (principais);- Unidades derivadas.

A Conferncia Geral, levando em considerao as vantagens de se adotar um sistema prtico nico para ser utilizado mundialmente nas relaes internacionais, no ensino e no trabalho cientfico, decidiu basear o Sistema Internacional em sete unidades perfeitamente definidas, consideradas como independentes sob o ponto de vista dimensional. Unidade de comprimento- metro (m) Unidade de massa - quilograma (kg) Unidade de tempo- segundo (s) Unidade de corrente eltrica - ampre (A) Unidade de termodinmica - kelvin (k) Unidade de quantidade de matria (mol) Unidade de intensidade luminosa - candela (cd)

Quadro 1 - Exemplos de unidades SI derivadas, expressas a partir das unidades de base

Quadro 2- Mltiplos e submltiplos decimais das unidades SI

3. Qumica para cultura de tecidos- Preparo das solues estoque

Importncia dos meios de cultura

Meios de cultivo so combinaes de sais minerais (macronutrientes e micronutrientes), carboidratos, vitaminas e reguladores de crescimento. Podem ser semi-slidos (adicionando-se gar ou outro agente para geleificao) ou lquidos, de acordo com o protocolo para o sistema de cultivo. Os meios nutritivos utilizados para as culturas fornecem as substncias essenciais para o desenvolvimento dos tecidos e controlam, em grande parte, o padro do desenvolvimento in vitro (Torres, 1998). A constituio do meio baseada nas exigncias das plantas quanto aos nutrientes minerais, com algumas modificaes para atender as necessidades especficas. Um dos primeiros meios de cultura desenvolvidos foi o de White (1942). Esse meio apresenta baixo nvel de nitrognio e de potssio, restringindo o seu uso para muitas clulas. O meio MS (Murashige e Skoog, 1962) foi baseada no White sendo uma das primeiras formulaes melhoradas usadas em cultura de tecidos de plantas, apresentando altos nveis de nitrato, potssio e amnio.

3. Composio do meio de cultura

Os meios nutritivos so formados por mltiplos componentes, sendo bastante variveis em funo da espcie vegetal e da origem do explante. constitudo de componentes essenciais e opcionais. Os essenciais compreendem a gua, os sais inorgnicos, a fonte de carbono e energia, vitaminas e substncias reguladoras de crescimento. Entre os componentes adicionais esto includos os aminocidos, amidas e cidos orgnicos. Os principais componentes de uso mais frequente nos meios de cultura so:

gua: o componente em maior quantidade do meio de cultura. A qualidade da gua muito importante em cultura de tecidos vegetais. Pode ser uma fonte potencial de impurezas quando no tratada. Para melhor controle deve-se usar gua destilada, bidestilada e desionizada. A utilizao de gua de torneira pode comprometer o desenvolvimento da cultura, pelo excesso de sais e cloro presente nesta gua, alm de formas de resistncia de inmeros microrganismos.

Nutrio mineralOs nutrientes empregados nos meios de cultura so os mesmos estabelecidos para a nutrio mineral bsica das plantas no campo e em hidroponia. Dentre eles podemos destacar:

Nitrognio: Acrescentado aos meios na forma orgnica (prontamente disponvel as culturas) ou na forma inorgnica. Pode estar disponvel como amnio (NH4+) (ction) ou nitrato (NO3-) (nion), ou ainda na forma de compostos orgnicos, dependendo do material em cultura (George, 1993). constituinte de aminocidos, nucleotdeos e coenzimas, tendo importncia na sntese protica. A toxidez do amnio s clulas diminui ou desaparece quando ele usado como nica fonte de nitrognio na forma de sal de um cido orgnico, de preferncia um cido tricarboxlico (ciclo de Krebs), como cido ctrico ou cido alfa-cetoglutarico (Torres, 1998). A glutamina (precursora de vrios aminocidos) a mais utilizada como fonte de nitrognio orgnico. Meios enriquecidos com nitrognio so fundamentais para a embriognese somtica, bem como diferenciao de parte area (Amirato, et. al. 1983).

Fsforo: Adicionado ao meio, principalmente, como fosfato de potssio monobsico (KH2PO4), pois a forma que absorvida (George, 1993). Algumas fontes orgnicas podem ser utilizadas quando existem restries aos fosfatos minerais (Torres, 1998). Atua no metabolismo energtico, na regulao de processos enzimticos e na ativao de enzimas (Santiago, 2001). constituinte dos cidos nuclicos (DNA e RNA), fosfolipdios e acares-fosfato; coenzimas (NADP) e especialmente do ATP (composto rico em energia que participa de vrios processos metablicos, tais como: sntese e degradao de carboidratos, sntese de protenas e de cidos graxos). Na organognese est envolvido na diferenciao da parte area, pois reverte o efeito das auxinas.

Potssio: utilizado com nitrato (KNO3), fosfato (KH2PO4) ou cloreto (KCl). Ativador de vrias enzimas do metabolismo de carboidratos e protenas. Como enzimas envolvidas nos processos de gliclise e respirao (Santiago, 2001). necessrio para a embriognese somtica (Ammirato, 1983). A deficincia de potssio pode conduzir a hiperhidricidade e decrscimo na taxa de absoro de fosfato. Atua como ativador enzimtico em vrios processos metablicos, tais como: respirao, sntese de carboidratos e protenas e reaes de fosforilao.

Enxofre: Utilizado na forma de sulfato (SO4-2) ou na forma de aminocidos (cistina, cistena e metionina). Envolvido no metabolismo energtico na formao do fosfosulfato de adenosina, constituinte da tiamina, biotina e coenzima A. Sua absoro relacionada assimilao do nitrognio e, independentemente, do pH (Santiago, 2001).

Clcio: Utilizado na forma de nitrato - Ca(NO3)2- ou cloreto- CaCl2-. Est envolvido na diviso celular, uma vez que um dos componentes da lamela mdia o pectato de clcio. Mantm a integridade da membrana celular e importante para a germinao de gros de plen (George, 1993). um agente quimiotrfico para o direcionamento do tubo polnico. Altas concentraes de clcio (6 a 9 mM) so necessrias para controle da necrose do pice caulinar. importante para manuteno da integridade funcional de membranas e neutralizao de cidos orgnicos (quelao), evitando sua toxicidade.

Magnsio: Usado na forma de sulfato de magnsio- MgSO47H2O-. um dos componentes da clorofila, co-fator importante para vrias reaes enzimticas que atuam sobre substratos fosforilados, necessrio para a absoro de fsforo e atua como ativador enzimtico em vrios processos com metabolismo de cidos nuclicos.

Ferro: Est numa faixa intermediria entre os macros e micronutrientes. adicionado ao meio na forma quelado Fe-EDTA. Envolvido nas reaes de oxi-reduo nos organismos vivos e essencial para a sntese da clorofila.

Molibdnio: adicionado na forma de molibidato de sdio (Na2MoO4), Co-fator da redutase do nitrato sendo desta maneira importante para a absoro no nitrognio.

Cobre: usado como sulfato de cobre- CuSO45H2O-. um ction que em doses acima do normal fitotxico s culturas. Constituinte da enzima plastocianina que importante componente do transporte de eltrons.

Cloro: essencial para a fotossntese, sendo requerido durante a reao de Hill, porm em altas concentraes txico.

Zinco: Adicionado ao meio atravs do Sulfato de zinco- ZnSO47H2O-. Importante nas reaes de oxi-reduo das plantas. Co-fator de enzimas anidrase carbnica. Mangans: Adicionado ao meio atravs do Sulfato de mangans- MnSO4H2O -. Essencial no metabolismo para a reao de Hill na fotossntese, quando a molcula de gua quebrada produzindo eltrons e oxignio.

Cobalto: usado como cloreto de cobalto- CoCl26H2O- e est envolvido na expanso foliar.

Boro: Embora a precisa funo do boro no metabolismo no esteja clara, evidncias sugerem que ele executa papis importantes no alongamento da clula, na sntese de cidos nuclicos, nas respostas a hormnios e na integridade estrutural da parede celular.

Constituintes orgnicosOs compostos orgnicos importantes so os carboidratos, substncias reguladoras de crescimento, vitaminas, aminocidos e amidas, certas purinas e pirimidinas, hexitis e cidos orgnicos.

Carboidratos: As clulas, tecidos e plntulas cultivadas in vitro no encontram condies adequadas de iluminao e concentrao de CO2 e, s vezes, no apresentam teores de clorofila suficientes para realizar fotossntese (Torres, 1998). Muitas vezes, acares que no so efetivos na manuteno do crescimento do calo, sustentam a iniciao de brotaes adventcias e a embriognese somtica. Os carboidratos mais usados nos meios de cultura so a sacarose, a glicose e a frutose nos nveis de 2% a 5% (p/p) (George, 1993). A concentrao de 3% a mais usada. Concentraes de sacarose entre 6% a 12% podem ser usadas em cultura de embries, frutos e anteras, enquanto que o nvel de 1,5% usado em cultura de protoplastos. Pode ocorrer a caramelizao do acar quando exceder o tempo de autoclavagem e a sua degradao pode ocorrer formao de hidroxiacetonas, dihidroxiacetona, furano, 2-metilfurano, 2,5-dimetilfuranoe maltol (Ammirato et. al. 1983). Estes compostos formam meladoidinas que so compostos de colorao amarronzada, de alto peso molecular, podendo inibir o crescimento celular. O acar purificado com acetato, para precipitar impurezas e pode conter alto nvel de zinco que txico para o tecido. Glicose e frutose devem ser esterilizadas a frio. Aminocidos e amidas: A suplementao pode ser realizada pela incluso de uma protena hidrolisada ao meio. Qualquer efeito benfico pode ser avaliado pela substituio desta protena por uma mistura de aminocidos e amidas. Os aminocidos e amidas tm importncia na amplificao das respostas morfogenticas, proporcionando maior crescimento e facilitando a diferenciao no sentido da regenerao. As formas "L" dos aminocidos so de ocorrncia natural. A tirosina apresenta influncia na iniciao de parte area em cultura de calos, L-arginina no enraizamento e L-serina na obteno de embries haplides mediante o cultivo de micrsporo. As amidas L-glutamina e L-aspagarina so benficas na obteno de embries somticos, e a cistena includa, s vezes, como agente redutor.

Vitaminas: Vitaminas so compostos orgnicos que, em baixas concentraes, desempenham funes reguladoras catalticas no metabolismo celular. A vitamina mais comumente usada em cultura de tecidos a tiamina (B1). A tiamina solvel em gua. Outras vitaminas utilizadas incluem cido nicotnico (B3) e piridoxina (B6). Riboflavina (Vitamina B2): componente da coenzima FMN (Flavina mononucleotdeo) e o FAD (Flavinaadenina-dinucleotdeo) que atuam em oxidaes biolgicas. Na fotossntese FMN participa do transporte de eltrons (George, 1996). Tiamina (Vitamina B1): atua no metabolismo celular devido funo como coenzima na descarboxilao dos cetocidos. Ex: Piruvato e cetoglutarato (George, 1996). cido pantotnico: um dos componentes da coenzima A e exerce papel importante no metabolismo de lipdios. cido nicotnico (Niacina ou Vitamina B3): um componente das coenzimas NAD e NADP importantes na transferncia de hidrognio. Piridoxina, Piridoxal e Piridoxamina (complexo vitamnico B6): Fazem parte de coenzima metablicas de aminocidos. Estas vitaminas tm papel importante nas reaes de transaminao e descarboxilao (George, 1996). Biotina: atua no metabolismo do cido asprtico, e nas reaes do ciclo de Krebs que levam formao deste cido (Ammirato, 1983). cido ascrbico (vitamina C): Catalisador de fosforilizao fotossinttica devido ao poder de oxidar e reduzir facilmente (Santiago, 2001).

4. Reguladores do crescimento vegetaisPara ocorrer o desenvolvimento ou a entrada de atividade de um determinado processo necessrio a sinalizao especfica por reguladores de crescimento. O controle qumico da diferenciao da parte area foi primeiramente observado em cultura de calo de tabaco. Foi observada inibio na formao de gemas por auxinas, e reverso deste efeito estimulando brotaes utilizando-se adenina bem como o fosfato inorgnico. Esta foi a constatao de que o processo de organognese in vitro controlado por substncias hormonais sendo que o desenvolvimento de parte area, raiz ou calo determinado pelo balano entre auxinas e citocininas. O balano de auxinas/citocininas em alto/baixo favorecem o enraizamento e o balano inverso promove a formao de parte area. Concentraes iguais promovem a produo de calos. Auxina: As auxinas mais usadas so AIA (cido indol-3-actico), AIB (cido indol-3-butirico), ANA (cido naftalenoactico), 2,4-D, 2,4,5-T, 4-CPA e picloran. A auxina 2,4-D bastante usada para a induo de calos e tem o efeito de inibir a morfognese. As auxinas 2,4-D e ANA so sintticas e tm efeitos semelhantes s auxinas de ocorrncias naturais, sendo mais estveis degradao. A auxina 2,4,5-triclorofenoxiactico (2,4,5-T) e o picloran induzem a formao de calos em monocotiledneas (Ammirato, 1983). As auxinas so termoestveis, no decompondo quando autoclavadas. O AIA a auxina natural e a menos estvel. A dissoluo das auxinas feita em NaOH 2 M.

Citocinina: so derivadas da adenina (aminopurina) e tm um papel fundamental na diferenciao e regenerao de plantas na maioria das espcies (Santiago, 2001). Induzem a diviso celular, proliferao e morfognese da parte area. As citocininas mais usadas em cultura de tecidos so a benzilaminopurina (BAP), cinetina (CIN), benziladenina (BA), zeatina (Zea), isopentenil adenina (2ip) e thidiazuron (TDZ).

cido giberlico (GA3): usado, algumas vezes, em cultura de meristemas, na recuperao de plantas livres de vrus. Alm de ser importante na superao da dormncia de sementes de algumas espcies. O GA3 deve ser dissolvido em gua com pH ajustado a 5,7 ou em base (NaOH 2M). As solues de GA3 devem ser esterilizadas em filtro bacteriolgico uma vez que esta substncia se decompe por autoclavagem. As solues estoques devem ser preparadas na hora.

pHO pH dos meios nutritivos em culturas de clulas vegetais normalmente ajustado com HCl ou NaOH, depois de adicionar todos os componentes para um valor ligeiramente cido, entre 5 e 6 (normalmente entre 5,7 - 5,8)(Torres, 1998). Recomenda-se este valor para formulaes lquidas. Em meios gelificados com gar, o pH deve ser ajustado em 5,7, pois em pH 5,0, ocorre a hidrlise de polissacardeos, enquanto que em pH 6,0 - 6,2 verifica-se a precipitao de sais (George, 1996). O pH varia durante o perodo de cultura.

Preparo dos meios e culturaO preparo de solues estoque tem por objetivo facilitar o preparo final dos meios de cultivo e preciso na dosagem dos componentes. As pores so mantidas em geladeira e por um perodo no superior a uma semana para a maioria das solues estoques, principalmente aquelas que apresentam precipitao. Solues estoques de vitaminas devem ser mantidas em geladeira ou em congeladores. Recomenda-se montar estoques de sais minerais (conjuntos de macronutrientes e micronutrientes), Fe-EDTA, misturas orgnicas e reguladores de crescimento. A sacarose e o agente gelificante so pesados e preparados no momento do preparo do meio. Para o preparo das solues estoque necessrio pesar os reagentes e colocar em gua destilada no balo volumtrico. O volume estar aferido se o menisco se encontrar na marca do balo volumtrico.

O menisco da sua soluo deve estar aqui.Figura1. Balo volumtrico com soluo.Obs. O menisco a volta que o lquido apresenta por causa da coeso do lquido e a adeso da parede do recipiente.

O que uma soluo estoque?A soluo estoque uma soluo com a concentrao do reagente muitas vezes maior do que ns usaremos no meio de cultura. Ex. Quando voc faz uma soluo de micronutrientes 1000 X quer dizer que com 1000 mL desta soluo eu posso fazer 1000 mL de meio de cultura. Por causa disso, ns devemos tomar muitos cuidados com as solues estoque tanto no seu preparo quanto na sua identificao correta. Sempre colocando a sua concentrao.

5.1 Preparo soluo de HCl, NaOH e Fe-EDTA

Para preparar 1000 mL da soluo de HCl 1 M.Lembrete: Adicionar o cido na gua.Dica: Deve-se colocar o Bquer em isopor com gelo, pois a reao do cido com a gua libera muito energia (exotrmica) e esquenta a vidro.

Os dados abaixo esto na embalagem do reagented= 1,19 g/mL ou 1,19g/cm3P.M.= 36,5 gSoluo de HCl 36,5% p/pClculo 11,19 g ------- 1 mL36,5 g --------xx= 30,67 ml

Clculo 2 30,67 mL ----- 36,5% y --------------- 100% y= 84 mL de soluo de HCl 36,5%Na capela exaustora, devemos colocar 84 mL de HCl 36,5% em 800 mL de gua destilada no Bquer. Depois que resfriar a soluo deve-se verter a soluo no balo volumtrico e completar o volume para 1000 mL.

Para preparar 1000 mL da soluo de NaOH 2 MOs dados abaixo esto na embalagem do reagenteP.M.= 40gDissolver 80g de NaOH no Bquer com 800 mL de gua destilada. Depois que resfriar a soluo deve-se verter a soluo no balo volumtrico e completar o volume para 1000 mL

Para preparar 1000 mL da soluo de Fe-EDTA (100x)- Dissolver 5,56 g de sulfato de ferro (FeSO47H2O) em 400ml de gua quente;- Dissolver 7,45 g de sdio-EDTA (Na2-EDTA) em 400ml de gua quente;- Misturar as duas solues quentes, vertendo-se a soluo de Na2-EDTA sobre a soluo de FeSO47H2O;- Completar o volume para 1000 mL de soluo fria, com gua destilada, esta soluo dever ter colorao verde claro.- Armazenar em vidro escuro e coberto com papel alumnio, colocando-o em geladeira.

Tabela 1. Soluo estoque do meio MS (Murashige; Skoog, 1962 )ComponentesMeio MS

Conc. estoquep/ 1000 mLEstoque

Macronutrientes

NH4NO310 X16,5 gMacro MS

KNO310 X19 gMacro MS

CaCl22H2O10 X4,4 gMacro MS

MgSO47H2O10 X3,7 gMacro MS

KH2PO410 X1,7 gMacro MS

Micronutrientes

MnSO4H2O1000 X16,90 gMicro MS

H3BO31000 X6,2 gMicro MS

ZnSO47H2O1000 X8,6 gMicro MS

KI1000 X0,83 gMicro MS

NaMoO42H2O1000 X0,25 gMicro MS

CuSO45H2O1000 X0,025 gMicro MS

CoCl26H2O1000 X 0,025 gMicro MS

EDTA100 X7,45 gFe-EDTA

FeSO47H2O100 X5,56 gFe-EDTA

Vitaminas

Tiamina HCl500 X0,05 gVit. MS

Piridoxina HCl500 X0,25 gVit. MS

cido nicotnico500 X0,25 gVit. MS

Glicina500 X1,0 gVit. MS

Mio-inositol500 X50 gVit. MS

Tabela 2. Soluo estoque do meio WPM (Lloyd; McCown, 1986))ComponentesMeio WPM

Conc. estoquep/ 1000 mLEstoque

Macronutrientes

NH4NO350 X20 gSol. A WPM

CaCl22H2O50 X4,8 gSol. A WPM

MgSO47H2O50 X18,5 gSol. A WPM

KH2PO450 X8,5 gSol. A WPM

Ca (NO3)250 X27,8 gSol. B WPM

K2SO450 X49,5 gSol. C WPM

Micronutrientes

MnSO4H2O100 X2,23 gMicro WPM

H3BO3100 X0,62 gMicro WPM

ZnSO47H2O100 X0,86 gMicro WPM

NaMoO42H2O100 X0,025 gMicro WPM

CuSO45H2O100 X0,025 gMicro WPM

EDTA100 X7,45 gFe-EDTA

FeSO47H2O100 X5,56 gFe-EDTA

Vitaminas

Tiamina HCl500 X0,05 gVit. WPM

Piridoxina HCl500 X0,25 gVit. WPM

cido nicotnico500 X0,25 gVit. WPM

Glicina500 X1,0 gVit. WPM

Mio-inositol500 X50 gVit. WPM

Tabela 3. Soluo estoque do meio WPM (Correia, 1996)ComponentesMeio JADS

Conc. estoquep/1000 mLEstoque

Macronutrientes

NH4NO3100 X32,4 gMacro JADS

KNO3100 X80,9 gMacro JADS

MgSO47H2O100 X73,95 gMacro JADS

KH2PO4100 X40,8 gMacro JADS

Ca (NO3)2100 X118,1 gCa(NO3)2 JADS

Micronutrientes

MnSO4H2O100 X1690 mgMicro JADS

H3BO3100 X310 mgMicro JADS

ZnSO47H2O100 X432 mgMicro JADS

NaMoO42H2O100 X15 mgMicro JADS

CuSO45H2O100 X125 mgMicro JADS

CoCl26H2O100 X25 mgMicro JADS

EDTA100 X7,45 gFe-EDTA

FeSO47H2O100 X5,56 gFe-EDTA

Vitaminas

Tiamina HCl100 X50 mgVit. JADS

Piridoxina HCl100 X50 mgVit. JADS

cido nicotnico100 X50 mgVit. JADS

Glicina100 X200 mgVit. JADS

L- Arginina100 X700 mgVit. JADS

L- Glutamina100 X14,6 gVit. JADS

L- Cisteina100 X250 mgVit. JADS

Pantotenato de clcio100 X250 mgVit. JADS

Mio-inositol1-100 mg-

1 Para o meio JADS, no precisar ser feita soluo, acrescenta o inositol em p.

Soluo estoque dos reguladores de crescimentoAuxinascido Indolactico-AIA 1mM

AIA250mL100mL50mL

43,798mg17,519mg8,7595mg

Obs.Solvente em NaOH 2M ( 3gotas)No recomendado o armazenamento

cido Indolbutrico-AIB 1mM

AIB250mL100mL50mL

50,8mg20,32mg10,16mg

Obs.Solvente em NaOH 2M( 3gotas)Armazenamento 0oC

2,4-D 1mM

2,4-D500mL250mL100mL

110,5mg55,25mg22,1mg

Obs.Solvente em NaOH 2M( 3gotas)Armazenamento 0oC

cido Naftalenoactico-ANA 1mM

ANA1000mL500mL250mL100mL

1,862g0,931g0,4655g0,01862g

Obs.Solvente em NaOH 2M ( 3gotas)Armazenamento 0oC

Citocininas6-Benzilaminopurina-BAP 1mM

BAP500mL250mL100mL

112,65mg56,325mg22,53mg

Obs.Solvente em NaOH 1N ( 3gotas)Armazenamento 0oC

Cinetina-KIN 1mM

Cinetina500mL250mL100mL

107,6mg53,8mg21,52mg

Obs.Solvente em NaOH 1N ( 3gotas)Armazenamento 0oC

6. Preparo dos meios de cultura MS, WPM e JADSDepois de feita as solues estoque como demonstrado no item 5, deve-se o utilizar o volume da soluo estoque indicado nas explicaes abaixo para fazer 1000 mL de dos meio de cultura.---------------------------------------------------------------------------------------Meio MS (para fazer 1000 mL de meio de cultura)Macronutrientes = 100 mLMicronutrientes = 1 mLFe-EDTA = 5 mLVitamina MS = 2 mLSacarose = 30 ggar = 6 g---------------------------------------------------------------------------------------Meio WPM (para fazer 1000 ml de meio de cultura)Sol. A WPM = 20 mLSol. B WPM = 20 mLSol. C WPM = 20 mLMicro WPM = 1 mLFe-EDTA = 5 mLVitamina WPM = 2 mLSacarose = 30 ggar = 6g---------------------------------------------------------------------------------------Meio JADS (para fazer 1000 mL de meio de cultura)Macro JADS = 10 mLCa(NO3)2 JADS = 10 mLMicro JADS = 10 mLVitamina JADS = 10 mLFe-EDTA = 10 mLMio-Inositol = 100 mgSacarose = 30 ggar = 6 g---------------------------------------------------------------------------------------OBS1: O pH do meio de cultura, varia de acordo com a espcie a ser trabalhada, porm, na maioria das vezes o ideal est entre 5,7- 5,8.OBS2: A concentrao de sacarose varia de acordo com a espcie a ser trabalhada, porm, a maioria delas exige 30g L-1 de sacarose.OBS3: O Meio de cultura WPM muito indicado para espcies lenhosas que no obtiveram bons resultados com meio MS.OBS4: Os reguladores de crescimento e suas concentraes variam de acordo com a espcie, indica-se fazer testes com no mnimo de concentraes (baixa, mdia e alta) para depois ajustar conforme a resposta da planta.OBS5: A presena e a quantidade de gar varia em relao do meio ser lquido( sem gar) ou da consistncia do meio (para algumas culturas o meio necessita ser mais rgido, para outras mais fluida). Alm existe a variao do grau de pureza entre as marcas fazendo com que utilize mais ou menos meio. 1. Bibliografia ConsultadaAMMIRATO, P. G. V. 1993. Embryogenesis, in: Evans, D. A.; Sharp, W. R.; Ammirato, P. G. V.; Yamada, Y.Handbook of plant cell culture. New York: MacMilam Publischer Company, v.1, 123p.

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